DE69928209T9

DE69928209T9 - Infektiöser cDNA Klon des das Reproduktions- und Atemwegs-Syndrom verursachenden Nord-Amerikanischen Schweinevirus und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69928209T9
Application number: DE1999628209
Authority: DE
Inventors: Jay Gregory Gales Ferry Calvert; Siao-Kun Wan North Stonington Welch; Michael George North Stonington Sheppard
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2006-10-19
Also published as: CA2440933A1; EP1627919B1; JP4159242B2; MXPA03009354A; DK1627919T3; HK1029140A1; CN1171996C; CN1263945A; CY1105680T1; BR9905902A; US6500662B1; AR058249A2; JP2004081218A; ES2251162T3; JP2008289485A; JP2008113670A; AU6173399A; US7232680B2; JP2001224384A; DE69928209T2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Tiergesundheit und ist auf infektiöse cDNA-Klone von RNA-Viren mit positiver Polarität und die Konstruktion von Impfstoffen, insbesondere Schweineimpfstoffen, unter Verwendung solcher cDNA-Klone gerichtet.
Hintergrund der Erfindung
Das Reproduktions- und Atemwegssyndrom der Schweine (PRRS) ist eine neue Schweinekrankheit, die erstmals 1987 in Nord Amerika und 1990 in Europa beschrieben wurde. Die Krankheit breitete sich seither nach Asien aus und beeinflußte einen Großteil der wichtigsten Schweinezuchtländer der Welt. Primäre Symptome sind Reproduktionsprobleme bei Sauen und Jungsauen, einschließlich Fehlgeburten im späten Stadium der Schwangerschaft, Todgeburten und Mumien, und Würfe kleiner schwacher Schweine, die mit Viren im Blut geboren werden und oftmals nicht überleben. Überdies offenbart sich das Syndrom selbst als eine Atemwegserkrankung bei jungen Schweinen, die sich horizontal ausbreitet und Fieber, Lethargie, schweres Atmen, Appetitverlust, langsames Wachstum und mit unter den Tod verursacht, oftmals im Zusammenhang mit anderen Atemwegspathogenen. Die Krankheit kann ferner über den Samen infizierter Eber entweder natürlich oder durch künstliche Befruchtung auf Sauen übertragen werden. Aus diesen und anderen Gründen ist PRRS eine schwer zu kontrollierende Krankheit und daher eine der am wirtschaftlich schädlichsten Krankheiten in der Schweineindustrie.
Der Erreger von PRRS ist das PRRS-Virus, das als zwei genetisch und serologisch unterschiedliche Arten existiert (Murtaugh, M. P. et al., 1995, Arch-Virol. 140, 1451–1460; Suarez, P. et al., 1996, Virus Research 42: 159–165). Es wird angenommen, daß die beiden Arten erstmals in den 1980ern unabhängig voneinander in die Schweinepopulationen aus unbekannten biologischen Reservoirs, möglicherweise vom Nager oder Vogel, eintraten, eine in Nord-Amerika und die andere in Europa. Die europäische Art, repräsentiert durch den Proto typen „Lelystad Virus", wurde in den Niederlanden 1991 isoliert und sequenziert (Terpstra, C. et al., 1991, Vet. Quart. 13: 131–136; Wensvoort, G. et al., 1991, Vet. Quart. 13: 121–130; Wensvoort, G. et al., WO 92/213751992 (PCT/NL92/00096), 1992; Meulenberg, J. J. M. et al., 1993, Virol. 192: 62–72).
Sowohl das Nord-Amerikanische PRRS-Virus als auch das europäische PRRS-Virus sind in der Familie der Arteriviridae klassifiziert, die auch das Pferdearteritisvirus, das Lactatdehydrogenase-förderne Virus und das haemorrhagische Fiebervirus bei Affen umfaßt. Die Arterienviren gehören wiederum in die Klasse Nidovirales, die auch die Coronaviren und die Toroviren umfaßt. Die Nidoviren sind umhüllte Viren mit Genomen, die aus einem einzelnen Stamm von RNA mit positiver Polarität bestehen. Die genomische RNA mit einem Positivstrang-RNA-Virus erfüllt eine Doppelrolle sowohl bei der Lagerung als auch der Expression genetischer Informationen. Bei der Replikation oder Transkription in Nidoviren ist keine DNA involviert. Die Reproduktion nidoviraler genomischer RNA ist daher ein kombiniertes Verfahren aus Genomreplikation und mRNA-Transkription. Überdies werden einige Proteine direkt aus der genomischen RNA von Nidoviren übertragen. Die Molekularbiologie der Arteriviridae-Familie ist kürzlich von Snijder und Meulenberg (Snijder, E. J. und Meulenberg, J. J. M., 1998, Journal of General Virology 79: 961–979) besprochen worden.
Derzeit kommerziell erhältliche Impfstoffe gegen PRRS sind entweder herkömmliche modifizierte Lebendviren (Zellkultur, abgeschwächt) oder herkömmliche getötete (inaktivierte Zellkultur-Präparate virulenter Viren). Mehrere dieser Impfstoffe sind hinsichtlich Sicherheits- und/oder Wirksamkeitsbetrachtungen kritisiert worden. Die Entwicklung einer zweiten Generation von PRRS-Impfstoffen, basierend auf speziellen Zugaben, Deletionen und anderen Modifikationen zu dem PRRS-Genom, ist daher überaus wünschenswert. Da die PRRS-Viren jedoch während ihrer Replikation keinerlei DNA-Zwischenprodukte enthalten, ist durch solche Impfstoffe daher die lang erwartete Konstruktion von cDNA-Klonen mit voller Länge aus PRRS-Viren zur Manipulation durch Molekularbiologietechniken bei dem DNA-Niveau möglich. Erst kürzlich ist von einem infektiösen cDNA-Klon mit voller Länge des europäischen PRRS-Virus berichtet worden (Meulenberg, J. J. M. et al., 1998, supra; Meulenberg, J. J. M. et al., 1988, J. Virol. 72, 380–387).
Database EMBL (Online) U87392 offenbart das vollständige Genom des PRSS-Virus-Stammes VR-2332.
Database EMBL (Online) AF046869 offenbart das vollständige Genom des PRSS-Virus 16244B.
WO 96/04010 offenbart eine Teilsequenz des PRRS-Virus VR-2332.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner eine transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, wobei die transfizierte Wirtszelle das codierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Plasmid, das eine geeignete Wirtszelle direkt transfizieren und ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus aus der so transfizierten geeigneten Wirtszelle exprimieren kann, wobei das Plasmid a) eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, und wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, und b) einen Promotor, der das infektiöse RNA-Molekül in der geeigneten Wirtszelle transkribieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, wobei das Verfahren das Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Plasmid der Erfindung, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, und den Erhalt des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, das durch die transfizierte Wirtszelle erzeugt wurde, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, daß es, wenn es ein vom Schwein stammendes Tier infiziert, kein PRRS in dem Tier erzeugen kann, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere Mutationen enthält, die das codierte PRRS-Virus genetisch daran hindern, PRRS zu erzeugen.
Die vorliegender Erfindung liefert ferner eine transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, daß es, wenn es ein vom Schwein stammendes Tier infiziert, kein PRRS in dem Tier erzeugen kann, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere Mutationen enthält, die das codierte PRRS-Virus genetisch daran hindern, PRRS zu erzeugen, wobei die transfizierte Wirtszelle das codierte, genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tiers vor einer Infektion durch ein PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül der Erfindung, oder das infektiöse RNA-Molekül oder das Polynucleotid-Molekül in Form eines Plasmids, oder einen viralen Vektor, umfassend eine Nucleotidsequenz der Erfindung, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, die eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen kann, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, das es ein oder mehrere heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein heterologes antigenes Epitop codieren, und wobei jedes heterologe antigene Epitop eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein bestimmtes Pathogen in einem Säuger oder einem Vogel induzieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner eine transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, das es ein oder mehrere heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das den Nord-Amerikanischen PRRS-Virus codiert, SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 ent spricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein heterologes antigenes Epitop codieren, und wobei jedes heterologe antigene Epitop eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein bestimmtes Pathogen in einem Säuger oder einem Vogel induzieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines Säugers oder eines Vogels vor einer Infektion durch ein Pathogen, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül der Erfindung, oder das infektiöse RNA-Molekül, oder ein Plasmid der Erfindung, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch das Pathogen wirksam ist, aus dem das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop oder Epitope davon oder dadurch codiert stammen; und einen Träger, der für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tieres vor der Infektion durch ein PRRS-Virus und vor der Infektion durch ein anderes Schweinepathogen als ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül der Erfindung, oder das infektiöse RNA-Molekül, oder ein Plasmid der Erfindung, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus und gegen die Infektion durch das Pathogen, aus dem das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop oder Epitope davon oder dadurch codiert stammen, wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, das es ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, die gleiche wie SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein detektierbares heterologes antigenes Epitop codieren.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammendes Tieres vor der Infektion durch ein PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül der Erfindung, umfassend ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope, behandelt oder weiter genetisch modifiziert, so daß es kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus bei dem vom Schwein stammenden Tier auslösen kann; oder das infektiöse RNA-Molekül, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder ein isoliertes Polynucleotid der Erfindung in Form eines Plasmids, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder einen viralen Vektor, der eine Nucleotidsequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein solches genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, umfaßt, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, daß es ihm an einem detektierbaren antigenen Epitop fehlt, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß es ihm an einer oder mehreren DNA-Sequenzen fehlt, die ein detektierbares antigenes Epitop codieren.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tieres vor der Infektion durch ein PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül der Erfindung, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen fehlt, behandelt oder weiter genetisch modifiziert, so daß es kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus bei einem vom Schwein stammenden Tier auslösen kann; oder das infektiöse RNA-Molekül, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder ein isoliertes Polynucleotid-Molekül in Form eines Plasmids, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder einen viralen Vektor, der eine Nucleotidsequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein solches genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, umfaßt, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die jeweils ein Peptid, codiert durch ein Nord- Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche ist, wie ein RNA-Molekül, das SEQ ID NR. 1 oder der Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner eine transfizierte Wirtszelle, umfassend eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die jeweils ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche ist, wie ein RNA-Molekül, das SEQ ID NR. 1 oder der Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, wobei die transformierte Zelle das Peptid oder die Peptide exprimieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, das eine immunschützende Reaktion in einem Säuger oder einem Vogel, die damit geimpft wurden, auslösen kann, wobei das Verfahren den Erhalt eines isolierten Polynucleotid-Moleküls, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Wildtyp-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist; die genetische Mutation der DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Wildtyp-Virus codiert, um so ein isoliertes Polynucleotid-Molekül zu erhalten, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei das Virus weiterhin eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch das Nord-Amerikanische PRRS-Wildtyp-Virus in einem Säuger oder einem Vogel auslösen kann; und das Exprimieren des genetisch modifizierten Nord- Amerikanischen PRRS-Virus aus dem isolierten Polynucleotid-Molekül, das so erhalten wurde, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Impfstoff zum Schutz eines Säugers oder eines Vogels vor der Infektion durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der Erfindung in einer Menge, die für das Auslösen einer wirksamen immunschützenden Reaktion gegen das Nord-Amerikanische PRRS-Wildtyp-Virus in einem Säuger oder einem Vogel, der damit geimpft wurde, wirksam ist, und einen Träger, der für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Klonierungsstrategie zur Konstruktion eines infektiösen cDNA-Klons mit voller Länge von einem Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, pT7P129A. Die Pfeilspitzen stellen T7-Promotorsequenzen dar.
2: Serumvirämie nach der Infektion mit P129A oder einem rekombinanten PRRS-Virus rP129A-1. Bestimmt durch einen Plaqueassay an MARC-145-Zellen. Die untere Nachweisgrenze beträgt 5 pfu/ml (oder 0,7 auf der log-Skala).
3: Anti-PRRS-Virus-Serum-Antikörper nach der Infektion mit P129A oder einem rekombinanten PRRS-Virus rP129A-1. Bestimmt durch den HerdChek PRRS ELISA-Assay (IDEXX (Westbrook, Maine, USA)).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Herstellung und Manipulation der hierin beschriebenen isolierten Polynucleotid-Moleküle liegen im Stand der Technik und können gemäß Rekombinantionstechniken, die unter anderem in Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Har bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York beschrieben werden, durchgeführt werden.
A. Isolierte Polynucleotid-Moleküle und RNA-Moleküle, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren, und isolierte Polynucleotid-Moleküle und RNA-Moleküle, die ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren:
Die vorliegende Erfindung liefert ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist. Die DNA-Sequenz codiert ein infektiöses RNA-Molekül, das heißt, das RNA-Genom des Nord-Amerikanischen PRRS-Isolats P129.
Es wird davon ausgegangen, daß Ausdrücke hierin, die sich auf Nucleinsäuremoleküle beziehen wie das „isolierte Polynucleotid-Molekül", die „Nucleotidssequenz", „offenes Leseraster (ORF)", und dergleichen, sofern nicht anders spezifiziert, sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle und sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrangmoleküle umfassen. Auch wenn sich auf eine bestimmte Sequenz aus dem „Sequenzlisten"-Teil der vorliegenden Anmeldung bezogen wird, soll sich diese, sofern nicht anders angegeben, sowohl auf die DNA der „Sequenzliste", als auch auf die der DNA-Sequenz entsprechende RNA beziehen und umfaßt Sequenzen, die zu den DNA- und RNA-Sequenzen komplementär sind. In solchen Zusammenhängen in dieser Anmeldung bezieht „entsprechend", auf DNA- und RNA-Sequenzen, die identisch sind, außer in dem Fall, daß die RNA-Sequenz Uracil anstelle von Thymin enthält und die Hauptkette des RNA-Moleküls Ribose anstelle von Deoxyribose enthält.
Beispielsweise ist SEQ ID Nr: 1 eine DNA-Sequenz, die dem RNA-Genom des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus entspricht. Daher ist eine DNA-Sequenz, die zu der in SEQ ID Nr: 1 festgelegten DNA-Sequenz komplementär ist, eine Matrize für, d. h. ist komplementär zu oder „codiert", das RNA-Genom des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus (d. h., RNA, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert). Trotzdem umfaßt ein Bezug auf SEQ ID Nr: 1 sowohl die RNA-Sequenz, die SEQ ID Nr: 1 entspricht, als auch eine DNA-Sequenz, die zu SEQ ID Nr: 1 komplementär ist.
Ein „infektiöses RNA-Molekül" ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein RNA-Molekül, das die notwendigen Elemente für eine virale Replikation, Transkription und Translation in ein funktionales Virion in einer geeigneten Wirtszelle codiert, ausgestattet, wenn nötig, mit einem Peptid oder Peptiden, die jegliche genetische Modifikationen, z. B. Sequenzdeletionen, in dem RNA-Molekül kompensieren.
Ein „isoliertes infektiöses RNA-Molekül" bezieht sich auf eine Zusammensetzung aus Substanz, die das zuvor genannte infektiöse RNA-Molekül umfaßt, gereinigt auf einen detektierbaren Grad aus seinem natürlichen Ursprung, wenn ein solches RNA-Molekül tatsächlich in der Natur vorkommt. Desgleichen bezieht sich ein „isoliertes Polynucleotid-Molekül" auf eine Zusammensetzung aus einer Substanz, die ein Polynucleotid-Molekül der vorliegenden Erfindung, gereinigt auf einen detektierbaren Grad aus seinem natürlichen Ursprung, sofern vorhanden, umfaßt.
Es wird ebenfalls angenommen, daß die isolierten Polynucleotid-Moleküle und die isolierten RNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sowohl synthetische Moleküle als auch Moleküle, die durch Rekombinantionstechniken, wie durch in vitro-Klonierung und Transkription erhalten wurden, umfassen.
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck „PRRS" Krankheitssymptome beim Schwein, die durch eine PRRS-Virus-Infektion verursacht wurden. Beispiele solcher Symptome umfassen Fehlgeburt schwangerer Weibchen und langsames Wachstum, Atemschwierigkeiten, Appetitverlust und Mortalität bei jungen Schweinen, sind aber nicht darauf beschränkt. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein PRRS-Virus, das „kein PRRS erzeugen kann" auf ein Virus, das ein Schwein infizieren kann, das jedoch keine Krankheitssymptome verursacht, wie sie normalerweise mit einer PRRS-Infektion bei einem Schwein in Verbindung stehen, oder solche Symptome erzeugt, jedoch zu einem geringeren Grad, oder weniger dieser Symptome erzeugt, oder beides.
Die Ausdrücke „vom Schwein stammend" und „Schwein" werden hierin abwechseln verwendet und beziehen sich auf irgendein Tier, daß ein Mitglied der Familie der Suidae ist, zum Beispiel ein Schwein. „Säuger" umfassen alle warmblütigen Wirbeltiere der Säugetier-Klasse, einschließlich Menschen.
Der Ausdruck „PRRS-Virus", wie hierin verwendet, sofern nicht anders angegeben, bedeutet irgendeinen Strang sowohl des Nord-Amerikanischen als auch des Europäischen PRRS-Virus.
Der Ausdruck „Nord-Amerikanisches PRRS-Virus" bedeutet irgendein PRRS-Virus mit genetischen Merkmalen, die mit einem North-Amerikanischen PRRS-Virusisolat in Verbindung stehen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf das PRRS-Virus, das erstmals in den frühen 1990ern in den Vereinigten Staaten isoliert wurde (siehe z. B. Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117–126); das Nord-Amerikanische PRRS-Virusisolat MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293–296); der Quebec IAF-exp91-Stamm von PRRS (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405–1418) und das Nord-Amerikanische PRRS-Virusisolat VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795–1801). Genetische Merkmale beziehen sich auf genomische Nucleotidsequenzähnlichkeit und Aminosäuresequenzähnlichkeit, die sich Nord-Amerikanische PRRS-Virusstämme teilen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus ein Virus, das durch eine RNA-Sequenz codiert wird, die die gleiche wie SEQ ID Nr: 1 ist.
Der Ausdruck „Europäisches PRRS-Virus" bezieht sich auf irgendeinen Stamm des PRRS-Virus mit den genetischen Merkmalen, die mit dem PRRS-Virus in Verbindung stehen, das erstmals um 1991 in Europa isoliert wurde (siehe z. B., Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121–130). Ein „Europäisches PRRS-Virus" wird in der Technik manchmal auch als „Lelystad Virus" bezeichnet.
Der Ausdruck „offenes Laserraster" oder „ORF", wie hierin verwendet, bedeutet die minimale Nucleotidsequenz, die zur Codierung eines bestimmten PRRS-Virusproteins ohne ein Intervening-Stopcodon erforderlich ist.
Ausdrücke wie „geeignete Wirtszelle" und „entsprechende Wirtszelle" beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf Zellen, in die RNA-Moleküle (oder isolierte Polynucleotid-Moleküle oder virale Vektoren, umfassend DNA-Sequenzen, die solche RNA-Moleküle codieren) der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert werden können. „Geeignete Wirtszellen" zur Transfektion mit solchen RNA-Molekülen, isolierten Polynucleotid-Molekülen oder viralen Vektoren umfassen Säugetier-, insbesondere vom Schwein stammende und vom Vogel stammende Zellen und werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Das „funktionale Virion" ist ein Virusteilchen, das in eine Zelle eintreten kann, die einem PRRS-Virus als Wirt dienen kann und Gene ihres bestimmten RNA-Genoms (entweder eines nicht modifizierten Genoms oder eines genetisch modifizierten Genoms wie hierin beschrieben) in der Zelle exprimieren kann. Zellen, die einem PRRS-Virus als Wirt dienen können, umfassen Schweine-Alveolarmakrophagenzellen und MARC 145-Affennierenzellen. Andere Säugetier- oder vom Vogel stammende Zellen, insbesondere andere Schweinezellen, können auch als Wirtszellen für PRRS-Virions dienen.
Die isolierten Polynucleotid-Moleküle der vorliegenden Erfindung codieren Nord-Amerikanische PRRS-Viren, die zur Herstellung lebender, toter oder abgeschwächter Impfstoffe unter Verwendung von in der Technik anerkannten Verfahren zum Schutz eines Schweins vor der Infektion durch ein PRRS-Virus verwendet werden können, wie hierin nachstehend ausführlich beschrieben. Diese isolierten Polynucleotid-Moleküle sind auch als Vektoren zur Einführung heterologer Gene in Säuger, einschließlich Schweine, oder Vögel verwendbar, wie ebenso hierin nachstehend ausführlich beschrieben. Ferner sind diese isolierten Polynucleotid-Moleküle nützlich, weil sie unter Verwendung von Molekularbiologietechniken mutiert werden können, um genetisch-modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Viren, die unter anderem als Impfstoffe zum Schutz eines Schweins vor einer PRRS-Infektion nützlich sind. Solche genetisch-modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren sowie Impfstoffe, die diese umfassen, werden hierin nachstehend auch ausführlich beschrieben.
Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, wobei das Verfahren die Mutation der DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus, wie oben beschrieben, codiert, und die Expression des genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems umfaßt. Ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, entweder der Wildtyp oder genetisch modifiziert, kann aus einem isolierten Polynucleotid-Molekül unter Verwendung geeigneter Expressionssysteme, die in der Technik allgemein bekannt sind, exprimiert werden, von denen Beispiele in dieser Anmeldung beschrieben werden. Beispielsweise kann das isolierte Polynucleotid-Molekül in Form eines Plasmids vorliegen, das das codierte Virus in einer geeigneten Wirtszelle in vitro exprimieren kann, wie nachstehend ausführlich beschrieben.
Der Ausdruck „genetisch modifiziert", wie hierin verwendet und sofern nicht etwas anderes angegeben ist, bedeutet genetisch mutiert, das heißt, ein oder mehrere Nucleotide wurden ersetzt, entfernt und/oder zugegeben. Polynucleotid-Moleküle können unter Verwendung von Rekombinationstechniken, die einem Fachmann bekannt sind, genetisch mutiert werden, einschließlich durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch Zufallsmutagenese wie durch Aussetzung zu chemischen Mutagenen oder Strahlung, wie es in der Technik bekannt ist. In einer Ausführungsform macht die genetische Modifikation des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung das Virus unfähig, sich wirksam zu replizieren oder verringert seine Fähigkeit sich wirksam in einem Vogel oder einem Säuger, in denen sich andererseits das Wildtyp-Virus wirksam replizieren kann, zu replizieren. In einer anderen Ausführungsform bleibt das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung fähig, sich wirksam in Vögeln oder Säugern, die damit infiziert sind, zu replizieren. „Wirksame Replikation" bedeutet die Fähigkeit, sich in einem infizierten Tier zu vervielfachen und Virusnachkommen (Virions) zu erzeugen, das heißt, die Fähigkeit, ein Tier „produktiv zu infizieren".
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, wobei die DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID Nr: 1 ist, außer es enthält eine oder mehrere Mutationen, die das codierte PRRS-Virus genetisch an seiner Fähigkeit, PRRS zu erzeugen, hindern. „Genetisch daran hindern" bedeutet, daß das PRRS-Virus kein PRRS in einem Schwein, das damit infiziert ist, erzeugen kann.
In einer Ausführungsform kann das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das kein PRRS erzeugen kann, eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus bei einem Schwein auslösen. Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung auch ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, das es, wenn es ein vom Schwein stammendes Tier infiziert, a) kein PRRS in dem Tier erzeugen und b) eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus in dem Tier auslösen kann, wobei die DNA-Sequenz, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID Nr: 1 ist, außer wenn es eine oder mehrere Mutationen enthält, die das codierte PRRS-Virus genetisch daran hindern, PRRS zu erzeugen.
Der Ausdruck „Immunreaktion" bedeutet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Produktion von Antikörpern und/oder Zellen (wie T-Lymphozyten) die gegen die Zersetzung eines bestimmten antigenen Epitops oder bestimmter antigener Epitope gerichtet sind oder deren Inhibierung unterstützen. Die Wortlaute „eine wirksame immunschützende Reaktion", „Immunschutz" und ähnliche Ausdrücke bedeutet zum Zwecke der vorliegenden Erfindung eine Immunreaktion, die gegen eines oder mehrere antigene Epitope eines Pathogens gerichtet ist, um so gegen eine Infektion durch das Pathogen in einem geimpften Tier zu schützen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt der Schutz gegen eine Infektion durch ein Pathogen nicht nur die absolute Verhinderung der Infektion, sondern auch jegliche detektierbare Verringerung des Grades oder der Rate der Infektion durch ein Pathogen, oder jegliche detektierbare Verringerung der Schwere der Krankheit oder irgendeines Symptoms oder Zustandes, die aus der Infektion durch das Pathogen resultieren, in dem geimpften Tier, im Vergleich zu einem nicht geimpften infizierten Tier. Eine wirksame immunschützende Reaktion kann in Tieren induziert werden, die vorher nicht mit dem Pathogen infiziert worden sind und/oder zum Zeitpunkt der Impfung nicht mit dem Pathogen infiziert sind. Eine wirksame immunschützende Reaktion kann auch in einem Tier induziert werden, das zum Zeitpunkt der Impfung bereits mit dem Pathogen infiziert ist.
Ein „antigenes Epitop" ist, sofern nicht etwas anderes angegeben ist, ein Molekül, das eine Immunreaktion in einem bestimmten Tier oder einer Spezies auslösen kann. Antigene Epitope sind proteinhaltige Moleküle, d. h., Polyaminosäuresequenzen, die gegebenenfalls Nicht-Proteingruppen umfassen, wie Kohlenhydrateinheiten und/oder Lipideinheiten.
Der Ausdruck „pathogen infizierend", wie hierin verwendet, bezeiht sich auf die Fähigkeit eines Pathogens, ein Tier zu infizieren und eine Krankheit bei diesem Tier hervorzurufen. Beispielsweise kann ein PRRS-Virus ein vom Schwein stammendes Tier infizieren, da es bei dem Schwein PRRS hervorrufen kann. Obgleich jedoch das PRRS-Virus einen Vogel oder einen anderen Säuger entweder produktiv oder nicht-produktiv infizieren kann, infiziert es andere Tiere als ein vom Schwein stammendes Tier nicht pathogen, da es in keinem anderen Tier als einem vom Schwein stammenden Tier eine Krankheit hervorruft.
Die genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, die durch die oben beschriebenen isolierten Polynucleotid-Moleküle codiert sind, können in einer Ausführungsform eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen. Solche genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren können bevorzugt eine wirksame immunschützende Reaktion gegen irgendeinen Stamm von PRRS-Viren auslösen, einschließlich sowohl der Europäischen als auch der Nord-Amerikanischen Stämme.
In einer Ausführungsform sind die Mutation oder Mutationen in dem isolierten Polynucleotid-Molekül, das das genetisch gehinderte Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, nicht still und treten in einem oder mehreren offenen Leserastern der Nucleotidsequenz auf, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert; d. h., die Mutation oder Mutationen treten in einer oder mehreren der Sequenzen in der Nucleotidsequenz auf, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, die die gleichen wie die ORFs 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 der SEQ ID Nr: 1 sind. In einer anderen Ausführungsform treten die Mutation oder Mutationen in einem oder mehreren nichtcodierenden Bereichen des Nord-Amerikanischen PRRS-Virusgenoms, wie zum Beispiel in der Leader-Sequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virusgenoms auf; d. h., die Mutation oder Mutationen treten in der Sequenz auf, die die gleiche ist wie die Sequenz der Nucleotide 1–191 von SEQ ID Nr: 1. In demselben isolierten Polynucleotid- Molekül können Mutationen sowohl in codierenden als auch nichtcodierenden Bereichen auftreten.
Wie hierin verwendet, sofern nicht etwas anderes angegeben ist, beziehen sich „nichtcodierende Bereiche" der Nucleotidsequenz, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, auf die RNA-Sequenzen, die nicht in ein Protein translatiert wurden und die cDNA-Sequenzen, die solche RNA-Sequenzen codieren. Codierende Bereiche beziehen sich auf die RNA-Sequenzen, aus denen Nord-Amerikanische PRRS-Virusproteine exprimiert werden, und ebenso auf cDNA, die solche RNA-Sequenzen codiert. Dem ähnlich beziehen sich „ORFs" sowohl auf RNA-Sequenzen, die Nord-Amerikanische PRRS-Virusproteine codieren, als auch auf eine cDNA-Sequenz, die solche RNA-Sequenzen codiert.
Die Bestimmung geeigneter Stellen für eine Mutation oder Mutationen, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren werden, das genetisch so gehindert ist, das es kein PRRS erzeugen kann, aber trotz allem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen kann, kann basierend auf der darin bereitgestellten SEQ ID Nr: 1 vorgenommen werden. Ein Fachmann kann die Sequenz des infektiösen cDNA-Klons des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, das in dieser Erfindung geliefert wird, zuordnen, Sequenzveränderungen vornehmen, die zu einer Mutation führen werden, und die Viren, die so codiert wurden, sowohl auf ihre Fähigkeit, PRRS in einem Schwein hervorzurufen, als auch eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auszulösen, testen. So kann ein Fachmann Techniken, die in der Technik bekannt sind und auch die, die hierin beschrieben und/oder exemplarisch dargestellt werden, einsetzen.
Beispielsweise kann ein ORF der Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, mutiert und das resultierende genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, auf seine Fähigkeit, PRRS hervorzurufen, getestet werden. Das ORF eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus codiert Proteine wie folgt: ORF 1a codiert ein Polyprotein, umfassend eine Proteasefunktion; ORF 1b codiert ein Polyprotein, umfassend Replikase- (RNA-Polymerase) und Helikasefunktionen; ORFs 2, 3 und 4 codieren kleine Membranglycoproteine; ORF 5 codiert ein Haupthüllglykoprotein; ORF 6 codiert ein nicht glycosyliertes integrales Membranprotein; und ORF 7 codiert ein Nucleokapsidprotein. Genetische Mutationen eines oder mehrerer dieser ORFs können bei der Herstellung gene tisch modifizierter Nord-Amerikanischer PRRS-Viren, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, das es ein oder mehrere heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID NR. 1 ist, und ferner eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein heterologes antigenes Epitop codieren, und wobei jedes heterologe antigene Epitop eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein bestimmtes Pathogen in einem Säuger oder einem Vogel induzieren kann.
Ein Pathogen, gegen das eine wirksame immunschützende Reaktion mittels des oben zitierten Aspektes der vorliegenden Erfindung induziert werden kann, ist irgendein Pathogen, wie ein Virus, Bakterium, Pilz oder Protozoon, das eine Krankheit bei einem Säuger oder einem Vogel hervorrufen kann, wobei das Pathogen damit in Verbindung stehend ein oder mehrere antigene Epitope umfaßt oder aufweist, die zur Induzierung einer wirksamen immunschützenden Reaktion gegen das Pathogen in dem Säuger oder Vogel verwendet werden können.
Der Ausdruck „heterologes antigenes Epitop" bedeutet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein antigenes Epitop, wie oben definiert, das normalerweise nicht in einem Nord-Amerikanischen PRRS-Wildtyp-Virus zu finden ist. Eine Nucleotidsequenz, die ein heterologes antigenes Epitop codiert, kann in ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virusgenom unter Verwendung bekannter Rekombinantionstechniken eingeführt werden. Antigene Epitope, die als heterologe antigene Epitope der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen weitere antigene Epitope des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, antigene Epitope aus Europäischen PRRS-Viren, andere antigene Epitope aus Schweinepathogenen als die PRRS-Viren, oder antigene Epitope aus Pathogenen, die außer einem Schwein auch Vögel oder Säuger pathogen infizieren, einschließlich Menschen. Sequenzen, die solche antigenen Epitope codieren, sind in der Technik bekannt oder werden hierin bereitgestellt. Beispielsweise kann das zweite Nord-Amerikanische PRRS-Virus-Hüllprotein, das durch das ORF 5 des Nord-Amerikanischen PRRS codiert wird, hierin beschrieben, in eine DNA-Sequenz, die ein RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung co diert, zur Erzeugung eines genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus eingeführt werden, das ein zusätzliches Hüllprotein als ein heterologes antigenes Epitop umfaßt. Solch ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus kann zur Induzierung einer wirksameren immunschützenden Reaktion gegen PRRS-Viren in einem vom Schwein stammenden Tier, das damit geimpft wurde, verwendet werden.
Beispiele für ein anderes antigenes Epitop aus einem Schweinepathogen als ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, ein antigenes Epitop aus einem Schweinepathogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Europäischen PRRS, dem Schweineparvovirus, dem Schweinecircovirus, dem Schweinerotavirus, der Schweinegrippe, dem Pseudorabies-Virus, dem übertragbaren Gastroenteritisvirus, Schweine-Atemwegscoronavirus, dem klassischen Schweinefiebervirus, dem afrikanischen Schweinefiebervirus, Enzephalomyokarditisvirus, Schweineparamyxovirus, Actinobacillus pleuropneumoni, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis und Streptococcus suis. Nucleotidsequenzen, die antigene Epitope aus den zuvor genannten Schweinepathogenen codieren, sind in der Technik bekannt und können aus öffentlichen Gendatenbanken wie der GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html), bereitgestellt von NCBI, erhalten werden.
Wenn die heterologen antigenen Epitope antigene Epitope aus einem oder mehreren anderen Schweinepathogenen sind, dann kann das isolierte Polynucleotid-Molekül ferner eine oder mehrere Mutationen enthalten, die das codierte PRRS-Virus genetisch an seiner Fähigkeit, PRRS zu erzeugen, hindern. Solche isolierten Polynucleotid-Moleküle und die Viren, die sie codieren, sind zur Herstellung von Impfstoffen zum Schutz eines Schweins gegen das Schweinepathogen oder Pathogene, aus denen heterologe antigene Epitope stammen, verwendbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus in einem vom Schwein stammenden Tier auslösen. Solche isolierten Polynucleotid-Moleküle und die Viren, die sie codierend, sind zur Herstellung von Impfstoffen mit einer Doppelfunktion zum Schutz eines Schweins vor der Infektion durch sowohl ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus als auch das Schweinepathogen oder Pathogene, aus denen heterologe antigene Epitope stammen, verwendbar. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das in einem Impfstoff mit Doppelfunktion verwendbar ist, genetisch gehindert.
Die isolierten Polynucleotid-Moleküle der vorliegenden Erfindung, die Nucleotid-Sequenzen umfassen, die heterologe antigene Epitope codieren, können wie oben beschrieben, basierend auf der Sequenz, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, hierin beschrieben, codiert, unter Verwendung von Techniken, die in der Molekularbiologie bekannt sind, hergestellt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein heterologes antigenes Epitop des genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung ein detektierbares antigenes Epitop. Solche isolierten Polynucleotid-Moleküle und die Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, die sie codieren, sind unter anderem für das Studium von PRRS-Infektionen bei einem Schwein, zur Bestimmung erfolgreich geimpfter Schweine und/oder zur Unterscheidung geimpfter Schweine von Schweinen, die durch ein PRRS-Wildtyp-Virus infiziert sind, nützlich. Bevorzugt enthalten solche isolierten Polynucleotid-Moleküle ferner eine oder mehrere Mutationen, die das codierte PRRS-Virus genetisch an seiner Fähigkeit hindern, PRRS zu erzeugen, und sind noch stärker bevorzugt fähig, eine wirksame immunschützende Reaktion in einem vom Schwein stammenden Tier gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auszulösen.
Heterologe antigene Epitope, die detektierbar sind, und die Sequenzen, die diese codieren, sind in der Technik bekannt. Techniken zur Detektierung solcher antigener Epitope sind in der Technik auch bekannt, und umfassen serologische Detektion von Antikörpern, die für das heterologe antigene Epitop spezifisch sind, mittels beispielsweise Western-Blot, ELISA oder fluoreszierend markierter Antikörper, die an die Antikörper, die für das heterologe antigene Epitop spezifisch sind, binden können. Techniken zur serologischen Detektion, die zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind in Texten, die in der Technik anerkannt sind, zu finden, wie Coligan, J. E., et al. (eds), 1998, Current Protocols in Immunology, John Willey & Sons, Inc.. Alternativ kann das heterologe antigene Epitop selbst beispielsweise durch das Kontaktieren von Proben, die potentiell das antigene Epitop umfassen, mit fluoreszierend markierten Antikörpern oder radioaktiv markierten Antikörpern, die spezifisch an antigene Epitope binden, detektiert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, dem es detektierbar an einem antigenen Epitop des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus mangelt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID Nr: 1 ist, außer, daß es ihm an einer oder mehreren Nucleotidsequenzen mangelt, die ein detektierbares antigenes Epitop des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus codieren. Solche isolierten Polynucleotid-Moleküle sind zur Unterscheidung zwischen einem Schwein, das mit einem rekombinanten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung infiziert ist, und einem Schwein, das mit einem PRRS-Wildtyp-Virus infiziert ist, nützlich. Beispielsweise können Tiere, die mit einem getöteten, lebenden oder abgeschwächten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, codiert durch ein solches isoliertes Polynucleotid-Molekül, geimpft wurden, von Tieren, die mit dem PRRS-Wildtyp geimpft wurden, basierend auf der Abwesenheit von Antikörpern, die für das fehlende antigene Epitop spezifisch sind, oder basierend auf der Abwesenheit des antigenen Epitops selbst, unterschieden werden: Wenn Antikörper, die für das fehlende antigene Epitop spezifisch sind, oder wenn das antigene Epitop selbst in einem Tier detektiert werden, dann war das Tier einem PRRS-Wildtyp-Virus ausgesetzt und damit infiziert. Mittel zur Detektion antigener Epitope und Antikörper, die dafür spezifisch sind, sind in der Technik bekannt, wie oben erörtert. Bevorzugt enthält ein solches isoliertes Polynucleotid-Molekül ferner eine oder mehrere Mutationen, die das codierte PRRS-Virus genetisch an seiner Fähigkeit hindern, PRRS zu erzeugen. Stärker bevorzugt kann das codierte Virus weiterhin eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen.
B. Plasmide, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus oder ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren:
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso irgendeines der oben beschriebenen isolierten Polynucleotid-Moleküle in Form eines Plasmids, das das so codierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren kann.
Plasmide der vorliegenden Erfindung können das codierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus außerhalb eines lebenden Organismus exprimieren, um Nord-Amerikanische PRRS-Viren der Erfindung zu erzeugen, die unter anderem zur Herstellung von Impfstoffen nützlich sind. In einer Ausführungsform ist ein Plasmid der vorliegenden Erfindung, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus außerhalb eines lebenden Organismus exprimieren kann, ein Plasmid, in dem die Transkription viraler RNA daraus in vitro (d. h. extrazellulär) auftritt; das resultierende virale RNA-Molekül wird unter Verwendung bekannter Transfektionsmechanismen wie Elektroporation, Lipofektion (in einigen Fällen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reagens wie Lipofectin^® (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA)), oder DEAE-Dextran vermittelter Transfektion in eine geeignete Wirtszelle transfiziert. Andere Verfahren zur Transfektion sind in der Technik bekannt und können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein solches Plasmid für die in vitro-Transkription viraler RNA des Nord-Amerikanischen PRRS ist das Plasmid pT7P129A (ATCC Accession Nr. 203488). Es kann irgendein Promotor, der für die in vitro-Transkription nützlich ist, in solchen Plasmiden dieser Erfindung verwendet werden. T7 ist ein solcher Promotor, es können aber auch andere Promotor wie ein SP6-Promotor oder ein T3-Promotor verwendet werden. Die Sequenzen solcher Promotor können künstlich synthetisiert oder aus kommerziell erhältlichen Plasmiden geklont werden. Geeignete Plasmide für die Herstellung solcher Plasmide, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Klon-Vektor-Plasmide für allgemeine Zwecke wie pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), pBR322 und pUC18. Eine Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, kann in irgendeines dieser Plasmide unter Verwendung bekannter Rekombinationstechniken eingeführt werden. Andere Plasmide, in die die Polynucleotid-Moleküle der vorliegenden Erfindung eingeführt werden können, werden einem Fachmann ersichtlich sein.
Geeignete Bedingungen für die in vitro-Transkription viraler RNA aus irgendeinem der oben beschriebenen rekombinanten Plasmide, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, hängen von der Art des Plasmids ab, zum Beispiel seinem speziellen Promotor, und können von einem Fachmann festgestellt werden. Wenn beispielsweise ein Plasmid der vorliegenden Erfindung auf einem pCR2.1-Plasmid basiert, das einen T7-Promotor umfaßt, dann umfaßt ein Beispiel für geeignete Bedingungen für die in vitro-Transkription die Reaktion des Plasmids mit T7 RNA-Polymerase und Ribonucleotiden in einem Standardpuffer und die Inkubation der Reaktion bei 37°C für etwa 30 Minuten. In einigen Fällen sind kommerzielle Kits für die Transkribtion von RNA aus einem bestimmten Plasmid erhältlich, und solche Kits können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Reaktiongemisch kann nach der Transkription direkt ohne Reinigung in eine geeignete Wirtszelle transfiziert werden oder die RNA des transkribierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus unter Verwendung bekannter RNA-Reinigungstechniken, zum Beispiel durch organische (z. B. Phenol) Extraktion und Alkoholausfällung (z. B. Ethanol oder Isopropanol) vor der Transfektion gereinigt werden.
In der Praxis kann irgendeine vom Säuger oder Vogel stammende Zellkultur mit der RNA des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, erhalten wie oben beschrieben, transfiziert werden, um eine erste Reihe Nord-Amerikanischer PRRS-Virions zu erzeugen. Ein Beispiel für Zellen, die wegen ihrer Fertigverfügbarkeit und leichten Verwendung besonders nützlich sind, sind BHK-Zellen (Baby-Hamsternierenzellen). Wenn man jedoch eine Zellkultur erzeugen möchte, die anhaltend Nord-Amerikanische PRRS-Virions erzeugen kann, dann sind Schweine-Alveolarmakrophagenzellen oder MARC-145-Zellen (Kim, H. S., et al., supra) bevorzugt, da diese Zellen nach der PRRS-Virus-Infektion hohe Niveaus an PRRS-Virions der neunen Generation absondern. Andere Zellinien, die aus der MA-104-Zellinie stammen, können für eine anhaltende Erzeugung von Nord-Amerikanischen PRRS-Virions der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Primäre Schweine-Alveolarmakrophagenzellen können durch Lungenspülungen von Schweinen erhalten werden und die MARC-145-Affennierenzellinie ist von den National Veterinary Services Laboratoriesm auch bekannt als NVSL (Ames, Iowa, USA) erhältlich.
In einer anderen Ausführungsform ist ein Plasmid, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung außerhalb eines lebenden Organismus exprimieren kann, ein Plasmid, das beispielsweise durch Elektroporation oder Lipofektion, Transkription des infektiösen RNA-Moleküls und Expression des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus daraus, das in der transfizierten Wirtszelle vorkommt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert wurde. Die transfitierte Wirtszelle erzeugt daher Nord-Amerikanische PRRS-Virions. Solch ein komplett zelluläres Verfahren ist daher noch nie offenbart oder für irgendein Virus in der Ordnung von Nidovirales vorgeschlagen worden. Wegen möglicher verborgener RNA-Spleiß- und Terminationssequenzen, die in dem RNA-Genom von Viren von Nidovirales vorhanden sind, wurde angenommen, daß ein komplett zelluläres Verfahren zur Expression eines Nidovirales-Virus unwahrscheinlich ist. Verborgene Sequenzen umfassen RNA-Spleißdonor- und Spleißakzeptorsequenzen, die unangemessenes Spleißen des RNA-Transkriptes verursachen können, sowie Polyadenylierungssequenzen, die den vorzeitigen Abbruch durch die zelluläre RNA-Polymerase II verursachen können. Die vorliegende Erfindung demonstriert jedoch, daß die Gegenwart solcher Sequenzen in einem Plasmid, das einen cDNA-Klon eines Nidovirus umfaßt, das Plasmid nicht an seiner Fähigkeit hindert, das Nidovirus zu exprimieren, wenn das Plasmid direkt in eine geeignete Wirtszelle transfiziert wird.
Geeignete Plasmide, die zur Herstellung rekombinanter Plasmide der vorliegenden Erfindung für eine komplette zelluläre Expression außerhalb eines lebenden Organismus eines Nidovirales-Virus, wie eines PRRS-Virus verwendet werden können, umfassen so gut wie alle Plasmide, die zur Transfektion und Expression in eukaryotischen Zellen nützlich sind. Ein Beispiel für ein Plasmid, das zur Herstellung rekombinanter Plasmide der vorliegenden Erfindung für die komplette zelluläre Expression eines Nidovirales-Virus geeignet ist, ist das Plasmid pCMVbeta (Clontech, Palo Alto, California, USA). Andere Plasmide, die Gene in eukaryotischen Zellen, die zur Herstellung von Plasmiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, transfizieren und exprimieren können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, pcDNA3.1, pRc/RSV und pZeoSV2 (alle von Invitrogen); und pCMV-Sport3 und pSV-Sport1 (beide von Life Technologies Inc.). In der vorliegenden Erfindung wird jedoch fast jeder eukaryotische Expressionsvektor funktionieren. Konstrukte, die auf Cosmiden basieren, können für die komplette zelluläre ex vivo-Expression eines Nidovirales-Virus auch verwendet werden.
Geeignete Wirtszellen für das komplett zelluläre Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Expression des PRRS-Virus umfassen Schweine-Alveolarmakrophagenzellen und die MARC-145-Zellen, oben beschrieben. Verfahren zur Transfektion dieser Zellen mit einem Plasmid sind im Grunde die gleichen wie die Verfahren zur Transfektion von Zellen mit viraler RNA, oben beschrieben. Solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Elek troporation, Lipofektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion und Calciumphosphatcoausfällung.
Sind Wirtszellen, wie Schweine-Alveolarmakrophagenzellen oder MARC-145-Zellen, gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert worden, entweder mit viraler RNA oder mit einem Plasmid, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die ein Virus codiert, dann können die Zellen bei etwa –80°C oder darunter für die Lagerung für mehrere Jahre eingefroren werden. Für längere Zeiträume, das heißt, Dekaden, ist die Lagerung in flüssigem Stickstoff bevorzugt. Soll das codierte Virus relativ häufig genutzt werden, dann können Zellen, die einem Virus als Wirt dienen, unter Verwendung bekannter Techniken für kürzere Zeiträume auch (ungefroren) in Kultur gehalten werden. Überdies können virale Teilchen, die von solchen Zellen abgesondert werden, gefroren bei etwa –80°C oder darunter als eine Virusquelle gelagert werden. Die Transfektion solcher Zellinien mit dem Polynucleotid-Molekül, das das Virus codiert, kann je nach Bedarf beispielsweise durch das Testen von verbrauchtem Medium, das von der Zellinie für ein PRRS-Virusantigen abgesondert wird, unter Verwendung eines Immunofluoreszenz-Antikörpertests bestätigt werden. Antikörper, die für PRRS-Virusantigene spezifisch sind, sind in der Technik bekannt (siehe z. B. Collins, E. J., et al., WO 93/03760, 4. März 1993).
In einer anderen Ausführungsform ist ein Plasmid der vorliegenden Erfindung, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, für die in vivo-Expression des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus geeignet, d. h. die Expression in einem lebenden Organismus. Plasmide, die zur Herstellung rekombinanter Plasmide für die in vivo-Expression eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus geeignet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Plasmide, die die oben beschriebenen eukaryotischen Zellen wie pCMVbeta transfizieren können.
Tiere, die mit Plasmiden der vorliegenden Erfindung transfiziert werden können, umfassen Säugetiere und Vögel. Wenn, das Tier ein anderes als ein vom Schwein stammendes ist, zum Beispiel eine Stockente, dann kann das Plasmid eine Nucleotidsequenz umfassen, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das ferner antigene Epitope aus Pathogenen umfaßt, die das Tier pathogen infizieren können; in einem solchen Fall wird das Plasmid ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren, das als ein Vektor zum Transport von Epitopen in das Tier dient. Wenn das Tier ein vom Schwein stammendes Tier ist, dann kann das Plas mid nützlicherweise irgendein hierin beschriebenes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren, einschließlich die genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, die hierin beschrieben werden.
C. Virale Vektoren, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren, einschließlich virale Vektoren, die genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Viren codieren:
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso virale Vektoren, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codieren, das irgendeines der hierin beschriebenen Nord-Amerikanischen PRRS-Viren codiert, einschließlich die hierin beschriebenen genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren. Solche viralen Vektoren sind für die Transfektion eukaryotischer Zellen zur Produktion von PRRS-Viren der vorliegenden Erfindung außerhalb eines lebenden Organismus oder zur Transfektion von Schweinen oder anderen Säugetieren oder Vögeln mit der Sequenz, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, für die in vivo-Expression des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus darin, nützlich.
Einige Beispiele für Viren, die als Vektoren zur Herstellung der viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Schweineviren wie das Schweinpockenvirus, das Pseudorabies-Virus oder das Afrikanische Schweinfiebervirus. Solche Schweinviren sind von The National Veterinary Services Laboratories (Ames, Iowa, USA) des United States Department of Agriculture; the American Type Culture Collection, auch bekannt als ATCC (Manassas, Virginia, USA); und anderen bekannten Quellen erhältlich. Rekombinante virale Vektoren, die auf geeigneten Schweineviren wie den zuvor genannten Schweineviren basieren, sind zur Transfektion von Schweinen mit einer Nucleotidsequenz, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung codiert, nützlich.
Virale Vektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein infektiöses RNA-Molekül codieren, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung codiert, basierend auf diesen und anderen Viren, kann unter Verwendung bekannter Rekombinationstechniken, die in Texten wie denen, die zuvor in dieser Anmeldung zitiert wurden, beschrieben werden.
D. Transfizierte Wirtszellen, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus oder ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren:
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso transfizierte Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein infektiöses RNA-Molekül codieren, das irgendeines der hierin beschriebenen Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, einschließlich der hierin beschriebenen genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, codiert, wobei die transfizierten Wirtszellen das Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren können. Solche transfizierten Wirtszellen sind zur Produktion Nord-Amerikanischer PRRS-Viren der vorliegenden Erfindung nützlich. Beispiele transfizierter Wirtszellen der vorliegenden Erfindung umfassen die transfizierten Schweine-Alveolarmakrophagenzellen und die transfizierten MARC-145-Zellen, die oben beschrieben wurden.
Andere transfizierte Wirtszellen der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, transfizierte MA-104-Zellen und andere Derivate von MA-104-Zellen, die transfiziert sind; transfizierte Baby-Hamsternieren-Zellen (BHK-Zellen); transfizierte Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen); und andere African Green Monkey-Nierenzellen (AGMK-Zellen) als MA-104-Zellen oder MARC-145-Zellen wie VERO-Zellen; die transfiziert sind.
E. Nord-Amerikanische PRRS-Viren, einschließlich genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Viren:
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso Nord-Amerikanische PRRS-Viren, wie hierin beschrieben, einschließlich genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Viren wie hierin beschrieben, die durch irgendeines der oben beschriebenen isolierten Polynucleotid-Moleküle, RNA-Moleküle, Plasmide, viralen Vektoren oder transfizierten Wirtszellen exprimiert und/oder codiert werden.
In bestimmten Situationen, zum Beispiel wo das Nord-Amerikanische PRRS-Virus in einem Impfstoff für Schweine genutzt werden soll und das Nord-Amerikanische PRRS-Virus nicht genetisch modifiziert worden ist, wie oben beschrieben, damit es kein PRRS erzeugt, wird das Nord-Amerikanische PRRS-Virus bevorzugt beispielsweise durch seine Inaktivierung oder Abschwächung behandelt, damit es in dem Schwein, dem es verabreicht wird, kein PRRS erzeugt. Zur Inaktivierung eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung können bekannte Verfahren verwendet werden, so das es kein PRRS in einem Tier erzeugen kann. Beispiele für solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Behandlung mit Formaldehyd, BEI (binärem Ethylenimin) oder BPL (beta-Propiolacton).
Verfahren zur Abschwächung sind auch in der Technik bekannt, und solche Verfahren können zur Abschwächung eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch serielle Passage in Zellkultur abgeschwächt werden.
Wenn ein Nord-Amerikanischer PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung in einem anderen Tier als einem vom Schwein stammenden Tier verwendet werden soll, oder wenn es wie hierin beschrieben genetisch so modifiziert worden ist, das es kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, dann ist es nicht erforderlich, das Virus wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben, vor seiner Verwendung in einem Impfstoff zu behandeln.
F. Impfstoffe und deren Verwendungen:
Die vorliegende Erfindung liefert auch Impfstoffe, umfassend Nord-Amerikanische PRRS-Viren, einschließlich die hierin beschriebenen genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren, die in einem Schwein kein PRRS erzeugen können; infektiöse RNA-Moleküle und Plasmide, die solche Nord-Amerikanischen PRRS-Viren codieren, wie hierin beschrieben, und virale Vektoren, die solche Nord-Amerikanischen PRRS-Viren und isolierte RNA-Moleküle wie hierin beschrieben, codieren. Die Erfindung liefert ebenso Verfahren zum Schutz von Tieren vor der Infektion, umfassend die Impfung mit solchen Impfstoffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung einen Impfstoff, umfassend ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, umfassend ein oder mehrere heterologoe antigene Epitope, wie hierin beschrieben, ein infektiöses RNA-Molekül, das solch ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, oder ein Plasmid, wie hierin beschrieben, das solch ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, in einer Menge, die wirksam eine immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch das Pathogen oder die Pathogene, aus denen das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop(e) stammen, auslösen kann, und einen Träger, der für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung akzeptabel ist.
Solche Impfstoffe können zum Schutz vor einer Infektion eines Säugers oder eines Vogels, der durch das Pathogen oder die Pathogene, aus denen das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop(e) stammen, pathogen infiziert werden kann, verwendet werden. Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Schutz eines Säugers oder eines Vogels vor einer Infektion durch ein Pathogen, das die Impfung des Säugers oder des Vogels mit einer Menge des Impfstoffes, beschrieben in dem vorhergehenden Absatz, umfaßt, die wirksam eine immunschützende Reaktion in dem Säuger oder dem Vogel vor der Infektion durch das Pathogen auslöst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus oder ein infektiöses RNA-Molekül oder ein Plasmid, das ein solches genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das ein oder mehrere heterologe antigene Epitope aus einem anderen Schweinepathogen als einem Nord-Amerikanischen PRRS-Virus umfaßt oder codiert. Diese Impfstoffe sind zum Schutz eines Schweins vor einer Infektion durch das Schweinepathogen oder -pathogene, aus denen das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop(e) stammen, nützlich. Wenn solch ein Impfstoff das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus umfaßt, kann das Virus durch die genetische Modifikation des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus bevorzugt kein PRRS in dem Schwein erzeugen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus in dem Impfstoff eine immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen, wodurch ein Impfstoff mit Doppelfunktion für das Schwein bereitgestellt wird, der das Schwein vor einer Infektion durch das Schweinepathogen oder -pathogene, aus denen das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop(e) stammen, sowie vor der Infektion durch ein PRRS-Virus schützt. Wenn der Impfstoff ein infektiöses RNA-Molekül oder ein Plasmid umfaßt, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, umfassend ein oder mehrere heterologe antigene Epitope aus einem anderen Schweinepathogen, dann umfaßt die Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das genetisch modifizierte PRRS-Virus codiert, bevorzugt eine oder mehrere weitere Mutationen, die das codierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus genetisch daran hindern, PRRS zu erzeugen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das codierte genetisch modifizierte, gehinderte Nord-Amerikanische PRRS-Virus eine immunschützende Reaktion gegen eine PRRS-Infektion in einem Schwein auslösen, wodurch ein Dual-Impfstoff für ein Schwein bereitgestellt wird, der Schweine vor einer Infektion durch ein Schweinepathogen oder -pathogene, aus denen das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop(e) stammen, sowie vor einer Infektion durch ein PRRS-Virus schützen kann. Alle diese Impfstoffe umfassen ferner einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können gemäß anerkannter Grundsätze formuliert werden und umfassen akzeptable Träger für Tiere, einschließlich Menschen (sofern anwendbar), wie Standardpuffer, Stabilisatoren, Verdünnungsmittel, Konservierungsstoffe und/oder Löslichmacher, und können auch so formuliert werden, das sie eine nachhaltige Freisetzung erleichtern. Verdünnungsmittel umfassen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Ethanol, Glycerol und dergleichen. Zusatzstoffe für Isotonizität umfassen unter anderem Natriumchlorid, Dextrose, Mannitol, Sorbitol und Lactose. Stabilisatoren umfassen unter anderem Albumin. Andere geeignete Impfstoffvehikel und -zusatzstoffe, einschließlich derer, die besonders bei der Formulierung modifizierter Lebend-Impfstoffe nützlich sind, sind bekannt oder werden einem Fachmann ersichtlich sein. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Science, 18. Auflage, 1990, Mack Publishing.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ferner unter anderem eine oder mehrere zusätzliche immunmodulatorische Komponenten umfassen, wie z. B. ein Hilfsmittel oder ein Zytokin. Nicht einschränkende Beispiele für Hilfsmittel, die in dem Impfstoff der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen das RIBI-Hilfsmittelsystem (Ribi Inc., Hamilton, MT), Alum, Mineralgele wie Aluminumhydroxidgel, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen wie z. B. Freund's komplette und unkomplette Hilfsmittel, Blockcopolymer (CytRx, Atlanta GA), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), AMPHIGEN^®-Hilfsmittel, Saponin, Quil A oder eine andere Saponinfraktion, Monophosphoryllipid A und Avridinlipid-Amin-Hilfsmittel. Nicht einschränkende Beispiele für Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in dem Impfstoff der Erfindung nützlich sind, umfassen modifizierte SEAM62- und SEAM ½-Formulierungen. Modifiziertes SEAM62 ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die 5% (V/V) Squalen (Sigma), 1% (V/V) SPAN^® 85 Detergens (ICI Surfactants), 0,7% (V/V) TWEEN^® 80 Detergens (ICI Surfactants), 2,5% (V/V) Ethanol, 200 μg/ml Quil A, 100 μg/ml Cholesterol und 0,5% (V/V) Lezithin enthält. Modifiziertes SEAM 1/2 ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die 5% (V/V) Squalen, 1% (V/V) SPAN^® 85 Detergens, 0,7% (V/V) Tween 80-Detergens, 2,5% (V/V) Ethanol, 100 μg/ml Quil A und 50 μg/ml Cholesterol umfaßt. Andere immunmodulatorische Mittel, die in dem Impfstoff enthalten sein können, umfassen zum Beispiel eines oder mehrere Interleukine, Interferone oder andere bekannte Zytokine.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls für eine nachhaltige Freisetzung des Virus, des infektiösen RNA-Moleküls, des Plasmids oder des viralen Vektors der vorliegenden Erfindung formuliert werden. Beispiele für solche nachhaltig freisetzenden Formulierungen umfassen das Virus, das infektiöse RNA-Molekül, das Plasmid oder den viralen Vektor in Kombination mit Kompositen aus biokompatiblen Polymeren wie zum Beispiel Poly(milchsäure), Poly(milch-co-glykolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure, Kollagen und dergleichen. Eine Übersicht der Struktur, Auswahl und Verwendung abbaubarer Polymere in Medikamentenverabreichungsvehikeln ist in mehreren Veröffentlichungen zu finden, einschließlich A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279–292, das hierin durch Verweis aufgenommen ist. Ein zusätzlicher Überblick über die Auswahl und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen Formulierungen ist in den Texten, die in der Technik bekannt sind, zu finden, zum Beispiel in M. Chasin und R. Langer (Ed.), 1990, „Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Bd. 45, M. Dekker, NY. Alternativ oder zusätzlich können das Virus, das Plasmid oder der virale Vektor mikroeingekapselt werden, um die Verabreichung und Effizienz zu verbessern. Verfahren zur Mikroeinkapselung von Antigenen sind in der Technik allgemein bekannt und umfassen Techniken, die z. B. in US-Patent 3,137,631; US-Patent 3,959,457; US-Patent 4,205,060; US-Patent 4,606,940; US-Patent 4,744,933; US-Patent 5,132,117 und der internationalen Patentveröffentlichung WO 95/28227 beschrieben werden.
Liposome können für die nachhaltige Freisetzung des Virus, des Plasmids oder des viralen Vektors auch verwendet werden. Details, die die Herstellung und Verwendung liposomaler Formulierungen betreffen, sind unter anderem in US-Patent 4,016,100; US-Patent 4,452,747; US-Patent 4,921,706; US-Patent 4,927,637; US-Patent 4,944,948; US-Patent 5,008,050 und US-Patent 5,009,956 zu finden.
Eine wirksame Menge eines der oben beschriebenen Impfstoffe kann durch herkömmliche Mittel, ausgehend von einer geringen Dosis an Virus, Plasmid oder viralem Vektor, und dann Erhöhung der Dosis unter Aufzeichnung der Wirkungen, bestimmt werden. Eine wirksame Menge kann nach einer einzelnen Verabreichung eines Impfstoffes oder nach mehreren Verabreichungen eines Impfstoffes erhalten werden. Bei der Bestimmung einer optimalen Dosis pro Tier können bekannte Faktoren in Betracht gezogen werden. Diese umfassen die Spezies, die Größe, das Alter und den Allgemeinzustand des Tiers, die Gegenwart anderer Medika mente in dem Tier und dergleichen. Die tatsächliche Dosis wird bevorzugt nach der Betrachtung der Ergebnisse aus anderen Tierstudien ausgewählt.
Ein Verfahren zur Detektion, ob eine adäquate Immunreaktion erreicht worden ist, ist die Bestimmung der Serokonversion und Antikörpertiter in dem Tier nach der Impfung. Der Zeitpunkt der Impfung und die Anzahl der Auffrischungen, sofern vorhanden, werden bevorzugt durch einen Arzt oder Veterinär, basierend auf der Analyse aller relevanten Faktoren, von denen einige oben beschrieben wurden, bestimmt.
Die wirksame Dosiermenge an Virus, infektiösem RNA-Molekül, Plasmid oder viralem Vektor der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung bekannter Techniken bestimmt werden, die Faktoren berücksichtigen, die durch einen Fachmann bestimmt werden können, wie das Gewicht des zu impfenden Tiers. Die Dosiermenge an Virus der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt bevorzugt im Bereich von etwa 10¹ bis etwa 10⁹ pfu (Plaque-bildenden Einheiten), stärker bevorzugt etwa 10² bis etwa 10⁸ pfu und am stärksten bevorzugt etwa 10³ bis etwa 10⁷ pfu. Die Dosiermenge eines Plasmids der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 μg bis etwa 100 mg, stärker bevorzugt etwa 1 μg bis etwa 10 mg, noch stärker bevorzugt etwa 10 μg bis etwa 1 mg. Die Dosiermenge eines infektiösen RNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt bevorzugt im Bereich von etwa 0,1 μg bis etwa 100 mg, stärker bevorzugt etwa 1 μg bis etwa 10 mg, noch stärker bevorzugt etwa 10 μg bis etwa 1 mg. Die Dosiermenge eines viralen Vektors der vorliegenden Erfindung in einem Impfstoff der vorliegenden Erfindung liegt bevorzugt im Bereich von etwa 10¹ bis etwa 10⁹ pfu, stärker bevorzugt etwa 10² bis etwa 10⁸ pfu und am stärksten bevorzugt etwa 10³ bis etwa 10⁷ pfu. Eine geeignete Dosierungsgröße liegt im Bereich von etwa 0,5 ml bis etwa 10 ml und stärker bevorzugt etwa 1 ml bis etwa 5 ml.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, umfassend ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, ein infektiöses RNA-Molekül, ein Plasmid oder einen viralen Vektor, hierin beschrieben, wobei das Verfahren das Kombinieren einer wirksamen Menge eines von dem Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, dem infektiösen RNA- Molekül, dem Plasmid oder dem viralen Vektor der vorliegenden Erfindung, mit einem Träger für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung.
Es sollte selbstverständlich sein, das „Nord-Amerikanische PRRS-Viren der vorliegenden Erfindung" und ähnliche Ausdrücke, sofern nicht anders angegeben, irgendeines der hierin beschriebenen genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Viren sowie das hierin beschriebene nicht modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, codiert durch SEQ ID Nr: 1, umfassen.
G. Isolierte Polynucleotid-Moleküle und transfizierte Wirtszellen, die Nord-Amerikanische PRRS-Viruspeptide codieren, und Verfahren zur Herstellung funktionaler Nord-Amerikanischer PRRS-Virions:
Die vorliegende Erfindung liefert ebenso ein isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, worin die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche ist, wie die des RNA-Moleküls, die SEQ ID Nr: 1 entspricht. Wie hierin verwendet, bedeuten Ausdrücke wie „Nord-Amerikanisches PRRS-Viruspeptid" ein Peptid, das durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus exprimiert wird. Solch ein Peptid kann für Nord-Amerikanische PRRS-Viren spezifisch sein, dies ist aber nicht notwendig.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein isoliertes Polynucleotid-Molekül der vorliegenden Erfindung, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Viruspeptid codiert, eine Sequenz oder Sequenzen, die unabhängig voneinander aus SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3, SEQ ID Nr: 4, SEQ ID Nr: 5, SEQ ID Nr: 6, SEQ ID Nr: 7, SEQ ID Nr: 8, SEQ ID Nr: 9 ausgewählt sind. Solche isolierten Polynucleotid-Moleküle sind in Plasmiden oder zur Herstellung viraler Vektoren für die Transfektion einer geeigneten Wirtszelle zur Erzeugung einer „Helfer"-Zelle, die eine oder mehrere Nucleotidsequenzen umfaßt, die ein Peptid codieren, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, nützlich, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche wie eine RNA-Sequenz, die SEQ ID Nr: 1 ist, entspricht, wobei die Helferzelle bei der Herstellung funktionaler Virions genetisch modifizierter Nord-Amerikanischer PRRS-Viren der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, wobei die Viren wie oben beschrieben genetisch so modifiziert wurden, das es ihnen an der/den RNA- Genomsequenz(en) mangelt, die das Peptid oder die Peptide, codiert durch die Helferzelle, codieren.
Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung auch Plasmide und virale Vektoren, die eine oder mehrere Nucleotidsequenzen umfassen, die ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche RNA-Sequenz, die SEQ ID Nr: 1 entspricht, ist. Solche Plasmide der Erfindung können auf den oben beschriebenen Plasmiden basieren, die zur Herstellung von Plasmiden nützlich sind, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert. Solche virale Vektoren der Erfindung können beispielsweise auf Retrovirusvektoren oder Adeno-verknüpften viralen Vektoren basieren. Diese Plasmide und viralen Vektoren sind zur Herstellung der Helferzellen, die in dem vorhergehenden Absatz beschrieben wurden, nützlich.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ebenso eine Helferzelle, das heißt, eine transfizierte Wirtszelle, die eine oder mehrere Nucleotidsequenzen umfaßt, die ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche RNA-Sequenz, die SEQ ID Nr: 1 entspricht, ist. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die transfizierte Wirtszelle eine Nucleotidsequenz oder -sequenzen, die unabhängig voneinander aus SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3, SEQ ID Nr: 4, SEQ ID Nr: 5, SEQ ID Nr: 6, SEQ ID Nr: 7, SEQ ID Nr: 8, SEQ ID Nr: 9 ausgewählt sind. Diese Helferzellen sind wie oben beschrieben, zur Lieferung von Peptiden für die Vervollständigung infektiöser RNA-Moleküle, denen es an Sequenzen mangelt, die das/die Peptid(e), codiert durch die Helferzelle, codieren, so daß funktionale Virions aus einem genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus durch die Zelle erzeugt werden können.
Geeignete Zellen für diesen Aspekt der Erfindung umfassen die oben beschriebenen Zellen, die zur Expression Nord-Amerikanischer PRRS-Viren geeignet sind, wie die Schweine-Alveolarmakrophagenzellen und die MARC-145-Zellen. In der Praxis kann jedoch irgendeine Zelle von einem Säuger oder einem Vogel verwendet werden. Wie oben erörtert, sind für den Erhalt einer transfizierten Wirtszelle, die durch PRRS-Virions wieder infiziert werden kann, und so mehrere Generationen funktionaler genetisch modifizierter Nord-Amerikanischer PRRS-Virions erzeugen kann, Schweine-Alveolarmakrophagenzellen und MARC-145-Zellen bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung liefert daher auch ein Verfahren zur Erzeugung eines funktionalen Virions aus einem genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, codiert durch eine RNA-Sequenz, die SEQ ID Nr: 1 entspricht, umfassend eine oder mehrere Mutationen, die eine oder mehrere Peptidcodierungssequenzen hindern, wobei das Verfahren die Transfektion einer Helferzelle, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben, mit einem infektiösen RNA-Molekül, Plasmid oder viralen Vektor, die das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus codieren, umfaßt, wobei die Helferzelle eine Nucleotidsequenz oder -sequenzen, die das Nord-Amerikanische PRRS-Viruspeptid oder -peptide der gehinderten Peptidcodierungssequenz(en) des genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus codieren, umfaßt.
Infektiöse RNA-Moleküle, Plasmide und virale Vektoren, die ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codieren, die in einem der beiden obigen Verfahren zur Erzeugung eines funktionalen Virions aus einem genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus nützlich sind, sind die infektiösen RNA-Moleküle, Plasmide und viralen Vektoren, die in dieser Anmeldung beschrieben werden.
Beispiele
Beispiel I. Herstellung eines infektiösen cDNA-Klons aus einem Nord-Amerikanischen PRRS-Virusisolat.
Quelle für PRRS-Virus und MARC-145-Zellen: Ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virusisolat, P129, wurde von den Doktoren Gregory W. Stevenson, William G. Van Alstine und Charles L. Kanitz des Purdue University's Animal Disease Diagnostic Laboratory in West Lafayette, Indiana erhalten. Das P129-Virus wurde ursprünglich im Herbst 1995 aus einer Schweineherde in Süd-Indiana, die einen schweren PRRS-Ausbruch erfuhr, isoliert. Diese Farm hatte keine vorhergehende Geschichte von PRRS-Problemen oder PRRS-Impfung. Das P129-Isolat war virulenter als alle anderen Feldisolate aus demselben Zeitraum und geographischem Gebiet, in denen es schwerere und anhaltendere Atemwegserkrankungen bei jungen Schweinen erzeugte. Das Virus wurde anfänglich auf primären Schweine-Alveolarmakrophagen (der natürlichen Wirtszelle) isoliert und dann auf MARC-145-Zellen passagiert (Kim, H. S. et al., 1993, Arch. Virol. 133: 477–483). Es wurde herausgefunden, daß Gene, die strukturelle Proteine von P129 codieren, zu den entsprechenden bekannten Nord-Amerikanischen PRRS-Gensequenzen homolog sind.
Die MARC-145-Zellinie, die zur Vermehrung der PRRS-Viren verwendet wurde, ist ein Klon der MA-104 Rhesus-Makaken-Affen-Nieren-Zellinie. Die MARC-145-Zellen wurden von den National Veterinary Services Laboratories (NVSL, Ames, Iowa) aus den USA erhalten. Diese Zellen sind getestet und als negativ für Mycoplasmen und für übliche exogene Mittel für Schweine befunden worden. Die MARC-145-Zellen konnten routinemäßig bei 37°C in OptiMEM (Life Technologies Inc.) mit 2% fetalem Rinderserum und Antibiotika wachsen.
Fünf biologische Klone wurden aus dem P129-Virusstamm plaquegereinigt und diese wurden mit P129A bis P129E gekennzeichnet. Die Plaquereinigung wurde durch die Infektion von Einzelschichten aus MARC-145-Zellen mit P129-Virus, Zugabe einer Deckschicht aus OptiMEM, enthaltend 1,25% SeaPlaque-Agarose (FMC BioProducts), 2% fetales Rinderserum und Antibiotika, durchgeführt. Die Plaques waren nach der Inkubation für 7 Tage deutlich erkennbar, als 5 gut isolierte Plaques herausgenommen und auf frischen MARC-145-Einzelschichten passagiert wurden. Als eine zytopathische Wirkung (Virus-induzierter Zelltod) ersichtlich war, wurde der Virusnachkomme aus jeder dieser Kulturen einer weiteren Plaquereinigung unterzogen. Ein gut isoliertes Plaque aus jedem der fünf Klone wurde herausgenommen und ausgedehnt, um große Stämme herzustellen. Die 5 Klone wurde auf ihre Virulenz in jungen Schweinen entweder einzeln (Klone A und E) oder in Kombination (Klone B–D, oder Klone A–E) getestet. In allen Fällen replizierte sich das plaquegereinigte Virus in den Schweinen gut und rief eine klinische Erkrankung hervor. Die Schwere der klinischen Symptome war geringer als die, die durch das nicht geklonte P129-Virus hervorgerufen wurde, auch wenn alle fünf Klone zusammen verwendet wurden. P129A wurde zur Sequenzierung ausgewählt und wurde bei den anschließenden molekularen Manipulationen verwendet.
Bestimmung der Genomsequenz von P129A: Das plaquegereinigte Virus P129A wurde zur Sequenzbestimmung nach 10 seriellen Passagen aus dem Schwein verwendet (einschließlich zwei Plaquereinigungen und einer anschließenden Passage). SEQ ID Nr: 1 zeigte die cDNA-Sequenz, die dem P129A RNA-Genom entspricht. Das Genom ist 15.395 Nucleotide lang (ausschließlich des Polyadenosinschwanzes), beginnt mit ATGACGTA und endet mit CCGCAATT. Ein typischer Polyadenosinschwanz von 55 Resten wird in SEQ ID Nr: 1 ebenso bereitgestellt.
Für die strukturellen Gene von P129A (ORFs 2 bis 7), die 3' 20% des Genoms umfassen, wurden verschiedene PCR-Primer ausgewählt, basierend auf mehreren cDNA-Teilsequenzen anderer Nord-Amerikanischer PRRS-Virusisolate, die in der öffentlichen DNA-Sequen-Datenbank GenBank (zum Beispiel PRU00153) erhältlich sind. Gereinigte virale RNA wurde unter Verwendung von Revertase und zufälliger hexamerer Primer in cDNA umkehrtranskribiert. Diese cDNA wurde dann bei der PCR mit genspezifischen Primern verwendet. Die PCR-Produkte wurden aus Gelen exzidiert und in Plasmid pCR2.1 (Invitrogen) T/A-geklont. Für jedes Primerpaar wurden mehrere Plasmide (aus unabhängigen PCR-Reaktionen) DNA-sequenziert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Seqman-Programms aus der Lasergenpackung (DNASTAR, Inc) vereinigt. Dies ermöglichte die Vervollständigung der Sequenz an den Stellen 11.992 bis 15.347 des P129A-Genoms.
In der GenBank-Datenbank gibt es auch eine Reihe kurzer Sequenzen (ungefähr 218 Nucleotide insgesamt), die einen Teil des ORF 1b-Gens mehrerer Isolate des PRRS-Virus umfassen. Eine davon (PPSSEQB) wurde zur Gestaltung von PCR-Primern (vorwärts 5'-ACAGTTTGGTGATCTATG-3' (SEQ ID Nr: 10), was den Positionen 9063–9080 entspricht; umgekehrt 5'-CAGATTCAGATGTTCAA-3' (SEQ ID Nr: 11), was den Positionen 9252–9268 entspricht) verwendet. Dies verstärkte ein 206 Nucleotidfragment, das 171 Nucleotide der neuen Sequenz aus dem P129A ORF1b-Gen umfaßt, was den Positionen 9081 bis 9251 entspricht. Ein neuer Vorwärtsprimer wurde in diesem Bereich gestaltet (5'-ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3' (SEQ ID Nr: 12), Positionen 9201–9224), und ein Matching-Primer wurde in dem unmittelbaren ORF1b-Aufwärtsstorm von ORF2 (5'-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAATGA-3' (SEQ ID Nr: 13) gestaltet, Positionen 12.027–12.050). Diese Primer wurden bei der RT-PCR zur Verstärkung eines 2850 Nucleotidfragments von ORF1b verwendet, das den Positionen 9201–12.050 des P129A-Genoms entspricht.
Während der RT-PCR-Verstärkung von ORF5 eines anderen Nord-Amerikanischen Feldisolats des PRRS-Virus, war eine geringe Bande zu sehen, die kleiner war, als die erwartete Größe. Diese wurde sequenziert und wies eine eingeschränkte Homologie mit ORF1a des Lelystad-Virus auf (was aus der fehlerhaften Initialreaktion resultiert). Neue Primer in diesem Bereich wurden ausgewählt, um P129A zu verstärken (vorwärts 5'-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3' (SEQ ID Nr: 14), was den Positionen 1587–1610 entspricht; umgekehrt 5'-AGAGCGGCTGGGATGACACTG-3' (SEQ ID Nr: 15), was den Positionen 1877–1897 entspricht). Zusätzlich zu dem Produkt der 311 Nucleotide (266 Nucleotide einer neuen P129A-Sequenz zwischen den Primern, die den Positionen 1611–1876 entsprechen), wurde ein größeres minderwertiges PCR-Produkt von 701 Nucleotiden geklont und sequenziert (656 Nucleotide einer neuen P129A-Sequenz zwischen den Primern, die den Positionen 1611–2264 entsprechen). Die größere Bande resultiert aus der fehlerhaften Initialreaktion des Umkehrprimers an den Positionen 2265–2269.
Das äußerste 5'-Ende des Genoms von P129A wurde durch 5'-RACE (rasche cDNA-Enden-Amplifikation) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Life Technologies Inc.) bestimmt. Zwei ineinandergesetzte Umkehrprimer wurden aus der bekannten ORF1a-Sequenz („RACE2" 5'-CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3' (SEQ ID Nr: 16), Positionen 1917–1938; und „RACE3" 5'-AGGGGGAGCAAAGAAGGGGTCATC-3' (SEQ ID Nr: 17), Positionen 1733–1756) ausgewählt. RACE2 wurde zum Starten der cDNA-Synthese verwendet, während RACE3 in der PCR verwendet wurde. Die resultierenden PCR-Produkte wurden geklont und sequenziert. Die beiden längsten Produkte endeten an genau derselben Base (Position 1 in SEQ ID Nr: 1).
Der große Freiraum zwischen der bekannten Sequenz in ORF1a und ORF1b wurde unter Verwendung der langen RT-PCR verbrückt. Zwei neue Primer wurden verwendet (vorwärts 5'-AGCACGCTCTGGTGCAACTG-3' (SEQ ID Nr: 18), Positionen 1361–1380; umgekehrt 5'-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3' (SEQ ID Nr: 19), Positionen 9420–9438). Das resultierende 8078 Nucleotid-RT-PCR-Produkt wurde geklont und sequenziert.
Das äußerste 3'-Ende des Genoms von P129A wurde durch das Ligieren der 3'- und 5'-Enden der viralen RNA und unter Verwendung der RT-PCR zur Amplifikation des Verbindungsfragments bestimmt. Die resultierenden Verbindungsfragmente wurden geklont und sequenziert. Kurz gesagt, wurde die RNA, die aus den pelletierten Virions extrahiert wurde, mit Tabaksäurepyrophosphatase (zur Entfernung der 5'-CAP-Strukturen) behandelt, dann mit T4 RNA-Ligase selbst-ligiert (beide von Epicentre Technologies). Die verwendeten Primer waren 5'-CGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3' (SEQ ID Nr: 20) (vorwärts, Positionen 15.218–15.239) und entweder 5'-CGGTAGGTTGGTTAACACATGAGTT-3' (SEQ ID Nr: 21) (umgekehrt, Positionen 656–680) oder 5'-TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3' (SEQ ID Nr: 22) (umgekehrt, Positionen 337–359). Alle resultierenden Klone wurden an dem 5'-Ende des Genoms beschnitten (der kompletteste kam auf 57 Nucleotide des tatsächlichen 5'-Endes, wie durch 5'-RACE bewiesen), zwei dieser Klone enthielten jedoch das komplette 3'-Ende des Genoms, einschließlich des Polyadenosinschwanzes (42 und 55 Adenosinreste in der Länge). Dies vervollständigte die Sequenzierung des cDNA 15.450 Basengenoms des PRRS-Isolats P129A, einschließlich des polyA-Schwanzes, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt.
Erzeugung eines infektiösen cDNA-Klons mit voller Länge von P129A: Ein infektiöser cDNA-Klon mit voller Länge von P129A, mit pT7P129A gekennzeichnet, wurde aus vier überlappenden geklonten RT-PCR-Produkten zusammengesetzt. Die vier RT-PCR-Produkte wurden zuerst in Plasmid pCR2.1 (Invitrogen) T/A-geklont und in den Escherichia coli-Stamm DH5-alpha transfiziert. Bakterielle Kolonien wurden gescreent und die, die Inserts erwarteter Größen in der „T7 bis M13"-Orientierung enthielten, wurde für die Sequenzierung und weitere Manipulation ausgewählt. Alle vier geklonten RT-PCR-Produkte enthielten eine oder mehrere nicht stille Mutationen (Abweichungen von der übereinstimmenden Nucleotidsequenz für P129A von SEQ ID Nr: 1, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz der codierten ORFs führen). Diese nicht stillen Mutationen (abgesehen von Position 12.622 in ORF 2) wurden durch Subklonierungsfragmente aus anderen geklonten RT-PCR-Produkten repariert. Die vier reparierten subgenomischen Klone wurden schrittweise in einen Klon mit voller Länge eingesetzt, unter Verwendung verfügbarer Restriktionsstellen (siehe 1). Die 5'- und 3'-Enden der cDNA, die dem P129A-Genom in pT7P129A entsprechen, wurden durch die Zugabe eines T7-Promotors und geeigneter Restriktionsendonukleasestellen modifiziert. Die Konstruktion von pT7P129A wird in den folgenden Absätzen ausführlich beschrieben:
Das 5'-Ende des Genoms (Positionen 1–1756), erzeugt durch 5'-RACE und in pCR2.1 geklont, wie oben beschrieben, wurde so modifiziert, das es einen T7-Promotor unmittelbar stromaufwärts der cDNA, die dem P129A-Genom entspricht, und eine PacI-Stelle für weiteres Klonen enthält. Eine 3-Wegeligierung wurde unter Verwendung des 1216 bp DsaI – BseRI-Fragments dieses Plasmids (enthaltend die Basen 27–1242 von P129A), des 4407 bp BseRI – XbaI-Fragments desselben Plasmids (enthaltend die Basen 1243–1756 von P129A und den ganzen Plasmidvektor bis zur XbaI-Stelle) und dem folgenden synthetischen Doppelstrang-Adapter (SEQ ID Nr.: 23 und 24) durchgeführt:
Das vorhergesagte Transkript aus dem T7-Promotor umfaßt einen einzelnen „G"-Rest aus dem Promotor unmittelbar stromaufwärts des ersten „A" des viralen Genoms. Eine nicht stille Mutation an Position 1230 (A bis G) wurde durch den Austausch des 906 bp AatII – SacII-Fragments (Basen 740–1645) mit demselben Fragment aus einem anderen Klon, repariert. Dieses Plasmid wurde „pT7R3A-2" genannt.
Das oben beschriebene 8078 Nucleotid-PCR-Produkt wurde zur Abdeckung der Basen 1361–9438 des P129A-Genoms verwendet. Eine 58 bp-Deletion (Positionen 2535–2592) und 7 nicht stille Punktmutationen wurden durch Subklonierungsfragmente aus anderen geklonten RT-PCR-Produkten korrigiert, wodurch das Plasmid „pGAP10B-4" erhalten wurde. Das 7837 bp Bsu36I – SpeI-Fragment aus diesem Plasmid wurde an das 5482 bp Bsu36I – SpeI-Fragment aus pT7R3A-2 ligiert. Das resultierende Plasmid „pT7RG" enthält die ersten 9438-Basen des P129A-Genoms hinter dem T7-Promotor.
Das oben beschriebene 2850 Nucleotidfragment von ORF1b (Genom-Positionen 9201–12.050) wurde korrigiert, um nicht stille Mutationen zu reparieren und als „p1B3A-2" gekennzeichnet. Das 2682 bp NdeI-SpeI-Fragment dieses Plasmids wurde an das 13.249 bp NdeI-SpeI-Fragment von pT7RG ligiert, wodurch das Plasmid „pT71A1B" erhalten wurde, das die ersten 12.050 Basen des P129A-Genoms enthielt.
Das vierte und letzte Fragment des P129A-Genoms wurde durch RT-PCR von ORFs 2 bis 7, einschließlich des 3' nicht-translatierten Bereiches und einem Teil des polyA-Schwanzes, gewonnen. Der Vorwärtsprimer war 5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3' (SEQ ID Nr: 25) (Positionen 11.504–11.530) und der Umkehrprimer war 5'-GGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTGCGGCCGCATGGTT CTCG-3' (SEQ ID Nr: 26). Der Umkehrprimer enthält die letzten 22 Basen des P129A-Genoms (Positionen 15.374–15.395), einen polyA-Schwanz von 21 Basen, eine NsiI-Stelle (ATGCAT) und eine SwaI-Stelle (ATTTAAAT). Nicht stille Punktmutationen und eine einzelne Basendeletion wurden durch Subklonierung von Fragmenten aus anderen Klonen repariert. Versehentlich wurde eine zusätzliche nicht stille Punktmutation an Position 12.622 (A bis G) in diesem Stadium eingeführt. Diese führte zu einer Veränderung von Glutamin zu Arginin nahe des C-Endes des ORF2-Proteins (Aminosäurerest 189 der 256 Aminosäuren in ORF2, der das überlappende ORF 3 nicht beeinflußt). Diese Mutation hatte keinen erkennbaren Einfluß auf das virale Wachstum in der Zellkultur oder in Schweinen und wurde nicht repariert. Diese Mutation diente als ein genetischer Marker zur Unterscheidung des Virus, das aus dem cDNA-Klon stammt, von der möglichen Kontamination mit parentalen P129A- oder anderen PRRS-Viren. Das Plasmid wurde als „p2_7D-4" bezeichnet. Die strukturellen Gene von P129A wurden zu dem Rest des Genoms durch Ligieren des 3678 bp Eco47III – SpeI-Fragments von p2_7D-4 mit dem 15.635 bp Eco47III – SpeI-Fragment von pT71A1B zugegeben.
Dies ergab das endgültige Konstrukt „pT7P129A", das cDNA umfaßt, die fast identisch dem gesamten Genom von P129A (jedoch nur mit einem 21 Basen-polyA-Schwanz, im Gegensatz zu 55 Basen-polyA-Schwanz) hinter einem T7-Promotor entspricht, das in den pCR2.1-Vektor zwischen einheitliche Restriktionsenzymstellen (PacI und SwaI) geklont wurde. Die Gesamtlänge von pTP7129A beträgt 19.313 bp, und es ist in dem E. coli-Stamm DH5-alpha stabil. pT7P129A enthält eine nicht stille A bis G-Punktmutation an Position 12.622, die eher zu einem Arginin an Position 189 von ORF2 als einem Glutamin führt (wie es durch SEQ ID Nr: 1 codiert wird) und eine stille C bis T-Mutation an Position 1559. Keine dieser Mutationen beeinträchtigt das virale Wachstum unter den geprüften Bedingungen, sowohl in Zellkultur als auch in Schweinen. Beispielsweise wurde pT7P129A für die in vitro-Transkription verwendet und die resultierenden RNA-Transkripte erzeugten ein lebendes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, wenn sie in MARC-145-Zellen transfiziert wurden, was demonstriert, das dieser Klon mit voller Länge infektiös ist.
In vitro-Transkription und Transfektion von RNA-Transkripten: In dem Plasmid pT7P129A gibt es zwei T7-Promotoren zusammen stromaufwärts des viralen Genoms. Einer der beiden wird unmittelbar stromaufwärts des viralen Genoms positioniert und in den PCR-Primer, wie oben beschrieben, eingebaut. Der andere liegt in dem pCR2.1-Klonierungsvektor vor und befindet sich außerhalb der Klonierungsstelle (Initiierung der Transkription von 44 Basen stromaufwärts des viralen Genoms). PacI wurde zum Schnitt zwischen diesen T7-Promotoren vor der in vitro-Transkription zur Erzeugung eines Transkripts verwendet, das authentischer viraler RNA näher ist (ein einzelnes Extra G unmittelbar stromaufwärts des viralen Genoms, im Gegensatz zu 44 Extrabasen aus dem distalen T7-Promotor). Zusätzlich wurde pT7P129A mit SwaI vor der in vitro-Transkription geschnitten. Die resultierenden Run-off-Transkripte umfassen einen 21 Basen langen polyA-Schwanz und neun Nicht-PRRS-Nucleotide, einschließlich einer NsiI-Stelle (die nicht zur Linearisierung des Plasmids verwendet wurde, da die Stelle auch einmal in dem viralen Genom vorkommt). Das digerierte Plasmid wurde durch Phenolextraktion und Ethanolausfällung vor der Verwendung gereinigt.
Ein kommerzieller Kit (T7 Cap-Scribe, Boehringer Mannheim) wurde zur in vitro-Transkription verwendet. Das DNA-Pellet von oben, das etwa 0,6 μg PacI/SwaI digeriertes pT7P129A enthält, wurde in 20 μl T7 Cap-Scribe-Puffer/T7-Polymerase resuspendiert und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Ein Teil der Reaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert und es wurde gezeigt, daß sie RNA-Transkripte mit voller Länge zusätzlich zu den erwarteten DNA-Banden von 15.445 bp und 3868 bp enthielt. Die in vitro-Transkriptionsreaktion wurde unmittelbar nach der Inkubation ohne Reinigung frisch verwendet. Frisch zusammengeführte Einzelschichten aus MARC-145-Zellen wurden einmal in OptiMEM (ohne Serum) gewaschen und mit 1 ml pro 35 mm-Loch OptiMEM (ohne Serum), das 500 μg/ml DEAE-Dextran (Molekulargewicht ungefähr 500.000, Pharmacia Biotech) enthält, abgedeckt. Die in vitro-Transkriptionsreaktion (15 μl) wurde unmittelbar zugegeben. Nach einer Stunde bei 37°C wurde das Transfektionsgemisch entfernt, die Einzelschichten wurden einmal mit PBS gewaschen und mit 1,25% SeaPlaque-Agarose (FMC Corporation) in OptiMEM mit 2% fetalem Rinderserum und Antibiotika abgedeckt. Nach 5 Tagen bei 37°C war ein einzelnes Plaque sichtbar. Das Virus wurde als „rP129A-1" bezeichnet und wurde auf MARC-145-Zellen ausgebreitet und in Zellkultur und in Schweinen charakterisiert. Anschließende Transfektionen von in vitro transkribierter RNA aus pT7P129A, unter Verwendung sowohl von DEAE-Dextran als auch Elektroporation, ergaben viele zusätzliche Plaques.
Charakterisierung des rekombinanten Virus rP129A-1: Es gibt keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich der Wachstumskinetiken, der Ausbeute oder der Plaquemorphologie zwischen dem aus cDNA stammenden rekombinanten Virus rP129A-1 und seinem nicht rekombinanten Elternteil P129A. Wie oben erörtert, gibt es zwei Unterschiede in der Nucleotidsequenz zwischen der Codierungssequenz von pT7P129A und der übereinstimmenden Sequenz von P129A (gezeigt in SEQ ID Nr: 1). Erstens enthält pT7P129A an Position 1559 ein T, wohingegen P129A ein C enthält (dies ist eine stille Mutation). Zweitens enthält pT7P129A an Position 12.622 ein G, wohingegen P129A ein A enthält (dies ist die Glutamin-zu-Arginin-Veränderung in ORF2, oben beschrieben). Um die Möglichkeit auszuschließen, daß rP129A-1 tatsächlich eine nicht rekombinante PRRS-Virus-Kontaminante ist, wurden RT-PCR und die Sequenzierung an den Bereichen um diese beiden Unterschiede herum durchgeführt. Im Falle beider genetischer Marker war rP129A-1 mit dem Plasmid pT7P129A identisch und unterschied sich von dem parentalen Virus P129A, so wurde bestätigt, daß rP129A-1 aus dem infektiösen cDNA-Klon stammt.
Charakterisierung des rekombinanten Virus rP129A-1 in Schweinen: Das aus cDNA stammende Virus rP129A-1 wurde mit seinem nicht rekombinanten Elternteil P129A auf seine Fähigkeit, junge Schweine zu infizieren und klinische Erkrankungen bei diesen hervorzurufen, verglichen. Drei Gruppen aus 10 Schweinen aus einer PRRS-negativen Herde wurden in einem Alter von 4 Wochen entweder mit P129A, rP129A-1 infiziert oder mit Zellkulturmedium scheinifiziert. Klinische Anzeichen, rektale Temperaturen und Körpergewichte wurden aufgezeichnet. Das Blut wurde an den Tagen 0, 2, 6, 10 und 13 nach der Infektion zur Bestimmung der Serumvirämie (durch Plaqueassay auf MARC-145-Zellen, 2) und Serumantikörper (durch ELISA unter Verwendung von HerdChek PRRS von IDEXX, 3) gesammelt. Gross- und mikroskopische Läsionen der Lunge wurden bei Nekropsie beobachtet. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Virus-infizierten Gruppen, was ein Anzeichen dafür ist, daß sich rP129A-1 in Schweinen repliziert und klinische Erkrankungen hervorruft, die quantitativ und qualitativ seinem nicht rekombinanten Elternvirus ähneln.
Beispiel II. Deletion von ORF7 (Nucleokapsidgen) aus dem Nord-Amerikanischen PRRS-Virus; Herstellung eines negativ-markierten, replikationsdefekten Impfstoffes dadurch.
Das virale Nucleokapsidgen (ORF7) wurde teilweise aus einem infektiösen cDNA-Klon des PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung deletiert. Das resultierende rekombinante modifizierte PRRS-Virus wäre in Schweinen erwartungsgemäß replikationsdefekt. Dieses rekombinante modifizierte PRRS-Virus könnte als ein Impfstoff zur Induzierung einer Immunreaktion auf die anderen PRRS-Virusproteine ohne die Risiken klinischer Erkrankungen, die sich auf nicht geimpfte Tiere ausbreiten, oder Reversion der Virulenz, die mit abgeschwächten Lebend-Impfstoffen in Verbindung steht, verwendet werden. Außer, daß ein solches Impfstoffvirus sehr sicher ist, würde es auch „negativ markiert" sein, in dem Sinne, daß das serologisch zu bestimmende PRRS-Virus Feldisolaten ausgesetzt werden kann, auch in Gegenwart von Antikörpern gegen das Impfstoffvirus. Antikörper gegen das ORF7-Protein sind üblicherweise in den Sera von PRRS-Virus-infizierten Schweinen zufinden, wohingegen Schweine, die mit einem ORF7-deletierten PRRSV geimpft wurden, keine Antikörper gegen das ORF7-Protein aufweisen.
Die Deletion von ORF7 aus einem infektiösen Klon wurde wie folgt erreicht: Das Plasmid p2_7D-4 (siehe 1) wurde als Matrize bei der PCR zur Amplifikation der 5'- und 3'-Flankenbereiche stromaufwärts und stromabwärts von ORF7 verwendet. Der Upstream-Flanken-Vorwärtsprimer 5'-ATTAGATCTTGCCACCATGGTGGGGAAATGCTTGAC-3' (SEQ ID Nr: 27) (der an die Genompositionen 13.776–13.791 nahe dem Beginn von ORF5 bindet und zusätzliche Restriktionsstellen enthält, die für das derzeitige Klonen irrelevant sind) und der Upstream-Flanken-Umkehrprimer 5'-CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGGTTTAC-3' (SEQ ID Nr: 28) (der an die Genompositionen 14.857–14.902 an der Verbindung der ORFs 6 und 7 bindet) verstärkten ein Fragment von 1147 bp. Der Umkehrprimer führte MluI- und AflII-Stellen ein und eine einzelne Basenänderung an Position 14.874, wodurch das ATG-Startkodon für ORF7 ohne Änderung des Tyrosins, das in dem überlappenden ORF6 codiert ist, zerstört wird. Für die Downstream-Flanke verstärkten der Vorwärtsprimer 5'-CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3' (SEQ ID Nr: 29) (Positionen 14.884–14.914 nahe des 5'-Endes von ORF7, eingeführt an der MluI-Stelle) und der Umkehrprimer 5'-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3' (SEQ ID Nr: 30) (stromabwärts des viralen Genoms in dem pCR2.1-Plasmid) ein 462 bp-Fragment. Eine 3-Wegeligierung wurde unter Verwendung des 611 bp BstEII-MluI-Fragments des Upstream-Flanken PCR-Produktes, des 575 bp MluI-SpeI-Fragmentes des Downstream-Flanken PCR-Produktes und des 6653 bp BstEII-SpeI-Fragmentes aus dem Plasmid p2_7D-4 durchgeführt (alle Fragmente wurden nach der Digerierung gelgereinigt). Das resultierende Plasmid p2_7Ddelta7+7023 wurde in den ersten sieben Aminosäuren von ORF7 deletiert und wies kein funktionales ATG-Startkodon auf. Zwei neue Restriktionsstellem, die sowohl in dem viralen Genom als auch der Plasmidhauptkette nicht vorhanden sind, AflII und MluI, sind zur Erleichterung des forcierten Klonierens fremder Gene in den Raum, der zuvor durch das 5'-Ende von ORF7 eingenommen wurde, eingeführt worden.
Die Veränderungen in p2_7Ddelta7+7023 wurden in einen genomischen Klon mit voller Länge durch die Ligerung des 3683 bp Eco47III-SpeI-Fragments an p2_7Ddelta7+7023 mit dem 15.214 bp Eco47III-SpeI-Fragment von pCMV-S-p129 eingeführt. Das resultierende Plasmid pCMV-S-p129delta7+7023 wurde zur Transfektion von Zellen verwendet.
Da Nucleokapsid für das virale Wachstum wichtig ist, muß dieses Protein bereitgestellt werden, um die Erzeugung und Replikation eines ORF7-defizienten PRRS-Virus zu ermöglichen. Dies kann beispielsweise unter Verwendung eines Helfervirus oder einer Komplementärzellinie erreicht werden. ORF7-exprimierende MARC-145-Zellinien können erzeugt werden, indem Zellen stabil mit einem Plasmid transfiziert werden, das sowohl das ORF7-Gen aus P129A als auch das Neomycin-resistente Gen enthält. Nach der Auswahl der Neomycinresistenz unter Verwendung des Antibiotikums G418, können dann Einzelzellkolonien ausgebreitet und charakterisiert werden. Klonale MARC-145-abstammdende Zellinien, die für die ORF7-Expression sowohl durch Immunfluoreszenz als auch RT-PCR positiv sind, können mit RNA aus pT7P129delta7 transfiziert werden, um ein ORF7-defizientes P129-Virus zu erzeugen.
Ähnliche Strategien können zur Erzeugung von PRRS-Viren verwendet werden, denen es an anderen strukturellen Genen fehlt (ORFs 2, 3, 4, 5 oder 6) oder die keine oder nur Teile nicht struktureller Gene 1a und 1b aufweisen. Überdies können mehrere Deletionen in ein einzelnes PRRS-Virus eingebaut werden, und diese können in Komplementärzellen, die alle notwendigen Funktionen bereitstellen, wachsen. Solche Gen-defizienten PRRS-Viren sind in Schweinen wahrscheinlich entweder teilweise oder vollständig abgeschwächt, wodurch sie als Impf stoffe gegen PRRS nützlich sind. Sie können auch zur Unterscheidung geimpfter Tiere von Tieren, die mit einem PRRS-Wildtyp-Virus, wie oben erörtert, infiziert sind, und/oder als Vektoren zur Impfung von Tieren mit Epitopen von anderen vom Schwein stammenden Pathogenen verwendet werden (siehe Beispiel III unten).
Beispiel III. Einlagerung heterologer Gene in das Nord-Amerikanische PRRS-Virusgenom; Verwendung des PRRS-Virus als ein Vektor und ein positiv markierter Nord-Amerikanischer PRRS-Virus.
In Beispiel II, oben, wurden AflII- und MluI-Restriktionsenzymstellen in den Bereich, der zuvor von dem 5'-Ende von ORF7 eingenommen wurde, eingelagert. Diese Stellen sind in dem P129A-Genom und in den pCR2.1- und pCMV-Plasmiden nicht vorhanden und können bei der forcierten Klonierung fremder (heterologer) Gene in das virale Genom zur Expression verwendet werden. Potentielle Leader-Verbindungsstellen zur Transkription der subgenomischen ORF7-RNA an den Positionen 14.744–14.749 (ATAACC) und 14.858–14.863 (TAAACC) werden durch die Deletion der ORF7-Codierungssequenz nicht beeinträchtigt und können bei der Transkription eines fremden Gens mitwirken. Fremde (heterologe) Gene können Gene aus anderen PRRS-Virusisolaten oder Genotypen und/oder Gene aus anderen Nicht-PRRS-Pathogenen, entweder Pathogenen, die Schweine infizieren oder Pathogene, die andere Säugetiere als Schweine oder Vögel infizieren, umfassen.
Überdies können diese fremden Gene (oder Teile davon) antigene Epitope liefern, die in Schweinen normalerweise nicht zu finden sind. Solche Epitope können zur „positiven Markierung" eines Impfstoffes verwendet werden, so daß eine erfolgreiche Impfung serologisch überwacht werden kann, auch in Gegenwart von Antikörpern gegen Feld- oder herkömmliche Impfstoffstämme des PRRS-Virus. Ein positiver Marker muß keine separate Expressionskassette sein. Ein antigenes Epitop kann an ein strukturelles Gen des PRRS-Virus fusioniert werden. Beispielsweise kann der Upstream-Flanken-Umkehrprimer, beschrieben in Beispiel I, oben, erweitert werden, indem eine Carboxyl-Terminalfusion eines antigenen Epitops eines Nicht-PRRS-Virus zu dem ORF6-Membranprotein zugegeben wird. Die Gegenwart von Antikörpern gegen dieses Epitop in Schweinen zeigt eine erfolgreiche Impfung an.
Beispiel IV. Zelluläre Expression eines PRRS-Virus durch direkte Transfektion von cDNA in Zellen.
Der eukaryotische Expressionsvektor pCMV-MC1 (SEQ ID Nr: 31) wurde aus dem kommerziell erhältlichen Plasmid pCMVbeta (Clontech) durch Austausch der LacZ-Codierungssequenz zwischen zwei Not I-Stellen mit einem Linker, der Not I-, EcoR V-, Avr II-, Bgl II-, Cla I-, kpn I-, Pac I-, Nhe I-, Swa I-, Sma I-, Spe I- und Not I-Stellen enthält, gewonnen. Die Modifikation des humanen sehr frühen CMV-Promotors wurde durch Substitution der Sequenz zwischen der Sac I- und der zweiten Not I-Stelle von pCMV-MC1 mit einem synthetischen Linker erreicht (unten gezeigt). Der Linker enthält eine halbe Stelle für Sac I, gefolgt von Pac I, Spe I und einer halben Stelle für Not I. Nach dem Annealing der beiden Einzelstrang-Oligonucletide wurde der Linker in pCMV-MC1 zwischen der Sac I- und der Not I-Stelle geklont und ein ausgewählter Klon wurde als pCMV-S1 bezeichnet. Die Spe I-Stelle von pCMV-S1 konnte nicht geschnitten werden, möglicherweise aufgrund eines Fehlers in der Oligosequenz. Daher wurde das Fragment zwischen Pac I und Hind III in pCMV-S1 durch Pac I (an Position 877) – Hind III (an Position 1162) Fragment aus pCMV-MC1 ersetzt. So wurde eine Spe I-Stelle wiedergewonnen. Dieses endgültige Konstrukt (pCMV-S) wurde zum Klonen des P129-Genoms mit voller Länge verwendet.
Linkersequenz (SEQ ID Nr: 32 und 33):
Die Sequenz unmittelbar stromaufwärts des 5'-Endes des P129-Genoms wurde so modifiziert, das sie richtiges Distanzverhalten und eine günstige Restriktionsenzymstelle (Pac I) enthält. Dies geschah durch die Gestaltung geeigneter PCR-Primer (SEQ ID Nr: 34 und 35) zur Amplifikation aus pT7P129. Nach der Digerierung mit Pac I und Aat II, wurde dieses PCR-Fragment in die Pac I- und Aat II-Stellen von pT7RG (1) subgeklont. Das resultierende Plasmid wurde als pT7RG-deltaT7 bezeichnet.
Die endgültige Konstruktion wurde durch das Subklonen der viralen Sequenzen aus pT7RG-deltaT7 an den Pac I- und Nde I-Stellen in pT7P129 vervollständigt, wodurch pT7P129- deltaT7 erzeugt wurde. Das P129-Genom mit voller Länge wurde aus pT7P129-deltaT7 an Pac I und Spe I digeriert und in pCMV-S an den Pac I- und Spe I-Stellen transfiziert. Dieses Konstrukt wurde pCMV-S-P129 genannt.
Die Sequenz des Modifikationsbereiches zwischen dem CMV-Promotor TATA box und dem 5'-Ende der P129-Sequenz in pCMV-S-P129 wird in SEQ ID Nr: 36 gezeigt und schematisch nachstehend dargestellt:
Zum Test der Verwendung des CMV-Promotors zur Initiierung der PRRS-Virusinfektion in Zellen, wurde pCMV-S-P129-Plasmid-DNA (0,5 oder 1,0 μg) durch Lipofektion unter Verwendung von Lipofectamine^® (Life Technologies Inc.) in MARC-145-Zellen transfiziert. Die PRRS-Virus spezifische zytopathische Wirkung wurde nach der Transfektion beobachtet und die Gegenwart von PRRS-Virusantigen wurde durch den Immunfluoreszenz-Antikörpertest bestimmt.
Das PRRS-Virus wurde effizient aus pCMV-S-P129 erzeugt und der Virusnachkomme konnte auf MARC-145-Zellen passagiert werden. Dies demonstriert, daß eine PRRS-Virusinfektion direkt aus einer Plasmid-cDNA, die ein PRRS-Virus codiert, ohne einen in vitro-Transkriptionsschritt initiiert werden kann. Ferner erzeugte pCMV-S-P129 eine größere Menge an Virusnachkommen, im Vergleich zu Plasmiden, in denen sich das 3'-Ende des pCMV-Promotors nicht unmittelbar vor Beginn der Sequenz befindet, die das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert.
Beispiel V. Deletion von ORF4 aus dem Nord-Amerikanischen PRRS-Virus; Herstellung eines replikationsdefekten Impfstoffes daraus.
Ein Teil des Gens für ORF4, das ein Membranglycoprotein codiert, wurde aus einem infektiösen cDNA-Klon des PRRS-Virus der vorliegenden Erfindung deletiert. Das resultierende rekombinante modifizierte PRRS-Virus ist in Schweinen voraussichtlich replikationsdefekt und wird eine Immunreaktion gegen die anderen PRRS-Virusproteine ohne die Risiken klini scher Erkrankungen, die sich auf nicht geimpfte Tiere ausbreiten, oder die Umkehr der Virulenz, die mit abgeschwächten Lebendimpfstoffen in Verbindung steht, induzieren.
Die Deletion von ORF4 aus einem infektiösen Klon wurde wie folgt erreicht. Das Plasmid p2_7D-4 (siehe 1) wurde als Matrize bei der PCR zur Amplifikation der 5'- und 3'-Flankierungsbereiche stromaufwärts und stromabwärts von ORF4 verwendet. Der Upstream-Flanken-Vorwärtsprimer war 5'-AGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCCTTCT-3' (SEQ ID Nr: 37). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 13194–13241, nahe dem Anfang von ORF4, und führt eine Mutation an Position 13225 ein, die das ATG-Startkodon von ORF4 zerstört, ohne die überlappende Aminosäuresequenz von ORF3 zu verändern. Der Upstream-Flanken-Umkehrprimer war 5'-TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-3' (SEQ ID Nr: 38). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 13455–13477 im ORF4-Codierungsbereich stromabwärts ORF3 und führt eine AflII-Stelle ein. Für den Downstream-Flankierungsbereich war der Vorwärtsprimer 5'-CTTCTTAAGTCCACGCGTTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCT-3' (SEQ ID Nr: 39). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 13520–13545 in der Mitte von ORF4, und führt AflII- und MluI-Stellen für das forcierte Klonen fremder Gene ein. Der Umkehrprimer war 5'-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT3' (SEQ ID Nr: 40). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 14981–14999 in der ORF7-Codierungssequenz. Es wurde eine Dreiwege-Ligierung unter Verwendung des SalI-AflII-Fragments des Upstream-Flanken-PCR-Produktes, des AflII-BstEII-Fragmentes des Downstream-Flanken-PCR-Produktes und des SalI-BstEII-Fragmentes aus Plasmid p2_7D-4 durchgeführt. Alle Fragmente wurden nach der Digerierung gelgereinigt. Das resultierende Plasmid p2_7D-4delta4N hatte 42 Basen des zentralen Teils von ORF4, die deletiert und durch eine künstliche 15 Basen-Klonierungsstelle ersetzt wurde. Die Klonierungsstelle enthält zwei Restriktionsstellen (AflII und MluI), die sowohl in dem viralen Genom als auch in der Pasmidhauptkette nicht vorhanden sind. Diese können zur Erleichterung der forcierten Klonierung fremder Gene in dem Raum, der zuvor von ORF4 eingenommen wurde, verwendet werden. Die Klonierungsstelle enthält ebenso ein Stopcodon (TAA), das von ORF4 umgeben ist, und ferner sicherstellt, daß das funktionelle ORF4-Protein nicht produziert wird.
Es ist herausgefunden worden, daß eine ausgedehntere Deletion der ORF4-Codierungssequenz ohne Beeinflussung der Expression des Downstream-ORF5-Hüllgens vorgenommen werden kann. In diesem Fall wurde ein kürzerer Downstream-Flankierungsbereich PCR unter Verwendung desselben Musters und Umkehrprimers und unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3' (SEQ ID Nr: 41) verstärkt. Dieser Primer bindet an die Genompositionen 13654–13669 nahe dem 3'-Ende von ORF4 und enthält eine AflII-Stelle. Eine Zweiwege-Ligierung zwischen dem AflII-BstEII-Fragment des Downstream-Flanken-PCR-Produktes und dem AflII-BstEII-Fragments aus Plasmid p2_7D-4delta4N ergab das neue Plasmid p2_7D-4delta4NS. Dieses Plasmid hatte 176 Basen der ORF4-Codierungssequenz, die deletiert und durch die 15 Basen-Klonierungsstelle ersetzt wurde.
Die Veränderung, die in p2_7D-4delta4N und p2_7Ddelta4NS vorgenommen wurden, wurden in den genomischen Klon mit voller Länge durch den Austausch des BsrGI-SpeI-Fragments aus pCMV-S-P129 mit den modifizierten BsrGI-SpeI-Fragmenten aus p2_7D-4delta4N und p2_7D-4delta4NS eingeführt. Die resultierenden Plasmide pCMV-S-P129delta4N und pCMV-S-P129delta4NS wurden zur Transfektion von Zellen verwendet.
Im Gegensatz zu pCMV-S-P129 führte die Transfektion von MARC-145-Zellen mit den Plasmiden pCMV-S-P129delta4N oder pCMV-S-P129delta4NS nicht zu viralen Plaques oder fluoreszierenden Herden. Es war zu erkennen, daß einzeln transfizierte Zellen das ORF7-Nucleokapsidprotein erzeugen, was darauf schließen läßt, daß das ORF4-Genprodukt für die RNA-Replikation oder Expression viraler Gene nicht erforderlich ist, aber für die Freisetzung des infektiösen Virusnachkommen wichtig ist. Da die Deletion von ORF4 für die Virusreplikation tötdlich ist, muß dieses Protein bereitgestellt werden. Dies kann durch die Verwendung einer Komplementärzellinie erreicht werden. Wir schufen ORF4-Expressions-MARC-145-Zellinien durch die stabile Transfektion von Zellen mit einem Plasmid, das sowohl ORF4 als auch das Neomycin-resistente Gen enthält. Nach der Auswahl der Neomycinresistenz unter Verwendung des Antibiotikums G418, wurden Einzelzellkolonien ausgebreitet und charakterisiert. Nach der Transfektion mit pCMV-S-P129delta4NS ergaben drei ORF4-Expressionszellklone ein lebendes Virus, das sich in diesen Zellen, aber nicht in MARC-145-Zellen vermehren konnte. Eines davon, MARC400E9, wurde weiter charakterisiert. Die Im munofluoreszenzfärbung für virales Nucleokapsid in MARC400E9-Zellen, die mit Plasmid pCMV-S-P129delta4NS transfiziert waren, war positiv.
Beispiel VI. Verwendung eines Gen-deletierten PRRS-Virus als ein Vektor zur Expression fremder Gene.
Zur Bestimmung, ob heterologe Gene aus einem Gen-deletierten PRRS-Virus exprimiert werden können, insertierten wir eine Kopie eines grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) in die Stelle der ORF4-Deletion in Plasmid pCMV-S-P129delta4N. Das GFP-Gen wurde aus einem herkömmlich erhältlichen Plasmidvektor unter Verwendung von PCR-Primern, die eine AflII-Stelle an dem 5'-Ende des Gens und eine MluI-Stelle an dem 3'-Ende des Gens einführten, verstärkt. Das resultierende Plasmid pCMV-S-P129delta4N-GFP wurde zur Transfektion von MARC-145- und MARC400E9-Zellen verwendet. Wie erwartet, unterstützen die MARC-145-Zellen die Replikation des ORF4-deletierten Virus nicht. Einzelne grüne Zellen, die aus der primären Tranfektion resultieren, waren unter dem UV-Beobachtungsinstrument zu sehen, was ein Anzeichen dafür ist, daß GFP exprimiert worden ist, das Virus breitete sich jedoch nicht auf Nachbarzellen aus und es wurde kein CPE beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden große grüne Herde in transfizierten MARC400E9-Zellen beobachtet. Sichtbare Plaques bildeten sich und verschmolzen, wodurch die Einzelschicht zerstört wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß fremde Gene aus einem ORF4-deletierten PRRS-Virus exprimiert werden können, und das die steigende Größe des viralen Genoms um 692 Basen (4,5%) das Packen der viralen RNA in infektiöse Teilchen nicht beeinträchtigt.
Beispiel VII. Verwendung des replikationskompetenten PRRS-Virus als einen Vektor für die Expression fremder Gene.
Zur Bestimmung, ob heterologe Gene aus einem replikationskompetenten PRRS-Virus exprimiert werden können, insertierten wir eine Kopie von GFP in den Bereich zwischen ORF1b und ORF2. Da die Leader/Verbindungs- (L/J) Sequenz für ORF2 in ORF1b liegt, wurde diese L/J-Sequenz zum Antrieb der Expression des GFP-Gens verwendet, und eine Kopie der ORF6-L/J-Sequenz wurde downstream des GFP zum Antrieb der Expression von ORF2 insertiert.
Plasmid p2_7D-4 (siehe 1) wurde als Matrize bei der PCR zur Amplifikation der 5'- und 3'-Flankierungsbereiche upstream und downstream der Insertionsstelle verwendet. Der Upstream-Flanken-Vorwärtsprimer war 5'-AACAGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3' (SEQ ID Nr: 42). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 11699–11721 in ORF1b. Der Upstream-Flanken-Umkehrprimer war 5'-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTCA-3' (SEQ ID Nr: 43). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 12031–12055 in ORF1b und fügt AflII- und MluI-Stellen zur forcierten Klonierung fremder Gene zwischen ORF1b und ORF2 ein. Der Downstream-Flanken-Vorwärtsprimer war 5'-GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGA AATGGG GTCTATACAAAGCCTCTTCGACA-3' (SEQ ID Nr: 44). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 12056–12089 in ORF2 und enthält eine MluI-Stelle gefolgt von den 40 Basen, die dem Beginn von ORF6 vorangehen (enthaltend die ORF6 L/J-Sequenz). Der Downstream-Flanken-Umkehrprimer war 5'-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3' (SEQ ID Nr: 45). Dieser Primer bindet an die Genompositionen 13819–13844 in ORF5. Es wurde eine Dreiwegeligierung unter Verwendung des Eco47III-MluI-Fragments des Upstream-Flanken-PCR-Produktes, des MluI-BsrGI-Fragmentes aus dem Downstream-Flanken-PCR-Produkt und des Eco47III-BsrGI-Fragments aus pCMV-S-P129 durchgeführt. Das resultierende Plasmid pCMV-S-P129-1bMCS2 enthält das gesamte P129-Genom mit einer Klonierungsstelle und einer zusätzlichen L/J-Stelle zwischen ORF1b und ORF2. Das Plasmid produziert ein funktional normales Virus, wenn es in MARC-145-Zellen transfiziert wird.
Das GFP-Gen aus einem kommerziell erhältlichen Plasmid wurde unter Verwendung von Primern, die eine AflII-Stelle an dem 5'-Ende und eine MluI-Stelle an dem 3'-Ende des Gens einführen, PCR-verstärkt. Nach der Digerierung des PCR-Fragments und PCMV-SP129-1bMCS2 mit AflII und MluI, wurde das Insert in den Vektor ligiert, was ein Plasmid pCMV-S-P129-1bGFP2 ergab. Dieses Plasmid produzierte grüne Plaques, wenn es in MARC-145-Zellen transfiziert wurde. Das resultierende Virus konnte auf MARC-145-Zellen paßagiert werden und produzierte weiter grüne Plaques, wenn es unter dem UV-Beobachtungsinstrument beobachtet wurde. Daher können fremde Gene aus replikationskomptetenten PRRS-Virusvektoren exprimiert werden. Das P129-1bGFP2-Virus enthält ein Genom, das 774 Basen (5%) länger ist, als das seines P129-Elternteils, dennoch wird es normal gepackt.
Hinterlegung von biologischen Materialien
Das folgende biologische Material wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110–2209, USA, am 19. November 1998 hinterlegt und mit den folgenden Zugriffsnummern versehen:

Plasmid Zugriffsnummer

Plasmid pT7P129A 203488

Plasmid pCMV-S-P129 203489
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist.
Isoliertes infektiöses RNA-Molekül, das durch ein isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 1 codiert wird, wobei des infektiöse RNA-Molekül ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 1, in Form eines Plasmids.
Transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, wobei die transfizierte Wirtszelle das codierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren kann.
Plasmid, das eine geeignete Wirtszelle direkt transfizieren und ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus aus der so transfizierten geeigneten Wirtszelle exprimieren kann, wobei das Plasmid a) eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, und wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, und b) einen Promoter, der das infektiöse RNA-Molekül in der geeigneten Wirtszelle transkribieren kann.
Verfahren zur Erzeugung eines Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, wobei das Verfahren das Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Plasmid nach Anspruch 5, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, und den Erhalt des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, der durch die transfizierte Wirtszelle erzeugt wurde, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, daß es, wenn es ein vom Schwein stammendes Tier infiziert, kein PRRS in dem Tier erzeugen kann, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere Mutationen enthält, die das codierte PRRS-Virus genetisch daran hindern PRRS zu erzeugen.
Transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert wurde, daß es, wenn es ein vom Schwein stammendes Tier infiziert, kein PRRS in dem Tier erzeugen kann, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere Mutationen enthält, die das codierte PRRS-Virus genetisch daran hindern PRRS zu erzeugen, wobei die transfizierte Wirtszelle das codierte, genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus exprimieren kann.
Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tiers vor einer Infektion durch ein PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 7, oder das infektiöse RNA-Molekül oder das Polynucleotid-Molekül in Form eines Plasmids, oder einen viralen Vektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, die Anspruch 7 entspricht, die ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, der eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus auslösen kann, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöes RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, daß es ein oder mehrere heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein heterologes antigenes Epitop codieren, und wobei jedes heterologe antigene Epitop eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein bestimmtes Pathogen in einem Säuger oder einem Vogel induzieren kann.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 10 in Form eines Plasmids.
Transfizierte Wirtszelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, daß es ein oder mehrere heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das RNA-Molekül codiert, das das Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein heterologes antigenes Epitop codieren, und wobei jedes heterologe antigene Epitop eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein bestimmtes Pathogen in einem Säuger oder einem Vogel induzieren kann.
Impfstoff zum Schutz eines Säugers oder eines Vogels vor einer Infektion durch ein Pathogen, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 10, oder das infektiöse RNA-Molekül, oder ein Plasmid nach Anspruch 11, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch das Pathogen wirksam ist, aus dem das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop oder Epitope davon oder dadurch codiert stammen; und einen Träger, der für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, eine oder mehrere weitere Mutationen umfaßt, durch die das codierte genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 14 in Form eines Plasmids.
Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tieres vor der Infektion durch ein PRRS-Virus und vor der Infektion durch ein anderes Schweinepathogen als ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 14, oder das infektiöse RNA-Molekül, oder ein Plasmid nach Anspruch 15, in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch ein PRRS-Virus und gegen die Infektion durch das Pathogen, aus dem das/die heterologe(n) antigene(n) Epitop oder Epitope davon oder dadurch codiert stammen, wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, daß es ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, wobei die DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, die gleiche wie SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß sie eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen umfaßt, die jeweils ein detektierbares heterologes antigenes Epitop codieren.
Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammendes Tieres vor der Infektion durch einen PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 17, umfassend ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope, behandelt oder weiter genetisch modifiziert, so daß es kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen einen PRRS-Virus bei dem vom Schwein stammenden Tier auslösen kann; oder das infektiöse RNA-Molekül, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder ein isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 17 in Form eines Plasmids, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus auslösen kann; oder einen viralen Vektor, der eine Nucleotidsequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein solches genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, umfaßt, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, das ein oder mehrere detektierbare heterologe antigene Epitope umfaßt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen einen PRRS-Virus auslösen kann; in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch einen PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, das genetisch so modifiziert ist, daß es ihm an einem detektierbaren antigenen Epitop fehlt, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, außer für den Fall, daß es ihm an einer oder mehreren DNA-Sequenzen fehlt, die ein detektierbares antigenes Epitop codieren.
Impfstoff zum Schutz eines vom Schwein stammenden Tieres vor der Infektion durch ein PRRS-Virus, wobei der Impfstoff ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codiert durch ein infektiöses RNA-Molekül, codiert durch ein Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 19, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen fehlt, behandelt oder weiter genetisch modifiziert, so daß es kein PRRS in einem vom Schwein stammenden Tier erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen ein PRRS-Virus bei einem vom Schwein stammenden Tier auslösen kann; oder das infektiöse RNA-Molekül, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen einen PRRS-Virus auslösen kann; oder ein isoliertes Polynucleotid-Molekül in Form eines Plasmids, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen einen PRRS-Virus auslösen kann; oder einen viralen Vektor, der eine Nucleotidsequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein solches genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, umfaßt, wobei das genetisch modifizierte Nord-Amerikanische PRRS-Virus, das dadurch codiert ist, dem es an einem oder mehreren detektierbaren antigenen Epitopen mangelt, weitere genetische Modifikationen umfaßt, so daß es kein PRRS erzeugen kann, aber trotzdem eine wirksame immunschützende Reaktion gegen einen PRRS-Virus auslösen kann; in einer Menge, die zur Erzeugung von Immunschutz gegen die Infektion durch einen PRRS-Virus wirksam ist; und einen Träger, der für die veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die jeweils ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche ist, wie ein RNA-Molekül, das SEQ ID NR. 1 oder der Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist.
Transfizierte Wirtszelle, umfassend eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die jeweils ein Peptid, codiert durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, codieren, wobei die Genomsequenz des Nord-Amerikanischen PRRS-Virus die gleiche ist, wie ein RNA-Molekül, das SEQ ID NR. 1 oder der Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist, wobei die transformierte Zelle das Peptid oder die Peptide exprimieren kann.
Verfahren zur Herstellung eines genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus, das eine immunschützende Reaktion in einem Säuger oder einem Vogel, die damit geimpft wurden, auslösen kann, wobei das Verfahren den Erhalt eines isolierten Polynucleotid-Moleküls, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein Wildtyp-Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 1 oder die Sequenz, beginnend mit und einschließlich Nucleotid 1 bis und einschließlich Nucleotid 15.416 von SEQ ID Nr. 1 ist, außer daß das Nucleotid, das dem Nucleotid 12.622 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Guanin anstelle von Adenin ist, und das Nucleotid, das dem Nucleotid 1.559 von SEQ ID Nr. 1 entspricht, Thymin anstelle von Cytosin ist; die genetische Mutation der DNA-Sequenz, die das infektiöse RNA-Molekül codiert, das das Wildtyp-Nord-Amerikanische PRRS-Virus codiert, um so ein isoliertes Polynucleotid-Molekül zu erhalten, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein infektiöses RNA-Molekül codiert, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus codiert, wobei das Virus weiterhin eine wirksame immunschützende Reaktion gegen die Infektion durch das Wildtyp-Nord-Amerikanische PRRS-Virus in einem Säuger oder einem Vogel auslösen kann; und das Exprimieren des genetisch modifizierten Nord-Amerikanischen PRRS-Virus von dem isolierten Polynucleotid-Molekül, das so erhalten wurde, umfaßt.
Impfstoff zum Schutz eines Säugers oder eines Vogels vor der Infektion durch ein Nord-Amerikanisches PRRS-Virus, das ein genetisch modifiziertes Nord-Amerikanisches PRRS-Virus gemäß Anspruch 23 in einer Menge, die für das Auslösen einer wirksamen immunschützenden Reaktion gegen das Wildtyp-Nord-Amerikanische PRRS-Virus in einem Säuger oder einem Vogel, der damit geimpft wurde, wirksam ist, und einen Träger, der für die pharmazeutische oder veterinäre Verwendung akzeptabel ist, umfaßt.