PT935660E - Clones infecciosos de vírus de arn e vacinas e ensaios de diagnóstico derivados destes - Google Patents

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DESCRIÇÃO "CLONES INFECCIOSOS DE VÍRUS DE ARN E VACINAS E ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO DERIVADOS DESTES" A invenção refere-se ao domínio de vírus de ARN e clones infecciosos obtidos a partir de vírus de ARN. Além disso, a invenção refere-se a vacinas e ensaios de diagnóstico obteníveis pela utilização e modificação de tais clones infecciosos de vírus de ARN. A tecnologia do ADN recombinante compreende técnicas de biologia molecular extremamente variadas e poderosas com vista à modificação de ácidos nucleicos ao nível do ADN torna possível a análise e modificação de genomas ao nível molecular. Neste contexto, os vírus, em virtude da dimensão reduzida do seu genoma, são particularmente receptivos a tais manipulações. Contudo, a tecnologia do ADN recombinante não é directamente aplicável a vírus de ARN não retrovirais porque estes vírus não abrangem uma etapa intermediária de ADN na sua replicação. Para tais vírus deverão ser desenvolvidos clones infecciosos (por exemplo, como cópia de ADN, como cópia de ARN transcrita ín vitro ou como derivado dos dois) antes de poder aplicar-se a tecnologia do ADN recombinante ao seu genoma para produzir o vírus modificado. Os clones infecciosos podem ser derivados através da construção de ADNc (aqui utilizado no sentido amplo de uma cópia de ADN de ARN e não apenas no sentido estrito de uma cópia de ADN de ARNm) de comprimento completo (comprimento genómico) do vírus em estudo, após o qual é sintetizado um 1 transcrito infeccioso in vivo, em células transfectadas com o ADNc de comprimento completo, porém os transcritos infecciosos podem ser igualmente obtidos por transcrição in vitro a partir de fragmentos de ADNc de comprimento parcial ligados in vitro que compreendem o genoma virai completo. Em qualquer caso, o ARN transcrito transporta todas as modificações que foram introduzidas no ADNc e pode ser utilizado para proceder à passagem adicional do virus assim modificado.

Foram produzidos clones de ADNc e transcritos infecciosos in vitro para um grande número de virus de ARN de cadeia positiva (para uma revisão ver Boyer e Haenni, Virology 198, 415-426) com um genoma de até 12 kb ou ligeiramente maior. 0 comprimento genómico virai de Pestivírus parece ser, até agora, o genoma de ARN virai de cadeia positiva mais comprido a partir do qual foram preparados clones infecciosos (Moormann et al., J. Vir. 70:763-770). Os problemas relacionados com o comprimento genómico estão, não apenas na dificuldade de obtenção e manutenção de clones extensos e estáveis de ADNc em bactérias, mas também na infectividade do transcrito de ARN inicial, cuja replicação na célula hospedeira deve ser alcançada sem o auxilio das normalmente associadas proteínas virais relacionadas com a replicação virai. Para alcançar uma infecção bem-sucedida, os transcritos virais devem interagir com proteínas codificadas por vírus, muito particularmente com a replicase virai e com componentes da célula hospedeira, tais como a maquinaria de tradução; por conseguinte, a estrutura dos transcritos virais deve mimetizar, o mais próximo possível, a do ARN do virião. Problemas adicionais podem verificar-se com os vírus de ARN de cadeia positiva que se replicam por um mecanismo de ARN mensageiros subgenómicos transcritos a partir do lado 3' do genoma e com os vírus de ARN de cadeia positiva que se produzem 2 durante a replicação defeituosa de partículas de interferência, tais como cápsides livres ou partículas de invólucro vazias, compreendendo diversas proteínas estruturais mas apenas uma parte do genoma. A presença de fragmentos incompletos de ARN virai ou, e. g., de proteínas da matriz ou da nucleocápside interagindo ou interferindo com o ARN virai a transcrever ou ARN intermediário replicativo e perturbando a sua estrutura, abolirá a síntese da cadeia de ARN de comprimento completo e, deste modo, a produção de vírus infeccioso compreendendo ARN de comprimento genómico. 0 vírus de Lelystad (LV), também denominado vírus da síndrome respiratória reprodutiva porcina (PRRSV, comprimento genómico de 15,2 kb) , é um membro da família Arteriviridae, que compreende, igualmente, o virus da arterite equina (EAV, comprimento genómico de 12,7 kb), vírus de elevação da lactato desidrogenase (LDV, comprimento genómico de, pelo menos, 14,2 kb) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV, comprimento genómico de, aproximadamente, 15 kb) (Meulenberg et al., 1993a; Plagemann e Moennig, 1993).

Recentemente, a Comissão Internacional sobre a Taxonomia de Vírus decidiu incorporar esta família em uma nova ordem de vírus, a Nidovirales, juntamente com a Coronaviridae (comprimento genómico de 28 a 30 kb) e Toroviridae (comprimento genómico de 26 a 28 kb). A ordem Nidovirales representa os vírus de ARN com envelope que contêm um genoma de ARN de cadeia positiva e sintetizam um conjunto com iniciadores internos em 3' de ARN subgenómicos durante a replicação. Os ARN subgenómicos de coronavírus e arterivírus contêm uma sequência condutora, a qual é derivada da extremidade 5' do genoma virai (Spaan et al., 1988; Plagemann e Moennig, 1993) . Os ARN subgenómicos de 3 torovírus não possuem uma sequência condutora (Snijder e

Horzinek, 1993) . Enquanto as ORF la e lb, codificando a ARN polimerase dependente de ARN, são expressas a partir do ARN genómico, as ORF mais pequenas na extremidade 3' dos genomas de Nidovirales, codificando proteínas estruturais, são expressas a partir dos ARNm subgenómicos. 0 PRRSV (vírus de Lelystad) foi isolado pela primeira vez em 1991 por Wensvoort et al. (1991) e demonstrou-se ser o agente causador de uma nova doença conhecida, agora, como síndrome respiratória reprodutiva porcina (PRRS). Os principais sintomas da doença são problemas respiratórios em suínos e abortos em porcas. Embora os principais surtos tenham diminuído, tal como observado a princípio nos EUA em 1987 e na Europa em 1991, este vírus ainda causa perdas económicas em efectivos nos EUA, Europa e Ásia. 0 PRRSV cresce, de um modo preferido, nos macrófagos alveolares do pulmão (Wensvoort et al., 1991). Algumas linhas celulares, tais como a CL2621 e outras linhas celulares clonadas a partir da linha celular de rim de macaco MA-104 (Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993) são igualmente susceptíveis ao vírus. Algumas estirpes bem conhecidas de PRRSV são conhecidas sob os números de registo CNCM 1-1102, 1-1140, 1-1387, 1-1388, ECACC V93070108, ou ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 e VR 2402. O genoma de PRRSV foi completa ou parcialmente sequenciado (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murthaugh et al., 1995) e codifica, além da ARN polimerase dependente de ARN (ORF la e lb), seis proteínas estruturais, das quais quatro glicoproteínas de envelope, denominadas GP2 (ORF2) , GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) e GP5 (ORF5) , uma proteína de membrana M não glicosilada (ORF6) e a proteína da nucleocápside N (ORF7) (Meulenberg et al. 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996). A caracterização imunológica 4 e a sequenciação nucleotídica das estirpes EP e US de PRRSV identificou pequenas diferenças antigénicas entre estirpes de PRRSV localizadas nas proteínas virais estruturais (Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995).

Os suínos podem ser infectados por PRRSV pela via oronasal. Nos pulmões, o vírus é capturado por macrófagos alveolares do pulmão e, nestas células, a replicação de PRRSV é completada no espaço de 9 horas. 0 PRRSV viaja dos pulmões para os nodos linfáticos do pulmão no espaço de 12 horas e para os nodos linfáticos periféricos, medula óssea e baço no espaço de 3 dias. Nestes sítios, apenas algumas células coram positivo para o antigénio virai. 0 vírus está presente no sangue durante, pelo menos, 21 dias e frequentemente muito mais tempo. Após 7 dias, encontram-se anticorpos para PRRSV no sangue. A presença combinada de vírus e anticorpo em suínos infectados por PRRS, demonstra que a infecção virai pode persistir durante muito tempo, embora a um nível baixo, apesar da presença de anticorpo. Durante, pelo menos, 7 semanas a população de células alveolares nos pulmões é diferente da de pulmões SPF normais. 0 PRRSV necessita do seu envelope para infectar suínos pela via oronasal e a resposta imune normal do suíno implica, deste modo, entre outras, a produção de anticorpos neutralizantes direccionados contra uma ou mais proteínas do envelope; tais anticorpos podem tornar o vírus não infeccioso. Contudo, uma vez no macrófago alveolar, o vírus produz, igualmente, cápsides livres, feitas de ARN encapsidado pela proteína M e/ou N, por vezes contendo parcialmente qualquer uma das glicoproteínas. A presença intra e extracelular destas partículas virais incompletas ou cápsides (parcialmente) livres pode ser demonstrada por microscopia electrónica. Por vezes, podem 5 verificar-se cápsides livres sem um conteúdo de ácido nucleico. As cápsides livres são distribuídas através do corpo pela corrente sanguínea e são removidas do sangue por macrófagos no baço, nodos linfáticos e medula óssea. Estas cápsides virais livres, mas infecciosas, não podem ser neutralizadas pelos anticorpos produzidos pelo suíno e explicam, assim, a persistência da infecção virai na presença de anticorpo. Desta forma, a descendência de macrófagos de células infectadas da medula óssea propaga a infecção virai para novos locais do corpo. Em virtude de nem todas as células da linhagem de macrófagos da medula óssea serem infectadas, apenas um pequeno número de macrófagos de locais periféricos são infectados e produzem vírus. As cápsides de PRRSV, consistindo apenas em proteínas 0RF7, podem ser formadas na ausência de outras proteínas virais, por exemplo, pela infecção de macrófagos por um vírus de vector quimérico de 0RF7 da pseudo-raiva. 0 vírus PRV foi manipulado para conter informação genética de 0RF7 de PRRSV. 18 horas após a infecção, o citoplasma de células infectadas contém um grande número de pequenas estruturas esféricas vazias com as dimensões de nucleocápsides de vírus de PRRS. A presente invenção proporciona agora um clone infeccioso derivado de um vírus com um comprimento genómico excedendo largamente o comprimento genómico máximo dos vírus de ARN de cadeia positiva, a partir dos quais foram obtidos, até agora, clones infecciosos. A parte experimental deste pedido descreve a produção de um clone infeccioso baseado e derivado de PRRSV com um comprimento genómico de 15,2 kb, porém tais clones podem, também, ser agora obtidos a partir de LDV e SHFV que possuem, igualmente, um comprimento genómico de cerca de 15 kb e a partir de EAV, embora o seu genoma seja ligeiramente mais pequeno, e a 6 partir de vírus com maior comprimento genómico. A invenção proporciona, igualmente, um método para a produção de clones infecciosos contornando os problemas encontrados na síntese da cadeia de ARN virai, relacionados com a presença de fragmentos incompletos de ARN virai ou, e. g., de proteínas da matriz ou da nucleocápside interagindo ou interferindo com o transcrito de ARN a ser transcrito ou com ARN intermediário replicativo e perturbando a sua estrutura, que abole a síntese da cadeia de ARN de comprimento completo e, deste modo, a produção do vírus infeccioso. A invenção proporciona um método para a produção de clones infecciosos pela transfecção de uma célula hospedeira que é essencialmente não susceptível à infecção pelo vírus de tipo selvagem, com um ácido nucleico recombinante baseado no genoma do referido vírus, seguido de resgate da descendência do vírus infeccioso da referida célula hospedeira, pela passagem ou co-cultivação com células que são susceptíveis ao vírus. As células que são essencialmente não susceptíveis podem ser, em comparação com as células que são utilizadas em rotina para a replicação do vírus em estudo, apenas ligeiramente susceptíveis ou ser não susceptíveis, em absoluto, ao vírus em estudo, mas podem ser totalmente susceptíveis a outras estirpes de vírus. A invenção proporciona um método para a produção de clones infecciosos pela transfecção de células hospedeiras que não são susceptíveis à infecção pelo vírus de tipo selvagem evitando, por este meio, a produção de cápsides livres ou partículas virais incompletas, compreendendo fragmentos de ARN e proteínas da matriz ou da nucleocápside que interferem na síntese da cadeia de ARN virai. 0 vírus infeccioso é resgatado das células hospedeiras, assim transfectadas, pela passagem para células que são susceptíveis ao vírus. Na parte experimental descreve-se de que modo é 7 obtido, desta forma, um clone infeccioso de PRRSV, porém o método é igualmente aplicável a outros virus de ARN de cadeia positiva da família de Arteriviridae. A presente invenção proporciona agora, igualmente, a possibilidade de produzir um clone infeccioso, modificado por meio da aplicação adicional da tecnologia do ADN recombinante. Tais modificações podem ser mutações simples ou múltiplas, substituições, deleções ou inserções ou combinações destas que podem ser alcançadas por meio de qualquer método da tecnologia do ADN recombinante conhecido na técnica. A presente invenção proporciona, deste modo, vírus de ARN modificados que podem ser utilizados para investigar vírus de ARN e para preparar vacinas. A presente invenção proporciona agora, igualmente, clones infecciosos, por exemplo, derivados de Arteriviridae, tal como PRRSV, que podem ser utilizados como uma vacina de utilização simples contra a doença causada pelo vírus no qual se baseia o clone infeccioso. Por exemplo, o clone infeccioso baseado em PRRSV pode ser agora utilizado para estudar marcadores de virulência ou marcadores serológicos do PRRSV. Os marcadores serológicos de PRRSV conhecidos localizam-se, por exemplo, em qualquer das proteínas estruturais de PRRSV codificadas pelas 0RF2 a 7, mas podem ser igualmente encontrados nas proteínas codificadas pela ORF la e lb. Os marcadores de virulência estão presentes na ORF la e lb codificando as proteínas não estruturais de PRRSV mas podem ser igualmente encontrados em quaisquer das proteínas codificadas pelas 0RF2 a 7. Pela modificação do genoma do clone infeccioso, com respeito a esses marcadores, é possível obter PRRSV que não seja virulento ou que seja muito menos virulento do que a sua estirpe ascendente e/ou que seja modificado pela deleção ou introdução de marcadores serológicos, a fim de possibilitar uma diferenciação serológica entre suinos vacinados e infectados pelo virus de tipo selvagem. Tais modificações são proporcionadas, por exemplo, pelos clones infecciosos do PRRSV, em que a sequência de ácidos nucleicos codificando a proteína N de 0RF7 é substituída pela proteína de 0RF7 de ATCC VR2332 ou LDV. A presente invenção proporciona agora, igualmente, clones infecciosos derivados de Arteriviridae, tal como PRRSV, que podem ser utilizados como um sistema de distribuição ou vacina de vector virai para uma ampla variedade de antigénios. Em tais clones, são inseridas sequências heterólogas de ácidos nucleicos que não correspondem à sequência do vírus em estudo. Tais sequências heterólogas de ácidos nucleicos podem ser derivadas, por exemplo, de sequências codificando qualquer antigénio de eleição. Este antigénio é uma proteína ou peptídeo que pode induzir imunidade contra um patogénio. Visto que o vírus infecta macrófagos e células da linhagem de macrófagos na medula óssea e distribui o vírus contendo o antigénio através das células da sua descendência, esta vacina de vector virai infecta células fundamentais ao sistema imunitário e pode apresentar os antigénios para processamento adicional. 0 vírus vector de vacina infecta células apresentadoras de antigénio, como os macrófagos dendríticos, as células de Kuppfer ou outras células do sistema imunitário e pode fazê-lo como uma partícula virai com envelope (incompleto) ou como uma partícula capsídica livre. Visto que uma infecção por uma cápside livre ou uma partícula virai incompleta assegura uma infecção persistente, o efeito de reforço imunológico causará uma imunidade duradoura (em virtude da estimulação contínua a um nível baixo) contra patogénios a partir dos quais os antigénios são seleccionados. Pode utilizar--se o vírus como um transportador antigénico integrando a 9 informação para epítopos de outros organismos ou substâncias patogénicas. Vários destes virus vectores de vacinas transportando informação epitópica estranha podem ser misturados e administrados de uma só vez. Isto possibilita imunidade activa contra vários antigénios diferentes de um patogénio, ou imunidade activa contra vários patogénios diferentes. A presente invenção proporciona agora, igualmente, clones infecciosos derivados de Arterívirídae, tal como PRRSV, gue podem ser utilizados como uma vacina de dupla utilização. Por exemplo, o clone infeccioso baseado em PRRSV pode ser utilizado para construir uma vacina protegendo contra PRRSV e contra outro patogénio, simplesmente pela combinação do desenvolvimento da vacina vectorizade com o desenvolvimento direccionado com vista ao desenvolvimento de uma vacina de utilização simples direccionada contra PRRS. Poderia desenvolver-se uma vacina especifica de dupla utilização gue protegesse contra a doença respiratória em suinos, pela inserção nos antigénios da vacina PRRS derivados de qualquer um da ampla variedade de outros patogénios respiratórios, que são conhecidos por infectarem suinos. A invenção proporciona igualmente vacinas, sejam elas de utilização simples, dupla utilização, ou vacinas de vectores que sejam seguras no sentido que as vacinas não podem ser libertadas para o ambiente. A segurança da vacina (não contagiosa) pode ser assegurada pela deleção da informação das proteínas virais que são necessárias para produzir o vírus infeccioso com envelope. Este vírus deve ser propagado numa linha celular que expresse constitutivamente a proteína. A replicação do vírus nesta linha celular complementar possui um envelope completo e é capaz de infectar macrófagos no suíno. Após um ciclo de replicação, o 10 vírus da descendência, não tendo a informação para a proteína do envelope, deixa de ser capaz de infectar outras células como um vírus com envelope. A infecção de macrófagos no corpo é ainda possível enquanto cápside livre ou partícula virai incompleta. A invenção proporciona, igualmente, antigénios virais e proteínas que podem ser recolhidos de culturas celulares infectadas com os vírus de ARN modificados de acordo com a invenção. Tais antigénios podem ser utilizados em ensaios de diagnóstico, tais como de ELISA ou outros tipos de ensaios de diagnóstico conhecidos do perito. Tais ensaios podem ser utilizados enquanto testes autónomos para diagnóstico primário ou como testes de acompanhamento a aplicar em populações animais que foram vacinadas com uma vacina discriminante ou indicadora, baseada nos virus de ARN modificados de acordo com a invenção.

PARTE EXPERIMENTAL A produção de clones de ADNc a partir dos quais pode ser transcrito ARN infeccioso in vitro, tornou-se uma ferramenta essencial para a análise de genética molecular de virus de ARN de cadeia positiva. Esta tecnologia é aplicável a vírus de ARN de cadeia positiva, cujos genomas de ARN podem funcionar como ARNm e iniciar um ciclo infeccioso completo após introdução em células hospedeiras apropriadas. Foram descritos clones infecciosos para um determinado número de virus, que facilitam os estudos da expressão genética, replicação, função de proteínas virais e recombinação de vírus de ARN (para uma revisão ver Boyer e Haenni, 1994) . Adicionalmente, podem ter-se em consideração estes clones para o desenvolvimento de novos vectores virais e vacinas. Até à data, não foi descrito um clone 11 de ADNc infeccioso para os Arterivirus. Revela-se aqui a produção de um clone infeccioso de PRRSV e sua primeira aplicação na produção de virus de PRRSV quiméricos. MATERIAIS E MÉTODOS Células e vírus A estirpe Ter Huurne de PRRSV (ou LV) (depositada no CNCM, Paris, com o número de registo 1-1102) foi isolada em 1991 (Wensvoort et al., 1991) e foi cultivada em macrófagos alveolares primários ou em células CL2621. Neste estudo foram utilizadas 6 passagens da estirpe Ter Huure (TH), bem como um derivado desta estirpe, LV4.2.1, que foi adaptado para crescer em células CL2621 por passagem em série. Os macrófagos alveolares foram mantidos em meio de crescimento RPMI 1640 (Flow), enquanto as células CL2621 foram mantidas em meio mínimo essencial de Hank (Gibco-BRL/Life technologies). As células BHK-21 foram mantidas em meio mínimo essencial de Dulbecco. Nas experiências de transfecção, as células BHK-21 foram cultivadas em meio mínimo essencial de Glasgow (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd), de acordo com o método de Liljestrõm e Garoff (1993).

Isolamento de ARN virais O ARN intracelular foi isolado a partir de macrófagos alveolares ou células CL2621, 24 h após infecção por PRRSV a uma multiplicidade de infecção de 1, como descrito anteriormente (Meulenberg et al., 1993a). A fim de isolar ARN genómico de virião, purificaram-se viriões em gradientes de sacarose como 12 descrito por van Nieuwstadt et al. (1996) e foram ressuspensos em TNE (Tris-HCl a 0,01 M, pH 7,2, NaCl a 0,1 M, EDTA a 1 mM) . Um mL de tampão de Proteinase K (Tris-HCl a 100 mM, pH 7,2, EDTA a 25 mM, NaCl a 300 mM, 2% (p/v) de SDS) e 0,4 mg de Proteinase K (Boehringer Mannheim) foram adicionados a um mL de viriões de PRRSV purificados (108 TCID50) . Esta mistura de reacção foi incubada a 37 °C durante 30 min. O ARN foi extraído uma vez com fenol/clorofórmio (1:1) e precipitado com etanol. O ARN foi armazenado em etanol a -20 °C. Um décimo desta preparação de ARN foi utilizada em reacções de Transcrição Reversa (RT).

Clonagem das extremidades 5' e 3' do genoma de PRRSV. A extremidade 5' do genoma virai de PRRSV foi clonada utilizando um processo modificado de ligação de cadeia simples a ADNc de cadeia simples (SLIC; Edwards et al., 1991). Um décimo do ARN de virião, preparado como descrito anteriormente, foi utilizado numa reacção RT com o iniciador 11U113 (5' TACAGGTGCCTGATCCAAGA 3') que é complementar aos nucleotídeos 1232 a 1251 do genoma. A reacção RT foi realizada num volume final de 20 pL, como descrito anteriormente (Meulenberg et ai., 1993b). Subsequentemente, 2 pL de NaOH a 6 M foram adicionados à reacção RT e o ARN foi hidrolisado durante 30 min a 37 °C. O ADNc de cadeia simples foi purificado utilizando o PCR Product Purification kit da Boehringer Mannheim extremamente puro. O ADNc purificado foi precipitado com etanol, ressuspendido em TE e ligado a um iniciador âncora ALG3 (5' CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC 3'). Este iniciador contém um sítio EcoRl, Ciai, e BamHl e a sua extremidade 3' é modificada por um grupo bloqueador amino para impedir a auto-ligação. O produto de ADNc de cadeia simples foi ligado a 4 pmol de ALG3 em 13

Tris-HCl a 50 mM (pH 8,0), MgC]_2 a 10 mM, 10 g/mL de BSA, 25% de PEG, Cloreto de Hexamina Cobalto a 1,0 mM, ATP a 40 μΜ e 0,5 pL (10 U) de T4 ARN ligase (New England Biolabs), de um dia para o outro à temperatura ambiente. Um terço da reacção de ligação foi utilizado como molde num PCR com os iniciadores LV69 (5' AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC 3') e ALG4 (5' GAAGGATCCAGAATCGATAG 3'). O iniciador LV69 é complementar aos nucleotideos 594 a 615 do genoma de LV, enquanto o ALG4 é complementar ao iniciador âncora ALG3. As condições de PCR foram como descrito em Meulenberg et al. (1993b) e o produto obtido foi digerido com EcoRI e Sall e clonado em pGEM-4Z. Foi utilizada uma estratégia semelhante para clonar a extremidade 5' do genoma de LV a partir de ARN de LV intracelular. Para estas experiências foram utilizadas 10 pg de ARN total celular isolado a partir de células CL2621 infectadas por LV. Os clones de ADNc em 5' foram sequenciados e um clone, pABV387, contendo uma extensão de 10 nucleotideos comparada à sequência publicada de PRRSV (Meulenberg et al., 1993a), foi utilizado para experiências adicionais.

Um clone de ADNc da extremidade 3' contendo uma longa cauda poli (A) foi construído por transcrição reversa de ARN de LV com o iniciador LV76 (5' TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T) 4o 3'), que contém um sítio EcoRI, XbaI e Pvul. A reacção de transcrição reversa foi seguida de um PCR com os iniciadores LV75 (5' TCTAGGAATTCTAGACGATCGT 3'), que é idêntico ao LV7 6 à excepção da sequência de poli(T) e 39U70R (5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAA 3'), um iniciador de sentido, correspondente aos nucleotideos 14566-14585 do genoma de LV e contendo um sítio Npal. Os produtos de PCR resultantes foram digeridos com Hpal e EcoRI e clonados no clone de ADNc pABV39 restringido com as mesmas enzimas (Fig. 1) . Dois clones de ADNc 14 contendo uma sequência poli(A) de 45 A (pABV382) e 109 A (pABV392) e a sequência correcta de ADNc genómico, como avaliado pela sequenciação oligonucleotídica, foram utilizados para construir o clone de ADNc genómico de comprimento completo.

Análise de Sequência.

As sequências oligonucleotidicas foram determinadas com o

TM

Ready Reaction Dye Deoxy Termmator Cycle Sequencmg Kit da PRISM™ e com o sequenciador Automatic da Applied Biosystems.

Construção de clones de ADNc genómico de comprimento completo de PRRSV.

Os clones de ADNc produzidos anteriormente para determinar a sequência nucleotidica do genoma de LV (Meulenberg et al., 1993a) foram ligados conjuntamente, nos sítios de restrição convenientes, como mostrado na figura 1. O plasmídeo pABV254 foi construído a partir dos clones pABV 25, 11, 12 e 100 e foi utilizado num estudo prévio (den Boon et al., 1996). Processos de clonagem padrão foram efectuados de acordo com Sambrook et al. (1989). O que resultou em três plasmídeos contendo sequências de ADNc de LV sobrepostas no plasmídeo de elevado número de cópias pGEM-4Z. Os plasmídeos pABV331 e pABV369 consistem nos nucleotídeos 5 a 6015 do genoma de LV. Verificou--se uma diferença nucleotidica na posição 3462 a uma razão de 1:1 num conjunto de 6 clones de ADNc independentes que foram sequenciados nessa região. Esta diferença nucleotidica resultou na substituição de um aminoácido na posição 1084 em ORF1A (Leu em vez de Pro) . Visto que não foi possível prever a influência 15 deste aminoácido na infectividade, clonou-se igualmente a Leu codificando o fragmento de ADNc em pABV331 pela permuta no sitio EcoRV (nucleotideo 3403) e Sacll (nucleotídeo 3605), que resultou em pABV369. O plasmideo pABV384 consiste nos nucleotideos 5168 a 9825 do genoma de LV. Visto não estar ainda disponível nenhum clone de ADNc apropriado que se sobrepusesse aos plasmídeos pABV20 e pABV5 e pudesse, finalmente, fundir-se às sequências de ADNc de pABV331 e pABV369, foram produzidos dois novos fragmentos de ADNc por RT-PCR. O iniciador sentido LV59 (5' TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG 3') correspondente aos nucleotideos 5169-5186 e o iniciador anti-sentido 61U303 (5' CATCAACACCTGTGCAGACC 3') complementar aos nucleotideos 6078 a 6097 foram utilizados num PCR. O iniciador de sentido 61U526R (5' TTCCTTCTCTGGCGCATGAT 3') localizado nos nucleotideos 5936 a 5955 e LV60 (5' GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC 3') complementar aos nucleotideos 6727 a 6745 foram utilizados noutro PCR. Estes dois fragmentos de PCR foram ligados um ao outro no pABV20 utilizando o sítio Xbal incorporado em LV59, o sítio interno Apol (nucleotideos 6006) e o sítio BamEI no nucleotídeo 6740, que foi igualmente incorporado no iniciador LV60. O novo fragmento de ADNc foi completamente sequenciado e não continha quaisquer mutações que resultassem em diferenças de aminoácidos relativamente à sequência publicada (Meulenberg et al., 1993a). O plasmideo pABV368 abrange os nucleotideos 8274 a 13720 do genoma de PRRSV. Visto que a ligação adicional de fragmentos de ADNc no pGEM-4Z resultou em clones instáveis, os insertos de pABV331/369, pABV384 e pABV368 foram ligados aos fragmentos de ADNc em 5' e 3' no pOK12 (Viera e Messing, 1991) . Espera-se que o vector plasmídico pOKl2 seja mais adequado para a clonagem de sequências de grandes dimensões de ADNc estranho, porque possui um menor número de cópias do que o pGEM-4Z. Os plasmídeos foram transformados na estirpe de Escherichia coli DH5a, cultivada a 16 32 °C na presença de 15 yg/mL de canamicina, para manter o número de cópias tão baixo quanto possível. Em primeiro lugar, os fragmentos de ADNc de pABV382 ( (A)45) e pABV392 ((A) 109) foram excisados por digestão com EcoRI e modificação deste sítio com a Klenow polimerase (Pharmacia) em extremidades rombas, seguido de digestão com BamRI. Estes fragmentos foram clonados em pOK12 digerido com BamEI e FspI, o segundo sítio modificado igualmente em extremidades rombas, resultando em pABV394 e pABV395. Desta forma, foi removido o promotor da T7 ARN polimerase presente em pOKl2. Subsequentemente, os fragmentos de ADNc de pABV368 e pABV384 foram ligados aos clones de ADNc da extremidade 3' utilizando o sítio Bell (nucleotídeo 13394), o sítio Seal (nucleotídeo 8657) e os sítios BamHI e BglII nas sequências flanqueantes ou de vector. 0 que resultou nos plasmídeos pABV401 e pABV4 02 (Fig. 1).

Um clone de ADNc em 5', contendo o promotor da T7 ARN polimerase directamente fundido à extremidade 5' do genoma de LV foi amplificado por PCR a partir de pABV387 com os iniciadores LV83 (5' GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC 3') e LV69. O LV83 é composto por, na ordem de 5' para 3', um sítio EcoRI e Spel, uma sequência promotora de T7 ARN polimerase, um único G para iniciação de transcrição e os nucleotídeos 1 a 19 do genoma de LV. O fragmento de PCR foi clonado no sítio EcoRI e SalI de pOKl2, resultando em pABV396. A sequência correcta de pABV396 foi avaliada por sequenciação oligonucleotídica. Subsequentemente, os fragmentos de ADNc de LV de pABV331 e pABV369 foram excisados com Apal e BamEI e foram ligados a pABV396, digerido com Apal e BamEI. Finalmente, os fragmentos de ADNc em 5' resultantes foram clonados em pABV401 e pABV402, utilizando o sítio Spel a montante do promotor da T7 ARN polimerase e do sítio único Pmll na posição 5168 no genoma 17 virai. Desta forma, os clones de ADNc de comprimento genómico foram obtidos como correspondentes a virus semelhantes à estirpe parental e a virus quiméricos compreendendo fases de leitura aberta estranhas.

Produção de vírus mutantes contendo um sítio PacI e/ou SwaI A fim de introduzir um sítio PacI único no clone de ADNc de comprimento genómico directamente a jusante do gene 0RF7, o T e A nos nucleotídeos 14987 e 14988 foram ambos substituídos por um A num PCR utilizando o iniciador sentido LV108 (5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') com o iniciador anti-sentido LV 112 (5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3') e iniciador sentido LV111 (5' TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG 3') com LV75.

Analogamente, um sítio SwaI único foi criado pela troca de G na posição 14980 por um T e o T na posição 14985 por um A, por PCR, com os iniciadores LV108 e LV110 (5' CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC 3') e iniciadores LV109 (5' GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG 3') e LV111. Os fragmentos de PCR foram ligados em pABV395 utilizando o sítio criado PacI e SwaI e flanqueando os sítios Hpal e Xbal, resultando em pABV427 e pABV426, respectivamente. Este fragmento foi, depois, inserido em pABV414 utilizando os mesmos sítios Hpal e Xbal únicos, resultando em pABV437 e pABV442 (ver Fig. 4). A fim de detectar a mutação do marcador no vírus recuperado a partir dos transcritos de pABV437 e pABV422, o ARN foi isolado a partir do sobrenadante de macrófagos alveolares porcinos infectados. Este ARN foi utilizado no PCR de transcrição reversa para amplificar um fragmento de, aproximadamente, 0,6 kb (abrangendo os nucleotídeos 14576-cauda poli(A) de comprimento variável) com os 18 iniciadores LV76, LV75 e 39U70R. A presença do marcador genético foi detectada pela digestão dos fragmentos de PCR com PacI ou SwaI.

Transcrição e transfecção in vitro de ARN

Os plasmideos pABV414, pABV416, contendo o fragmento de ADNc genómico de comprimento completo de LV, foram linearizados com Pvul, que se localiza directamente a jusante da sequência de poli(A). 0 plasmídeo pABV296, que consiste na 0RF4 do vector de expressão pSFVl no vírus de Semliki Forest (SFV) (Meulenberg et al.r 1997), foi linearizado com Spel e serviu como controlo para as experiências de transcrição e transfecção in vitro. Os plasmideos linearizados foram precipitados com etanol e 1,5 yg destes plasmideos foram utilizadas para transcrição in vitro com a T7 ARN polimerase (plasmideos pABV414, pABV416) ou Sp6 ARN polimerase (pABV296), de acordo com os métodos descritos para SFV por Liljestrõm e Garoff (1991 e 1993) . 0 ARN transcrito in vitro foi precipitado com isopropanol, lavado com etanol a 70% e armazenado a -20 °C até à sua utilização. As células BHK-21 foram semeadas em poços M6 (aproximadamente 106 células/poço) e transfectadas com 2,5 yg de ARN misturado com 10 yL de lipofectin em optimem como descrito por Liljestrõm e Garoff (1993) . Alternativamente, o ARN foi introduzido em

células BHK-21 por electroporação. Neste caso, 10 yg de ARN transcrito in vitro ou 10 yg de ARN de LV intracelular foram transfectadas em, aproximadamente, 107 células BHK-21 utilizando as condições de electroporação de Liljestrõm e Garoff (16). O meio foi recolhido 24 h após transfecção e foi transferido para células CL2621 para resgatar o vírus infeccioso. As células transfectadas e infectadas foram testadas para expressão de 19 proteínas específicas de LV por intermédio de um ensaio de monocamada de imunoperoxidase (IPMA), essencialmente como descrito por Wensvoort et al. (1986). Para coloração no IPMA foram utilizados os anticorpos monoclonais (MAbs) 122.13, 122.59, 122.9 e 122.17, dirigidos contra as proteínas GP3, GP4, M e N (van Nieuwstadt et al., 1996).

RESULTADOS

Reconstrução da sequência terminal 5' do ARN genómico de LV.

Embora tenha sido relatada a infectividade de ARN transcritos in vitro com extremidades 5' truncadas (Davis et al. 1989, Klump et al., 1990), é geralmente reconhecido que é necessária toda a sequência virai, incluindo a extremidade mais em 5' e 3', para a obtenção de clones infecciosos. A fim de clonar a extremidade 5' do genoma de LV, foi utilizado um processo modificado de ligação de cadeia simples a ADNc de cadeia simples (SLIC; Edwards et al., 1991). Ambos os ARN intracelulares isolados a partir de células CL2621 infectadas por LV e ARN de LV de viriões purificados foram transcritos reversamente utilizando o iniciador LV69, que era complementar à extremidade 5' de ORF1A. A primeira cadeia do produto de ADNc foi ligada a um iniciador âncora ALG3 cuja extremidade 3' foi bloqueada para auto-ligação. Os produtos ligados foram amplificados por PCR e foram clonados. Foram sequenciados doze clones, derivados de ARN intracelular de LV e resultantes de dois PCR independentes e catorze clones, derivados de ARN de virião e resultantes de dois PCR independentes. Destes 26 clones de ADNc, 22 clones continham uma extensão de 10 nucleotídeos 20 (5' ATGATGTGTA 3') comparativamente com a sequência de ADNc, anteriormente publicada (Meulenberg et al., 1993a), enquanto 4 clones não possuíam um a três nucleotídeos na extremidade 5' desta sequência adicional (Tabela 1). 0 que conduziu à conclusão que estes dez nucleotídeos representam a extremidade mais em 5' do genoma de LV e foram, por conseguinte, incorporados no clone de ADNc de comprimento genómico.

Construção de clones de ADNc de comprimento genómico de LV A fim de construir um clone de ADNc de comprimento genómico de LV, ADNc que foram isolados e sequenciados anteriormente (Meulenberg et al., 1993a) foram ligados em sítios partilhados de enzimas de restrição, de acordo com a estratégia representada na Figura 1. Adicionalmente, foram produzidos novos fragmentos de ADNc para construir os clones de ADNc de comprimento genómico. Um fragmento de ADNc abrangendo os nucleotídeos 5168 a 6740 foi criado por RT-PCR para possibilitar a ligação de sequências de ADNc dos clones pABV5 e pABV20. Um promotor da T7 ARN polimerase para transcrição in vitro foi directamente ligado à extremidade 5' do genoma de LV por PCR e este novo fragmento de ADNc, clonado em pABV396, foi inserido no clone de ADNc de comprimento genómico. A re-sequenciação dos nucleotídeos 3420 a 3725 em seis novos clones de ADNc independentes indicou que no aminoácido 1084 na ORFla, estão presentes uma Leu e Pro numa razão de 1:1. Visto que não se pôde prever a influência deste aminoácido na infectividade do ARN transcrito a partir do clone final de ADNc de comprimento genómico, utilizaram-se ambos para construir este clone. Foram utilizados dois clones de ADNc diferentes na extremidade 3' . Foram isolados anteriormente clones de ADNc de extremidade 3' contendo caudas poli(A) de, no 21 máximo, 20 A (Meulenberg et al., 1993a). Contudo, em vista de estudos relatados sobre o comprimento de caudas poli(A) de virus relacionados, tais como LDV (Chen et al., 1994), esperava-se que a totalidade da cauda poli(A) fosse muito mais comprida. Por conseguinte, os novos clones de ADNc de extremidade 3' foram produzidos utilizando o iniciador LV76 que contém uma sequência de 40 resíduos T. Estes clones de ADNc foram sequenciados e continham sequências de 40 a 109 resíduos A. O clone de ADNc contendo a sequência poli (A) mais comprida (109 resíduos A; pABV392) foi utilizado para o clone de ADNc de comprimento genómico. Visto que extensões homopoliméricas compridas poderiam interferir com a replicação de plasmídeos em E. coli (Deng e Wu, 1981), seleccionou-se igualmente um segundo clone, pABV382, contendo 45 resíduos A para utilização em etapas de clonagem subsequentes. Foi anteriormente observado que a manutenção de clones de ADNc de comprimento genómico em plasmídeos de elevado número de cópias conduz a acumulação de mutações ou deleções que resultam na perda de infectividade de transcritos sintetizados a partir destes clones (Lai et al., 1991; Rice et al., 1987; Sumiyoshi et al., 1992). Também foi observada instabilidade de plasmídeos quando se tentou ligar os maiores fragmentos de ADNc dos clones de pABV 331/369, 384 e 368 às extremidades 5' e 3' no pGEM-4Z e, por conseguinte, estes clones foram finalmente fundidos entre si no vector de baixo número de cópias pOK12 (Viera e Messing, 1991) . Isto resultou nos clones de ADNc de comprimento genómico pABV414/415 e 416, que podiam ser propagados de forma estável em E. coli com as condições de cultivo utilizadas. Não foi observada nenhuma diferença na estabilidade dos clones de ADNc de comprimento genómico contendo 45 ou 109 resíduos A. 22

Infectividade de ARN de LV 0 LV cresce, de um modo preferido, em macrófagos alveolares porcinos. Até agora, a linha celular CL2621 ou outros clones derivados da linha celular de rim de macaco MA104 são linhas celulares que demonstraram propagar o LV (Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993). Por conseguinte, as células CL2621 foram utilizadas para determinar as condições óptimas para a transfecção de ARN de LV. 0 ARN isolado a partir de células CL2621 infectadas por LV foi transfectado para células CL2621 em dosagens diferentes utilizando métodos diferentes, tais como lipofectin, lipofectamin, dextrano DEAE e electroporação. As células foram pesquisadas para efeito citopático e halos até 7 dias após transfecção, porém estes sinais de virus infecciosos não puderam ser detectados. Adicionalmente, não puderam ser detectados nenhuns antigénios específicos de LV em IPMA utilizando MAbs específicos de LV. Nestas experiências, foi utilizado como controlo ARN de pABV296 transcrito in vitro. 0 plasmídeo pABV296 consiste no gene da 0RF4 codificando a GP4 inserido no vector de expressão pSFVl (Meulenberg et al., 1997). A eficiência de transfecção do ARN de pABV296 foi testada pela coloração das células transfectadas em IPMA com MAbs específicos de Gap4~. A eficiência de transfecção mais elevada, resultando em 0,01% de células CL2621 positivas, foi obtida por electroporação, enquanto 80-90% de células positivas foram obtidas com células BHK-21, utilizando condições semelhantes. Estes resultados indicaram que as células CL2621 não eram adequadas para experiências de transfecção, enquanto as células BHK-21 (não susceptíveis à infecção por vírus de tipo selvagem) pareceram, surpreendentemente, muito adequadas. Por conseguinte, as células BHK-21 foram utilizadas para testar a infectividade de ARN de LV. Duas yg de ARN isolado de células 23 CL2621 infectadas por LV foram transfectadas para, aproximadamente, 106 células BHK-21 com lipofectin, de acordo com as condições descritas para SFV (Liljestrõm e Garoff, 1993). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram coradas com MAb 122.17 especifico de LV dirigido contra a proteína N de LV. Aproximadamente 3-10 células individuais coraram positivo, porém não se observaram centros ou halos infecciosos sugerindo propagação célula a célula. A transfecção do ARN de controlo transcrito a partir de pABV296, resultou em 60-70% de células BHK-21 positivas utilizando estas condições. O sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com ARN de LV intracelular e pABV296 foi transferido para células CL2621. Após 3 a 4 dias, observaram-se halos nas células que foram incubadas com o sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com ARN de LV intracelular, mas não naquelas incubadas com sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com ARN de pABV296. Os halos coraram positivo com MAbs específicos de LV em IPMA. Obtiveram--se resultados semelhantes quando foi utilizado ARN isolado a partir de viriões purificados de LV. Além disso, o número de células coradas positivamente aumentou 2 a 4 vezes quando as células foram transfectadas por electroporação. Estes dados indicaram que o LV não consegue infectar as células BHK-21 porque, muito provavelmente, estas não possuem o receptor para LV. Contudo, após o ARN genómico ter sido introduzido nas células BHK-21, novas partículas virais infecciosas são produzidas e excretadas para o meio. A re-infecção de células BHK-21 já transfectadas com estas partículas, sejam cápsides livres ou partículas com envelope parcial ou total não é, de novo, possível. 24 Síntese in vitro de ARN infeccioso.

Visto que — para um PRRSV de tipo selvagem essencialmente não susceptivel — as células BHK21 eram especificamente apropriadas para o resgate de vírus a partir de ARN de LV intracelular e as células CL2621 susceptíveis não o eram, as células BHK-21 foram utilizadas para testar se o ARN transcrito a partir dos clones de ADNc de comprimento genómico era infeccioso. Os plasmídeos pABV414/416 foram linearizados com Pvul e transcritos in vitro utilizando a T7 ARN polimerase. 0 sítio Pvul localiza-se directamente a jusante da sequência poli (A), tal que o ARN transcrito contém 2 nucleotídeos não virais na extremidade 3' (Fig. 2) . Adicionalmente, os transcritos devem conter um G não virai na extremidade 5', que é o sítio de iniciação da transcrição da T7 ARN polimerase. Aproximadamente 2,5 yg de ARN transcrito in vitro foram transfectadas para células BHK-21, juntamente com 2 yg de ARN de LV intracelular como controlo positivo para o resgate subsequente de vírus em células CL2621 e ARN de pABV296 como controlo positivo para a transfecção de ARN para células BHK-21 e controlo negativo para resgate subsequente de vírus em células CL2621. Decorridas 24 h após a transfecção, o sobrenadante das células foi recolhido e as células foram fixadas e coradas em IPMA com MAb 122.17 específico de N. Ao passo que apenas se observaram algumas células positivas nos poços com células BHK-21 que foram transfectadas com ARN de LV intracelular, 800 a 2700 células positivas foram observadas nos poços com células BHK-21 transfectadas com ARN transcrito a partir de pABV414/416. A fim de confirmar se o vírus infeccioso foi libertado das células, os sobrenadantes foram utilizados para infectar células CL2621. Foram produzidos halos em culturas de CL2621 que foram infectadas com o sobrenadante de células BHK-21 transfectadas 25 com ARN de LV intracelular e transcritos de pABV414/415. Os halos coraram positivo em IPMA com MAbs contra as proteínas N, M, GP4 e GP3, sugerindo que estas proteínas foram todas correctamente expressas. Não se observaram halos e coloração em IPMA em culturas de CL2621 incubadas com o sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com ARN transcrito a partir de pABV296. Por conseguinte, estes resultados demonstram, manifestamente, que a transfecção de ARN transcrito a partir dos clones de ADNc de comprimento genómico pABV414 e pABV416 para células BHK-21 resulta na produção e libertação de LV infeccioso. Além disso, quando os transcritos de pABV414 e pABV416 foram transfectados para células BHK-21 por electroporação em vez de lipofectin, obteve-se um aumento duas a quatro vezes de células que coram positivo com MABbs específicos de LV. 0 título dos vírus recombinantes no sobrenadante destas células BHK-21 electroporadas foi de, aproximadamente, 105 TCIDso/mL.

Curvas de crescimento de vírus de cópias infecciosas comparadas a Ter Huurne e LV4.2.1:

Características de crescimento de vírus resgatados

As experiências iniciais de transfecção e infecçâo sugeriram que os vírus recombinantes resgatados, designados vABV414 e vABV416, infectam e crescem igualmente bem em macrófagos alveolares porcinos, mas crescem mais devagar em células CL2621 do que vírus resgatados de células BHK-21 transfectadas com ARN de LV intracelular. Este ARN de LV intracelular foi isolado a partir de células CL2621 infectadas por LV4.2.1, que foi adaptado para crescer em CL2621. A fim de 26 estudar mais exaustivamente as propriedades de crescimento de vABV414 e vABV416, determinaram-se curvas de crescimento em células CL2621 e macrófagos alveolares porcinos e foram comparadas com aquelas de LV de tipo selvagem, que foi apenas submetido a passagem em macrófagos alveolares porcinos (TH) e com aquelas de LV4.2.1 cultivados em células CL2621. As taxas de crescimento dos dois vírus recombinantes não diferiram, crescendo igualmente bem, independentemente se eram derivadas directamente de BHK-21 ou submetidas a passagem adicional em macrófagos alveolares porcinos (Fig. 3) . Os títulos (7,1-7,9 TCID5o/mL) em macrófagos alveolares porcinos tiveram um pico em torno das 32 h após infecção, ao passo que os títulos em CL2621 foram mais lentos e ainda não tinham atingido o pico, mesmo decorridas 96 h após a infecção. 0 vírus TH possuía características de crescimento semelhantes aos recombinantes. Em contrapartida, o vírus adaptado de CL2621 LV4.2.1 cresceu mais depressa em células CL2621 do que os vírus vABV414, vABV416 e TH (Fig. 3) . Resumindo, estes resultados demonstram que as propriedades de crescimento dos vírus recombinantes são semelhantes às dos vírus TH. Tal era esperado, visto que a sequência de ADNc utilizada para construir os clones infecciosos foi derivada do vírus TH parental "não adaptado".

Introdução de um marcador genético no clone infeccioso de LV A fim de demonstrar que o clone de ADNc de comprimento genómico pode ser utilizado para produzir vírus LV mutantes, introduziu-se um sítio PacI e SwaI único directamente a jusante do gene 0RF7 por intermédio de mutagénese dirigida por PCR (Fig. 4) . Quando ARN transcrito a partir do clone de ADNc de 27 comprimento genómico pABV437 contendo o sítio PacI e pABV442 contendo o sítio Swal foi transfectado para células BHK-21 e o sobrenadante foi transferido para macrófagos alveolares porcinos e células CL2621, decorridas 24 h após a transfecção, produziu--se vírus infeccioso. Os vírus resgatados, vABV437 e vABV442, possuíam propriedades de crescimento semelhantes ao vírus parental vABV414 em macrófagos alveolares porcinos e nas células CL2621 (dados não apresentados). Uma região específica de, aproximadamente, 0,6 kb (nucleotídeos 14576-cauda poli(A)) foi amplificada por transcrição reversa e PCR de ARN virai isolado a partir do sobrenadante de macrófagos alveolares porcinos infectados por vABV414 e vABV416. A digestão com PacI demonstrou que este sítio de restrição estava, de facto, presente no fragmento derivado de vABV437, mas estava ausente do fragmento derivado de vABV414. Analogamente, foi demonstrada a presença do sítio SwaI em vABV442 (dados não apresentados). Deste modo, foi possível excluir a possibilidade de contaminação por vírus de tipo selvagem e, por conseguinte, foi confirmada a identidade de νΑΒV437 e vABV4 42.

DISCUSSÃO

A moderna tecnologia do ADN recombinante permite a análise e modificação de genomas ao nível molecular e adquirir, assim, um conhecimento mais profundo da sua organização e expressão. No caso dos vírus de ARN, esta requer a produção de clones de ADNc de comprimento genómico a partir dos quais se podem sintetizar transcritos infecciosos. Na maioria dos casos, um pré-requisito para a construção de clones infecciosos consiste na identificação das sequências na extremidade do respectivo genoma virai que são, provavelmente, cruciais para a replicação de ARN 28 virai. Demonstrou-se num estudo prévio que o LV contém uma cauda poli(A) na extremidade 3' (Meulenberg et al., 1993a). No presente trabalho determinou-se a extremidade 5' exacta do genoma de LV. Embora tenham sido descritos vários métodos para determinar a extremidade 5' de ARN ou ARNm genómicos virais, porém, a maior parte deles possui limitações importantes. Para os flavírus e pestivírus, tem sido utilizado um método que é baseado na circularização de ARN genómico. Contudo, este método necessita de análises concomitantes para definir a fronteira entre a extremidade 5' e 3' do genoma. 0 método de amplificação rápida de extremidades de ADNc (RACE 5') baseia-se na adição de uma cauda homopolimérica com a terminal desoxirribonucleotideo transferase (TdT) à primeira cadeia da cadeia de ADNc. Contudo, a reacção de adição da cauda é muito ineficiente e este método requer, igualmente, análises adicionais, visto que não se pode concluir se o primeiro nucleotideo da cauda representa a sequência virai ou já faz parte da cauda adicionada enzimaticamente. Neste estudo, determinou-se a extremidade mais em 5' do genoma virai por ligação de um oligonucleotideo com uma sequência especificada a um produto de extensão de um iniciador de primeira cadeia e amplificação por PCR. Verificou-se uma extensão de 10 nucleotídeos (ATGATGTGTA), com respeito à sequência publicada, em vários clones independentes e, por conseguinte, assumiu-se que representam os nucleotídeos da extremidade mais em 5' do genoma virai. Isto resulta, ao todo, numa sequência condutora de 221 nucleotídeos, que é semelhante em comprimento à sequência condutora de EAV (207 nucleotídeos; den Boon et al., 1991), SHFV (208 nucleotídeos; Zeng et al., 1995), mas mais comprida do que a sequência condutora de LDV (155 nucleotídeos; Chen et al., 1994). Contudo, não existe homologia significativa entre as sequências condutoras destes arterivírus. 29 A extremidade mais em 5' foi incorporada no ADNc de comprimento genómico para criar um clone infeccioso. Os principais problemas relacionados com a produção de clones infecciosos envolvem a estabilidade das sequências viricas quando clonadas em bactérias, bem como a produção das extremidades 5' e 3' correctas. Embora falhassem as tentativas iniciais para construir um clone de ADNc de comprimento genómico em pGEM-4Z, o fragmento de ADNc genómico de 15207 nucleotideos de comprimento de LV permaneceu estável no plasmideo de baixo número de cópias pOKl2 e é agora o clone infeccioso mais longo de um virus de cadeia de ARN positiva produzido até agora. Os transcritos dos clones de ADNc de comprimento genómico continham uma estrutura cap em 5' e um G não virai extra na extremidade 5' e um GG não virai na extremidade 3', porém estas extensões não aboliram a sua infectividade. Diversos investigadores relataram uma reduzida infecção inicial de ARN transcrito a partir de clones de ADNc de comprimento completo em virtude de sequências estranhas não autênticas em ambas as extremidades 5' e 3' ou em virtude de encapsulação incompleta. Os transcritos de ADNc de comprimento completo de LV que não possuiam uma estrutura cap não eram infecciosos. Embora a infectividade de transcritos de clones de ADNc infecciosos tenha sido sempre testada em linhas celulares que são susceptiveis ao virus, não se conseguiu demonstrar a infectividade de transcritos de clones de ADNc de comprimento genómico ou ARN de LV isolado a partir de células CL2621 por transfecção destes ARN para células CL2621. Tal deveu-se à fraca eficiência de transfecção em células CL2621, pelo que a síntese da cadeia de ARN virai é, provavelmente, impedida pela interferência ou interacção com fragmentos de ARN incompletos ou proteínas da cápside resultantes da reinfecção das células CL2621 por partículas interferentes defeituosas, tais como cápsides livres contendo apenas fragmentos do genoma 30 virai. Contudo, a transfecção de transcritos de clones de ADNc de comprimento completo e ARN de LV intracelular para BHK-21 resultou na produção e libertação de virus infeccioso, que podia ser resgatado em células CL2621. A reinfecção de células BHK-21 com cápsides livres não ocorre e, portanto, não impede a síntese de ARN virai de comprimento completo. A infectividade específica foi de, aproximadamente, 400-1500 células positivas por pg de ARN transcrito in vitro, ao passo que foram obtidas 2 a 5 células positivas por pg de ARN intracelular de LV. Contudo, estas infectividades específicas não podem ser comparadas, porque apenas uma fracção muito pequena do ARN intracelular isolado a partir de células CL2621 infectadas por LV representa ARN genómico de LV. Além disso, a quantidade de ARN genómico isolado a partir de viriões, que foi utilizada nas transfecções, era demasiado pequena para permitir uma quantificação exacta.

Adicionalmente, as células BHK-21 foram avaliadas quanto à produção de antigénio em IPMA com MAb específicos de LV, que não correlaciona necessariamente com a produção de vírus infeccioso. O que resulta do facto de o sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com 2 pg de ARN de LV intracelular conter um título mais elevado de unidades formadoras de halos, ensaiado em células CL2621, do que o sobrenadante de células BHK-21 transfectadas com 2,5 pg de transcrito de clones de ADNc de comprimento completo. Embora se tenha verificado anteriormente para um determinado número de vírus que o comprimento da cauda poli(A) influenciou a infectividade dos transcritos virais (Holy e Abouhaidar, 1993; Sarow, 1989), não se observou qualquer diferença de infectividade entre transcritos de clones de ADNc genómico contendo uma cauda de 45 ou 109 resíduos. Poderá ser possível que uma cauda de 45 resíduos A esteja acima de um comprimento limite, abaixo do qual se alterará a estabilidade 31 dos transcritos correspondentes. Verificou-se uma diferença entre clones no aminoácido 1084 na ORFla, originando uma PRO e LEU a uma razão de 1:1. Este aminoácido não possuiu uma influência na infectividade, visto que transcritos de clones de ADNc de comprimento completo contendo este codão LEU ou PRO não exibiram qualquer diferença na infectividade de células BHK-21. O clone infeccioso de comprimento genómico foi utilizado para produzir um virus quimérico expressando a proteina da nucleocápside da estirpe de PRRSV ATCC VR2332. Adicionalmente, o clone infeccioso de comprimento genómico foi utilizado para produzir um virus quimérico expressando a proteína da nucleocápside do virus de murganho LDV. Os vírus quiméricos podem ser distinguidos de vírus parentais com MAbs específicos de estirpe, estes não coram com anticorpos monoclonais especificamente reactivos com a proteína N (ORF7) da estirpe Ter Huurne de PRRSV. Além disso, o vírus quimérico em que a proteína N de PRRSV é substituída pela proteína N de LDV, não é reactivo com anticorpos de porcinos convalescentes reactivos com a proteína N de PRRSV. Visto que todos os suínos infectados por PRRSV desenvolvem anticorpos dirigidos contra a proteína N de PRRSV, os vírus quiméricos serão utilizados em projectos futuros utilizando novas vacinas vivas contra PRRSV e a utilização deste vírus como sistema vector, que é especificamente alvejado para a sua célula hospedeira, o macrófago pulmonar alveolar. Neste contexto, deve mencionar-se que as tentativas iniciais para conferir protecção com vírus mortos ou unidades recombinantes foram decepcionantes. A única vacina actualizada eficaz contra PRRS disponível é uma vacina viva modificada, baseada numa estirpe US (Gorcyca, et al., 1995). Contudo, os suínos vacinados com este produto vivo modificado não se conseguem distinguir de suínos infectados pelo vírus selvagem. O clone infeccioso de 32 PRRSV proporciona, portanto, uma denominada vacina indicadora por intermédio de mutagénese dirigida pontual do genoma, tal que suínos vacinados podem ser distinguidos de suínos infectados por vírus selvagens com base na diferença em anticorpos do soro. 0 clone infeccioso de LV, aqui descrito, é o clone infeccioso de maior comprimento alguma vez desenvolvido de um vírus de ARN de cadeia positiva e o primeiro da família de arterivírus. A produção deste clone infeccioso de PRRSV deixa em abeto novas oportunidades para estudos direccionados para a patogénese, tropismo de hospedeiro e replicação e transcrição deste vírus. Os arterivírus e coronavírus partilham um mecanismo de transcrição específico, também referido como transcrição iniciada por sequência condutora, que envolve a produção de um denominado conjunto com iniciadores internos de ARN subgenómicos contendo uma sequência condutora em 5' comum (Spaan et. al., 1988; Plagemann e Moennig, 1991) . Esta transcrição iniciada por sequência condutora é um processo complexo, que ainda não é totalmente compreendido. Os estudos de virologia do coronavírus para elucidar o mecanismo subjacente à transcrição iniciada por sequência condutora estão restringidos a análises e mutagénese dirigida pontual de ADNc de ARNs interferentes defeituosos, visto que as grandes dimensões do genoma (28 a 30 kb) têm impedido a construção de um clone infeccioso. O clone infeccioso de PRRSV é útil como sistema modelo para estudar e decifrar o intrigante mecanismo de transcrição e replicação de arterivírus e coronavírus.

Os clones infecciosos derivados de PRRSV podem ser, igualmente, utilizados como um sistema de distribuição ou vírus de vacina de vector para antigénios estranhos inseridos no genoma de PRRSV, porque o vírus infecta macrófagos e células da 33 linhagem de macrófagos na medula óssea e outras células do sistema imunitário e distribui o vírus contendo o antigénio através das suas células de descendência. No caso específico de antigénios contendo fragmentos da 0RF7 ou da proteína N de Arterivírus ou PRRSV, estes antigénios serão (sobre)expressos no lado exterior da membrana celular da célula infectada melhorando, assim, adicionalmente a resposta imune. Tais efeitos de reforço imunológico causarão uma imunidade duradoura (em virtude da estimulação contínua a um nível baixo) contra patogénios. Pode utilizar-se o vírus como um transportador antigénico integrando a informação para epítopos de outros organismos ou substâncias patogénicas. Vários vírus PRRS modificados transportando informação epitópica estranha podem ser misturados e administrados de uma só vez. 0 que possibilita imunidade activa contra vários epítopos diferentes de um patogénio, ou imunidade activa contra vários patogénios diferentes. A segurança das vacinas de PRRSV modificado (tal como não contagiosa) pode ser assegurada pela deleção da informação das proteínas virais que são necessárias para produzir o vírus infeccioso com envelope. Este vírus deve ser propagado numa linha celular que expresse constitutivamente essa proteína de envelope. A replicação do vírus nesta linha celular complementar possui um envelope completo e é capaz de infectar macrófagos no suíno. Após um ciclo de replicação, o vírus da descendência, não tendo a informação para a proteína do envelope, já não é capaz de infectar outras células como um vírus com envelope completo. A infecção de macrófagos no corpo é ainda possível enquanto cápside livre. Desta forma, a vacina ficará contida no animal que tenha sido vacinado e não se propagará a outros animais. 34

Legendas das figuras.

Figura 1. Construção de um clone de ADNc de comprimento genómico de LV. A parte superior (A) mostra a fusão de clones de ADNc, que foram anteriormente sequenciados (Meulenberg et al., 1993a) em pGEM-4Z. Estão indicados os números de pABV dos clones e os sítios de restrição que foram utilizados. As caixas a negro representam as partes de clones de ADNc que estão fundidas na etapa de clonagem seguinte. As caixas a cinzento-claro, indicadas por R. T., são clones de ADNc produzidos de novo por RT-PCR, uma caixa a cinzento-escuro representa um novo clone de ADNc produzido por PCR. A parte inferior (B) mostra a montagem dos clones maiores de ADNc pABV331/369, pABV384 e pABV368 com o clone da extremidade 5' pABV396, contendo um promotor da T7 ARN polimerase e o clone da extremidade 3' pABV395, contendo uma cauda poli(A), no vector de baixo número de cópias pOK12. Estão indicados os sítios de restrição no interior e exterior do sítio de clonagem múltipla de pOKl2. Os sítios de endonuclease de restrição são; A, Apal; Ap, Apol; B, BamRI; Bg, BglII; Bs, BspEl; Bc, Bell; E, EcoRI; Ec, EcoRV; H, BindlII; K, Kpnl; N, Narl; Nc, Ncol; S, SacII; Sp, Spel; Sa, Sall; Sc, Seal; P, PstI; Pm, Pmll; X, Xbal; Xh, Xhol.

Figura 2. Sequências terminais de ADNc de LV clonado de comprimento completo e ARN infeccioso transcrito a partir deste clone de ADNc. Os clones de ADNc de comprimento genómico foram linearizados com PvuI e foram transcritos na presença do análogo sintético de cap m7G (5' ) ppp (5' ) G com T7 ARN polimerase. 0 ARN resultante deve conter um nucleotídeo extra (G) na extremidade 5' e dois nucleotídeos extra (GC) na extremidade 3' . As setas no ARN correspondem aos nucleotídeos terminais 5' e 3' correspondentes à sequência autêntica de ARN de LV. 35

Figura 3. Curvas de crescimento do vírus de tipo selvagem de LV TH, LV4.2.1, e dos vírus recombinantes vABV414 e vABV416 em macrófagos alveolares porcinos (A) e células CL2621 (B) . Os vírus recombinantes vABV414 e vABV416 produzidos em células BHK-21 foram utilizados directamente (BHK), ou foram utilizados após multiplicação em macrófagos alveolares Porcinos (PAM). 0 vírus TH foi preparado em macrófagos alveolares porcinos (PAM) , enquanto o LV4.2.1 foi preparado em células CL2621 (CL). As culturas celulares foram infectadas pelos vírus indicados, a uma MOI de 0,05 e recolhidas nos intervalos de tempo indicados. Os títulos de vírus (TCID50/mL) foram determinados em macrófagos alveolares Porcinos ou células CL2621 por diluição final.

Figura 4. Introdução de um sítio PacI e Swal único no clone de ADNc infeccioso de LV. Os sítios PacI e SwaI foram criados por intermédio de mutagénese dirigida por PCR, como descrito pormenorizadamente em Materiais e Métodos. Os fragmentos de ADNc contendo o sítio PacI e Sival foram trocados em pABV414 utilizando os seus sítios Hpal e Xbal únicos, que estão indicados. O que resultou em pABV437 e pABV442, respectivamente. 36

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Tabela 1. Sequência nucleotídica dos clones de extremidade 5' de LV. Sequência 1) N.° de clones ATGATGTGTAGGG..... 22 TGATGTGTAGGG..... 1 GATGTGTAGGG..... 2 ATGTGTAGGG..... 1 1) Os nucleotídeos sublinhados representam sequências adicionais, que não se verificaram em clones de ADNc, isolados e sequenciados anteriormente (Meulenberg et al., 1993a).

Lisboa, 23 de Julho de 2007 43

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de um clone infeccioso baseado no genoma de um vírus de ARN de cadeia positiva da família de Arteriviridae, o referido método compreendendo a produção de um ácido nucleico recombinante compreendendo, pelo menos, uma cópia de ADN de comprimento completo ou cópia de ARN transcrito in vitro do referido vírus de ARN de cadeia positiva, compreendendo ainda a selecção de clones infecciosos pela transfecção de uma célula hospedeira com o referido ácido nucleico recombinante, por meio do qual a referida célula hospedeira não é susceptivel à infecção pelo referido vírus.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual a referida célula hospedeira é uma célula BHK-21.
3. 3. Ácido nucleico recombinante compreendendo um clone infeccioso, em que o clone infeccioso é um clone de ADNc obtenível por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.
4. 4. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 3, em que o referido vírus é o PRRSV.
5. 5. Molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um ácido nucleico de acordo com as reivindicações 3 ou 4, em que foi modificada uma sequência de ácidos nucleicos codificando um marcador de virulência e/ou um marcador serológico. 1
6. 6. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência de ácidos nucleicos codificando o referido marcador se localiza dentro de qualquer uma das fases de leitura aberta codificando proteínas virais estruturais.
7. 7. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 6, em que uma fase de leitura aberta é a 0RF7 de qualquer de Arteriviridae.
8. 8. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com as reivindicações 6 ou 7, em que uma fase de leitura aberta é substituída por uma 0RF7 de Arteriviridae.
9. 9. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 8, em que é inserida, pelo menos, uma sequência heteróloga adicional de ácidos nucleicos.
10. 10. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 9, em que a referida sequência heteróloga de ácidos nucleicos codifica um antigénio.
11. 11. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 10, em que uma fase de leitura aberta foi modificada.
12. 12. Vírus de ARN modificado, derivado de um ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 11. 2
13. 13. Vacina compreendendo um vírus de ARN modificado de acordo com a reivindicação 12.
14. 14. Célula infectada por um vírus de ARN modificado de acordo com a reivindicação 13. Lisboa, 23 de Julho de 2007 3