PL191258B1 - Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem - Google Patents
Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusemInfo
- Publication number
- PL191258B1 PL191258B1 PL333070A PL33307097A PL191258B1 PL 191258 B1 PL191258 B1 PL 191258B1 PL 333070 A PL333070 A PL 333070A PL 33307097 A PL33307097 A PL 33307097A PL 191258 B1 PL191258 B1 PL 191258B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- rna
- virus
- infectious
- viral
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 116
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 104
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 85
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 25
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 claims description 8
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 claims description 6
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 131
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 93
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 91
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 70
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 15
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 13
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011999 immunoperoxidase monolayer assay Methods 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 7
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 6
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 102100039059 Dol-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,3-mannosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 4
- 101000958975 Homo sapiens Dol-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,3-mannosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001066778 Enterobacteria phage HK97 Portal protein Proteins 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 3
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 3
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 241001516645 Simian hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000714195 Varicella-zoster virus (strain Dumas) Tegument protein UL51 homolog Proteins 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 2
- 101150082475 ORF7 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 2
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 101000619174 Enterobacteria phage HK97 Prohead protease Proteins 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777658 Homo sapiens Platelet glycoprotein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100473971 Mus musculus Pdcd11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 101150000233 ORF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000009341 RNA Virus Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101100030133 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEC53 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000711517 Torovirus Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 lipofectamine Chemical compound 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
1. Sposób wytwarzania zakaznego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, zna- mienny tym, ze wytwarza sie technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmuja- cy, co najmniej jedna pelnej dlugosci kopie DNA albo transkrybowana in vitro kopie RNA albo ich pochodna, za pomoca którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pelna sekwencje genomu wirusa i za pomoca którego wytwarzania wlacza sie, co najmniej zakonczenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a nastepnie dostarcza sie komórke gospodarza nie wrazliwa na zaka- zenie przez dziki typ wirusa, transfekuje sie komórke gospodarza rekombinowanym kwasem nukle- inowym i wybiera sie klony zakazne. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórka gospodarza jest komórka BHK-21. 3. Rekombinowany kwas nukleinowy obejmujacy zakazny klon wirusa zawierajacy, co naj- mniej jedna pelnej dlugosci kopie DNA albo transkrybowana in vitro kopie RNA albo ich pochod- na, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pelna sekwencje genomu wirusowego z wlaczonym, co najmniej zakonczeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem.
Technologia rekombinowanego DNA obejmuje niezwykle zróżnicowane i sprawne techniki biologii molekularnej ukierunkowane na modyfikowanie kwasów nukleinowych na poziomie DNA, oraz umożliwia analizę i modyfikację genomów na poziomie cząsteczkowym. Wtym sensie, z powodu niewielkiego wymiaru swych genomów, wirusy są szczególnie podatne na takie manipulacje. Jednakże, technologia rekombinowanego DNA nie jest możliwa do bezpośredniego zastosowania wobec wirusów RNA innych niż retrowirusy, ponieważ wirusy te nie obejmują w swej replikacji etapu pośredniego DNA. Dla takich wirusów trzeba opracować klony zakaźne (przykładowo jako kopia DNA albo kopia RNA przepisanego in vitro, albo jako ich pochodna) zanim można będzie zastosować technologię rekombinowanego DNA w stosunku do ich genomów w celu wytworzenia zmodyfikowanego wirusa. Zakaźne klony można otrzymać przez skonstruowanie cDNA (tu zastosowane w szerszym znaczeniu kopii DNA z RNA, nie zaś w wąskim znaczeniu kopii DNA z mRNA) pełnej długości (długość genomowa) badanego wirusa, po czym zakaźny transkrypt syntetyzuje się in vivow komórkach transfekowanych cDNA pełnej długości, ale transkrypty zakaźne można również otrzymać przez transkrypcję in vitro z fragmentów cDNA częściowej długości połączonych przez ligację in vitro i obejmujących pełny genom wirusa. We wszystkich przypadkach, przepisany RNA niesie wszystkie modyfikacje, które wprowadzono do cDNA i można go zastosować do dalszego pasażowania tak zmodyfikowanego wirusa.
Zakaźne klony cDNA i zakaźne transkrypty in vitro wytworzono dla wielu nici sensownych wirusów RNA (patrz, Boyer i Haenni, Virology 198:415-426) o genomach dochodzących do 12 kb albo nieco większych. Długość genomu Pestiwirusów wydaje się być największą do tej pory sensowną nicią genomu wirusa RNA, z której wytworzono klony zakaźne (Moorman i in., J. Virol. 70:763-770). Problemy związane z długością genomu nie polegają tylko na trudności w otrzymaniu i utrzymaniu długich i stabilnych klonów cDNA w bakteriach, ale również na zakaźności początkowego transkryptu RNA, którego replikacja w komórce gospodarza ma być osiągnięta bez pomocy normalnie towarzyszących białek wirusowych związanych z replikacją wirusa. Wcelu osiągnięcia pomyślnego zakażenia, transkrypty wirusowe muszą oddziaływać z białkami kodowanymi przez wirusa, szczególnie z replikazą wirusową, oraz ze składnikami komórki gospodarza takimi jak mechanizmy translacyjne; stąd, budowa transkryptów wirusowych musi naśladować budowę wirionu RNA najściślej jak to możliwe. Dodatkowe problemy można spotkać w przypadku wirusów RNA, które replikują na drodze mechanizmu subgenomowego posłańcowego mRNA przepisywanego od końca 3' genomu oraz takich wirusów RNA, które podczas replikacji wytwarzają defektywne cząsteczki zakłócające, takie jak puste kapsydy albo puste cząsteczki pokrywy, obejmujące kilka białek strukturalnych, ale tylko część genomu. Obecność niekompletnych fragmentów wirusowego RNA albo np. białek matrycowych albo nukleokapsydu oddziałujących albo interferujących z przepisywanym wirusowym RNA albo z replikacyjnym pośrednim RNA i niszczącym jego strukturę uwalnia syntezę nici RNA pełnej długości i powstawanie zakaźnego wirusa obejmującego RNA genomowej długości.
Wirus Lelystad (LV) zwany również świńskim wirusem zespołu rozrodczo-oddechowego (PRRSV, długość genomowa 15,2 kb) jest członkiem rodziny Arteriviridae, która obejmuje również końskiego wirusa zapalenia tętnic (EAV, długość genomowa 12,7 kb), wirusa podnoszącego poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDV, długość genomowa przynajmniej 14,2 kb) i małpiego wirusa gorączki krwotocznej (SHFV, długość genomowa około 15 kb) (Meulenberg i in., 1993a, Plagemann i Moening, 1993).
Ostatni Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów zadecydował o włączeniu tej rodziny do nowego rzędu wirusów, Nidovirales, wraz z Coronaviridae (długość genomowa 28-30 kb) i Toroviridae (długość genomowa 26-28 kb). Rząd Nidovirales obejmuje otoczkowe wirusy RNA, które zawierają genom RNA w postaci nici sensownej i syntetyzują podczas replikacji zagnieżdżony na końcu 3' zestaw subgenomowych RNA. Subgenomowe RNA coronawirusów i arteriwirusów zawiera sekwencję liderową, która pochodzi z końca 5' genomu wirusowego (Spaan i in., 1988; Plagemann i Moennig, 1993). Subgenomowe RNA torowirusów pozbawione są sekwencji liderowej (Snijder i Horzinek, 1993). Podczas gdy ORF 1a i 1b, kodujące polimerazę RNA zależną od RNA, ulegają ekspresji
PL 191 258 B1 z genomowego RNA, mniejsze ORF na końcu 3' genomów Nidovirales, kodujące białka strukturalne, ulegają ekspresji z subgenomowych RNA.
PRRSV (wirus Lelystad) został po raz pierwszy wyizolowany w 1991 roku przez Wensvoorta i in. (1991) i dowiedziono, że jest czynnikiem przyczynowym nowej choroby znanej obecnie jako zespół rozrodczo-oddechowy świń (PRRS), Głównymi objawami choroby są problemy oddechowe u świń i poronienia u macior. Jakkolwiek większe epidemie, jak obserwowana po raz pierwszy w USA w 1987 roku i w Europie w 1991 zmniejszyły się, wirus wciąż powoduje straty ekonomiczne w hodowlach w USA, Europie i Azji. PRRSV rośnie w makrofagach pęcherzyków płucnych (Wensvoort i in., 1991). Kilka linii komórkowych, takie jak CL2621 i inne sklonowane z linii komórkowej nerki małpiej MA-104 (Benfield i in., 1992; Collins i in., 1992; Kim i in., 1993) są również podatne na wirusa. Niektóre dobrze znane szczepy PRRSV są znane pod numerami dostępu CNCM I-1102, I-1140, I-1387, I-1388, ECACC V93070108 albo ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 i VR 2402. Genom PRRSV został całkowicie albo częściowo sekwencjonowany (Conzelmann i in., 1993; Meulenberg i in., 1993a, Murthaugh i in., 1995) i koduje, oprócz zależnej od RNA polimerazy RNA (ORF 1ai 1b), sześć białek strukturalnych, wśród których są cztery gliko-proteiny otoczkowe zwane GP2 (ORF2), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) i GP5 (ORF5), nie glikozylowane białko błonowe M (ORF6) i białko nukleokapsydu N (ORF7) (Meulenberg i in., 1995; van Neuwstadt i in., 1996). Charakterystyka immunologiczna i sekwencjonowanie nukleotydów szczepów EP i US PRRSV wykazało niewielkie różnice antygenowe pomiędzy szczepami PRRSV zlokalizowane w strukturalnych białkach wirusa (Nelson i in., 1993; Wensvoort i in., 1992; Murtaugh i in., 1995).
Świnie mogą się zarażać PRRSV drogą ustno-nosową. Wirus w płucach jest pobierany przez makrofagi pęcherzyków płucnych, zaś w tych komórkach replikacja wirusa zachodzi w ciągu 9 godzin. PRRSV podróżuje z płuc do węzłów chłonnych płuc w ciągu 12 godzin, zaś do obwodowych węzłów chłonnych, szpiku i śledziony w ciągu 3 dni. W tych miejscach jedynie nieliczne komórki znakują się pozytywnie na antygen wirusowy. Wirus występuje we krwi w ciągu, co najmniej 21 dni, a często jeszcze znacznie dłużej. Po 7 dniach, we krwi można znaleźć przeciwciała przeciwko PRRSV. Równoczesna obecność wirusa i przeciwciał w organizmie zakażonych świń świadczy o tym, że zakażenie wirusem może przetrwać przez czas dłuższy, chociaż na niskim poziomie, mimo obecności przeciwciał. W ciągu przynajmniej 7 tygodni populacja komórek płuc jest różna od normalnych płuc SPF.
PRRSV wymaga swojej otoczki do zakażenia świń drogą ustno-nosową, zaś normalna reakcja odpornościowa świń obejmuje m.in. wytwarzanie przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko jednemu albo wielu białkom otoczki; takie przeciwciała mogą wirusa uczynić niezakaźnym. Jednakże, w makrofagu pęcherzykowym wirus wytwarza również puste kapsydy, skonstruowane z RNA obudowanego białkiem M i/lub N, czasami częściowo zawierające dowolną ilość białek wybranych spośród glikoprotein. Obecność wewnątrz- i zewnątrzkomórkowa tych niekompletnych cząstek wirusa albo (częściowo) nagich kapsydów można wykazać mikroskopią elektronową. Niekiedy, można spotkać nagie kapsydy bez zawartości kwasu nukleinowego. Nagie kapsydy rozmieszczane są w organizmie przez układ krążenia i pobierane z krwi przez makrofagi w śledzionie, węzłach chłonnych i szpiku. Owe nagie, ale zakaźne kapsydy nie mogą być zneutralizowane przez przeciwciała wytworzone przez świnię, co tłumaczy przetrwanie zakażenia wirusowego w obecności przeciwciał. W ten sposób, potomstwo makrofagów z zakażonych komórek szpiku rozsiewa zakażenie wirusem do nowych miejsc w organizmie. Ponieważ nie wszystkie komórki linii makrofagalnej szpiku są zarażone, jedynie mała liczba makrofagów w miejscach obwodowych jest zarażona i wytwarza wirusa. Kapsydy PRRSV, zawierające jedynie białko ORF7, mogą być wytwarzane pod nieobecność innych białek wirusa, przez, przykładowo, zakażenie makrofagów chimerycznym wektorem wirusowym pseudowścieklizny-ORF7. Wirus PRV manipuluje się w taki sposób, że zawiera on informację genetyczną ORF7 PRRSV. W 18 godzin po zakażeniu, cytoplazma zakażonych komórek zawiera znaczną liczbę małych pustych struktur sferycznych o wielkości nukleokapsydu wirusa PRRS.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, polegający na tym, że wytwarza się technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, za pomocą, którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusa i, za pomocą, którego wytwarzania włącza się co najmniej zakończenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a następnie dostarcza się komórkę gospodarza nie wrażliwą na zakażenie przez dziki typ wirusa, transfekuje się komórkę gospodarza rekombinowanym kwasem nukleinowym i wybiera się klony zakaźne.
PL 191 258 B1
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się komórką gospodarza, którą jest komórka BHK-21.
Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej, charakteryzująca się tym, że co najmniej jedna sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik wirulencji i/lub znacznik serologiczny została zmodyfikowana tak, aby sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik była usytuowana w jednej z otwartych ramek odczytu kodujących białka strukturalne.
Korzystnie, w cząsteczce według wynalazku otwarta ramka jest ramką ORF7.
Korzystnie jedna otwarta ramka odczytu jest podstawiona przez ORF7 Arteriviridae.
Również korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, że włączona jest do niej, co najmniej jedna dodatkowa sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego, a bardziej korzystnie ta heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen.
W kolejnym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka wynalazku charakteryzuje się tym, że otwarta ramka odczytu została zmodyfikowana.
Następnym przedmiotem wynalazku jest modyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka obejmująca antygen wirusowy i dopuszczalne farmaceutycznie substancje dodatkowe, charakteryzująca się tym, że jako antygen zawiera zmodyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka zakażona modyfikowanym wirusem RNA obejmującym rekombinowany kwas nukleinowy zawierający zakaźny klon wirusa, o co najmniej jednej pełnej długości kopii DNA albo transkrybowanej in vitro kopii RNA albo ich pochodnej, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
Wynalazek dostarcza zakaźnego klonu wirusa o długości genomowej znacznie przekraczającej maksymalną wielkość genomową wirusów RNA o nici sensownej, z których zakaźne klony dotąd otrzymano. Część doświadczalna niniejszego zgłoszenia opisuje wytworzenie zakaźnego klonu opartego na, i pochodzącego od PRRSV o długości genomowej rzędu 15,2 kb, ale klony takie można obecnie otrzymać z LDV i SPHV, które również mają długość genomową rzędu 15 kb oraz z EAV, jakkolwiek jego genom jest nieco mniejszy, oraz z wirusów o większej długości genomowej, takich jak Coronaviridae albo Toroviridae.
Wynalazek dostarcza również sposobu wytworzenia zakaźnych klonów przez przezwyciężenie problemów napotkanych przy syntezie wirusowej nici RNA, związanych z obecnością niekompletnych fragmentów wirusowego RNA albo np. białek matrycowych albo nukleokapsydu oddziałujących albo interferujących z przepisywanym wirusowym RNA albo z replikacyjnym pośrednim RNA i niszczącym jego strukturę uwalniając syntezę nici RNA pełnej długości i powstawanie zakaźnego wirusa. Wynalazek dostarcza sposobu tworzenia zakaźnych klonów przez transfekowanie komórki gospodarza, która zasadniczo nie jest podatna na zakażenie wirusem typu dzikiego, rekombinowanym kwasem nukleinowym opartym na genomie wirusa, a następnie przez ratowanie zakaźnego potomstwa wirusa z komórki gospodarza przez pasażowanie albo równoczesną hodowlę z komórkami, które są podatne na wirusa. Komórki, które w zasadzie nie są podatne, w porównaniu z komórkami, które są rutynowo stosowane do replikacji badanego wirusa, mogą być nieco podatne albo nie podatne na badanego wirusa, ale mogą być w pełni podatne na inne szczepy wirusa. Wynalazek dostarcza sposobu tworzenia zakaźnych klonów przez transfekowanie komórek gospodarza, które nie są podatne na zakażenie
PL 191 258 B1 wirusem typu dzikiego, co pozwala uniknąć wytwarzania pustych kapsydów albo niekompletnych cząstek wirusa zawierających fragmenty RNA i białka matrycowe albo nukleokapsydu, które zakłócają syntezę nici RNA wirusa. Zakaźny wirus jest ratowany z zakażonych komórek gospodarza przez pasażowanie na komórki, które są podatne na wirusa. W części doświadczalnej opisano, jak otrzymać w ten sposób zakaźny klon PRRSV, ale sposób można zastosować również wobec innych wirusów o nici sensownej RNA.
Wynalazek dostarcza również możliwości wytworzenia zmodyfikowanego klonu zakaźnego przez dalsze zastosowanie technologii rekombinowanego DNA. Takimi modyfikacjami mogą być pojedyncze albo liczne mutacje, zastąpienia, delecje albo insercje albo ich kombinacje, które można osiągnąć dowolną znaną metodą technologii rekombinowanego DNA. Wynalazek dostarcza również zmodyfikowanych wirusów RNA, które można zastosować do badania wirusów RNA oraz do wytwarzania szczepionek.
Wynalazek dostarcza również klonów zakaźnych, przykładowo pochodzących z Arterioviridae, takiego jak PRRSV, który można zastosować jako pojedynczą szczepionkę przeciwko chorobie wywołanej przez wirusa, na którym oparty jest zakaźny klon. Przykładowo, zakaźny klon oparty na PRRSV można zastosować do badania znaczników zjadliwości albo znaczników serologicznych PRRSV. Znane znaczniki serologiczne PRRSV położone są, przykładowo, na jednym z białek strukturalnych PRRSV kodowanym przez ORF2 do 7, ale można je również znaleźć na białkach kodowanych przez ORF 1a i 1b. Znaczniki zjadliwości obecne są na ORF 1a i 1b kodujących białka nie-strukturalne PRRSV, ale można je również znaleźć na dowolnym z białek kodowanych przez ORF2 do 7. Przez modyfikowanie genomu klonu zakaźnego w odniesieniu do tych znaczników, możliwe jest otrzymanie PRRSV, który nie jest, albo jest znacznie mniej zjadliwy w porównaniu ze szczepem rodzicielskim i/lub jest zmodyfikowany przez delecję albo wprowadzenie znaczników serologicznych umożliwiających różnicowanie serologiczne pomiędzy świniami szczepionymi i zakażonymi wirusem typu dzikiego. Modyfikacje takie dostarczone są, przykładowo, przez zakaźne klony PRRSV, w których sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko N ORF7 jest zastąpiona przez białko ORF7 ATCC VR2332 albo LDV.
Niniejszy wynalazek dostarcza również klonów zakaźnych, przykładowo, pochodzących z Arteriviridae takiego jak PRRSV, które można zastosować jako układ dostarczania albo szczepionkę oparta na wektorze wirusowym dla różnych antygenów. W takich klonach, wprowadza się heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego, które nie odpowiadają sekwencji badanego wirusa. Takie heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego mogą, przykładowo, pochodzić z sekwencji kodujących dowolny wybrany antygen. Antygenem tym jest białko albo peptyd, który może wywołać odporność przeciwko patogenowi. Ponieważ wirus zakaża makrofagi i komórki linii makrofagalnej w szpiku i rozprzestrzenia wirusa zawierającego antygen wśród komórek potomnych, taka szczepionka oparta na wektorze wirusowym zakaża komórki centralne układu odpornościowego i może prezentować antygeny do dalszej obróbki. Szczepionka wirusowa zakaża komórki prezentujące antygen, takie jak makrofagi dendrytyczne albo komórki Kupfera albo inne komórki układu odpornościowego i może to robić jako (niekompletnie) opłaszczona cząstka wirusowa albo jako naga cząstka kapsydu. Ponieważ zakażenie nagim kapsydem albo niekompletną cząstką wirusa zapewnia przetrwanie zakażenia, efekt przypominania odporności spowoduje długotrwałą odporność (z powodu ciągłego pobudzania na słabym poziomie) przeciwko patogenom, których antygeny wybrano. Można zastosować wirusa jako nośnik antygenu przez wbudowanie informacji dla epitopów innych organizmów albo substancji patogennych. Kilka takich szczepionek wirusowych niosących informację dla obcych epitopów można zmieszać i podać w tym samym czasie. Umożliwia to czynną odporność przeciwko kilku różnym antygenom jednego patogenu albo czynną odporność przeciwko kilku różnym patogenom.
Wynalazek dostarcza również zakaźnych klonów, przykładowo pochodzących z Arteriviridae takiego jak PRRSV, które można zastosować jako szczepionka diwalentna. Przykładowo, klon zakaźny oparty na PRRSV można zastosować do skonstruowania szczepionki chroniącej przed PRRSV oraz przed innym patogenem, przez połączenie opracowania szczepionki wirusowej z opracowaniem skierowanym na opracowanie szczepionki monowalentnej skierowanej przeciwko PRRS. Konkretną szczepionkę diwalentną można opracować w taki sposób, że chroni ona świnie przed chorobą oddechową przez wprowadzenie do szczepionki PRRS antygenów pochodzących z dowolnego spośród innych patogenów oddechowych, o których wiadomo, że zakażają świnie.
Wynalazek dostarcza również szczepionek monowalentnych, diwalentnych albo szczepionek opartych na wektorze, które są bezpieczne w tym sensie, że szczepionki nie są uwalniane do otoczenia. Bezpieczeństwo stosowania szczepionki (nie uwalniającej się) można zapewnić przez usunięcie
PL 191 258 B1 informacji tych białek wirusowych, które są konieczne do wytworzenia opłaszczonego, zakaźnego wirusa. Wirus taki namnaża się na linii komórkowej, która konstytutywnie wyraża białko. Wirus replikując w takiej dopełniającej linii komórkowej posiada kompletną otoczkę i jest zdolny do zakażania makrofagów świń. Po jednym cyklu replikacji potomstwo wirusa pozbawione informacji dotyczącej białek otoczki nie jest zdolne do zakażania innych komórek jak czyni to wirus z otoczką. Zakażenie makrofagów w organizmie jest wciąż możliwe w postaci nagiego kapsydu albo niekompletnej cząstki wirusowej.
Wynalazek dostarcza również antygenów i białek wirusowych, które można zebrać z hodowli komórkowych zakażonych wirusami RNA według wynalazku. Antygeny takie można zastosować w testach diagnostycznych znanych specjalistom. Takie testy można zastosować jako osobne testy do wstępnej diagnostyki albo jako testy towarzyszące do zastosowania w populacji zwierząt, która ma być szczepiona szczepionką dyskryminującą albo znacznikową opartą na zmodyfikowanych wirusach RNA według wynalazku.
Część doświadczalna
Wytwarzanie klonów cDNA, z których można przepisać in vitro zakaźny RNA staje się zasadniczym narzędziem w analizie metodą genetyki molekularnej wirusów o sensownej nici RNA. Technologia ta jest możliwa do zastosowania wobec wirusów o sensownej nici RNA, których genomy RNA mogą działać jako mRNA i zapoczątkowywać kompletny cykl zakaźny po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza. Opisano klony zakaźne dla wielu wirusów, co ułatwia badania nad ekspresją, replikacją, funkcją białek wirusowych i rekombinacją wirusów RNA (patrz, Boyer i Haenni, 1994). Oprócz tego, klony te można uwzględnić podczas opracowywania nowych wektorów wirusowych i szczepionek. W przypadku Arteriviridae, zakaźny klon cDNA nie został dotąd opisany. Opisuje się tu wytworzenie zakaźnego klonu PRRSV i jego pierwsze zastosowanie w wytwarzaniu chimerycznych wirusów PRRSV.
Materiały i metody
Komórki i wirusy
Szczep PRRSV (albo LV) Ter Huurne (zdeponowany w CNCM, Paryż, pod numerem dostępu I-1102) wyizolowany w 1991 roku (wensvoort i in., 1991) hodowano w hodowli pierwotnej makrofagów pęcherzykowych albo na komórkach CL2621. W badaniu tym zastosowano pasaż 6 szczepu Ter Huurne (TH) jak również pochodną tego szczepu LV4.2.1, którą zaadaptowano do hodowli na komórkach CL2621 przez kolejne pasaże. Makrofagi pęcherzykowe hodowano w pożywce hodowlanej RPMI 1640 (Flow), podczas, gdy komórki CL2621 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Hanksa (Gibco/BRL/Life Technologies). Komórki BHK-21 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Dulbecco. Do transfekcji, komórki BHK-21 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Glasgow (Gibco/BRL/Life Technologies), metodą Liljestrom i Garoff (1993).
Izolowanie wirusowych RNA
Wewnątrzkomórkowy RNA izolowano z makrofagów pęcherzykowych albo komórek CL2621 w 24 godziny po zakażeniu PRRSV w wielokrotności zakażenia równej 1, jak to opisano wcześniej (Muelenberg iin., 1993a). W celu wyizolowania genomowego RNA wirionów, wiriony oczyszczano na gradiencie sacharozy, jak to opisano przez van Nieuwstadt i in., (1996) i zawieszono w TNE (0,01 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA). 1 ml buforu proteinazy K (100 mM Tris-HCl, pH 7,2, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2% (wag/obj) SDS) i 0,4 mg proteinazy K (Boehringer Mannheim) dodano do1 ml oczyszczonych wirionów PRRSV (108 TCID50). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 37°C przez 30 minut. RNA ekstrahowano raz mieszaniną fenol/chloroform (1:1) i precypitowano etanolem. RNA przechowywano w etanolu w -20°C. 1/10 tego preparatu RNA zastosowano w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).
Klonowanie końców 5' i 3' genomu PRRSV
Koniec 5' genomu wirusowego PRRSV klonowano przy użyciu modyfikowanej procedury ligacji pojedynczej nici do jednoniciowego cDNA (SLIC; Edwards i in., 1991). 1/10 RNA wironów, preparowanego jak wyżej, zastosowano w reakcji RT ze starterem 11U113 (5'TACAGGTGCCTGATCC-AAGA3'), który jest komplementarny do nukleotydów 1232 do 1251 genomu. Reakcję RT przeprowadzono w objętości końcowej 20 ml, jak to opisano wcześniej (Meulenberg i in., 1993b). Następnie, do reakcji RT dodano 2 ml6 M NaOH i hydrolizowano RNA przez 30 minut w 37°C. Pojedynczą nić cDNA oczyszczono stosując wysokiej czystości zestaw PCR Product Purification Kit firmy Boehringer Mannheim. Oczyszczony cDNA strącono etanolem, zawieszono w TE i poddano ligacji ze starterem kotwiczącym ALG3 (5'CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC3'). Starter ten zawierał miejsce EcoRI, ClaIi BamHI i koniec 3' zmodyfikowany blokującą grupą aminową w celu zapobieżenia samoligacji. Jednoniciowy produkt cDNA poddano ligacji
PL 191 258 B1 z 4 pmolami ALG3 w 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 10 mg/ml BSA, 25% PEG, 1,0 mM solą kobaltową chlorku heksaminy, 40 mM ATP i 0,5 ml (10 U) ligazy RNA T4 (New England Biolabs) przez noc w temperaturze pokojowej. 1/3 reakcji ligacji zastosowano jako matrycę w PCR ze starterami LV69 (5'AGGTCGTCGACGGG-CCCCGTGATCGGGTACC3') i AALG4 (5'GAAGGATCCAGAATCGATAG3'). Starter LV69 jest komplementarny do nukleotydów 594 do 615 genomu LV, podczas gdy ALG4 jest komplementarny do startera kotwiczącego ALG3. Warunki PCR opisano w Meulenberg i in., (1993b), zaś otrzymany produkt trawiono EcoRI i SalIi klonowano w pGEM-4Z. Podobną strategię zastosowano w celu klonowania końców 5' genomu LV z wewnątrzkomórkowego RNA LV. Do tego doświadczenia zastosowano 10 mg całkowitego komórkowego RNA wyizolowanego z komórek CL2621 zakażonych LV. Klony 5' cDNA sekwencjonowano, zaś do dalszych doświadczeń zastosowano jeden z klonów pABV387, zawierający wydłużenie 10 nukleotydów w porównaniu z opublikowaną sekwencją PRRSV (Meulenberg i in., 1993a).
Klon 3' cDNA zawierający długi ogon poli(A) skonstruowano przez odwrotną transkrypcję RNA LV przy użyciu startera LV76 (5'TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)403'), który zawierał miejsca EcoRI, Xbal i Pvul. Po reakcji odwrotnej transkrypcji przeprowadzono PCR ze starterami LV75 (5'TCTAGGAATTCTAGACGATCG3'), który jest identyczny z LV76 z wyjątkiem ciągu poli(T) i 39U70R (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAA3'), starterem sensownym odpowiadającym nukleotydom 1456614585 genomu LV i zawierającym miejsce Hpal. Powstały produkt PCR trawiono Hpal i EcoRI i klonowano w klonie cDNA pABV39 trawionym tymi samymi enzymami (fig. 1). Dwa klony cDNA zawierające ciągi poli(A) po 45 A (pABV382) i 109 A (pABV392) oraz prawidłową sekwencję genomową, jak oceniono przez sekwencjonowanie oligonukleotydowe, zastosowano do konstruowania genomowego klonu cDNA pełnej długości.
Analiza sekwencji
Sekwencje oligonukleotydowe określono przy użyciu zestawu PRISM™ Ready Reaction Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequencing Kit i automatycznego sekwenatora Applied Biosystems.
Konstruowanie genomowych klonów cDNA pełnej długości PRRSV
Klony cDNA wytworzone wcześniej w celu sprawdzenia sekwencji genomowej LV (Meulenberg i in., 1993a) poddano ligacji ze sobą w dogodnych miejscach restrykcyjnych jak to pokazano na figurze 1. Plazmid pABV254 skonstruowano z klonów 25, 11, 12 i 100 pABV i zastosowano w poprzednim badaniu (den Boon i in., 1996). Standardowe procedury klonowania przeprowadzono w oparciu o Sambrook i in. (1989). Pozwoliło to uzyskać trzy plazmidy zawierające nakładające się sekwencje cDNA LV w plazmidzie o dużej liczbie kopii pGEM-4Z. Plazmidy pABV331 i pABV369 obejmowały nukleotydy od 5 do 6015 genomu LV. Stwierdzono różnicę nukleotydową w pozycji 3462 w stosunku 1:1 w zestawie 6 niezależnych klonów cDNA, które sekwencjonowano w tym regionie. Różnica ta powodowała zastąpienie aminokwasowe w pozycji 1084 ORF1A (Leu zamiast Pro). Ponieważ nie można było przewidzieć wpływu tego aminokwasu na zakaźność, klonowano fragment cDNA kodujący Leu w pABV331 przez wymianę w miejscu EcoRV (nukleotyd 3403) i SacII (nukleotyd 3605), co dało pABV369. Plazmid PABV384 obejmował nukleotydy 5168 do 9825 genomu LV. Ponieważ nie było dostępnego odpowiednim klonem cDNA, który nakładał się z plazmidami pABV20 i pABV5 i który mógł być poddany fuzji z sekwencjami cDNA pABV331 i pABV369, wytworzono przez RT-PCR dwa nowe fragmenty cDNA. W jednej reakcji PCR zastosowano starter sensowny LV59 (5'TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG3') odpowiadał nukleotydom 5169-5186, zaś starter antysensowny 61U303 (5'CATCAACACCTGTGCAGACC3'), który był komplementarny do nukleotydów 6078 do 6097. W innej reakcji PCR zastosowano starter sensowny 61U526R (5'CATCAACACCTGTGCAGACC3') położony w nukleotydzie 5936 do 5955 i LV60 (5'GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC3') komplementarny do nukleotydów 6727 do 6745. Te dwie fragmenty PCR poddano ligacji ze sobą w pABV20 przy użyciu miejsca Xbal włączonego do LV59, wewnętrznego miejsca Apol (nukleotyd 6006) i miejsca BamHI na nukleotydzie 6740, które również włączono do LV60. Nowy fragment cDNA całkowicie sekwencjonowano i nie zawierał on żadnych mutacji, które powodowałyby zmianę aminokwasu w stosunku do opublikowanej sekwencji (Muellenberg i in., 1993a). Plazmid pABV368 obejmował nukleotydy 8274 do 13720 genomu PRRSV. Ponieważ dalsza ligacja fragmentów cDNA w pGEM-4Z dawała niestabilne klony, wstawki pABV331/369, PABV384 i pABV368 poddano ligacji z fragmentami cDNA 5' i 3' pOK12 (Viera i Messing, 1991). Wektor plazmidowy pOK12 jest, jak się oczekuje, bardziej przydatny do klonowania znacznych sekwencji obcego cDNA, ponieważ ma mniejszą liczbę kopii niż pGEM-4Z. Plazmidy transformowano do szczepu DH5a Escherichia coli, hodowano w 32°C w obecności 15 mg/ml kanamycyny, aby utrzymać możliwie niską liczbę kopii. Najpierw, fragmenty cDNA pABV382 ((A)45) i pABV392 ((A)109) wycięto przez trawienie EcoRI
PL 191 258 B1 i modyfikowano miejsce cięcia polimeraza Klenowa (Pharmacia) doprowadzając do tępego zakończenia, a następnie trawiono BamHI. Fragmenty te klonowano do pOK12 trawionego BamHI i Fspl, przy czym to ostatnie miejsce modyfikowano do tępego zakończenia otrzymując pABV394 i pABV395. W ten sposób usunięto promotor polimerazy RNA T7 obecny w pOK12. Następnie, fragmenty cDNA pABV368 i pABV384 poddano ligacji z klonami cDNA końca 3' stosując miejsce Bell (nukleotyd 13394), miejsce Scal (nukleotyd 8657) oraz miejsca BamHI i Bglll w sekwencjach flankujących albo sekwencjach wektora. Dało to plazmid pABV401 i pABV402 (fig. 1).
Klon cDNA 5', zawierający promotor polimerazy RNA T7 poddany fuzji bezpośrednio z końcem 5' genomu LV poddano amplifikacji przez PGR z pABV387 przy użyciu starterów LV83 (5'GAATCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC3') i LV69. LV83 jest zbudowany z, w kierunku od 5' do 3', miejsca EcoRI i Spel, sekwencji promotora polimerazy RNA T7, pojedynczego G dla zapoczątkowania transkrypcji i nukleotydów 1 do 19 genomu LV. Fragment PGR klonowano w miejsce EcoRI i SalI pOK12, otrzymując pABV396. Prawidłową sekwencję pABV396 oceniono przez sekwencjonowanie oligonukleotydem. Następnie, fragmenty cDNA LV z pABV331 i pABV369 wycięto Apal i BamHI, po czym poddano ligacji z pABV396, trawionym Apal i BamHI. Na koniec, powstałe fragmenty cDNA 5' klonowano do pABV401 i pABV402, stosując miejsce Spel powyżej promotora polimerazy RNA T7 i unikalnego miejsca Pm1I w pozycji 5168 genomu wirusowego. W ten sposób otrzymano klony genomowego cDNA pełnej długości jako odpowiadające wirusom przypominającym szczep rodzicielski oraz chimeryczne wirusy obejmujące obce otwarte ramki odczytu.
Wytwarzanie zmutowanych wirusów zawierających miejsce PacI i/lub Swal
W celu wprowadzenia unikalnego miejsca PacI do klonu cDNA genomowej długości bezpośrednio poniżej genu ORF7, nukleotydy T i A w pozycji 14987 i 14988 zastąpiono na A metodą PCR z użyciem startera sensownego LV108 (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC3') i startera antysensownego LV112 (5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA3') oraz startera sensownego LVIII (5'TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG3') i startera LV75. Podobnie, unikalne miejsce Swal wytworzono przez zmianę G w pozycji 14980 na T, oraz T w pozycji 14985 na A przez PCR ze starterami LV108 i LV110 (5'CCTGACTGTC-AATTTAAATTGCACCCTGAC3' i starterów LV109 (3'GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTC-AGG3') i LV111. Fragmenty PCR poddano ligacji w pABV395 stosując wytworzone miejsce PacI i Swal oraz flankujące miejsca Hpal i Xbal, otrzymując, odpowiednio, pABV427 i pABV426. Fragment ten wprowadzono do pABV414 stosując te same unikalne miejsca Hpal i Xbal, otrzymując pABV437 i pABV442 (patrz, fig. 4). W celu wykrywania mutacji znacznikowej w wirusie odzyskanym z transkryptów pABV437 i pABV422, RNA wyizolowano z nadsączu zakażonych świńskich makrofagów pęcherzykowych. RNA zastosowano w reakcji odwrotnej transkrypcji-PCR w celu amplifikacji fragmentu wielkości około 0,6 kb (obejmującego nukleotydy 14576-ogon poli(A) różnej długości) starterami LV76, LV75 i 39U70R. 0becność znacznika genetycznego wykrywano przez trawienie fragmentów PCR PacI i Swal.
Transkrypcja in vitro i transfekcja RNA
Plazmidy pABV414, pABV416 zawierające fragment cDNA pełnej długości genomowej LV linearyzowano trawiąc Pvul, w miejscu które jest położone bezpośrednio poniżej ciągu poli(A). Plazmid pABV296, który obejmował ORF4 w wektorze wirusa puszczy Semliki (SFV) pSFV1 (Meulenberg i in., 1987) linearyzowano przy użyciu Spel i służył on jako kontrola doświadczeń transkrypcji in vitro i transfekcji. Linearyzowane plazmidy precypitowano etanolem i 1,5 mg tych plazmidów zastosowano do transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 (plazmidy pABV414, pABV416) albo polimerazy RNA Sp6 (pABV296) według metody opisanej dla SFV przez Liljestroma i Garoffa (1991 i 1993). Przepisany in vitro RNA strącano izopropanolem, płukano 70% etanolem i przechowywano w -20°C do zastosowania. Komórki BHK-21 wysiano w studzienkach M6 (około 106 komórek/studzienkę) i transfekowano 2,5 m g RNA zmieszanego z 10 m l lipofectin w optimem, jak to opisali Liljestrom i Garoff (1993). Alternatywnie, RNA wprowadzono do komórek BHK-21 przez elektroporację. W tym przypadku, 10 mg RNA przepisanego in vitro albo 10 mg wewnątrzkomórkowego RNA LV poddano transfekcji do około 107 komórek BHK-21 stosując warunki elektroporacji opisane przez Liljestroma i Garoffa (16). Pożywkę zebrano w 24 godziny po transfekcji i przeniesiono do komórek CL2621 w celu ratowania zakaźnego wirusa. Transfekowane i zakażone komórki badano w kierunku ekspresji białek swoistych dla LV przez jednowarstwowy test immuno-peroksydazowy (IPMA), zasadniczo jak to opisano w Wensvoort i in., (1986). Przeciwciała monoklonalne (mAbs) 122.13, 122.59, 122.9 i 122.17, skierowane przeciwko białku GP3, GP4, M i N (van Nieuwstadt i in., 1996) zastosowano do znakowania w IPMA.
PL 191 258 B1
Wyniki
Rekonstrukcja sekwencji końca 5' genomowego RNA LV
Jakkolwiek opisano zakaźność RNA przepisywanego in vitro z okrojonymi końcami 5' (Davis i in., 1989, Klump i in., 1990) ogólnie uznaje się, że do otrzymania klonów zakaźnych konieczna jest kompletna sekwencja wirusowa, obejmująca końce 5' i 3'. W celu klonowania końca 5' genomu LV, zastosowano zmodyfikowaną procedurę ligacji pojedynczej nici z jednoniciowym DNA (SLIC; Edwards i in., 1991). Wewnątrzkomórkowy RNA wyizolowany z komórek CL2621 zakażonych LV, jak i RNA LV z oczyszczonych wirionów poddano odwrotnej transkrypcji stosując starter LV69, który był komplementarny końca 5' ORF1A. Produkt stanowiący pierwszą nić cDNA poddano ligacji ze starterem kotwiczącym ALG3, którego koniec 3' zablokowano przez samoligacją. Produkt poddano amplifikacji PGR i klonowano. Sekwencjonowano 12 klonów pochodzących z wewnątrzkomórkowego RNA LV i powstałych w wyniku dwóch niezależnych reakcji PGR i 14 klonów pochodzących z RNA wirionów i powstałych w dwóch niezależnych reakcjach PGR. Spośród tych 26 klonów cDNA, 22 klony zawierały wydłużenie o 10 nukleotydów (5'ATGATGTGTA3') w porównaniu z sekwencją cDNA opublikowaną uprzednio (Meulenberg i in., 1993a), podczas gdy 4 klony pozbawione były trzech nukleotydów na końcu 5' tej dodatkowej sekwencji (tabela 1). Doprowadziło to do konkluzji, że te 10 nukleotydów stanowi koniec 5' genomu, a wiec włączono je do klonu cD-NA genomowej długości.
Konstruowanie klonów cDNA LV genomowej długości
W celu skonstruowania klonu cDNA LV genomowej długości uprzednio wyizolowane i sekwencjonowane cDNA (Meulenberg i in., 1993a) połączono przez wspólne miejsca restrykcyjne, w oparciu o strategię opisaną na figurze 1. Oprócz tego, wytworzono nowe fragmenty cDNA w celu połączenia klonów cDNA genomowej długości. Jeden fragment cDNA obejmujący nukleotydy 5168 do 6740 wytworzono przez RT-PCR w celu umożliwienia ligacji sekwencji z klonów pABV5 i pABV20. Promotor polimerazy RNA T7 do transkrypcji in vitro połączono bezpośrednio z końcem 5' genomu LV przez PGR, i ten nowy fragment cDNA klonowany do pABV396 wprowadzono do klonu cDNA genomowej długości. Ponowne sekwencjonowanie nukleotydów 3420 do 3725 na sześciu nowych i niezależnych klonach cDNA wykazało, że aminokwas 1084 w ORF1a Leu i Pro są obecne w stosunku 1:1. Ponieważ nie można było przewidzieć wpływu tego aminokwasu na zakaźność przepisanego RNA z końcowego klonu cDNA genomowej długości zastosowano oba do konstruowania tego klonu. Na końcu 3' zastosowano dwa różne klony cDNA. Uprzednio wyizolowano koniec 3' klonów cDNA zawierających ogony poli(A) o maksymalnej długości 20 A (Meulenberg i in., 1993a). Jednakże, w świetle opisanych badań dotyczących długości ogonów poli(A) w spokrewnionych wirusach takich jak LDV (Chen i in., 1994) cały ogon poli(A) powinien być znacznie dłuższy. Stąd, wytworzono nowe klony cDNA końca 3' stosując starter LV76, który zawierał ciąg 40 reszt T. Te klony cDNA sekwencjonowano i zawierały one ciągi reszt od 40 do 109 A. Klon cDNA zawierający najdłuższy ciąg poli(A) (109 reszt A, pABV392) zastosowano do klonu cDNA genomowej długości. Ponieważ długie ciągi homo-polimeryczne mogą zakłócać replikację plazmidów w E. coli (Deng i Wu, 1981), wyselekcjonowano również drugi klon pABV382 zawierający 45 reszt A do zastosowania w kolejnych etapach klonowania. Uprzednio obserwowano, że utrzymywanie klonów cDNA genomowej długości w plazmidach o dużej liczbie kopii prowadzi do gromadzenia się mutacji albo delecji, które powodują utratę zakaźności transkryptów syntetyzowanych z takich klonów (Lai i in., 1991; Rice i in., 1987; Sumiyoshi i in., 1992). Obserwowano również niestabilność plazmidów, gdy próbowano poddać ligacji większy fragment cDNA klonów pABV 331/369, 384 i 386 z końcem 3' albo 5' w pGEM-4Z, a stad poddano fuzji wszystkie klony ze sobą w wektorze o niskiej liczby kopii pOK12 (Viera i Messing, 1991). Dało to klony cDNA genomowej długości pABV414/415 i 416, które można stabilnie namnażać w E. coli w stosowanych warunkach hodowli. Nie obserwowano żadnej różnicy w stabilności klonów cDNA zawierających 45 albo 109 reszt A.
Zakaźność RNA LV
LV wybiórczo rośnie na makrofagach pęcherzykowych świni. Jak dotąd, linia komórkowa CL2621 albo inne klony pochodzące z linii komórkowej nerki małpiej MA104 są liniami komórkowymi, na których namnaża się LV (Benfield i in., 1992; Collins i in., 1992; Kim i in., 1993). Stąd, komórki CL2621 zastosowano do określenia optymalnych warunków do transfekcji RNA LV. RNA wyizolowany z komórek CL2621 zakażonych LV transfekowano do komórek CL2621 w różnych dawkach przy użyciu różnych metod takich jak lipofectin, lipofectamine, dekstran DEAE i elektroporacja. Komórki badano przesiewowo w kierunku efektu cytopatycznego i łysinek przez 7 dni po transfekcji, ale objawy zakaźnego wirusa nie występowały. Oprócz tego, nie można było wykryć antygenów swoistych dla LV w IPMA, stosując przeciwciała swoiste wobec LV. RNA przepisany in vitro z pABV296 zastosowano
PL 191 258 B1 jako kontrolę do tego doświadczenia. Plazmid pABV296 obejmował gen ORF4 kodujący GP4 wprowadzoną w wektorze ekspresyjnym pSFV1 (Meulenberg i in., 1997). Skuteczność transfekowania RNA pABV296 badano przez znakowanie transfekowanych komórek w IPMA przeciwciałami swoistymi wobec GP4. Najwyższą skuteczność transfekcji, powodującą około 0,01% komórek pozytywnych uzyskano przez elektroporację, natomiast 80-90% komórek pozytywnych uzyskano w komórkach BHK-21. Wyniki te wskazują, że komórki CL2621 nie będą przydatne do doświadczeń nad transfekcją podczas, gdy komórki BHK-21 (nie podatne na zakażenie wirusem typu dzikiego) nieoczekiwanie okazały się bardzo przydatne. Stąd, komórki BHK-21 zastosowano do badania RNA LV. 2 mg RNA wyizolowanego z komórek CL2126 zakażonych LV transfekowano do około 10b komórek przy użyciu lipofectin w oparciu o warunki opisane dla SFV (Liljestrom i Garoff, 1993). 24 godziny po transfekcji komórki znakowano mAb swoistym wobec LV 122.17, skierowanym przeciwko białku N LV. Około 3-10 pojedynczych klonów barwiło się pozytywnie, ale brak było zakaźnych ośrodków albo łysinek wskazujących na rozsiew między komórkami. Transfekcją kontrolnego RNA przepisanego z pABV296 dała 60-70% pozytywnych komórek BHK-21 przy wykorzystaniu tych warunków. Nadsącz z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV i RNA pABV296 przeniesiono na komórki CL2621. Po 3-4 dniach, obserwowano łysinki w komórkach, które były inkubowane z nadsączem komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV, ale nie z nadsączem z komórek BHK-21 transfekowanych RNA pABV296. Łysinki znakowały się pozytywnie przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko LV w teście IPMA. Podobne wyniki otrzymano, gdy stosowano RNA wyizolowany z oczyszczonych wirionów LV. Ponadto, liczba komórek barwiących się pozytywnie zwiększała się 2-4-krotnie, gdy komórki transfekowano przez elektroporację. Dane te wskazują, że LV nie może zakażać komórek BHK-21, prawdopodobnie, dlatego że nie posiadają one receptora dla LV. Jednakże, po wprowadzeniu genomowego RNA do komórek BHK-21 wytwarzane są nowe zakaźne cząstki wirusa i wydzielane do pożywki. Ponowne zakażenie już transfekowanych komórek BHK-21 tymi cząstkami, czy są to nagie kapsydy albo w pełni albo w części opłaszczone cząsteczki ponownie nie jest możliwe.
Synteza in vitro zakaźnego RNA
Ponieważ komórki BHK-21 są w zasadzie niewrażliwe na PRRSV typu dzikiego, są one szczególnie odpowiednie do ratowania wirusa z wewnątrzkomórkowego RNA LV, w przeciwieństwie do podatnych komórek CL2621, Komórki BHK-1 zastosowano do zbadania, czy RNA przepisany z klonów cDNA długości genomowej był zakaźny. Plazmidy pABV414/416 linearyzowano Pvul i poddano transkrypcji in vitro stosując polimerazę RNA T7. Miejsce Pvul jest położone bezpośrednio poniżej ciągu poli(A) tak, że przepisywany RNA zawiera 2 nie wirusowe nukleotydy na końcu 3' (fig. 2). Oprócz tego, transkrypty powinny zawierać nie wirusową G na końcu 5', która jest miejscem rozpoczęcia transkrypcji przez polimerazę RNA 11. Około 2,5 mg RNA przepisanego in vitro transfekowano do komórek BHK-21 wraz z 2 mg wewnątrzkomórkowego RNA LV jako kontrola pozytywna do ratowania wirusa z komórek CL2621 i RNA pABV296 jako kontrola pozytywna transfekcji RNA do komórek BHK-21 i negatywna kontrola do późniejszego ratowania komórek CL2621. W 24 godziny później nadsącz z transfekowanych komórek zebrano, zaś komórki utrwalono i barwiono w IPMA przeciwciałem swoistym wobec N 122.17. Podczas gdy obserwowano tylko kilka komórek pozytywnych w studzienkach z komórkami BHK-21, które transfekowano wewnątrzkomórkowym RNA LV, w studzienkach z komórkami BHK-21 transfekowanymi RNA przepisanym z pABV414/416 obserwowano od 800 do 2700 komórek pozytywnych. W celu sprawdzenia, czy zakaźny wirus był uwalniany z komórek, nadsącze zastosowano do zakażania komórek CL2621. W hodowlach komórek CL2621, które zakażono nadsączem z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV i transkryptami pABV414/415. Łysinki znakowały się pozytywnie w IPMA przy użyciu przeciwciał swoistych wobec białka M, N, GP4 i GP3, co wskazuje, że białka te ulegały prawidłowej ekspresji. Nie obserwowano łysinek ani znakowania w IPMA w hodowlach inkubowanych z nadsączem komórek BHK-21 transfekowanych RNA przepisanym z PABV296. Stąd, wyniki te jasno pokazują, że transfekowanie RNA przepisanego z klonów cDNA genomowej długości pABV414 i pABV416 do komórek BHK-21 powoduje wyniki w produkcji i uwalnianiu zakaźnego LV. Ponadto, gdy transkrypty pABV414 i pABV416 transfekowano do komórek BHK-21 przez elektroporację zamiast lipofectin, obserwowano dwu- do czterokrotnego wzrost liczby komórek barwiących się pozytywnie przeciwciałami swoistymi wobec LV. Miano rekombinowanego wirusa w nadsączu tych elektroporowanych komórek BHK-21 wynosiło około 105 TCID50/ml.
PL 191 258 B1
Krzywe wzrostu zakaźnych kopii wirusa w porównaniu z Ter Huurne i LV4.2.1:
Charakterystyka wzrostu ratowanego wirusa
Początkowe doświadczenia transfekcji i zakażania wskazywały, że ratowane wirusy rekombinowane oznaczone vABV414 i vABV416 zakażają i rosną równie dobrze na świńskich makrofagach pęcherzykowych, ale rosną wolniej na komórkach CL2621 niż wirus uratowany z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV. Ten wewnątrzkomórkowy RNA LV wyizolowano z komórek CL2621 zakażonych LV4.2.l., który zaadaptowano do wzrostu na komórkach CL2621. W celu bardziej dokładnego zbadania zdolności wzrostu vABv414 i vABV416 określone krzywe wzrostu komórek CL2621 i świńskich makrofagów pęcherzykowych i porównano je z LV typu dzikiego, który pasażowano tylko na makrofagach pęcherzykowych (TH) i LV4.2.l hodowanym na komórkach CL2621. Tempa wzrostu dwóch rekombinowanych wirusów nie różniły się, rosnąc równie dobrze niezależnie czy pobrano je bezpośrednio z BHK-21 czy dalej pasażowano na świńskich makrofagach pęcherzykowych (fig. 3). Miana (7,1-7,9 TCID50/ml) w makrofagach pęcherzykowych osiągały szczyt około 32 godzin po zakażeniu, podczas gdy miana w komórkach CL2621 były wolniejsze i nie osiągnęły szczytu nawet po 96 godzinach. Wirus miał podobną charakterystykę wzrostu co rekombinanty. W przeciwieństwie, zaadaptowany do CL2621 wirus LY4.2.1 rósł szybciej na komórkach CL2621 niż wirusy vABV141 i vBAV416 i TH (fig. 3). Podsumowując, wyniki pokazują, że właściwości wzrostu rekombinowanych wirusów są podobne do wirusa TH. Oczekiwano tego, ponieważ sekwencja cDNA zastosowana do konstruowania klonów zakaźnych pochodziła od rodzicielskiego „nie zaadaptowanego” wirusa TH.
Wprowadzenie znacznika genetycznego do zakaźnego klonu LV
W celu wykazania, że klon cDNA genomowej długości można zastosować do wytwarzania zmutowanych wirusów LV, wprowadzono unikalne miejsca PacI i Swal bezpośrednio poniżej genu ORF7 ukierunkowaną mutagenezą przez PGR (fig. 4). Gdy RNA przepisany z klonu cDNA genomowej długości pABV437 zawierający miejsce PacI i pABV442 zawierający miejsce Swal transfekowano do komórek BHK-21, zaś nadsącz przeniesiono do makrofagów pęcherzykowych i komórek CL2621 w 24 godziny po transfekcji, wytwarzając zakaźnego wirusa. Uratowane wirusy vABV437 i vABV442 miały podobną charakterystykę wzrostu w świńskich makrofagach pęcherzykowych i komórkach CL2621co rodzicielski wirus vABV414 (dane nie pokazane). Swoisty region, wielkości około 0,6 kb (nukleotydy 14576-ogon (poliA) amplifikowano przez odwrotną transkrypcję i PCR wirusowego RNA wyizolowanego z nadsączu świńskich makrofagów pęcherzykowych zakażonych vABV414 i vABV416. Trawienie PacI wykazało, że miejsce restrykcyjne rzeczywiście występowało we fragmencie pochodzącym od vABV437, ale był nieobecny we fragmencie pochodzącym z vABV414. Podobnie, wykazano obecność miejsca Swal w vABV442 (dane nie pokazane) Tak więc, można było wykluczyć możliwość zanieczyszczenia wirusem typu dzikiego i w ten sposób potwierdzić tożsamość vABV437 i vBAV442.
Dyskusja
Nowoczesna technologia rekombinowanego DNA umożliwia analizowanie i modyfikowanie genomu na poziomie cząsteczkowym i w ten sposób sięganie głębiej w jego organizację i ekspresję. W przypadku wirusów RNA wymaga to wytworzenia klonów cDNA genomowej długości, z których możliwe jest wytworzenie zakaźnych transkryptów. W większości przypadków, wstępnym wymogiem dla konstruowania klonów zakaźnych jest identyfikacja sekwencji na końcach odpowiedniego genomu wirusowego, które są prawdopodobnie kluczowe dla replikacji wirusowego RNA. W poprzednim badaniu wykazano, że LV zawiera ogon poli(A) na końcu 3' (Meulenberg i in., 1993a). W niniejszej pracy określono dokładnie koniec 5' genomu LV. O ile opisano kilka sposobów określenia końca 5' genomowego wirusowego RNA albo mRNA, większość z nich ma istotne ograniczenia. Dla flaviwirusów i pestiwirusów zastosowano sposób, który jest oparty na cyrkularyzacji genomowego RNA. Jednakże, metoda ta wymaga towarzyszących analiz w celu określenia granicy pomiędzy końcem 5' i 3' genomu. Metoda szybkiej amplifikacji końca 5' cDNA (5'RACE) oparta jest na dodaniu homopolimerowego ogona przez końcową transferazę dezoksyrybonukleotydową (TdT) do pierwszej nici cDNA. Jednakże dodawanie ogona jest raczej niewystarczające i metoda ta wymaga również dodatkowych analiz, ponieważ nie można wywnioskować, czy pierwszy nukleotyd ogona odpowiada sekwencji wirusowej, czy też jest już częścią enzymatycznie dodanego ogona. W badaniu tym określono skrajny koniec 5' genomu wirusowego przez poddanie ligacji oligonukleotydu o swoistej sekwencji z pierwszą nicią pierwotnie wydłużonego produktu i amplifikację metodą PCR. Wydłużenie 10 nukleotydowe (ATGATGTGTA) w odniesieniu do opublikowanej sekwencji znaleziono w wielu niezależnych klonach i przez to sądzi się, że odpowiada nukleotydom skrajnego końca 5' genomu wirusowego. Wspólnym rezultatem jest sekwencja liderowa 221 nukleotydów, której długość jest podobna do sekwencji liderowej EAV
PL 191 258 B1 (207 nukleotydów; den Boot i in., 1991), SHFV (208 nukleotydów; Zeng i in., 1995), lecz dłuższa niż LDV (155 nukleotydów; Chen i in., 1995). Jednakże nie występuje żadna istotna homologia pomiędzy sekwencjami liderowymi tych arteriwirusów.
Skrajny koniec 5' włączono do cDNA o długości równej długości genomu w celu stworzenia klonu zakaźnego. Podstawowe problemy związane z tworzeniem tych klonów zakaźnych koncentrują się na stabilności sekwencji wirusowych, podczas klonowania w bakterii jak również tworzenia prawidłowych końców 5' i 3'. Mimo, że początkowe próby magazynowania cDNA o długości genomu w pGEM4Z skończyły się niepowodzeniem, fragment genomowego cDNA LV o długości 15207 pozostał stabilny w niewielkiej liczbie kopii plazmidu pOK12 i jak dotąd jest najdłuższym wytworzonym klonem infekcyjnym sensownej nici RNA wirusa. Transkrypty klonów cDNA o długości genomu zawierały strukturę czapeczki 5' i dodane nie-wirusowe G na końcu 5' i nie-wirusowe CG na końcu 3', lecz te wydłużenia nie zniszczyły ich zakaźności. Wielu badaczy donosiło o zmniejszonej początkowej zakaźności RNA, który był transkryptem klonów cDNA pełnej długości cDNA co zależało od obcych, nieprawdziwych sekwencji na obu końcach 5' i 3' albo od niekompletnego czapeczkowania. Transkrypty cDNA LV pełnej długości nie posiadające struktury czapeczki nie były zakaźne. Podczas gdy zakaźność transkryptów zakaźnych klonów cDNA zawsze badano na liniach komórkowych wrażliwych na dany wirus, nie można wykazać zakaźności transkryptów klonów cDNA o pełnej długości albo RNA LV izolowanych z komórek CL2621 przez transfekcję tych RNA do komórek CL2621. Zależne to jest od niewielkiej sprawności transfekcyjnej w komórkach CL2621, gdzie synteza nici wirusowego RNA jest prawdopodobnie zaburzana prze interferencje albo oddziaływania z niepełnymi fragmentami RNA, albo białkami kapsydu powstającymi z powtórnych zakażeń komórek CL2621 defektywnie interferującymi cząsteczkami takimi jak, nagie kapsydy zawierające jedynie fragmenty genomu wirusowego. Ponieważ transfekcja do BHK-21 transkryptów klonów cDNA pełnej długości i RNA wewnątrzkomórkowego LV powoduje wytwarzanie i uwalnianie zakaźnego wirusa, może być to ratunkiem dla komórek CL2621. Nie występuje ponowne zakażenie komórek BHK-21 nagimi kapsydami i przez to nie zaburza to syntezy wirusowego RNA pełnej długości. Swoista zakaźność wynosiła z grubszą 400-1500 dodatnich komórek na mg RNA transkrybowanego in vitro, podczas gdy uzyskano 2 do 5 dodatnich komórek na mg RNA wewnątrzkomórkowego LV. Jednakże, te swoiste zakaźności nie mogą być porównywane jedynie ze względu na bardzo niską frakcje wewnątrzkomórkowego RNA izolowanego z komórek zakażonych LV reprezentującego genomowe RNA LV. Następnie ilość genomowego RNA izolowanego z wirionów, które wykorzystano do transfekcji jest zbyt mała by pozwolić na dokładne policzenie.
Dodatkowo, komórki BHK-21 oceniano w kierunku produkcji antygenu w IPMA z MAb swoistymi w stosunku do LV, który nie koniecznie koreluje z wytwarzaniem zakaźnego wirusa. Było to oczywiste ze względu na to, że supernatant komórek BHK-21 transfekowanych 2 mgRNA wewnątrzkomórkowego LV zawierał większe miano jednostek łysinkowych, badanych na komórkach CL2621, następnie supernatant komórek BHK-21 transfekowano 2,5 mg transkryptu klonów cDNA pełnej długości. Mimo że, zostało wykazane wcześniej dla pewnej liczby wirusów, że długość ogona poli(A) wpływa na zakaźność transkryptów wirusowych (Holy i Adouhaidar, 1993; Sarow, 1989), tutaj nie obserwowano żadnej różnicy w zakaźności pomiędzy transkryptami klonów genomowego cDNA zawierającymi ogon 45 reszt albo 109 reszt. Jest możliwe, że ogon 45 reszt A jest powyżej progu długości poniżej, którego stabilność odpowiednich transkryptów zostanie zmieniona. Znaleziono klon różniący się aminokwasem 1084 w ORF1a, dający Pro i Leu w stosunku 1:1. Ten aminokwas nie wpływa na zakaźność, ponieważ transkrypty klonów cDNA pełnej długości zawierające ten kodon Leu albo Pro nie wykazują żadnej różnicy w zakaźności komórek BHK-21.
Klony zakaźne o długości genomu wykorzystano do wytworzenia wirusa chimerycznego wyrażającego białko nukleokapsydu PRRSV szczepu ATCC VR2332. Dodatkowo klony zakaźne o długości genomu wykorzystano do wytworzenia wirusa chimerycznego wyrażającego białko nukleokapsydu mysiego wirusa LDV. Wirusy chimeryczne można odróżnić od wirusów rodzicielskich MAb swoistym w stosunku do szczepu, nie przyłączają przeciwciał monoklonalnych swoiście reagujących z białkiem N (ORF7) szczepu Ter Huurne PRRSV. Następnie, wirus chimeryczny, w którym białko N PRRSV jest podstawione białkiem N LDV nie jest reaktywny z przeciwciałami rekonwalescentnymi świni reagującymi z białkiem N PRRSV. Ponieważ wszystkie świnie zakażone PRRSV wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko białku N PRRSV, wirusy chimeryczne będą wykorzystane w przyszłych projektach nowych, żywych szczepionek przeciwko PRRSV i wykorzystujących ten wirus jako układ wektorowy, który jest swoiście kierowany do swoich komórek docelowych, makrofagów pęcherzyków płucnych. W odniesieniu do tego należy wspomnieć, że początkowe próby zapewnienia ochrony
PL 191 258 B1 z wykorzystaniem zabitych wirusów albo rekombinowanych podjednostek były niezadowalające. Jak dotąd jedyna skuteczna szczepionka przeciwko PRRS jest modyfikowana, żywa szczepionka oparta o szczep US (Gorcyca i in., 1995). Jednakże świń szczepionych tym modyfikowanym, żywym produktem można nie odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim. Tak więc, klon zakaźny PRRSV dostarcza tak zwanego znacznika szczepionki dzięki kierowanej mutagenezie genomu, tak że szczepione świnie można odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim na podstawie różnicy w przeciwciałach surowicy.
Klon zakaźny LV, opisany tutaj jest najdłuższym klonem zakaźnym uzyskanym z sensownej nici wirusowego RNA i pierwszym z rodziny arteriwirusów. Wytworzenie tego zakaźnego klonu PRRSV otworzyło nowe możliwości badań nakierowanych na patogenezę, tropizm docelowy i replikację i transkrypcje tego wirusa. Arteriwirusy i koronawirusy posiadają swoisty mechanizm transkrypcyjny, zwany również jako transkrypcja rozpoczynana liderem, która obejmuje wytwarzanie tak zwanego zestawu zagnieżdżonego subgenomowych RNA zawierających zwykły lideer 5' (Spaan i in., 1988; Plegemann i Moennig, 1991). Transkrypcja rozpoczynana liderem, jest złożonym procesem, który nie jest do końca poznany. Badania wirusologiczne nad koronawirusami wyjaśniające mechanizmy leżące u podstawy transkrypcji rozpoczynanej liderem są ograniczone do analiz i kierowanej mutagenezy cDNA defektywnych interferujących RNA, ponieważ wielkość genomu (28-30 kb) uniemożliwia konstruowanie klonów zakaźnych. Klon zakaźny PRRSV jest przydatny jako układ modelowy do badania i odkrywania intrygującego mechanizmu transkrypcji i replikacji arteriwirusów i coronawirusów.
Klony zakaźne pochodzące z PRRSV można również zastosować jako układ dostarczania albo szczepionkę opartą na wektorze wirusowym dla obcych antygenów wprowadzonych do genomu PRRSV ponieważ wirus zakaża makrofagi i linie komórek makrofagalnych w szpiku oraz inne komórki układu odpornościowego i rozprowadza wirusa zawierającego antygen wśród komórek potomnych. W konkretnych przypadkach antygenów zawierających fragmenty ORF7 albo białka N Arteriwirusów albo PRRSV, antygeny te będą (nadmiernie) wyrażane na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej zakażonych komórek, dalej zwiększając w ten sposób reakcję odpornościową. Taki efekt przypominania odporności powoduje długotrwałą (z powodu ciągłego pobudzania na słabym poziomie) odporność na patogeny. Można zastosować wirusa jako nośnik antygenu przez wbudowanie informacji dla epitopów innych organizmów patogennych albo substancji. Kilka modyfikowanych wirusów PRRS niosących informację o obcych epitopach można zmieszać i podawać równocześnie. Umożliwia to czynną odporność wobec kilku różnych epitopów jednego patogenu albo czynną odporność wobec kilku patogenów. Bezpieczeństwo modyfikowanych szczepionek PRRSV (takich jak nie uwalniające się) można zapewnić przez usuniecie informacji tych białek wirusowych, które są konieczne do wytworzenia opłaszczonego, zakaźnego wirusa. Wirus taki namnaża się na linii komórkowej, która konstytutywnie wyraża białko. Wirus replikując w takiej dopełniającej linii komórkowej posiada kompletną otoczkę i jest zdolny do zakażania makrofagów świń. Po jednym cyklu replikacji potomstwo wirusa pozbawione informacji dotyczącej białek otoczki nie jest zdolne do zakażania innych komórek jak wirus z otoczką. Zakażenie makrofagów w organizmie jest wciąż możliwe w postaci nagiego kapsydu. W ten sposób szczepionka będzie zatrzymywana w organizmie jednego zwierzęcia, które zostało zaszczepione i nie rozsiewa się na inne zwierzęta.
Legenda do figur.
Figura 1. Konstruowanie klonu cDNA genomowej długości LV. Część górna (A) pokazuje fuzję klonów cDNA, które uprzednio sekwencjonowano (Muelenberg i in., 1993a) w pGEM-4Z. Numery pABV klonów i miejsca restrykcyjne zastosowano w oznaczony sposób. Czarne ramki oznaczają te części klonów cDNA, które poddano fuzji w następnym etapie klonowania. Jasno szare ramki, zaznaczone R.T., oznaczają klony cDNA wytworzone na nowo przez RT-PCR, ciemnoszare ramki oznaczają nowy klon cDNA wytworzony przez PCR. Część dolna (B) pokazuje połączenie większych klonów cDNA pABV331/369, pABV384 i pABV368 z końcem 5' klonu pABV396, zawierającym promotor polimerazy T7 i końcem 3' klonu pABV395, zawierającym ogon poli(A) w wektorze o niskiej liczbie kopii pOK12, Miejsca restrykcyjne wewnątrz i na zewnątrz wielokrotnych miejsc klonowania pOK12 są zaznaczone. Miejscami endonukleaz restrykcyjnych są: A, Apal; Ap, Apol; B, BamHI; Bg, Bg1ll; Bs, BspE1; Bc, Bc1I; E, EcoRI; Ec, EcoRV; H, Hindlll; K, KpnI; N, NarI; Nc, Ncol; S, SacII; Sp, Spel; Sa, SalI; Sc, Scal; P, Pstl; Pm, PmlI; X, Xbal; Xh, Xhol.
Figura 2. Sekwencje końcowe klonowanego cDNA pełnej długości LV i zakaźny RNA przepisywany z tego klonu cDNA. Klony cDNA genomowej długości linearyzowano Pvul i poddawano transkrypcji w obecności syntetycznego analogu „czapeczki” m7D(5')ppp(5')G przy użyciu polimerazy RNA T7. Powstały RNA powinien zawierać jeden dodatkowy nukleotyd (G) na końcu 5' i dwa dodatkowe
PL 191 258 B1 nukleotydy (GC) na końcu 3'. Strzałki w RNA odpowiadają nukleotydom końcowym 5' 13' odpowiadającym oryginalnej sekwencji RNA LV.
Figura 3. Krzywe wzrostu wirusa LV typu dzikiego TH, LV4.2.1 i rekombinowanych wirusów vABV414 i vABV416 w makrofagach pęcherzyków płucnych świń (A) i komórkach CL2621 (B). Rekombinowane wirusy vABV414 i vBAV416 wytworzone w komórkach BHK-21 zastosowano bezpośrednio (BHK) albo po namnożeniu w makrofagach pęcherzykowych świń (PAM). Wirus TH wytworzono w makrofagach pęcherzyków płucnych świń (PAM), zaś LV4.2.1 wytworzono w komórkach CL2621 (CL). Hodowle komórkowe zakażono oznaczonym wirusem w MOI równej 0,05 i zebrano w oznaczonym czasie. Miana wirusów (TCID50/ml) oznaczono na makrofagach pęcherzyków płucnych świń albo CL2621 przez skrajne rozcieńczenia.
Figura 4. Wprowadzenie unikalnego miejsca PacI i Swal do zakaźnych klonów cDNA LV. Miejsce PacI i Swal wytworzono przez mutagenezę kierowaną PGR, jak to opisano szczegółowo w Materiałach i Metodach. Fragmenty cDNA zawierające miejsce PacI i Swal wymieniono w pABV414 stosując unikalne miejsca Hpal i Xbal, które zaznaczono. Dało to, odpowiednio, pABV437 i pABV442.
Tabe l a 1
Sekwencja nukleotydowa końca 5' klonów LV
Sekwencja1) | Liczba klonów |
ATGATGTGTAGGG..... | 22 |
TGATGTGTAGGG....... | 1 |
GATGTGTAGGG......... | 2 |
ATGTGTAGGG............ | 1 |
1 Podkreślone nukleotydy reprezentują dodatkowe sekwencje, które nie występują w cDNA klonów, wcześniej izolowanych i sekwencjonowanych (Meulenberg i in., 1993a).
Claims (11)
- '. Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, znamienny tym, że wytwarza się technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, za pomocą którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusa i za pomocą którego wytwarzania włącza się, co najmniej zakończenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a następnie dostarcza się komórkę gospodarza nie wrażliwą na zakażenie przez dziki typ wirusa, transfekuje się komórkę gospodarza rekombinowanym kwasem nukleinowym i wybiera się klony zakaźne.
- 2. Sposób według zastrz. ', znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka BHK-2'.
- 3. Rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
- 4. Cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 4, znamienna tym, że co najmniej jedna sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik wirulencji i/lub znacznik serologiczny została zmodyfikowana tak aby sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik była usytuowana w jednej z otwartych ramek odczytu kodujących białka strukturalne.
- 5. Cząsteczka według zastrz. 4, znamienna tym, że jedną otwartą ramką odczytu jest ORF7.
- 6. Cząsteczka według zastrz. 4, znamienna tym, że jedna otwarta ramka odczytu jest podstawiona przez ORF7 Arteriviridae.
- 7. Cząsteczka według zastrz 4, znamienna tym, że włączona jest do niej, co najmniej jedna dodatkowa sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego.
- 8. Cząsteczka według zastrz. 7, znamienna tym, że heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen.
- 9. Cząsteczka według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że otwarta ramka odczytu została zmodyfikowana.'0. Modyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitroPL 191 258 B1 kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
- 11. Szczepionka obejmująca antygen wirusowy i dopuszczalne farmaceutycznie substancje dodatkowe, znamienna tym, że jako antygen zawiera zmodyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
- 12. Komórka zakażona modyfikowanym wirusem RNA obejmującym rekombinowany kwas nukleinowy zawierający zakaźny klon wirusa, o co najmniej jednej pełnej długości kopii DNA albo transkrybowanej in vitro kopii RNA albo ich pochodnej, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96203024A EP0839912A1 (en) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
PCT/NL1997/000593 WO1998018933A1 (en) | 1996-10-30 | 1997-10-29 | Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL333070A1 PL333070A1 (en) | 1999-11-08 |
PL191258B1 true PL191258B1 (pl) | 2006-04-28 |
Family
ID=8224533
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL333070A PL191258B1 (pl) | 1996-10-30 | 1997-10-29 | Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6268199B1 (pl) |
EP (2) | EP0839912A1 (pl) |
JP (1) | JP3921552B2 (pl) |
KR (1) | KR100437254B1 (pl) |
CN (1) | CN1138859C (pl) |
AT (1) | ATE366314T1 (pl) |
AU (1) | AU719991B2 (pl) |
BR (1) | BR9712592A (pl) |
CA (1) | CA2272046C (pl) |
CZ (1) | CZ294781B6 (pl) |
DE (1) | DE69737886T2 (pl) |
DK (1) | DK0935660T3 (pl) |
ES (1) | ES2290973T3 (pl) |
HU (1) | HUP9903829A3 (pl) |
ID (1) | ID22208A (pl) |
MY (1) | MY117686A (pl) |
PL (1) | PL191258B1 (pl) |
PT (1) | PT935660E (pl) |
SI (1) | SI0935660T1 (pl) |
SK (1) | SK286231B6 (pl) |
UA (1) | UA72433C2 (pl) |
WO (1) | WO1998018933A1 (pl) |
ZA (1) | ZA979732B (pl) |
Families Citing this family (79)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
WO2000053787A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
EP0974660A1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-01-26 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays |
US7132106B2 (en) * | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7618797B2 (en) * | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
CA2290220C (en) | 1998-12-22 | 2013-11-19 | Pfizer Products Inc. | An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof |
AU4482200A (en) | 1999-04-22 | 2000-11-10 | United States Department Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142 |
SK10932002A3 (sk) * | 2000-01-26 | 2002-11-06 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Živý oslabený PRRS vírus obsahujúci ORF 1a, 1b a 2, nukleotidová sekvencia kódujúca vírus, spôsob generovania infekčného živého oslabeného PRRS vírusu, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie |
EP1156111A1 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-21 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Chimeric arterivirus-like particles |
EP1800697B1 (de) | 2001-06-05 | 2010-04-14 | CureVac GmbH | Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt für die Gentherapie |
DE10162480A1 (de) | 2001-12-19 | 2003-08-07 | Ingmar Hoerr | Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen |
US6841364B2 (en) * | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
DE10229872A1 (de) * | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
DE10347710B4 (de) | 2003-10-14 | 2006-03-30 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung |
US7611717B2 (en) | 2004-06-18 | 2009-11-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Identifying virally infected and vaccinated organisms |
KR100872840B1 (ko) | 2004-07-09 | 2008-12-22 | (주)씨아이디 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 전체-길이의감염성이 있는 cDNA 클론 및 이의 용도 |
US20060020227A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Moore Thomas E | Collection means and a method for collecting cord blood |
US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
CN101189027A (zh) | 2005-01-13 | 2008-05-28 | 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 改良的prrs疫苗 |
CA2599322C (en) * | 2005-02-25 | 2013-09-03 | Pfizer Products Inc. | N protein mutants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
CA3033206C (en) | 2005-06-24 | 2021-10-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use |
JP2009506129A (ja) * | 2005-08-30 | 2009-02-12 | ボード・オブ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ネブラスカ | 改善された免疫原性を有するprrsv抗原で動物を予防接種するための方法及び組成物 |
DE102005046490A1 (de) | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen |
EP2046954A2 (en) | 2006-07-31 | 2009-04-15 | Curevac GmbH | NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT |
US7666585B2 (en) | 2007-06-15 | 2010-02-23 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations |
CN101454442A (zh) * | 2007-06-15 | 2009-06-10 | 普泰克国际有限公司 | 嵌合体prrsv的构建,组合物及疫苗的制备 |
EP2181189B1 (en) * | 2007-06-25 | 2012-06-20 | South Dakota State University | Recombinant north american type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use |
WO2009030254A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Curevac Gmbh | Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation |
EP2548960B1 (en) | 2008-01-31 | 2018-01-31 | CureVac AG | Nucleic acids comprising formula (nugixmgnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agents/adjuvant |
WO2010025109A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. | Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs) |
WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 |
US20110053829A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-03 | Curevac Gmbh | Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids |
EP2955230A1 (en) | 2010-07-30 | 2015-12-16 | CureVac AG | Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation |
EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
CA3162352A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Modernatx, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
UA108902C2 (uk) | 2010-11-10 | 2015-06-25 | Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування | |
CA2827337C (en) | 2011-02-17 | 2019-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Commercial scale process for production of prrsv |
MX355058B (es) | 2011-02-17 | 2018-04-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nueva cepa del prrsv europea. |
DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
PT3892295T (pt) | 2011-05-24 | 2023-06-01 | Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh | Vacinas individualizadas para o cancro |
WO2013017570A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells |
US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
PT3682905T (pt) | 2011-10-03 | 2022-04-07 | Modernatx Inc | Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações |
LT2791160T (lt) | 2011-12-16 | 2022-06-10 | Modernatx, Inc. | Modifikuotos mrnr sudėtys |
WO2013113326A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Curevac Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen |
WO2013143555A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Biontech Ag | Rna formulation for immunotherapy |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
CA2868996A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
UA114503C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae |
US9120859B2 (en) | 2012-04-04 | 2015-09-01 | Zoetis Services Llc | Mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
UA114504C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
KR102012109B1 (ko) | 2012-05-17 | 2019-08-19 | 조에티스 엘엘씨 | 이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종 |
PL2922554T3 (pl) | 2012-11-26 | 2022-06-20 | Modernatx, Inc. | Na zmodyfikowany na końcach |
JP6484558B2 (ja) | 2012-11-28 | 2019-03-13 | バイオエヌテック エールエヌアー ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハーBiontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | 癌ワクチンの組み合せ物 |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
WO2014150822A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
WO2014180490A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Biontech Ag | Predicting immunogenicity of t cell epitopes |
SG10201801431TA (en) | 2013-08-21 | 2018-04-27 | Curevac Ag | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
JP2016538829A (ja) | 2013-10-03 | 2016-12-15 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. | 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド |
WO2015062738A1 (en) | 2013-11-01 | 2015-05-07 | Curevac Gmbh | Modified rna with decreased immunostimulatory properties |
HUE061768T2 (hu) | 2013-12-20 | 2023-08-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus variáns, európai PRRS virus cDNS klón, és alkalmazásuk |
EP3129050A2 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-15 | CureVac AG | Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant |
JP6398454B2 (ja) * | 2014-08-13 | 2018-10-03 | セイコーエプソン株式会社 | 圧電駆動装置、ロボット、及び、それらの駆動方法 |
WO2016045732A1 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
WO2016128060A1 (en) | 2015-02-12 | 2016-08-18 | Biontech Ag | Predicting t cell epitopes useful for vaccination |
PT3344289T (pt) | 2015-08-31 | 2020-04-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacinas de pestivírus para tremores congénitos |
WO2017059902A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | 3' utr sequences for stabilization of rna |
WO2017106079A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Hybrid core feline vaccines |
BR112019000887A2 (pt) | 2016-08-05 | 2019-04-30 | Hipra Scientific, S.L.U. | clone de cdna do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina e usos do mesmo |
US11090376B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-08-17 | Zoetis Services Llc | Effective vaccination against European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus prior to weaning |
JP2021514609A (ja) * | 2018-02-28 | 2021-06-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ウイルス混入物質を同定するためのシステムおよび方法 |
CN116716322A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-08 | 中山大学 | 一种denv-3全长感染性克隆及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3137631A (en) * | 1959-12-01 | 1964-06-16 | Faberge Inc | Encapsulation in natural products |
US3359457A (en) * | 1963-10-14 | 1967-12-19 | Triplett Electrical Instr Co | Device for overload protection of electrical equipment |
US3959457A (en) * | 1970-06-05 | 1976-05-25 | Temple University | Microparticulate material and method of making such material |
US4015100A (en) * | 1974-01-07 | 1977-03-29 | Avco Everett Research Laboratory, Inc. | Surface modification |
US4122167A (en) * | 1977-02-09 | 1978-10-24 | Merck & Co., Inc. | Respiratory synctial vaccine |
US4205060A (en) * | 1978-12-20 | 1980-05-27 | Pennwalt Corporation | Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use |
US4224412A (en) * | 1979-05-01 | 1980-09-23 | Dorofeev Viktor M | Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same |
DD145705A1 (de) | 1979-08-31 | 1981-01-07 | Peter Solisch | Herstellungsverfahren von organspezifischen retrovirusimmunpraeparaten fuer prophylaxe,therapie und diagnostik |
US4554159A (en) * | 1981-11-12 | 1985-11-19 | Institute Merieux | Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2) |
US4452747A (en) * | 1982-03-22 | 1984-06-05 | Klaus Gersonde | Method of and arrangement for producing lipid vesicles |
US4468346A (en) * | 1983-10-27 | 1984-08-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins |
DE3405100A1 (de) * | 1984-02-14 | 1985-08-14 | Drägerwerk AG, 2400 Lübeck | Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel |
US4744933A (en) * | 1984-02-15 | 1988-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for encapsulation and encapsulated active material system |
US5008050A (en) * | 1984-06-20 | 1991-04-16 | The Liposome Company, Inc. | Extrusion technique for producing unilamellar vesicles |
US4921706A (en) * | 1984-11-20 | 1990-05-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Unilamellar lipid vesicles and method for their formation |
US4606940A (en) * | 1984-12-21 | 1986-08-19 | The Ohio State University Research Foundation | Small particle formation and encapsulation |
US5206163A (en) * | 1985-07-08 | 1993-04-27 | Chiron Corporation | DNA encoding bovine diarrhea virus protein |
US4753884A (en) * | 1986-01-28 | 1988-06-28 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
FR2602791B1 (fr) | 1986-08-18 | 1988-11-10 | Ministere Agri Direction Quali | Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu |
NZ222465A (en) | 1986-11-07 | 1992-11-25 | Pasteur Institut | Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen |
US5009956A (en) * | 1987-02-24 | 1991-04-23 | Univ Minnesota | Phospholipase A2-resistant liposomes |
DE3833925A1 (de) | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
US5213759A (en) * | 1988-05-05 | 1993-05-25 | Elopak Systems A.G. | Sterilization |
US4927637A (en) * | 1989-01-17 | 1990-05-22 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
US4944948A (en) * | 1989-02-24 | 1990-07-31 | Liposome Technology, Inc. | EGF/Liposome gel composition and method |
US5132117A (en) * | 1990-01-11 | 1992-07-21 | Temple University | Aqueous core microcapsules and method for their preparation |
AU7007491A (en) * | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
ATE118352T1 (de) * | 1991-06-06 | 1995-03-15 | Stichting Centr Diergeneeskund | Erreger der mysteriösen schweinekrankheit,impfstoff-zusammensetzungen und diagnose kits. |
US5846805A (en) * | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
US6982160B2 (en) * | 1991-08-26 | 2006-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions that include SIRS virus |
US6042830A (en) | 1992-08-05 | 2000-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Viral agent associated with mystery swine disease |
CA2076744C (en) * | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Danny W. Chladek | Viral agent associated with mystery swine disease |
US6080570A (en) * | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome |
CA2116348C (en) * | 1991-08-26 | 2001-07-03 | James E. Collins | Sirs vaccine and diagnosis method |
AU2696792A (en) | 1991-09-16 | 1993-04-27 | David A Benfield | Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof |
EP0610250B2 (en) | 1991-10-14 | 2008-10-29 | Intervet International BV | Porcine reproductive respiratory syndrome (prrs) vaccine and diagnostic |
FR2686097B1 (fr) * | 1992-01-14 | 1994-12-30 | Rhone Merieux | Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie. |
US5338543A (en) * | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
TW289731B (pl) * | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
US6251397B1 (en) * | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US5419907A (en) * | 1992-11-10 | 1995-05-30 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Pathogenic porcine respiratory coronavirus |
DK0683816T3 (da) * | 1993-02-08 | 2001-01-08 | Bayer Ag | Fremgangsmåde til dyrkning af porcinreproduktions- og respirationssygdom-virus og dets anvendelse i vacciner |
ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
DE4407489A1 (de) * | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bayer Ag | Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines |
ES2165405T3 (es) * | 1994-04-11 | 2002-03-16 | Akzo Nobel Nv | Cepas de vacuna europeas del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrsv). |
AU2386595A (en) | 1994-04-15 | 1995-11-10 | Children's Hospital Of Philadelphia, The | Aqueous solvent encapsulation method, apparatus and microcapsules |
DK53595A (da) * | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
ES2262142T3 (es) | 1994-08-05 | 2006-11-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Secuencia virica de nucleotidos de vr-2332 y metodos de uso. |
ES2223058T3 (es) * | 1995-03-14 | 2005-02-16 | Akzo Nobel N.V. | Expresion en la misma celula de polipeptidos del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino. |
US5690940A (en) * | 1995-06-21 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof |
ES2102971B1 (es) * | 1996-01-25 | 1998-03-01 | Hipra Lab Sa | Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion. |
US6015663A (en) * | 1996-03-01 | 2000-01-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains |
CN1165342C (zh) | 1996-03-01 | 2004-09-08 | 先灵公司 | 猪生殖和呼吸综合症疫苗 |
US5866401A (en) * | 1996-03-01 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
US5976537A (en) * | 1996-07-02 | 1999-11-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
PT835930E (pt) | 1996-10-09 | 2001-06-29 | Akzo Nobel Nv | Estirpes europeias de vacina do virus do sindroma reprodutivo e respiratorio porcino (prrsv) |
WO2000053787A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
WO1998035023A1 (en) | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Origen, Inc. | Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays |
ES2289781T3 (es) * | 1997-05-06 | 2008-02-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sitios antigenicos prrsv que identifican secuencias de peptidos de virus prrs, para su uso en vacunas de ensayos de diagnosticos. |
US6140486A (en) | 1997-06-04 | 2000-10-31 | Calgene Llc | Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants |
AU7960598A (en) | 1997-06-05 | 1998-12-21 | Origen, Inc. | Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine |
US6391314B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
US7211379B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
US7618797B2 (en) * | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
CA2290220C (en) * | 1998-12-22 | 2013-11-19 | Pfizer Products Inc. | An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof |
US7132106B2 (en) * | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7691389B2 (en) * | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
FR2789695B1 (fr) * | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
AU4482200A (en) * | 1999-04-22 | 2000-11-10 | United States Department Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142 |
US20040213805A1 (en) * | 1999-10-12 | 2004-10-28 | Verheije Monique Helene | Deletions in arterivirus replicons |
WO2002095040A1 (en) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Delections in arterivirus replicons |
US20020012670A1 (en) * | 2000-01-26 | 2002-01-31 | Knut Elbers | Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) |
US7041443B2 (en) | 2000-02-08 | 2006-05-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use |
EP1156111A1 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-21 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Chimeric arterivirus-like particles |
US7018638B2 (en) * | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
US7279166B2 (en) * | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US6841364B2 (en) * | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
EP1350840B1 (en) * | 2002-04-05 | 2012-05-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Adaptation sites of PRRSV |
US7335361B2 (en) * | 2003-06-09 | 2008-02-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine |
US7722878B2 (en) | 2004-06-17 | 2010-05-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PRRSV subunit vaccines |
US7611717B2 (en) * | 2004-06-18 | 2009-11-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Identifying virally infected and vaccinated organisms |
US20060063151A1 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Michael Roof | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
CN101189027A (zh) | 2005-01-13 | 2008-05-28 | 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 改良的prrs疫苗 |
WO2007064742A2 (en) | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof |
WO2008109237A2 (en) | 2007-02-13 | 2008-09-12 | Washington State University Research Foundation | Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
WO2008121958A1 (en) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia |
US20100003278A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof |
WO2010025109A1 (en) | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. | Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs) |
US20100129398A1 (en) * | 2008-11-26 | 2010-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome |
ES2742262T3 (es) | 2010-04-16 | 2020-02-13 | Univ Gent | Vacuna con protección cruzada para el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino |
-
1996
- 1996-10-30 EP EP96203024A patent/EP0839912A1/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-10-29 ID IDW990271A patent/ID22208A/id unknown
- 1997-10-29 PT PT97954491T patent/PT935660E/pt unknown
- 1997-10-29 PL PL333070A patent/PL191258B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 US US09/297,535 patent/US6268199B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 SI SI9730768T patent/SI0935660T1/sl unknown
- 1997-10-29 EP EP97954491A patent/EP0935660B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 AU AU58828/98A patent/AU719991B2/en not_active Expired
- 1997-10-29 DK DK97954491T patent/DK0935660T3/da active
- 1997-10-29 HU HU9903829A patent/HUP9903829A3/hu unknown
- 1997-10-29 ES ES97954491T patent/ES2290973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 KR KR10-1999-7003788A patent/KR100437254B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 DE DE69737886T patent/DE69737886T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 BR BR9712592-0A patent/BR9712592A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-29 WO PCT/NL1997/000593 patent/WO1998018933A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-29 CN CNB97180706XA patent/CN1138859C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 JP JP52032198A patent/JP3921552B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 SK SK547-99A patent/SK286231B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 UA UA99052951A patent/UA72433C2/uk unknown
- 1997-10-29 CZ CZ19991564A patent/CZ294781B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 AT AT97954491T patent/ATE366314T1/de active
- 1997-10-29 MY MYPI97005141A patent/MY117686A/en unknown
- 1997-10-29 CA CA2272046A patent/CA2272046C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 ZA ZA9709732A patent/ZA979732B/xx unknown
-
2001
- 2001-06-05 US US09/874,626 patent/US20020098573A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-12-30 US US10/750,410 patent/US20040197872A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-09-29 US US11/239,529 patent/US8546124B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-09-30 US US14/041,560 patent/US20140030290A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL191258B1 (pl) | Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem | |
CA2366072C (en) | Prrsv vaccines | |
US7273617B2 (en) | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof | |
US7122347B2 (en) | Chimeric Arterivirus-like particles | |
US20040213805A1 (en) | Deletions in arterivirus replicons | |
US20040224327A1 (en) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof | |
Wang et al. | Generation of a recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus stably expressing two marker genes | |
MXPA99003967A (en) | Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20121029 |