CZ156499A3 - Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaný RNA virus - Google Patents

Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaný RNA virus Download PDF

Info

Publication number
CZ156499A3
CZ156499A3 CZ991564A CZ156499A CZ156499A3 CZ 156499 A3 CZ156499 A3 CZ 156499A3 CZ 991564 A CZ991564 A CZ 991564A CZ 156499 A CZ156499 A CZ 156499A CZ 156499 A3 CZ156499 A3 CZ 156499A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
virus
rna
nucleic acid
genome
recombinant nucleic
Prior art date
Application number
CZ991564A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ294781B6 (cs
Inventor
Johanna Jacoba Maria Meulenberg
Johannes Maria Antonius Pol
Ruijter Judy Norma Aletta Bos-De
Original Assignee
Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek filed Critical Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
Publication of CZ156499A3 publication Critical patent/CZ156499A3/cs
Publication of CZ294781B6 publication Critical patent/CZ294781B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Description

Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaný RNA virus (57) Anotace:
Způsob vytvoření infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, který má genom alespoň okolo 15 kb. Způsob vytvoření infekčního klonu, založeného na genomu + RNA viru, kde tento způsob dále zahrnuje selekci infekčních klonů pomocí transfekce hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, kde hostitelská buňka je v podstatě necitlivá k infekci zmíněným virem, jakož i modifikované RNA viry a vakcíny.
i
Infekční klesy LV ; 414.41«
M -MCI »oku
Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaná RNA virus.
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti RNA virů a infekčních klonů, získaných z RNA virů. Dále se týká vakcín a diagnostických testů, které se dají získat použitím a modifikací takovýchto infekčních klonů RNA virů.
Dosavadní stav techniky
Technologie rekombinatní DNA zahrnuje množství různých a velmi účinných technik molekulární biologie, jejichž předmětem je modifikování nukleových kyselin na úrovni DNA a které umožňují analyzování a modifikování genomů na molekulární úrovni. Takovéto manipulace se dají provádět zejména u virů, kvůli malé velikosti jejich genomu. Technologie rekombinantní DNA se však nedá rovnou aplikovat na neretrovirové RNA viry, protože tyto viry neprocházejí při své replikaci stadiem DNA. U takovýchto virů musí být před tím, než na jejich genom může být aplikována technologie rekombinantní DNA, za účelem vytvoření modifikovaného viru, vytvořeny infekční klony (například jako DNA kopie nebo jako in vitro transkribovaná RNA kopie nebo jako derivát jedné z těchto možností). Infekční klony mohou být získány pomocí vytvoření cDNA (zde použito v širším slova smyslu, zhrnujícím kopii DNA kopii RNA, a ne pouze užším slova smyslu, zhrnujícím DNA kopii mRNA) plné délky (genomové délky) • · · · · · ···· • ··· · ···· · ·· · · ····· · · · · · · ··· ··· L ······· ·· • · · ·· ·· ·· · · viru a pomocí následného zjišťování, který transkript, syntetizováný in vivo v buňkách transfekovaných touto cDNA plné délky, je infekční. Infekční transkripty mohou být také získány pomocí in vitro transkripce in vitro ligovaných cDNA fragmentů částečné délky, které zahrnují celý virový genom. Ve všech případech nese RNA všechny modifikace, které byly zavedeny do cDNA, a může být použita pro další pasážování takto modifikovaných virů.
Infekční cDNA klony a infekční in vitro transkripty byly vytvořeny pro velké množství +RNA virů (přehled viz např. Boyer a Haenni, Virology 198, 415-426) s genomem do 12 kb nebo nepatrně větším. Zdá se, že velikost genomu Pestivirů je doposud největší velikostí genomu +RNA virů, ze kterého byly infekční klony připraveny (Moormann et al., J.
Vir. 70 : 763-770).
Problémy spojené s délkou genomu nezahrnují pouze potíže se získáním a udržením dlouhých a stabilních cDNA klonů v bakterii, ale také potíže s infektivitou počátečního RNA transkriptu, jehož replikace v hostitelské buňce musí být provedena bez pomoci virových proteinů, které jsou normálně spojeny s virovou replikací. Pro dosažení úspěšné infekce musí virový transkript interagovat s virem-kódovanými proteiny, zejména s virovou replikázou, a se součástmi hostitelské buňky, jako např. translačním aparátem; struktura virového transkriptu musí tudíž napodobovat virionovou RNA co nejpřesněji. Další problémy mohou vznikat u těch +RNA virů, které se replikují pomocí subgenomových rnRNA, transkribovaných z 3' strany genomu, a u těch +RNA virů, které během své replikace vytváří defektní interferující partikule, jako jsou nahé kapsidy či prázdné partikule, obsahující několik strukturních proteinů, ale pouze část genomu. Přítomnost neúplných virových RNA nebo např. matrixových či nukleokapsidových ·· · ·· ·· ·· ·· ··· ··· ···· • ··· · · ··· · ·· · • · ···· · · · · · · ··· ··· ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·· proteinů, interagujících nebo interferujících s virovou RNA, která má být transkribována, a s RNA, která je intermediátem replikace, a narušujících jejich strukturu, zruší syntézu RNA plné délky a tedy vytvoření infekčního viru, který obsahuje RNA genomové délky.
Lelystad virus (LV), také zvaný PRRSV (porcine reproductive respirátory syndrome virus, velikost genomu 15,2 kb), patří do čeledi Arteriviridae, do které patří také EAV (equine arteritis virus, velikost genomu 12,7 kb), LDV (lactate dehydrogenase-elevating virus, velikost genomu minimálně 14,2 kb) a SHFV (simian hemorrhagic fever virus, velikost genomu přibližně 15 kb). (Meulenberg et al., 1993a; Plagemann a Moennig, 1993).
Nedávno se Mezinárodní výbor pro taxonomii virů rozhodl zařadit tuto čeleď od nového řádu Nidovirales, společně s Coronaviridae (velikost v
genomu 20 až 30 kb) a toroviridae (velikost genomu 26 až 28 kb). Rád Nidovirales představuje obalené RNA viry, které obsahují +RNA genom a které během své replikace syntetizují sadu subgenomových RNA od 3' konce. Subgenomové RNA coronavirů a arterivirů obsahují vedoucí sekvenci, která je odvozena od 5' konce virového genomu (Spaan et al., 1988). Subgenomové RNA torovirů postrádají vedoucí sekvence. (Snijder a Horzinek, 1993). Zatímco ORF la a lb, kódující RNA dependentní RNA polymerázu, jsou exprimovány z genomové RNA, menší ORF na 3' konci genomu Nidovirales, kódující strukturní proteiny, jsou exprimovány ze subgenomových mRNA.
PRRSV (Lelystad virus) byl nejdříve izolován v 1991 Wesvoortem et al. (1991) a ukázalo se, že je příčinou nové nemoci, známé jako PRRSV (porcine reproductive respirátory syndrome virus). Hlavní příznaky této nemoci jsou problémy s dýcháním v prasat a potraty u prasnic. Ačkoliv nevětší rozšíření, nejdříve v USA v 1987 a v Evropě v 1991, byla
0·· snížena, tento virus stále způsobuje ekonomické ztráty ve stádech v USA, Evropě a Asii. PRRSV roste přednostně v plicních alveolárních makrofázích (Wesvoort et al., 1991). Několik buněčných linií, jako je CL2621 a jiné buněčné linie, klonované z buněčné linie opičí ledviny MA-104 (Benfield et al., 1992; Collis et al., 1992; Kim et al., 1993), je k tomuto viru také citlivých. Některé známé PRRSV kmeny jsou známé pod přístupovými čísly CNCM 1-1102, 1-1140, 1-1287, 1-1388, ECACC V93070108 nebo ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR2429, VR 2474 a VR 2402. Genom PRRSV byl úplně nebo částečně osekvenován (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a; Murthaugh et al., 1995) a kóduje, kromě RNA dependentní RNA polymerázy (ORF la a lb), šest strukturních proteinů, z nichž čtyři jsou obalové glykoproteiny, označené jako GP2 (ORF2), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) a GP5 (ORF5), neglykosylovaný membránový protein M (ORF6) a nukleokapsidový protein N (ORF7) (Meulenberg et al., 1995, 1996; van Nieewstadt et al., 1996). Imunologická charakterizace a nukleotidové sekvenování kmenů PRRSV z Evropy a USA odhalilo menší a antigenní rozdíly ve strukturních virových proteinech mezi kmeny PRRSV (Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995).
Prasata mohou být infikována PRRSV oronazální cestou. Virus je v plicích pohlcen alveolárními makrofágy a do 9 hodin je v těchto buňkách dokončena replikace PRRSV. PRRSV cestuje z plic do plicních lymfatických uzlin (do 12 hodin) a do periferních lymfatických uzlin, do kostní dřeně a sleziny (do 3 dnů). V těchto místech se pouze několik buněk barví pozitivně na virový antigen. Virus je přítomen v krvi po dobu alespoň 21 dní a často i mnohem déle. Po 7 dnech se v krvi nacházejí protilátky proti PRRSV. Společná přítomnost viru a ··· ·· · · · · · · • · · · · · ···· • ·«· · ···· · ·· ·
- · ····· · · · · · · ··· ···
J ······· ·· ·· · ·· ·· ·· ·· protilátek proti PRRSV u infikovaných prasat ukazuje, že virová infekce, ačkoliv na nízké úrovni, může přetrvávat po dlouhou dobu, navzdory přítomnosti protilátky. Během alespoň 7 týdnů je populace alveolárních buněk v plicích odlišná od normálních SPF plic.
PRRSV potřebuje k infekci prasat oronazální cestou svůj obal a normální imunitní reakce prasete tedy zahrnuje mezi jinými produkci neutralizačních protilátek, cílených proti jednomu nebo několika obalovým proteinům; takovéto protilátky mohou učinit virus neinfekčním. Je-li však již jednou virus v alveolárním makrofágovi, může také produkovat nahé kapsidy, složené z RNA, enkapsidované M a/nebo N proteinem, někdy částečně obsahující nějaký z glykoproteinů. Intra- a extracelulární přítomnost těchto neúplných virových partikulí nebo (částečně) nahých kapsid může být prokázána elektronovou mikroskopií. Někdy mohou být nalezeny nahé kapsidy bez nukleové kyseliny. Nahé kapsidy jsou roznášeny po těle krevním oběhem a z krve jsou pohlcovány makrofágy ve slezině, lymfatických uzlinách a kostní dřeni. Tyto nahé ale infekční virové kapsidy nemohou být neutralizovány protilátkami, vytvořenými prasetem a tedy vysvětlují přetrvávání virové infekce v přítomnosti protilátek. Tímto způsobem rozšiřuje makrofágové potomstvo z infikovaných buněk kostní dřeně virovou infekci do nových míst těla. Protože ne všechny makrofágy, pocházející z buněk kostní dřeně, jsou infikovány, pouze malé množství makrofágů v periferních místech je infikováno a produkuje virus. V nepřítomnosti jiných virových proteinů mohou být pomocí např. infekce makrofágů chimerním pseudorabies-ORF7 vektorovým virem vytvářeny PRRSV kapsidy, složené pouze z ORF7 proteinů. PRV virus byl upraven tak, aby obsahoval ORF7 genetickou informaci z PRRSV. 18 hodin po infekci obsahovala cytoplazma infikovaných buněk velké • · *· • · · · · · · • fc · · · · · · « • ·· » · · · · · o · • · · · · · ·· · · »· · · množství malých, prázdných, kulových nukleokapsid PRRS viru.
struktur, s velikostí
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález nyní poskytuje infekční klon, odvozený od viru s velikostí genomu, která daleko přesahuje maximální velikost genomu +RNA virů, u kterých byly doposud infekční klony získány. V příkladech provedení vynálezu je popsána příprava infekčního klonu, který je založen a odvozen od PRRS V s velikostí genomu 15,2 kb, ale takovéto klony mohou být nyní získány také pro LDV a SHFV, které také mají velikost genomu okolo 15 kb, a pro EAV, ačkoliv velikost jeho genomu je lehce menší, a pro viry s vyššími velikostmi genomu, jako např. Coronaviridae nebo Toroviridae.
Tento vynález také poskytuje způsob vytvoření infekčního klonu obejitím problémů spojených se syntézou řetězce virové RNA, které jsou spojeny s přítomností nekompletních virových RNA nebo např. matrixových nebo nukleokapsidových proteinů, interagujících nebo interferujících s virovým RNA transkriptem, který má být transkribován, a RNA, která je intermediátem replikace, a narušujících jejich strukturu, které ruší syntézu RNA řetězce plné délky a tedy vytvoření infekčního viru, který obsahuje RNA genomové délky. Tento vynález poskytuje způsob vytvoření infekčních klonů pomocí transfekce hostitelské buňky, která je v podstatě necitlivá k infekci virem divokého typu, rekombinantní nukleovou kyselinou, která je založena na genomu zmíněného viru, po níž následuje zachránění infekčního virového potomstva ze zmíněných hostitelských buněk pasážováním nebo kultivací s buňkami, které jsou citlivé k tomuto viru. Buňky, které • •fc ·» fcfc ·· ·· • fcfc ··· »··· • ··· · ···· * ·· « «·<,·»···«»··>····· ······· ·· ·· · ·· ·· ·· ·· v podstatě nejsou citlivé, mohou, ve srovnání s jinými buňkami, které jsou rutinně používány pro pomnožení studovaného viru, být pouze lehce citlivé nebo úplně necitlivé ke studovanému viru, ale mohou být plně citlivé k jiným virovým kmenům. Vynález poskytuje způsob vytvoření infekčních klonů pomocí transfekce hostitelských buněk, které nejsou citlivé k infekci virem divokého typu, čímž nedochází ke vzniku nahých kapsid nebo neúplných virových partikulí, obsahujících fragmenty RNA a matrixové či nuklokapsidové proteiny, které brání syntéze řetězce virové RNA. Infekční virus je zachráněn z takto transfekovaných hostitelských buněk pasážováním s hostitelskými buňkami, které jsou k tomuto viru citlivé. V příkladech provedení vynálezu je popsáno, jak je tímto způsobem získán infekční klon PRRSV, ale tento způsob se dá také aplikovat na jiné +RNA viry. Předkládaný vynález nyní také poskytuje možnost vytvoření modifikovaného klonu další aplikací technologie rekombinantní DNA. Takovéto modifikace mohou být jednoduché nebo několikanásobné mutace, substituce, delece nebo inzerce nebo jejich kombinace, kterých může být dosaženo pomocí jakékoliv v oboru známé metody technologie rekombinantní DNA. Předkládaný vynález tedy poskytuje modifikované RNA viry, které mohou být použity pro zkoumání RNA virů a pro přípravu vakcín.
Předkládaný vynález nyní také poskytuje infekční klony, například odvozené od Arteriviridae, jako je PRRSV, které mohou být použity jako jadnoúčelové vakcíny proti nemoci, způsobené virem, na kterém je tento infekční klon založen. Například, infekční klon, založený na PRRSV, může být nyní použit pro studium virulenčních markérů nebo serologických markérů PRRSV. Známé serologické markéry jsou například umístěny na kterémkoliv ze strukturních proteinů PRRSV, s
»· « ·· ·· ti ·· » · · · · · · · 9 t t t t 9 9 ··» · · to · • 9999999 9 9 9 9 99 9 · · * • · 9 9 9 9 9 9 9
9 99 99 99 99 kódovaných ORF2-7, ale mohou se také nacházet na proteinech, kódovaných ORF la a lb. Virulenční markéry jsou přítomny v ORF 1 a lb, kódujících nestrukturní proteiny PRRSV, ale mohou se také nacházet na kterémkoliv z proteinů, kódovaných ORF2-7. Upravením genomu infekčního klonu s ohledem na tyto markéry je možno získat PRRSV, který není nebo je mnohem méně virulentní než jeho rodičovský kmen, a/nebo který je upraven deleci nebo zavedením serologických markérů, za účelem umožnění serologické rozlišení mezi očkovanými prasaty a prasaty infikovanými virem divokého typu. Takovéto modifikace jsou například poskytnuty u infekčních klonů PRRSV, ve kterých je sekvence nukleové kyseliny, kódující ORF7 N protein, nahrazena ORF7 proteinem z ATCC VR2332 nebo LDV. Překládaný vynález nyní také poskytuje infekční klony, například odvozené od Arteriviridae, jako např. PRRSV, které mohou být použity jako přenášecí systém nebo virová vektorová vakcína pro velkou řadu antigenů. V takovýchto klonech je inzerována heterologní sekvence nukleové kyseliny, která neodpovídá sekvenci studovaného viru. Takováto heterologní sekvence nukleové kyseliny může být například odvozena od sekvence, kódující jakýkoliv vybraný antigen. Tento antigen je protein nebo peptid, který může indukovat imunitu proti patogenu. Protože tento virus infikuje makrofágy a buňky makrofágové linie v kostní dřeni a roznáší antigen-obsahující virus skze své dceřiné buňky, tato vektorová virové vakcína infikuje ústřední buňky v imunitním systému a může prezentovat antigeny pro další zpracování. Tato vektorová virová vakcína infikuje antigen prezentující buňky, jako dendritické makrofágy nebo Kuppferovy buňky nebo jiné buňky imunitního systému a může to dělat jako (neúplně) obalená virová partikule nebo jako nahá kapsida. Protože infekce nahými kapsidami ·· · ·» ·· *· ·· ··· ··· ···· • · · · · · ··· · · · · • · ···· » · · · · · ··· ··· 4·· 4444 4 4 • 4 4 44 44 44 44 nebo neúplnými virovými partikulemi zajistí přetrvávající infekci, imunologický zesilovací efekt způsobí doživotní (kvůli průběžné stimulaci na nízké úrovni) imunitu proti patogenům, ze kterých byly antigeny vybrány. Po vložení informace pro epitopy jiných patogenních organismů nebo látek, můžeme tento virus použít jako nosič antigenu. Několik takovýchto vektorových vakcínových virů, nesoucích informaci pro cizí epitopy, může být smícháno a podáváno najednou. Toto umožní aktivní imunitu proti několika různým antigenům jednoho patogena, nebo aktivní imunitu proti několika různých patogenům. Předkládaný vynález nyní také poskytuje infekční klony, například odvozené od Arteriviridae, jako je PRRSV, který může být použit jako dvouúčelové vakcíny. Například, infekční klon, založený na PRRSV, může být použit pro vytvoření vakcíny, která chrání proti PRRSV a proti jinému patogenu, jednoduše kombinací vývoje vektorové vakcíny s vývojem směrovaným k vývoji jednoúčelové vakcíny, směrované proti PRRSV. Konkrétní dvouúčelová vakcína, která by chránila proti nemoci dýchací soustavy u prasat, by mohla být vyvinuta inzercí antigenu, odvozených od kteréhokoliv z velké řady jiných patogenů dýchací soustavy, kteří jsou známi u prasat, do PRRS vakcíny.
Tento vynález také poskytuje vakcíny, ať už jednoúčelové, dvouúčelové nebo vektorové, které jsou bezpečné v tom smyslu, že se tyto vakcíny nemohou šířit do prostředí. Bezpečnost vakcín (nešíření se) může být zajištěna delecí informace pro ty virové proteiny, které jsou třeba pro tvorbu obalených, infekčních virů. Tento virus musí být množen v buněčné linii, která konstitutivně exprimuje tento protein. Virus, replikující se v této komplementární buněčné linii, mé úplný obal a je schopen infekce makrofágů v praseti. Po jednom replikačním cyklu již potomstvo viru, kterému chybí informace pro obalový protein, není • · schopno infekce jiných buněk jako obalený virus. Infekce makrofágů v těle je stále možná nahými kapsidami nebo neúplnými virovými partikulemi.
Tento vynález také poskytuje virové antigeny a proteiny, které mohou být sklizeny z buněčných kultur, které byly infikovány upravenými RNA viry podle tohoto vynálezu. Takovéto antigeny mohou být použity v diagnostických pokusech, jako je ELISA nebo jiné typy diagnostických pokusů, známých v oboru. Takovéto pokusy mohou být použity jako samostatné testy pro primární diagnózy nebo jako doprovodné testy, aplikované u zvířecích populací, které byly očkovány rozlišovací nebo markerovou vakcínou, založenou na modifikovaném RNA viru podle tohoto vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Vytvoření cDNA klonu LV genomové délky. Horní část (A) ukazuje fúzi cDNA klonů, které byly dříve sekvenovány (Meulenberg et al., 1993a) v pGEM-4Z. pABV čísla klonů a restrikční místa, která byla použita, jsou uvedena. Černé obdélníky představují ty části cDNA klonů, které jsou fúzovány dalším klonovacím kroku. Světle šedé obdélníky, označené s R. T., jsou cDNA klony, vytvořené pomocí RTPCR a tmavě šedý obdélník představuje nový cDNA klon, vytvořený pomocí PCR. Dolní část (B) ukazuje spojení větších částí cDNA klonů pABV331/369, pABV384 a pABV368 s pABV396 klonem 5' konce, který obsahuje promotor pro T7 RNA polymerázu, a pABV395 klonem 3' konce, který obsahuje poly(A) konec, v nízkokopiovém vektoru pOK12. Restrikční místa v rámci a mimo mnohonásobného klonovacího místa pOK12 jsou uvedena. Místa pro restrikční endonukleázy jsou A, Apal; Ap, Apol; B, BamHI; Bg, BglII; Bs, BspEI; Bc, Bell; E, EcoRI;
• · β ·· · · ·· ·· • · · ··· ···· • ··· · · · · · · ·· · · · ···· · · · · · · ··· ··· ······· ·· • · · ·· ·· ·· ··
Ec, EcoRV; H, HindlII; K, KpnI; Ν, Narl; Nc, Ncol; S, SacII; Sp, Spěl;
Sa, Sáli; Sc, Seal; P, Pstl; Pm, PmlI; X, Xbal; Xh, Xhol.
Obrázek 2. Terminální sekvence klonované LV cDNA plné délky a infekční RNA, transkribované z tohoto cDNA klonu. cDNA klony genomové délky byly linearizovány Pvul a byly transkribovány v přítomnosti syntetického analogu čepičky m7G(5 ')ppp(5 ')G T7 RNA polymerázou. Výsledná RNA by měla obsahovat jeden nukleotid (G) navíc ne 5' konci a dva nukleotidy (GC) na 3' konci. Šipky u RNA odpovídají 5' a 3' koncové nukleotidy, odpovídající původní LV RNA sekvenci.
Obrázek 3. Růstové křivky LV viru divokého-typu TH, LV4.2.1 a rekombinantních virů vABV414 a vABV416 ve vepřových alveolárních makrofázích (A) a CL2621 buňkách (B). Rekombinantní viry vABV414 a vABV416, vytvořené v buňkách BHK-21 byly použity buď přímo (BHK) nebo po několikanásobné multiplikaci ve vepřových alveolárních makrofázích (PAM). TH virus byl připraven ve vepřových alveolárních makrofázích (PAM), zatímco LV4.2.1 byl připraven v buňkách CL2621 (CL). Buněčné kultury byly infikovány uvedenými viry při MOI 0,05 a sklizeny v uvedených časech. Titry virů (TCID50/ml) byly určeny na vepřových alveolárních makrofázích nebo buňkách CL2621 konenčým ředěním.
obrázek 4. Zavedení unikátních míst PacI s Swal do infekčního cDNA klonu LV. PacI a Swal místa byla vytvořena pomocí PCR-řízené mutageneze, jak jest popsáno v příkladech provedení vynálezu. cDNA fragmenty, obsahující PacI a Swal, byly vloženy do pABV414, za použití unikátních Hpal a Wbal míst, která jsou uvedena. Výsledkem toho byly jednotlivě pABV437 a pABV442.
• · • · • · · · • · · · • ······· · · ·· ··· ··· • · · · · · · · · ·· * · · ·· · · 9 9
Příklady provedení vynálezu
Příprava cDNA klonů, ze kterých mohou být in vitro transkribovány infekční RNA, se stala důležitým nástrojem technik molekulární genetiky +RNA virů. Tato technologie je aplikovatelná na +RNA viry, jejichž RNA genomy mohou sloužit jako mRNA a zahajují celý infekční cyklus, po zavedení do příslušných hostitelských buněk. Pro řadu virů byly popsány infekční klony, které usnadňují studie genové exprese, replikace, funkce virových proteinů a rekombinace RNA virů (přehled viz Boyer a Haenni, 1994). Tyto klony mohou být dále využity pro přípravu nových virových vektorů a vakcín. Infekční cDNA klony pro Arteriviry doposud nebyly popsány. Popisujeme zde přípravu infekčního klonu PRRSV a jeho první využití pro vytvoření chimerních PRRVS virů.
Příklad 1
Materiály a metody
Buňky a viry
Kmen Ter Huurne PRRVS (nebo LV) (uložený v CNCM, Paříž, pod přístupovým číslem 1-1102) byl izolován v roce 1991 (Wensvoort et al.,
1991) a rostl v alveolárních makrofázích nebo v buňkách CL2621. V této studii byla použita pasáž 6 kmene Ter Huurne (TH), stejně jako od tohoto kmene odvozený kmen LV4.2.1, který byl sériovým pasážováním upraven pro růst na buňkách CL2621. Alveolární makrofágy byly udržovány na mediu RPMI 1640 growth medium (Flow), kdežto buňky CL2621 byly udržovány na mediu Hank's minimal essential medium (Gibco-BRL/Life technologies). Buňky BHK-21 byly udržovány na mediu Dulbecco's minimal essential medium. Pro transfekční pokusy • · · « · 4 ···· • ··· · ···· · ·· ·
..................
· · » · · · · 4 · ·· 4 · · · · tt · · byly buňky BHK-21 kultivovány na mediu Glasgow minimal essential medium (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd), podle metody Lijestróma a Garoffa (1993).
Izolace virových RNA
Intracelulární RNA byla izolována z alveolárních makrofágů nebo buněk CL2621 24 hodin po infekci PRRSV, při několikanásobné infekci makrofágů, jak bylo popsáno dříve (Meulenberg et al., 1993a). Za účelem izolace virionové genomové RNA, byly viriony purifikovány v sacharozovém gradientu, jak jest popsáno Nieuwstadtem et al., (1996) a poté byly resuspendovány v TNE (0,01 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M NaCl, lmM EDTA). K 1 ml purifikovaných PRRSV virionů (108 TCID50) byl přidán 1 ml pufru pro Proteinkinázu K (100 mM TrisHCl, pH 7,2, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2% (w/v) SDS) a 0,4 mg Proteinkinázy K (Boehringer Mannhaim). Tato reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 30 min. RNA byla jednou extrahována směsí fenol/chloroform (1:1) a vysrážena ethanolem. RNA byla skladována v ethanolu při - 20°C. Desetina takto připravené RNA byla použita pro reakce reverzní transkripce (RT)
Klonování 5' a 3 konců genomu PRRSV.
5' konec virového genomu PRRSV byl klonován za použití upraveného postupu jenořetězcové ligace do jednořetězcové cDNA (SLIC; Edwards et al., 1991). Jedna desetina virionové RNA, připravené tak, jak je popsáno výše, byla použita pro RT s primerem 11U113 (5'TACAGGTGCCTGATCCAAGA 3'), který je komplementární k nukleotidům 1232 až 1251 genomu. RT byla provedena v konečném objemu 20 pl, jak bylo popsáno dříve (Meulenberg et al., 1993b).
Následně byly do RT reakce přidán 2 pl NaOH a RNA byla hydrolyzována po dobu 30 min při 37 °C. Jednořetězcová cDNA byla purifikována za použití soupravy High pure PCR product purification kit od Boehringer Mannhaim. Purifikovaná cDNA byla výsrážená ethanolem, resuspendována v TE a ligována s nástavcem ALG3 (5' CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTA 3 ) Tento primer obsahuje EcoRI, Clal a BamHI místa a jeho 3' konec je modifikován aminoblokující skupinou pro zamezení samoligaci. Jednořetězcový cDNA produkt byl ligován v roztoku se 4 pmol ALG3 v 50 mM 50 TrisHC1 (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 10 μί/ml BSA, 25% PEG, 1,0 mM Hexamine Cobaltchloride, 40 μΜ ATP a 0,5 μί (10 U) T4 RNA ligázy (New England Biolabs) přes noc při pokojové teplotě. Jedna třetina ligační reakce byla použita jako templát v PCR s primery LV68 (5' AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC 3) a ALG4 (5' GAAGGATCCAGAATCGATAG 3'), Primer LV69 je komplementární k nuklotidům 594 až 615 LV genomu, zatímco ALG4 je komplementární k nástavci ALG3. Použity byly takové podmínky PCR, jako ty popsané v Meulenberg et al. (1993b) a získaný produkt byl štěpen EcorI a Sáli a klonován do pGEM-4Z. Obdobný postup byl použit pro klonování 5' konce LV genomu z intracelulární LV RNA. Pro tyto pokusy bylo použito 10 μί totální buněčné RNA, izolované z buněk CL2621, které byly infikovány LV. 5'cDNA byly sekvenovány a jeden klon, pABV387, který obsahoval prodloužení o 10 muklotidů ve srovnání s publikovanou PRRSV sekvencí (Meulenberg et al., 1993a) byl použit pro další pokusy.
Klony 3'koncové cDNA obsahující dlouhý poly(A) konec byly vytvořeny pomocí reverzní transkripce LV RNA s primerem LV76 (5'TCTAGGATTCTAGACGATCG(T)40 3'), který obsahuje EcoRI, Xbal a Pvul místa. Reverzní transkripce byla následována PCR s primery LV 75 (5'TCTAGGAATTCTAGACGATCGT 3'), který je identický s LV76 • · • · s výjimkou poly(T) prodloužení, a 3970R (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAA 3'), sense primerů, který odpovídá nukleotidům 14566-14585 LV genomu a obsahuje Hpal místo. Výsledné produkty byly štěpeny Hpal a EcoRI a klonovány do pABV39, který byl štěpen stejnými enzymy (obr. I). Dva cDNA klony, obsahující poly(A) prodloužení, o 45 A (pABV382) a 109 A (pABV392), a správnou genomovou cDNA sekvenci, jak bylo zjištěno oligonukleotidovým sekvenováním, byly použity pro vytvoření klonu cDNA plné genomové délky.
Sekvenční analýza.
Oligonukleotidové sekvence byly určeny pomocí soupravy PRISM™ Ready Reaction Dye Deoxy™ Terminátor Cycle Sequencing Kit a automatického sekvenátoru od Applied Biosystems.
Příprava klonů PRRSV cDNA plné genomové délky.
cDNA klony, vytvořené před určením nukleotidové sekvence genomu LV (Meulenberg et al., 1993a) byly ligovány spolu ve vhodných restrikčních místech, jak jest ukázáno na obrázku 1. Plazmid pABV254 byl vytvořen z pABV klonů 25, 11, 12 a 100 a byl použit v předešlé studii (den Boon et al., 1996). Standardní klonovací techniky byly provedeny podle Sambrook et al., (1989). Výsledkem byly tři vysokokopiové plazmidy pGEM-4Z, obsahující překrývající se cDNA sekvence LV. Plazmidy pABV331 a pABV369 obsahují nukleotidy 5 až 6015 z LV genomu. V pozici 3462 byl nalezen nukleotidový rozdíl v poměru 1 : 1 v sadě 6 nezávislých cDNA klonů, které byly sekvenovány v tomto úseku. Tento nukleotidový rozdíl měl za následek aminokyselinovou substituci v pozici 1084 v ORF1A (Leu místo Pro). Protože jsme nemohly předpovědět vliv této aminokyseliny na • · · infektivitu, nakloňovali jsme také Leu kódující fragment do pABV331 výměnou v místech EcoRV (nukleotid 3403) a SacII (nukleotid 3605), výsledkem čehož byl pABV369. Plazmid pABV384 obsahuje nuklotidy 5168 až 9825 LV genomu. Protože ještě neexistoval vhodný cDNA klon, který by měl překryv s plazmidy pABV20 a pABV5 a který by mohl být fúzován s cDNA sekvencemi pABV331 a pABV369, byly vytvořeny dva cDNA fragmenty pomocí RT-PCR. V jednom PCR byl použit sense primer LV59 (5' TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG 3'), odpovídající nukleotidům 5169-5186, a antisense primer 61U303 (5 CATCAACACCTGTGCAGACC 3'), kompementární k nukleotidům 6078 až 6097. V druhém PCR byl použit sense primer 61U526R (5' TTCCTTCTCTGGCGCATGAT 3'), odpovídající nukletidům 59365955, a LV60 (5' GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC 3 ), kompementární k nukleotidům 6727 až 6745. Tyto dva PCR fragmenty spolu byly ligovány do pABV20, za použití místa Xbal, které bylo v LV59, a vnitřního místa Apol (nukleotidy 6006) a místa BamHI na nukleotidu 6740, které bylo také v primerů LV60. Nový cDNA fragment byl úplně osekvenován a neobsahoval žádné mutace, které by měly za následek aminokyselinové rozdíly s publikovanou sekvencí (Meulenberg et al., 1993a). Plazmid pABV368 obsahuje nukleotidy 8274 až 13720 PRSV genomu. Protože další ligace cDNA fragmentů do pGEM-4Z měla za následek nestabilní klony, byly inzerty pABV331/369, pABV384 a pABV 368 ligovány s 5' a 3' koncovými cDNA fragmenty do pOK12 (Viera a Messing, 1991). Má se za to, že plazmidový vektor pOK12 je vhodnější pro klonování větších cizorodých cDNA sekvencí, protože má nižší kopiové číslo něž pGEM4Z. Kmen Escherichia coli DH5a byl transformován těmito plazmidy, • · · • · · · • · * · · · · fc · ·· · · · ·· ·· ·· byl kultivován při 32 °C v přítomnosti 15 μ g/ml kanamycinu, za účelem udržení co nejnižšího kopiového čísla. Nejprve byly vyštěpeny cDNA fragmenty pABV382 ((A)45) a pABV392 ((Ajios») pomocí štěpení EcoRI a modifikace tohoto místa Klenowovým fragmentem (Pharmacia) pro zatupení, následované štěpením BamHI. Tyto fragmenty byly klonovány do pOK12, který byl štěpen BamHI a FspI, kde toto druhé místo bylo také zatupeno. Výsledkem byly pABV394 a pABV395.
Tímto způsobem byl odstraněn T7 RNA polymerázový promotor, přítomný na pOK12. Poté byly s 3' cDNA klony ligovány cDNA fragmenty pABV368 a pABV384, za použití místa Bell (nukleotid 13394), místa Seal (nukleotid 8657) a míst BamHI a BglII, v koncové nebo vektorové sekvenci. Výsledkem tohoto byly plazmidy pABV401 a pABV 402 (obr. 1).
5' cDNA klon, obsahující T7 RNA polymerázový promotor, přímo fúzovaný s 5' koncem LV genomu, byl amplifikován pomocí PCR z pABV387 s primery LV83 (5'
GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTA
TTCC 3') a LV69. LV83 je ve směru 5' k 3' složen z míst EcoRI a Spěl a sekvence T7 RNA polymerázového promotoru, jednoho G pro iniciaci transkripce a nukleotidů 1 až 19 z LV genomu. Tento PCR fragment byl klonován do EcoRI a Sáli míst pOK12, výsledkem čehož byl pABV396. Správná sekvence pABV396 byla stanovena pomocí oligonukleotidového sekvenování. Následně byly vyštěpeny fragmenty LV cDNA z pABV331 a pABV369 pomocí Apal a BamHI a byly ligovány do pABV396, který byl štěpen Apal a BamHI. Nakonec byly výsledné 5'cDNA fragmenty klonovány do pABV401 a pABV402, za použití Spěl místa upstream od T7 RNA polymerázového promotoru a jedinečného Plml místa v pozici 5168 virového genomu. Tímto • · • · to • · · · • * ···· · · · · · to ··· ··· ··· ··· · · ·· · ·* ·· ·· ·· způsobem byly získány klony cDNA plné délky, odpovídající virům, podobajícím se rodičovskému kmenu, a chimerním virům, obsahujícím cizí otevřené čtecí rámce.
Příklad 2
Příprava mutantních virů, obsahujících PacI a /nebo Swal místa.
Pro zavedení jedinečného PacI místa do klonu cDNA genomové délky, přímo downstream od genu ORF7, byly nukleotidy T a A v pozicích 14987 a 149888 oba zaměněny za A pomocí PCR, za použití sense příměru LVI 08 (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAG CC 3') společně s primerem LV12 (5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3') a sense primerem (5 TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG 3') s LV75. Obdobně bylo vytvořeno jedinečné Swal místo záměnou G v pozici 14980 za T a T v pozici 14985 za A pomocí PCR s primery LV108 a LVI 10 (5' CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC 3') a primery LVI09 (5' GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG 3 ) a LVI 11. PCR fragmenty byly ligovány do pABV395 za použití míst PacI a Swal a ohraničujících míst Hpal a Xbal, což mělo za výsledek pABV427 respektive pABV426. Tento fragment byl poté vložen do pABV414, za použití stejných unikátních míst Hpal a Xbal, výsledkem čehož byly pABV437 respektive pABV442 (viz obr. 4). Za účelem detekce markerové mutace ve viru, získaném z transkriptu pABV437 a pABV422, byla ze supernatantů infikovaných vepřových alveolárních makrofágů izolována RNA. Tato RNA byla použita pro RT-PCR, za účelem amplifikace fragmentu délky přibližně 0,8 kb (zahrnujícího nukleotidy 14576-polyA různé velikosti), s primery LV76, LV75 a ··· ·· ·· · · · · • · · ··· · · · · j j J.Í. . I J J*’. · *·.ϊ ’··!
*.· · · · · · · • · · ·· ·· ·· · ·
30U70R. Přítomnost genetického markéru byla detekována štěpením těchto PCR fragmentů enzymy PacI nebo Swal.
Příklad 3
In vitro transkripce a transfekce RNA
Plazmidy pABV414, pABV416, obsahující genomovou LV cDNA plné délky, byly linearizovány v místě Pvul, které je umístěno přímo downstream od poly(A) konce. Plazmid pABV296, což je ORF4 v Semliki Forest virus (SFV) expresním vektoru pSFVl (Meulenberg et al., 1997) byl linearizován pomocí Spěl a posloužil jako kontrola pro in vitro transkripční a transfekční pokusy. Tyto linearizované plazmidy byly precipitovány ethanolem a 1,5 pg těchto plazmidů bylo použito pro in vitro transkripci T7 RNA polymerázou (plazmidy pABV414 a pABV416) nebo Sp6 RNA polymerázou (pABV296), podle metod, popsaných pro SFV Liljetrómem a Garoffem (1991 a 1993). In vitro transkribovaná RNA byla precipitována isopropanolem, promyta 70% ethanolem a uložena při -20 °C až do použití. BHK-21 buňky byly zaočkovány na misky M6 (přibližně 106 buněk/misku) a byly transfekovány 2,5 pl RNA za použití 10 pl lipofektinu, jak jest popsáno Liljetrómem a Garoffem (1993). Alternativně, byla RNA zavedena do BHK21 buněk elektroporaci. V tomto případě bylo přibližně 107 BHK21 buněk transfekováno 10 pg in vitro transkribované RNA nebo 10 pg intracelulární LV RNA, za použití elektroporačních podmínek popsaných Liljetrómem a Garoffem (16). Medium bylo sklizeno 24 hodin po transfekcí a bylo přeneseno k buňkám CL2621, za účelem zachránění infekčních virů. Transfekované a infikované buňky byly testovány na expresi LV-specifických proteinů pomocí IPMA (immuno peroxidase monolayer assay), v podstatě tak, jak jest popsáno ve • · on · · ···· · · · · · ·
Z-V · · · * · · · • · · · · · ·
Wensvoort et al., (1986). V IPMA byly pro barvení použity monoklonální protilátky (MAb) 122,13, 122,59, 122,9 a 122,17, směrované proti proteinům GP3, GP4, M a N (van Nieuwstadt et al.,
1996).
Výsledky
Rekonstrukce 5' terminální sekvence genomové RNA LV.
Ačkoliv byla již popsána infektivita in vitro transkribovaných RNA se zkrácenými 5' konci (Davis et al., 1989, Klump et al., 1990), má se obecně ze to, že pro získání infekčních klonů je zapotřebí celá virová sekvence, včetně nejzažších 5'a 3' konců. Pro klonování 5' konce LV genomu byla použita upravená metoda jednořetězcové ligace do jednořetězcové cDNA (SLIC, Edwards et al., 1991). RNA, izolovaná z buněk CL2621 infikovaných LV, a LV RNA z purifikovaných virionů byla reverzně transkribována za použití primeru LV69, který byl komplementární s 5'koncem ORF1A. První řetězec cDNA byl ligován s nástavcem ALG3, jehož 3' konec byl blokován proti samoligaci. Tyto ligované produkty byly amplifikovány pomocí PCR a klonovány. Dvanáct klonů, odvozených od LV intracelulární RNA, které byly výsledkem dvou nezávyslých PCR, a čtrnáct klonů, odvozených od virionové RNA, které byly výsledkem dvou nezávyslých PCR, bylo sekvenováno. Z těchto 26 cDNA klonů obsahovalo 22 klonů prodloužení o 10 nukleotidů (5' ATGATGTGTA 3'), ve srovnání s cDNA sekvencí, která byla dříve publikována (Meulenberg et al., 1993a), zatímco 4 klony postrádaly 1 až 3 nukleotidy na 5'konci této přídavné sekvence (tabulka 1). Toto nás vedlo k závěru, že těchto 10 nukleotidů představuje nejzažší 5' konec LV genomu, a byly tudíž zahrnuty do cDNA klonu plné délky.
• · • · ··**···«« • · · · · · ·
Příprava klonů cDNA plné genomové délky LV.
Za účelem vytvoření klonů cDNA plné genomové délky LV, byly cDNA, které byly dříve izolovány a osekvenovány (Meulenberg et al., 1993a), spolu spojeny ve sdílených restrikčních místech, podle strategie, která je zobrazena na obrázku 1. Dále byly vytvořeny nové cDNA fragmenty pro sestavení klonu cDNA plné délky. Jeden cDNA fragment, obsahující nukleotidy 5168 až 6740 byl vytvořen pomocí RTPCR, za účelem umožnění ligace cDNA sekvencí z klonů pABV5 a pABV20. T7 RNA polymerázový promotor pro in vitro transkripci byl přímo spojen s 5'koncem genomu LV pomocí PCR a tento nový cDNA fragment, klonovaný v pABV396, byl inzerován od klonu cDNA plné genomové délky. Přesekvenování nukleotidů 3420 až 3725 v šesti nových a nezávislých cDNA klonech ukázalo, že v aminokyselinové pozici 1084 v ORFla jsou přítomny Leu a Pro v poměru 1:1. Protože jsme nemohly předpovědět vliv této aminokyseliny na infektivitu RNA transkribované z konečného klonu cDNA genomové délky, použily jsme pro vytvoření tohoto klonu obě. Na 3' konci byly použity dva různé cDNA klony. Již dříve jsme izolovaly 3'koncové cDNA klony, obsahující poly(A) konce maximálně 20 A (Meulenberg et al., 1993a). Avšak vzhledem ke studiím, týkajícím se délky poly(A) konce příbuzných virů jako LDV (Chen et al., 1994), jsme očekávaly, že je úplný poly(A) konec mnohem delší. Proto byly vytvořeny nové 3' koncové cDNA klony, za použití primerů LV76, který obsahuje prodloužení o 40 T zbytků. Tyto cDNA klony byly sekvenovány a obsahovaly prodloužení 40 až 109 A zbytků. cDNA klon, obsahující nejdelší poly(A) konec (109 A; pABV392), byl použit pro klon cDNA genomové délky. Protože dlouhé homo-polymerní úseky mohou bránit replikaci plazmidů v E. coli. (Deng a Wu, 1981), vyselektovali jsme • · · · také druhý klon pABV382, obsahující 45 A zbytků, pro použití v následných klonovacích krocích. Dříve bylo pozorováno, že zachování klonu cDNA genomové délky ve vysokokopiových plazmidech vede k akumulaci mutací nebo delecí, které mají za následek ztrátu infektivity transkriptů, syntetizovaných z těchto klonů (Lai et al., 1991; Rice et al., 1987; Sumiyoshy et al., 1992). Pozorovaly jsme také nestabilitu plazmidů, když jsme se pokusily ligovat větší cDNA fragmenty pABV klonů 331/369, 384 a 368 s 5' a 3' konci do pGEM-4Z a proto jsme nakonec spojily tyto klony spolu v nízkokopiovém vektoru pOK12 (Viera a Messing, 1991). Výsledkem tohoto byly klony cDNA genomové délky pABV 414/415 a 416, které mohly být stabilně množeny v E. coli, za použitých kultivačních podmínek. Nebyly pozorovány žádné rozdíly ve stabilitě klonů cDNA genomové délky, které obsahovaly 45 nebo 109 A zbytků.
Infektivita LV RNA.
LV roste přednostně ve vepřových alveolárních makrofázích. Ukázalo se, že se LV množí v buněčných liniích CLS2621 nebo jiných klonech odvozených od buněčné linie MA104 opičí ledviny (Befield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993). Buňky CL2621 byly tudíž použity pro určení optimálních podmínek pro transfekci LV RNA RNA izolovaná z CL2621 buněk, které byly infikované LV, byla transfekována do CL2621 buněk v různých dávkách, za použití různých metod, jako je metoda vužívající lipofektin, Íipofektamin, DEAEdextran a elektroporace. Buňky byly testovány na cytopatický účinek a plaky 7 dní po transfekci, ale tyto signály virové infekce nebyly detekovatelné. Navíc, v IPMA nebyly za použití LV-specifických MAb detekovatelné žádné LV-specifické antigeny. RNA, transkribovaná in vitro z pABV269, byla v těchto pokusech použita jako kontrola.
Plazmid pABV296 sestává z 0RF4 genu, který kóduje GP4, inzerovaného v expresním vektoru pSFVl (Meulenberg et al., 1997).
Transfekční úspěšnost RNA z pABV296 byla testována barvením transfekovaných buněk v IPMA pomocí GP4 specifických MAb.
Nejvyšší transfekční úspěšnosti, jejímž výsledkem bylo 0,01 % pozitivních CLS261 buněk, bylo dosaženo elektroporací, zatímco za podobných podmínek u BHK-21 buněk bylo získáno 80-90 % pozitivních buněk. Tyto výsledky naznačily, že CLS2621 buňky nejsou vhodné pro transfekční pokusy, zatímco BHK-21 buňky (necitlivé k infekci virem divokého typu) se překvapivě ukázaly jako velmi vhodné. Pro testování infektivity LV RNA byly tudíž použity buňky BHK-21. Přibližně 106 BHK-21 bylo pomocí lipofektinu transfekováno 2 pg RNA, izolované z buněk CL2621 infikovaných LV, za podmínek popsaných pro SFV (Liljetróm a Garoff, 1993). Dvacet čtyři hodin po transfekcí, byly buňky barveny LV-specifickou MAb 122,17, která je směrována proti proteinu N z LV. Přibližně 3-10 individuálních buněk bylo barveno pozitivně, ale pozorována nebyla žádná infekční centra ani plaky, které by naznačovaly šíření z buňky na buňku. Výsledkem transfekce kontrolní RNA, transkribované z pABV296, bylo 60-70 % pozitivních BHK-21 buněk, za použití stejných podmínek. Supernatant z BHK-21 buněk, transfekovaných intracelulární LV RNA a RNA z pABV296 byl přenesen na CL2621 buňky. Po 3 až 4 dnech byly na buňkách, které byly inkubovány se supernatantem z BHK-21 buněk, transfekovaných intracelulární LV RNA, pozorovány plaky. Ty nebyly pozorovány u buněk, které byly inkubovány se supernatantem, transfekovaných RNA z pABV296. Tyto plaky byly v IMPA pozitivně barveny LV-specifickými MAb. Podobné výsledky byly získány, když byla použita RNA izolovaná z virionů LV. Počet pozitivně barvených • · ·· · ·· ·· • · · · · · • ··· · ···· : : ··:· *: :: : * ·· · ·· ·· buněk se navíc zvýšil 2 až 4 krát, když byly transfekovány elektroporací. Tyto údaje naznačují, že LV není schopen infikovat buňky BHK-21, protože nejpravděpodobněji postrádají receptor pro LV. Když je však již jednou genomová RNA do BHK-21 buněk vpravena, jsou produkovány nové infekční virové partikule a ty jsou sekretovány do media. Reinfekce již transfekovaných BHK-21 buněk těmito partikulemi, což jsou bud’ nahé kapsidy nebo úplně či částečně obalené partikule, také není možná.
In vitro syntéza infekční RNA
Protože -- k PRRSV divokého typu v podstatě necitlivé — BHK-21 buňky byly vhodné pro záchranu viru z intracelulární LV RNA a citlivé buňky CL2621 vhodné nebyly, byly pro testování, zda je RNA, transkribovaná z klonu cDNA genomové délky, infekční, použity BHK21 buňky. Plazmidy pABV414/416 byly linearizovány Pvul a transkribovány in vitro za použití T7 RNA polymerázy. Pvul místo je umístěno downstream od poly(A) tak, že transkribovaná RNA obsahuje 2 nevirové nukleotidy na 3'konci (obr. 2). Transkripty by navíc měly obsahovat nevirový G na 5' konci, který je počátečním místem transkripce T7 RNA polymerázy. Přibližně 2,5 pg in vitro transkribované RNA bylo transfekováno do BHK-21 buněk, společně s 2 pg intracelulární LV RNA, sloužícími jako pozitivní kontrola pro následnou záchranu viru v CL2621 buňkách, a s RNA z pABV296, sloužící jako pozitivní kontrola pro RNA transfekci do BHK-21 buněk a negativní kontrola pro následnou záchranu viru v CL2621 buňkách. 24 hodin po transfekci byl supernatant z buněk sklizen a buňky byly fixovány a barveny v IPMA N-specifickou MAb 122,17. Zatímco na miskách s BHK-21 buňkami, které byly transfekovány intracelulární LV RNA, bylo pozorováno pouze několik pozitivních buněk, na miskách s • ·· 44 99 99
9 9 4 4 4 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 · · ···· · · · · · · ··· ···
9 9 9 9 9 9 4 ·
4 44 44 44 44
BHK-21 buňkami, které byly transfekovány RNA transkribovanou z pABV414/416, bylo pozorováno 800 až 2700 pozitivních buněk. Za účelem kontroly, zda byl z buněk uvolněn infekční virus, byly supernatanty použity k infekci CL2621 buněk. Plaky byly vytvořeny v CL2621 kulturách, které byly infikovány supernatantem z BHK-21 buněk, které byly transfekovány LV RNA a transkripty pABV414/416.
Plaky byly obarveny pozitivně v IPMA MAb proti proteinům N, M,
GP4 a GP3, což naznačuje, že všechny tyto proteiny byly správně v
exprimovány. Zádně plaky ani barvení v IPMA nebylo pozorováno v CL2621 kulturách, které byly inkubovány se supernatantem z BHK-21 buněk, které byly transfekovány RNA transkribovanou z pABV296.
Tyto výsledky tudíž jasně ukazují, že transfekce BHK-21 buněk RNA, transkribovanou z cDNA klonů genomové délky pABV 414 a pABV 416, má za následek produkci a uvolňování infekčního LV. Navíc, když byly BHK-21 buňky transfekovány transkripty pABV414 a pABV416 pomocí elektroporace místo lipofektinu, bylo dosaženo 2 až 4 násobného zvýšení pozitivního barvení buněk LV-specifickými protilátkami. Titr rekombinantních virů v supernatantech těchto elektroporovaných BHK-21 buněk byl přibližně 105 TCIDso/ml. Růstové křivky infekční kopie viru ve srovnání s Ter Huurne a LV4.2.1:
Růstové charakteristiky zachráněného viru
Počáteční transfekční a infekční pokusy naznačily, že zachráněné rekombinantní viry, označené jako vABV414 a vABV416, infikují a rostou stejně dobře ve vepřových alveolárních makrofázích, ale rostou pomaleji v CL2621 buňkách než virus, zachráněný z BHK-21, které byly transfekovny intracelulární LV RNA. Tato intracelulární LV RNA byla izolována z CL2621 buněk, které byly infikovány LV4.2.1, který byl přizpůsoben růstu na CL2621. Pro důkladnější studium růstových • to • toto to · · · · to · • 999 9 9999 9 99 · *·· ···· · · ·· · toto ·· ·· ·· vlastností vABV414 a vABV416 byly stanoveny růstové křivky v CL2621 a vepřových alveolárních makrofázích a byly srovnány s růstovými křivkami LV divokého typu, který byl pouze pasážován s vepřovými alveolárními makrofágy (TH), a s růstovými křivkami LV4.2.1, který rostl na buňkách CLS2621. Růstové rychlosti těchto dvou rekombinantních virů se nelišily a rostly stejně dobře bez ohledu na to, zda byly odvozeny přímo od BHK-21 nebo byly dále pasážovány na vepřových alveolárních makrofázích (obr. 3). Titry (7,1-7,9 TCIDso/ml) ve vepřových alveolárních makrofázích měli maximum asi 32 hodin po infekci, zatímco titry v CL2621 byly nižší a neměly maximum ani 96 po infekci. TH měl podobné charakteristiky jako tito rekombinanti. Naopak, na CL2621 adaptovaný viru LV4.2.1 rošt rychleji na CL2621 než viry vABV414, vABV416 a TH (obr. 3). V souhrnu tyto výsledky dokazují, že růstové vlastnosti rekombinantních virů jsou podobné růstovým vlastnostem TH viru. Toto bylo očekáváno, protože cDNA sekvence, použitá pro tvorbu infekčních klonů byla odvozena od „neadaptovaného“ TH viru.
Zavedení genetického markéru do infekčního klonu LV
Jako důkaz toho, že klon cDNA genomové délky může být použit pro tvorbu mutantních LV virů, bylo pomocí PCR-řízené mutageneze přímo downstream od ORF7 genu zavedeno PacI a Swal místo (obr. 4).
Když byla RNA, transkribovaná z klonu cDNA plné délky pABV374, obsahujícího PacI místo, a pABV442, obsahujícího Swal místo, transfekována do BHK-21 buněk a supernatant byl přenesen na vepřové alveolární makrofágy, byl produkován infekční virus. Zachráněné viry vABV437 a vABV442 měly podobné růstové vlastnosti ve vepřových alveolárních makrofázích a CL2621 buňkách jako rodičovský virus vABV414 (údaje nejsou ukázány). Reverzní transkripcí a PCR virové • · ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • · · « · · · · · · · · · ··· · « · · · · ·· · ·· · · ·· · ·
RNA, izolované ze supernatantu vepřových alveolárních makrofágů, které byly infikovány vABV414 a vABV416, byl amplifikován specifický úsek, přibližně 0,6 kb (nukleotidy 14576-poly(A)). Štěpení v místě PacI ukázalo, že toto restrikční místo bylo skutečně přítomno na fragmentu, který byl odvozen vABV437, ale chybělo na fragmentu, který byl odvozen vABV414. Obdobně byla prokázána přítomnost Swal ve vABV442 (údaje nejsou ukázány). Byly jsme tedy schopni vyloučit možnost kontaminace virem divokého typu a tudíž potvrdit identitu vABV437 a vABV442.
Diskuse
Moderní technologie rekombinantní DNA nám umožňuje analyzovat a modifikovat genomy na molekulární úrovni a tedy hlouběji proniknout do jejich organizace a exprese. V případě RNA virů je třeba vytvořit klony cDNA genomové délky, ze kterých mohou být syntetizovány infekční transkripty. Ve většině případů je pro přípravu infekčních klonů napřed nutné zjištění sekvence na koncích dotyčného virového genomu, které jsou pravděpodobně pro replikaci virové RNA rozhodující. V dřívější studii bylo zjištěno, že LV obsahuje na 3' konci poly(A) (Meulenberg et al., 1993a). V této práci byl určen přesný 5' konec LV genomu. Bylo popsáno několik metod určení 5' konce virových genomových RNA nebo mRNA, ale většina z nich má významná omezení. Pro flaviviry a pestiviry bylo použita metoda, která je založena na cirkularizaci genomové RNA. Tato metoda však vyžaduje doprovodné analýzy pro definování hranice mezi 5' a 3' koncem genomu. 5' rychlá amplifikace cDNA konců (5' RACE) je metoda, založená na přidělání homopolymerního konce terminální deoxyrinukleotid transferázou (TdT) k prvnímu řetězci cDNA. Tato ··· ·· ·· ·· ·· « · · S · · 9 9 9 9 • 999 9 9 999 · 9 9 · • ······· ·· · * ··· · · · • 99 9 9 9 9 · ·
9 99 99 ·» ·9 prodlužovací reakce je však dost neúčinná a tato metoda také vyžaduje doprovodné analýzy, protože není možno rozhodnout, zda první nukleotid konce představuje virovou sekvenci nebo zda je to již část enzymaticky připojeného konce. V této studii jsme určily nejzažší konec virového genomu pomocí ligace oligonukleotidu specifické sekvence s prvním řetězcem cDNA a PCR ampifikace. V několika nazávyslých klonech bylo nalezeno prodloužení o 10 nukleotidů (ATGATGTGTA) vzhledem k publikované sekvenci. Předpokládáme tudíž, že představuje nejzažší 5' konec virového genomu. Dohromady je zde tvořena vedoucí sekvence z 221 nukleotidů, která je délkou podobná vedoucí sekvenci EAV (207 nukleotidů; den Boon et al.,
1991), SHFV (208 nukleotidů; Zeng et al., 1995), ale delší než vedoucí t
sekvence LDV (155 nukleotidů; Chen et al., 1994). Mezi vedoucími sekvencemi artrerivirů však neexistuje žádná významná homologie.
Nejzašší 5' konec byl zahrnut do cDNA genomové délky, za účelem vytvoření infekčního klonu. Největší problémy při přípravě infekčních klonů jsou spojeny se stabilitou virové sekvence, když je klonována v bakterii, stejně jako s vytvořením správných 5' a 3' konců. Ačkoliv původní pokusy o vytvoření klonu cDNA genomové délky v pGEM-4Z ztroskotaly, 15 207 nukleotidů dlouhá genomová cDNA zůstala stabilní v nízkokopiovém plazmidu pOK12 a je nyní nejdelším, doposud připraveným infekčním klonem +RNA viru. Transkripty těchto klonů cDNA genomové délky obsahovaly 5' čepičku a nevirový G navíc na 5' koci a nevirové CG na 3'konci, ale tato prodoužení nezrušila jejich infektivitu. Několikrát již byla popsána snížená původní infekčnost RNA, transkribované z klonů cDNA genové délky, kvůli cizím, nepůvodním sekvencím na 5' či 3' konci, nebo neúplné čepičce. Transkripty cDNA plné délky LV postrádající čepičkovou strukturu ·· · ·· Φβ *· ΦΦ
ΦΦΦ · · · ΦΦΦΦ • · · · · · ··· · Φ Φ · • · ΦΦΦΦ Φ · · · Φ Φ ··· ··· • φ φ ΦΦΦΦ · · φ* φ ΦΦΦΦ φφφφ nebyly infekční. Zatímco infektivita transkriptů infekčních cDNA klonů byla vždy testována na buněčných liniích, které jsou citlivé k danému viru, my jsme nebyli schopni prokázat infektivitu transkriptů klonů cDNA genomové délky nebo LV RNA, izolované z CL2621 buněk, transfekcí těchto RNA do CL2621 buněk. Toto bylo způsobeno malou transfekční úspěšností u CL2621 buněk, způsobenou pravděpodobně zastavením syntézy RNA řetězce interakcemi s nekompletními RNA fragmenty nebo kapsidovými proteiny, které pochází z reinfekce CL2621 buněk defektními interferujícími partikulemi, jako jsou nahé kapsidy, obsahující pouze části virového genomu. Výsledkem transfekce transkriptů klonů cDNA plné délky a intracelulární LV RNA do BHK-21 byla produkce a uvolňování infekčního viru, který mohl být zachráněn v CL2621 buňkách. K reinfekci BHK-21 buněk nahými kapsidami zde nedochází a není tedy bráněno syntéze virové RNA plné délky. Konkrétní infektivita byla zhruba 400-1500 pozitivních buněk na pg in vitro transkribované RNA, zatímco u intracelulární LV RNA bylo získáno pouze 2 až 5 pozitivních buněk na 1 pg. Tyto konkrétní infektivity však nemohou být srovnávány, protože genomová LV RNA představuje pouze velmi malou část intracelulární RNA, izolované z CL2621 buněk, které byly infikovány LV. Množství genomové RNA izolované z virionů, které bylo použito pro transfekcí bylo navíc příliš malé pro přesnou kvantifikaci.
U BHK-21 buněk byla navíc sledována produkce antigenu v IMPA pomocí LV-specifických MAb, která nutně nemusí mít vztah s produkcí infekčního viru. Toto bylo zřejmé z faktu, že supernatant z BHK-21 buněk, které byly transfekovány 2 pg intracelulární LV RNA, testovaný na CL2621 buňkách, obsahoval vyšší titr složek tvořících plaky než supernatant z BHK-21 buněk, které byly transfekovány 2,5 pg
transkriptu z klonů cDNA plné délky. Ačkoliv již dříve bylo u řady virů ukázáno, že délka poly(A) konce ovlivňuje infektivitu virových transkriptů (Holý a Abouhaidar, 1993; Sarow, 1899), nepozorovali jsme žádné rozdíly v infektivitě mezi transkripty z klonů genomové cDNA, které obsahovaly konec 45 či 109 zbytků. Je možné, že konec tvořený 45 A zbytky je nad prahem délky, pod kterou je stabilita odpovídajících transkriptů měněna. Nalezli jsme rozdíl mezi klony v aminokyselině 1084 v ORFla; PRO a LEU v poměru 1:1. Tato aminokyselina neměla vliv na infektivitu, protože transkripty klonů cDNA plné délky, obsahující LEU nebo PRO kodon, nevykazovaly žádné rozdíly v infektivitě BHK-21 buněk.
Infekční klon genomové délky byl použit pro vytvoření chimerního viru, který exprimuje nukleokapsidový protein PRPSV kmene ATCC VR2332. Infekční klon genomové délky byl dále použit pro vytvoření chimerního viru, který exprimuje nukleokapsidový protein myšího viru LDV. Chimerní viry mohou být rozeznány od rodičovských virů pomocí MAb, specifických pro daný kmen. Nejsou barveny monoklonálními protilátkami, specifickými pro N (ORF7) protein Ter Huurne kmene PRRSV. Chimerní virus, ve kterém je je PRPSV N protein nahrazen LDV N proteinem, navíc nereaguje s vepřovými protilátkami, reaktivními s PRPSV N proteinem. Protože všechny PRRSV-infikovaná prasata vytváří protilátky, cílené proti PRRSV N proteinu, budou tyto chimerní viry použity v budoucích projektech, které využívají nové živé vakcíny proti PRRSV a které využívají tento virus jako vektorový systém, který je specificky cílen na své hostitelské buňky, plicní alveolární makrofágy. Zde by mělo být zmíněno, že počáteční pokusy o poskytnutí ochrany mrtvými buňkami nebo rekombinatními podjednotkami byly neúspěšné. Doposud jediná dostupná účinná
vakcína proti PRRSV je modifikovaná živá vakcína, založená na americkém kmeni (Gorcyca et al., 1995). Prasata, očkovaná tímto modifikovaným živým produktem, však nemohou být rozlišena od prasat, která byla infikována divokým virem. Tento infekční klon PRRSV tedy poskytuje takzvanou markerovou vakcinu, pomocí místně cílené mutageneze genomu, takže očkovaná prasata mohou být rozlišena od, která byla infikována divokým virem, na základě rozdílu antibiotik v séru.
Infekční klon LV, zde popsaný, je nejdelším dosud vytvořeným infekčním klonem +RNA viru a prvním z čeledi Arteriviridae. Vytvoření tohoto infekčního klonu PRRSV otevírá nové možnosti pro studie, zaměřené na patogenezi, hostitelský tropismus a replikaci a transkripci tohoto viru. Arteriviry a koronaviry sdílejí specifický mechanismus transkripce, také označovaný jako „leader primed transcription“, který zahrnuje vytvoření sady subgenomových RNA, obsahujících běžné 5' vedoucí sekvence (Spaan et al., 1988; Plagemann a Moenning, 1991). Tento druh transkripce je komplexní proces, který ještě nebyl plně pochopen. Studie virologů, studujících koronaviry, snažící se objasnit základní mechanismus této transkripce, jsou omezeny na analýzy a místně cílenou mutagenezi cDNA z neúplných interferujících RNA, protože velikost genomu (28 až 30 kb) bránila vytvoření infekčního klonu. Infekční klon PRRSV je užitečným modelovým systémem pro studium splitého mechanismu transkripce a replikace arterivirrů a koronavirů.
Infekční klony, odvozené od PRRSV, mohou být také použity jako přenášecí systém nebo virová vektorová vakcína pro cizí antigeny, inzerované v genomu PRRSV, protože tento virus infikuje makrofágy a buňky makrofágové linie v kostní dřeni a jiné buňky imunitního systému • · • ······· · · · · • · · · · · · • · · · · · · a roznáší antigen-obsahující virus skze své dceřiné buňky. V konkrétním případě antigeny-obsahujících fragmentů ORF7 a proteinu N z Arterioviru nebo PRRSV, budou tyto antigeny (nad)exprimovány na vnější stranu buněčné membrány infikované buňky, čímž dojde k dalšímu zesílení imunitní odpovědi. Takovéto imunologické zesilovací efekty způsobují doživotní (kvůli průběžné stimulaci na nízké úrovni) imunitu proti patogenům. Po vložení informace pro epitopy jiných patogenních organismů nebo látek, můžeme tento virus použít jako nosič antigenu. Několik modifikovaných PRRS virů, nesoucích informaci pro cizí epitopy, může být smícháno a podáváno najednou. Toto umožní aktivní imunitu proti několika různým antigenům jednoho patogena, nebo aktivní imunitu proti několika různým patogenům. Bezpečnost vakcín z modifikovaného PRRSV (jako nešíření se) může být zajištěna delecí informace pro ty virové proteiny, které jsou třeba pro tvorbu obalených, infekčních virů. Tento virus musí být množen v buněčné linii, která konstitutivně exprimuje tento protein. Virus, replikující se v této komplemetární buněčné linii, má plný obal a je schopen infekce makrofágu v praseti. Po jednom replikačním cyklu již potomstvo viru, kterému chybí informace pro obalový protein, není schopno infekce jiných buněk jako obalený virus. Infekce makrofágů v těle je stále možná nahými kapsidami. Takto bude vakcína obsažena ve zvířeti, které bylo očkováno, a nebude se šířit na jiná zvířata.
• ·
Tabulka 1. Nukleotidová sekvence 5'koncových cDNA klonů LV.
Sekvence 1) Počet klonů
ATGATGTGTAGGG..... 22
TGATGTGTAGGG..... 1
GATGTGTAGGG..... 2
ATGTGTAGGG..... 1
1) Uvedené nukleotidy představují sekvence navíc, které nebyly nalezeny v klonech cDNA, izolovaných a sekvenovaných dříve (Meulenberg et al., 1993a).
Literatura
Benfield D. A., Nelson E., Collins, J. Ε. , Harris L., Goyal S. M., Robinson D., Christianson W. T., Morrison R. B., Gorcyca D. E. a Chládek D. W. (1992). Characterization of swine infertility and respirátory syndrom virus (Isolate ATCC-VR3332) J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133.
Boyer J. a Haenni A. (1994) Infectious transcripts and cDNA dones of RNA viruses. Virology, 198, 415-426.
Ghen z., Faaberg K. S. a Plagemann P. G. W. (1994) Determination of the 5' end of lactate dehydrogenase-elevating virus genome by two independent approaches. J. Gen. Virol. 75, 925-930.
Collins J. E., Benfield D. A., Christianson W. T., Harris L., Hennings J. C., Shaw D. P., Goyal S. M., McCullough S., Morrison R. B., Joo H. S., Gorcyca D. E., Chládek D. W. (1992). Isolation of swine infertility and respirátory syndrom virus (Isolate ATCC-VR3332) in North
AMerica and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs. J. of Vet. Diagn. Invest. 4, 117-126.
Conzelmann K. K., Visser N., van Woensel P. a Thiel H. J. (1993). Molecular charasterization of porcine reproductive and respirátory syndrom virus, a member of the Arterivirus group. Virology 193, 329339.
den Boon J. A., Faaberg K. S., Meulengberg J. J. M., Wassenaar A. L. M., Plagemann P. G. W., Gorbalenya A. E. a Snijder E. J. (1995) Processimg and evolution of the N-terminal region of the arterivirus replicase ORFla protein : Identification of two papainlike cysteine protease. J. Virol. 69 : 4500-4505.
Davis N. L., Willis L. V., Smith J. F. a JOhnston R. E. (1989). In vitro synthesis of infection Venezuelan equine encephalitis virus RNA of an insect virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 63-66.
Dneg R. a Wu R. (1981). An improvede proceduře for utilizing terminál transferase to add homopolyiners to the 3' termini of DNA. Nucleic Acids Res. 9, 4173-4188.
Edwards J. B. D. M., Delort J. a Mallet J. (1991) Oligodeoxyribonucleotide ligation to single-stranded cDNAs; A tool for cloning 5'ends of mRNAs and for constructing cDNA libraires by in vitro amplification. Nucleic Acids Res. 19, 5227-5232.
Gorcyca D., Schlesinger K., Chládek D., et al., (1995) Proč Am. Assoc. of Swine Pract., Omaha, NE, 1-22.
Holý S. a AAbouhaidar M. G. (1993). Production of infectious in vitro transcripts from a full-length clover yellow mosaic virus cDNA cloně. J. Gen. Virol., 74, 781-784.
Kim H. S., Kwang J. a Yoon I. Y. (1993). Enhanced replication of porcine reproductive and respirátory syndrome virus in a homogenous
subpopulation of MA-104 cell line. Arch. Virol. 133, 477-483.
Klump W. M., Bergmann I., Muller B. C., Ameis D. a Kandolf R. (1990) Complete nucleotide sequence of infectious coxsckie-virus B3 cDNA : Two initial 5' uridine residues are regained during plus-strand RNA synthesis. J Virol. 64, 1573-1583.
Lai C. J., Zhao B., hoři H. a Bray M. (1991) Infectious RNA transcribed from stably cloned full.length cDNA of dengue type 4 virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 5139-5143.
Liljestróm P. a Garoff H. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. Biotechnol. 9, 1356-1361.
Liljestróm P. a Garoff H. (1993). Expression of proteins using Semliki Forest virus vector, str. 16. xx. l-16.xx.00 V: Current protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Struhl (Ed.) Greene Publishing associates and Wiley interscience, New York.
Meulenberg J. J. M., Hulst Μ. M., de Meijer E. J., Moonen P. L. J. M., den Besten A., de Kluyver Ε. P, Wensvoort G. a Moormann R. J. M. (1993a). Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemie abortion and respirátory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV. Virology 192, 62-74.
Meulenberg J. J. M., de Meijer E. J.a Moormann R. J. M. (1993b). Subgenomic RNAs of Lelystad virus, contain a conserved junction sequence. J. of Gen. Virol. 74, 1697-1701.
Meulenberg J. J. M., Petersen-den Besten A., de Kluyver Ε. P, Moormann R. J. M., Wensvoort G (1995). Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology 206, 155-163. Meulenberg J. J. M. a Petersen-den Besten (1996) Identification and • ·
characterization of siwth strctural protein of Lelystad virus : The glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology, v tisku.
Meulenberg et al., 1997
Murtaugh Μ. P., Elám M. R. a Kakach (1995) Comparison of structural protein coding sequence of the VR-2332 and Lelystad virus strains of PRRS virus. Arch. Virol., 140, 1451-1460.
Nelson E. A., Christopher-Hennings J., Drew T., Wensvoort G., Collins a Benfield D. A. (1993). Differentiation of United States ans European isolates of porcine reproductive and respirátory syndrome virus by monoclonal antibodies. J of Clin. Microbiol. 31, 3184-3189.
Plagemann P. G. W. a Moenning V. (1991). Lactate dehyrogenaseelevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA virus. Adv. in Virus Res. 41, 99-192.
Rice C. M., Levis R., Strauss J. H. a Huang Η. V. (1987). Production of infectious RNA transcripts from Sindbis virus cDNA dones : mapping of lethal mutations, rescue of a temperature-sensitive markér, and in vitro mutagenesis to generate defined mutants. J. Virol., 61, 3809-3819. Smbrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Sprimg Harbor Lab., Cold Sprikg Harbor NY. Sarnow P. (1989) Role of 3' end sequence in infectivity of polio-virus transcripts made in vitro. J. Virol., 63, 467-470.
Snijder E. J. a Horzinek M. C. (1993). Toroviruses : replication, evolution and comparison with other members of the coronavirus.like superfamily. J. Gen. Virol.,74, 2305-2316.
Spaan W. J. M., Cavanagh D. a Horzinek M. C. (1988) Coronaviruses : Structure and genome expression. J. Gen. Virol. 69, 2939-2952.
ο *7 · · · · · · ·
JI ··· ···· ·«
Sumiyoshi H., Hoke C. H, a Trent D. W. (1992). Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthetized from in vitro.ligated cDNA templates. J. Vrol., 66, 5425-5431.
van Nieuwstadt A. P., Meulenberg J. J. M., van Essen-Zandbergen A., Petersen-den Besten A., Bende R. J., Moormann R. J. M., Wensvoort G (1996). Proteins encoded by ORFs 3 and 4 of genome of Lelystad virus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion. J. Virol., 70, 47674772.
Viera J. a Messing J. (1991) New pUC-derived cloning c;vectors with different selectable markers and DNA replication origines. Gene, 100, 189-194.
Wensvoort G., de Kluyer Ε. P., Luijtze E. A., den Besten A., Harris L., Collins J. E., Christianson W. T. a Chládek D. (1992) Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respirátory (SIRS) virus. J. Vet. Diagn. Invest. 4, 134-138.
Wensvoort G., Terpstra C., Boonstra J., Bloemraad M. a Van Zaane (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12, 101-108. Wensvoort G., Terpstra C., Pol J. M. A., Ter Laak E. A., Bloemraad M., de Kluyer Ε. P., Kragten C., van Buiten L., den Baštěn A., Wagenaar F., Broekhuijsen J. M., Moonen P. L. J. M., Zestra T., de Boer E. A., Tribben H. J., de Jong M. F., van 't Veld P., Groenland G. J. R., van Gennep J. A., Voets M. Th., Verheijden J. Η. M a Braamskamp J. (1991). Mystery swine disease in the Netherlands : the isolation of Lelystad virus. Vet. Quart. 13, 121-130.
Zeng L., Godeny Ε. K., Methven S. L. a Briton M. A. (1995) Analysis of simian hemorrhagic fever virus (SHFV) subgenomic RNAs, junction sequences and 5' leader. Virology 207, 543-548.
Z
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (18)

1. Způsob vytvoření infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu rekombinantní nukleové kyseliny, která zahrnuje alespoň jednu DNA kopii plné délky nebo in-vitro transkribovanou RNA kopii nebo derivát jedné z těchto možností, kde tento RNA virus má genom alespoň okolo 1 5 kb.
2. Způsob vytvoření infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu rekombinantní nukleové kyseliny, která zahrnuje alespoň jednu DNA kopii plné délky nebo in-vitro transkribovanou RNA kopii nebo derivát jedné z těchto možností, a který dále zahrnuje selekci infekčních klonů pomocí transfekce hostitelské buňky zmíněnou rekombinantní nukíeovou kyselinou, kde zmíněná hostitelská buňka je v podstatě necitlivá k infekci zmíněným virem.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zmíněný virus je +RNA virus s genomem alespoň okolo 15 kb.
4. Způsob podle nároků 2 a 3, vyznačující se tím, že zmíněná hostitelská buňka je BHK-21 buňka.
5. Rekombinantní nukleová kyselina, zahrnující infekční klon, který se dá získat způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
• · · · · · • ··· · ····
70 ······· · · · «···
6. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 5, zahrnující infekční klon, založený na genomu viru, který je vybrán z řádu Nidovirales.
7. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 6, zahrnující infekční klon, založený na genomu viru, který je vybrán z čeledi Arteriviridae.
8. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 7, kde zmíněný virus je PRRSV.
9. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, kde byla modifikována sekvence nukleové kyseliny, kódující markér virulence a/nebo serologický markér.
10. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 9, kde je sekvence nukleové kyseliny, kódující zmíněný markér, umístěna v rámci kteréhokoliv z otevřených čtecích rámců, kódujících strukturní virové proteiny.
11. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 10, kde jedním otevřeným čtecím rámcem je ORF7 kteréhokoliv viru z čeledi Arteriviridae.
12. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, kde je jeden otevřený čtecí rámec substituován ORF7 kteréhokoliv viru z čeledi Arteriviridae.
13. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 5 až • · • ·
12, kde je inzerována alespoň jedna heterologní sekvence nukleové kyseliny navíc.
14. Rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 13, kde zmíněná heterologní sekvence nukleové kyseliny kóduje nějaký antigen.
15. Rekombinantní nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 5 až 14, kde byl modifikován jeden otevřený čtecí rámec.
16. Modifikovaný RNA virus, obsahující rekombinantní nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 15.
17. Vakcína, obsahující modifikovaný RNA virus podle nároku 16.
18. Buňka, infikovaná modifikovaným RNA virem podle nároku 16.
1/4 • · · · · · • · · · · <
• to toto·· · · ' • · · to ·· · · tototo • « · · · ·
Iv 0*1 <*i
CZ19991564A 1996-10-30 1997-10-29 Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaný RNA virus CZ294781B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96203024A EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1996-10-30 Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ156499A3 true CZ156499A3 (cs) 1999-09-15
CZ294781B6 CZ294781B6 (cs) 2005-03-16

Family

ID=8224533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19991564A CZ294781B6 (cs) 1996-10-30 1997-10-29 Způsob přípravy infekčního klonu, založeného na genomu +RNA viru, jej zahrnující rekombinantní nukleová kyselina, modifikovaný RNA virus, obsahující tuto kyselinu, a vakcína, obsahující tento modifikovaný RNA virus

Country Status (23)

Country Link
US (5) US6268199B1 (cs)
EP (2) EP0839912A1 (cs)
JP (1) JP3921552B2 (cs)
KR (1) KR100437254B1 (cs)
CN (1) CN1138859C (cs)
AT (1) ATE366314T1 (cs)
AU (1) AU719991B2 (cs)
BR (1) BR9712592A (cs)
CA (1) CA2272046C (cs)
CZ (1) CZ294781B6 (cs)
DE (1) DE69737886T2 (cs)
DK (1) DK0935660T3 (cs)
ES (1) ES2290973T3 (cs)
HU (1) HUP9903829A3 (cs)
ID (1) ID22208A (cs)
MY (1) MY117686A (cs)
PL (1) PL191258B1 (cs)
PT (1) PT935660E (cs)
SI (1) SI0935660T1 (cs)
SK (1) SK286231B6 (cs)
UA (1) UA72433C2 (cs)
WO (1) WO1998018933A1 (cs)
ZA (1) ZA979732B (cs)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0974660A1 (en) * 1998-06-19 2000-01-26 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays
US7618797B2 (en) * 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7691389B2 (en) * 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
NZ513289A (en) 1998-12-22 2003-04-29 Pfizer Prod Inc Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) * 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
CA2366072C (en) 1999-03-08 2007-07-10 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Prrsv vaccines
MXPA01010681A (es) 1999-04-22 2003-08-20 Us Agriculture Vacuna de sindrome respiratorio y reproductiva porcina a base de ja-142 aislado.
HUP0204176A3 (en) * 2000-01-26 2003-12-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Recombinant attenuation of prrsv
EP1156111A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Chimeric arterivirus-like particles
EP2842964A1 (de) 2001-06-05 2015-03-04 Curevac GmbH Virtuelles Verfahren zur Ermittlung einer modifzierten mRNA-Sequenz
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
US6841364B2 (en) * 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
WO2006009880A2 (en) 2004-06-18 2006-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
KR100872840B1 (ko) 2004-07-09 2008-12-22 (주)씨아이디 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 전체-길이의감염성이 있는 cDNA 클론 및 이의 용도
US20060020227A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Moore Thomas E Collection means and a method for collecting cord blood
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
RU2007130801A (ru) 2005-01-13 2009-02-20 Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) Улучшенные вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs)
NZ561848A (en) * 2005-02-25 2010-02-26 Pfizer Prod Inc N protein mutants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
PT2369001T (pt) 2005-06-24 2016-10-25 Univ Minnesota Vírus srrp, clones infecciosos, os seus mutantes e processos de utilização
CN101300363A (zh) * 2005-08-30 2008-11-05 内布拉斯加大学董事会 用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接种动物的方法和组合物
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
EP2046954A2 (en) 2006-07-31 2009-04-15 Curevac GmbH NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
WO2008153572A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Protatek International, Inc. Construction of chimera prrsv, compositions and vaccine preparations
US7666585B2 (en) 2007-06-15 2010-02-23 Protatek International, Inc. Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations
JP2010531143A (ja) * 2007-06-25 2010-09-24 サウス ダコタ ステート ユニバーシティー 組換え北アメリカ１型ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス及び使用方法
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
KR101483715B1 (ko) 2008-01-31 2015-01-19 큐어백 게엠바하 면역증강제／애주번트인 화학식（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａ를 포함하는 핵산 및 이의 유도체
WO2010025109A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs)
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
EP2955230A1 (en) 2010-07-30 2015-12-16 CureVac AG Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
RU2013120302A (ru) 2010-10-01 2014-11-20 Модерна Терапьютикс, Инк. Сконструированные нуклеиновые кислоты и способы их применения
UA108902C2 (uk) 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
EP2675476B1 (en) 2011-02-17 2015-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Commercial scale process for production of prrsv
MX345188B (es) 2011-02-17 2017-01-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Nueva cepa del prrsv europea.
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
SI3473267T1 (sl) 2011-05-24 2022-01-31 BioNTech SE Individualizirana cepiva za rak
WO2013017568A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
LT2791160T (lt) 2011-12-16 2022-06-10 Modernatx, Inc. Modifikuotos mrnr sudėtys
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9192651B2 (en) 2012-04-02 2015-11-24 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
KR102012109B1 (ko) 2012-05-17 2019-08-19 조에티스 엘엘씨 이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종
WO2014081507A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
EP3417874A1 (en) 2012-11-28 2018-12-26 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
WO2014150822A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
ES2747762T3 (es) 2013-08-21 2020-03-11 Curevac Ag Vacuna contra el virus respiratorio sincitial (RSV)
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CA2925021A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Ag Modified rna with decreased immunostimulatory properties
MX2020010248A (es) 2013-12-20 2020-10-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Variante del virus prrs, clon de adnc del virus europeo y sus usos.
US10369216B2 (en) 2014-04-01 2019-08-06 Curevac Ag Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant
JP6398454B2 (ja) * 2014-08-13 2018-10-03 セイコーエプソン株式会社 圧電駆動装置、ロボット、及び、それらの駆動方法
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
CA2996629A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirus vaccines for congenital tremors
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
EP3389706A1 (en) 2015-12-14 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Hybrid core feline vaccines
BR112019000887A2 (pt) 2016-08-05 2019-04-30 Hipra Scientific, S.L.U. clone de cdna do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina e usos do mesmo
BR112019012158A2 (pt) 2016-12-14 2019-11-12 Zoetis Services Llc vacinação eficaz contra cepas europeias de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (prrs) antes do desmame
JP2021514609A (ja) * 2018-02-28 2021-06-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ウイルス混入物質を同定するためのシステムおよび方法
CN116716322A (zh) * 2023-05-12 2023-09-08 中山大学 一种denv-3全长感染性克隆及其构建方法与应用

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3137631A (en) * 1959-12-01 1964-06-16 Faberge Inc Encapsulation in natural products
US3359457A (en) * 1963-10-14 1967-12-19 Triplett Electrical Instr Co Device for overload protection of electrical equipment
US3959457A (en) * 1970-06-05 1976-05-25 Temple University Microparticulate material and method of making such material
US4015100A (en) * 1974-01-07 1977-03-29 Avco Everett Research Laboratory, Inc. Surface modification
US4122167A (en) * 1977-02-09 1978-10-24 Merck & Co., Inc. Respiratory synctial vaccine
US4205060A (en) * 1978-12-20 1980-05-27 Pennwalt Corporation Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use
US4224412A (en) * 1979-05-01 1980-09-23 Dorofeev Viktor M Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same
DD145705A1 (de) 1979-08-31 1981-01-07 Peter Solisch Herstellungsverfahren von organspezifischen retrovirusimmunpraeparaten fuer prophylaxe,therapie und diagnostik
US4554159A (en) * 1981-11-12 1985-11-19 Institute Merieux Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2)
US4452747A (en) * 1982-03-22 1984-06-05 Klaus Gersonde Method of and arrangement for producing lipid vesicles
US4468346A (en) * 1983-10-27 1984-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins
DE3405100A1 (de) * 1984-02-14 1985-08-14 Drägerwerk AG, 2400 Lübeck Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel
US4744933A (en) * 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5008050A (en) * 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4921706A (en) * 1984-11-20 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Unilamellar lipid vesicles and method for their formation
US4606940A (en) * 1984-12-21 1986-08-19 The Ohio State University Research Foundation Small particle formation and encapsulation
US5206163A (en) * 1985-07-08 1993-04-27 Chiron Corporation DNA encoding bovine diarrhea virus protein
US4753884A (en) * 1986-01-28 1988-06-28 Novagene, Inc. Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same
FR2602791B1 (fr) * 1986-08-18 1988-11-10 Ministere Agri Direction Quali Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu
NZ222465A (en) 1986-11-07 1992-11-25 Pasteur Institut Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen
US5009956A (en) * 1987-02-24 1991-04-23 Univ Minnesota Phospholipase A2-resistant liposomes
DE3833925A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Inst Angewandte Biotechnologie Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu
US5213759A (en) * 1988-05-05 1993-05-25 Elopak Systems A.G. Sterilization
US4927637A (en) * 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4944948A (en) * 1989-02-24 1990-07-31 Liposome Technology, Inc. EGF/Liposome gel composition and method
US5132117A (en) * 1990-01-11 1992-07-21 Temple University Aqueous core microcapsules and method for their preparation
AU7007491A (en) * 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
DK0587780T4 (da) * 1991-06-06 2008-10-13 Boehringer Ingelheim Vetmed Smitstof, som forårsager Mystery Swine Disease,vaccinepræparater og diagnostiske sæt
US5846805A (en) * 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
SG43852A1 (en) 1991-08-26 1997-11-14 Boehringer Animal Health Inc Sirs vaccine and diagnosis method
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
US6982160B2 (en) * 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US6080570A (en) * 1991-08-26 2000-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
MX9204885A (es) * 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos.
AU2696792A (en) 1991-09-16 1993-04-27 David A Benfield Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
CA2121241C (en) 1991-10-14 2007-12-04 Nicolaas Visser Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
TW289731B (cs) * 1992-07-09 1996-11-01 Akzo Nv
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6773908B1 (en) * 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US5419907A (en) * 1992-11-10 1995-05-30 Iowa State University Research Foundation, Inc. Pathogenic porcine respiratory coronavirus
JP3710095B2 (ja) 1993-02-08 2005-10-26 バイエル・コーポレーシヨン ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスの増殖方法並びにワクチンにおけるその使用
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
EP0659885A1 (en) * 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
DE4407489A1 (de) * 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
DE69522984T2 (de) * 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
AU2386595A (en) 1994-04-15 1995-11-10 Children's Hospital Of Philadelphia, The Aqueous solvent encapsulation method, apparatus and microcapsules
GB2289279B (en) 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
DE69535061T2 (de) 1994-08-05 2007-01-25 Regents Of The University Of Minnesota, Minneapolis Virale nukleotidsequenz vr-2332 und nutzungsverfahren
DE69632658T2 (de) * 1995-03-14 2005-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom
US5690940A (en) 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof
ES2102971B1 (es) 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US6015663A (en) * 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
EE04741B1 (et) 1996-03-01 2006-12-15 Schering Corporation Sigade sigimis- ja hingamissündroomi vaktsiin
US5976537A (en) * 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
DK0835930T3 (da) 1996-10-09 2001-06-18 Akzo Nobel Nv Europæiske vaccinestammer af porcint reproduktions- og respirationssyndrom-virus. (PRRSV)
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO1998035023A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Origen, Inc. Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays
DE69837992T2 (de) 1997-05-06 2008-03-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prrsv-antigene, die auf peptidsequenzen des prrs-virus basieren, für die verwendung als impfstoff und für diagnostische tests
JP2002510205A (ja) 1997-06-04 2002-04-02 カルジーン エルエルシー ポリケチド様合成遺伝子を植物内で発現させることによる多不飽和脂肪酸の製造
AU7960598A (en) 1997-06-05 1998-12-21 Origen, Inc. Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US7132106B2 (en) * 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
NZ513289A (en) 1998-12-22 2003-04-29 Pfizer Prod Inc Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7691389B2 (en) * 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7618797B2 (en) * 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
FR2789695B1 (fr) * 1999-02-11 2003-03-07 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
CA2366072C (en) 1999-03-08 2007-07-10 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Prrsv vaccines
MXPA01010681A (es) 1999-04-22 2003-08-20 Us Agriculture Vacuna de sindrome respiratorio y reproductiva porcina a base de ja-142 aislado.
US20040213805A1 (en) * 1999-10-12 2004-10-28 Verheije Monique Helene Deletions in arterivirus replicons
US20020012670A1 (en) * 2000-01-26 2002-01-31 Knut Elbers Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV)
US7041443B2 (en) 2000-02-08 2006-05-09 Regents Of The University Of Minnesota Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use
EP1156111A1 (en) 2000-05-19 2001-11-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Chimeric arterivirus-like particles
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
EP1397498A1 (en) 2001-05-21 2004-03-17 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Delections in arterivirus replicons
US7279166B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US6841364B2 (en) 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
ATE557082T1 (de) * 2002-04-05 2012-05-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Sequenz positionen zur anpassung bei prrsv
US7335361B2 (en) * 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
US7722878B2 (en) 2004-06-17 2010-05-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PRRSV subunit vaccines
WO2006009880A2 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US20060063151A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-23 Michael Roof Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
RU2007130801A (ru) * 2005-01-13 2009-02-20 Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) Улучшенные вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs)
CN103641920B (zh) 2005-11-29 2016-08-17 衣阿华州立大学研究基金公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的保护性抗原决定子的鉴定及其用途
US8563313B2 (en) 2007-02-13 2013-10-22 Washington State University Research Foundation Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
WO2008121958A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia
US20100003278A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof
WO2010025109A1 (en) 2008-08-25 2010-03-04 Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs)
US20100129398A1 (en) * 2008-11-26 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
WO2011128415A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Universiteit Gent Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus

Also Published As

Publication number Publication date
BR9712592A (pt) 1999-12-21
HUP9903829A3 (en) 2001-06-28
PT935660E (pt) 2007-08-03
DE69737886T2 (de) 2008-04-03
SK54799A3 (en) 2000-05-16
DE69737886D1 (de) 2007-08-16
UA72433C2 (en) 2005-03-15
HUP9903829A1 (hu) 2000-03-28
US6268199B1 (en) 2001-07-31
KR100437254B1 (ko) 2004-06-23
CN1240481A (zh) 2000-01-05
ID22208A (id) 1999-09-16
US20040197872A1 (en) 2004-10-07
US8546124B2 (en) 2013-10-01
EP0839912A1 (en) 1998-05-06
CZ294781B6 (cs) 2005-03-16
EP0935660B1 (en) 2007-07-04
US20020098573A1 (en) 2002-07-25
US20060205033A1 (en) 2006-09-14
ZA979732B (en) 1998-05-22
MY117686A (en) 2004-07-31
PL333070A1 (en) 1999-11-08
SK286231B6 (sk) 2008-05-06
KR20000052920A (ko) 2000-08-25
SI0935660T1 (sl) 2007-10-31
US20140030290A1 (en) 2014-01-30
CN1138859C (zh) 2004-02-18
ES2290973T3 (es) 2008-02-16
AU5882898A (en) 1998-05-22
CA2272046C (en) 2011-01-04
PL191258B1 (pl) 2006-04-28
AU719991B2 (en) 2000-05-18
CA2272046A1 (en) 1998-05-07
JP3921552B2 (ja) 2007-05-30
JP2000514314A (ja) 2000-10-31
WO1998018933A1 (en) 1998-05-07
ATE366314T1 (de) 2007-07-15
DK0935660T3 (da) 2007-10-29
EP0935660A1 (en) 1999-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8546124B2 (en) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
CA2366072C (en) Prrsv vaccines
Meulenberg et al. Infectious transcripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
US7273617B2 (en) Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
EP1283887B1 (en) Chimeric arterivirus-like particles
US20040213805A1 (en) Deletions in arterivirus replicons
US20040224327A1 (en) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
MXPA99003967A (en) Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
Infectivity Heterodimerization of the Two Major

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20121029