ES2322237T3

ES2322237T3 - Particulas quimericas de tipo arterivirus.

Info

Publication number: ES2322237T3
Application number: ES01932411T
Authority: ES
Inventors: Monique Helene Verheije; Johanna Jacoba Maria Meulenberg
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-21
Publication date: 2009-06-18
Anticipated expiration: 2021-05-21
Also published as: DE60138014D1; KR100916883B1; EP1156111A1; US20030161845A1; DK1283887T3; CY1109141T1; JP2004506411A; MXPA02011415A; WO2001090363A1; AU2001258938A1; CA2409209C; CA2409209A1; KR20030026931A; PT1283887E; EP1283887A1; EP1283887B1; ATE426026T1; US7122347B2; JP4875274B2

Abstract

Una partícula de tipo Arterivirus que comprende al menos una primera proteína estructural de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y una segunda proteína estructural de dicho PRRSV en la que dicha segunda proteína estructural es una proteína de membrana (M) o una glucoproteína (GP), y en la que al menos el ectodominio de dicha proteína de membrana o glucoproteína se ha intercambiado o sustituido por al menos el ectodominio de una proteína de membrana o glucoproteína de un Arterivirus diferente.

Description

Partículas quiméricas de tipo Arterivirus.

La invención está relacionada con el campo de los Arterivirus y las vacunas dirigidas contra las infecciones causadas por estos virus.

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es un virus de RNA de cadena positiva que pertenece a la familia de los Arterivirus junto con el virus de la arteritis equina (EAV), el virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV) y el virus de la fiebre hemorrágica de los simios (SHFV.14). El PRRSV causa un fallo reproductivo en las cerdas embarazadas y problemas respiratorios en las crías de cerdo (20). Este causa pérdidas económicas enormes en las poblaciones porcinas a nivel mundial. El EAV causa fallo reproductivo y abortos en las yeguas y da lugar a sementales infectados de forma persistente. Las infecciones con LDV o SHFV son principalmente de importancia como infecciones de los animales experimentales de laboratorio.

La vacunación frente a estas infecciones por Arterivirus es a menudo dificultosa. Las vacunas inactivas en general no son lo suficientemente efectivas para la mayoría de propósitos y aunque están disponibles vacunas vivas atenuadas de Arterivirus, se ha demostrado que algunas de ellas no son seguras y además se expanden. Además, estas vacunas no pueden distinguirse de los virus salvajes naturales.

El genoma del PRRSV, como ejemplo de genoma de Arterivirus, tiene una longitud de 15,1 kb y contiene genes que codifican la polimerasa de RNA dependiente de RNA (ORF1a y ORF1b) y genes que codifican proteínas estructurales (ORF 2 a 7; (14), (11)). Otros genomas de Arterivirus son algo menores, pero comparten la misma estructura de genoma, en el que todos sintetizan RNA mensajero subgenómico que codifica las proteínas estructurales.

Los ORF 2, 3 y 4 codifican las glucoproteínas denominadas GP2, GP3 y GP4, respectivamente. El ORF5 codifica la glucoproteína principal de la cubierta, denominada GP5, el ORF6 codifica la proteína de membrana M, y el ORF7 codifica la proteína de la nucleocápside N. Un pequeño OFR, el ORF2b codifica una proteína estructural adicional (GP2b). El análisis de la secuencia del genoma del PRRSV aislado en Europa y Norteamérica, y su reactividad con anticuerpos monoclonales indica que los aislamientos de estos continentes son genéticamente distintos y deben haberse diferenciado de un ancestro común hace relativamente bastante tiempo (15).

La invención proporciona una partícula de tipo Arterivirus que comprende al menos una primera proteína estructural derivada de un primer Arterivirus y una segunda proteína estructural en la que dicha segunda proteína estructural es al menos parcialmente no derivada de dicho primer Arterivirus. En una realización preferible, la invención proporciona un Arterivirus quimérico que está compuesto de partes que se originan de al menos dos Arterivirus diferentes. Dichas partes están codificadas por genes (o partes de los mismos) que se originan de dichos Arterivirus diferentes, y que preferiblemente están al menos parcialmente intercambiados o sustituidos el uno por el otro. (Nótese que esta sustitución no es una mera adición de una segunda proteína estructural (como se describe en de Vries et al Virol. 270:84-97) en la que un segmento de ácido nucleico que codifica un fragmento de una proteína no arterivírica se inserta en el genoma completo de un Arterivirus, extendiendo así dicho genoma sin un intercambio de partes como se proporciona aquí. En una realización preferible de la invención, dicho Arterivirus quimérico, como se proporciona aquí, muestra características diferenciales de los Arterivirus que lo componen.

Dicha segunda parte que no se deriva del primer Arterivirus puede comprender, por ejemplo, una secuencia completa pero preferiblemente sólo parcialmente artificial o sintética, que codifica en marco de lectura un segmento de aminoácidos de diferentes longitudes que permiten la dimerización funcional con dicha primera proteína estructural como se muestra aquí, permitiendo así la heterodimerización. Un heterodímero es una composición de dos cadenas peptídicas diferentes que interactúan. La interacción por ejemplo puede consistir tanto en fuerzas de Van der Waals como en puentes disulfuro covalentes, pero no se limitan a estos. Se ha descrito que dicha heterodimerización, preferiblemente de dos glucoproteínas, o de una glucoproteína y una proteína de matriz o membrana, aumenta la integridad estructural de la partícula vírica quimérica resultante, permitiendo así una mejor presentación de los dominios importantes inmunológicamente en la partícula y haciendo de ella un mejor constituyente para una vacuna.

Además, dicha parte que está involucrada en la heterodimerización debe ser una proteína estructural (las proteínas no estructurales no forman parte de la partícula), por lo tanto es preferible que dicha parte que no se ha derivado de un primer Arterivirus, al menos tenga cierta homología con dicho segundo Arterivirus, por ejemplo para permitir la dimerización funcional. Otra condición relevante para la heterodimerización es que en general la nucleoproteína (N) no debe estar involucrada, la nucleoproteína de las partículas como se proporciona en la PE 0 839 912 no contribuye al fenómeno. Sin embargo, la partícula proporcionada aquí puede basarse, por ejemplo, en un clon de cDNA infeccioso de Arterivirus (13; PE 0 839 912), como también se describe en la WO 98/55626, en la que se describe un virus recombinante que comprende una combinación de proteínas no estructurales (de los genes que codifican los marcos abiertos de lectura 1a y 1b, como la polimerasa viral) de un primer Arterivirus con las proteínas estructurales (de los genes que codifican los marcos abiertos de lectura des 2 a 7) de un segundo Arterivirus. Un clon infeccioso es una herramienta excelente para la mutagénesis dirigida y es importante para los proyectos cuyo objetivo es obtener nuevas vacunas vivas frente a los Arterivirus. Aquí, por ejemplo, se proporciona la denominada vacuna marcador mediante mutagénesis del genoma, de forma que, en el caso del PRRSV, por ejemplo, los cerdos vacunados (es decir, vacunados con una vacuna como la que aquí se proporciona) pueden distinguirse o discriminarse de los cerdos infectados con un virus natural en base a las diferencias en los anticuerpos séricos, y viceversa, en base a las diferencias en los anticuerpos séricos. Tal discriminación en particular puede realizarse bien cuando dicha segunda proteína estructural es al menos parcialmente no derivada de dicho primer Arterivirus, y los anticuerpos dirigidos frente a dicha parte artificial, sintética o heteróloga pueden detectarse, o alternativamente, los animales vacunados son detectables en análisis diagnósticos por la ausencia de anticuerpos dirigidos frente a la proteína estructural o parte de la misma homóloga, ahora ausente. Es preferible que dicha segunda proteína estructural es la proteína de la nucleocápside (N) ya que los anticuerpos dirigidos frente a N a menudo son muy abundantes, especialmente en las infecciones naturales, y permiten la discriminación de animales vacunados de los no vacunados pero infectados. En particular, la invención proporciona una partícula en la que dicha segunda proteína estructural es al menos parcialmente derivada de un segundo Arterivirus, o al menos tiene cierta homología (por ejemplo superior al 50%) con dicho segundo Arterivirus. Una partícula como la que se proporciona aquí también se denomina una partícula inter-Arterivirus o partícula quimérica de tipo virus, y por supuesto también puede comprender segmentos de ácido nucleico que no son derivados de Arterivirus, por ejemplo, que codifiquen patógenos diferentes de Arterivirus o antígenos de los mismos. Es particularmente útil una partícula en la que dicha primera y segunda proteína estructural comprenden un heterodímero, por ejemplo ligado por un puente disulfuro entre dos cisteínas. La partícula más preferible de acuerdo con la invención es la que dicha primera o segunda proteína estructural comprende una proteína integral de membrana (M) o parte de la misma.

La proteína M (18 kDa) no está glucosilada y es la proteína estructural más conservada de los Arterivirus. En el PRRSV, su topología y función asociada a membrana la sugirió en primer lugar Meulenberg et al (14). La mitad N-terminal de la proteína sugiere que ésta posee tres regiones potenciales de inserción en membrana, el extremo N-terminal comprende la parte de ectodominio, el extremo C-terminal comprende la parte de endodominio. Un segmento de 16 aminoácidos está expuesto en superficie de la partícula vírica. En el LDV, la proteína M se has identificado como una proteína de membrana de clase III (5). La proteína M se asume que juega un papel importante en el ensamblaje del virus y la gemación. En el ER, forma heterodímeros ligados por un puente disulfuro (3, 4, 10) con la glucoproteína principal GP5 (25-42 kDa), codificada por el ORF5. Además, también pueden formarse homodímeros de proteína M ligados por un puente disulfuro, sin embargo, en general se cree que estos no se incorporan a las partículas víricas (3).

En otra realización, la invención proporciona una partícula en la que dicha primera o segunda proteína estructural comprende una glucoproteína (GP) o parte de la misma, como GP2, GP2b, GP3, GP4 o preferiblemente GP5. La GP5 es la principal glucoproteína de los Arterivirus y se ha sugerido que es una glucoproteína de clase I (5). Contiene un péptido señal y tras el procesado de la proteína consiste en un ectodominio corto N-terminal, un segmento que cruza la membrana tres veces, y un endodominio C-terminal. Además, el ectodominio contiene puntos de N-glucosilación (12). Recientemente, el principal epítopo de neutralización del LDV se mapó en el presunto ectodominio (30 aa) de la glucoproteína del ORF5 (8). En el EAV, el ectodominio de la GP5, que es algo mayor que el del LDV, también contiene un epítopo de neutralización.

Como el residuo de cisteína en el pequeño ectodominio N-terminal de la proteína M está naturalmente involucrado en la formación de un puente disulfuro intermolecular con un residuo de cisteína del ectodominio de la glucoproteína codificada por el ORF5, proporcionando así un heterodímero, la invención proporciona una partícula quimérica parecida a la nativa, en la que dicha primera proteína estructural comprende GP5 o parte de la misma y dicha segunda proteína estructural comprende una proteína de membrana (M) o parte de la misma. Preferiblemente, la invención proporciona una partícula tipo PRRSV para la generación de vacunas frente al PRRS, y así la invención proporciona una partícula en la que dicho primer Arterivirus comprende un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). En la descripción detallada se proporciona una partícula de acuerdo con la invención en la que dicho segundo Arterivirus comprende el virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV), sin embargo, también puede intercambiarse, y que la GP5, o parte de la misma, preferiblemente el ectodominio anteriormente identificado, sea derivado del LDV y la proteína M, o parte de la misma, preferiblemente el ectodominio anteriormente identificado, sea derivado del PRRSV, siempre que pueda establecerse un heterodímero mediante la formación de un puente disulfuro por ejemplo. Por supuesto, otros Arterivirus pueden utilizarse como primer y/o segundo Arterivirus como se explica aquí, y dicho segundo Arterivirus puede ser del mismo género pero de otra cepa o serotipo de dicho primer Arterivirus. Para el PRRSV, también se ha descrito que se forma un puente disulfuro entre la proteína M y la proteína GP5 (10). Este residuo de cisteína de la proteína M está altamente conservado entre todos los Arterivirus. Para el LDV, se ha descrito que los viriones, tras un tratamiento con DTT 5-10 mM para eliminar los puentes disulfuro, pierden su infectividad (4). Para el EAV, se han observado os mismos resultados (3).

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica al menos una primera proteína estructural derivada de un primer Arterivirus y una segunda proteína estructural en la que dicha segunda proteína estructural, al menos parcialmente, no es derivada de dicho primer Arterivirus, y en el que dicha primera y segunda proteína estructural permiten la incorporación en una partícula de tipo Arterivirus. Tal ácido nucleico o los transcritos del mismo como se proporcionan aquí permiten la producción en una célula huésped, como una célula BHK-21 o un macrófago, de una partícula de acuerdo con la invención. También se proporcionan aquí partículas de acuerdo con la invención, junto con un ácido nucleico de acuerdo con la invención, véanse por ejemplo las tablas 2 y 3 en las que se muestra la infección de macrófagos con las partículas quiméricas que se proporcionan aquí.

La invención también proporciona una vacuna que comprende tal partícula, ácido nucleico o célula huésped de acuerdo con la invención. Con el propósito de desarrollar una vacuna, la invención proporciona un método para la atenuación del virus y uno de los logros es la infectividad viral reducida. En particular, se proporciona un método para obtener un Arterivirus atenuado (una vacuna) que comprende un primer Arterivirus con una proteína estructural que, al menos parcialmente, no es derivada de dicho primer Arterivirus, y preferiblemente aunque no necesariamente, como se muestra aquí anteriormente, un método en el que dicha proteína estructural es al menos parcialmente derivada de un segundo Arterivirus, y en el que dicha proteína estructural comprende un heterodímero con otra proteína estructural. Cuando una de tales proteínas estructurales comprende una proteína de membrana (M) o parte de la misma, tal dimerización es particularmente útil, al menos en aquellos casos en los que otra de tales proteínas estructurales comprende una glucoproteína, como GP5 o parte de la misma.

Esto se consigue reduciendo la estabilidad de la interacción entre la proteína M y la proteína GP5, reduciendo así la infectividad. En particular, se ha determinado que el primer residuo de cisteína (en el PRRSV en la posición 8, véase la Figura 1) del ectodominio de la proteína M de los Arterivirus es esencial para el ciclo de vida del virus, ya que no se producen virus infecciosos a partir de mutantes sin esta cisteína. Este residuo es esencial para el puente disulfuro entre la proteína M y la GP5, y la heterodimerización entre estas dos proteínas estructurales es esencial para el adecuado ensamblaje del virus o para la entrada del virus, por ejemplo mediante la interacción del virus con un receptor. Por lo tanto, se demuestra que el residuo de cisteína en la posición 8 (o una posición similar en relación a la posición que aquí se muestra para el PRRSV) del ectodominio de la proteína M es esencial para mantener la infectividad completa. Para este propósito, se sustituyó este residuo de cisteína por un residuo de serina y en segundo lugar, se eliminó este residuo, en ambos casos utilizando el clon de cDNA infeccioso del PRRSV (13). Los transcritos de RNA de estas denominadas construcciones de cDNA completo mutantes se analizaron para comprobar su capacidad de expresar las proteínas virales tras la transfección en células BHK-21, y su capacidad de generar virus infeccioso. Además, se introdujeron varias mutaciones distintas del ectodominio de la proteína M en el clon de cDNA infeccioso del LV, incluyendo el intercambio del ectodominio del LV por el del LDV, un Arterivirus relacionado (Fig. 1) Como puede observarse en las tablas 2 y 3, por ejemplo, las partículas salvajes o parentales pueden diferenciarse de las partículas quiméricas comparando su diferente patrón de reactividad con los anticuerpos; asimismo los animales infectados con el virus natural pueden diferenciarse de los animales vacunados con tales partículas quiméricas con análisis diagnósticos que utilizan tales patrones distintos de reactividad. Un antígeno adecuado para tal análisis diagnóstico puede ser una parte antigénica del virus salvaje que no está presente, o lo está sólo parcialmente, en la vacuna. Por ejemplo, en las vacunas descritas en la descripción detallada, puede utilizarse un segmento de 16-18 aminoácidos, o partes antigénicas del mismo, del ectodominio de M, en combinación con anticuerpos con una especificidad similar a los anticuerpos monoclonales (Mab) 126.3 o 126.4. La invención, por lo tanto, también proporciona un método para controlar o erradicar una infección por Arterivirus en una población de animales que comprende el análisis de muestras (por ejemplo, muestras de sangre) de los animales vacunados con una vacuna de acuerdo con la invención para determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos que diferencian tales animales de los animales infectados con un Arterivirus salvaje, por ejemplo aplicando medidas rutinarias de recogida y control.

La invención se expone más extensamente en la presente descripción detallada sin limitar la invención.

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Leyenda

Figura 1. Comparativa de las secuencias aminoacídicas de las proteínas M de los Arterivirus EAV, LDV-P, PRRSV-Ter Huurne, PRRSV-VR2332 y SHFV.

Figura 2. Construcciones de la proteína GP5-M.

Figura 3 Curvas de crecimiento de los mutantes con deleción.

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Descripción detallada Materiales y métodos Células y virus

Las células BHK-21 se cultivaron en medio BHK-21 (Gibco BRL), suplementado con SFB al 5%, caldo de triptosa fosfato al 10% (Gibco BRL), Hepes 20 mM pH 7,4 (Gibco BRL) y glutamina 200 mM, penicilina 10 U/ml y estreptomicina 10 mg/ml. Los macrófagos alveolares de pulmón porcino (MAP) se mantuvieron en medio MCA-RPMI-1640, que contenía SFB al 10%, kanamicina 100 mg/ml, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml. Las reservas de virus se obtuvieron mediante una siembra seriada de virus LV recombinante secretado en el sobrenadante de cultivo de células BHK-21 transfectadas en MAP. Los virus se recogieron cuando las MAP mostraban efectos citopáticos (ecp), normalmente tras 48 horas de la infección. Los títulos víricos (expresados como el 50% de la dosis infectiva en un cultivo de tejido [DICT_{50}] por ml) se determinaron en los MAP utilizando una dilución a punto final (19).

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Construcción de mutaciones en el ectodominio de la proteína M del PRRSV

Se utilizó la mutagénesis por PCR para mutar los aminoácidos del ectodominio de la proteína M en el mutante PacI del clon de cDNA del genoma completo del LV (pABV437) (13). Los cebadores utilizados se listan en la Tabla 1. Los fragmentos de PCR se digirieron con StuI y HpaI y se ligaron en estas dianas del pABV651, un subclón del pABV437 que contiene la región que codifica las proteínas estructurales del PRRSV. Se realizaron procedimientos estándar de clonaje esencialmente como los descritos (17). Las condiciones de transformación utilizadas son las descritas por Sambrook et al. (17). Se realizó un análisis de secuencia para confirmar las mutaciones insertadas. Los clones que contienen los insertos correctas se digirieron con AatII y HpaI y se ligaron en las dianas apropiadas del
pABV437.

En primer lugar, el residuo de cisteína en la posición 8 del ectodominio de la proteína M se sustituyó por un residuo de serina mediante mutagénesis por PCR con los cebadores LV217 y LV93, lo que resultó en el subclón pABV702 y el clon completo pABV705. Además, este residuo de cisteína se eliminó del ectodominio de M mediante mutagénesis dirigida por PCR con los cebadores LV227 y LV93. Esto resultó en el subclón pABV703 y el clon de cDNA completo pABV706. En segundo lugar, el ectodominio completo de la proteína M (aminoácidos de 1 a 16) se reemplazó por el ectodominio del LDV utilizando los cebadores LV218 y LV93. Los clones mencionados se denominaron pABV704 (subclón) y pABV707 (clon de cDNA completo). En tercer lugar, se crearon varias sustituciones y deleciones de otros aminoácidos en el ectodominio del ORF6, utilizando del LV219 al LV226 como cebadores directos y LV93 como cebador reverso, lo que resultó en los subclones pABV732 a pABV736 y los clones de cDNA completo pABV737 a pAB743.

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Análisis de secuencia

Las regiones de los subclones originadas a partir de productos de PCR se analizaron mediante secuenciación de los nucleótidos. Las secuencias se determinaron con el equipo de secuenciación cíclica PRISM Ready Dye Deoxy Terminator y el ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer).

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Transcripción in vitro y transfección de células BHK21

Los clones de cDNA genómico completo obtenidos y los derivados de los mismos se linearizaron con PvuI y se transcribieron in vitro utilizando la polimerasa de RNA T7 (9). Las células BHK-21 se transfectaron con el RNA resultante mediante electroporación como está descrito (13). El medio se recogió 24 h después de la transfección, y las células BHK-21 se lavaron con PBS, se secaron y almacenaron a -20ºC hasta que se realizó el EIPM.

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Infección de los MAP

Para rescatar el virus infeccioso, el sobrenadante de cultivo de las células BHK-21 se recogió 24 h después de la transfección y se utilizó para inocular MAP. Tras 1 hora se eliminó el inóculo y se añadió medio de cultivo fresco. Aproximadamente 24 horas tras la infección el sobrenadante de cultivo se recogió y los MAP se lavaron con PBS, se secaron y almacenaron a -20ºC hasta que se realizó el ensayo inmunoperoxidasa en monocapa.

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Ensayo inmunoperoxidasa en monocapa (EIPM)

Se realizó una inmunotinción de las células BHK-21 y los MAP mediante los métodos descritos por Wensvoort et al. (19), para determinar la expresión transitoria y el virus infeccioso, respectivamente. Se utilizó un panel de anticuerpos monoclonales (MAb) (126.3, 126.4, 122.9, 126.12, 126.6 (18)) dirigidos frente a dianas antigénicas conocidas de la proteína M para estudiar la expresión de la proteína M y la presencia de dianas antigénicas en ella. Los MAb 122.14, 122.1 y 122.17 (18) (dirigidos frente a las proteína GP3, GP4 y N respectivamente) se utilizaron para detectar la expresión de otras proteínas del PRRSV.

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Análisis de la producción de virus no infeccioso a partir de los transcritos de RNA recombinante

A partir del sobrenadante de cultivo de las células BHK-21 transfectadas, se aisló RNA viral para determinar si los recombinantes de cDNA completo se empaquetaban en virus o partículas tipo virus, que eran no infecciosas. A 500 \mul de sobrenadante se añadió un volumen de 500 \mul de tampón de proteinasa K (Tris-HCl 100 mM [pH 7,2], EDTA 25 mM, NaCl 300 mM, dodecilsulfato sódico al 2% [p/v]) y 0,2 mg de Proteinasa K. Tras una incubación de 30 minutos a 37ºC, el RNA se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol. Se realizó la transcripción reversa del RNA con el cebador LV76. Luego, se realizó una PCR con los cebadores LV35 y LV7 para amplificar los fragmentos que comprenden la región en la que se han introducido las mutaciones. El análisis de secuencia se realizó para determinar si las mutaciones introducidas en el clon de cDNA también estaban presentes en el RNA viral
aislado.

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Radioinmunoprecipitación (RIP)

La expresión de las proteínas GP5 y M se analizó mediante marcaje metabólico de las células transfectadas BHK-21, seguido por una inmunoprecipitación utilizando los sueros peptídicos o MAb dirigidos frente a las proteínas GP5 o M, respectivamente, esencialmente como se describe en Meulenberg et al. [Meulenberg, 1996 nº10]. Además, la co-precipitación de ambas proteínas se investigó lisando las células bajo condiciones no reductoras. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) utilizando un gel de poliacrilamida al 14% desnaturalizante.

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Resultados

Para analizar si el puente disulfuro entre los ectodominios de la proteína GP5 y de la proteína M del PRRSV es esencial para la infección viral, se sustituyó el residuo aminoacídico 8 de la proteína M (10) por un residuo de serina. Además, este residuo de cisteína se eliminó del ectodominio de la proteína M. Las mutaciones de sustitución y de deleción de la cisteína se introdujeron a continuación en el clon infeccioso pABV437 del aislamiento del virus de Lelystad del PRRSV, lo que resultó en los plásmidos pABV705 (C->S) y pABV706 (C->deleción). Los transcritos de RNA de estos clones de cDNA completo se transfectaron en células BHK-21 y se examinó la expresión de las proteínas virales. En ambos casos, las células mostraron una tinción positiva en el EIPM con los Mab específicos de GP3, GP4 y N (Tabla 2). Además, los Mab 126.12 dirigidos frente a la proteína M también resultaron en una tinción positiva. Otros dos MAb dirigidos frente a la proteína M, 126.3 y 126.4, resultaron en una tinción positiva de las células BHK-21 transfectadas con los transcritos del pABV705, pero no las transfectadas con los transcritos del pABV706 (Tabla 2). Esto indicó que estos MAb estaban dirigidos frente al ectodominio de la proteína M, o al menos dirigidos frente a un fragmento(s) del péptido que comprende alguno de los 18 aminoácidos que comprenden dicho dominio. Los sobrenadantes de las células transfectadas se utilizaron para infectar los MAP y rescatar virus infecciosos. Sin embargo, no pudo detectarse tinción de ninguno de los MAb en los MAP 24 horas tras la transfección (Tabla 3). Además, no pudo inducirse un efecto citopatogénico (ecp). En conclusión, los transcritos de cDNA completo del PRRSV que carecen del residuo de cisteína en la posición 8 de la proteína M, ya sea por sustitución o por deleción, son capaces de replicarse y expresan las proteínas virales en las células BHK-21, pero son incapaces de producir virus infeccioso.

En segundo lugar, el ectodominio de la proteína M se intercambió por el ectodominio del LDV, lo que resultó en el clon de cDNA completo pABV707. Las células BHK-21 transfectadas con los transcritos de este recombinante del PRRS pudieron teñirse con MAb frente a las proteínas GP3, GP4 y N, el MAb 126.12 dirigido frente a la proteína M, pero no con los MAb 126.3 y 126.4 (Tabla 2). Esto confirmó los resultados anteriormente descritos, que estos MAb reaccionan con el ectodominio de la proteína M. Para analizar la producción de virus quimérico infeccioso, los MAP se infectaron con el sobrenadante de las células BHK-21 transfectadas. En el EIPM, los MAP pudieron teñirse con todos los MAb, excepto con los MAb 126.3 y 126.4 (Tabla 3). En conclusión, el ectodominio de la proteína M puede reemplazarse con el ectodominio del LDV, resultando en la producción de un virus quimérico, que sigue infectando los macrófagos alveolares porcinos. Estudios en Coronavirus sugieren que todos los dominios de la proteína M son importantes para el ensamblaje de los Coronavirus (1). El dominio aminoterminal de la proteína M, que está expuesto en el lado externo del virus, tiene un papel en el ensamblaje del virus. Además, el dominio carboxiterminal, localizado en el interior de la cubierta del virus, también es importante para el ensamblaje del virus al interaccionar con la nucleocápside. Este dominio también es crucial para el ensamblaje de la cubierta viral. Sin embargo, se mostró que el dominio aminoterminal de la proteína M no estaba involucrada en la interacción entre la proteína M y la proteína S (2). Esto indica que la asociación entre las proteínas tiene lugar a nivel de la membrana, y posiblemente también involucra parte del dominio carboxiterminal de la proteína M. En otro Coronavirus, el TGEV, se ha descrito que los MAb frente al dominio carboxiterminal de la proteína M neutralizan la infectividad del virus (16), lo que indica que el dominio C-terminal de la proteína M está expuesto en la parte externa de esta partícula vírica. Esta topología de la proteína M probablemente coexiste con la estructura descrita actualmente de la proteína M de los Coronavirus, que consiste en un dominio aminoterminal expuesto y un dominio carboxiterminal intravírico. En un estudio reciente nuestro, se han realizado mutaciones en otros aminoácidos del ectodominio de la proteína M. Hemos demostrado que diferentes deleciones o mutaciones resultan en el debilitamiento del puente disulfuro entre la proteína M y GP5. Estas construcciones muestran en general una replicación normal y expresión de las proteínas estructurales, lo que resulta en una respuesta inmune comparable a la salvaje. Sin embargo, se producen menos partículas víricas. También resulta en la producción de partículas víricas que son incapaces de infectar los macrófagos. En ambos casos, resulta en un virus, que se considera que puede ser una vacuna segura para la protección de los cerdos frente al PRRSV, por ejemplo. Nuestros resultados también muestran que las mutaciones del ectodominio de la proteína M pueden resultar en la generación de una vacuna marcador, ya que el reemplazo con el ectodominio del LDV, así como la deleción de algunos de sus aminoácidos, como la deleción del residuo de cisteína, resulta en la pérdida de unión de dos MAb. Es decir, la mutación del virus en este epítopo resulta en la generación de una vacuna marcador. En este estudio, también se muestra que los transcritos de PRRSV que contienen el ectodominio de la proteína M del LDV, generan un virus quimérico infeccioso, también útil como vacuna
(marcador).

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Materiales y métodos Posterior construcción de mutaciones en el ectodominio de la proteína M del PRRSV

En primer lugar, los residuos de cisteína en la posición 50, 111, y 117 en la GP5 se sustituyeron por residuos de serina. Para la sustitución del aminoácido 50, se realizó una mutagénesis por PCR con los cebadores LV32 y LV303 para el primer fragmento y con los cebadores LV302 y LV182 para el segundo fragmento. Para la sustitución del aminoácido 111, se realizó una mutagénesis por PCR con los cebadores LV32 y LV311 para el primer fragmento y con los cebadores LV310 y LV182 para el segundo fragmento. Para la sustitución del aminoácido 117, se realizó una mutagénesis por PCR con los cebadores LV32 y LV313 para el primer fragmento y con los cebadores LV312 y LV182 para el segundo fragmento. Los fragmentos se fusionaron y se amplificaron utilizando los cebadores más en 5' y en 3'. Los fragmentos resultantes se clonaron utilizando BstXI y NheI en pABV651, y de los clones resultantes, el fragmento AatII-HpaI se clonó en las dianas apropiadas del pABV437. Esto dio lugar al pABV858, 861 y 859 para los residuos de cisteína 50, 111, y 117, respectivamente.

En segundo lugar, la región desde el aminoácido 9 hasta el 16 se delecionaron del ectodominio de la proteína M. Se realizó una PCR utilizando los cebadores LV32 y LV306. El fragmento se digirió con BstXI-NheI y se clonó en estos sitios de pABV651. A partir de este clon, el fragmento AatII-HpaI se clonó en los correspondientes sitios de pABV437, dando lugar a pABV855.

En tercer lugar, la región que codifica el ectodominio de la proteína M del LV se sustituyó por el de otro Arterivirus. Para la introducción del ectodominio VR2332, se realizaron dos PCR secuenciales con los cebadores LV32 y PRRSV57 y con los cebadores LV32 y PRRSV58. EL clonaje del fragmento de PCR con BstXI y NheI en pABV651 y de este clon resultante con AatII y HpaI en pABV437 dio lugar al clon de longitud completa pABV857. Para la introducción del ectodominio de M de EAV, se realizaron PCR secuenciales con los cebadores LV32 y PRRSV59 y con los cebadores LV32 y PRRSV60. El fragmento resultante se clonó con BstXI y NheI en pABV651, y del clon resultante con AatII y HpaI en pABV437, dando lugar al pABV856.

En cuarto lugar, el solapamiento entre los ORF5 y 6 del LV se eliminó al realizar una PCR con los cebadores LV32 y LV358. El fragmento de PCR resultante se clonó en los sitios BstXI y StuI de pABV651. Del clon resultante, el fragmento AatIIHpaI se introdujo en pABV437, dando lugar a pABV871. En este clon, se introdujeron los ectodominios de otro Arterivirus. Para la introducción del ectodominio de la proteína M de VR2332, se generaron dos fragmentos de PCR, uno utilizando LV32 y LV357 y otro utilizando LV356 y 118U250. Para la introducción del ectodominio de la proteína M de EAV, se generaron fragmentos de PCR con los cebadores LV32 y LV361 y con los cebadores LV360 y 118U250. Los fragmentos de PCR se fusionaron y se amplificaron con los cebadores LV32 y 118U250. Ambos fragmentos de PCR se digirieron con BstXI y HpaI, y se ligaron en estos sitios de pABV651. Los clones resultantes se digirieron con AatII y HpaI, y los fragmentos se ligaron en estos sitios de pABV437. Esto dio lugar al clon pABV872 para el ectodominio de la proteína M de VR2332 y a pABV873 para el ectodominio de la proteína M de
EAV.

Los cebadores utilizados se listan en la Tabla 4.

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Resultados Clones de cDNA de longitud completa que contienen deleciones en el ectodominio de la proteína M

Los transcritos de RNA de pABV738 (deleción de los aa 15 y 16), pABV739 (deleción del aa 15), pABV740 (cambio del aa 15Q en E), pABV741 (deleción del aa 9), y pABV742 (deleción del aa 5) se transfectaron en células BHK-21 y se analizó la expresión de las proteínas estructurales 24 horas después de la transfección en EIPM. Para todos los mutantes, se detectó la expresión de GP3, GP4, y N. Dos MAb dirigidos contra la proteína M (126.3 y 126.4) no tiñeron las células transfectadas, al contrario que otro Mab frente a la proteína M (126.12), que tiñó las células positivamente. El sobrenadante del cultivo de las células transfectadas se utilizó para infectar MAP. La tinción a las 24 horas después de la infección mostró la expresión de la proteína N para todos los mutantes. Esto indica que todos los mutantes produjeron virus viables.

Además, se construyó un mutante en que se delecionó la región codificante desde el aminoácido 9 hasta el 16 de la proteína M, dando lugar a pABV855. La transfección de estos transcritos de RNA en células BHK-21 mostró la expresión de todas las proteínas estructurales del LV. Los MAb 126.3 y 126.4, sin embargo, no tiñeron las células transfectadas. Tras la inoculación de los MAP con el sobrenadante de cultivo de las células transfectadas, no se detectó expresión de las proteínas estructurales. En conclusión, no se produjeron virus viables.

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Mutaciones de residuos de cisteína en la proteína GP5

Los residuos de cisteína 50, 111, y 117 de GP5 se cambiaron por residuos de serina, dando lugar a los clones de cDNA de longitud completa pABV858, pABV 861 y en pABV 859, respectivamente. La transfección de los transcritos de RNA en células BHK-21 mostró en todos los mutantes la expresión de las proteínas estructurales, como se detectó en un EIPM 24 horas después de la transfección. Se inocularon los MAP con el sobrenadante del cultivo de las células transfectadas y se tiñeron en un EIPM 24 horas tras la infección. Las células se tiñeron positivamente cuando las MAP se inocularon con sobrenadante del cultivo de células BHK-21 transfectadas con transcritos de RNA del pABV861 y 859, al contrario que las MAP inoculadas con sobrenadante del cultivo de células BHK-21 transfectadas con transcritos de RNA del pABV858, en las que no se observó tinción positiva. En conclusión, el residuo de cisteína en la posición 50 de la GP5 es esencial para la producción de virus viables, y los residuos 111 y 117 no lo son.

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Introducción del ectodominio de la proteína M de otros Arterivirus

Ya que la introducción del ectodominio de la proteína M del LDV resultó en la producción de virus viables, se insertó el ectodominio de la proteína M de VR2332 y el del EAV en el clon de cDNA infectivo de LV, dando lugar a pABV857 y pABV856, respectivamente (Figura 2A). Sin embargo, ambas introducciones de estas secuencias produjeron mutaciones en el extremo C-terminal de la proteína GP5, ya que las secuencias codificantes de GP5 y M, los ORF5 y 6, respectivamente, se solapan. La transfección de sus transcritos de RNA mostró para ambos mutantes la expresión de las proteínas estructurales. Sin embargo, la tinción de los MAP infectados con el sobrenadante del cultivo de células BHK-21 transfectadas fue negativa. En conclusión, no se produjeron virus viables a partir de estos Arterivirus quiméricos.

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Eliminación del solapamiento entre los ORF5 y 6 e introducción de secuencias quiméricas

Ya que la introducción del ectodominio de la proteína M de VR2332 y EAV también introdujo mutaciones en la región que codifica el extremo C-terminal de la GP5, se eliminó el solapamiento entre los ORF5 y 6 del clon de cDNA infectivo del LV. De esta forma, queremos crear una región en el ORF6 en la que las secuencias de Arterivirus puedan introducirse sin interrumpir la secuencia codificante del ORF5. Primero, el solapamiento entre el ORF5 y 6 se eliminó en el clon de cDNA infectivo, dando lugar al pABV871 (Figura 2B). La transfección de sus transcritos de RNA en células BHK-21 reveló que las proteínas estructurales se expresaban, lo que indica que no se ha interrumpido la replicación y la transcripción. La infección de MAP con el sobrenadante del cultivo de las células BHK-21 transfectadas mostró que se producen virus infectivos ya que se detectó expresión de proteína estructural mediante EIPM y se observaron ecp. Segundo, el ectodominio de la proteína M de VR2332 y el de EAV se introdujo en esta construcción, dando lugar a ABV872 y pABV873 (Figura 2B). Sus transcritos de RNA se transfectaron en células BHK-21. Todos los MAb, menos 126.3 y 126.4, tiñeron las células transfectadas positivamente. Los MAP infectados con el sobrenadante del cultivo de células BHK-21 transfectadas mostró expresión de todas las proteínas estructurales en EIPM. Estos resultados indican que el ectodominio de la proteína M de otros Arterivirus, siempre que el extremo C-terminal de la GP5 se mantenga intacto, puede intercambiarse de forma funcional por el ectodominio de la proteína M del LV.

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Estabilidad genética de los Arterivirus quiméricos

Para poder investigar si los virus generados a partir de pABV707, 738, 741, y 742, 871, 872 y pABV873 se mantienen estables in vitro, se sometieron a pases seriados en MAP. El RNA viral se aisló del sobrenadante del cultivo tras 5 pases, y se estudiaron mediante análisis genético. El RNA viral se transcribió de forma reversa y se amplificó la región flanqueante a las deleciones introducida mediante PCR. El análisis de la secuencia del fragmento mostró que para cada mutante, las mutaciones introducidas estaban aún presentes y que no se habían introducido mutaciones adicionales en las regiones flanqueantes durante los pases in vitro. Estos resultados indican que las deleciones se mantuvieron estables durante los pases in vitro en MAP.

Se determinaron las características de crecimiento para vABV707, vABV741, y vABV742 en una curva de crecimiento y se compararon con las de vABV437 de tipo salvaje. Se infectaron MAP con el pase 5 en una multiplicidad de infección de 0,05, y se retiró el medio de cultivo a varios intervalos de tiempo. Se determinaron las titulaciones de virus mediante dilución final en macrófagos. En todos los casos, se observó que las tasas de crecimiento eran similares, sin embargo, la cantidad de virus viables disminuyó más rápido tras alcanzar su titulación más alta. Este resultado puede indicar que los virus generados son termolábiles lo que puede ser otra propiedad útil para los propósitos de una vacuna.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Cebadores utilizados en la mutagénesis por PCR y la secuenciación

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TABLA 2 Tinción de células BHK-21 transfectadas con transcritos de pABV437, 705, 706 y 707

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TABLA 3 Tinción de MAP infectados con sobrenadante de células BHK-21 transfectadas con pABV437, 705, 706 y 707

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TABLA 4 Secuencias de los cebadores utilizados para introducir deleciones mediante PCR, y cebadores utilizados para secuenciar las mutaciones introducidas

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Ejemplos de vacunación Inoculación intranasal de PRRSV de tipo salvaje (tipo EU y tipo US) tras la vacunación de cerdos de 8 semanas de edad con los mutantes de PRRSV especificados; cinética del virus y respuesta de los anticuerpos Introducción

El virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) provoca abortos y camadas de baja calidad en cerdas embarazadas en su tercer trimestre. Además, puede provocar enfermedad respiratoria en cerdos jóvenes. La infección con PRRSV en cerdas embarazadas en último estadío (80-95 días) puede provocar un fallo reproductivo grave, especialmente debido a un alto nivel de mortalidad entre la progenie de estas cerdas en el momento del parto y durante la primera semana de vida. El PRRSV es un patógeno ubicuo. Se pueden distinguir dos tipos antigénicos distintos, es decir el tipo Europeo y el Americano. Los efectos clínicos tras la infección por PRRSV dependen del tipo de cepa involucrada. La vacunación de cerdos con una vacuna para el PRRS influye en la forma en que una exposición al PRRSV resulta a nivel del animal y de la granja. El nivel y duración de la viremia, y la dispersión del virus natural se reduce gracias a esta vacunación.

Para el desarrollo de una segunda generación de vacuna para el PRRS, se deben probar nuevos candidatos. Por lo tanto, se vacunaron cerdos de 8 semanas de edad con una serie de mutantes específicos del PRRSV (virus recombinante), tras lo que se expusieron al PRRSV. La cinética de esta exposición al virus se puntúa según el nivel y duración de la viremia y respuesta a dosis de refuerzo, tanto en una realización homóloga como heteróloga.

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Objetivo del estudio

La determinación de la eficacia inmunológica y la seguridad de los mutantes de PRRSV definidos utilizados como vacuna en un modelo de exposición a la vacunación (homóloga y heteróloga). Además de esto, se analizó la inmunogenicidad del mutante.

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Diseño del estudio

Se probaron cuatro mutantes de PRRSV que siguieron los siguientes criterios:

- estabilidad genética tras 5 pases in vitro (cultivos celulares).

- estabilidad genética tras 3 semanas de exposición a animales.

- inmunogenicidad (determinado mediante Elisa de IDEXX).

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Se probaron los siguientes mutantes:

vABV707: virus quimérico LDV-PRRS (ectodominio de M intercambiado).

vABV741: deleción del aa 9 de la proteína M de PRRSV.

vABV746: deleción de 18 nucleótidos en la parte C-terminal del ORF7.

vABV688: mutaciones en la posición 88-95 del ORF2.

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Como control positivo, se utilizaron los siguientes virus:

vABV437: recombinante de tipo salvaje del virus Lelystad.

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Cada mutante se analizó en dos grupos, cada uno consistente en 5 cerdos SPF de 8 semanas de edad.

Todos los grupos se segregaron completamente sin ningún contacto entre ellos. Dos cerdos centinela no expuestos (uno por cada grupo mutante) se unieron 24 horas después de la vacunación a los cerdos vacunados y se retiraron y sacrificaron 28 días después.

En los 2 grupos (por mutante) consistentes en 5 vacunados, dos animales se expusieron al virus salvaje (es decir, virus Lelystad (LV-tH) como representante de la cepa Europea del PRRSV o al SDSU#73 como representante de la cepa Americana (US) del PRRSV), el día 28 después de la vacunación.

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Los otros tres vacunados se separaron de estos animales expuestos durante 24 horas y se reagruparon después. Todos los cerdos se retiraron y sacrificaron 28 días después de la exposición.

El vABV437 sirvió como control positivo. Se incluyó un control de exposición durante 14 días contando desde el momento de la exposición para controlar la eficacia de exposición con LV-tH y SDSU#73, Los animales se trataron como se ha descrito para el resto de animales durante la fase de exposición.

La distribución de los cerdos se indica en la Tabla 1.

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TABLA 1 Distribución de los cerdos en los grupos designados. Cada grupo mutante consiste en 5 cerdos vacunados y 1 centinela (de forma que cada mutante de PPRSV posee dos grupos). Los grupos 11 y 12 sirven como grupos control de exposición (++) que consisten en 5 animales por grupo; sólo dos de estos cerdos sufrieron una exposición intranasal de LV-tH o SDSU#73. Todos los grupos mutantes se alojaron en unas instalaciones de aislamiento de recombinantes, mientras que los grupos del tipo salvaje se alojaron en unas instalaciones de aislamiento estándar

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Las vacunas se administraron por vía intramuscular según una PNT (2 ml de profundidad intramuscular en el cuello, a medio camino entre el hombro y la oreja derecha; titulación mínima 10^{5} DICT_{50}/ml). Todos los inóculos se titularon antes y después de su uso y se almacenaron en hielo fundido en todo momento.

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Animales experimentales

70 cerdos de 8 semanas de edad, libres de PRRSV.

Ejecución del estudio (Tabla 2) TABLA 2 Curso del estudio válido para cada uno de los grupos de mutantes

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Resultados

No se detectaron reacciones adversas tras la exposición a los virus mutantes o virus salvajes de los cerdos en cada uno de los grupos.

Las Tablas 3 y 4 muestran los resultados del aislamiento del virus del PRRS del suero y las puntuaciones de viremia calculadas. La incidencia de la viremia en puntos de muestreo definidos se determinó mediante el aislamiento del virus en macrófagos alveolares porcinos utilizando las técnicas de rutina ya publicadas.

La positividad del virus en una dilución 1:10 de una muestra de suero se designó (+), y (++) significa positividad del virus en una dilución 1:100 de una muestra de suero. Estos resultados se utilizaron para calcular una "puntuación de viremia" total de grupo como (tipo 1) el porcentaje de animales expuestos al virus en cada grupo (cada animal positivo para el virus en cada punto de tiempo = 1 punto, por lo que puede obtenerse una puntuación máxima del 100% (= 12/12), y (tipo 2) como el porcentaje de viremia máxima de los animales expuestos. En este último caso, puede obtenerse una puntuación máxima del 100% (= 24/24) en base al hecho de que la viremia máxima se puntúa con 2 puntos (dilución 1:100 de las muestras) para cada animal individual. Todos los grupos de virus mutante mostraron una puntuación de viremia de tipo 1 y tipo 2 reducida comparado con la vABV437. Los cerdos vacunados con vABV707 mostraron una puntuación de viremia de tipo 1 y tipo 2 reducida previamente a la exposición comparada con la puntuación de los cerdos del resto de grupos. En el momento de la exposición no se encontraron más animales virémicos. Todos los centinelas se encontraron virémicos y seroconvertidos, lo que significa que el virus ha pasado de los cerdos expuestos a los centinelas. Se demuestra que la exposición primaria de los cerdos al virus mutante da lugar a una respuesta inmunológica efectiva como se determina mediante una prevención casi completa de la viremia tras la exposición salvaje homóloga y una firma reducción de la viremia tras la exposición heteróloga comparado con los controles de exposición. Los centinelas vacunados quedaron protegidos de forma efectiva.

No pudieron documentarse diferencias en la respuesta serológica tras la vacunación y la exposición entre los grupos estudiados.

Todos los controles de exposición muestran viremia durante el curso del estudio de 14 días, siendo la viremia más predominante en los cerdos con exposición intranasal.

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TABLA 3 Puntuación de viremia tipo 1. Se calculó una "puntuación de viremia" total del grupo como el porcentaje de los animales expuestos al virus en cada grupo. Cada animal positivo para el virus en cada punto de tiempo = 1 punto, de forma que puede obtenerse una puntuación máxima del 100% (= 12/12)

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TABLA 4 Puntuación de viremia tipo 2, calculada como el porcentaje de máxima viremia de los animales expuestos. Puede obtenerse una puntuación máxima del 100% (= 24/24) en base al hecho de que la máxima viremia se puntúa con dos puntos (dilución 1:100 de las muestras) para cada animal individual en cada punto de tiempo

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Conclusión

Los virus del PRRS mutantes recombinantes estudiados muestran una virulencia reducida como se determina mediante una reducción de la viremia (duración e intensidad) comparado con el salvaje (vABv437). Todos los mutantes inician una respuesta inmune efectiva para la protección de los cerdos frente al PRRSV salvaje natural. La protección homóloga parece ser de algún modo más efectiva que la heteróloga. La vABV707 parece ser la vacuna más adecuada de entre los virus analizados.

La respuesta humoral puede medirse mediante un ELISA comercial (IDEXX) en todos los casos. No se provocan reacciones adversas.

Referencias

1. de Haan, C. A., L. Kuo, P. S. Masters, H. Vennema, y P. J. Rottier. 1998. Coronavirus particle assembly: primary structure requirements of the membrane protein. J Virol. 72:6838-50.

2. de Haan, C. A., M. Smeets, F. Vernooij, H. Vennema, y P. J. Rottier. 1999. Mapping of the coronavirus membrane protein domains involved in interaction with the spike protein. J Virol. 73:7441-52.

3. de Vries, A. A., S. M. Post, M. J. Raamsman, M. C. Horzinek, y P. J. Rottier. 1995. The two major envelope proteins of equine arteritis virus associate into disulfide-linked heterodimers. J Virol. 69:4668-74.

4. Faaberg, K. S., C. Even, G. A. Palmer, y P. G. Plagemann. 1995. Disulfide bonds between two envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus are essential for viral infectividad. J Virol. 69:613-7.

5. Faaberg, K. S., y P. G. Plagemann. 1995. The envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus and their membrana topography. Virology. 212:512-25.

6. Godeke, G. J., C. A. de Haan, J. W. Rossen, H. Vennema, y P. J. Rottier. 2000. Assembly of spikes into coronavirus particles is mediated by the carboxy-terminal domain of the spike protein. J Virol. 74:1566-71.

7. Kuo, L., G. J. Godeke, M. J. Raamsman, P. S. Masters, y P. J. Rottier. 2000. Retargeting of coronavirus by substitution of the spike glucoprotein ectodomain: crossing the célula huésped species barrier. J Virol. 74:1393-406.

8. Li, K., Z. Chen, y P. Plagemann. 1998. The neutralization epitope of lactate dehydrogenase-elevating virus is located on the short ectodomain of the primary envelope glucoprotein. Virology. 242:239-45.

9. Liljestrom, P., y H. Garoff. 1991. A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. Biotechnology N Y. 9:1356-61.

10. Mardassi, H., B. Massie, y S. Dea. 1996. Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virology. 221:98-112.

11. Meulenberg, J. J. M., y A. Petersen den Besten. 1996. Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad virus: the glucoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology. 225: 44-51.

12. Meulenberg, J. J. M., A. Petersen-Den Besten, E. P. De Kluyver, R. J. M. Moormann, W. M. M. Schaaper, y G. Wensvoort. 1995. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology. 206:155-163.

13. Meulenberg, J. J. M., J. N. A. BosDeRuijter, R. vandeGraaf, G. Wensvoort, y R. J. M. Moormann. 1998. Infectious transcripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal Of Virology. Jan. 72:380-387.

14. Meulenberg, J. J. M., M. M. Hulst, E. J. De Meijer, P. L. J. M. Moonen, A. Den Besten, E. P. De Kluyver, G. Wensvoort, y R. J. M. Moormann. 1993. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV y EAV. Virology. 192:62-72.

15. Murtaugh, M. P., M. R. Elam, y L. T. Kakach. 1995. Comparison of the proteína estructural coding secuencias of the VR-2332 y Lelystad virus strains of the PRRS virus. Arch Virol. 140:1451-60.

16. Risco, C., I. M. Anton, C. Sune, A. M. Pedregosa, J. M. Martin Alonso, F. Parra, J. L. Carrascosa, y L. Enjuanes. 1995. Membrane protein molecules of transmissible gastroenteritis coronavirus también expose the carboxyterminal region on the external surface of the virion. J Virol. 69:5269-77.

17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

18. van Nieuwstadt, A. P., J. J. Meulenberg, A. van Essen Zanbergen, A. Petersen den Besten, R. J. Bende, R. J. Moormann, y G. Wensvoort. 1996. Proteins encoded by open reading frames 3 and 4 of the genome of Lelystad virus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion. J Virol. 70:4767-72.

19. Wensvoort, G., C. Terpstra, J. Boonstra, M. Bloemraad, y D. Van Zaane. 1986. Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet Microbiol. 12:101-8.

20. Wensvoort, G., C. Terpstra, J. M. Pol, E. A. ter Laak, M. Bloemraad, E. P. de Kluyver, C. Kragten, L. van Buiten, A. den Besten, F. Wagenaar, y et al. 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Vet Q. 13:121-30.

Claims

1. Una partícula de tipo Arterivirus que comprende al menos una primera proteína estructural de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y una segunda proteína estructural de dicho PRRSV en la que dicha segunda proteína estructural es una proteína de membrana (M) o una glucoproteína (GP), y en la que al menos el ectodominio de dicha proteína de membrana o glucoproteína se ha intercambiado o sustituido por al menos el ectodominio de una proteína de membrana o glucoproteína de un Arterivirus diferente.

2. Una partícula de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dicha primera y segunda proteína estructural forman un heterodímero.

3. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2 en la que dicha glucoproteína es GP5.

4. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 en la que dicha primera proteína estructural es GP5 o parte de la misma y dicha segunda proteína estructural es una proteína de membrana (M) o parte de la misma.

5. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 en la que dicho Arterivirus diferente es el virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV).

6. Un ácido nucleico que codifica al menos una primera proteína estructural de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) y una segunda proteína estructural del PRRSV, en el que dicha segunda proteína estructural es una proteína de membrana (M) o una glucoproteína (GP), y en el que al menos el ectodominio de dicha proteína de membrana o glucoproteína se ha intercambiado o sustituido por al menos el ectodominio de una proteína de membrana o glucoproteína de un Arterivirus diferente, y en el que dicha primera y segunda proteína estructural permite la incorporación en una partícula de tipo Arterivirus.

7. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 o 7, o que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

9. Una vacuna que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 o 7, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Un método para obtener un Arterivirus atenuado que comprende proporcionar un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) con una proteína estructural que es una proteína de membrana (M) o una glucoproteína (GP), y en el que al menos el ectodominio de dicha proteína de membrana o glucoproteína se ha intercambiado o sustituido por al menos el ectodominio de una proteína de membrana o glucoproteína de un Arterivirus diferente.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicha proteína estructural forma un heterodímero con otra proteína estructural.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o 11 en el que dicha glucoproteína es GP5.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 12 en el que una de dichas proteínas estructurales es GP5 o parte de la misma y dicha otra proteína estructural es una proteína de membrana (M) o parte de la misma.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 10 a 13 en el que dicho Arterivirus diferente comprende virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV).