JP4875274B2 - キメラアルテリウィルス様粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、アルテリウィルスおよびこれらのウィルスによって引起こされる感染に対するワクチンの分野に関する。
【0002】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(porcine reproductive and respiratory syndrome virus;略称:PRRSV)は、ウマ動脈炎ウィルス(equine
arteritis virus;略称:EAV)、乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス(lactate dehydogenase-elavating virus;略称:LDV)およびサル出血熱ウィルス(simian hemorrhagic fever virus;略称:SHFV,14)とともにアルテリウィルスのファミリーに属するプラス鎖RNAウィルスである。PRRSVは妊娠している雌ブタにおいて生殖不全を引起こし、ブタにおいて呼吸系の問題を引起こす(20)。そのことは、全世界でブタの個体群における大きな経済的損失を引起こす。LDVまたはSHFVでの感染は研究室における実験動物の感染として非常に重要である。
【0003】
これらのアルテリウィルス感染に対するワクチン接種は、扱いにくいことが多い。一般に死滅させたワクチンは多くの目的に充分効果的なものではなく、生きている弱毒化したアルテリウィルスワクチンは有用であるけれども、いくつかは安全ではなく、未だに感染することが示されている。さらに、これらのワクチンは野生型ウィルスと区別することができない。
【0004】
アルテリウィルスゲノムの一例として、PRRSVゲノムは、長さが15.1kbであり、RNA依存性RNAポリメラーゼ(ORF1aおよびORF1b)をコードする遺伝子および構造タンパク質(ORF2〜ORF7(14)、(11))をコードする遺伝子を含む。他のアルテリウィルスゲノムは、多少小さいけれども、同じゲノム構成を共有し、そのゲノム構成では全てが構造タンパク質をコードするサブゲノムメッセンジャーRNAを合成する。
【0005】
ORF2、3および4は、それぞれGP2、GP3およびGP4を意味する糖タンパク質をコードする。ORF5は、GP5を意味する主要なエンベロープ糖タンパク質をコードし、ORF6は、膜タンパク質Mをコードし、ORF7は、ヌクレオカプシドタンパク質Nをコードする。付加的な構造タンパク質(GP2b)は、小さなOFR、ORF2bによってコードされる。欧州および北アメリカのPRRSV単離物のゲノム配列分析およびモノクローナル抗体との反応性は、これらの大陸からの単離物は遺伝学的に識別され、比較的昔に共通の祖先から分岐したに違いないことを示している(15)。
【0006】
本発明は、少なくとも、第1アルテリウィルス由来の第1構造タンパク質と、第2構造タンパク質であって、少なくとも一部は前記第1アルテリウィルス由来ではない第2構造タンパク質とを含むアルテリウィルス様粒子を提供する。より好ましい実施の形態では、本発明は、少なくとも2つの異なるアルテリウィルスから生ずる部分で構成されるキメラアルテリウィルスを提供する。前記部分は、前記異なるアルテリウィルスから生ずる遺伝子(またはその一部)によってコードされ、それは好ましくはお互いに少なくとも部分的に交換され、置換される。((de Vries et al.Virol.270:84-97で発表されたように)置換は、第2構造タンパク質のほんの少しの添加も含まないことに注目する。この論文では、非アルテリウィルスタンパク質断片をコードする核酸の伸長部分はアルテリウィルスの完全ゲノムにおいて挿入され、それによってここで提供されるような一部の交換をすることなく前記ゲノムを伸ばす。)本発明のさらに好ましい実施の形態では、提供されるような前記キメラアルテリウィルスは、構成しているアルテリウィルスの明確な特性を示す。
【0007】
第1アルテリウィルス由来ではない前記第2部分は、たとえば完全に、しかし好ましくは部分的にのみ人工のまたは合成配列を含むことが可能である。この配列はここで示す前記第1構造タンパク質と機能的に二量体化させる軸部における明確な長さのアミノ酸の伸長部分をコードし、それによってヘテロ二量体化させる。ヘテロダイマーは、二つの異なる相互作用性ペプチド鎖の構成物である。その相互作用はたとえばファンデルワールス力または共有ジスルフィド結合の両方から成りうるけれども、これに限定されるものではない。好ましくは二つの糖タンパク質または1つの糖タンパク質とマトリックスまたは膜タンパク質との前記ヘテロ二量体化は、結果として生じるキメラウィルス粒子の構造的な完全性を強め、それによってその粒子における免疫学的に重要なドメインをより好ましく存在させ、より好ましいワクチン成分を作製する。
【0008】
ヘテロ二量体化に関連する前記部分が構造タンパク質であるはずだ(非構造タンパク質は粒子の一部ではない)ということを除いて、このように前記第1アルテリウィルス由来ではない部分は、少なくともたとえば機能的に二量体化させるような、前記第2アルテリウィルスとの適度な相同性を有することが好ましい。ヘテロ二量体化のさらなる適切な条件は、一般的に核タンパク質(N)は含まれるべきではないことである。EP0839912に示されるように核タンパク質の粒子は、その現象に貢献しない。しかしながら、組換えウィルスが(第1アルテリウィルスの(ウィルス性ポリメラーゼのようなオープンリーディングフレーム1a、1bをコードする遺伝子由来の)非構造タンパク質と、第2アルテリウィルスの(オープンリーディングフレーム2〜7をコードする遺伝子由来の)構造タンパク質との組合せからなることが記載されるWO98/55626に示されるように、ここで提供されるようなそのような粒子は、たとえばアルテリウィルスの感染性cDNAクローンに基づくことが可能である(13、EP0839912)。感染性クローンは、位置指定突然変異誘発に対する優れた道具であり、アルテリウィルスに対する新しい生ワクチンを構築することを目的とするプロジェクトにとって重要である。ここで我々は、たとえばゲノムの突然変異誘発によっていわゆるマーカーワクチンを提供し、そのため、たとえばPRRSVの場合はワクチン接種された(すなわちここで提供されるワクチンでワクチン接種された)ブタは、血清中抗体における違いに基づいて野生ウィルスに感染したブタと見分けるまたは区別することができ、逆もまた血清中抗体における違いに基づいて見分けるまたは区別することができる。そのような区別は、前記第2構造タンパク質が少なくとも部分的に前記第1アルテリウィルス由来でない場合に特にうまく成すことができ、前記人工の、合成または異種構造の部分に対する抗体はこのように検出することができ、または二者択一的にワクチン接種された動物が、相同の現在欠損している構造タンパク質またはその一部に対する抗体の欠如による診断テストにおいて検出可能である。ヌクレオカプシド(N)に対する抗体はしばしば過剰であるので前記第2構造タンパク質はヌクレオカプシド(N)タンパク質であるということが好ましく、このことは特に自然の感染において感染した動物以外で未ワクチン接種の動物からワクチン接種された動物を区別することを可能にする。特に本発明は、前記第2構造タンパク質は少なくとも部分的に第2アルテリウィルス由来であり、または少なくとも前記第2アルテリウィルスとある相同性(たとえば>50%)を有する粒子を提供する。またここで提供される粒子は、相互アルテリウィルスまたは相互アルテリウィルス様キメラ粒子と呼ばれ、たとえば非アルテリウィルス病原体またはその抗原をコードするアルテリウィルス由来ではない核酸における伸長部分を当然含むことができる。特にそのような粒子は、たとえば2つのシステインの間でジスルフィド結合によって結合されて、前記第1および第2構造タンパク質がヘテロダイマーを構成することにおいて有用である。本発明によれば、前記第1および第2構造タンパク質が完全な膜タンパク質(M)またはその部分を構成する粒子が最も好ましい。
【0009】
Mタンパク質(18kDa)は、非グリコシル化タンパク質であり、アルテリウィルスの最も保存された構造タンパク質である。PRRSVに対して、そのトポロジーおよび膜関連性機能は最初にMeulenbergらによって提案されている(14)。タンパク質のN末端半分は3つの潜在性膜間領域を有することが提案され、N末端はエクトドメイン部分を含み、C末端はエンドドメイン部分を含む。16アミノ酸の伸長部分はビリオン表面で暴露される。LDVに対して、Mタンパク質はクラスIII膜タンパク質として同定されてきた(5)。Mタンパク質はウィルス集合および出芽において重要な役割を果たすことが仮定されている。ERにおいては、それはORF5によってコードされる主要な糖タンパク質GR5(25〜42kDa)とジスルフィド結合性ヘテロダイマーを形成する(3、4、10)。さらに、ジスルフィド結合性Mタンパク質ヘテロダイマーが形成される。しかしながらそれらは一般的にビリオンへ組込まれないと考えられる。
【0010】
他の実施の形態では、本発明は、GP2、GP2b、GP3、GP4または好ましくはGP5のような糖タンパク質(GP)またはその一部を構成する前記第1または第2構造タンパク質を含む粒子を提供する。GP5は、アルテリウィルスの主要な糖タンパク質であり、クラスI糖タンパク質であることが仮定されている(5)。それはシグナルペプチドを含み、プロセッシング後、タンパク質は、短いN末端エクトドメイン、3回膜貫通型セグメントおよびC末端エンドドメインからなる。さらにエクトドメインは、N−グリコシル化部位を含む(12)。最近、LDVの主要な中和エピトープは、ORF5糖タンパク質の推定されるエクトドメイン(30aa)に位置づけられている(8)。またEAVに対しては、LDVよりも多少大きいGP5のエクトドメインが中和エピトープを含む。
【0011】
Mタンパク質の短いN末端エクトドメインにおけるシステイン残基は、ORF5によってコードされる糖タンパク質のエクトドメインにおけるシステイン残基との分子間ジスルフィド結合の形成に関与し、それによってヘテロダイマーが提供されるので、本発明は、前記第1構造タンパク質がGP5またはその一部を構成し、前記第2構造タンパク質が膜タンパク質(M)またはその一部を構成する未変性に近いキメラ粒子を提供する。好ましくは、本発明は、PRRSに対するワクチンの産生のためのPRRSV様粒子を提供する。このように本発明は、前記第1アルテリウィルスがブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)を含む粒子を提供する。詳細な説明において、本発明に従えば、前記第2アルテリウィルスが乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス(LDV)を含む粒子が提供されるが、ヘテロダイマーがたとえばジスルフィド結合形成によって安定することができる限りは、GP5、またはその一部、好ましくは前述の同定されたエクトドメインがLDV由来であり、M、またはその一部、好ましくは前述の同定されたエクトドメインがPRRSV由来であるという点においては変更可能である。もちろん、他のアルテリウィルスは、ここで説明したように第1および/または第2アルテリウィルスとして使用することができる。それによって前記第2アルテリウィルスは、前記第1アルテリウィルスの同じ属であり得るが前記第1アルテリウィルスの他の菌株または抗原型であり得る。PRRSVに対して、Mタンパク質とGP5タンパク質との間のジスルフィド結合が形成されることが示されている(10)。LDVに対しては、ジスルフィド結合を阻止するために5〜10mMDTT処理後ビリオンがその感染性を失う(4)。EAVに対しては、同じ結果が得られた(3)。
【0012】
また本発明は、少なくとも、第1アルテリウィルス由来の第1構造タンパクと第2構造タンパクとをコードする核酸において、第2構造タンパクは少なくとも一部は第1アルテリウィルス由来ではなく、第1および第2構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子内に組み込むことができることを特徴とする核酸を提供する。前記第1および第2構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子において結合される。本発明によれば、ここで提供されるようなそのような核酸またはその転写物は、BHK−21細胞またはマクロファージのような宿主細胞おける粒子の産生を可能にする。また、本発明に従う核酸が付与された本発明に従う粒子も提供される。キメラ粒子でのマクロファージ感染が示されているたとえば表2および3を参照。
【0013】
本発明は、発明に従った、かかる粒子、核酸、宿主細胞を含むワクチンを提供する。ワクチン開発のために、本発明は、ウィルスを弱毒化する方法を提供し、その完成型の1つはウィルスの感染性を減少させる。特に、少なくとも部分的には前記第1アルテリウィルス由来でない構造タンパク質とともに第1アルテリウィルスを含む弱毒化したアルテリウィルス(ワクチン)を得る方法を提供する。好ましくは、必要ではないけれども、前述したように他の構造タンパク質とともにヘテロダイマーを構成する前記構造タンパク質が少なくとも部分的には第2アルテリウィルス由来である方法である。前記構造タンパク質の1つが膜タンパク質(M)またはその一部分を含む場合、そのような二量体化は特に有用である。少なくともそのような場合は、前記構造タンパク質の他の1つがGP5またはその一部分のような糖タンパク質を含む。
【0014】
このことは、Mタンパク質とGP5タンパク質との間の相互作用の安定性を減少させることによって成される。特に、感染性のウィルスはこのシステインを欠損した変異体から産生されないので、アルテリウィルスのMタンパク質のエクトドメインの(PRRSVにおいてポジション8での、図1参照)第1システイン残基はウィルスのライフサイクルにとって必須であるということを我々は決定づけた。この残基は、Mタンパク質とGP5タンパク質とのジスルフィド結合にとって必須であり、これらの2つの構造タンパク質は、たとえば受容体とのウィルスの相互作用による適切なウィルス集合またはウィルスのエントリーのいずれかにとって必須である。そのため、Mタンパク質のエクトドメインのポジション8(またはPRRSVに対してここで示されたポジションに関して類似のポジション)のシステイン残基は、完全な感染性を維持するために必須であることを我々は示した。この目的のために、我々はPRRSVの感染性cDNAクローンを用いることによって、セリン残基によってシステイン残基を置換し、第2に我々はこの残基を消去した(13)。これらのいわゆる突然変異体完全長cDNA構成物のRNA転写物は、BHK−21細胞へのトランスフェクションの後、ウィルスタンパク質を発現する能力および感染性ウィルスを産生する能力を試験された。さらに、Mタンパク質のエクトドメインのいくつかの他の突然変異体は、関連するアルテリウィルスであるLDVのエクトドメインによるLVのエクトドメインの交換を含んでLVの感染性cDNAクローンにおいて導入される(図1)。たとえば表2および3から見ることができるように、野生型または親の粒子は、抗体との反応性の明確なパターンを比較することによってキメラ粒子を区別することができる。同様に野生のウィルスで感染した動物は、反応性のそのような明確なパターンを利用する診断試験で区別することができるそのようなキメラ粒子でワクチン接種された動物と区別することができる。そのような診断テストのための適当な抗原は、ワクチンにおいて存在しないまたは部分的にのみ存在する野生型ウィルスの抗原部分であろう。詳細な説明において記載されるワクチンに対して、Mのエクトドメインの16〜18アミノ酸伸長部分またはその抗原部分をMabs126.3または126.4のような類似の特異性を有する抗体と組合せて利用することができる。このように本発明は、たとえば、常套的な選別およびコントロール手段を適用して、野生型アルテリウィルスで感染させた動物とワクチン接種された動物を区別する抗体の存在、不存在に関する本発明に従うワクチンを接種された動物の検体(たとえば血液検体)を試験することを含む、動物の集団におけるアルテリウィルス感染のコントロールまたは根絶のための方法を提供する。
【0015】
さらに本発明を詳細な説明において説明するが、これは発明を限定するものではない。
【0016】
(詳細な説明)
(材料および方法)
(細胞およびウィルス)
BHK−21細胞は、5%FBS、10%トリプトースフォスフェートブロス(Gibco BRL)、20mMHepes pH7.4(Gibco BRL)、200mMグルタミン、10U/mlペニシリンおよび10μg/mlストレプトマイシンで満たされた(BHK−21培地(Gibco BRL)で生育させた。ブタ肺胞マクロファージ(PAMs)は、10%FBS、100μg/mlカナマイシン、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを含むMCA−RPMI−1640培地で維持された。ウィルス群は、PAMsに関しトランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清において分泌された組換えLVウィルスの連続的な継代によって産生される。(mlあたり50%の組織培養感染価[TCID50]として表現される)ウィルス力価は、終末点希釈度を用いてPAMsに関して決定された(19)。
【0017】
(PRRSVのMタンパク質のエクトドメインにおける突然変異の構築)
PCR突然変異誘発は、LV(pABL437)のゲノム長cDNAクローンのPacI突然変異体におけるMタンパク質のエクトドメインのアミノ酸を突然変異させるために用いられる(13)。プライマーは、表1に列挙する。PCR断片は、StuIおよびHpalで消化され、PRRSVの構造タンパク質をコードする領域を含むpABV651、pABV437のサブクローンのこれらの部位と連結される。一般的なクローニング方法は、本質的に(17)に記載されるように行われる。形質転換の条件は、Sambrookらによって記載されたように利用される(17)。配列分析は、挿入突然変異を確認するために行われた。正しい挿入を含むクローンは、AatIIおよびHpaIで消化され、pABV437の適切な部位に連結された。第1に、Mタンパク質のエクトドメインにおけるポジション8のシステイン残基は、プライマーLV217およびLV93を用いたPCR突然変異誘発によってセリン残基で置換された。結果としてpABV702のサブクローンおよびpABV705の完全長cDNAクローンが生じた。さらに、このシステイン残基は、プライマーLV227およびLV93を用いたPCR指定突然変異誘発によってMのエクトドメインから消去された。これにより、pABV703のサブクローンおよびpABV706の完全長cDNAクローンが生じた。第2にMタンパク質の完全なエクトドメイン(アミノ酸1〜16)は、プライマーLV218およびLV93を用いてLDVのエクトドメインによって置換された。設計されたクローンは、pABV704(サブクローン)およびpABV707(完全長cDNAクローン)と名付けた。第3に、フォワードのプライマーとしてLV219からLV226,リバースのプライマーとしてLV93を用いてORF6のエクトドメインにおけるいくつかの他のアミノ酸の置換および消去が生じ、結果としてpABV732からpABV736までのサブクローンおよびpABV737からpABV743までの完全長cDNAクローンが得られた。
【0018】
(配列分析)
PCR産物から生じるサブクローンの領域は、ヌクレオチド配列によって分析される。配列は、PRISMレディダイデオキシターミネーターサイクル配列決定キット(PRISM Ready Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit)およびABI PRISM310遺伝子分析機(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer)(Perkin Elmer)で決定された。
【0019】
(BHK−21細胞のインビトロでの転写およびトランスフェクション)
構築された完全長ゲノムcDNAクローンおよびその派生物は、PvuIで線状にされ、T7RNAポリメラーゼによってインビトロで転写された(9)。BHK−21細胞は、前述したようなエレクトロポレーションによって生じるRNAでトランスフェクトされた(13)。培地はトランスフェクション後24時間で回収され、BHK−21細胞はPBSで洗浄し乾燥させてIPMAが行われるまで−20℃で貯蔵された。
【0020】
(PAMsの感染)
感染性ウィルスを援助するために、BHK−21細胞の培養液上清がトランスフェクション後24時間回収され、PAMsを接種するため用いられた。一時間後接種物は取除かれ、新しい培養培地が加えられた。感染後およそ24時間で培養液上清は回収され、PAMsはPBSで洗浄、乾燥されて、イムノペルオキシダーゼ単層分析が行われるまで−20℃で保存した。
【0021】
(イムノペルオキシダーゼ単層分析(immuno peroxidase monolayer assay;略称:IPMA))
一過性の発現および感染性ウィルスをそれぞれ決定するため、BHK−21細胞およびPAMsの免疫染色がWensvoortらによって記載された方法(19)によって行われた。Mタンパク質の未知の抗原部位に対するモノクローナル抗体(monoclonal antibodies;略称:MAbs)(126.3、126.4、122.9、126.12、126.6(18))のパネルは、Mタンパク質発現の研究およびそこでの抗原部位の存在の研究に用いられた。(GP3、GP4およびNタンパク質それぞれに対する)MAbs122.14、122.1および122.17(18)は、他のPRRSVタンパク質発現の検出に用いられた。
【0022】
(組換えRNA転写物の非感染性ウィルス産生の分析)
トランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清から、完全長cDNA組換え体が非感染性ウィルスまたはウィルス様粒子へ納められるか否かを決定するためにウィルスのRNAが単離された。500μlのプロテイナーゼKバッファー(100mM Tris−HCl(pH7.2)、25mM EDTA、300mM NaCl、2%(wt/vol)ドデシル硫酸ナトリウム)および0.2mgプロテイナーゼKが500μlの上清に加えられた。37℃で30分放置後、RNAがフェノール−クロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿させた。RNAは、プライマーLV76で逆転写された。それから突然変異が導入された領域から成る断片を増幅させるためプライマーLV35およびLV7を用いてPCRが行われた。配列分析は、cDNAクローンに導入された突然変異がまた単離されたウィルスRNAにおいても存在するか否かを決定するため行われた。
【0023】
(放射性免疫沈降(radio immuno precipitation;略称:RIP))
GP5およびMタンパク質の発現は、トランスフェクトされたBHK−21細胞の代謝性標識によって分析され、続いて、本質的にはMeulenbergらが記載したように(Meulenberg、1996#10)GP5またはMタンパク質それぞれに対してペプチド血清またはMAbsを用いて免疫沈降させる。さらに、両タンパク質の共沈降は非減少条件下で細胞を溶解させることによって研究された。検体は、14%変性アクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis;略称:SDS−PAGE)によって分析された。
【0024】
(結果)
GP5のエクトドメインとPRRSVのMタンパク質とのジスルフィド結合がウィルス感染に必須であるか否かを試験するために、我々はMタンパク質のポジション8のアミノ酸残基(10)をセリン残基によって置換した。さらに、このシステイン残基は、Mタンパク質のエクトドメインから欠失された。続いてシステイン置換および欠失突然変異は、PRRSVのレリスタッドウィルス単離物の感染性クローンpABV437において導入され、結果としてプラスミドpABV705(C−>S)およびpABV706(C−>欠失)を生じた。これらの完全長cDNAクローンのRNA転写物は、BHK−21細胞にトランスフェクトされ、ウィルスタンパク質の発現が試験された。両方の場合において、細胞はGP3、GP4およびN特異性MAbsでIPMAにおいて陽性に染色された(表2)。さらに、Mタンパク質に対するMAbs126.12は、陽性染色を生じた。Mタンパク質に対する2つの他のMAbs126.3、126.4は、pABV705由来の転写物でトランスフェクトされたBHK−21細胞を染色した。しかしpABV706由来の転写物でトランスフェクトされた細胞は染色しなかった(表2)。このことは、MAbsがMタンパク質のエクトドメインに対してのものであり、または少なくとも前記ドメインを含む18アミノ酸のいくつかを含む単数または複数のペプチド断片に対してのものであることを示した。トランスフェクトされた細胞の上清は、感染性ウィルスを援助するためPAMsへの感染に使用された。しかしながら、感染後24時間でPAMSに関していずれのMAbsも染色されずPAMsを検出することができなかった(表3)。さらに、細胞病原性効果(cytopathogenic effect;略称:cpe)は誘導されなかった。結論として、置換または欠失のいずれかによってMタンパク質のポジション8でシステイン残基を欠損しているPRRSVの完全長cDNA転写物は、BHK−21細胞においてウィルスタンパク質を複製し発現することができる。しかし感染性ウィルスを産生することはできない。
【0025】
第2に、Mタンパク質のエクトドメインは、LDVのエクトドメインによって交換され、結果として完全長cDNAクローンpABV707を生じる。このPRRS組換え体由来の転写物でトランスフェクトさせたBHK−21細胞は、GP3、GP4およびNタンパク質に対するMAbsで染色され、Mタンパク質に対するMAbs126.12で染色されることが可能であったけれども、MAbs126.3および126.4では染色されなかった(表2)。このことはこれらのMAbsがMタンパク質のエクトドメインと反応したという前述の結果を確認した。感染性キメラウィルスの産生を試験するため、PAMsはトランスフェクトされたBHK−21細胞の上清で感染させた。PAMsはMAbs126.3および126.4以外の全てで染色された(表3)。結論として、Mタンパク質のエクトドメインは、LDVのエクトドメインによって置換することができ、ブタ肺胞マクロファージに未だ感染するキメラウィルスの産生が起こる。コロナウィルスに関する研究は、Mタンパク質の全てのドメインがコロナウィルス集合にとって重要であることを提案する(1)。ウィルスの外側にさらされるMタンパク質のアミノ末端ドメインは、ウィルス集合において役割を果たす。さらに、ウィルスエンベロープの内側に位置するカルボキシ末端ドメインは、ヌクレオカプシドと相互作用することによってウィルス集合にとって重要である。このドメインはまた、ウィルスのエンベロープの集合にとって非常に重要である。しかしながらそれらは、Mタンパク質のアミノ末端ドメインがMタンパク質とSタンパク質との間の相互作用に関連しないということを示した(2)。このことは、タンパク質間の結合は、膜レベルで起こり、またはおそらくMタンパク質のカルボキシ末端ドメインの一部を含む。他のコロナウィルス、TGEVに対しては、Mタンパク質のカルボキシ末端に対するMAbsはウィルス感染性を中和することが記載されており(16)、Mタンパク質のC末端ドメインは、ウィルス粒子の外側にさらされる。このMタンパク質のトポロジーは、さらされたアミノ末端およびビリオン内でのカルボキシ末端ドメインからなるコロナウィルスのMタンパク質に関して一般に記載される構造とおそらく共存している。我々の最近の研究において、我々はMタンパク質のエクトドメインにおいて他のアミノ酸を突然変異させている。我々は明確な欠失と突然変異は、Mタンパク質とGP5とのジスルフィド結合を弱めることになることを示す。これらの構成物は、一般に構造タンパク質の通常の複製および発現を示し、野生型に匹敵する免疫反応を引起こす。しかしながら、より少ないウィルス粒子が産生されるであろう。また、それはウィルス粒子の産生を生じる。このことは、マクロファージの感染において損なわれる。両方の場合において、ウィルスを生じ、これはたとえばPRRSVに対するブタの防御のための安全なワクチンとなると考えられる。また我々の結果は、システイン残基の欠失のようないくつかのアミノ酸の欠失と同様LDVエクトドメインでの置換は2つのMAbsの結合の損失を生じるので、Mタンパク質のエクトドメインにおける突然変異はマーカーワクチンの産生を生じることができるということを示した。そしてエピトープにおけるウィルスの突然変異により、マーカーワクチンの産生が起こる。この研究において、我々はLDVのMタンパク質のエクトドメインを含むPRRSV転写物が、感染性キメラウィルスを産生し、(マーカー)ワクチンとして有用であるということを示した。
【0026】
(材料および方法)
第1にGP5におけるポジション50、111および117のシステイン残基はセリン残基によって置換された。アミノ酸50の置換のために、PCR突然変異誘発が第1断片に対してプライマーLV32およびLV303で行われ、第2断片に対してプライマーLV302およびLV182で行われた。アミノ酸111の置換のために、PCR突然変異誘発は第1断片に対してプライマーLV32およびLV311で行われ、第2断片に対してプライマーLV310およびLV182で行われた。アミノ酸117の置換のために、PCR突然変異誘発は第1断片に対してプライマーLV32およびLV313で行われ、第2断片に対してプライマーLV312およびLV182で行なわれた。断片は融解させ、大抵の5’および3’プライマーで増幅された。結果として生じる断片は、pABV651においてBstXIおよびNheIを用いてクローン化され、生じたクローンからAatII−HpaI断片がpABV437の適切な部位へクローン化された。これにより、それぞれシステイン残基50、111および117それぞれに対してpABV858、861および859を生じた。
【0027】
第2にアミノ酸9から16までの領域はMタンパク質のエクトドメインから欠失された。PCRはプライマーLV32およびLV306を用いて行われた。断片はBstXI−NheIで消化され、pABV651のこれらの部位にクローン化された。このクローンからAatII−HpaI断片はpABV437の対応する部位へクローン化され、pABV855を生じた。
【0028】
第3に、LVのMタンパク質のエクトドメインをコードする領域は、他のアルテリウィルスのエクトドメインによって置換された。VR2332の導入のために、2つの連続したPCRがプライマーLV32およびPRRSV57、プライマーLV32およびPRRSV58で行われた。BstXIおよびNheIでのpABV651へのPCR断片のクローニング、およびこの結果生じるクローンからAatIIおよびHpaIでのpABV437へのクローニングは完全長クローンpABV857を生じた。EAVのMのエクトドメイン導入のために、我々はプライマーLV32およびPRRSV59、プライマーLV32およびPRRSV60で連続したPCRを行った。結果として生じる断片は、BstXIおよびNheIでpABV651にクローン化され、結果として生じたクローンからAatIIおよびHpaIでpABV437へクローン化されて、結果としてpABV856を生じた。
【0029】
第4に、LVのORF5および6間の部分的重複は、プライマーLV32およびLV358でPCRを行うことによって取除かれた。生じたPCR断片はpABV651のBstXIおよびStuI部位へクローン化された。生じたクローンから、AatII−HpaI断片がpABV437へ導入され、pABV871を生じた。このクローンにおいて、他のアルテリウィルスのエクトドメインが導入された。VR2332のMタンパク質のエクトドメイン導入のために、1つはLV32およびLV357を用いて1つはLV356および118U250を用いて2つのPCR断片が生成された。PCR断片は融解され、プライマーLV32および118U250で増幅された。両方のPCR断片はBstXIおよびHpaIで消化され、pABV651のこれらの部位に連結された。生じたクローンは、AatIIおよびHpaIで消化され、断片はpABV437のこれらの部位へ連結された。このことはVR2332のMタンパク質エクトドメインに対してクローンpABV872を生じ、EAVのMタンパク質のエクトドメインに対してpABV873を生じた。
プライマーは表4に列挙する。
【0030】
(結果)
(Mタンパク質のエクトドメインにおける欠失を含む完全長cDNAクローン)
pABV738(aa15および16欠失)、pABV739(aa15欠失)、pABV740(aa15Q〜E)、pABV741(aa9欠失)およびpABV742(aa5欠失)のRNA転写物は、BHK−21細胞にトランスフェクトさせ、IPMAでトランスフェクション後24時間構造タンパク質の発現を試験した。全ての突然変異体に対して、GP3、GP4およびNの発現が検出された。Mタンパク質に対する2つのMAbs(126.3および126.4)は、細胞を陽性に染色したMタンパク質に対する他のMab(126.12)とは反対にトランスフェクトされた細胞を染色しなかった。トランスフェクトされた細胞の培養液上清はPAMsを感染させるために用いられた。感染後の24時間染色は、全ての突然変異体に対してNタンパク質の発現を示した。このことは、全ての突然変異体が生存能力のあるウィルスを産生することを示す。
【0031】
さらに、Mタンパク質のアミノ酸9〜16までのコード領域が欠失された突然変異体が構築され、pABV855を生じた。そのRNA転写物のBHK−21細胞へのトランスフェクションは、LVの全ての構造タンパク質の発現を示した。しかしながら、MAbs126.3および126.4は、トランスフェクトされた細胞を染色しなかった。トランスフェクトされた細胞の培養液上清とともにPAMsを接種後、構造タンパク質の発現は検出されなかった。結論として、生存能力のあるウィルスは産生されなかった。
【0032】
(GP5タンパク質におけるシステイン残基の突然変異体)
GP5のシステイン残基50、111および117は、セリン残基へ換えられ、完全長cDNAクローンpABV858、pABV861、およびpABV859をそれぞれ生じた。BHK−21細胞におけるRNA転写物のトランスフェクションは、トランスフェクション後24時間IPMAにおいて検出されたように、全ての突然変異体に対して構造タンパク質の発現を示した。PAMsはトランスフェクトされた細胞の培養液上清とともに接種され、感染後24時間でIPMAにおいて染色された。pABV858のRNA転写物でトランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清で接種され、陽性染色が観察されなかったPAMsとは反対に、PAMsがpABV861および859のRNA転写物でトランスフェクトしたBHK−21細胞の培養液上清で接種された場合、細胞が陽性に染色された。結論として、GP5のポジション50におけるシステイン残基は、生存能力のあるウィルスの産生にとって必須であり、残基111および117は必須ではない。
【0033】
(他のアルテリウィルスのMタンパク質エクトドメインの導入)
LDVのMタンパク質のエクトドメインの導入は、生存能力のあるウィルスを産生するので、我々は現在VR2332のMタンパク質エクトドメインおよびEAVのMタンパク質エクトドメインをLVの感染性cDNAクローンに挿入し、それぞれpABV857およびpABV856を生じた(図2A)。しかしながら、GP5およびM、ORF5および6のコード配列はそれぞれ一部重複しているので、これらの配列の導入はGP5のC末端における突然変異を導入した。それらのRNA転写物のトランスフェクションは、両突然変異体が構造タンパク質発現を示した。しかしながら、トランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清感染させたPAMsの染色は陰性であった。結論として、生存能力のあるウィルスはこれらのキメラアルテリウィルスから産生されない。
【0034】
(ORF5および6間の重複部分の除去およびキメラ配列の導入)
VR2332およびEAVのエクトドメイン導入はまた、GP5のC末端をコードする領域において突然変異を導入するので、我々はLVの感染性cDNAクローンからORF5および6間の重複を除去した。この方法において、我々はORF5のコード配列を妨げることなくアルテリウィルス配列が導入可能であるORF6における領域を作製したかった。第1に、ORF5および6間の重複は感染性cDNAクローンにおいて除去され、pABV871を生じた(図2B)。そのRNA転写物のBHK−21細胞へのトランスフェクションは、構造タンパク質が発現されたことを示し、複製及び転写の両方が妨げられないことを示した。トランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清でのPAMs感染は、構造タンパク質の発現がIPMAによって検出され、cpeが観察されたので、感染性ウィルスが産生されたことを示した。第2にVR2332のMタンパク質エクトドメインおよびEAVのMタンパク質エクトドメインはこの構築物に導入され、pABV872およびpABV873を生じた(図2B)。これらのRNA転写物は、BHK−21細胞へトランスフェクトさせた。126.3および126.4以外の全てのMAbsは、トランスフェクトされた細胞を陽性に染色した。トランスフェクトされたBHK−21細胞の培養液上清で感染させたPAMsは、IPMAにおいて全ての構造タンパク質の発現を示した。これらの結果は、GP5のC末端が完全なままである他のアルテリウィルスのMタンパク質のエクトドメインが、LVのMタンパク質のエクトドメインのC末端によって機能的に交換することが可能であったことを示す。
【0035】
(キメラアルテリウィルスの遺伝的安定性)
pABV707、738、741、742、871、872およびpABV873から生成されたウィルスがインビトロで安定して維持されたか否かを研究するため、それらはPAMsにおいて連続的に継代させた。ウィルスRNAは、5回継代後の培養液上清から単離され、遺伝子分析によって研究された。ウィルスのRNAは逆転写され、導入された欠失の横に位置する領域がPCRによって増幅された。断片の配列分析により各突然変異体に対して導入された突然変異がまた存在し、付加的な突然変異はインビトロでの継代の間フランキング領域に導入されないことを示した。これらの結果は、欠失がPAMsにおけるインビトロ継代の間安定して維持されることを示した。
【0036】
成長特性は、増殖曲線においてvABV707、vABV741およびvABV742に対して決定し、野生型のvABV437のものと比較した。PAMsは、0.05の感染の多重性で継代5回目において感染させ、培養培地は様々な時間間隔で回収された。ウィルス力価は、マクロファージの終点希釈度によって決定された。全ての場合において、成長割合は類似しているけれども、生存能力のあるウィルスの量はその最も高い力価に達した後急速に傾いたことを我々は観察した。この結果は、産生されたウィルスがワクチンの目的に対してさらに有用な性質があり得る熱不安定性があることを示し得る。
【0037】
【表1】
a制限酵素部位は下線で、外来配列は斜体である。
【0038】
【表2】
【0039】
【表3】
【0040】
【表4】
【0041】
(接種例)
(明記されたPRRSV突然変異体での8週齢のブタへの接種後の野生型PRRSV(EU型およびUS型)の鼻腔内接種。ウィルス動態および抗体反応)
(導入)
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)は、妊娠9ヶ月の雌ブタにおいて流産および貧弱な同腹子の特性を引起こす。さらに、それは若いブタにおいて呼吸系疾患を引起こし得る。妊娠後期の雌ブタ(80〜95日)のPRRSVによる感染は、根深い生殖不全を引起こす。特に誕生時および誕生から1週間でのこれらの雌ブタの子孫の高いレベルの死亡数のためである。PRRSVは遍在する病原体である。2つの明確な抗原型が分類される。すなわち欧州型とアメリカ型である。PRRSV感染後の臨床的影響は、含まれる菌株の型に依存する。PRRSワクチンでのブタへの接種は、PRRSVチャレンジが動物および農場レベルで解決するという方法に影響を与える。ウィルス血症のレベルと持続時間および野生型ウィルスの広がりはこのワクチンの投与によって減少する。
【0042】
第2世代のPRRSワクチン開発のために、新しい候補が試験されるべきである。そのため8週齢のブタがPRRSVチャレンジを与えた後多くの明記されたPRRSV突然変異体(組換えウィルス)を接種された。このウィルス暴露の動態は、同種および異種構成の両方においてウィルス血症および追加免疫反応のレベルと持続時間とに関して評価される。
【0043】
(研究目的)
定義されたPRRSV突然変異体の免疫学的効力および安全性の決定は、接種(同種および異種)チャレンジモデルにおいてワクチンとして使用された。このことに加えて、突然変異体の免疫原性が試験された。
【0044】
(実験計画)
以下の基準を全て満たす4つのPRRSV突然変異体が試験された。基準はインビトロで5回継代(細胞培養物)後の遺伝的安定性、動物に3週間暴露後の遺伝的安定性、(IDEXX−elisaによって決定される)免疫原性である。
【0045】
以下の突然変異体が試験された。vABV707すなわちLDV−PRRSキメラウィルス(Mエクトドメインの交換)、vABV741すなわちPRRSVのMタンパク質のaa9欠失、vABV746すなわちORF7のC末端部分での18ヌクレオチド欠失、vABV688すなわちORF2のポジション88〜95での突然変異である。
【0046】
ポジティブコントロールとして、以下のウィルスを用いた。vABV437すなわちレリスタッド(Lelystad)ウィルスの野生型組換え体である。
【0047】
それぞれの突然変異体は、8週齢の5匹のSPFブタでそれぞれ構成される2群において試験された。すべての群はお互い一切接触することなく完全に隔離された。2匹の未感作の標識となるブタ(各突然変異群につき1匹)は接種後24時間これらの接種されたブタと一緒にされ、それから28日後取出して殺した。
【0048】
それぞれ5つの接種物からなる(突然変異体あたり)2群において、2匹の動物が接種後28日目に、野生型ウィルス(すなわちPRRSVの欧州種の代表としてレリスタッドウィルス(LV−tH))でチャレンジされ、アメリカ型の代表としてSDSU#73(PRRSVの(アメリカ)種)でチャレンジされた。
【0049】
他の3つの接種を受けた動物は、24時間これらのチャレンジされた動物から放され、それから再び合わせられた。チャレンジから28日後、全てのブタが除去され、解剖された。
【0050】
vABV437は、ポジティブコントロールとして与えられた。チャレンジコントロールはLV−tHおよびSDSU#73でチャレンジ効力を制御するためチャレンジの時点から開始して14日間一緒にされ、動物はチャレンジ段階の間他の動物に関して記載されたように扱われた。
ブタの割当は表1に概説する。
【0051】
【表1】
【0052】
ワクチンは、SOP(肩と右耳の間の首の中間点において深く筋肉内に2ml。分毎の力価105TCID50/ml)に従って筋肉内に投与された。全ての接種物は、使用の前後で滴定され、全ての時間溶けかけている氷の上で保存された。
【0053】
(実験動物)
8週齢の70匹のSPFブタをPRRSVフリーで試験した。
【0054】
(研究の実行(表2))
【表2】
【0055】
(結果)
各群において突然変異体ウィルスまたは野生型ウィルスの暴露後、有害な反応は起こらなかった。表3および4は、血清から単離されたPRRSの結果および計算されたウィルス血症を示す。定義された試料採取時点でのウィルス血症の発症率は、慣例の出版された技術を用いてブタ肺胞マクロファージおいて単離されたウィルスによって決定された。
【0056】
1対10の血清検体希釈度におけるウィルス陽性は(+)で表され、(++)は1対100の血清検体希釈度におけるウィルス陽性を意味する。これらの結果は、(各時点での各ウィルス陽性動物=1点、最高値100%(=12/12)を得ることができる各群におけるウィルス暴露動物の百分率(1型)、暴露動物の最高ウィルス血症百分率(2型)として群全体の「ウィルス血症評価」を計算するために用いられた。後者の場合において、最大値100%(=24/24)は、最高ウィルス血症が個々の動物に対して2点(検体の1対100希釈)として評価されるという事実に基づいて得ることができる。全ての突然変異体ウィルス群は、vABV437と比較して1型および2型ウィルス血症評価の減少を示した。vABV707接種ブタは、全ての他の群におけるブタの評価と比較してチャレンジ前の1型および2型ウィルス血症評価の減少を示した。チャレンジのとき、ウィルス血症であった動物はいなかった。全ての標識がウィルス血症になり、セロコンバーションが起こった。これはウィルスが暴露されたブタから標識へと拡散したことを意味する。ブタに対する突然変異ウィルスの第1暴露は、チャレンジコントロールと比較して、同種の野生型チャレンジ後のウィルス血症のほぼ完全な阻止および異種のチャレンジ後のウィルス血症の安定した減少によって決定されるように、効果的な免疫学的反応を起こさせる。接種された標識は効果的に防御された。
【0057】
研究された各グループの間に接種およびチャレンジ後血清学的反応において違いは記録されなかった。
【0058】
全てのチャレンジコントロールは、14日目の研究進行の間にウィルス血症を示す。このときウィルス血症は鼻腔内暴露されたブタにおいて最も優勢である。
【0059】
【表3】
【0060】
【表4】
【0061】
(結論)
研究された組換え突然変異体PRRSウィルスは、野生型(vABV437)と比較して、ウィルス血症(長さおよび高さ)の減少によって決定されるように減少したウィルス血症を示す。全ての突然変異体が野生型PRRSVに対してブタを防御するために効果的な免疫反応を起こす。同種の防御が、異種のものよりもいくらか効果的であるようだ。
【0062】
体液性反応は、すべての場合において市販のELISA(IDEXX)によって測定される。有害な反応は導出されない。
【0063】
【0064】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 EAV、LDV−P、PRRSV−TerHuurne、PRRSV−VR2332およびSHFVのMタンパク質のアミノ酸配列の比較。
【図2】 GP5−Mタンパク質の構成。
【図3】 LV欠失突然変異体の増殖曲線。
Claims (14)
- 少なくとも、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)由来の第1構造タンパク質と、前記PRRSVの第2構造タンパク質とを含むアルテリウィルス様粒子であって、
前記第2構造タンパク質は、膜タンパク質(M)または糖タンパク質(GP)であり、
前記膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインは、異なるアルテリウィルス由来の膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインによって交換または置換されたことを特徴とするアルテリウィルス様粒子。 - 前記第1および第2構造タンパク質は、
ヘテロダイマーを含むことを特徴とする請求項1に記載のアルテリウィルス様粒子。 - 前記糖タンパク質は、
GP5を含むことを特徴とする請求項1または2のいずれか1項に記載のアルテリウィルス様粒子。 - 前記第1構造タンパク質は、
GP5またはその一部を含み、
前記第2構造タンパク質は、
膜タンパク質(M)またはその一部を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のアルテリウィルス様粒子。 - 前記第2アルテリウィルスは、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス(LDV)を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のアルテリウィルス様粒子。 - 少なくとも、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)由来の第1構造タンパク質と前記PRRSVの第2構造タンパク質とをコードする核酸であって、
前記第2構造タンパク質は、膜タンパク質(M)または糖タンパク質(GP)であり、
前記膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインは、異なるアルテリウィルスの膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインによって交換または置換され、
前記第1および第2構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子内に組み込むことができることを特徴とする核酸。 - 請求項6に記載の核酸を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載のアルテリウィルス様粒子。
- 請求項6に記載の核酸を含む請求項1〜5または7のいずれか1項に記載の粒子を含む宿主細胞。
- 請求項6に記載の核酸を含む請求項1〜5もしくは7のいずれか1項に記載の粒子、または請求項8に記載の宿主細胞を含むワクチン。
- ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)に、膜タンパク質(M)または糖タンパク質(GP)である構造タンパク質を付与することを含む弱毒化されたアルテリウィルスを得る方法であって、
前記膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインが、異なるアルテリウィルスの、膜タンパク質または糖タンパク質の少なくともエクトドメインによって交換または置換されたことを特徴とする弱毒化されたアルテリウィルスを得る方法。 - 前記構造タンパク質は、
他の構造タンパク質とのヘテロダイマーを含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。 - 前記糖タンパク質は、
GP5を含むことを特徴とする請求項10または11に記載の方法。 - 前記構造タンパク質の1つは、
GP5またはその一部を含み、
他の構造タンパク質は、
膜タンパク質(M)またはその一部を含むことを特徴とする請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記異なるアルテリウィルスは、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス(LDV)を含むことを特徴とする請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
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