TWI359868B - Recombinant parainflulenza virus expression system - Google Patents

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TWI359868B
TWI359868B TW092103642A TW92103642A TWI359868B TW I359868 B TWI359868 B TW I359868B TW 092103642 A TW092103642 A TW 092103642A TW 92103642 A TW92103642 A TW 92103642A TW I359868 B TWI359868 B TW I359868B
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Haller Aurelia
Tang Roderick
Adrianus Maria Fouchier Ronaldus
Gerarda Van Den Hoogen Bernadetta
Dominicus Marcellinus Erasmus Osterhaus Albertus
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Medimmune Vaccines Inc
Vironovative Bv
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Description

rl359868 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於重组的副流感病毒（PIV) CDNA或RNA,其 可用來在適當的宿主細胞系統中表現異源基因產物，並/或 解救表現、包裝及/或提交異源基因產物的負股rna重組病 母。特定而言，本發明包括疫苗製品，其包括表現異源基 因產物的嵌合型PIV ’其中該異源基因產物最好是抗原肽或 多肽。在一個具體實施例中，本發明之plv載體表現一、二 或二個異源基因產物，其可由相同或不同的病毒編碼。在 較佳的具體實施例中，該異源序列編碼異源基因產物，其 為得自其他PIV物種，或得自其他負股RNA病毒的抗原多肽 ，包括但不限於流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺 乳動物間質肺病毒和禽肺病毒。本發明之疫苗製品包括多 仏疫$ ’包括二價和三價的疫苗製品。可以一個表現每個 異源抗原序列的PIV載體，或二或多個分別編碼不同的異源 抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明之多價疫苗。可單 獨或與其他疫苗、預防劑或治療劑—起投予本發明之疫苗 製品。 【先前技術】 副流感病毒的感染，在嬰幼兒和兒童導致嚴重的呼吸道 疾病（Tao等人，1999, Vaccine 17:1100-08)。傳染性副流感病 毒的感染’佔全世界所有因為呼吸道感染而住院之小兒科 患者的大約20% °同上。對於治療PIV相關之疾病，沒有可 利用的有效抗病毒治療，亦尚未核准預防PIV感染的疫苗》 -6 - 83860.doc 1359868 PIV是副黏液病毒科（paramyxoviridae)之呼吸道病毒 (respirovirus)(PIV卜 I>IV3)或路伯拉病毒（rubulavirus) (PIV2 、PIV4)屬的成員。Piv由兩個結構功能域（module)構成：（1) 内部的核糖核蛋白核心或殼包核酸，含有病毒的基因组和 (2)外部粗略為球狀的脂蛋白被膜》其基因組由單股的反義 RNA所組成’長度約為15,456個核荅酸，編碼至少8個多肽 。這些蛋白質包括殼包核酸的結構蛋白質（視屬而為NP、NC 或N)、磷蛋白（P)、基質蛋白質（μ)、融合糖蛋白（F)、血球 凝集素-神經胺糖酸：y：酶糖蛋白（HN)、大聚合酶蛋白質（L) 以及未知功能的C和D蛋白質。同上。 副流感殼包核酸蛋白質（Np、NC或N)，在每個蛋白質單 元内’含有兩個功能部位。這些功能部位包括：胺基-終端 的功能部位’其幾乎包括分子的三分之二，並直接與RNA 產生交互作用’以及羧基-終端功能部位，其位在裝配好之 殼包核酸的表面上《認為在這兩個功能部位的接合處存有 絞鏈，藉此給與該蛋白質一些彈性（參見Fields等人（編輯 1991，FUNDAMENTAL VIROLOGY，第 2版，Raven Press,
New York，將其全文以引用的方式併入本文中）。基質蛋白 質（M)顯然涉及病毒的裝配，且其與病毒膜和殼包核酸蛋白 質兩者產生交互作用。磷蛋白（P)經歷磷酸化作用，並已經 涉及轉錄調節作用、甲基化作用、磷酸化作用和聚腺苷酸 化作用。融合糖蛋白（F) —開始以無活性前驅物的形式產生 ’在轉譯時將其切開，產生兩個二硫連接的多肽。有活性 的F蛋白質與病毒膜產生交互作用，在那裏它藉著促進病毒 83860.doc 被膜與宿主細胞漿膜的融合，而使副流感病毒粒子更容易 貫穿進入宿主細胞内。同上。糖蛋白，血球凝集素-神經胺 糖酸苷酶（HN)從被膜中伸出，並給與病毒血球凝集素和神 經胺糖酸苷酶活性。HN具有強忌水性的胺基終端，其功能 為將HN蛋白質固定在脂雙層内。同上。最後，大聚合酶蛋 白質（L)在轉錄和複製作用兩者中，扮演重要的角色。同上。 牛流感病毒是在1959年，首先從顯示運輸熱症狀的小牛 中分離出。從那時起，已經從正常的牛、流產胎兒和顯露 呼吸疾病症狀的牛中分離出該病毒（Breker-Klassen等人， 1996，Can. J. Vet. Res. 60:228-236。亦參見Shibuta，1977, Microbiol. Immunol. 23(7), 617-628)。人類和牛PIV3共享中 和抗原決定位，但顯示出不同的抗原特性。在人類和牛病 毒品系之間，在HN蛋白質中存有顯著的差異。事實上，牛 品系對hPIV感染誘導一些中和抗體，而人類品系似乎對人 類PIV3誘導更大範圍的中和抗體（Van Wyke Coelingh等人, 1990, J. Virol. 64:3833-3843)。 所有負股RNA，包括PIV的複製，均由於缺少複製RNA所 需之細胞結構，而變得很複雜。此外，必須在發生轉譯之 前，將負股的基因組轉錄成正股（mRNA)副本。因此，在進 入細胞内時，單獨的基因組RNA不能合成所需的RNA-依賴 性RNA聚合酶。L、P和N蛋白質必須與基因組RNA—起進入 宿主細胞。 假設大多數或全部的病毒蛋白質，轉錄PIV mRNA亦進行 基因組的複製。尚未清楚地確認調節蛋白質之相同補體另 83860.doc 1359868 一種用途（即轉錄或複製作用）的機制，但該過程顯然涉及增 強一或多種殼包核酸蛋白質的自由形式。在病毒貫穿之後 ，就藉由L蛋白質，使用在殼包核酸中的反義RNA作為模板 ，開始轉錄作用。調節病毒的RNA合成，使得它在轉錄期 間，產生單順反子的mRNAs。 在轉錄之後，在被負股RNA病毒感染時，病毒基因組的 複製是第二個必要事件。像其他的負股RNA病毒一樣，在 PIV中，由病毒特有的蛋白質調解病毒基因組複製。複製RNA 合成的第一個產物是PIV基因組RNA的互補副本（cRNA)(即 正-極性）。這些正-股副本（反-基因組），在其終端的結構上 ，是與正-股mRNA轉錄本不同的。不像mRNA轉錄本，反-基因組cRNAs在V端未被加帽或甲基化，且它們在3’端沒有 被截短也沒有被聚腺甞酸化。cRNAs與其負股模板是同終 端的，並以互補的形式含有所有的遺傳資訊。cRNAs係擔 任合成PIV負股病毒基因組（vRNAs)的模板。 藉著殼包核酸將bPIV負股基因組（vRNAs)和反基因組 (cRNAs)殼體化；只有未殼體化的RNA物種是病毒的mRNAs 。bPIV RNA的複製和轉錄發生在宿主細胞的細胞質中。病 毒組份的裝配似乎發生在宿主細胞漿膜，在那裏藉著出芽 釋放成熟的病毒。 2.1.禽肺病毒 在1970年代末期，首先在南美描述了由禽肺病毒（APV) 引起的呼吸道疾病（Buys等人，1980, Turkey 28:36-46)，在那 裏它成為毁滅火雞工廠的原因。該疾病在火雞中的症狀， 83860.doc 1359868 包括竇炎和鼻炎。將該疾病稱為火雞鼻氣管炎（TRT)。亦已 經強烈地暗示，APV的歐洲分離株為雞的頭腫徵候群（SHS) 的原因（O’Brien，1985, Vet. Rec. 117:619-620)。最初，該疾 病出現在已感染新城雞瘟病毒（NDV)的肉雞群中，並以為是 與新城雞瘟（ND)有關的二級問題。在SHS發生後，在被感 染的難中檢測到對抗歐洲APV的抗體（Cook等人，1988, Avian Pathol. 17:403-410)，因此暗示 APV為致病原。 禽肺病毒是單股、非-片斷的RNA病毒，屬於副黏液病毒 科的肺病毒亞科（Pneumovirinae)，間質肺病毒屬（Cavanagh 和 Barrett, 1988，Virus Res. 11:241-256; Ling 等人，1992，J. Gen. Virol· 73:1709-1715; Yu等人，1992，J.Gen.Virol. 73:1355-1363)。將副黏液病毒科分成兩個亞-科：副黏液病 毒亞科和肺病毒亞科。副黏液病毒亞科包括：副黏液病毒 屬、路伯拉病毒屬和摩比利病毒（Morbillivirus)屬。最近， 按基因順序和序列同種性，將肺病毒亞科分成兩屬，即肺 病毒和間質肺病毒（Naylor等人，1998，J. Gen. Virol., 79: 1393-1398; Pringle，1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。肺病 毒屬包括人類呼吸道融合細胞病毒（HRSV)、牛呼吸道融合 細胞病毒（BRSV)、羊呼吸道融合細胞病毒和老鼠肺病毒。 間質肺病毒包括歐洲禽肺病毒（A和B亞群），其與肺病毒屬 的典型物種HRSV有別（Naylor等人，1998, J. Gen. Virol·，79: 1393-1398; Pringle, 1998，Arch. Virol. 143:1449-1159)。APV 的美國分離株代表在間質肺病毒屬中的第三個亞群（C亞群） ，因為已經發現它在抗原性上和遺傳上，與歐洲分離株不 1359868 同（Seal, 1998，Virus Res. 58:45-52; Senne等人，1998，在 Proc.第 47次 WPDC，California,第 67-68 頁中）。 負染色APV的電子顯微鏡檢查，顯示多晶的，有時球狀 的病毒粒子，直徑範圍從80至200毫微米，具有長度範圍從 1000 至 2000毫微米的長絲（Collins 和 Gough，1988，J. Gen. Virol. 69:909-916)。被膜則由鑲有長度從13至15毫微米之釘 子的膜構成。殼包核酸是螺旋狀的，直徑為14毫微米，高 度為7毫微米。殼包核酸的直徑比來自副黏液病毒和摩比利 病毒之病毒的殼包核酸之直徑更小，後者的直徑通常為18 毫微米。 禽肺病毒感染，在美國是正在發生的疾病，不管在家禽 中，它的全世界發生已持續數年。在1996年5月，在科羅拉 多州出現火雞的高度傳染性呼吸道疾病，接著在Ames, Iowa 的國家獸醫服務實驗室（National Veterinary Services Laboratory (NVSL))中分離出 APV (Senne等人，1997，Proc. 第134次Ann. Mtg.，AVMA，第190頁）。在此之前，已經認為 美國和加拿大是沒有禽肺病毒的（Pearson等人，1993,在 Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control,第 78-83 頁中；Hecker和 Myers，1993，Vet. Rec. 132:172)。在1997年早期，在明尼蘇達州，以血清學之方式 在火雞中檢測到APV。在那時，進行第一次證明診斷，而 APV感染亦已經散播至許多農場。與該呼吸道疾病有關的 臨床症狀，包括：多泡沫的眼睛、鼻分泌物和竇腫脹。藉 83860.doc -11 - 1359868 由一 /人感染使其惡化，而被感染鳥類的發病率已高達1 〇〇% 。死亡率範園從1至90%，而最高的是在6至12週齡的禽類。 禽肺病毒是藉著接觸傳播。鼻分泌物、被感染鳥類的移 動、被污染的水、被污染的環境、被污染的飼料卡車和裝 入·倒出的活動，都有助於病毒的散播。認為恢復的火雞是 帶原者。因為顯示病毒感染產卵火雞的輸卵管上皮，並因 為已經在小鳥中檢測到APV，亦猜測卵是傳播的方式。 2.2.人類間質肺病毒 大部分的人類呼吸道疾病是由病毒亞科副黏液病毒亞科 和肺病毒亞科所引起的，對於賦與保護、對抗各種導致呼 吸道感染之病毒的有效疫苗將仍有需求。 不應將在本文中引述或討論的參考文獻解釋為承認這類 參考文獻為本發明的先前技術》 【發明内容】 本發明係關於重組的副流感病毒cDna*rna，可將其加 以設計，以便表現異源的或非-天然的基因產物，特定而言 ，表現抗原多肽和肽。在一個具體實施例中，本發明係關 於設計重組的牛或人類副流感病毒，其表現異源抗原，或 異源抗原之免疫原及/或抗原片段。在特定的具體實施例中 ，該異源基因產物是得自其他PIV物種或其他負股腿病毒 的抗原多肽。在本發明的另一個具體實施例中，異源基因 產物是非-天然的PIV基因產物’包括由突變之ριν核芬酸序 列編碼的那些。料而言，本發明係祕重組的堪薩斯 (Kansas)·品系的牛副流感第3型病毒，將其設計成表現編碼 83860.doc -12 - 1359868 相同物的異源序列，以及cDNA* RNA分子。本發明亦關於 重组的PIV，其含有修改，結果產生嵌合型病毒，具有更適 合用來作為疫苗調配物的表現型，以及含有異源基因或異 源基因之片段的重組PIV，包括其他PIV物種、其他病毒、 病原、細胞基因、腫瘤抗原等等的基因。 本發明首次提供調配成疫苗的嵌合型PIV，它能夠賦與對 柷各種病毒感染的保護β在特定的具體實施例中，本發明 提供能夠賦與對抗呼吸道融合細胞病毒感染之保護的疫苗 本發月首/入^供了能夠賦與在哺乳動物宿主中，對抗間 質肺病毒感染之保護的疫苗。 根據本發明，重組的病毒係衍生自牛副流感病毒或人類 田1J流感病毒，其由内源或天然的基因組序列，或非_天然的 基因組序列編碼。根據本發明，非-天然序列是因為一或多 個突變’包括但不限於點突變、重排、插人、刪除等等， 而^天然或内源的基因組序列不同的序列，對基因組序列 而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。 根據本發月’本發明之谈合型病毒是重組的bpiv或 其更匕括或多個異源的核嘗酸序列《根據本發明，該 嵌合型病毒可由其中已經將異源㈣酸序列加至基因组内 的核嘗酸序列’或其中已經利用異源核菩酸序列置換的核 菩酸序列編碼。 本發明《於設計重組㈣流感病毒和病毒載體，其編 碼異源序列的組合’該異源序列所編碼之基因產物，包括 仁不限於传自；P'同品系之ριν、流感病毒、哼吸道融合細胞 83860.doc -13 - 1359868 病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病毒）、禽肺病 毒、其他病毒、病原的基因、細胞基因、腫瘤抗原或其組 合》此外，本發明係關於設計重組的副流感病毒，其含有 與衍生自呼吸道融合細胞病毒之核甞酸序列組合的衍生自 間質肺病毒之核甞酸序列，並進一步與衍生自人類副流感 病毒之核菩酸序列組合。本發明亦包括重組的副流感載體 和病毒’設計使其編碼得自副流感病毒之不同物種和品系 的基因，包括人類PIV3的F和HN基因。 在一個具體實施例中’設計本發明之PIV載體，以便表現 一或多個異源序列’其中該異源序列所編碼之基因產物， 最好疋抗原之基因產物。在較佳的具體實施例中，本發明 之PIV載體表現一、二或三個異源序列，其編碼抗原多肽和 肽。在某些具體實施例中，該異源序列係衍生自相同的病 毒或不同的病毒《在較佳的具體實施例中，該異源序列編 碼異源基因產物，其為得自其他PIV物種，像是人類ριν、 PIV之突變品系，或得自其他負股RNA病毒，包括但不限於 流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病 毒（例如人類間質肺病和禽肺病毒的抗原多肽。 在一個具體實施例中’該異源序列編碼異源基因產物的免 疫原及/或抗原片段。在較佳的具體實施例中，該重組的PIV 為牛PIV第3型或減毒的人類PIV第3型。在一個具體實施例 中，刪除編碼融合（F)蛋白質、血球凝集素（HN)糖蛋白或ριν 基因組之其他非·必要基因的序列，並藉著異源抗原序列取 代之在另一個具體實施例中，除了異源核贫酸序列之外 83860.doc -14 - 1359868 ，還有含有突變或修改的PIV基因組，結果產生具有更適合 在疫苗調配物中使用之表現型的嵌合型病毒，例如減毒的 表現型或具有增強抗原性的表現型。 在特定的具體實施例中，待插入PIV基因組内的異源核苷 酸序列，係衍生自編碼F蛋白質、G蛋白質或HN蛋白質的核 甞酸序列。在某些具體實施例中，待插入之核苷酸序列編 碼嵌合型F蛋白質、嵌合型G蛋白質或嵌合型HN蛋白質。在 特定的具體實施例中，F蛋白質包括間質肺病毒之F蛋白質 的外功能部位（ectodomain)、副流感病毒之F蛋白質的穿透 膜功能部位和副流感病毒之F蛋白質的魯米那功能部位。在 某些具體實施例中，待插入之核站酸序列編碼F蛋白質，其 中刪除該F蛋白質之穿透膜功能部位，而得以表現可溶的F 蛋白質。 在其他特定的具體實施例中，本發明提供包括PIV基因組 的嵌合型病毒，該PIV基因組包括衍生自間質肺病毒的異源 核甞酸序列。在特定的具體實施例中，該PIV病毒是堪薩斯 -品系的牛副流感第3型病毒。在其他的具體實施例中，該 PIV病毒是具有減毒之表現型的人類副流感病毒。在其他的 具體實施例中，本發明提供嵌合型牛副流感病毒第3型/人 類副流感病毒，設計使其在牛副流感主鏈中，含有人類副 流感病毒F和HN基因。該嵌合型病毒可進一步包括衍生自 間質肺病毒的異源核苷酸序列，及/或進一步包括衍生自呼 吸道融合細胞病毒的異源核甞酸序列。 在某些具體實施例中，本發明之病毒包括衍生自間質肺 83860.doc -15 - 1359868 病毒之至少兩個不同基因的異源核苷酸序列。在特定的具 體實施例中，該異源序列係衍生自間質肺病毒，例如禽肺 病毒和人類間質肺病毒。更特定而言，該異源序列係衍生 自禽肺病毒，包括禽肺病毒A型、禽肺病毒B型和禽肺病毒 C型。 本發明亦提供包括表現一或多個異源抗原序列之嵌合型 PIV的疫苗製品和免疫原組合物。在特定的具體實施例中， 本發明提供多價疫苗，包括二價和三價的疫苗。本發明之 多價疫苗可以一個表現每個異源抗原序列的PIV載體，或以 二或多個分別編碼不同異源抗原序列的PIV載體之形式投 予。在一個具體實施例中，本發明之疫苗製品包括嵌合型 PIV，表現一、二或三個異源多肽，其中該異源多肽可由衍 生自相同病毒的一個品系、相同病毒的不同品系，或不同 病毒的序列編碼。該異源抗原序列最好是衍生自負股RN A 病毒，包括但不限於流感病毒、副流感病毒、啤吸道融合 細胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病 毒（hMPV))和禽肺病毒（APV)。該異源抗原序列包括，但不 限於編碼人類副流感病毒F或HN蛋白質、RSV之F蛋白質、 流感病毒A、B和C型的HA蛋白質以及人類MPV和禽肺病毒 之F蛋白質的序列。更佳的是，本發明之疫苗製品包括減 毒的嵌合型病毒，其為可存活並有傳染性的。在較佳的具 體實施例中，重組的PIV為牛PIV第3型或人類PIV的減毒品 系。 在一個具體實施例中，疫苗製品包括本發明之嵌合型病 83860.doc -16 - 1359868 毒’其中已經取代或刪除PIV基因組之F、HN或一些其他非 必要的基因。在較佳的具體實施例中，藉著設計在想要之 伤主中’具有減毒表現型的pIV品系’來製備本發明之疫苗 製品。在其他較佳的具體實施例中，藉著設計PIV的減毒品 系’來製備本發明之疫苗製品。 在另一個具體實施例中，將異源核钻酸序列加至完整的 PIV基因組中。在某些具體實施例中，設計PIV基因組，以 便在位置1、2、3、4、5或6處，插入該異源序列，而得以 病毒基因组的第i、2、3、4、5或6個基因，來表現該異源 序列。在特定的具體實施例中，在病毒基因組的位置丨、2 或3處插入異源序列。在某些具體實施例中，將在被插入之 異源基因的密碼序列末端，與下游基因之密碼序列的起點 之間的基因間區域，變更為想要的長度，、结果提高了該異 源序列的表現，或促進該嵌合型病毒的生長。或者，將基 因間區域變更為想要的長度，有可能改變該異源序列的表 現，或重組的或嵌合型病毒，例如減毒之表現型的生長。 在-些具體實施例中’設計插入的位置和位在該異源核甞 酸序列側面之基因間區域的長度兩者，以便選擇具有想要 程度之異源序列表現，和想要之病毒生長特徵的重组或嵌 合型病毒。 在某些具體實施例中，本發明提供包括本發明之重組或 嵌合型届毒’以及在醫藥上可接受之賦形劑的疫苗調配物 。在特定的具體實施例中’使用本發明之疫苗調配物，來 調節諸如人類、靈長類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、 83860.doc -17 - 1359868 貓、嗡齒動物之類的個體，或禽類個體的免疫反應。在更 特定的具體實施例中，使用疫苗來調節人類嬰幼兒或兒童 的免疫反應。在其他的具體實施例中，本發明係關於獸醫 用途的疫苗調配物。可單獨或與其他疫苗，或其他的預防 或治療劑，一起投予本發明之疫苗調配物。 3.1.慣例和縮寫
cDNA 互補DNA CPE 致細胞病變作用 L 大蛋白質 Μ 基質蛋白質（被膜的線内） F 融合糖蛋白 ΗΝ 血球凝集素-神經胺糖酸甞酶糖蛋白 Ν、ΝΡ 或 NC 核蛋白（與RNA有關，並為聚合酶活性所必 需的） Ρ 磷蛋白 ΜΟΙ 傳染的多重性 ΝΑ 神經胺糖酸甞酶（被膜糖蛋白） PIV 副流感病毒 bPIV 牛副流感病毒 bPIV3 牛副流感病毒第3型 hPIV 人類副流感病毒 hPIV3 人類副流感病毒弟3型 bPIV/hPIV 或 重組的bPIV，具有hPIV序列 b/h PIV 83860.doc -18 - 1359868 b/h PIV3 或 bPIV3/hPIV3 nt RNP rRNP yRNA cRNA hMPV APV 位置 bPIV3、b/h PIV3及其衍生 物的位置1 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置2 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置3 重組的bPIV第3型，具有hPIV第3型的序列 核苷酸 核糖核蛋白 重組的RNP 基因組病毒RNA 反基因組的病毒RNA 人類間質肺病毒 禽肺病毒 當設計任何病毒而使用位置時，意指欲轉 錄之病毒基因組的基因位置。例如，若基因 位在位置1，則它便是欲轉錄之病毒基因組 的第一個基因，若基因位在位置2，則它便 是欲轉錄之病毒基因組的第二個基因。 基因組的核苷酸位置104,或者是欲轉錄之 病毒基因組的第一個基因位置。 基因組的核甞酸位置1774，或者是在天然副 流感病毒的第一和第二個開放編閱架構之 間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組的 第二個基因位置。 基因組的核甞酸位置3724，或者是在天然 副流感病毒的第二和第三個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 83860.doc -19 - 1359868 的第三個基因位置。 bPIV3 > b/h PIV3及其衍 生物的位置4 bPIV3、b/h PIV3及其衍 生物的位置5 bPIV3 ' b/h PIV3及其衍 生物的位置6 基因組的核甞酸位置5042，或者是在夭然 副流感病毒的第三和第四個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第四個基因位置。 基因组的核苷酸位置6790，或者是在天然 副流感病毒的第四和第五個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第五個基因位置。 基因組的核甞酸位置8631，或者是在天然 副流感病毒的第五和第六個開放編閱架構 之間的位置，或者是欲轉錄之病毒基因組 的第六個基因位置。 【實施方式】 本發明係關於重組的副流感cDNA和RNA構築體，包括但 不限於重組的牛和人類PIV cDNA和RNA構築體，其可用來 表現異源或非-天然的序列。 根據本發明，重組的病毒是衍生自由内源或天然基因組 序列，或非-天然基因組序列編碼之牛副流感病毒或人類副 流感病毒的病毒。根據本發明，非-天然的序列是因為一或 多個突變，包括但不限於點突變、重排、插入、刪除等等 ，而與天然或内源之基因組序列不同的序列，對基因組序 列而言，可能或可能沒有導致表現型上的改變。
根據本發明，本發明之嵌合型病毒是重组的bPIV或hPIV 83860.doc -20 - 1359868 ’其進一步包括一或多個異源核甞酸序列。根據本發明， 該嵌合型病毒可由其中已經在基因組中加入異源核答酸序 列的核甞酸序列，或其中已經利用異源核甞酸序列代替之 核答酸序列來編碼。可使用這些重組的和嵌合型病毒，以 及表現產物’作為適合投予人類或動物的疫苗。例如，可 在疫苗調配物中使用本發明之嵌合型病毒，賦與對抗肺病 毒、呼吸道融合細胞病毒、副流感病毒或流感病毒感染的 保護。 在一個具體實施例中，本發明係關sPIVeDNA和RNA構 築體，其衍生自人類或牛PIV變種，並將其設計成表現一、 二或三個異源序列，最好是編碼外來抗原和得自各種病原 、細胞基因、腫瘤抗原和病毒之其他產物的異源基因。特 定而言，該異源序列衍生自負股RNA病毒，包括但不限於 流感病毒、呼吸道融合細胞病毒（RSV)、哺乳動物間質肺病 毒（例如人類間質肺病毒變種Al、A2、B1和B2)，以及禽肺 病毒亞組A、B、C和D。在本發明其他的具體實施例中，該 異源序列是非-天然的PIV序列，包括突變的PJV序列。在一 些具體實施例中’該異源序列係衍生自相同，或衍生自不 同的病毒。 在特定的具體實施例中，本發明之病毒是重組的PIV，包 括衍生自人類間質肺病毒或禽肺病毒的異源核苷酸序列。 待插入PIV基因組内的異源序列，包括但不限於編碼人類間 質肺病毒Al、A2、B1或B2之F、G和HN基因的序列，編碼 禽肺病毒A、B或C型之F、G和HN基因的序列，以及其免疫 83860.doc -21 - 1359868 原及/或抗原片段。 在某些具體實施例中，將異源核:y：酸序列加至病毒基因 組内。在另外的具體實施例中，以異源核苷酸序列交換内 源的核苷酸序列。可將異源核站酸序列加至或插入PIV基因 組的各種位置’例如在位置1、2、3、4、5或6處。在較佳 的具體實施例中，在位置1處加入或插入異源核苷酸序列。 在另一個較佳的具體實施例中，在位置2處加入或插入異源 核甞酸序列。在另一個較佳的具體實施例中，在位置3處加 入或插入異源核：y：酸序列。在病毒之較低編號的位置處插 入或加入異源核苷酸序列，與在較高編號的位置處插入相 比較，產生較強的異源核苷酸序列表現。這是因為跨越病 毒基因組存在的轉錄梯度。然而，亦必須考量病毒複製的 效率》例如，在本發明之b/h piV3嵌合型病毒中，在位置1 處插入異源基因，在活體外延遲了複製動力學，而在活體 =亦達到較低的程度（參見第8節，實例3和圖5,以及第％ 節實例21)。目此，若需要異源核芬酸序列的強表現，則 在較低編號的位置處插人異源核芬酸序列，是本發明較佳 的具體實施例β若需要異源序列的強表現，最好是將異源 冷列插入b/"IV3基因組的位置2處(參見下文第412.節和 第8節’實例3) » 在些其他的具體實施例中，設計重組或援合型m基因 而得以改變在異源基因之密碼序列末端，和下游基因 之达、碼序列起點之間的其m , _ — 间的基因間區域。在另外一些其他的且 體貫施例中，本發明之症主 病母包括重組或嵌合型PIV基因組， 83860.doc -22 · 1359868 «*又汁使其得以在選自由位置丨、2、3、4、5和6所組成之群 的位置處插入異源核苷酸序列，並改變在該異源核甞酸序 列與接下來的下游基因之間的基因間區域。可使用適當的 測足，判定最佳的插入方式（即插入那一個位置，以及基因 間區域的長度）’達到適噹程度的基因表現，和病毒生長特 徵°關於細節，參見下文第4.1.2.節。 在某些具體實施例中，本發明之嵌合型病毒含有兩個不 同的異源核苷酸序列。可在PIV基因組的各種位置，插入不 同的異源核苷酸序列》在較佳的具體實施例中，在位置j處 插入一個異源核甞酸序列，並在位置2或3處，加入或插入 另一個異源核菩酸序列❶在本發明其他的具體實施例中， 將額外的異源核苷酸序列插入PIV基因組之較高編號的位 置處。根據本發明，異源序列的位置意指從病毒基因組中 轉譯序列的順序，例如在位置丨處的異源序列，是欲從基因 組中轉綠的第一個基因序列。 在本發明的某些具體實施例中，欲插入本發明病毒之基 因組内的異源核苷酸序列，係衍生自負股RNA病毒，包括 但不限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細胞病毒、 哺乳動物間質肺病毒和禽肺病毒。在本發明的特定具體實 犯例中，該異源核苷酸序列係衍生自人類間質肺病毒，在 另一個特定的具體實施例中，該異源核茹酸序列係衍生自 禽肺病毒。更特定而言，本發明之異源核钻酸序列，編碼 人類或禽間質肺病毒的F、G或SH基因，或其一部分。在特 定的具體實施例中，該異源核苷酸序列可以是序列識別1號 83860.doc -23 - 1359868 至序列識別5號、序列識別H號和序列識別ls號（參見表ι6) 中的任-個。在某些特定的具體實施例中，該核甞酸序列 編碼序列識別6號至序列識別13號、序列識別16號和序列識 別17號（參見表16)中任一個的蛋白質。在某些特定的具體實 施例中，該核苷酸序列編碼序列識別314至389號中任一個 的蛋白質。 在本發明特定的具體實施财，本發明之異源核嘗酸序 列係衍生自A型禽肺病毒。在本發明其他特定的具體實施例 中，本發明之異源核苷酸序列係衍生自B型禽肺病毒。在本 發明其他特定的具體實施财，本發明之異源㈣酸序列 係何生自C型禽肺病毒。系統發生分析顯示，a型和b型彼 此的相關性’比它們對c型的更密切（Seal，2〇〇〇, Αη_
Health Res· Rev. i⑴：67_72)。在歐洲發現a型和B型而c 型則首先在美國發現。 山在本發明另—個具體實施财，該異源料酸序列編碼 嵌β型多肽，其中外功能部位含有衍生自與從其中衍生載 體王鏈又PIV品系不同的病毒之抗原序列，以及衍生自MV 序列的穿透膜和魯米那功能部位。所得的嵌合型病毒，將 給與所選出之負股RNA病毒抗原性，並將具有減毒的表現 型。 山在本發明特定的具體實施例中，該異源核甞酸序列編碼 肷合型F蛋白質。特定而言，該嵌合型F蛋白質的外功能部 位是間質肺病毒的外功能部位，像是人類間質肺病毒或禽 肺病毒，而穿透膜功能部位和魯米那功能部位是副流感病 83860.doc -24 · 毒的穿透膜和魯米那功能部位，像是人類或牛副流感病毒 。未與任何理論結合，嵌合蛋白質的插入，可進一步在 預定的宿主中將病毒減毒，但㈣藉其外功能部位減毒之卩 蛋白質的抗原性。 可在疫苗調配物中，使用本發明之嵌合型病毒，賦與對 抗各種感染的保護，包括但稀於肺病毒感染、呼吸道融 合細胞病毒感染、副流感病毒感染、流感病毒感染或其组 合。本發明提供包括嵌合型PIV的疫苗製品，其表現一或多 個異源抗原序列，包括二價和三價的疫苗。可以一個表現 每個異源抗原序列的P! V載體’或二或多個分別編碼不同的 異源抗原序列的PIV載體之形式，投予本發明之二價和三價 疫苗。該異源抗原序列最好是衍生自負股RNA病毒，包括 但不限於流感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細胞病毒 (RSV)、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間質肺病毒）和禽肺 病毒。因此，可設計本發明之嵌合型病毒粒子，創造例如 抗-人類流感疫苗、抗-人類副流感疫苗、抗-人類RSv疫苗 和抗-人類間質肺病毒疫苗。本發明之疫苗製品最好包括減 毒的嵌合型病毒，其為可存活並有傳染力的。可單獨或與 其他疫苗，或其他預防劑或治療劑一起投予本發明之疫苗 製品。 本發明亦關於病毒載體和嵌合型病毒，在調配對抗大範 圍病毒及/或抗原，包括腫瘤抗原之疫苗上的用途。可使用 本發明之病毒.載體和嵌合型病毒，藉著刺激體液免疫反應 、細胞免疫反應，或藉著刺激對抗原之耐受性，來調節個 83860.doc -25 - 體的免疫反應。當在本文中使用時，個體意指人類、靈長 類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓嚆齒動物和禽類 的成員。在遞送腫瘤抗原時’可使用本發明來治療罹患順 從調解排斥之免疫反應的疾病，像是非_固體腫瘤，或小尺 寸之固體腫瘤的個體。亦企圖藉著在本文中描述的病毒載 體和嵌合型病毒，來遞送腫瘤抗原，這將可用於移除大固 體腫瘤之後的後續治療。亦可使用本發明來治療懷疑患有 癌症的個體。 為了解釋之目的，並非企圖加以限制，僅將本發明分成 下列的階^又.（a)建構重組的cDNA和RNA模板；（b)使用重 組的cDNA和RAN模板表現異源基因產物並（c)在重組的病 毒顆粒中，解救該異源基因。
4.1.建構重組的cdna和RNA 本發明包括由衍生自副流感病毒，包括牛副流感病毒和 哺乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的重組或嵌 合型涡毒❶根據本發明，重組病毒是衍生自牛副流感病毒 或哺乳動物副流感病毒的病毒，其係由内源或天然的基因 組序列或非-天然的基因組序列編碼。根據本發明，非·天然 的序列是因為一或多個突變，包括但不限於點突變、重排 、插入、刪除等等，而與天然或内源之基因組序列不同的 序列，對基因組序列而言，可能或可能沒有導致表現型上 的改變。本發明之重組病毒包括由衍生自副流感病毒，包 括牛和哺乳動物副流感病毒之基因組的病毒載體編碼的那 些病毒，可能或可能沒有包括對該病毒基因組而言，為非_ 83860.doc -26 - 1359868 天然的核酸。根據本發明，衍生自副流感病毒之基因組的 病毒載體，含有編碼至少一部分副流感病毒的一個ORF之 核酸序列。
根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自哺乳動物副流 感病毒的基因組，特別是人類副流感病毒（hPIV)。在本發 明特定的具體實施例中，該病毒載體係衍生自人類副流感 病毒第3型的基因組。根據本發明，這些病毒載體可以或可 以不包含對該病毒基因組而言，為非-天然之核酸。 根據本發明，本發明之病毒載體係衍生自牛副流感病毒 (bPIV)之基因組。在本發明特定的具體實施例中，該病毒 載體係衍生自牛副流感病毒第3型的基因組。根據本發明， 這些病毒載體可以或可以不包含對該病毒基因組而言，為 非-天然之核酸。
根據本發明，嵌合型病毒為重組bPIV或hPIV，其進一步 包括異源核苷酸序列。根據本發明，該嵌合型病毒可由其 中已經將異源核苷酸序列加至基因組中的核苷酸序列，或 其中已經利用異源核苷酸序列代替的内源或天然核苷酸序 列編碼。根據本發明，該嵌合型病毒係由本發明之病毒載 體編碼，其進一步包括異源核苷酸序列。根據本發明，該 嵌合型病毒係由可以或可以不含對該病毒基因組而言，為 非-天然之核酸的病毒載體編碼。根據本發明，該嵌合型病 毒係由其中已經加入、插入或取代天然或非-天然序列之異 源核芸酸序列的病毒載體編碼。 嵌合型病毒對於產製可保護對抗二或多種病毒的重組疫 83860.doc • 27 - 1359868 苗，具有特殊的用途（Tao等人，J. Virol. 72, 2955-2961; Durbin等人，2000, J. Virol. 74, 6821-6831; Skiadopoulos等人 ，1998，J. Virol· 72，1762-1768 (1998); Teng等人，2000，夂 Virol. 74，9317-9321)。例如，可想像hPIV或bPIV病毒載體 表現一或多個其他負股RNA病毒，例如MPV的蛋白質或 RSV載體表現一或多個MPV的蛋白質，將可保護接種這類 疫苗的個體對抗兩種病毒感染。可對其他的副黏液病毒， 想像類似的方法。為了以活毒疫苗接種疫苗之目的，減毒 和複製缺陷的病毒可能是有用的，如同已經針對其他病毒 所討論的（參見PCT WO 02/057302，在第6和23頁，以引用 的方式併入本文中）。 根據本發明，欲併入編碼本發明之重組或嵌合型病毒之 病毒載體内的異源或非-天然序列，包括獲自或衍生自不同 的間質肺病毒品系、禽病毒品系，以及其他負股RNA病毒 ，包括但不限於RSV、PIV、流感病毒，及其他病毒，包括 摩比利病毒的序列。 在本發明的某些具體實施例中，本發明之嵌合型或重組 病毒係由衍生自病毒基因組的病毒載體編碼，其中已經利 用異源或非-天然之序列，取代一或多個序列、基因間區域 、終端序列或一部分或整個ORF。在本發明的某些具體實施 例中，本發明之嵌合型病毒係由衍生自病毒基因組的病毒 載體編碼，其中已經將一或多個異源序列加至該載體内。 本發明特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍生自 副流感病毒基因組之核苷酸序列編碼的主鏈。在較佳的具 83860.doc -28 - 1359868 體實施例中，該PIV基因組係衍生自牛PIV，像是bPIV3的堪 薩斯品系或衍生自人類PIV。在較佳的具體實施例中，該PIV 基因組係衍生自bPIV3的堪薩斯品系，其中已經利用異源序 列取代牛副流感病毒核甞酸序列，或其中已經將異源序列 加至完整的bPIV基因組中。本發明更進一步的特定具體實 施例為嵌合型病毒，包括由衍生自人類副流感病毒第3型基 因組之核荅酸序列編碼的主鏈，其中已經利用異源序列取 代人類副流感病毒核苷酸序列，或其中已經將異源序列加 至完整的hPIV基因組中。本發明額外特定的具體實施例為 嵌合型病毒，包括由衍生自牛副流感病毒基因組之核苷酸 序列編碼的主鏈，像是bPIV3的堪薩斯品系，其中（a)已經利 用人類副流感病毒之F基因和HN基因取代牛副流感病毒F 基因和HN基因（bPIV/hPIV)，且其中（b)已經將異源序列加至 完整的bPIV基因組中。 本發明亦包括嵌合型病毒，其包括由衍生自bPIV、hPIV 或bPIV/hPIV基因組之核菩酸序列編碼的主鏈，除了異源序 列之外尚含有突變或修改，結果使該嵌合型病毒具有更合 適在疫苗調配時使用的表現型，例如減毒的表現型或增強 的抗原性。根據本發明該特定的具體實施例，在牛PIV3主鏈 前後的異源序列，可以是對bPIV3而言為異源的任何序列。 本發明其他特定的具體實施例是嵌合型病毒，包括由衍 生自人類PIV1、2或3之核甞酸序列編碼的主鏈，其中已經 利用異源序列取代hPIV核甞酸序列，或其中已經將異源序 列加至完整的hPIV基因組中，其限制條件為所得的嵌合型 83860.doc -29 - 1359868 病毒，不是其中血球凝集素-神經胺糖酸甞酶和融合糖蛋白 已經被hPIVl的那些取代的嵌合型hPIV3。本發明亦包括嵌 合型病毒，其包括由衍生自hPIV基因組之核苷酸序列編碼 的主鏈，除了異源序列之外尚含有突變或修改，結果使該 嵌合型病毒具有更合適在疫苗調配時使用的表現型，例如 減毒的表現型或增強的抗原性。 ^ 可使用此項技藝中已知的技術，建構位在病毒聚合酶結 合位置/啟動基因之互補物，例如本發明之3’-PIV病毒終端. 的互補物，或3'-和5'-PIV病毒兩端之互補物側面的異源基因 密碼序列。所得的RNA模板可能具有負-極性，並可含有適 當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。或 者，亦可使用正-極性的RNA模板，其含有適當的終端序列 ，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可選殖含有這些 雜種序列的重組DNA分子，並藉著DNA-指揮之RNA聚合酶 ，像是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核生物 聚合酶，像是聚合酶I及其類似物轉錄，以便在活體外或 在活體内產製具有適當之病毒序列，並給予病毒聚合酶認 知和活性的重組RNA模板。 在一個具體實施例中，本發明之PIV載體表現一、二或三 個編碼抗原多肽和肽的異源序列。在一些具體實施例中， 該異源序列係衍生自相同病毒或衍生自不同病毒。在某些 具體實施例中，將一個以上相同異源核苷酸序列的副本， 插入牛副流感病毒、人類副流感病毒或bPIV/hPIV嵌合型載 體的基因組中。在較佳的具體實施例中，將兩個相同異源 83860.doc -30 - 1359868
核菩酸序列的副本，插入本發明之病毒的基因組中。在一 些具體實施例中，該異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒 ，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒。在特定的具體實施例 中，衍生自間質肺病毒之異源核铝酸序列是間質肺病毒的F 基因。在其他特定的具體實施例中，衍生自間質肺病毒之 異源核苷酸序列是間質肺病毒的G基因。在一些其他的具體 實施例中，該異源核甞酸序列係衍生自呼吸道融合細胞病 毒。在特定的具體實施例中，衍生自呼吸道融合細.胞病毒 之異源核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的F基因。在其他 特定的具體實施例中，衍生自呼吸道融合細胞病毒之異源 核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的G基因。當插入一或多 個異源核苷酸序列時，可操縱每個被插入之副本的插入位 置和基因間區域之長度，並藉著根據下文第4.1.2.節的不同 測定來判定之。
在某些具體實施例中，可藉著逆向遺傳學，在其中利用 嵌合型cDNA或RNA構築體轉移感染的宿主細胞中，達成嵌 合型病毒或表現產物的解救。藉著以DNA-指揮之RNA聚合 酶轉錄適當的DNA序列，來製備本發明之RNA模板。可在 活體外或在活體内，藉著使用DNA-指揮之RNA聚合酶，像 是噬菌體T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核生物聚合 酶，像是聚合酶I，轉錄適當的DNA序列，來製備本發明 之RNA模板。在某些具體實施例中，可在活體外或在活體 内，藉著使用以質體為基礎的表現系統，像是在Hoffmann 等人，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113 中描述 83860.doc -31 - 1359868 的，或單一方向的RNA聚合酶I-聚合酶II轉錄系統，像是在 Hoffmann和 Webster, 2000，J. Gen. Virol. 81:2843-2847 中描 述的，轉錄適當的DNA序列，來製備本發明之RNA模板。 所得的帶負極性之RNA模板，將含有適當的終端序列，其 將使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。或者，亦可使用 正-極性的RNA模板，其含有適當的終端序列，使病毒RNA-合成裝置能夠認出該模板。可藉著具有被DNA-依賴性RNA 聚合酶認出之啟動基因的質體的轉移感染，完成從正極性 之RNA模板中的表現。例如，在T7啟動基因控制之下，編 碼正RNA模板的質體DNA，可與疫苗病毒或禽痘T7系統一 起使用。 可建構二順反子的mRNAs，容許從内部開始病毒序列的 轉譯，並容許從正常的終端開始位置，表現外來蛋白質之 密碼序列，反之亦然。或者，可從内部的轉錄單位表現外 來蛋白質，其中該轉錄單位具有開始位置和聚腺甞酸化作 用位置。在另一個具體實施例中，將外來基因插入PIV基因 内，使得所得的表現蛋白質是融合蛋白質。
在某些具體實施例中，本發明係關於包括本發明之病毒 的三價疫苗。在特定的具體實施例中，可供三價疫苗使用 的病毒是嵌合型牛副流感第3型/人類副流感第3型病毒，其 含有衍生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒或禽肺病毒 的第一個異源核甞酸序列，以及衍生自呼吸道融合細胞病 毒的第二個異源核苷酸序列。在代表性的具體實施例中， 這類三價疫苗將是對下列專一的：（a)人類副流感病毒之F 83860.doc -32 - 1359868 基因和HN基因的基因產物；（b)由衍生自間質肺病毒之異源 核苷酸序列編碼的蛋白質以及（c)由衍生自呼吸道融合細胞 病毒之異源核苷酸序列編碼的蛋白質。在特定的具體實施 例中，第一個異源核苷酸序列是呼吸道融合細胞病毒的F 基因，並將其插入位置1中，而第二個異源核嘗酸序列是人 類間質肺病毒的F基因，並將其插入位置3中。本發明包括多 更多的組合，並在表1中舉例說明一些。可使用禽肺病毒之 F或G基因的其他組合。此外，亦可使用編碼嵌合型F蛋白質 的核甞酸序列（參見前文）。在一些較差的具體實施例中，可 將異源核苷酸序列插入病毒基因組之較高編號的位置中。 表1.在三價疫苗使用之病毒中，異源核苷酸序列的代表性 配置 組合 位置1 位置2 位置1 1 hMPV之F-基因 RSV之F-基因 — 2 RSV之F-基因 hMPV之F-基因 — 3 — hMPV之F-基因 RSV之F-基因 4 — RSV之F-基因 hMPV之F-基因 5 hMPV之F-基因 — RSV之F-基因 6 RSV之F-基因 — hMPV之F-基因 7 hMPV之G-基因 RSV之G-基因 一 8 RSV之G-基因 hMPV之G-基因 — 9 — hMPV之G-基因 RSV之G-基因 10 - RSV之G-基因 hMPV之G-基因 83860.doc -33 - 11 hMPV之G-基因 -— RSV之G-基因 12 RSV之G-基因 — hMPV之G-基因 13 hMPV之F-基因 RSV之G-基因 — 14 RSV之G-基因 hMPV之F-基因 — 15 — hMPV之F-基因 RSV之G-基因 16 — RSV之G-基因 hMPV之F-基因 17 hMPV之F-基因 — RSV之G-基因 18 RSV之G-基因 — hMPV之F-基因 19 hMPV之G-基因 RSV之F-基因 — 20 RSV之F-基因 hMPV之G-基因 — 21 - hMPV之G-基因 RSV之F-基因 22 — RSV之F-基因 hMPV之G-基因 23 hMPV之G-基因 — RSV之F-基因 24 RSV之F-基因 - hMPV之G-基因 1359868 在一些其他的具體實施例中，可改變在異源序列和下游 基因之密碼序列起點之間的基因間區域。例如，在表1中列 舉的每個基因，可具有想要長度的基因間區域。在代表性 的具體實施例中，三價疫苗包括b/hPIV3載體，其具有插入 位置1處之呼吸道融合細胞病毒的F基因，改變了的177個核 苷酸之基因間區域（最初是75個核苷酸，至下游N基因起始 密碼子AUG)，以及插入位置3處之人類間質肺病毒的F基因 ，具有其天然的基因間區域。本發明包括多更多的組合， 因為可根據下文的4.1.2節，操縱每個異源核苷酸序列的插 83860.doc -34 - 入0 在更廣泛的具體實施例中，可設計本發明之表現產物和 嵌合型病毒粒子，創造對抗各種病原，包括病毒抗原 '腫 瘤抗原和涉及自體免疫病症之自體抗原的疫苗。一種達成 該目的的方式，涉及修改現存的PIV基因，使其在它個別的 外部功能部位中，含有外來序列《在異源序列為抗原決定 位或病原的抗原之處，可使用這些嵌合型病毒誘導保護性 免疫反應，對抗從其中衍生出這些決定位的病原。 一種建構這些雜種分子的方法，是將異源核苷酸序列插 入PIV基因組，例如hPiv、bPIV或bPIV/hPIV之DNA補體内 ’而得以使該異源序列位在病毒聚合酶活性所需之病毒序 列’即病毒聚合酶結合位置/啟動基因的側面，在後文中稱 為病毒聚合酶結合位置，以及聚腺:y：酸化作用位置。在較 佳的具體實施例中，該異源密碼序列係位在包括5,和3,終端 之複製啟動基因、基因起點和基因結束序列，以及在5,及/ 或3·終端中發現之包裝信號的病毒序列的側面。在另一種方 法中’可將編碼病毒聚合酶結合位置的寡核甞酸，例如病 毒基因組斷片之3，_端或兩端的補體，與該異源密碼序列連 接’建構雜種分子。在標把序列中放置外來基因或外來基 因的斷片’從前是藉著在標靶序列中出現之適當限制酵素 位置來指揮。然而，最近在分子生物學上的進步，已經大大 地減少了該問題。可經由使用指定位置之突變生成作用（例 如’參見’例如由 Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488描述的技術），迅速地將限制酵素位置放在標靶序列 83860.doc -35 - 1359868 中的任何地方。在下文中描述之在聚合酶連鎖反應（PCR) 技術上的改變，亦容許序列（即限制酵素位置）的指定插入， 並容許輕易地建構雜種分子。或者，可使用PCR反應，製 備重組的模板，而不需要選殖。例如，可使用PCR反應， 製備含有DNA-指揮之RNA聚合酶啟動基因（例如噬菌體T3 、T7或SP6)的雙股DNA分子，以及含有異源基因和PIV聚合 酶結合位置的雜種序列。然後可從該重組DNA中，直接轉 錄RNA模板。在另一個具體實施例中，可藉著使用RNA連 接酶，使指出異源基因之負極性的RNAs與病毒聚合酶結合 位置連接，來製備重組的RNA模板。 此外，可在未轉譯區域中，在HN基因之3’端加入一或多 個核甞酸，與“六的規則”附接，該“六的規則”在成功的病 毒解救中，可能是很重要的。“六的規則’’適用於許多副黏 液病毒，且RNA基因組之核甞酸的數目，必須是6的因數， 才是有功能的。可藉著此項技藝中已知的技術，像是使用 市售的突變生成套組，像QuikChange突變生成套組 (Stratagene)，完成核芬酸的加入。在加入適當數目的核嘗 酸之後，可藉著以適當限制酵素消化，並以凝膠純化，分 離出正確的DNA片段，例如hPIV3 F和NH基因的DNA片段。 可根據在後文之子章節中描述的本發明，使用病毒聚合酶 活性所需之序列和構築體。 4.1.1.欲插入之異源基因序列 本發明包括設計重組的牛或人類副流感病毒，表現一或 多個異源序列，其中該異源序列編碼基因產物或基因產物 83860.doc -36 - 1359868 的片段’其最好是抗原性及/或免疫原 性的。當在本文中使 用“抗原性的”一詞咕 * , J Μ ’意指分子與抗體或MHC分子結合的 能力。“免疫原性的” A > 、 巧意扣分子在宿主中產生免疫反應 的能力。 在較佳的具體實施例中，欲插人之異源核#酸序列係衍 生自負股RNA病毒，包括但不限於流感病毒、副流感病毒 呼吸道融α細胞病毒、哺乳動物間質肺病毒（例如人類間 質肺病毒）和禽肺病毒。在較佳的具體實施例中，欲插入之
/、源序列匕括，但不限於編碼人類PIV之F或ΗΝ基因、RS V 之F基因、流感病毒Α、B4C型之ηα基因、人類之F基 因、禽肺病毒之F基因或其免疫原及/或抗原片段的序列。 在一些具體實施例中，欲插入之異源核甞酸序列係衍生 自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在某些具體實施例中， 欲插入之異源核贫酸序列係衍生自⑷人類間質肺病毒和呼 吸道融w細胞病毒及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞病 毒。 在本發明某些較佳的具體實施例中，欲插入之異源核甞 馼序列係衍生自得自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒的F基 因。在某些具體實施例中，該F基因係衍生自（a)人類間質肺 病毒和呼吸道融合細胞病毒及/或邙）禽肺病毒和呼吸道融 合細胞病毒。 在本發明的某些具體實施例中，欲插入之異源核苷酸序 列為衍生自人類間質肺病毒及/或禽肺病毒的G基因。在某 些具體實施例中，該G基因係衍生自（a)人類間質肺病毒和 83860.doc -37 - 1359868 呼吸道融合細胞病毒及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞 病毒。 在某些具體實㈣中’可將衍生自人類間f肺病毒、禽 肺病毒和呼吸道融合細胞病毒之不同F基因及/或不同“ 因的任何組合，插人本發明之病毒内，其限制條件為在所有 的具體實施例中’至少有-個衍生自人類間質肺病毒或禽 肺病母的異源序列’出現在本發明之重組副流感病毒中。 在某二具體實Μ例中，欲插人之核#酸序列是編碼衍生 自人類間質肺病毒蛋白質的核芬酸序列。在某些其他的 具把實施例中，欲插人之核誓酸岸列是編碼衍生自人類間 質肺病毒之G蛋白質的核#酸序列。在另外的具體實施例中 ，’插之核甘酸序列是編碼衍生自禽肺病毒之F蛋白質的 核苷酸序列。在其他的具體實施例中，欲插入之核苷酸序 列是編碼衍生自禽肺病毒之G蛋白質的核㈣序列。其限制 條件為在所有的具體實施例中，至少有—個異源核芬 =生自間質肺病毒，欲播入之異源讀序列係編碼 呼及道融合細胞病毒的？蛋白質或g蛋白質。 在某-具體實施例中，欲插人之核#酸序列係編 ㈣白質或嵌合型G蛋白質。嵌合Μ蛋白質包括-部分; 自不同病毒的F蛋白質，傻θ χ相胡肪 付 疋人類間質肺病毒、禽肺病毒及 道融合細胞病毒。嵌合型G蛋白質包括-部分得自 不同病毒的G蛋白皙，德θ 』 于目 ^像疋人類間質肺病毒、禽肺病毒及/ ^道縣纟讀病毒。在特定的具㈣施财，該F蛋白 質包括間質肺病毒之F蛋白質的外功能部位，副流感病= 83860.doc -38 - 1359868 F蛋白質的穿透膜功能部位以及副流感病毒之F蛋白質的魯 米那功能部位。 在某些特定的具體實施例中，本發明之異源核苷酸序列 是序列識別1號至序列識別5號、序列識別14號和序列識別 15號中的任一個（參見表16)。在某些特定的具體實施例中， 該核答酸序列編碼序列識別6號至序列識別b號、序列識別 16號和序列識別π號中任一個的蛋白質（參見表16^在某些 特定的具體實施例中’該核甞酸序列編碼序列識別314至 389號中任一個的蛋白質。 至於衍生自呼吸道融合細胞病毒的異源核苷酸序列，參 見’例如PCT/US98/20230，將其全文以引用的方式併入本 文中。 在較佳的具體實施例中，可在本發明之嵌合型病毒内表 現的異源基因序列’包括但不限於編碼病毒之抗原決定位 和糖蛋白的那些，像是流感病毒之糖蛋白，特別是血球凝 集素H5、H7、呼吸道融合細胞病毒之抗原決定位、新城雞 瘟病毒之抗原決定位、引起呼吸道疾病之仙臺病毒（Sendai vmis)和傳染性喉氣管炎病毒（ILVp在最佳的具體實施例中 ，該異源核苷酸序列係衍生自間質肺病毒，像是人類間質 肺病毒及/或禽肺病毒。在本發明另一個具體實施例中，可 設計成在本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但 不限於編碼病毒抗原決定位和病毒糖蛋白，像是B型肝炎病 毒表面抗原、愛氏頓病毒之人或(：型肝炎病毒之表面糖蛋白 、人類礼頭狀瘤病毒、猿病毒5或流行性腮腺炎病毒、西尼 83860.doc -39 - 1359868 羅何病毒（West Nile virus)、登革病毒（Dengue virus)之糖蛋 白、疱疹病毒之糖蛋白、骨髓灰白質炎病毒之VPI以及衍生 自人類免疫缺陷病毒（HIV)，最好是第1型或第2型之序列的 那些。在另外的具體實施例中，可設計成在本發明之嵌合 型病毒内的異源基因序列，包括但不限於編碼馬立克氏 (Marek’s)病病毒（MDV)之抗原決定位、傳染性華氏囊炎病 毒（IBDV)之抗原決定位、雞貧血病毒、傳染性喉氣管炎病 毒（ILV)、禽流感病毒（AIV)、狂犬病、貓白血病病毒、犬瘟熱 病毒、水疱性口炎病毒和豬痘病毒之抗原決定位的那些（參 見 Fields等人（編輯），1991，FUNDAMENTAL VIROLOGY,第 2版，Raven Press, New York,將其全文以引用的方式併入本 文中）。 本發明其他的異源序列，包括編碼為自體免疫疾病所特 有之抗原的那些。這些抗原通常將衍生自哺乳動物組織的 細胞表面、細胞質、核、粒線體及其類似物，包括糖尿病 、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、風濕性關節炎、惡 性貧血、愛迪森氏（Addison's)病、硬皮病、自體免疫萎縮性 胃炎、青少年糖尿病和盤狀紅斑性狼瘡所特有的抗原。 為過敏原之抗原通常包括蛋白質或糖蛋白，包括衍生自 花粉、塵埃、黴、孢子、皮屑、昆蟲和食物的抗原。此外 ，為腫瘤抗原所特有的抗原，通常將衍生自腫瘤組織之細 胞的表面、細胞質、核、胞器及其類似物。實例包括腫瘤 蛋白質所特有的抗原，包括由突變之致癌基因編碼的蛋白 質；與腫瘤有關之病毒蛋白質；以及糖蛋白。腫瘤包括， 83860.doc -40 - 1359868 但不限於從下列類型之癌症衍生的那些：唇、鼻咽、咽和 口腔、食道、θ、結知、直腸、肝臟、贍囊、胰臟、喉、 肺臟和支氣管、皮膚之黑色素瘤 '乳房、子宮頸、卵巢、 膀胱、腎臟、子宮、腦和神經系統的其他部分、甲狀腺、 鈾列腺、睪丸、霍奇金氏（Hodgkin's)症、非-霍奇金氏淋巴 瘤、多發性骨髓瘤和白血病。 在本發明一個特定的具體實施例中，該異源序列係衍生 自人類免疫缺陷病毒（HIV)，最好是人類免疫缺陷病毒]或 人類免疫缺陷病毒-2的基因組◊在本發明其他的具體實施 例中’可將該異源密碼序列插入pIV基因密碼序列中，而得 以表現在PIV病毒蛋白質中，含有該異源肽序列的嵌合型基 因產物。在本發明的這類具體實施例中，該異源序列亦可 何生自人類免疫缺陷病毒，最好是人類免疫缺陷病毒“或 人類免疫缺陷病毒· 2的基因組。 在異源序列為HIV-衍生的案例中，這類序列可包括，但 不限於衍生自env基因（即編碼全部或部分gpl6〇、邱12〇及/ 或gp41之序列）、p〇i基因（即編碼全部或部分逆轉錄酶、核 酸内切酶、蛋白酶及/或接合酶之序列）、gag基因（即編碼全 部或部分P7、P6、p55、pl7/18、p24/25之序列）、⑻⑽ 、nef、vif、vpu、vpr 及/或 νρχ的序列。 在其他的具體實施例中，T設計成在嵌合型病毒内的異 源基因序列’包括編碼具有免疫強化活性之蛋白質的那些 。免疫強化蛋白質的實例，包括但不限於細胞激動素、干 擾素第1型、γ干擾素、菌落刺激因子和介白素_丨、 83860.doc • 41 · 1359868 -5、-6、-12 〇 此外，其他可設計成在嵌合型病毒内之異源基因序列， 包括編碼衍生自細菌之抗原的那些，像是細菌表面糖蛋白 、衍生自真菌的抗原以及衍生自各種其他病原和寄生蟲的
抗原。衍生自細菌病原之異源基因序列的實例，包括但不 限於編碼衍生自下列屬之物種的抗原的那些：沙門氏桿菌 屬（Salmonella)、志賀桿菌屬（Shigella)、衣原體屬 (Chlamydia)、螺桿菌屬（Helicobacter)、耶爾森氏菌屬. (Yersinia)、博德氏菌屬（Bordatella)、假單孢菌屬 (Pseudomonas)、奈瑟菌屬（Neisseria)、豕菌屬（Vibrio)、啥 血桿菌屬（Haemophilus)、黴毁菌屬（Mycoplasma)、鏈黴菌屬 (Streptomyces)、密螺旋體屬（Treponema)、柯克斯體屬 (Coxiella)、艾利希體屬（Ehrlichia)、布氏桿菌屬（Brucella) 、鏈桿菌屬（Streptobacillus)、梭菌螺旋體屬（Fusospirocheta) 、螺菌屬（Spirillum)、膽原體屬（Ureaplasma)、螺旋體屬 (Spirochaeta)、徽漿菌屬、放線菌屬（Actinomycetes)、疏螺 旋體屬（Borrelia)、類桿菌屬（Bacteroides)、奇可莫拉菌屬 (Trichomoras)、布藍漢氏菌屬（Branhamella)、巴斯德菌屬 .(Pasteurella)、梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium)、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)、李士 德菌屬（Listeria)、桿菌屬（Bacillus) 、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix)、紅球菌屬（Rhodococcus)、埃 希桿菌屬（Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella)、假單 抱菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter)、沙雷菌屬（Serratia)、葡 萄球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、軍團 83860.doc -42 - 1359868 菌屬（Legionella)、分枝桿菌屬（Mycobacterium)、變形桿菌 屬（Proteus)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)、腸球菌屬 (Enterococcus)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、摩根菌屬 (Morganella)、莫拉菌屬（Moraxella)、檸檬酸細菌屬 (Citrobacter)、立克次體屬（Rickettsia)、羅查利馬氏體·屬 (Rochlimeae)，以及細菌物種，像是綠膿桿菌（P. aeruginosa) 、大腸桿菌、蔥頭假單胞菌（P. cepacia)、表皮葡萄球菌（S. epidermis)、糞腸球菌（E. faecalis)、肺炎鏈球菌（S. pneumonias)、金黃色葡萄球菌（S. aureus)、腦膜炎奈瑟菌（N. meningitidis)、釀膿鏈球菌（S. pyogenes)、敗血性巴斯德桿 菌（Pasteurella multocida)、梅毒螺旋體（Treponema pallidum) 和奇異變形菌（P. mirabilis) β 衍生自病原性真菌之異源基因序列的實例，包括但不限 於編碼衍生自下列真菌之抗原的那些，像是：新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans);皮炎芽生黴菌（Blastomyces dermatitidis);皮炎艾洛黴菌（Aiellomyces dermatitidis);荚 膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum); 粗球黴菌 (Coccidioidesimmitis);念珠菌屬（Candida)物種，包括白色 念珠菌（C. albicans)、熱帶念珠菌（C. tropicalis)、近平滑念 珠菌（C· parapsilosis)、吉利蒙念珠菌（C. guilliermondii)和克 魯斯念珠菌（C. krusei)，麴菌屬（Aspergillus)物種，包括煙 麴菌（A. fumigatus)、黃麴菌（A. flavus)及黑麴菌（A. niger) ，根黴菌屬（Rhizopus)物種；根毛黴菌屬（Rhizomucor)物種 ;克銀漢黴屬（Cunninghammella)物種；囊托黴菌屬 -43 -
83860.doc 1359868 (Apophysomyces)物種，包括沙氏囊托黴菌（A. saksenaea)、 毛黴菌（A. mucor)和棘子鬚黴菌（A. absidia);申克氏抱子絲 菌（Sporothrix schenckii)、巴西副球黴菌（Paracoccidioides brasiliensis);波迪假黴樣真菌（Pseudallescheriaboydii)、光 滑球擬酵母（Torulopsis glabrata);毛癬菌屬（Trichophyton) 物種、小芽孢菌屬（Microsporum)物種和皮癖菌屬 (Dermatophyres)物種，以及任何目前已知或稍後確認為病 原性的其他酵母菌或真菌》 最後，衍生自寄生蟲之異源基因序列的實例，包括但不 限於編碼衍生自下列物種之抗原的那些：頂複動物門 (Apicomplexa)的成員，像是例如焦蟲屬（Babesia)、弓漿蟲 屬（Toxoplasma)、癔原蟲屬（Plasmodium)、艾美球蟲屬 (Eimeria)、等孢球蟲屬（Isospora)、阿托索漿蟲屬 (Atoxoplasma)、囊等孢球蟲屬（Cystoisospora)、哈蒙蟲屬 (Hammondia)、貝諾蟲屬（Besniotia)、肉抱子蟲屬 (Sarcocystis)、福瑞克蟲屬（Frenkelia)、血變形蟲屬 (Haemoproteus)、白血球抱子蟲屬（Leucocytozoon)、赛利爾 梨衆蟲屬（Theileria)、普金蟲屬（Perkinsus)和孢子蟲屬 (Gregarina spp.);卡氏肺抱子蟲（Pneumocystis carinii);微 孢子門（Microspora)的成員，像是例如小孢子蟲屬（Nosema) 、腸微孢子蟲屬（Enterocytozoon)、腦炎微孢子蟲屬 (Encephalitozoon)、赛普塔塔蟲屬（Septata)、馬拉辛凱蟲屬 (Mrazekia)、純孢子蟲屬（Amblyospora)、阿美森蟲屬 (Ameson)、格留蟲屬（Glugea)、普抱子蟲屬（Pleistophora)和 83860.doc • 44 - 1359868 微孢子屬（Microsporidium spp.);以及奇異抱子蟲門 (Ascetospora)的成員，像是例如單孢子蟲屬（Haplosporidium spp.)，以及包括下列的物種：惡性癔原蟲（Plasmodium
falciparum)、間曰癔原蟲（P. vivax)、卵形癌原蟲（Ρ· ovale) 、三曰癌原蟲（P. malaria);鼠弓黎蟲（Toxoplasma gondii); 墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana)、熱帶利什曼原蟲 (L. tropica)、碩大利什曼原蟲（L. major)、埃塞俄比亞利什 曼原蟲（L_ aethiopica)、杜氏利什曼原蟲（L. donovani)、克氏 錐蟲（Trypanosoma cruzi)、布氏錐蟲（T. brucei)、曼氏住血吸 蟲（Schistosoma mansoni)、埃及住血吸蟲（S. haematobium) 、曰本住血吸蟲（S. japonium);旋毛蟲（Trichinella spiralis) ;班氏吳策絲蟲（Wuchereria bancrofti);馬來布魯線蟲 (Brugia malayli);溶組織内阿米巴（Entamoeba histolytica) ;蟯蟲（Enterobiusvermiculoarus);有鈎絛蟲（Taenia solium) 、無鈎絛蟲（T. saginata);陰道滴蟲（Trichomonas vaginatis) 、人滴蟲（T. hominis)、口腔毛滴蟲（T. tenax);腸梨形蟲 (Giardia lamblia);短小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum) ;卡氏肺抱子蟲、牛焦蟲（Babesia bovis)、分歧焦蟲（B. divergens) ' 田鼠焦蟲（B. microti)、貝氏等抱球蟲（Isospora belli)、人焦蟲（L. hominis);脆弱雙核阿米巴（Dientamoeba fragilis);人盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus);人細蟲（Ascaris lumbricoides);美洲鈎蟲（Necator americanis);十二指腸釣 蟲（Ancylostoma duodenale);糞類圓線蟲（Strongyloides 5161*(：0^1丨8);菲律賓毛細線蟲（€&卩丨11&1^卩11山卩卩丨1^118丨8);廣 83860.doc -45 - 1359868 東血管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis);短小包膜絛蟲 (Hymenolepis nana);闊節裂頭絛蟲（Diphyllobothrium latum) ;細粒棘球絛蟲（Echinococcus granulosus)、多房型棘球絛 蟲（E. multilocularis)；衛氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani)、卡列并殖吸蟲（p. caliensis);中華後睪吸蟲 (Chlonorchis sinensis);描後睪吸蟲（Opisthorchis felineas) 、維氏腹囊雙 口吸蟲（G. viverini)、肝經（Fasciola hepatica) 、疥癬蟲（Sarcoptes scabiei)、人兹（Pediculus humanus);陰. 蟲（Phthirlus pubis)和人膚繩（Dermatobia hominis) ’ 以及任何 目前已知或稍後確認為病原性的其他寄生蟲。 4.1 · 2 ·異源基因序列的插入 可藉著以外來基因完全置換病毒之密碼區，或藉著相同 物的部分置換，或藉著將異源核苷酸序列加至病毒基因組 中，完成將外來基因序列插入PIV之未分斷基因組内的作用 。完全置換可能最好是經由使用PCR-指定之突變生成作用 來完成。簡言之’ PCR-引子A，從5'至3,端，將含有：獨特 的限制酵素位置，像是第ns級的限制酵素位置（即"轉移者 (shifter)”酵素；它認得特定的序列，但切開在該序列上游 或下游的DNA); —片與ριν基因區互補的核苷酸；以及— 片與外來基因產物之羧基·端密碼部分互補的核苷酸。PCR_ 引子B，從5'至3,端，將含有：獨特的限制酵素位置；一片 與PIV基因互補的核站酸；以及一片與外來基因之5,密碼部 分互補的核甞酸。在使用這些引子與外來基因之選殖副本 的PCR反應之後，可切除產物，並使用獨特的限制位置選 83860.doc -46 - 1359868 殖。以第IIS級的酵素消化，並利用經過純化之噬菌體聚合 酶轉錄，將產生含有PIV基因之正確未轉譯末端，並帶有外 來基因插入的RNA分子。在另一個具體實施例中，可使用 PCR-誘發的反應，來製備含有噬菌體啟動基因序列和雜種 基因序列的雙股DNA，而得以直接轉錄RNA模板，不需選 殖。 可將異源核苷酸序列加入或插入本發明之病毒的各種位 置。在一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加入或插入 位置1。在另一個具體實》施例中，將異源核甞酸序列加入或 插入位置2。在另一個具體實施例中，將異源核苷酸序列加 入或插入位置3。在另一個具體實施例中，將異源核甞酸序 列加入或插入位置在另一個具體實施例中，將異源核苷 酸序列加入或插入位置5 ^在另一個具體實施例中，將異源 核·#紅序列加入或插入位置6。當在本文中使用”位置"一詞 時’意指在該異源核苷酸序列在待轉錄之病毒基因組上的 位置，例如，位置1意指它是第一個待轉錄的基因，而位置 2思私^疋第二個待轉錄之基因。在病毒之較低-編號位置 處插入異源核苷酸序列，與在較高-編號位置處的插入相比 較’通常產生較強的異源核苷酸序列表現，是因為跨越病 母基因組存在的轉錄梯度。然而’轉錄梯度亦產生特定比 例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾亂這些比例，並導 致不同量之病毒蛋白質的合成，其可能影響病毒的複製 因此，在選擇插入位置時，必須考量轉錄梯度和複製動力 學。例如，在b/h PIV3載體的位置2處插入異源核苷酸序列 83860.doc -47 - 1359868 ，產生最佳的複製比例和異源基因的表現程度。若想要異 源核甞酸序列的強表現，在較低-編號的位置處插入異源核 苷酸序列，是本發明較佳的具體實施例。在較佳的具體實 施例中，在位置1、2或3處加入或插入異源序列。 當將異源核甞酸序列插入本發明之病毒内時，可改變在 異源基因之密碼序列末端與下游基因之密碼序列起點之間 的基因間區域，而達到想要的效果。當在本文中使用”基因 間區域”一詞時，意指在一個基因之中止信號與下一個下游 開放編閱架構之密碼序列的起始密碼子（例如AUG)之間的 核苷酸序列。基因間區域可包括基因的非-密碼區，即是在 轉錄開始位置與基因之密碼序列的起點（AUG)之間。該非-密碼區天然存在於bPIV3 mRNAs和其他病毒基因中，在表2 中以非-限制性實例說明之： 表2 : bPIV3 mRNAs之非-密碼區的長度_ ...CTT[基因起點] ................. AUG·.. N 45個核甞酸 P 68個核甞酸 Μ 21個核苷酸 F 201個核苷酸 ΗΝ 62個核苷酸 L 12個核苷酸 b/h RSV FI 10個核苷酸 b/h RSV F2 86個核甞酸 b/h RSV FI NP-P 83個核苷酸 83860.doc -48 - 1359868
在各種具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核甞酸 序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為至少10個 核甞酸、至少20個核甞酸、至少30個核苷酸、至少50個核 甞酸、至少75個核苷酸、至少100個核甞酸、至少125個核 苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核苷酸或至少200個核 甞酸。在某些具體實施例中，可彼此獨立地設計在異源核 甞酸序列與下游基因之間的基因間區域，使其長度為最多 10個核苷酸、最多20個核甞酸、最多30個核苷酸、最多50 個核苷酸、最多75個核苷酸、最多100個核苷酸、最多125 個核甞酸、最多150個核甞酸、最多175個核苷酸或最多200 個核甞酸。在各種具體實施例中，亦可彼此獨立地設計在 病毒基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為至少10個 核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少50個核 甞酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少125個核 苷酸、至少150個核苷酸、至少175個核苷酸或至少200個核 甞酸。在某些具體實施例中，亦可彼此獨立地設計在病毒 基因組中想要基因的非-密碼區，使其長度為最多10個核甞 酸、最多20個核苷酸、最多30個核苷酸、最多50個核苷酸 、最多75個核甞酸、最多100個核苷酸、最多125個核甞酸、 最多150個核苷酸、最多175個核苷酸或最多200個核甞酸。 當插入異源核苷酸序列時，可合併使用位置的影響和基 因間區域的操縱，以便達到想要的效果。例如，可在選自 由位置1、2、3、4、5和6處所組成之群的位置，加入或插. 入異源核苷睃序列，並可改變在異源核牮酸序列與下一個 83860.doc -49 - 下游基因之間的基因間區域(參見表3)。在代表性的具體實 施例中，將hRSVF基因插入b/hPIV3載體的位置丨處，並將 在F基因和N基因（即F的下一個下游基因）之間的基因間區 域改為177個核苷酸。本發明包括多更多的組合，並在表3 中舉例顯示其中的一些。 表3.異源核答酸序列之插入模式的實例
10-20
IGRa 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20
IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR IGR 221-240 221-240 241-260 241-260 261-280 261-280 281-300 281-300 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 221-240 241-260 261-280 281-300 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 221-240 241-260 261-280 281-300 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 221-240 241-260 261-280 281-300 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 221-240 241-260 261-280 281-300 a基因間區域，以核苷酸測量 83860.doc -50 - 1359868
依據插入異源核苷酸序列之目的（例如具有強的免疫原 性），可藉著各種指標來判定插入的位置和所插入之異源核 苷酸序列的基因間區域之長度，包括但不限於複製動力學 ，以及藉著下列非-限制性的測定實例，測量到的蛋白質或 mRNA表現程度：溶菌斑測定、螢光-焦點測定、感染中心 測定、轉化測定、終點稀釋測定、電鍍效力、電子顯微鏡 、血球凝集作用、病毒酵素活性的測量、病毒中和作用、 血球凝集抑制作用、補體固定、免疫染色、免疫沉澱和免
疫墨點、酵素連接之免疫吸附測定、核酸檢測（例如南方墨 點分析、北方墨點分析、西方墨點分析）、生長曲線、報告 者基因的使用（例如使用報告者基因，像是綠螢光蛋白質 (GFP)或增強的綠螢光蛋白質（eGFP)，整合到病毒基因組， 以與感興趣之異源基因相同的方式，觀察蛋白質表現）或其 組合。進行這些測定的程序，為此項技藝中已熟知的（參見 ，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本文中），並在 下文的實例章節中，提供非-限制性的實例。 例如，可藉著以本發明之病毒感染培養的細胞，並接著 藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基因 產物專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或藉著北方墨 點分析，使用對該異源序列專一的探針，測量RNA的表現 程度，來判定表現程度。同樣地，可藉著感染動物模式， 並在該動物模式中，測量來自本發明之重組病毒的異源序 83860.doc -51 - 1359868 列的蛋白質表現程度，來判定該異源序列的表現程度。可 藉著從被感染的動物中獲得组織試樣，錢使該組織試樣 接受西方墨點分析或ELISA，使用對該異源序列之基因產物 專的杬體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物模 式’便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，包括但不限於 ELISA’來判定該動物對異源序列之基因產物所產生之抗體 的力價。 因為異源序列可以是與在病毒之基因組中的核苷酸序列 同種的，故應小心地採用確實對該異源序列或其基因產物 專一的探針和抗體》 在某些特定的具體實施例中，可藉著熟諳此藝者已知的 任何技術，判定來自嵌合型b/h PIV3 RSV* b/h piV3 或b/h PIV3 RSV F及hMPV F之RSV或hMPV的F-蛋白質表現 程度。可藉著以本發明之嵌合型病毒，感染培養的細胞， 並藉著例如西方墨點分析或ELISA，使用對hMpV2F蛋白 質及/或G·蛋白質專一的抗體，測量蛋白質的表現程度，或 藉著例如北方墨點分析，使用對人類間質肺病毒之F_基因 及/或G-基因專一的探針，測量RNA的表現程度，來判定f_ 蛋白質的表現程度》同樣地，可使用動物模式，藉著感染 動物，並在該動物模式中，測量F_蛋白質及/或^蛋白質的 含量，來判定該異源序列的表現程度。可藉著從被感染的 動物中獲彳于組織試樣，並使該組織試樣接受西方墨點分析 或ELISA，使用對該異源序列之|?_蛋白質及/或〇_蛋白質專 一的抗體，來測量蛋白質的含量。此外，若使用動物模式 83860.doc -52 - ^59868 包括但不限於 白質所產生之 ，便可藉著任何熟諳此藝者已知的技術， EUSA，來判定該動物對F-蛋白質及/或G_蛋 抗體的力價β 可藉著熟諳此藝者已知的任何技術，判定本發明之重組 病毒的複製速率。 在某些具體實施例中，欲更容易地確認異源序列在病毒 基因組中的最佳位置，以及基因間區域的最佳長度，可使 該異源序列編碼報告者基因。一旦決定最佳的參數，便由 編碼所選出之抗原的異源核-酸序列代替該報告者基因。 在本發明之方法中，可使用任何熟諳此藝者已知的報告者 基因。關於更多的細節，參見45節。 可藉著任何熟諳此藝者已知的標準技術，判定重組病毒 的複製速率。可以病毒的生長速率表示複製速率，並可藉 著將病毒力價對感染後的時間作圖，來判定之。可藉著任 何熟暗此藝者已知的技術，測量病毒力價。在某些具體實 施例中’將含有病毒的懸浮液與易被該病毒感染的細胞一 起培養。可在本發明之方法中使用的細胞類型，包括但不 限於 Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043 (HEL) 細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞或tMK細胞。在將病毒與細 胞一起培養之後’判定被感染細胞的數目。在某些特定的 具體實施例中，病毒包括報告者基因β因此，表現報告者 基因之細胞的數目，代表被感染細胞的數目。在特定的具 體實施例中，病毒包括編碼eGFP的異源核苷酸序列，並使 用FACS判定表現eGFP之細胞的數目，即被該病毒感染之細 83860.doc -53 - 1359868 胞的數目。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的20%。相同的條件意指相同的開始病毒力價 、相同的細胞品系、相同的培養溫度、生長培養基、細胞 數目以及其他可能影響複製速率的試驗條件。例如，在位 置1處帶有RSV之F基因的b/h PIV3的複製速率，最多是 bPIV3之複製速率的20%。 在某些具體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率， 最多是在相同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病 毒的複製速率的5%、最多10%、最多20%、最多30%、最多 40%、最多50%、最多75%、最多80%、最多90%。在某些具 體實施例中，本發明之重組病毒的複製速率，至少是在相 同條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速 率的5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實施例 中，本發明之重組病毒的複製速率，是在相同條件下，從 其中衍生該重組病毒之野外型病毒的複製速率的5%到20% 之間、10%到40%之間、25%到50%之間、40%到75%之間、 50%到80%之間或75%到90%之間。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的20%。相同的條 件意指相同的開始病毒力價、相同的細胞品系、相同的培 83860.doc -54 - 1359868 養溫度、生長培養基、細胞數目以及其他可能影響複製速 率的試驗條件。例如，在bPIV3之位置1處，MPV之F-蛋白 質的異源序列的表現程度，最多是bPIV3之牛F_蛋白質的表 現程度的20%。 在某些具體實施例中，在本發明之重組病毒中的異源序 列的表現程度，最多是在相同條件下，從其中衍生該重組 病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度的5%、最多10% 、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最多75%、最 多80%、最多90%。在某些具體實施例中，在本發明之重組 病毒中的異源序列的表現程度，至少是在相同條件下，從 其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質之表現程度 的5。/◦、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50% 、至少75%、至少80%、至少90%。在某些具體實施例中， 在本發明之重組病毒中的異源序列的表現程度，是在相同 條件下，從其中衍生該重組病毒之野外型病毒的F-蛋白質 之表現程度的5%到20%之間、10%到40%之間、25%到50% 之間、40%到75%之間、50%到80%之間或75%到90%之間。 4.1.3.將異源基因序列插入HN基因内 由單一基因HN，編碼負貴PIV之血球凝集素和神經胺糖 酸苷酶活性的蛋白質。該HN蛋白質是病毒的主要表面糖蛋 白。對各種病毒而言，像是副流感病毒，已經顯示血球凝 集素和神經胺糖酸苷酶蛋白質含有許多抗原位置。結果， 該蛋白質在感染之後，是體液免疫反應的可能標靶。因此 ，以一部分外來的蛋白質取代HN之抗原位置，可提供對抗 83860.doc -55 - 1359868 該外來肤之旺盛的體液反應。若將序列插入hn分子内，並 在HN的外表面上表現它’則它是免疫原性的。例如，可用 衍生自HIV之gpl60的肽來代替HN蛋白質的抗原位置，結果 產生對gpl60和HN蛋白質兩者的體液免疫反應。以不同的 方法’可將外來的肽序列插入抗原位置内，而不刪除任何 病毒的序列。這類構築體的表現產物，可用在對抗外來抗 原的疫苗中’且確實可規避稍早討論的問題，即是重組病 毒在接種疫苗之宿主中繁殖^僅在抗原位置發生取代的完 整HN分予，仍可給予HN功能，並因此容許建構可存活的病 母。因此，該病毒不需添加額外的協助者功能便可生長。 5F可以其他方式將該病毒減毒，以避免任何意外逃脫的危 險。 可進行其他的雜種建構，在細胞表面表現蛋白質或得以 從細胞中釋放它們。作為表面糖蛋白，抓具有運送至細胞 表面所需之胺基-終端的可切開信號序列，以及膜固定所需 .讀基·終端序列。為了在細胞表面上表現完整的外來蛋白 質，可能需要使用這些HN信號，創造雜種蛋白質❶在該情 況下，可以與額外之内部啟動基因分開的融合蛋白質形^ :來表現該融合蛋白質。或者，若只出現運送信號，但缺 •^膜固定功能部位，則可將蛋白質分泌至細胞外。 4· 1.4.二順反子之rna的建構 可建構二順反子的mRNA，容許從内部開始病毒序列 ;，並容許從正常的終端開始以，表現外來蛋白 馬序列。或者，可建構二順反子的mRNA序列，其中從正常 83860.doc -56 - 1359868 ·-、吻的開放編閱架構，轉譯病毒序列，而從内部位置開始 外來序列。可使用某些内部的核糖體進入位置（IREs)序列 應選擇L得足以避免干擾副流感病毒之包裝限制的 序列。因此，為這類二順反子方法所選出的〗res，長度最 好不超過500個核苷酸，而理想的長度是小於25〇個核苷酸 。在特定的具體實施例中，該IRES#衍生自細小核糖核酸 病毒，且不包括任何額外的細小核糖核酸病毒之序列。較 佳的IRES元件包括，但不限於哺乳動物Bip IRES*C型肝炎 病毒IRES。 或者’可從新的内部轉錄單位來表現外來蛋白質，其中 該轉錄單位具有開始位置和聚腺甞酸化作用位置。在另一 個具體實施例中，將外來基因插入PIV基因内，使得所得的 表現蛋白質為融合蛋白質。 4.2.使用重組的01)]^^和1〇^^模板，表現異源基因產物 可使用按照上述製備的重組模板，以各種方式在適當的 宿主細胞中’表現異源基因產物，或創造表現該異源基因 產物的喪合型病毒。在一個具體實施例中，可使用重組的 cDNA ’轉移感染適當的宿主細胞，而所得的rNA可以高程 度指揮該異源基因產物的表現。提供高程度表現之宿主細 胞系統，包括供應病毒功能的連續細胞株，像是以piv重複 感染的細胞株、設計補足PIV功能的細胞株等等。 在本發明另一個具體實施例中，可使用重組模板，轉移 感染表現病毒聚合酶蛋白質的細胞株，以便達成該異源基 因產物的表現。為了這個目的，可利用表現聚合酶蛋白質 83860.doc -57 - 1359868 ，像是L蛋白質的轉化細胞株，作為適當的宿主細胞。可以 類似的方式設計宿主細胞，提供其他的病毒功能，或額外 的功能’像是HN、NP或N » 在其他的具體實施例中，協助者病毒可提供由細胞利用 的RNA聚合酶蛋白質，以便達成該異源基因產物的表現。 在另一個具體實施例中，可利用編碼病毒蛋白質，像是N 或NP、P和l蛋白質的載體，轉移感染細胞。
可使用不同的技術，檢測異源基因產物的表現（參見，例 如 Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY，MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press第25-56頁，將全文以引用的方式併入本文中）。在實 例的測定中，利用甲醇或丙酮，使以病毒感染的細胞變成 可通透的，並與對該異源基因產物升高的抗體一起培養。 然後加入認得第一個抗體的第二個抗體。該第二個抗體通 常與指示劑結合，而得'以用肉眼看到或檢測出該異源基因 產物的表現。 4.3.解救重組的病毒顆粒 為了製備嵌合塑病毒’可使用編碼PIV基因組及/或外來 蛋白質之經過修改的cDNAs、病毒RNAs或RNA ’以+或-義 轉移感染提供複製和解救所需之病毒蛋白質和功能的細胞 。或者，可在藉著編碼PIV基因組及/或外來蛋白質之DNA 或RNA分子轉移感染之前、期間或之後’以協助者病毒轉 移感染細胞。可藉著幾個熟諳此藝者已知的技術’按照在 1992年11月24日發證之美國專利第5,166,057號；在1998年 83860.doc -58 - 1359868 12月2.9日發證之美國專利第5,854,037號；在1996年2月20日 發表之歐洲專利公開案EP 0702085A1 ;在美國專利申請案 第09/152,845號；在1997年4月3日發表之國際專利公開案 PCT WO97/12032 ;在 1996年 11月 7日發表之W096/34625 ; 在歐洲專利公開案EP-A780475 ;在1999年1月21曰發表之 WO99/02657 ;在 1998 年 11 月 26 日發表之 WO98/53078 ;在 1998年1月22曰發表之W098/02530;在1999年4月1曰發表之 W099/15672 ;在 1998年 4月 2 日發表之 WO98/13501 ;在 1997 年2月20日發表之W097/06270以及在1997年6月25日發表之 EPO 780 47SA1中的描述，分別將其全文以引用的方式併入 本文中，在傳染性病毒顆粒内複製並解救合成的重組質體 PIV DNAs和 RNAs。 在本發明的一個具體實施例中，可製備合成的重組病毒 RNAs，其含有由病毒聚合酶認出，以及產製成熟病毒粒子 所需之包裝信號所必要的負股病毒RN A之非密碼區。可使 用許多不同的方法，將逆向遺傳法應用在解救負股RNA病 毒上。首先，從重組的DNA模板中合成重組的RNAs，並在 活體外利用經過純化的病毒聚合酶複合物重建，形成重組 的核糖核蛋白（RNPs)，可用它來轉移感染細胞。在另一種 方法中，若在活體外或在活體内，在合成RNAs的轉錄期間 出現病毒的聚合酶蛋白質，則達成更有效的轉移感染。利 用該方法，可從cDNA質體轉錄合成的RNAs，其在活體外 與編碼聚合酶蛋白質之cDNA質體共同-轉錄，或在活體内 ，在聚合酶蛋白質的存在下轉錄，即在暫時性或在組成上 83860.doc • 59 - 1359868 表現聚合酶蛋白質的細胞中。 在本文描述的其他方法中，可在表現PIV病毒聚合酶蛋白 質的宿主細胞系統中（例如，在病毒/宿主細胞表現系統中； 設計成表現聚合酶蛋白質之經過轉化的細胞株等等），重複 有傳染性之嵌合型病毒的產製，而得以解救有傳染性之嵌 合型病毒。在該例子中，不需使用協助者病毒，因為藉著 所表現之病毒聚合酶蛋白質，提供該功能。
根據本發明，可使用任何熟諳此藝者已知的技術，達成 嵌合型病毒的複製和解救。一種方法涉及在轉移感染宿主 細胞之前，在活體外供應複製所需的病毒蛋白質和功能。 在這類的具體實施例中，可以野外型病毒、協助者病毒、 經過純化之病毒蛋白質，或以重組表現之病毒蛋白質的形 式，提供病毒蛋白質。可在編碼後合型病毒之合成cDNAs 或RNAs的轉錄之前、期間或之後，提供病毒蛋白質。可使 用整個混合物來轉移感染宿主細胞。在另一種方法中，可 在編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs的轉錄之前或期間 ，提供複製所需之病毒蛋白質和功能。在這類的具體實施 例中，可以野外型病毒、協助者病毒、病毒萃取物、合成 之cDNAs或RNAs，其經由感染或轉移感染導入宿主細胞内 ，來表現病毒蛋白質的形式，提供病毒蛋白質。該感染/轉 移感染，係在導入編碼嵌合型病毒之合成cDNAs或RNAs之 前，或與其同時發生。 在特別想要的方法中，設計細胞使其表現PIV病毒的所有 基因，結果可能產生有傳染性的嵌合型病毒，其含有想要 83860.doc -60 - 1359868
的基因型；因此排除了對選擇系統的需求。在理論上，可 利用外來序列代替編碼PIV之結構蛋白質的六個基因中的 任一個，或六個基因中任一個的一部分。然而，該等式的 必要部分為繁殖有缺陷之病毒的能力（因為漏掉或改變正 常的病毒基因產物而變成有缺陷的）。可利用許多可能的方 法，規避該問題。在一種方法中，可使具有突變蛋白質的 病毒生長細胞株中，將該細胞株建構成，或使其在組成上 表現相同蛋白質之野外型版本。以此方式，使該細胞株補 足了病毒中的突變。可使用類似的技術，建構經過轉化的 細胞株，使其在組成上表現任何的PIV基因。可使用這些能 夠表現病毒蛋白質的細胞株，補足在重組病毒中的缺陷， 並藉此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列系統， 來繁殖重組的病毒。
在另一個具體實施例中，可以編碼嵌合型病毒之合成 cDNAs或RNAs的形式，作為遺傳材料，來供應複製所需之 病毒蛋白質和功能，使其與編碼嵌合型病毒的合成cDNA或 RNAs共同-轉錄。在特別想要的方法中，將表現嵌合型病毒 和病毒聚合酶，及/或其他病毒功能的質體，共同-轉移感染 到宿主細胞内。例如，可將編碼野外型或經過修改的基因 組或反基因组之PIV RNA的質體，與編碼PIV病毒聚合酶蛋 白質NP或N、P或L的質體，共同-轉移感染到宿主細胞内。 或者，可藉著使用編碼T7 RNA聚合酶之經過修改的疫苗病 毒安卡拉（Modified Vaccinia Virus Ankara)(MVA)或MVA與 編碼聚合酶蛋白質（N、P和L)之質體的組合，達成嵌合型b/h 83860.doc -61 - 1359868 PIV3病毒的解救。例如，可將MVA-T7或禽痘-T7感染到HeLa 、Hep-2或Vero細胞内。在以MVA感染之後，可將全長.的反 基因組b/h PIV3 cDNA與編碼NP、P和L之表現質體，一起轉 移感染到HeLa或Vero細胞内。接著可收獲細胞和細胞上清 液，並接受單次的冷凍-融解。然後可使用所得的細胞溶胞 產物，在Ι-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（ara C)，一種疫苗病 毒之複製抑制劑的存在下，感染新鮮的HeLa或Vero細胞單 層，產生病毒母液。然後從這些培養盤中收獲上清液和細 胞，冷凍-融解一次，並藉著病毒溶菌斑的免疫染色，使用 PIV3-專一的抗血清，檢測bPIV3病毒顆粒的存在。 其他繁殖重組病毒的方法，可能涉及與野外型病毒共同-培養。這可藉著簡單地取得重組的病毒，並以該病毒和其 他野外型病毒（最好是疫苗品系）共同-感染細胞來進行。野 外型病毒應該補足有缺陷的病毒基因產物，並容許野外型 和重組病毒兩者生長。或者，可使用協助者病毒，供應重 組病毒的繁殖。 在另一種方法中，可在以表現PIV病毒聚合酶蛋白質之重 組病毒共同-感染的細胞中，複製合成的模板。事實上，可 使用該方法，根據本發明來解救重組有傳染性的病毒。為了 這個目的，可在任何表現載體/宿主細胞系統，包括但不限 於病毒表現載體（例如疫苗病毒、腺病毒、桿狀病毒等等） ，或表現聚合酶蛋白質的細胞株中，表現PIV聚合酶蛋白質 (參見，例如Krystal等人，1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713)。再者，表現所有六個PIV蛋白質之宿主細胞 83860.doc -62 - 1359868 、勺心染可旎導致有傳染性之嵌合型病毒顆粒的產生。請 在意有可能建構不改變病毒存活力的重組病毒。這些經過 改變的病毒將能夠生長，且不需協助者的功能便可複製。 4·4.重组病毒的減毒 β進步以遣傳方式設計本發明的重组病毒，以便表現 出減毒的表現型。特別是在將其投予作為疫苗之病毒的個 中本發明之重組病毒表現出減毒的表現型。可藉著任 可一日此藝者已知的方法，完成減毒作用。未與理論結合 例如可藉著在特定之宿主中，使用自然不能完美複製 的病毒（例如在人類中使用牛piV3載體），&藉著相對於病 毒、，野外土 系，降低病毒基因組的複製、降低病毒感染 僧主j田胞的力，或降低病毒蛋白質裝配成有傳染性之病 母、ί的把力，而引起重組病毒的減毒表現型。可使用迷 你基因組（minigen〇me)測定（參見4 5丨節），測試病毒某些序 列的存活力。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法（參見，例如4.5節）， 來測試本發明之重组病毒的減毒表現型。例如，可針對其 感染宿王的能力，或在細胞培養系統中複製的速率，來測 試候選病毒。在某些具體實施例中，可測試重組病毒在動 物模式巾，s秀發病j里學之徵候的能力。病毒在動物模式系 統中，降低誘發病理學之徵候的能力，代表其減毒的表現 型。在特定的具體實施例中，在猴子模式中對鼻感染測試 候選的病毒，並藉著黏液的產生表示。 可將本發明之病毒減毒，而使得一或多個病毒的功能特 83860.doc -63 - 1359868 徵受損。在某些具體實施例中，與從其中衍生該減毒病毒 的病毒之野外型品系相比較，來測量減毒作用。在其他的 具體實施例中，藉著比較減毒病毒在不同宿主系統中的生 長，來判定減毒作用。因此，關於非-限制性的實例，與牛PIV3 在牛宿主中的生長相比較，若降低了牛PIV3在人類宿主中 的生長，便將在人類宿主中生長的牛PIV3稱為減毒的。
在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿主 ，能夠在宿主中複製，而得以產生有傳染性的病毒顆粒。 然而，與野外型品系相比較，減毒的品系生長至較低的力 價，或生長得更慢。可使用任何熟諳此藝者已知的技術， 判定減毒病毒的生長曲線，並將其與野外型病毒的生長曲 線相比較。關於代表性的方法，參見下文的實例章節。在 特定的具體實施例中，減毒的病毒在按照實例3、4、5和10 中描述的條件下，在Vero細胞中，生長至低於105 pfu/毫升 、低於104pfu/毫升、低於103pfu/毫升或低於102pfu/毫升的
力價。 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒（例如嵌合型 PIV3)在人類細胞中，不能像野外型病毒（例如野外型PIV3) 一樣好地複製。例如，減毒的b/h PIV3/RSV F在人類HEP-2 細胞中，不像野外型PIV3或RSV—樣好地複製。然而，減 毒的病毒能夠在缺乏干擾素功能的細胞株，像是Vero細胞 中良好地複製。 在其他的具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿 主、在宿主中複製，並使本發明之病毒的蛋白質插入細胞 83860.doc -64 - 1359868 質膜内，但減毒病毒不能使宿主產生新的有傳染性的病毒 顆粒。在某些具體實施例中，減毒病毒以與野外型哺乳動 物病毒相同的效力，感染宿主、在宿主中複製，並使病毒 蛋白質插入宿主的細胞質膜内。在其他的具體實施例中， 與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了使待插入細胞質膜 内之病毒蛋白質進入宿主細胞内的能力。在某些具體實施 例中，與野外型病毒相比較，減毒病毒降低了在宿主中複 製的能力。可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒 是否能夠感染哺乳動物細胞、在宿主内複製，並使病毒蛋 白質插入宿主的細胞質膜内。關於解釋性的方法，參見4.5 即 0 在某些具體實施例中，本發明之減毒病毒能夠感染宿主 。然而，與野外型哺乳動物MPV相反，減毒的哺乳動物MPV 不能在宿主中複製。在特定的具體實施例中，減毒的哺乳 動物病毒可感染宿主，並可使宿主將病毒蛋白質插入其細 胞質膜内，但減毒病毒不能在宿主中複製。可使用任何熟 諳此藝者已知的方法，測試減毒的哺乳動物MPV是否感染 宿主細胞，並使宿主將病毒蛋白質插入其細胞質膜内。 在某些具體實施例中，與野外型病毒感染相同宿主的能 力相比較，減毒的哺乳動物病毒降低了感染宿主的能力。 可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定病毒是否能夠感 染宿主。關於解釋性的方法，參見4.5節。 在某些具體實施例中，將突變（例如錯義突變）導入病毒的 基因組内，產生具有減毒表現型的病毒。可將突變（例如錯 83860.doc -65 - 1359868 義突變）導入重組病毒的N-基因、P-基因、Μ-基因、F-基因 、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因内。在更特定的具 體實施例中，錯義突變是感冷性的突變。在其他的具體實 施例中，錯義突變是感熱性的突變。在一個具體實施例中 ，移除病毒之P蛋白質的主要磷酸化作用位置。在另一個具 體實施例中，將突變或突變們導入病毒的L基因内，產生感 溫性的品系。 在其他的具體實施例中，在重組病毒的基因組中導入刪 除。在更特定的具體實施例中，可將刪除導入重組病毒的 N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、 G-基因或L-基因内。在特定的具體實施例中，該刪除是在 本發明之重組病毒的M2-基因中。在其他特定的具體實施例 中，該刪除是在本發明之重組病毒的SH-基因中。 在某些具體實施例中，藉著以不同物種之病毒的基因代 替野外型病毒的基因，達成病毒的減毒作用。在解釋性的 具體實施例中，可利用hPIV3的N-基因、P-基因、M-基因、 F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因，分別代替 bPIV3的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在其他解釋性的具體實施例中， 可利用bPIV3的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基 因、SH-基因、G-基因或L_基因，分別代替hPIV3的N-基因 、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因 或L-基因。 在本發明的某些具體實施例中，可修改本發明之重組病 83860.doc -66 - 1359868 毒的前導及/或拖尾序列，獲得減毒的表現型◊在某些較特 定的具體實施例中，相對於野外型病毒，減少前導及/或拖 尾序列的長度至少1個核苷酸、至少2個核：y：酸、至少3個核 苷酸、至少4個核苷酸、至少5値核誃酸或至少6個核苷酸。 在某些其他更特定的具體實施例中，使重組病毒之前導及/ 或拖尾的序列發生突變。在特定的具體實施例中，前導和 拖尾序列是彼此100%互補的。在其他的具體實施例中，前 導和拖尾序列中有1個核苷酸、2個核苷酸、3個核替酸、4 個核甘酸、5個括4酸、6個核嘗酸、7個核:y：酸、8個核:y： 酸、9個核甞酸或10個核：y：酸不是彼此互補的，但剩下的核 甞酸是彼此互補的。在某些具體實施例中，非_互補的核甞 酸是彼此相同的。在某些其他的具體實施例中，非_互補的 核苷酸是彼此不同的。在其他的具體實施例中，若在拖尾 中的非-互補核榇酸是嘌呤，則在前導序列中相對應的核苷 酸亦是嘌呤。在其他的具體實施例中，若在拖尾中的非_互 補核甞酸是嘧啶，則在前導序列中相對應的核芬酸亦是嘌 〇 當使用活減毒疫苗時，亦必須考慮它的安全性。該疫苗 必須不引起疾病。在本發明中，可使用任何使疫苗安全之 此項技蟄中已知的技術。除了減毒的技術之外，可使用其 他技術。一個非-限制性的實例是使用可溶性異源基因，不 能將其併入病毒粒子膜内。例如，可使用可溶基因 的單一副本、缺乏穿透膜和胞液功能部位的RSV基因版本 。因為不能將其併入病4粒予㈣’古文不預#改變該病毒 83860.doc -67 - 1359868 的向性。 可使用各種測定來測試疫苗的安全性。參見下文45節。 特別疋使用薦糖梯度和中和測定。 4.5.測量嵌合型病毒的病毒力價、抗原序列的表現、免 疫原性及其他特徵 可使用任何熟諳此藝者已知的技術，判定本發明之病毒 在細胞培養系統或在個體中的生長速率。在某些具體實施 例中，在以該病毒感染細胞或個體之後的某些時間點，判 疋病母的力價。然後將病毒力價對時間作圖，判定該病毒 的生長特徵。在特定的具體實施例中，藉著從被感染的細 胞或被感染的個體中獲得試樣，製備該試樣之連續稀釋， 並以容許顯現出單一溶菌斑之病毒稀釋程度，感染易感受 該病毒感染的細胞單層，來判定病毒力價。然後可計算溶 菌班，並以每毫升試樣的溶菌斑形成單位來表示病毒力價 可使用任何熟胬此藝者已知的技術，測試減毒活疫苗的 安全性，包括但不限於中和測定和蔗糖梯度測定。 在本發明特定的具體實施例中，藉著在個體中測量對抗 二病母之抗奴的力價，來評估本發明之病毒在個體中的生 長速率未與任何理論結合，在個體中的抗體力價，不僅 反映在該個體中的病毒力價，亦反映抗原性。若病毒的抗 原性是不變的’則可使用在個體中抗體力價的增加，來判 定病毒在該個體中的生長曲線。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，來判定異源基因序 列在細胞培養系統或在個體中的表現。在某些具时施例 83860.doc -68 - 1359868 中，藉著定量轉錄本的含量，來測量異源基因的表現。可 藉著北方墨點分析，或藉著RT-PCR，分別使用對轉錄本專 一的探針或引子，來測量轉錄本的含量。可區別轉錄本和 病毒之基因組，因為病毒為反義之方位，而轉錄本則是有 意義的方位。在某些具體實施例中，藉著定量異源基因之 蛋白質產物的量，來測量異源基因的表現。可藉著西方墨 點分析，使用對該蛋白質專一的抗體，來測量蛋白質的含 量。在特定的具體實施例中，將肽標籤附貼在異源基因上 。可使用對抗該肽標籤的抗體來檢測肽標籤。所檢測到之 肽標籤的含量，代表從異源基因中表現之蛋白質的含量》 或者，可藉著肽標籤來分離從異源基因中表現之蛋白質》 經過純化之蛋白質的含量，與異源基因的表現程度有關。 這類肽標籤，以及分離與這類肽標籤融合之蛋白質的方法 為此項技藝t已熟知的。可使用此項技藝中已知的各種肽 標籤來修改異源基因，包括但不限於免疫球蛋白恒定區、 聚組胺酸序列（Petty, 1996，金屬-螯合親和力層析法 (Metal-chelate affinity chromatography),在 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 冊，編輯 Ausubel 等人，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 中），毅耽甘肤 S-轉移酉每 (GST; Smith，1993, Methods Mol, Cell Bio· 4:220-229)、大腸 桿菌甘露糖結合蛋白質（Guan等人，1987, Gene 67:21-30)、 各種纖維素結合功能部位（美國專利第5,496,934號； 5,202,247號；5，137,819號；Tomme等人，1994，Protein Eng. 7:117-123)，以及 FLAG 抗原決定位（Short Protocols in 83860.doc -69 - 1359868
Molecular Biology，1999，編輯 Ausubel等人，John Wiley & Sons, Inc.，單元10.11)等等。其他的肽標籤可被專一的結合 夥伴認出，並因此有助於藉著對結合夥伴的親和力結合作 用分離，最妤是將該結合夥伴固定及/或放在固體支撐物上 。如同熟諳此藝者所知曉的，可使用許多方法獲得上文-提 及之肽標籤的密碼區，包括但不限於DNA選殖、DNA擴大 和合成方法。一些肽標籤和用來檢測及分離它們的試劑是 可購得的。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，獲得來自個體的試 樣。在某些具體實施例中，該試樣包括鼻抽吸物、咽喉抹 拭物、痰或支氣管-肺泡灌洗液。 4.5.1.迷你基因組構築體 可產製迷你基因組構築體，含有反義報告者基因。本發 明可使用任何熟諳此藝者已知的報告者基因（參見下文 4.5.6.節）。在特定的具體實施例中，報告者基因為CAT。在 某些具體實施例中，報告者基因可位在反-義bPIV3或hPIV3 前導序列的側面，與肝炎δ核酶（Hep-d Ribo)和T7聚合酶終 止（T-T7)信號連接，而bPIV3或hPIV3拖尾序列則在T7 RNA 聚合酶啟動基因之前。 在一個具體實施例中，以協助者噬菌體，例如MVA-T7或 禽痘-T7轉移感染的細胞，提供了 T7 RNA聚合酶的來源。在 另一個具體實施例中，以編碼T7 RNA聚合酶之質體轉移感 染細胞。 在一些具體實施例中，然後以編碼N、P、L基因之質體 83860.doc - 70 - 1359868 和編碼迷你基因組之質體（所有的質體均在T7啟動基因的 控制之下），轉移感染表現Τ7 RNA聚合酶的細胞。在一些其 他的具體實施例中，以編碼Ν、Ρ、L和M2-1基因之質體和編 碼迷你基因組之質體，轉移感染表現Τ7 RNA聚合酶的細胞。 可藉著任何熟諳此藝者已知的方法，測定報告者基因之 表現程度及/或其活性，像是，但不限於在4.5.6節中描述的 方法。 4.5.2.測量感染速率的發生率 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定感染的發生 率，包括但不限於針對感染的存在，測試臨床試樣（例如鼻 抹拭物），例如，可藉著免疫螢光測定（IFA)，分別使用抗 -hMPV-抗原抗體、抗-RSV-抗原抗體、抗-hPIV-抗原抗體， 及/或對異源核甞酸序列之基因產物專一的抗體，來檢測 hMPV、RSV、hPIV或 bPIV/hPIV組份。 在某些具體實施例中，可直接處理含有完整細胞的試樣 ，而沒有完整細胞的分離物應先在許可的細胞株（例如 HEp-2細胞）上培養。在解釋性的具體實施例中，應藉著在 室溫下，以例如300xg離心5分鐘，使培養的細胞上清液澄 清，接著在相同的條件下以PBS，pH 7.4(不含Ca++和Mg++) 沖洗。將細胞小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。 將含有完整細胞的原始臨床分離物與PBS混合，並在室溫下 以300xg離心5分鐘。利用無菌的吸移管尖端，從界面中移 除黏液，並在相同的條件下，以PBS沖洗細胞小球一次以上 。然後將小球再懸浮於少量體積的PBS中，以供分析。將細 83860.doc -71 1359868 胞懸浮液各5-10微升，點在以丙酮沖洗過之12-孔HTC超級 矯正之（supercured)玻片上每個5毫米的孔中，並容許風乾。 在冰冷的（-20°C)丙酮中固定玻片10分鐘。藉著在每孔中加 入PBS-1%BSA，接著在室溫下培養10分鐘，阻斷該反應。 以PBS-0.1 %吐溫-20沖洗玻片三次，並風乾。將各10微升之 以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升的初級抗體試劑， 點在每孔中，並在潮濕的37°C環境下培養該反應30分鐘。 然後以PBS-0.1%吐溫-20廣泛地沖洗玻片，更換三次，並風 乾。將10微升之以阻斷緩衝溶液稀釋至250毫微克/毫升的適 當二級共軛抗體試劑，點在每個個別的孔中，並在潮濕的37 °C環境下培養該反應額外的30分鐘。然後以PBS-0.1%吐溫 -20沖洗玻片，並更換三次。將5微升PBS-50%甘油-10 mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA點在每個反應孔中，並在玻片上覆 上蓋玻片。接著藉螢光顯微鏡，以200X功率，使用B-2A濾 光鏡（EX 450-490毫微米），分析每個反應孔。對獲自未染色 細胞，或僅以二級試劑染色之細胞的自動螢光背景，給陽 性反應評分。藉著在被感染細胞之細胞質中，由小包涵物 點出的明亮螢光，來定出RSV陽性反應的特徵。 4.5.3.測量血清力價 可藉著任何此項技藝中已熟知的方法，判定抗體的血清 力價，例如，但不限於，可藉著三明治ELISA來定量抗體或 抗體片段在血清試樣中的含量。簡言之，ELISA包括利用認 得在血清中之抗體或抗體片段的抗體塗覆微量滴定盤，並 在4°C下過夜。然後在室溫下，以PBS-吐溫-0.5% BSA阻斷 83860.doc -72 - 1359868 这培養盤大约3〇分鐘，使用以pBSBSABSA稀釋之經過純 化的抗體或抗體片段，建構標準曲線，並以pbsbsabsa 稀釋試樣〃—式兩❾，將試樣和標準物加至測定培養盤 的孔中並在至溫下培養大約1小時。接著，以PBS·吐溫沖 洗掉未-結合的抗體，並在室溫下利用經過標示的二級抗體 (例如與辣根過氧化酶共軛的山羊-抗·人類處理已結合 的抗體大約1小時。藉著加入對該標示專一的色原受質，並 測量该受質的周轉率，例如藉著分光光度計，來檢測已標 示之抗體的結合作用。藉著比較試樣之受質周轉率與標準 曲線之受質周轉率，來判定抗體或抗體片段在血清中的濃 度。 4.5.4.攻毒研究 使用該測定來判定本發明之重組病毒和本發明之疫苗， 在動物模式系統’包括棉鼠、敘利亞黃金倉鼠和老鼠 中，預防下呼吸道病毒感染的能力。可藉著靜脈内（ιν)路徑 、藉著肌肉内（IM)路徑或藉著鼻内路徑（IN)，投予該重組病 母及/或疫3。可藉著任何熟諳此藝者已熟知的技術，投予 該重組病毒及/或疫苗。亦使用該測定，使抗體之血清濃度 與降低與該抗體結合之病毒的肺臟力價發生關連。 在第0天，藉著肌肉内注射、藉著靜脈内注射或藉著鼻内 之路徑，以重組病毒或感興趣之疫苗或BSA接種動物組， 包括但不限於棉鼠（棉鼠（Sigm〇d〇n hispidis)，平均重1〇〇克） 和倉鼠（例如敘利亞黃金倉鼠）。在投予本發明的重組病毒或 疫苗之前、同時或之後，以野外型病毒感染動物，其中該 83860.doc • 73 - 1359868 野外型病毒是針對其產製疫苗的病毒。在某些具體實施例 中’在投予本發明之重组病毒及/或疫苗之後至少丨天、至 少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週 、至少2週、至少3週或至少4週，以野外型病毒感染動物。 在較佳的具體實施例中，在投予本發明之重組病毒及/或疫 苗之後21天，以野外型病毒感染動物，在另一個較佳的具 體實施例中’在投予本發明之重組病毒及/或疫苗之後28天 ’以野外型病毒感染動物。 在感染之後，犧牲動物，並收獲牠們鼻部的鼻〒骨組織 及/或肺組織’再藉著適當的測定’例如溶菌斑測定和tcid50 /貝J疋’來判定病毒力價。可使用牛血清白蛋白（Bsa) 毫 克/公斤作為陰性對照組。可使用三明治Elisa，判定在攻 毒時，在血清中的抗體濃度。 4.5.5.臨床試驗 可進一步在正常健康的人類志願者組別中，包括所有年 齡的組別中，就其安全性、耐受性、免疫原性、傳染性和 藥物動力學，評估已經在活體外測定和動物模式中測試過 的本發明之疫苗或其片段。在較佳的具體實施例中，健康 的人類志願者是大約6週大的嬰兒，或較大的兒童和成人。 以經鼻、肌肉内、靜脈内之方式，或藉著肺臟遞送系統， 將單一劑量的本發明之重組病毒及/或本發明之疫苗投予 志願者。在6至60個月齡之血清陰性的兒童中，可能需要多 個劑量的本發明之病毒及/或疫苗。在生命中前6個月，刺 激局部和全身免疫力，並克服母體抗體的中和作用，亦可 83860.doc • 74 - 1359868 能需要多個劑量的本發明之病毒及/或疫苗^在較佳的具體 實施例中，使用在2、4和6週齡時的最初劑量攝生法，以及 在生命第二年開始時的補強劑量。可單獨或與在相當年齡 時所建議之小兒科疫苗一起，投予本發明之重組病毒及/或 本發明之疫苗。 在較佳之具體實施例中，使用雙盲隨機的、安慰劑-對照 •^臨床試驗。在特定的具體實施例中’使用電腦產生的隨 機計畫。例如’將在研究中的每個個體登記為單一的單位 ’並指派獨待的案號。為了登記之目的，將個別處理在一 個家族中的多個個體。在研究期間’將仍使患者/監護人、 個體和研究者不知道個體已被分配到那一個處理組。將由 不知處理組分配的實驗室人員來進行血清學和病毒學的研 九。然而，預期在接種疫苗之後，從鼻沖洗液中獲得疫苗 病毒的分離，將可能使病毒學實驗室的人員確認疫苗。將 血清學和病毒學的人員分開，並將避免血清學組獲得任何 培養結果的知識β 最好在接受本發明的重組病毒及/或本發明的疫苗之前 ’先監視每個志願者至少12小時，並在臨床處接受投藥之 後’將監視每個志願者至少15分鐘1後在投藥後第Μ4 、21、28、35、42、49和56天’以門診病患之方式監視志 願者。在較佳的具體實施例中，在每次接種疫苗之後的第丄 個月以門0病患之方式監視志願者。在整個試驗期間， 將報告與所有疫苗有關的嚴重不利事件。將嚴重不利的事 件定義為1)導致死亡，2)立刻威脅生命的，3)導致永久或實 83860.doc -75 - 1359868 際上的無能’ 4)導致患者住院，或延長現正住院之患者的 住院期間’ 5)導致先天異常’ 6)是癌症或7)是研究疫苗藥量 過多之結果的事件。在第一次接種疫苗的當天（第〇天）開始 報告與疫苗無關的嚴重不利事件’並持續至最後一次接種 疫苗之後30天。在最後一次接種疫苗之後的3〇天報告期間 之後5至8個月’將不再報告與疫苗無關的嚴重不利事件。 在先前的劑量之後，若兒童有與疫苗有關之嚴重不利事件 ，將不再給予疫苗/安慰劑的投藥。並未將任何不利事件視 為是與疫苗有關的’但若擔心，將在決定進行另一次投藥 之前’由臨床研究監視者與醫療監视者先進行討論。 以下列之間隔：（1)在投與本發明之重組病毒及/或本發明 之疫苗的給藥之前；（2)在投與本發明之重組病毒及/或本發 明之疫田的給藥期間，（3)在投與本發明之重組病毒及/或本 發明之疫苗的給藥之後5分鐘、1〇分鐘、15分鐘、2〇分鐘、 30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時 和48小時以及（4)在投與本發明之重組病毒及/或本發明之 疫苗的給藥之後3天、7天、14天、21天、28天、35天、42 天、49天和56天，經由留置套管或直接靜脈穿刺（例如，藉 著使用10毫升紅蓋的真空採血管），收集血液試樣。在特定 的具體實施例中，獲得總共5次抽血（各3·5毫升），分別在投 予疫苗或安慰劑的第一次、第三次和補強給藥之前，以及 在第三次給藥和補強給藥之後大約1個月。容許試樣在室溫 下凝固，並在離心之後收集血清。 就對iu本發明之病毒的品系-專一之血清血球凝集素抑 83860.doc -76 - 1359868 制作用（HAI)抗體含量，測試血清。亦測試其他免疫原性的 指示劑，像是IgG、IgA或中和抗體。可測量對一或多個其 他同時給予之疫苗的血清抗體反應。可藉著ELISA定量在得 自患者之試樣中，對抗本發明之重組病毒及/或本發明之疫 苗所產生的抗體含量。
藉著從在投予本發明之重组病毒及/或本發明之疫苗的 給藥之後，在每個收集間隔處的血清含量，減去給藥前的 血清含量（背景含量），修正在志願者血清中之抗體含量的濃 度。對每個志願者，根據模式-獨立性方法（Gibaldi等人，編 輯，1982，Pharmacokinetics，第 2 版，Marcel Dekker，New York)，從經過修正的血清抗體或抗體片段濃度，計算藥物 動力學參數。
培養在每次投予疫苗/安慰劑之後大約2、3、4、5、6、7 或8天時獲得的鼻沖洗液，檢測本發明之疫苗病毒的排毒。 在較佳的具體實施例中，培養在每次投予疫苗/安慰劑之後 7天時獲得的鼻沖洗液。亦使用鼻咽抹拭物、咽喉抹拭物或 鼻沖洗液，判定在志願者中，在研究期間的任何時間，在 醫學上伴隨著發燒疾病（直腸溫度大於或等於102°F)，及/ 或喉炎、支氣管炎或肺炎而至之其他病毒的存在。將試樣 放在乾冰上運送至指定的研究場所。使用分離和定量本發 明之疫苗病毒的測定，以及使用MAb來確認本發明之疫苗 病毒的免疫染色測定（在下文的實例章節中，提供這類測定 的實例）。可針對其他的病毒和免疫反應，包括IgG、IgA和 中和抗體，測試鼻沖洗液的樣本。 83860.doc •ΊΊ - 1359868 4.5.6.報告者基因
在某些具體實施例中，本發明之方法可使用在組織培養 或在動物模式中，測量報告者基因表現的測定。將報告者 基因的核铝酸序列選殖到病毒内，像是bPIV、hPIV或b/h PIV3，其中⑴改變報告者基因的位置並（ii)變更位在報告者 基因側面之基因間區域的長度。測試不同的組合，判定報 告者基因表現的最佳速率以及包括該報告者基因之病毒的 最佳複製速率。 在某些具體實施例中，產生包含報告者基因的迷你基因 組構築體。在4.5.1節中描述了迷你基因組構築體的建構。 可藉著任何熟諳此藝者已知的技術，判定報告者基因產 物的豐富性。這類技術包括，但不限於北方墨點分析或西方 墨點分析，分別使用對該報告者基因專一的探針或抗體。 在某些具體實施例中，可使用發出可在FACS中檢測到之 螢光信號的報告者基因。可使用FACS來檢測在其中表現該 報告者基因的細胞。 將使用實行本發明之特定觀點的技術，除非另行指定， 由熟諳此藝者例行地實行傳統的分子生物學、微生物學和 重組DNA操縱及產製技術。參見，例如Sambrook，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版；DNA Cloning,第 I和 II冊（Glover編輯，1985);.以及 Transcription and Translation (Hames & Higgins編輯，1984)。 報告者基因產物的生化活性，代表報告者基因的表現程 度。報告者基因活性的總量，亦依據本發明之重組病毒的 83860.doc -78 - I速率。因Λ ’欲狀得自重組病毒之報告者基因的真 現程度，應將總表現程度除以在細胞培養或動物模式 中之重組病毒的力價。 本發明之方*可使用的報告者基因，包括但不、限於在下 表4中列舉的基因： 蛋白質活性&測量 將放射性乙醯基運送至氯黴素或藉 著薄層層析法和放射自顯術檢測 水解無色的半乳糖苷，產生有顏色 的產物 水解無色的尿甘酸’產生有顏色的 產物 乳化蟲榮光素’放出光子 螢光蛋白質，無受質 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 在氧化氫的存在下，氧化3,3，，5,5，-四 甲基聯苯胺，形成有顏色的複合物 與適當受質或與產生發色團之受 質的發光反應 I4 .報告者基因及各個_報告者基因產物的生化特性 ^告者某因 CAT (氣黴素乙醯轉移酶） GAL (b-半乳糖苷酶） GUS (b-尿甘酸酶） LUC (蟲勞光素酶） GFP (綠螢光蛋白質） SEAP (分泌性驗性磷酸酶） HRP (辣根過氧化酶） AP (驗性磷酸酶） 特別可藉著西方墨點分析或北方墨點分析，或任何用來 定量核甞酸序列之轉錄、其mRNA或其蛋白質之豐富性的其 他技術’測量報告者基因的豐富性（參見Sh〇rt Pr〇t〇c〇ls in 83860.doc -79 - 1359868
Molecular Biology，Ausubel等人（編輯），John Wiley & Sons, Inc.，第4版，1999)。在某些具體實施例中，以得自重組病 毒之報告者基因表現的讀出，來測量報告者基因的活性。 為了定量報告者基因產物的活性，可調查報告者基因產物 的生化特徵（參見表4)。測量報告者基因產物之生化活性的 方法，為熟諳此藝者已熟知的。在下文中陳述本發明之方 法可使用之解釋性報告者基因的更詳細說明。 蟲螢光素酶 蟲螢光素酶是在氧和受質（蟲螢光素）存在下發光的酵素 ，並已經在細胞培養、個別細胞、整個生物和基因轉質之 生物中，用於基因表現的真-時、低-光顯影（由Greer & Szalay， 2002，Luminescence 17(1):43-74回顧）〇 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“蟲螢光素酶” 一詞，企圖包括所有的蟲螢光素酶，或衍生自具有蟲螢光 素酶活性之蟲螢光素酶的重組酵素。已經完全定出得自螢 火蟲之蟲螢光素酶基因的特徵，例如得自螢火蟲屬 (Photinus)和絲角螢屬（Luciola)之物種（參見，例如國際專利 公開案第W0 95/25798號的北美螢火蟲（Photinus pyralis)， 歐洲專利申請案第EP 0 524 448號的十字絲角螢（Luciola cruciata)和侧絲角螢（Luciola lateralis)，以及Devine等人， 1993, Biochim. Biophys. Acta 1173 (2):121-132的明格里卡 絲角螢（Luciola mingrelica)。其他真核生物的蟲螢光素酶基 因包括，但不限於海三色堇（sea panzy)(海三色堇（Renilla reniformis)，參見，例如 Lorenz等人，1991，Proc Natl Acad Sci 83860.doc -80 - 1359868
USA 88(10):4438-4442)，以及無翅螢火蟲（無翅螢火蟲 (Lampyris noctiluca)，參見，例如Sula-Newby等人，1996, Biochem J. 3 13:761-767)。細菌的蟲螢光素-蟲螢光素酶系統 ，包括但不限於陸生勞光光桿菌（Photorhabdus luminescens) 的細菌lux基因（參見，例如Manukhov等人，2000，Genetika 36(3):322-30)，和海洋細菌費氏旅菌（Vibrio fischeri)和哈氏 政菌（Vibrio harveyi)(分別參見，例如 Miyamoto等人，1988, J
Biol Chem. 263(26):13393-9和 Cohn等人，1983，Proc Natl Acad Sci USA·，80(1):120-3)。本發明所包括之蟲螢光素酶 ，亦包含在Squirrell等人之美國專利第6,265，177號中描述的 突變種蟲螢光素酶，將其全文以引用的方式併入本文中。 綠螢光蛋白質 綠螢光蛋白質（“GFP”）是238個胺基酸的蛋白質，其中胺 基酸65至67涉及發色團的形成，不需額外的受質或輔因子 來發出螢光（參見，例如Prasher等人，1992，Gene 111 :229-233; Yang等人，1996, Nature Biotechnol. 14:1252-1256 · 和 Cody等人，1993，Biochemistry 32:1212-1218)。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“綠螢光蛋白質” 或“GFP” 一詞，企圖包括所有的GFPs (包括顯示出綠色以外 的顏色的各種形式之GFPs)，或衍生自具有GFP活性之GFPs 的重組酵素。從生物發光的水母（水母（Aequorea victoria)) 中，選殖GFP的天然基因（參見，例如Morin等人，1972, J. Cell Physiol. 77:313-318)。野外型GFP在395毫微米處具有主要的 激發高峰，並在470毫微米處具有次要的激發高峰。在470 83860.doc -81 · 1359868 毫微米處的吸光度高峰，容許使用標準的螢光素異硫代氰 酸酯（FITC)濾紙組來監視GFP含量。已經發現GFP基因的突 變種，可用來增強表現，並修改激發和螢光。例如，以丙 胺酸、甘胺酸、異亮胺酸或蘇胺酸取代在位置65處之絲胺 酸的突變種GFPs ’結果使突變種GFPs在激發最高點出現位 移，並當在488毫微米處激發時，有比野外型蛋白質更大的 螢光（參見，例如Heim等人，1995, Nature 373:663-664;美國 專利第 5,625,048 號；Delagrave 等人，1995，Biotechnology 13:151-154; Cormack等人，1996，Gene 173:33-38和 Cramer等 人，1996, Nature Biotechnol. 14:315-319)。在 488 毫微米處激 發GFP的能力，容許將GFP用於標準螢光激活細胞分類 (“FACS”）設備。在另一個具體實施例中，從水母以外的生 物中分離GFPs，像是但不限於海三色堇，海三色堇。 EGFP是野外型GFP(3-5)的變紅變種，為了在哺乳動物細 胞中更明亮的螢光和更高的表現，而充分運用它。（最大激 發=488毫微米；最大發射=507毫微米）。EGFP編碼GFPmutl ，其含有Phe-64至Leu和Ser-65至Thr的雙-胺基酸取代。EGFP 基因之密碼序列含有超過190個無聲鹼基變化，其與人類的 密碼子-使用偏好一致。 β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶（“b-gal”）是催化b-半乳糖苷，包括乳糖，以及 半乳糖甞類似物鄰-硝苯基-b-D-吡喃半乳糖茹（“ONPG”）和 氯酚紅-b-D-吡喃半乳糖菩（“CPRG”）之水解作用的酵素（參 見，例如 Nielsen 等人，1983 Proc Natl Acad Sci USA 83860.doc -82 - 1359868 80(17):5198-5202; Eustice等人，1991，Biotechniques 11:739-742以及Henderson等人，1986，Clin. Chem. 32:1637-1641)。 b-gal基因非常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是 極穩定的，對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用 有抵抗力，並容易測定。當使用ONPG作為受質時，可利用 分光光度計或微盤讀取器來定量b-gal活性。 當在本文中使用時，關於本發明所使用之"β-半乳糖甞酶 "或"b-gal"—詞，企圖包括所有的b-gals，包括lacZ基因產物 ，或衍生自具有b-gal活性之b-gals的重組酵素。b-gal基因非 常適合作為報告者基因，因為其蛋白質產物是極穩定的， 對於在細胞溶胞產物中之蛋白水解的降解作用有抵抗力， 並容易測定。在ONPG為受質的具體實施例中，可利用分光 光度計或微盤讀取器判定在420毫微米處轉變之ONPG的量 ，來定量b-gal活性。在CPRG為受質的具體實施例中，可利 用分光光度計或微盤讀取器判定在570至595毫微米處轉變 之CPRG的量，來定量b-gal活性。 氣黴素乙臨轉移酶 氯黴素乙醯轉移酶（“CAT”)在哺乳動物細胞系統中，經常 用來作為報告者基因，因為哺乳動物細胞沒有可檢測之含 量的CAT活性。CAT的測定涉及將細胞萃取物與放射性標示 之氯黴素和適當輔因子一起培養，藉著例如薄層層析法 (“TLC”）從產物中分離起始物質，接著是閃燦計數（參見， 例如美國專利第5,726,041號，將其全文以引用的方式併入 本文中）。 83860.doc -83 - 1359868 當在本文中使用時，關於本發明所使用之“氯黴素乙醯轉 移酶”或“CAT”一詞，企圖包括所有的CATs，或衍生自具有 CAT活性之CAT的重組酵素。雖然最好是不需要細胞加工、 放射性同位素和層析分離的報告者系統，將更可接受高輸 貫量的篩選，但在報告者基因之穩定性極為重要的情況下 ’以CAT作為報告者基因可能是較佳的。例如，cat報告者 蛋白質具有大約50小時的在活體内之半衰期，當想要累積 對動力學變化類型之結果時，這是有利的。 分泌性驗性鱗酸酶 分泌性驗性磷酸酶（“SEAP”）酵素是鹼性磷酸酶的截短形 式’其中蛋白質之穿透膜功能部位的切開，容許將其從細 胞中分泌至周園培養基内。 當在本文中使用時’關於本發明所使用之“分泌性鹼性磷 酸酶”或“SEAP”一詞，企圖包括所有的SEAp，或衍生自具 有鹼性磷酸酶活性之SEAP的重組酵素。可藉著各種方法檢 測SEAP活性，包括但不限於測量螢光受質之催化作用、免 疫沉澱法、HPLC和放射檢測。發光法是較佳的，因為它增 加的敏感性勝過熱量檢測法。使用SEAP的優點是不需要細 胞溶解步驟’因為SEAP蛋白質被分泌到細胞外’其有助於 採樣和測定程序的自動化。在p〇Us等人之美國專利第 6,280,94〇號t描述了以細胞為基礎，使用SEAp的測定，可 用在C型肝炎病毒蛋白酶抑制劑之以細胞為基礎的評估中 ’將其全文以引用的方式併入本文中。 4.5.7.細胞培養系統、胚胎卵和動物模式 83860.doc -84 - 1359868
可使用此項技藝中已知的細胞培養系統，繁殖或測試本 發明之病毒的活性（參見，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press 第 25-29頁’將其全文以
引用的方式併入本文中）。這類細胞培養系統的實例’包括 但不限於從動物組織製備的原始細胞培養物（例如衍生自 猴腎、人類胚胎羊膜、腎臟和包皮以及雞或老鼠胚胎的細 胞培養物）；由單一類型之均一族群所組成的二倍體細胞品 系，在染色之前可分裂高達1 〇〇次（例如衍生自人類胚胎的 細胞培養物，像是衍生自人類胚胎肺臟的WI-38品系）；以 及由單一細胞類型組成的連續細胞株，並可在培養中無限 期地繁殖（例如HEp-2細胞、Hela細胞、Vero細胞、L·和3T3 細胞以及BHK-21細胞）。 亦可在雞胚中繁殖本發明之病毒。在受精後5至14天’在 殼上鑽孔，並將病毒注射到適合其複製的地方。 在本發明中可使用任何此項技藝中已知的動物模式’達 成各種目的，像是判定本發明之疫苗的效力和安全性。這 類動物模式的實例包括，但不限於棉鼠（棉鼠（sigmodon hispidis))、倉鼠、老鼠、猴子和黑猩猩。在較佳的具體實 施例中，使用敘利亞黃金倉鼠。 4.5.8.中和測定 可進行中和測定，提出將異源表面糖蛋白併入病毒粒子 内，是否可能產生改變病毒向性表現型之結果的重要安全 性爭論。當在本文中使用時，“向性”一詞意指病毒對特定 83860.doc -85 - 1359868 細胞類型的親和力。通常藉著出現在特定細胞上的細胞受 體’來判定向性’其容許病毒侵人並僅限於該特定細胞類 型。藉著使用異源表面糖蛋白的MAbs (非限制性的實例為 負股RNA病毒的F蛋白質），或包括對抗該異源表面糖蛋白 之抗體的多株抗血清’來進行中和測定。測試不同稀釋度 的抗體，看是否可中和本發明之嵌合型病毒。異源表面： 蛋白不應該以足以導致抗體結合和中和作用的量，出現在 病毒粒子表面上。 4.5.9.蔗糖梯度測定 可藉著使用生化測定，進一步調查異源蛋白質是否被併 入病毒粒子内的問題。可在2〇_6〇%的蔗糖梯度中，分級分 離被感染細胞的溶胞產物，收集各種溶離份，並藉著西方 墨點法，分析異源蛋白質和載體蛋白質的存在與分布。亦 可藉著溶菌斑測定，就高峰病毒力價，測定溶離份和病毒 蛋白質。在下文第23節中提供了蔗糖梯度測定的實例。當 異源蛋白質與病毒粒子結合時，它們將與病毒粒子一起移 動。 4.6·使用歲合型病毒的疫苗調配物 本發明包括含有本發明之經過設計之負股RNA病毒的疫 苗調配物。可使用本發明之重組PIV病毒，作為表現外來抗 原決定位的媒介，該抗原決定位誘導對任何各種病原的保 護性反應。在特定的具體實施例中，本發明包括在疫苗調 配物中使用已經修改的重組bPIV病毒或減毒的hpiv，賊與 對hPIV感染的保護。 、 83860.doc -86 - 1359868 本發明之疫田製品包括多價疫苗，包括二價和三價的疫 苗製品。可以一個表現每個異源抗原序列的pIV載體，或二 或多個分別編碼不同的異源抗原序列之PIV載體的形式，投 予本發明之二價和二價疫苗。例如，可將表現一或多個異 源抗原序列的第一個嵌合型p丨v，與表現一或多個異源抗原 序列的第二個嵌合型PIV—起投予，其中在第二個嵌合型 PIV中的異源抗原序列，與在第一個嵌合型ply中的異源抗 原序列不同。在第一和第二個嵌合型PIV中的異源抗原序列 ’可衍生自相同的病毒，但編碼不同的蛋白質，或衍生自 不同的病毒。在較佳的具體實施例中，在第一個嵌合型PIV 中的異源抗原序列，係衍生自呼吸道融合細胞病毒，而在 第二個嵌合型PIV中的異源抗原序列，係衍生自人類間質肺 病毒。在另一個較佳的具體實施例中，在第一個嵌合型PIV 中的異源抗原序列，係衍生自呼吸道融合細胞病毒，而在 第二個嵌合型PIV中的異源抗原序列，係衍生自禽肺病毒。 在某些較佳的具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物 ’保護對抗由負股RNA病毒引起的感染，包括但不限於流 感病毒、副流感病毒、呼吸道融合細胞病毒和哺乳動物間 質肺病毒（例如人類間質肺病毒）。更特定而言，使用本發明 之疫苗調配物，保護對抗由人類間質肺病毒及/或禽肺病毒 引起的感染》在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配 物，保遵對柷由人類間質肺病毒和呼吸道融合細胞病毒 及/或（b)禽肺病毒和呼吸道融合細胞病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 83860.doc -87 - 1359868 對抗由（a)人類間質肺病毒和人類副流感病毒及/或（b)禽肺 病毒和人類副流感病毒引起的感染。 在某些具體實施例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由（a)人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副 流感病毒及/或（b)禽肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副 流感病毒引起的感染。 在某些具體貫如例中，使用本發明之疫苗調配物，保護 對抗由人類間質肺病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類副流 感病母引起的感染。在某些其他的具體實施例中，使用本 發明之疫田凋配物，保護對抗由禽肺病毒、呼吸道融合細 胞病毒和人類副流感病毒引起的感染。 因為在不同病毒物種之F蛋白質中的高度同種性，關於代 表性的胺基酸序列比較，參見圖丨，故可使用本發明之疫苗 調配物，保護免於與從其中衍生編碼1?蛋白質之異源核站酸 序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性具體實施例中， 該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒A型之異源核甞酸 序列的病毒’並使用該疫苗調配物，保護免於禽肺病毒A 型和禽肺病毒B型的感染。在另一個特定的代表性具體實施 例中’該疫苗調配物含有包括衍生自禽肺病毒C類之異源核 站酸序列的病毒，並使用.該疫苗調配物，保護免於禽肺病 毒C類和禽肺病毒D類的感染"。 本發明包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其可用來 保護對抗PIV、流感、RSV、仙臺病毒、腮腺炎、喉氣管炎 病毒、猿病毒5、人類乳頭狀瘤病毒以及其他病毒和病原。 83860.doc -88 - 1359868 本發明更進一步包括待投予人類和動物的疫苗調配物，其 可用來保護對抗人類間質肺病毒感染和禽肺病毒感染。 在一個具體實施例中，本發明包括可用來對抗家畜致病 原，包括狂犬病病毒、貓白血病病毒（FLV)和犬痕熱病毒的 疫苗調配物。在另一個具體實施例中’本發明包括可用來 保護家畜對抗水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、 豬痘病毒，並進一步保護野生動物對抗狂犬病病毒的疫苗 調配物。 在本文中描述之疫苗和醫藥組合物中，可使用藉著逆向 遣傳方法產製的減毒病毒。亦可使用逆向遺傳技術，為其 他對產生疫苗很重要的病毒基因，設計額外的突變。例如 ，在5'非-密碼區中的突變，可影響mRNA轉譯，咸相信在衣 殼蛋白質中的突變會影響病毒的裝配，而感溫性和感冷性 的突變種，通常具有比親代病毒更低的病原性（參見，例如 Flint 等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM φ Press第670-683頁，將其全文以引用的方式併入本文中）。 可將有用病毒品系變種的抗原決定位，設計在減毒病毒内 β或者，可將完全外來的抗原決定位，包括衍生自其他病 毒或非-病毒病原的抗體，設計在減毒品系内。例如，可將 無關的病毒，像是HIV (gpl60、gpl20、gp41)、寄生蟲抗原 (例如癌疾）、細菌或真菌抗原，或腫瘤抗原，設計在減毒品 系内。或者，可將在活體外改變病毒向性的抗原決定位， 設計在本發明之嵌合型減毒病毒内。 83860.doc -89 - 1359868 幾乎可將任何的異源基因序列建構至本發明之嵌合型病 毒内，以便在疫苗中使用。較佳的是，對任何各種的病原 誘導保護性免疫反應的抗原決定位，或與中和抗體往人， 可由嵌合型病毒表現，或為其一部分的抗原。例如；^建 構至本發明之嵌合型病毒内的異源基因序列，包括但不限 於流感和副流感血球凝集素_神經胺糖酸苷酶，以及融合糖 蛋白，像是人類PIV3的HNw基因。在另一個具體實^例 中，可設計在嵌合型病毒内的異源基因序列，包括編碼具 有免疫強化活性之蛋白質的那些。免疫強化蛋白質的實例 包括，但不限於細胞激動素、干擾素第丨型、γ干擾素、菌 落刺激因子、介白素·！、_2、·4、_5、_6、_12。 此外，可被建構至本發明之嵌合型病毒内，並在疫苗中 使用的異源基因序列，包括但不限於衍生自人類免疫缺陷 病毒（HIV)，最好是第1或第2型的序列。在較佳的具體實施 例中，免疫原性之HIV-衍生肽，可以是建構至嵌合型ριν内 之抗原的來源，然後用它來誘發脊椎動物的免疫反應。這 類HIV-衍生之肽，可包括但不限於衍生自env基因（即編碼 全部或部分gP160、gP120及/或gP41的序列）、ρ〇ι基因（即編 碼全部或部分逆轉錄酶、核酸内切酶、蛋白酶及/或接合酶 的序列）、gag基因（即編碼全部或部分p7、p6、p55、pl7/18 、p24/25 的序列）' tat、rev、nef、vif、vpu、vpr及 /或 VpX 的 序列。 其他的異源序列可衍生自Β型肝炎病毒表面抗原（HBsAg) ;A或C型肝炎病毒表面抗原、愛氏頓病毒的糖蛋白；人類 83860.doc -90 - 1359868 乳頭狀瘤病毒的糖蛋白；呼吸道融合細胞病毒、副流感病 毒、仙臺病毒、猿病毒5或胳腺炎病毒的糖蛋白；流感病毒 的糖蛋白；疱疹病毒的糖蛋白；骨髓灰白質炎病毒的VP1 :諸如細菌和寄生蟲之類非-病毒性病原的抗原決定位，此 外還有很多。在另一個具體實施例中，可表現全部或部分 的免疫球蛋白基因。例如，可將模仿這類抗原決定位的抗-遺傳性型之免疫球蛋白的可變區建構至本發明之嵌合型病 毒内。 其他的異源序列可衍生自腫瘤抗原，並可使用所得的嵌 合型病毒產生對抗該腫瘤細胞的免疫反應，導致腫瘤在活 體内退化。為了治療腫瘤，這些疫苗可與其他治療攝生法 併用，包括但不限於化學治療、輻射治療、手術、骨髓移 植等等。根據本發明，可設計重組病毒，表現與腫瘤有關 的抗原（TAAs)，包括但不限於由T細胞認出的人類腫瘤抗原 (Robbins和 Kawakami，1996，Curr· Opin. Immunol. 8:628-636 ，將其全文以引用的方式併入本文中）、黑色素細胞系統的 蛋白質，包括 gplOO、MART-1/MelanA、TRP-1 (gp75)、酪 胺酸酶；腫瘤專一的廣泛共享之抗原，MAGE-1、MAGE-3 、：BAGE、GAGE-1、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶-V、pl5 ;腫 瘤專一的突變抗原，L凱特寧U-catenin)、MUM-1、CDK-4 ;乳房、卵巢、子宮頸和胰臟癌的非黑色素瘤抗原、 HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、-E7、MUC-1。 在另一個具體實施例中，異源核苷酸序列係衍生自間質 肺病毒，像是人類間質肺病毒及/或禽肺病毒。在另外的具 83860.doc -91 - a實施例巾纟發明之病毒含有兩個不同的異源核苷酸序 / ’、中個何生自間質肺病毒，像是人類間質肺病毒及/ 或禽肺病母❿另—個衍生自呼吸道融合細胞病毒。異源 核芬酸序列編碼個別病毒的⑼白質或G蛋白質。在特定的 具體實施例中，異源核替酸序列編碼嵌合型F蛋白質，其中 ，嵌口聖F蛋白質含有間質肺病毒之f蛋白質的外功能部位 以及副流感病毒之?蛋白質的穿透膜功能部位和魯米那功. 能部位。 可調配活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。活疫 田可此疋IU圭的’因為在宿主中增殖，導致與在自然感染 時所發生〈刺激類似種類和大小的延長刺激，並因此賦與 實質上長期-持續的免疫力。可使用涉及在細胞培養物或在 雞胚之尿囊中繁殖病毒的傳統方法’接著純化，完成這類 ’舌重，且病毒疫旬凋配物的產製。另外，已經證實WIV在人 類中是非-病原性的，該病毒極適合用來作為活疫苗。 關於這一點，為了疫苗而使用遺傳設計的PIV (載體），可能 希望在這些品系中’有減毒特徵的存在。將適當的突變（例如 删除）導入用來轉移感染的模板中，可提供具有減毒特徵的 新穎病毒。例如，可將與感溫性或冷適應性有關的特定誤 義突變，做成删除突變。這些突變應該比與感冷或感溫性 突變種有關的點突變更穩定，且逆轉的頻率應該很低。 或者，亦可建構具有"自殺"特徵的嵌合型病毒。這類病 母在宿主内將僅完成一次，或數次複製。當用來作為疫苗 時，重組的病毒將冗成有限回合的複製，並引起足夠程度 83860.doc -92 - 1359868 的免疫反應’但它將不會在人類宿主中進一步運轉，並引 起疾病。缺乏一或多個PIV基因，或持有突變PIV基因的重 組病毒，將不能經歷成功的連續複製。可在永久表現這類基 因（們）的細胞株中，產製有缺陷的病毒。缺乏必要基因（們） 的病毒將在這些細胞中複製，然而，當投予人類宿主時，它 們將不能完成一回合的複製。這類製品可轉錄和轉譯―在該 不成熟的回合中-·足夠數目的基因，而誘導免疫反應。或者， 可投予較大量的品系，使這些製品得以作為失活的（死的）病 毒疫苗。關於失活的疫苗，最好是以病毒組份之形式來表 現異源基因產物，使基因產物得以與病毒粒子結合。這類 製品的優點是它們含有天然蛋白質，且未經歷藉著福馬林 或其他用來製造死毒疫苗之製劑處理的失活作用。或者， 可將由cDNA製造的突變PIV高度減毒，使其僅可複製數回 合0 在本發明該項觀點的其他具體實施例中，可使用傳統技 術來"殺死，，嵌合型病毒，製備失活的疫苗調配物。失活的 疫苗是”死的”，在意義上來說，已經破壞了它的傳染性。 確實，破壞病毒的傳染性，但不影#其免疫^為了製 備失活的疫苗，可使嵌合型病毒生長在細胞培養物中，或 在雞胚的尿囊中，藉著區域超離心作用純化，藉著甲越或合_ 丙醇酸内自旨失活’並收集之。所得的疫苗通常以肌肉内接 種。 明之疫苗的效力和安全 的細胞和體液反應，保 可使用各種技術來評估根據本發 有效的疫苗是藉著引起適當天生 83860.doc -93 . 1359868 護接種疫苗之個體免於病原引起的疾病，並具有最低副作 用的疫苗。疫苗不得引起疾病。可使用任何能夠測量病毒 之複製，以及接種疫苗之個體的免疫反應的技術，來評估 病毒。在下文的實例章節中提供非_限制性的實例。 4.6.1.本發明之疫苗或免疫原製品的劑量攝生法和投藥 本發明提供疫苗和免疫原製品，包括表現一或多個異源 或非-天然抗原序列的嵌合型PIV。本發明之疫苗或免疫源 製品，包括單一或多價的疫苗’包括二價和三價的疫苗。 本發明之疫苗或免疫原調配物，可用來提供對抗各種病毒 感染的保護。特定而言，本發明之疫苗或免疫原調配物提 供宿主對抗呼吸道感染的保護。
可單獨或與其他疫苗一起投予本發明之重組病毒及/或 疫％或免疫原調配物。較佳的是，與其他提供對抗呼吸道 疾病之保護的疫苗或免疫原調配物’ 一起投予本發明之疫 苗或免疫原調配物，像是但不限於呼吸道融合細胞病毒疫 苗、流感疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次體疫苗、葡萄球菌 疫苗、百日咳疫苗或對抗呼吸道癌症的疫苗。在較佳的具 體實知例中，本發明之病毒及/或疫苗可與在相符年齡建議 之小兒科疫苗同時投予。例如，在2、4或6個月齡時，本發 明之病毒及/或疫苗可與DtaP (IM)、Hib (IM)、骨髓灰白質 炎（IPV或OPV)和B型肝炎（IM)同時投予。在12或15個月齡時 ，本發明之病毒及/或疫苗可與Hib (IM)、骨髓灰白質炎（IPV 或 OPV)、MMRII® (SubQ) ; Varivax® (SubQ)和 B型肝炎（iM) 同時投予。在各種出版物中回顧可與本發明之方法一起使 83860.doc -94 · 1359868 用的疫苗，例如 The Jordan Report 2000，Division of
Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States，將其全文以引用的方式併入本文中。
可將本發明之疫苗或免疫原調配物本身投予個體，或以 醫藥或治療組合物之形式投予。包括佐劑和本發明之免疫 原抗原（例如病毒、嵌合型病毒、突變病毒）的醫藥組合物， 可藉著傳統的混合、溶解、粒化、製造糖衣錠、研磨、乳. 化、包膠、陷入或冷凍乾燥加工的方法來製造。可使用一 或多種在生理學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助 劑，以傳統的方式調配醫藥組合物，其有助於將本發明之 免疫原抗原加工成可在藥學上使用的製品。其中，適當的 調配物將視所選擇的投藥途徑而定。 當本發明之疫苗或免疫原組合物包括佐劑或與一或多種 佐劑一起投予時，可使用的佐劑包括，但不限於無機鹽佐 劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微顆粒佐劑、黏液的佐 劑和免疫刺激性的佐劑。佐劑之實例包括，但不限於氫氧 化鋁、磷酸鋁凝膠、福瑞德氏完全佐劑、福瑞德氏不完全 佐劑、角鯊烯或角鯊烷水包油佐劑調配物、生物可降解和 生物可相容的聚酯類、聚合的微脂粒、三萜系糖：y：或皂角 甞（例如 QuilA和 QS-21，亦以商標 STIMULON、ISCOPREP 販售）、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異穀胺醯胺（蘇 胺醯基-MDP，亦以商標TERMURTIDE販售）、LPS、單磷醯 基脂質A(3D-MLA，亦以商標MPL販售）。 83860,doc -95 - 投予本發明之疫苗或免疫原組合物的個體較好是哺乳動 物，最好是人類，但亦可以是非_人類的動物，包括但不限 於靈長類、牛、馬、绵羊、豬、禽類（例如雞、火雞）、山羊 、貓、狗、倉鼠、老鼠和大鼠。 可使用許多方法’導入本發明之疫苗或免疫原組合物， 包括但不限於口服、皮内、肌肉内、腹腔内、靜脈内、皮
下、鼻内的路徑，並經由劃痕法（經由皮膚的上層劃痕，例 如使用分又的針頭P 關於局部投藥’可將本發明之疫苗或免疫原製品調配成 此項技藝中已熟知的溶液、凝膠、軟膏、乳霜、懸浮液等 等。 至於吸入投藥，可以從加壓包裝或霧化器提供之氣溶膠 噴霧的形式’便利地遞送根據本發明使用之製品，並使用 適當的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四 氟乙燒、二氧化碳或其他適當的氣體。在加壓氣溶膠的案 例中，可藉著提供活門，遞送計量過的含量，來判定劑量 單位。可調配在吸入器或吹藥器中使用的膠囊和藥筒，使 其含有化合物之散劑混合物，以及適當的散劑基底，像是 乳糖或澱粉。 關於注射，可在含水溶液中，最好是在生理學上可相容 的緩衝溶液，像是漢克氏液、林格氏液或生理鹽水緩衝溶 液中’調配疫苗或免疫原製品。該溶液可含有調配劑，像是 懸浮、穩定及/或分散劑。或者’該蛋白質為散劑形式’在 使用之前’利用適當的媒劑，例如無菌無熱原的水重建。 83860.doc -96 - J359868 熟諳此藝者有能力判定投藥用的疫苗或免疫原調配物的 有效含量，特別是㈣在本文中提供的詳細揭示内容。 -開始可從在活體外的測定，估計有效劑量。例如，可 使用此項技藝中已熟知的技術，調配在動物模式中達到誘 導免疫反應的劑量。熟諳此藝者可以在本文中描述的結果 為基礎，輕易地充分運用冑所有動物物種的投藥。可個別 地調整劑量含量和間隔。例如’當用來作為免疫原組合物 時，適當的劑量是當按照上述投藥時，能夠誘發抗體反應 的組合物！。當用來作為疫苗時，可在卜刊週的期間，以 大約1至3個劑量，投予本發明之疫苗或免疫原調配物。較 佳的是以大約2週至大約4個月的間隔，投予〖或2個劑量， 之後定期給予補強的疫苗接種。交替的草案可能適合個別 的動物。適當的齊】量是當按照上述投帛時，能夠使在被免 疫動物中的免疫反應升高，足以保護該動物免於感染至少4 至12個月的疫苗調配物量。一般而言，出現在劑量中之抗 原的，，範圍是從每公斤宿主大約丨微微克到大約1〇〇毫克 ，通系疋從大約10微微克到大約i毫克，而較佳的是從大約 1〇〇微微克到大約i微克，適當的劑量範圍，將視注射路徑 和患者的尺十而改變’但通常範圍是從大約0 · 1毫升到大約5 毫升。 在特疋的具體實施例中，以至少1〇3 TCID5〇、至少1〇4 TCID50、至少1〇5 tcid50、至少1〇6 TCID50之開始單一劑量 才又丁本發明之病毒及/或疫苗。在另一個特定的具體實施 例中，以多個劑量投予本發明之病毒及/或疫苗。在較佳的 83860.doc -97 - 1359868 具體實施例中，使用在2、4和6個月齡時的最初給藥攝生法 ’以及在生命第二年開始時的補強給藥。更佳的是，以多 次給藥攝生法，給予至少105 TCID5G或至少1〇6 tcid5。的每 個劑量。在臨床試驗中，可使用病毒的複製速率作為調整疫 苗劑量的指標。例如，可使用測試病毒複製速率的測定（例 如生長曲線，關於可利用的測定，參見4.5節），比較本發明 之病毒及/或疫苗的複製速率與bPIV3的速率，在先前的研 究中已證實之（參見Clements等人，J. Clin. Microbiol. 29:1175-82(1991); Karron等人，J. lnfect. Dis. 171:1107-14 (1995); Karron等人，Ped. Inf. Dis. J. 5:650-654(1996)。這些 研究顯示牛PIV3疫苗通常是安全的，並為健康的人類志願 者所能完全忍受的’包括成人、6·60個月齡的兒童以及2-6 個月齡的嬰兒。在這些研究中，個體接受至少一個劑量從 103TCID5〇至l〇6TCID5〇的bPIV3疫苗。12個兒童改而接受兩 個劑量的105 TCID5〇 PIV3疫苗代替一個劑量，沒有不利的 影響）。可與bPIV3相比擬的複製速率，暗示在臨床試驗中 可使用可相比擬的劑量。與bPIV3相比較，較低的複製速率 暗示可使用較高的劑量。 下列的實例係用來解釋，而非限制本發明。如下維持在實 例中使用的細胞和病毒：使RSV A2品系和載有牛副流感第 3型/人類副流感第3型之RSV病毒（bPIV3/hPIV3/RSV病毒） ，在健大黴素的存在下生長在在〇pti-MEM (Gibco/BRL)中 的Vero細胞中。使表現噬菌體T7 RNA聚合酶的經過修改之 疫苗病毒安卡拉（MVA-T7)或禽-痘-T7 (FP-T7)生長在雞胚 83860.doc -98 - 1359868 腎臟細胞（SPAFAS)中。將Vero、HeLa和Hep-2細胞維持在補 充有10%胎牛血清（FBS)、2mM L-穀胺醯胺、非-必要胺基酸 和抗生素的 MEM (JRH Bioscienc.es)中。
實例1 :建構並選殖嵌合型牛副流感3/人類副流感3 cDNA 為了以hPIV3的F和HN基因取代bPIV3的那些，將額外的 限制酵素位置導入傳染性的bPIV3 cDNA内，使用指定位置 之突變生成作用，在bPIV3 cDNA的核甞酸位置5041處，導 入獨特的Nhe I位置，並在核嘗酸8529處，導入Sail位置。_ ..馨 以Nhel和Sail限制酵素處理經過修改的全長bPIV3 cDNA， 並藉著凝膠純化作用，分離包括除了 F和HN基因之外所有 病毒bPIV3序列的14 kb DNA片段。 欲獲得hPIV3F和HN基因序列，以hPIV3品系（hPIV3/Tex/ 12〇84/1983)感染1〇公分培養皿的匯合Ver〇細胞。在37。〇下 培養3天之後’收獲細胞，並使用rnA STAT-LS 50 (Tel-Test Inc·)分離總RNA。藉著逆轉錄作用，使用hpIV3專一的寡， 在hPIV3基因組的位置4828處黏接，產生病毒cDNA。藉著 籲 PCR (聚合酶連鎖反應），使用丁叫聚合酶，擴大hPIV3 F和 HN基因。將PCR產物選殖到pT/A τ〇ρ〇選殖載體（Invitr〇gen) 内’並從兩個純種系⑴號和14號）中，定序hPiV3F和HN基 因。序列分析顯示’關於純種系丨丨號，F基因是正確的，但 HN基因含有反常的序列；關於純種系14號，hn基因是正確 的’但F基因含有反常的中止密碼子。因此，藉著以下列方 式混合11號的正確F基因與14號的正確HN基因，建構包含 具有功能之hPIV3 F和HN基因的質體。以Nhe 1和EcoRl消化 83860 -99 - 1359868 兩個hPIV3質體（11號和14號广一個ι·6 kb之片段，藏有分離 自純種系11號的正確F基因，以及一個8.5 kb之片段，含有 分離自純種系14號的正確HN基因和質體序列。連接兩個片 段，產生含有完整hPIV3 F和HN基因的質體。藉著DNA序列 分析證實正確的序列。最後，在非轉譯區域中之HN基因的 3'末端處，加入一個核荅酸，以便滿足“六的規則可藉著 使用QuikChange突變生成套组（stratagene)完成單一核甞酸 的加入’並藉著DNA定序證實之《然後藉著以Nhe 1和Sal 1 消化，分離正確的hPIV3 F和HN基因DNA片段，並以凝膠純 化3.5 kb之DNA片段。 藉著連接上述之藏有bPIV3序列的14.5 kb DNA片段與含 有hPIV3 F和HN基因的3.5 kb DNA片段，建構全長的b/h PIV3嵌合型cDNA (參見圖3)。藉著延伸限制酵素作圖，證 實全長的嵌合型質體DNA。此外，可藉著對兩個含有bpiv3 和hPIV3序列’以及Nhe 1和Sal 1限制酵素位置分別進行 DNA定序，證實嵌合型構築體的Μ/F和HN/L基因接合點。 實例2 :建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒f或〇 cDNAs 的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 為了判定在b/h PIV3基因組之位置1或2中，插入RSV抗原 對病毒複製的影響’將呼吸道融合細胞（RSV)F和G基因選殖 到嵌合型牛副流感3/人類副流感3載體（b/h PIV3載體）的不 同位置内。參見圖4。 為了將外來基因插入牛/人類（b/h) PIV3 cDNA内，藉著指 定位置之突變生成作用’使用QuickChange套組（Stratagene) 83860.doc • 100 - 1359868
，將AvrII限制酵素位置導入b/h PIV3 cDNA質體（Haller等人 ，2000; 2001，這是與在實例5中相同的構築體）内。使用下 列的寡5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3'及其互補物，將一個AvrII位置導入b/h PIV3基因組中 的核苷酸（nt) 104處，使四個核甞酸改變。使用該限制酵素 位置，在病毒基因組的第一個（最靠近3’)位置中插入RSV基 因。使用下列的寡 5'CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCAT
GGAAGACAATG3'及其互補物，將另一個AvrII位置導入在. nt 1774處的N-P基因間區域中，使兩個核苷酸改變。使用該 限制位置，在b/h PIV3之N和P基因之間的第二個位置中插 入RSV基因（圖4)。藉著逆向遣傳學，針對病毒恢復之官能 性，測試在nts 104和1774處藏有AvrII位置的全長b/h PIV3 cDNAs ° RSV G卡匣（N-P基因中止/開始）的建構··使用b/h PIV3 cDNA作為PCR模板，產生DNA片段，其含有bPIV3 N-P基因間 區域，以及RSV G基因的3'端序列。藉著PCR，使用下列的寡 φ ：5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3' 和 5'CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3· 產生該片段。然後使用該片段進行重疊PCR，將RSV G基因 加至bPIV3 N-P基因間區域。至於第二個PCR反應，使用含 有RSV G和F基因的質體作為DNA模板，並使用寡5’CAGCG GATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3，和 從上文之短PCR片段產生的寡作為引子。將所得的含有RSV G基因（其與bPIV3N-P基因間區域連接，並位在AvrII限制酵 83860.doc -101 - 1359868 素位置側面）之PCR片段，選殖到PGEM3内。定出RSV G基 因之序列，證實完整的開放編閱架構和預測之胺基酸序列 的存在。使用在僅藏有bPIV3基因組前5200個核甞酸（1-5 bPIV3)，並以AvrII弄直之繼代純種系内的AvrII限制酵素位 置，將藏有RSV G基因的DNA片段插入第一或第二個位置 内。當在此處和其他實例中使用時，1-5 bPIV3意指牛PIV3 基因組的核甞酸1至5196 (或5200)。在該處有BstBl位置。 RSV F卡匣（N-P基因開始/中止）的建構：藉著PCR，使用. 在RSV F基因之5’和Y端加入AvrII的寡，從全長的bPIV3/ RSV F+G cDNA質體中，分離RSV F基因片段，並導入在nt 1774處藏有AvrII位置，並以AvrII弄直之1-5 bPIV3質體内。 藉著PCR，使用1-5 bPIV3/RSV G2作為模板，分離bPIV3 N-P 基因間區域。使用寡5’GACGCGTCGACCACAAAGAGATGA CCACTATCACC3,和在bPIV3 F基因中黏接的寡，產生含有 bPIV3 N-P基因間區域、AvrII位置和高達nt 5200之bPIV3序 列的PCR片段。以Sail和Nhel消化PCR片段，並加至以Sail 和Nhel處理，並在位置2中藏有RSV F基因的1-5 bPIV3質體 中"欲將含有N-P基因間區域的RS V F基因導入位置1内，使 用AvrII切除1.8 kb RSV F卡匣，並連接到在nt 104處含有 AvrII位置，並以AvrII弄直的1-5 bPIV3内。
建構帶有短基因間區域之RSV F卡匣（N中止/N開始）：藉 著進行PCR反應，使用1-5 bPIV3/RSV F2作為模板，寡 5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAA CCCTAGGACTGTA3·以及在包括AvrllP艮制酵素位置之RSV 83860.doc • 102 - 1359868 F基因5'端上游黏接的寡，完成帶有短N-N基因間區域之 RSV F基因的產製。以AvrII消化含有RSV F基因和短N-N基 因間區域的PCR產物，並導入以AvrII弄直的1_5 bPIV3 nt 104 内。 在藉著限制酵素作圖，證實合宜的方位之後。以SphI和 BssHII消化在第一個位置藏有RSV基因的質體，並分離4 kb (1-5 bPIV3/RSV G1)或 4·8 kb (1-5 bPIV3/RSV FI) DNA片段
。在第二個選殖步騾中，以Sphl-BssHII 15.1 kb之DNA片段 ，加入剩下的b/h PIV3基因組，產生全長的cDNAs。利用SphI 和Nhel切開在第二個位置藏有RSV基因的bPIV3繼代純種 系，並分離5.8 kb (bPIV3/RSV G2)和 6.5 kb (bPIV3/RSV F2) 的DNA片段。在第二個選殖步驟中，以尺寸為14 kb之Nhel-Sphl DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3基因組。在STBL-2細 胞（Gibco/BRL)中繁殖全長的嵌合型b/h PIV3/RSV質體，其 提供高產量的全長病毒cDNA質體。 實例3 :載有呼吸道融合細胞病毒F或G的牛副流感3/人類副 · 流感3，對於在活體外的mRNA產生和蛋白質表現，以及病 毒複製，展現出位置的影響 進行3個實驗，證實在實例2之構築體中的RSVF或G基因 的有效表現，並欲判定在PIV3基因組中之基因揷入的位置 影響。 首先，為了證實由嵌合型病毒表現RSV蛋白質，進行嵌 合型病毒-感染之細胞溶胞產物的西方墨點分析，並以RSV-專一抗血清來探測。參見圖5 A。如下進行西方墨點分析·· 83860.doc -103 - 1359868
以0.1或1.0之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合不足 的Vero細胞。在感染後48小時，移出覆蓋的培養基，並以1 毫升PBS沖洗被感染單層1次。接著以400毫升含有0.05°/〇b-疏基乙醇（Sigma)的Laemmli緩衝溶液（Bio-Rad)，溶解細胞 。在12% Tris-HCl準備好的凝膠（Bio-Rad)上，分離試樣各15 毫升，並使用半-乾的運送細胞（Bio-Rad)將其運送至尼龍膜 。以含有0.5% (體積/體積）之吐溫-20 (Sigma)的PBS [pH 7.6](PBST)沖洗尼龍膜，並在室溫下以含有5% (重量/體積) 奶粉的PBST (PBST-M)阻斷20-30分鐘。在室溫下，將該膜
與在PBST-M中，以1:1000稀釋之RSV F單株抗體（WHO 1269 、1200、1153、1112、1243、1107)的混合物，或在PBST-M 中，以1:2000稀釋之RSV G 10181多株抗體（Orbigen)—起培 養1小時。在以PBST沖洗四次之後，在室溫下將該膜與在 PBST-M中，以1:2000稀釋之二次辣根過氧化酶-共軛的山羊 抗-老鼠抗體（Dako)—起培養1小時。以PBST沖洗四次，並 使用化學發光受質（Amersham Pharmacia)展開，使Biomax φ Light軟片（Kodak)曝光，看到蛋白質譜帶。 與在Vero細胞中降低b/h/RSV fTN-N的複製效率（圖5C， 參見下文）一致，在感染後48小時檢測到的RSVF,含量，大 約比出現在b/h PIV3/RSV F2或野外型RSV A2感染細胞中的 更低10倍（比較跑道2、3和4 ’圖5A)。50 kDa之譜帶代表在 以所有嵌合型病毒和野外型RSV感染之細胞中檢測到的Fi 片段。然而，與野外型RSV相比較，在嵌合型病毒感染細 胞的溶胞產物中，有較多20 kDa F片段的堆積。當以1 .〇的 83860.doc • 104 - 1359868 較高MOI，重複b/hPIV3/RSVFl*N-N感染時（圖5A，跑道1) ，在感染後48小時，b/h PIV3/RSV F1感染細胞中的Fi片段 ，堆積至野外型RSV的含量。在b/h PIV3/RSV F1或b/h PIV3/RSVF2感染細胞中，50kDa和SOkDaF!片段的相對含 量為大約1:5。在以嵌合型病毒感染的細胞中未檢測到F〇， 表示在b/hPIV3/RSVFl和b/hPIV3/RSVF2感染期間，有效 地加工F〇前驅物，如同亦在野外型RSV感染中觀察到的。
在圖 5A 中顯示 RSV G在 b/h PIV3/RSV Gl、b/h PIV3/RSV G2和野外型RSV感染之細胞中的相對表現。檢測到兩個 RSV G的不成熟和糖基化形式，分別移動至大約50 kDa和90 kDa。b/h PIV3/RSV G1感染的細胞，顯示出類似在野外型 RSV感染細胞中看到的RSV G表現程度（跑道1和3，圖5A) 。然而，在b/h PIV3/RSV G2感染的細胞中，RSV G的堆積 比在野外型RSV感染細胞中出現的更多大約2-3倍（跑道2和 3，圖5A)。這些資料集體地顯示嵌合型b/h PIV3/RSV，在 位置1或2處，有效地表現RSV蛋白質。然而，在位置2藏有 RSV基因的病毒，表現較高程度的RSV蛋白質。 接下來，北方墨點分析顯示與藉著西方墨點分析證實之 蛋白質表現結果相關的mRNA轉錄作用，參見圖5B®如下 進行北方墨點分析：使用Trizol LS (Life Technologies) ’從 病毒感染的細胞中製備總細胞RNA。藉著一次紛-氯仿萃取 作用進一步純化RNA，並以乙醇使其沉澱。将RNA小球再 懸浮於焦碳酸二乙酯處理過的水中’並儲存在-80°c下°在 含有1%甲醛的1%瓊脂糖凝膠上分離等量的總RNA，並使用 83860.doc • 105 - 1359868
Turboblotter裝置（Schleicher & Schuell)，移至尼龍膜（Amersham Pharmacia Biotech)上。使墨點與藉著在活體外之轉錄作用 ，使用 DIG RNA標示套組（Roche Molecular Biochemicals)合 成的毛地黃毒^(DIG)-UTP-標示之核糖探針雜交。在68°C 下，在Express Hyb溶液（Clontech)中進行雜交作用12小時。 在68°C下，以2XSSC(lXSSC含有0·015MNaCl與0.015M檸 檬酸鈉）-0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS)沖洗墨點兩次，接著以 0.5XSSC-0.1%SDS 沖洗一次，最後再以 0.1XSSC-0.1%SDS 沖洗。藉著使用DIG-發光檢測套組（Roche Molecular Biochemicals)，檢測來自雜交探針的信號，並藉著使BioMax ML軟片（Kodak)曝光，而得以看到。 b/h PIV3/RSV FTN-N'b/h PIV3/RSV F2>b/h PIV3/RSV G1 和b/h PIV3/RSV G2的北方墨點分析，顯示RSV F或RSV G之 病毒mRNA含量，與觀察到的RSV蛋白質含量頗有關連（圖 5B)。對b/h PIV3/RSV FrN-N觀察到最低含量的RSV F mRNAs，其亦展現出產生最低量的RSV F蛋白質。b/h PIV3/RSV G1產生少量的RSV G mRNAs，結果產生比在b/h PIV3/RSV G2中觀察到更低的RSV G蛋白質含量。 最後，不同病毒（在位置1或位置2處有RSV F或G基因）的 生長，亦與蛋白質表現和RNA轉錄的結果有關連。如下獲 得在圖5C中所示的生長曲線：使Vero細胞生長至90%匯合， 並以 0.01 或 0.1 之MOI，以 b/h PIV3、b/h PIV3 RSV FI、b/h PIV3 RSV G1、b/h PIV3 RSV F2和 b/h PIV3 RSV G2感染。 在3 7°C下培養被感染的單層。在感染後〇、24、48、72、96 83860 -106 - 1359868 和120小時，一起收獲細胞和培養基，並儲存在-7(TC下。 藉著在Vero細胞中的TCID50或溶菌斑測定，判定每個時間 點收獲的病毒力價。TCID5〇測定是在37°C下培養6天之後， 以肉眼檢查CPE，而溶菌斑測定則是在培養5天之後，利用 RSV多株抗血清進行免疫染色，來定量之。
在Vero細胞中，以0.01之MOI，在第一個位置藏有RSV G 或F基因的嵌合型病毒（b/h PIV3 RSV G1和b/h PIV3 RSV
fTn-n)，比起在第二個位置含有RSV基因的病毒，以更慢 的速率複製，產生更低的高學力價，並顯示出較大的遲滯 期。在感染後96小時，b/hPIV3/RSVFTN-N和b/hPIV3/RSV G1的高峰力價，分別為106·7和105_5TCID50/毫升（圖5C)。相 反的，在感染後72和96小時，b/h PIV3/RSV F2和b/h PIV3/RSVG2的高峰力價，分別為10"和107 4 TCID50/毫升（ 圖5C)。b/h PIV3對照組病毒，展現出108 ()TCID50/毫升的高 峰力價（圖 5C)。b/h PW3/RSV F2 產生比 b/h PIV3/RSV F1*N-N 更高 1.3 log10的力價。b/h PIV3/RSV G2複製比 b/h φ PIV3/RSV G1更高1.9 logl0的力價。結果表示與在第二個位 置藏有RSV基因的嵌合型病毒相比較，在第一個位置藏有 RSV基因的嵌合型病毒，延遲開始在活體外複製。 欲判定到底能不能達到b/h PIV3/RSV F1_N-N和b/h PIV3/RSVG1的較高力價，以0.1的較高MOI，重複生長曲線 。在 0.1 之MOI時，b/hPIV3/RSVFrN-N和 b/hPIV3/RSVGl 的高辛力價增加0.5至1.3 log 1〇 (資料未顯示）。在生長週期中 ，較早降低了這些病毒的遲滞期，並達到高峰力價。 83860.doc -107 - 1359868 實例4 :在牛副流感3/人類副流感3基因組中插入eGFP，對 病毒複製的位置影響
藉著實質上在PIV3的所有基因之間，導入eGFP基因，並 觀察對病毒複製和eGFP表現的影響（圖6)，系統性地評估將 基因插入牛/人類PIV3載體主鏈中的影響。這類型的測定調 查對副黏液病毒所觀察到之轉錄梯度的重要性，其產生特 定比例的病毒mRNAs。外來基因的插入將擾亂這些比例， 結果合成不同含量的病毒蛋白質，其可影響病毒的複製。 為了該測定選出eGFP基因，因為它不會被併入病毒粒子的 膜内，並因此應該不干擾病毒的加工，像是包裝、出芽、 侵入等等。將eGFP基因插入b/h PIV3基因組的四個位置内 ，其中三個是eGFP表現和病毒複製所特有的。將eGFP基因 卡匣與bPIV3 N-P基因間區域連接。b/h GFP1在b/h PIV3基 因組最接近3'的位置中，藏有eGFP基因卡匣。b/h PIV3/GFP2 在b/h PIV3基因組的N和P基因之間，含有eGFP基因卡匣。 b/h PIV3/GFP3 則是在 P和 Μ之間，b/h PIV3/GFP4 是在 b/h φ PIV3的Μ和F之間，含有eGFP基因（圖6)。 eGFP基因卡E的建構：eGFP基因的模板是市售的，例如
可從BD Biosciences (pIRES2-EGFP)或 Clontech (pEGFP-Nl) 購買。參見Hoffmann 等人，Virology 267:310-317 (2000)。藉 著PCR分離eGFP基因，並藉著使用重疊PCR法，使用下列的 寡：5，ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3'、5OGACGA GCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3,和 5'CTA CCTAGGTGAATCTTTGGTTG3’，加入bPIV3 N-P基因間區域 83860.doc -108 - 1359868 。將eGFP卡匣插入PCR2.1内，定序，並證實堅守六的規則 。然後以AvrII消化eGFP卡g，凝膠純化，並按照下述插入 b/h PIV3的位置1、2、3和4内。
產生在位置1和2處藏有eGFP基因的全長cDNAs :將eGFP
基因卡匣插入含有從nts 1至5200之bPIV3序列，並在ntl04 (位 置1)或nt 1774 (位置2)處含有AvrII限制酵素位置的1-5 bPIV3質體内。在藉著限制酵素作用證實合宜的方位之後， 以Sphl和BssHII消化在第一個位置藏有eGFP基因的質體， 並分離4 kb (1-5 eGFPl) DNA片段。接著，以 Sphl-BssHII 15.1 kb之DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3基因組，產生全長的 cDNAs。至於在第2個位置中包括eGFP之全長cDNA的產製 ，以SphI和Nhel切開在第二個位置藏有eGFP基因的bPIV3 繼代純種系，並分離5.8 kb (1-5 eGFP2) DNA片段。接下來 ，以尺寸為14 kb的Nhel-SphI DNA片段，加入剩餘的b/h PIV3 基因組。在STBL-2細胞（Gibco/BRL)中繁殖全長的嵌合型b/h PIV3/eGFP質體，其提供高產量的全長病毒cDNA質體》 產生在位置3和4處藏有eGFP基因的全長cDNAs :為了將 eGFP卡匣插入b/hPIV3基因組的位置3内，在含有bPIV3nts 1-5200之繼代純種系的P-Μ基因間區域中，在nt 3730處導入 AvrII限制酵素位置，改變兩個核菩酸。在QuickChange PCR 反應中使用下列的寡及其互補物·· ,5'GGACTAATCAATCCTA GGAAACAATGAGCATCACC3'，導入 AvrII位置。以AvrII 消 化eGFP卡匡，並連接到以AvrII弄直，在nt 3730處藏有AvrII 位置的1-5 bPIV3繼代純種系内。從含有GFP之繼代純種系 83860.doc -109 - 1359868 中，分離從SphI至Nhel的5.5 kb DNA片段，並導入以SphI 和Nhel消化的b/h PIV3 cDNA内，產生全長的質體。為了將 eGFP基因卡匣加至b/hPIV3基因組的位置4内，產製含有從 nts 1-8500之b/h PIV3序列的繼代純種系。以Nhel (nt 5042)
弄直該純種系，並插入含有可相容之AvrII末端的eGFP卡匣 。然後以SphI和Xhol消化藏有eGFP卡匣的繼代純種系，並 分離7.1 kb之DMA片段。以SphI和Xhol處理b/h PIV3質體，產 生11 kb之片段。連接這兩個DNA片段，產生b/h PW3/GFP4 ό 以兩種方式評估b/h PIV3/GFP1、2和3所產生的eGFP量。 首先使用螢光顙微鏡，判定以0.1和0.01之MOI，利用b/h PIV3/GFP1、2和3感染Vero細胞20小時時，所產生之綠細胞 的量（圖7A)。"b/h PIV3/GFP3產生的綠細胞，明顯比b/h PIV3/GFP1 或 2更少。 其次，對被慼染的細胞進行西方墨點分析，並以GFP MAb 和PIV3 PAb探刻墨點。最初的觀察證實b/h PIV3/GFP3產生 戲劇化少量的eGFP蛋白質（圖7B)。b/h PIV3 GFP1和GFP2產 生類似含量的eGFP蛋白質。西方墨點法控制相同的裝載體 積，以供使用PIV3抗體探測（圖7B)。有趣的是，所有的三 種病毒均顯示產生類似含量的PIV3蛋白質（HN蛋白質是最 突出的譜帶）》這些結果暗示與位置1和2相比較，b/h PIV3/GFP3在位置3轉錄較少的GFP mRNAs。該資料證實了 在副黏液病毒_，存有病毒mRNAs的轉錄梯度。PIV3 HN 蛋白質的產量，不受eGFP基因插入的影響（圖7B)。 為了判定GFP基因插入是否對b/h PIV3/GFP1、2和3之病 83860.doc -110 - 1359868 毒複製的動力學有影響，在Vero細胞中進行多回合的生長 曲線（圖7C)。生長曲線顯示b/h PIV3/GFP1在感染後24和48 小時，具有比b/hPIV3/GFP2或GFP3延遲發生的病毒複製。 然而，所有三種病毒最後獲得的高峰力價是類似的。b/h PIV3/GFP2和GFP3的複製動力學，幾乎是相同的（圖7C)。有 趣的是，改變了的病毒mRNAs比例，似乎未顯著地影響病 毒複製。 實例5 :建構並選殖載有呼吸道融合細胞病毒F與不同基因 一_ 間區域的嵌合型牛副流感3/人類副流感3 使用三種不同的構築體’判定基因間區域（在每個mRNA 之間的核苷酸，例如在F基因和N基因之間的核苷酸）對蛋白 質表現和病毒複製的影響。參見圖8。第一個構築體是在位 置1中載有RSV fTN-N的b/h PIV3，其具有較短的bPIV N基 因中止/N基因開始序列（RSV FrN-N ’在圖4中）；第二個構 築體是在位置1中載有RSVF的b/hPIV3(RSVF2 ’在圖4中） ;而最後一個是在位置1中載有RSV的b/hPIV3 (RSVF卜在 籲 圖4中）。根據在第6節’實例2中描述的選殖策略’產製所 有三種構築體。 在兩個卡匣之間最戲劇化的差異，是在b/h PIV3/RSV F1 *N-N中，在N基因開始序列與N轉譯開始密碼子之間的距 離，它僅有10個核嘗酸長。相反的’在PIV3/RSV F2中 ，該距離為86個核苷酸長。另一個差異是在b/h PIV3/RSV F1*N-N中使用N基因開始序列，而非在b/h PIV3/RSV F2中 使用的P基因開始序列。為了判定在病毒轉錄單元之轉錄基 83860.doc -111 _ 1359868 因起點和轉譯起點之間的距離，是否影響病毒的複製，產 製b/hPIV3/RSVFl構築體，其含有與b/hPIV3/RSVF2所使 用的相同的RSV F基因卡匣。 實例6 :在呼吸道融合細胞病毒基因下游之基因間區域的長 度及/或性質，對病毒複製的影響 在下列的實驗中’使用在實例5中的三種構築體，判定基 因間區域對病毒蛋白質表現和病毒複製的影響。參見圖9。 首先，使用西方墨點分析，在以0.1之MOI感染Vero細胞 後 24和 48 小時，比較 b/h PIV3/RSV F 卜 b/h PIV3/RSV F1 ·Ν-Ν 和b/h PIV3/RSV F2的RSV F蛋白質表現。如下進行西方墨點 分析：以0.1之MOI，使用嵌合型病毒感染（70-80%)匯合不 足的Vero細胞。在感染後24和48小時，移出覆蓋的培養基 ，並以1毫升PBS沖洗被感染的單層1次。接著以400毫升含 有0.05% b-巯基乙醇（Sigma)的Laemmli緩衝溶液（Bio-Rad) ，溶解細胞。在12%Tris-HCl準備好的凝膠（Bio-Rad)上，分 離試樣各15毫升，並使用半-乾的運送細胞（Bio-Rad)將其運 送至尼龍膜β以含有0.5% (體積/體積）之吐溫-20 (Sigma)的 PBS (pH 7.6)(PBST)沖洗尼龍膜，並在室溫下以含有5% (重 量/體積）奶粉的PBST (PBST-M)阻斷20-30分鐘。在室溫下， 將該膜與在PBST-M中’以PBST-M稀釋1:1000之RSVF單株 抗體（WHO 1269、1200、1153、1112、1243 ' 1107)的混合 物，一起培養卜】、時。在以PBST沖洗四次之後，在室溫下將 該膜與在PBST-Μ中，以1:2000稀釋之二次辣根過氧化酶-共輛的山羊抗-老鼠抗體（Dako) —起培養1小時。以PBST沖 83860.doc -112 - 1359868 洗四次，並使用化學發光受質（Amersham Pharmacia)展開， 使Biomax Light軟片（Kodak)曝光，看到蛋白質譜帶。 在感染後24和48小時，b/h PIV3/RSV F1表現的RSV尸,蛋 白質含量，接近對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的含量，但比 b/h PIV3/RSV F1‘N-N的那些高很多。因此，在基因開始元
件與轉譯開始密碼子之間的間隔，對病毒複製可能是很重 要的。將N基因開始序列變更成P基因開始序列，然而，該 變更僅招致單一核苷酸的改變。這些因素中任一個，可能 負責解救RSV F蛋白質表現的表現型。 接下來，進行多回合的生長曲線，以便在以0.1之MOI感 染的 Vero細胞中，比較b/h PIV3/RSV FI、b/h PIV3/RSV FTN-N和b/h PIV3/RSV F2之病毒複製的動力學（參見圖9B) ，如下進行之：使Vero細胞生長至90%匯合，並以0.1之MOI ，利用 b/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1*N-N、b/h PIV3/RSV F1 和b/h PIV3/RSV F2感染。在37°C下培養被感染的單層。在 感染後0、24、48、72和96小時時，一起收獲細胞和培養基 鲁 ，並儲存在-70°C下。藉著在Vero細胞中的溶菌斑測定，判 定每個時間點收獲的病毒力價。溶菌斑測定是在培養5天之 後，利用RSV多株抗血清進行免疫染色，來定量之》 如同在圖9B中所示，與b/h PIV3/RSV F2相比較，延遲了 b/h PIV3/RSV fTN-N的複製發生，且高峰力價較低。相反 的，PIV3/RSV F1展現出與對b/h PIV3/RSV F2所觀察到的幾 乎相同的生長曲線。 實例7 :選殖三價載有牛副流感3/人類副流感3的構築體 83860.doc • 113 · 1359868 下列的實例係關於三價疫苗的產製，它藏有hPIV3之表面 糖蛋白（F和HN)、RSV F和hMPV F，以便使用單一的活減毒 病毒疫苗，保護兒童免於由RSV、hMPV和hPIV3引起的疾 病。此等三價病毒藉逆向遺傳回收。 如下進行兩個病毒基因組的建構（參見圖1〇)，其分別包括 帶有兩個額外之異源序列插入的嵌合型b/h PIV3主鏈，其中 一個異源核甞酸序列係衍生自間質肺病毒F基因，而另一個 異源核甞酸序列係衍生自呼吸道融合細胞病毒F基因：以 SphI和 Nhel消化質體b/h PIV3/RSV F2或b/h PIV3/hMPV F2 ，並分離6.5 1<:1)之片段。以8卩111和]^1^1消化1)/11?1¥3 118¥?1 或 b/h PIV3/hMPV F1 的全長 CDNA，並分離 14.8 kb之DNA片 段，再將其與衍生自質體b/h PIV3/RSV F2或b/hPIV3/hMPV F2的6.5 kb片段連接，產生全長的病毒cdNAs。 已經在Vero細胞中擴大帶有上述構築體的病毒。可使用 按照在本文中之描述設計的病毒，作為三價疫苗，對抗副 流感病毒感染、間質肺病毒感染和呼吸道融合細胞病毒感 染。 實例8 :選殖兩種呼吸道融合細胞病毒至牛副流感3 /人類副 流感3載體 設計攜帶兩個RSV F基因之副本的嵌合型病毒，以便判定 由嵌合型病毒產生較多的RSV蛋白質，是否將導致改良的 免疫原性。可藉著在Vero細胞中的逆向遺傳、生物學選殖 和擴大，解救該病毒，產生具有lxl〇6pfu/毫升之力價的病 毒母液。可使用該病毒b/h PIV3/RSV F1F2，來許估病毒生 83860.doc • 114 · 1359868 長動力學、RSV F蛋白質的產製以及在倉鼠中的複製和免疫 原性。 以下列方式產製構築體（參見圖11):以sPhI和NheI消化 1-5 118¥?2質體，並分離6.5 1^之片段。以3?111和]^1^1消化 b/h PIV3 RSV F1的全長cDNA ’並分離14.8 kb之DNA片段’ 再與衍生自1-5 bPIV3/RSV F2的6.5 kb DNA片段連接’產生 全長的病毒cDNAs。 實例9:建構和選殖載有人類間質肺病毒F cDNA的牛副流感……φ 3/人類副流感3 將人類間質肺病毒（hMPV)的F基因插入b/h PIV3基因組 的位置1和2中（圖12)。hMPV F基因卡匣藏也bPIV3 N-P基因 間區埤。使用hMPV F基因質體（pRF5l5) ’並修正在hMPV F 基因中的單一核甞酸突變（即將核甞酸3352從C修正為T (野 外型）），產生PRF515-M4。使用重疊PCR，將bPIV3 N-P基因 間區域加至hMPV F基因的3’端。至於hMPV F，重疊PCR寡為 5'GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCACCTAATCA _ TGTTCTTACAATGGTCGACC3’。在該選殖步驟期間，在5' 端使用的寡（5’GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTT GGAAAGTGGTGATC3，）以及在PCR反應中hMPV F基因卡匣 的 3,端（5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3，），含有 AvrII 限 制酵素位置。使用QuickChange突變生成套組和下列的寡 (5'CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3·，5丨CCAAGACA TTGTCTATTGCGGCCTAGG3’），調整hMPV F基因卡匣，使 其符合六的規則。以與在上文第8節，實例4中，關於b/h 83860.doc -115 - 1359868 PIV3/eGFPl和eGFP2之描述相同的方式’產製全長的b/h PIV3/hMPV F1(位置 1)和 F2 (位置 2) cDNA質體。 實例10 :載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流感3 的免疫沉澱和複製測定 欲證實在在位置2處載有人類間質肺病毒F (hMPV F2)之 b/h PIV3中表現F蛋白質，使用天竺鼠或人類抗血清’對 hMPVF蛋白質進行免疫沉澱（參見圖13A)。關於由b/hPIV3 表現之hMPV F蛋白質的免疫沉澱作用，以0.1或0.05之MOI ，利用b/hPIV3或b/hPIV3/hMPVF2感染Vero細胞》在感染 後24小時，以沒有半胱胺酸且無甲硫胺酸（ICN)的DME沖洗 細胞1次，並在相同的培養基中培養30分鐘。移出培養基， 並將0.5毫升缺乏半胱胺酸和甲硫胺酸，含有100微居里 [35S]-Pro-Mix (Amersham)的 DME加至細胞中。在37°C 下， 在35S-同位素的存在下，培養被感染的細胞5小時》移出培 養基，並以含有蛋白酶抑制劑的0.3 M RIPA緩衝溶液，溶解 被感染的細胞。將該細胞溶胞產物與hMPV天竺鼠或人類多 株抗血清一起培養，並與IgG-瓊脂糖（Sigma)結合。在以〇.5 M RIPA緩衝溶液沖洗三次之後，在10%蛋白質凝膠上分級 分離試樣。將凝膠脫水，並使X-光軟片曝光。 藉著免疫沉澱作用，使用gp和人類抗-hMPV抗血清，顯 示由b/h PIV3/hMPV F2表現的hMPV F蛋白質（圖13A)。有趣 的是，在b/h PIV3/hMPV F2之溶胞產物中，觀察到移動至大 約80 kDa的特定譜帶。該尺寸符合F前驅物蛋白質F〇。亦在 b/h PIV3和模仿對照組跑道中，觀察到不同尺寸的非-特異 83860.doc 116 - 1359868
譜帶（圖13)。這些資料暗示b/h PIV3/hMPV F2表現hMPV F 蛋白質。然而，可利用之hMPV抗體試劑是有限的，且這些 抗血清僅與hMPVF蛋白質之前驅物產生交互作用。被切開 的F1亦可能是不穩定的，並因此不易使用該方法呈像。 進行生長曲線’判定b/h PIV3/hMPV F2之病毒複製的動 力學，並將其與在Vero細胞中，以0.1之MOI，對b/hPIV3和 b/h PIV3/RSV F2所觀察到的那些相比較（圖13B)。資料顯示 在感染後24小時，與b/h PIV3/RSV F2相比較，b/h
PIV3/hMPV F2展現出延遲的複製發生。然而，在感染後48 小時和之後，不再觀察到複製上的差異。 亦進行生長曲線，判定b/h PIV3/hMPV F1之病毒複製的 動力學，並將其與在Vero細胞中，以0.01之MOI，對b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3所觀察到的那些相比較（圖13C)。 資料顯示，與b/h PIV3/hMPV F2或b/h PIV3相比較’ b/h PIV/hMPV F1具有延遲的複製發生，並產生較低的高峰力價 。b/h hMPV F1的溶菌斑尺寸，亦比b/h hMPV F2更小。 亦評估嵌合型病毒b/h PIV3/hMPV F1和F2 ’在敘利亞黃 金倉鼠中感染和複製的能力（表5)。結果顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠鼻甲骨和肺臟中，複製達在b/h PIV3中觀察到 的程度。甚至在倉鼠的上和下呼吸道中，hMPV亦複製至5.3 和3.6 log1() TCID5〇/克組織的力價。這些資料顯示b/h PIV3/hMPV F1和F2在倉鼠的呼吸道中，可有效地感染和複 製，藉此證實倉鼠代表適合用來判定hMPV之免疫原性的小 動物模式，並可使用該動物模式來評估hMPV疫苗候選者。 83860.doc • 117 · 1359868 表5 在位置1或2中表現hMPV F蛋白質的 b/h PIV3，在倉鼠中的複製 病毒a 在感染後4天的平均病毒力價 (log10TCID50/克組織士S.E.)b 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 4.8 ± 0.2 5.6 土 0.6 b/h hMPV FI 5.3 ± 0.5 5.7 ± 0.4 b/h hMPV F2 5.7 ± 0.5 4.6 ± 0.3 hMPV 5.3 ± 0.1 3.6 士 0.3 3以lxl06pfu的指定病毒 ，鼻内接種一 組六隻倉鼠
^票準偏差 注解：對第10天的CPE讀取TCID5〇測定 實例11 :選殖可溶性呼吸道融合細胞病毒F基因構築體 亦產製含有可溶性RSVF基因之單一副本，RSVF基因缺 乏穿透膜和胞液功能部位之版本的構築體（圖14)。可使用該 構築體測試免疫原性。其優點將是該可溶性RSV F不會被併 入病毒粒子膜内的能力。因此，可將該病毒視為較安全的 病毒，因為不預期它的病毒向性會改變。可藉著逆向遺傳 ，解救b/hPIV3/solRSVF的 cDNA質體》
使用質體1-5/RSVF2 (前述）作為PCR的DNA模板。使用寡 RSV f.2 (5，GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3')(其黏接 RSV 的 nt 5946)和寡 5，CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATT 83860.doc -118 - 1359868 AGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3' 移除RSV F的穿透膜和細胞質功能部位，刪除150個核答酸 。以Hpal和Sail消化所得的PCR片段，並導入以Hpal和Sail 處理過的 1 -5 RSV F2 内，產生 1 -5 bPIV3/sol RSV F。以 SphI 和Nhel消化該質體，並將所得的片段導入以SphI和Nhel消 化過的b/hPIV3 cDNA内，產生全長的cDNA。
實例12 :在以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流 感3感染的細胞中，表現人類間質肺病毒F 連續10倍稀釋b/h 104hMPVF病毒母液，並用來感染匯合 不足的Vero細胞。以含有健大黴素的optiMEM培養基覆蓋被 感染的細胞，並在35°C下培養5天。以100%甲醇固定細胞， 並以1:1000稀釋的抗-hMPVOOl天竺鼠血清，接著是1:1000 稀釋的抗-天竺鼠HRP共軛抗體，進行免疫染色。藉著比色 展開，在AEC受質系統（DAKO corporation)的存在下，使 hMPV F的表現呈像。參見圖15A。 連續10倍稀釋b/hNP-PhMPVF病毒母液，並用來感染匯 合不足的Vero細胞。以補充有1 X L15/含有青黴素/鏈黴素、 L-穀胺醯胺和胎牛血清之MEM培養基的1 %在EMEM/L-15 培養基（JRH Biosciences; Lenexa，KS)中之甲基纖維素，覆 蓋被感染的細胞❶在35°C下培養被感染的細胞5天，以100% 甲醇固定細胞，並以1:1〇〇〇稀釋的抗-hMPVOOl天竺鼠血清 ，接著是1:1000稀釋的抗·天竺鼠HRP共軛抗體，進行免疫 染色（參見圖15B)。抗hMPVOOl天竺鼠血清，是對hMPVOOl 蛋白質專一的，且不與b/hPIV3蛋白質結合。 83860.doc -119 - 1359868 實例13 :在HELA細胞和VERO細胞中，解救嵌合型牛副流 感第3型/人類副流感第3型病毒
使用與bPIV3解救類似的程序，進行嵌合型b/hPIV3病毒 的解救。在HeLa細胞中，使用 LipofecTACE (Gibco/BRL)， 藉著逆向遗傳，進行b/hPIV3嵌合型病毒的解救。以4之MOI ，利用MVA感染80%匯合的HeLa細胞、Hep-2細胞或Vero細 胞。在感染1小時之後，將全長的反-基因組b/h PIV3 cDNA (4 微克），連同NP (0.4微克）、P (0.4微克）和L/pCITE (0.2微克） 表現質體，一起轉移感染至被感染的HeLa或Vero細胞内。 在感染後40小時，收獲細胞和細胞上清液（P0)，並使其接受 一回合的冷凍-融解。然後使用所得的細胞溶胞產物，在 1 -β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（ara C) —種疫苗病毒的複製 抑制劑的存在下，感染新鮮的Vero細胞單層，產生P1病毒 母液。收獲得自這些培養盤的上清液和細胞，冷康融解一 次，並使用PIV3-專一抗血清，藉著病毒溶菌斑的免疫染色 ，測定bPIV3病毒顆粒的存在。P1收獲物的細胞溶胞產物， 導致Vero細胞單層的完全CPE，且免疫染色表示出現廣泛的 病毒感染。 實例14 :解救載有人類間質肺病毒F病毒的牛副流感第3型/ 人類副流感第3型
如下獲得在位置l(b/h 104 hMPV F)或位置2 (b/h NP-P hMPV F)處表現hMPV F的b/h PIV3病毒。以0.1至0.3之傳染 多重性（m.o.i)，利用禽痘_T7感染在6孔培養皿中，80-90% 匯合度的ΗΕρ-2或Vero細胞。在以禽痘-Τ7感染之後，以PBS 83860.doc -120 - 1359868 沖洗細胞一次，並以下列用量的質體dna轉移感染：全長 的 b/h 104 hMPV F或 b/h NP-P hMPV F cDNA 2.0微克，pcite N 0.4微克，pCite P 0.4微克，pCite L 0.2微克（pCite質體具 有T7啟動基因，接著是衍生自腦心肌炎病毒（EMCV)的IRES 元件）。根據製造者的指示’在脂染胺（Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)的存在下’進行轉移感染。在33°C下培養轉移
感染反應5至12小時，接著以2毫升含有健大黴素的新鮮 OptiMEM，取代含有脂染胺2000的培養基。在33°C下進一 步培養經過轉移感染的細胞2天。以SPG使細胞穩定，並藉 著在-80°C下一回合的冷凍·融解’使細胞溶解。使用粗製的 細胞溶胞產物感染新的Vero單層，以便擴大解救的病毒。 實例15 :藉著逆向遺傳，解救載有呼吸道融合細胞病毒基 因的牛副流感第3型/人類副流感第3型 藉著逆向遺傳，在HeLa或HEp-2細胞中，使用前述的轉移 感染法（參見實例13) ’回收有傳染性的病毒（Haller等人， 2000)。簡言之，分別以至〇.3或1-5的傳染多重性（m.0.i) 鲁 ，利用FP-T7或MVA-T7，感染在6孔組織培養皿中，80-90% 匯合度的HEp-2或Vero細胞。在以FP-T7或MVA-T7感染之後 ，以PBS沖洗細胞一次，並以下列用量的質體DNA轉移感染 (2.0微克全長的 b/h PIV3 RSV F或 G cDNA ’ 0.4微克 pCITE/N ，0.4微克pCITE/P ’ 0.2微克pCITE/L)。根據製造者的指示 ，在脂染胺2000 (Invitrogen)的存在下’進行轉移感染。在 33°C下培養轉移感染反應5至12小時，接著以2毫升含有健 大黴素的新鮮OptiMEM，取代含有脂染胺2000的培養基。 83860.doc -121 - 1359868
在33°C下進一步培養經過轉移感染的細胞2天。以SPG使細 胞Λ定，並利用在-80°C下一回合的冷凍融解，使細胞溶解 。使用粗製的細胞溶胞產物感染新的Vero細胞單層，以便 擴大解救的病毒。藉著在Vero細胞中有限的稀釋，純化嵌 合型病毒，並產製106-108PFU/毫升的高力價病毒母液。藉 著RT-PCR分離嵌合型病毒的RSV基因，並證實其序列。藉 著以RSV山羊多株抗血清（Biogenesis)對被感染之Vero細胞 單層進行免疫染色，證實RSV蛋白質的表現。 實例16 :證實藉著RT-PCR解救之嵌合型牛副流感第3型/人 類副流感第3型病毒
欲確定所解救之病毒在性質上是嵌合的，即該病毒在 bPIV3主鏈中含有hPIV3 F和HN基因序列，藉著RT-PCR進一 步分析病毒的RNA基因組。收獲利用三種獨立衍生之b/h PI V3的分離株之P1病毒母液感染的Vero細胞，並分離總 RNA。使用在bPIV3之位置4757處黏接的寡，擴大病毒RNA 。藉著PCR擴大得自5255至6255的病毒區域。所得的1 kb PCR片段應含有hPIV3序列。這可藉著以對hPIV3專一的酵 素（Sac 1和Bgl H)消化來證實之，且它不切開bPIV3的互補 區（參見圖2)。如同預期的，Sac 1和Bgl.II切開PCR片段，成 為較小的片段，證實該經過分離的序列是衍生自hPIV3 (參 見跑道3、5、7)。此外，藉著PCR擴大在聚合酶L基因中， 從nt 9075至nt 10469的區域。該區域應含有bPIV3序列。再 度使用對bPIV3專一的酵素（Pvull和BamHl)，消化所得的1.4 kb PCR片段，它不切開hPIV3的相等區域（圖3)。藉著Pvull 83860.doc • 122 - 1359868 和BamHl實在地消化1.4 kb片段，證實該聚合酶基因的來源 是bPIV3(參見圖3的跑道3、4、6、7、9和10)。總而言之， RT-PCR分析顯示該解救的b/h PIV3病毒在性質上是嵌合型 的。它在bPIV3遺傳主鏈中含有hPIV3F和HN基因。 實例17 :載有呼吸道融合細胞病毒基因之牛副流感第3型/ 人類副流感第3型的遺傳穩定性
為了判定b/h PIV3/RSV嵌合型病毒在遺傳上是穩定的， 並保持導入的RSV基因卡匣，在Vero細胞中，連續盲目地繼. 代被感染細胞之溶胞產物10次。以0.1之MOI，利用b/h PIV3/RSV感染在T25燒瓶中，匯合不足的Vero細胞，並在33°C 下培養4天，或直到看見CPE為止。在培養期間結束時，收 獲被感染的細胞和培養基，冷凍並融解兩次，並使用所得 的細胞溶胞產物感染新的T25燒瓶中的Vero細胞。重複該循 環10次。針對RSV蛋白質的表現和病毒力價，藉著溶菌斑 測定，分析得自P1至P10的所有細胞溶胞產物，並以RSV多 株抗血清進行免疫染色。在第10次繼代時，藉著RT-PCR分 離出RSV基因卡匣，並藉著DNA序列分析證實RSV基因序列 (以便確認可能的核苷酸改變）。所有的分離株均保持RSV基 因卡匣，並分析10次繼代的RSV蛋白質表現（資料未顯示）。 實例18 :在蔗糖梯度上，载有呼吸道融合細胞病毒基因之 牛副流感第3型/人類副流感第3型的病毒粒子分級分離 藉著使用生化測定，進一步調查是否將RSV蛋白質導入 b/h PIV3病毒粒子内的問題。以0.1之MOI，利用每種嵌合型 b/hPIV3/RSV病毒接種Vero細胞。當看見最大CPE時，冷凍 83860.doc -123 - 1359868
、融解被感染的單層，並以2000 rpm旋轉10分鐘。通過20% 蔗糖墊’以100,000 X g旋轉澄清的上清液90分鐘。然後將小 球再懸浮於PBS中，並在20-66%蔗糖梯度的上方，輕輕地 分出層次。以1〇〇,〇〇〇 X g旋轉梯度20小時，達成平衡。從梯 度的上方開始，收獲18個2毫升等份的溶離份。每個溶離份 中各移出0.4毫升，進行病毒力價判定。將每個溶離份再懸 浮於2倍體積的20% PBS中，並藉著以100,000 X g旋轉1小時 離心，然後將小球再懸浮於0.05毫升Laemmli緩衝溶液 (Biorad)中，並藉著西方墨點法，使用RSV F MAb (NuMax L1FR-S28R)、RSV(Biogenesis)和 bPIV3 (VMRD)多株抗血清 ，分析RSV和PIV3蛋白質"純化在桿狀病毒中表現的C-終 端截短之RSV F蛋白質至均質，亦在蔗糖梯度上分析之》 亦藉著溶菌斑測定，分析溶離份的高峰病毒力價。一開 始進行自由RSV F之對照組梯度（在桿狀病毒中產製，並為 C-終端截短的）、RSV A2和b/h PIV3。大部分的自由RSV F 出現在梯度上方的溶離份3、4、5和6中（圖16A)。在溶離份 10、11和12中觀察到最大濃度的RSV病毒粒子（圖16B)。利 用RSV多株抗血清，並以RSV F MAb探測RSV溶離份。含有 最大量RSV病毒粒子的溶離份，亦顯示最強的RSV F信號， 暗示RSV F蛋白質共同-移動，並與RSV病毒粒子結合（圖 16B)。這些溶離份亦展現出最南的病毒力價（圖16B)。b/h PIV3病毒粒子可能是更多形的’並因此含有b/h PIV3病毒粒 子之高峰溶離份的散布是更廣泛的。b/h PIV3病毒粒子出現 在溶離份9、10、11、12和13中（圖16C)。藏有最大量病毒 83860.doc -124 - 粒子的溶離份’藉著溶菌斑測定再度展現出最高的病毒力 價（圖16C)。利用pIV3多株抗血清和rSv f MAb兩者，分析 b/hPIV3/RSVF2的蔗糖梯度溶離份（圖16D)e含有大多數病 毒粒子的溶離份，是溶離份11、12、13和14，如同藉著西 方墨、點法，使用PIV3抗血清所示。同樣的，這些亦是展現 出最向含量之RSV F蛋白質的溶離份。然而，亦有些自由 RSV F出現在溶離份5和6中。溶離份11、12、13和14展現出 南學病毒力價（圖16D)。類似的，含有b/h PIv3/RSV G2之大 多數病毒粒予的溶離份（溶離份9、1〇、η和12)，亦顯示最 強的RSV G蛋白質信號（圖16Ε)»這些再度是具有最高病毒 力價的溶離份（圖16E)。這些資料集體地暗示大部分的RSV F和G蛋白質共同·移動，並與b/h PIV3病毒粒子結合。然而 ’有些自由的RSV蛋白質亦出現在梯度上方的溶離份中。 實例19 .不能以rsv抗血清，中和載有呼吸道融合細胞病 毒（RSV)之嵌合型牛副流感第3型/人類副流感第3型 為了尋求是否將RSV表面糖蛋白併入b/h PIV3病毒粒子 内’結果改變病毒向性表現型之重要安全問題性的解答， 進行中和測定（表6和7)。RSV F MAbs (WHO 1200 MAb)在 1:2000的稀釋度下，中和50%的野外型RSV A2(表6)。相反 地’即使是1:25之稀釋度，亦不能中和任何嵌合型b/h PIV3/RSV。同樣地，1:400稀釋度的多株RSV抗血清 (Biogenesis)中和了 50%RSV A2，但即使是1:15.6之稀釋度， 亦不能中和b/h PIV3 RSV (表6)。 83860.doc -125 - 1359868 表6 不能藉著RSV抗體中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 RSV F MAb RSV Ab RSY 2000 400.0 b/h PIV3 <25 <15.6 b/h RSV F1*N-N <25 <15.6 b/h RSV F2 <25 <15.6 b/h RSV G1 ND <15.6 b/h RSV G2 ND <15.6 hPIV3 F MAb C191/9，在1:500的稀釋度下，中和50%的 b/h PIV3 以及 b/h PIV3/RSV(表 7)。hPIV3 HN MAb 68/2在 1:16,000的稀釋度下， 中和了 b/h PIV3，並在1:32,000的稀釋 度下，中和了 b/h PIV3/RSV (表 7)。 表7 藉著hPIV3 Mabs中和b/h PIV3 RSV嵌合型病毒 在中和測定中 .50%中和抗體稀釋度之倒數 使用的病毒 hPIV3 F MAb hPIV3 HN MAb RSV 62.5 <500 b/h PIV3 500 16000 b/h RSV F1*N-N 500 32000 b/h RSV F2 500 32000 b/h RSV G1 NDd 32000 b/h RSV G2 ND 32000 £1未判定。 實例20 :當在活體内投藥時，嵌合型牛PIV證實了減毒表現 型，並誘發強的保護性反應 83860.doc -126 - 1359868 以5 x 105 pfu之野外型bPIV3、重組的bPIV3、hPIV3、人 類/牛PIV3和安慰劑感染5週齡的敘利亞黃金倉鼠。將五組 不同的動物分開關在微生物隔離籠中。在感染後4天，犧牲 動物。將動物的鼻甲骨和肺臟均質化，並冷凍在-80°C下。 藉著在37°C下，在MDBK細胞中的TCID50測定，判定出現在 組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天竺鼠紅血球 細胞，證實病毒感染。表8顯示不同PIV3品系在倉鼠肺臟和 鼻甲骨中的複製力價。注意到重組的bPIV3和b/h PIV3嵌合 型病毒在倉鼠肺臟中是減毒了的： 表8 PIV3病毒在敘利亞黃金倉鼠中，在鼻 甲骨和肺臟中的複製 bPIV3、r-bPIV3、r-bPIV3(l)、hPIV3 和牛/人類 PIV3(1)在倉 鼠之上和下呼吸道中的複製 在感染後4天時的平均病毒力價 (log10 TCID50/克組織=S.E‘)b 病毒3 鼻甲骨 肺臟 bPIV3 5.3 士 0.3 5.3 ± 0.2 r-bPIV3 5.0 土 0.3 3.5 ± 0.2 r-bPIV3(l) 5.5 ± 0.2 5.4 ± 0.2 hPIV3 4.9 ± 0.2 5.4 ± 0.2 牛/人類PIV3(1) 4.9 ± 0.2 4.5 ± 0.2 a#5xl05PFU之指定病毒，鼻内接種一組四隻倉鼠。 b標準偏差。
此外，在感染之前和在感染後21天，從倉鼠中收集血液 試樣，以血球凝集抑制測定來分析之。以受體破壞酵素（RDE 83860.doc 127 - 1359868
、DENKA Seiken Co.)處理血清試樣，並藉著在冰上與天竺 鼠紅血球細胞一起培養1小時，移除非-特異性的凝集素。 將野外型bPIV3和hPIV3加至2-倍連續稀釋的倉鼠血清試樣 中。最後，加入天竺鼠紅血球細胞（0.5%)，並容許在室溫下 發生血球凝集作用。表9顯示在以不同PIV3品系感染之倉鼠 中產生的抗體反應。注意到b/h PIV3嵌合型病毒對hPIV3， 產生像野外型hPIV3 —樣強的抗體反應，遠超過由重组體或 野外型bPIV3所產生的反應： 表9 使用得自以不同PIV3病毒感染之倉鼠的 血清的血球凝集抑制測定 接種倉鼠所用的病毒 倉鼠血清力價 野外型bPIV3 HPIV3 重組的bPIV3 1:16 1:16 野外型bPIV3 1:16 1:8 野外型hPIV3 1:4 1:128 b/h PIV3嵌合型病毒 1:8 1:128 安慰劑 <1:4 <1:4 這些結果證實本發明之b/h PIV3嵌合型病毒的性質，其使 這些重組體更適合用於疫苗調配物。當在活體内投藥時， b/h PIV3嵌合型病毒不僅證實減毒的表現型，亦產生像野外 型hPIV3 —樣強的抗體反應。因此，因為本發明之嵌合型病 毒具有具減毒表現型，並誘發像野外型hPIV—樣強之免疫 反應的獨特組合，故這些嵌合型病毒具有在人類中成功地 用來抑制及/或保護對抗PIV感染所必需的特徵。 實例21 :載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流感 83860.doc -128 - 1359868 3/人類副流感3 ’在倉鼠之上和下呼吸道中的複製 利用 100 毫升體積之 lxl〇6pfu 或 lxl〇4pfu々b/li piV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2或安慰劑培養基，鼻内感染5週齡的敘 利亞黃金倉鼠（每組6隻動物）。將不同組的動物分開關在微 生物隔離籠中。在感染後4天’收獲動物的鼻甲骨和肺臟， 均質化並儲存在-70 C下。在Vero細胞中，藉著tciD5〇測定 ’判足出現在組織中之病毒的力價。關於攻毒測定，在第 28天時以lxlO6 pfu/毫升的hPIV3或RSV A2鼻内接種動物。 在攻毒後4天，分離動物的鼻曱骨和肺臟，並藉著溶菌斑測 定，在Vero細胞上測定攻毒病毒的複製，以免疫染色來定 量。表10顯示在倉鼠中，不同品系在肺臟和鼻甲骨中的複 製力價。 表10 表現RSV G或F蛋白質之牛/人類PIv3，在倉鼠 之上和下呼吸道中的複製 在感染後4天時的平均病毒力價 (l〇gi〇TCID50/克組織=5； f 病毒a 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 4.8 ± 0.4 4.4 +03 RSV A2 3,4 ± 0.5 3.3 + 05 b/h RSV G1 4.2 ± 0.7 Ί 2.9 ± 0.7 b/h RSV FI 3.9 ±0.4 1 2.7 +〇2 b/h RSV FI N-P 4.6 ± 0.4 3.5 +〇2 b/h RSV G2 4.2 ± 0.9 4.3 + 〇2 b/h RSV F2 4.6 ± 0.6 ±±^0.5 以5 X10 PFU之和足病毒，鼻内接種一組四隻倉鼠。 6標準偏差 83860.doc -129 - 1359868 敘利亞黃金倉鼠代表適用於評估重組之bPIV3和hPIV3遺 傳設計病毒的複製和免疫原性的小動物模式。預期導入 RSV抗原將不會改變嵌合型b/h PIV3在倉鼠中複製的能力 。該結果顯示所有的嵌合型病毒，均以類似b/h PIV3在倉鼠 鼻曱骨中的程度複製（表10)。相反的，在第1個位置藏有RSV 基因的嵌合型病毒，與b/h PIV3相比較，在倉鼠肺臟中展現 出1-1.5 log10降低的力價（表10)。在第2個位置藏有RSV基因 的嵌合型病毒，以類似在倉鼠的下呼吸道中，對b/h PIV3 觀察到的力價複製。 實例22 :當以人類副流感病毒3和呼吸道融合細胞病毒A2 攻毒時，以載有呼吸道融合細胞病毒G或F蛋白質之牛副流 感3/人類副流感3免疫的倉鼠得到保護 在免疫之後28天，以1x106PFU的RSV A2或hPIV3攻毒倉 鼠，評估由b/h PIV3/RSV引起的免疫原性。接受b/h PIV3/ RSV的動物，受到完全免於RSV和hPIV3的保護（表11)。只 有投予安慰劑培養基的動物，在下和上啤吸道展現出高力 價的攻毒病毒。該測定亦顯示以RSV免疫的動物，未得到 免於hPIV3攻毒的保護。同樣地，接種hPIV3疫苗的動物， 顯示出高力價的RSV攻毒病毒（表11)。 83860.doc -130 - 1359868 表u—
當以 hPIV3和 RSVA2攻毒時，b/hPIV3/RSV 一 免疫之免立受到保護_ 攻毒病毒· hPIV3 —------ RSV A2 在攻毒後4天的平均病 毒力價（log10TCID50/克 組織土S.E.)bc —----- 在攻毒後4天的平均病 毒力價（log10 pfu50/克組 織士 S.E.)b 免疫病毒3 鼻甲骨 肺臟 鼻甲骨 1------- 肺臟 b/h PIV3 <1.2 ± 0.0 <1.0 ± 0_1 ND ND b/h RSV G1 <1.2 ± 0.1 <1.1 ± 0.1 <1_0 ± 0.3 <0.7 + 0.1 b/h RSV FI <1.2 ± 0.2 <1.0 ± 0.0 <1.1 ± 0.5 <0.6 + 〇.〇 b/h RSV FI NP-P <1.0 ± 0.0 <1.0 ± 0.0 <0.8 ± 0.1 <0.5 + 0.0 b/h RSV G2 <1.2 ± 0.2 <1.1 ± 0.2 <0.8 ± 0.1 <0.8 + 0.3 b/h RSV F2 <1.2 ± 0.1 <1.0 ± 0.1 <1_3 ± 0.6 <1.6 + 1.0 RSV A2 4.5 ± 0.6 4.8 ± 0.6 <0.6 + 0.2 <0.6 + 0.1 安慰劑 4.4 ± 0.1 4.1 ± 0,1 3.6 土 0.8 3.1 ± 0.7 a在第0天’用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天，以i〇6pfu的hPiV3或RSV A2攻毒倉鼠。在攻毒 後4天，收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 e標準偏差》 實例23 :以载有呼吸道融合細胞病毒之牛副流感3/人類副 流感3接種倉鼠，誘導血清hai和中和抗體 在攻毒之前’在第28天從免疫動物中獲得血清試樣。使 83860.doc • 131 - 1359868 用50%溶菌斑降低測定，對倉鼠血清分析RSV中和抗體的存
在，並藉著進行血球凝集素抑制（HAI)測定（表8)，分析PIV3 HAI血清抗體的存在。如下進行50%溶菌斑降低測定（中和 測定）：連續2-倍稀釋倉鼠血清，並與100 PFU的RSV入2 — 起培養1小時。然後將病毒-血清混合物移至Vero細胞單層， 並以甲基纖維素覆蓋。在35°C下培養5天之後，使用RSV多 株抗血清將單層免疫染色，以便定量。藉著在V型底的96-孔培養盤中，在25°C下，將第28天之倉鼠血清的連續2-倍 稀釋與hPIV3—起培養30分鐘，進行血球凝集-抑制（HAI)測 定。接著在每孔中加入天竺鼠紅血球，連續培養額外的90 分鐘，並記綠在每孔中血球凝集作用的出現或缺乏。
結果顯示表現RSV F蛋白質的病毒，展現出幾乎像在獲自 以野外型RSV接種之動物的血清中觀察到的那些一樣高的 RSV中和抗體力價（表12)。相反的，表現RSV G蛋白質的病 毒則顯示出低很多的RSV中和抗體（表12)。所有的嵌合型 b/h PIV3/RSV倉鼠血清，所顯示出之HAI血清抗體的含量， 接近對b/h PIV3觀察到的含量（表12)。結果顯示嵌合型b/h PIV3可在倉鼠中有效地感染和複製，並謗發保護性免疫反 應。 83860.doc -132 · 1359868 表12 以b/h PIV3/RSV接種倉鼠，誘發血清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV反應的中和抗體bx 對hPI V3反應的Η AI抗體^ (平均值倒數log2± SE) (平均值倒數log2± SE) RSV 7.9 ± 1.00 ND b/hRSVFl*N-N 7.8 ± 0.85 6.6 土 0.5 b/h RSV FI 5.5 ± 0.53 5.5 ± 0.5 b/h RSV G1 3.4 ± 0.50 6.6 ±0.7 b/h RSV F2 6.9 ± 0.65 6.7 ± 0.8 b/h RSV G2 3‘4 ± 0.50 5.2 ± 0.4 b/h PIV3 ND 7.2 ± 0.5 a用來免疫倉氣的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定判定的中和抗體力價。 e倉鼠前-血清的中和抗體力價<1.0，且HAI抗體力價<4.0。 實例24 :以低劑量之載有呼吸道融合細胞病毒的牛副流感 3/人類副流感3接種倉鼠，保護倉鼠免於呼吸道融合細胞病 毒A2的攻毒，並誘導血清HAI和中和抗體 為了確認最佳的疫苗候選者，使用低劑量的不同構築體 (參見實例2)來免疫倉鼠。在表13中概述攻毒的結果。 83860.doc -133 - 1359868 表13 b/h PIV3/RSV-低劑量免疫的倉鼠，受到 _免於RSV A2攻毒的保護 複製 以RSV A2攻毒 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(log10TCID50/克 組織 ±S.E.)bx 在接種疫苗後4天的平均 病毒力價(logio pfu5〇/克組 織士S.E.)b 免疫的疫苗3 鼻甲骨 肺臟 鼻甲骨 肺臟 b/h PIVE 4.9 ± 0.5 4.8 ± 1.0 ND ND b/h RSV G1 3.0 ± 0.8 3.1 ± 0.5 <0.9 土 0.5 <0.7 ± 0.4 b/h RSV F1*N-N 3_4 ± 0.1 3.5 ± 0.1 <1_4 土 0.7 <0.5 ± 0.0 b/h RSV G2 4.1 ± 0.6 3.8 ± 0.4 <0.8 ± 0.0 <0.5 ± 0.1 b/h RSV F2 5.2 土 0.6 3.9 ± 0.4 <0.7 ± 0.1 <0.5 ± 0.1 RSV A2 2_8 ± 0.3 2.7 ± 0.6 <0.8 ± 0.1 <0.5 ± 0.0 安慰劑 NDd ND 3.0 ± 0.8 3.2 ± 0.9 a在第0天’以104 PFU/毫升之低劑量，用來免疫一組6隻動 鲁 物的病毒。 b在第28天，以1〇6 pfu之RSV A2攻毒倉鼠。在攻毒後4天， 收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 e標準偏差。 义判定。 接下來’藉著50%溶菌斑降低測定（中和測定），判定中和 抗體力價。使用Vero細胞，對b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合 83860.doc -134 - 1359868
型病毒或RSV，進行中和測定。在室溫下，在0.5毫升 OptiMEM中，將連續2·倍稀釋的RSV多株抗血清（Biogenesis; Poole，England)、獲自 Medlmmune的 RSV F MAb (WHO 1200 MAb)或hPIV3 F (C191/9)和HN (68/2) MAbs，與大約 100 PFU 之b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合型病毒或RSV—起培養60分 鐘。在培養之後，將病毒-血清混合物移至Vero細胞單層，在 35°C 下培養卜h 時，以在 EMEM/L-15培養基（JRH Biosciences;
Lenexa, KS)中的1%甲基纖維素覆蓋，並在35°C下培養。在 接種之後6天，將被感染的細胞單層免疫染色。以抑制50% 病毒溶菌斑之最高血清稀釋度的倒數來表示中和力價。亦 對在感染後28天，獲自以b/hPIV3、b/hPIV3/RSV嵌合型病 毒或RSV A2免疫之倉鼠的血清，進行中和測定。以連續2-倍稀釋倉鼠血清，並與100 PFU之RSV A2—起培養1小時。 然後將病毒-血清混合物移至Vero細胞單層，並以甲基纖維 素覆蓋。在35°(：下培養5天之後，使用RSV多株抗血清，將 該單層免疫染色’以便定量。倉鼠前-血清之中和抗體力價 鲁 <1.0 ’而HAI抗體力價<4.0。藉著在25°C下，在v型底的96-孔培養盤中，將連續2-倍稀釋的第28天倉鼠血清與hPIV3 — 起培養’進行血球凝集-抑制（HAI)測定。接著，在每孔中 加入天竺鼠紅血球細胞，繼續培養額外的90分鐘，並記錄 在每孔中血球凝集作用的出現或缺乏。表14概述該結果： 83860.doc -135 · 1359868 表14 以較低劑量之b/hPIV3/RSV接種倉鼠，誘 導血清HAI和中和抗體 病毒a 對RSV的中和抗體反應be (平均值倒數log2±SE) 對hPIV3的HAI抗體反應。 (平均值倒數log2±SE) RSV 6.5 ± 0.7 ND b/h RSVF1*N-N 2.5 ± 0.7 5.7 ± 0.6 b/h RSV G1 2.0 ± 0.0 6.0 ±0.0 b/h RSV F2 3.8 ± 1.5 6.7 ± 0.6 b/h RSV G2 3.8 ± 1.3 5_5 ± 0.6 b/h PIV3 ND 6.5 ± 0.7 a以104 pfu/毫升之低劑量，用來免疫倉鼠的病毒。 b藉著50%溶菌斑降低測定，判定中和抗體力價。 e倉鼠前-血清之中和抗體力價<1.0，而HAI抗體力價<4.0。
當將接種劑量降低至每隻動物1 X 104 PFU時，加劇了在 第一個位置具有RSV基因之嵌合型病毒的受限複製表現型 。b/h PIV3/RSV F1和G1在倉鼠之上呼吸道中複製的力價， 與b/h PIV3的那些相比較，降低1.0-2.0 log10(表13)。相反的 ，在位置2帶有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在上呼吸道中複 製，達到在b/h PIV3中觀察到的程度。在第一個位置藏有 RSV基因的b/h PIV3/RSV，在倉鼠肺臟中的複製亦較受限制 (表13)。相反的，b/h PIV3/RSV F2在鼻甲骨和肺臟中的複 製’仍分別達1〇52和103 9的高力價（表13)。在第28天，以1 X 83860.doc -136 - 1359868 106pfu的RSV A2攻毒接種疫苗的倉鼠（表13)。不管在倉鼠 的呼吸道中觀察到低程度的複製，動物仍在下和上呼吸道 兩處，得到免於RSV攻毒的保護（表13)。保護的程度，像在 以野外型RSV接種之動物中觀察到的一樣好》只有接受安 慰劑培養基的動物，在鼻甲骨和肺臟顯示出高病毒力價（表 13)。在第28天，從免疫倉鼠中收集血清，並分析RSV中和 抗體和PIV3 HAI血清抗體的存在（表14)。與在野外型RSV血 清中觀察到的力價相比較。在獲自以b/h PIV3/RS V免疫之 倉鼠的血清中，在RSV中和抗體力價方面，觀察到大約50% 的下降（表14)。但獲自接受在位置2中藏有RSV基因之b/h PIV3的動物的血清，仍展現出比得自在位置1中帶有RSV基 因之PIV3/RSV的血清，更高的RSV中和抗體。與b/h PIV3血 清相比較，PIV3 HAI之血清抗體力價亦稍微降低（表14)。 實例25 :當以人類副流感病毒3或人類間質肺病毒NL/001攻 毒時，以載有人類間質肺病毒F之牛副流感3/人類副流感3 免疫的倉鼠得到保護 分別以 b/h PIV3、b/h hMPV FI、b/h hMPV F2、hMPV或 安慰劑免疫五組敘利亞黃金倉鼠（每組有六隻倉鼠）。將5組 不同的動物分開關在微生物隔離籠中。在免疫後28天’以1 X 106 PFU之hPIV3或hMPV (NL/001品系）攻毒倉鼠，以便評 估由b/h PIV3/hMPV F引起的免疫原性。在攻毒後4天’犧牲 動物。將動物的鼻甲骨和肺臟均質化，並儲存在-80°C下° 藉著在37。(：下，在MDBK細胞中的TCID50測定’判定出現在 組織中的病毒。藉著紅血球吸附作用，利用天竺鼠紅血球 83860.doc -137 · 1359868 細胞，證實病毒感染。表I5顯示PIV3品系和MPV品系在倉 鼠肺臟和鼻甲骨中的複製力價。 表15 當以hPIV3或hMPV/NL/ΟΟΙ攻毒時，以 b/h PIV3/hMPV F-免疫的倉鼠得到保護 攻毒病毒· hPIV3 hMPV 在攻毒後4天的平均病 毒力價（logl〇TCID50/克 組織±S.E)b 在攻毒後4天的平均病 毒力價（log10TCID5〇/克 組織土S.E)b 免疫病毒a 鼻甲骨 肺臟 鼻甲骨 肺臟 b/h PIV3 <1.3 ± 0.2 <1.1 ± 0.1 ND b/h hMPV FI <1.3 ± 0.1 <1.1 ± 0.1 3.5 ± 0.8 <0.5 ± 0.2 b/h hMPV F2 <1.2 ± 0.1 <1.2 ± 0.1 <0.9 ± 0.4 <0.5 ± 0.1 hMPV ND <0.8 ± 0.3 <0.4 ± 0·0 安慰劑 4.3 ± 0.3 4.5 ± 0.5 6.0 ± 〇·3 4.5 ± 1.3 a在第0天用來免疫每組6隻倉鼠的病毒。 b在第28天，以106pfu之hPIV3或hMPV攻毒倉鼠。在攻毒後4 天，收獲動物的肺臟和鼻甲骨。 ND=未判定。 結果顯示接受b/hPIV3/hMPVF2(F在位置2)的動物，完全 得到免於hMPV和hPIV3的保護（表15)。然而，b/hPIV3/hMPV FI (F在位置1)僅在上呼吸道（例如鼻甲骨）中，降低感染 hMPV力價2.5 logs，雖然其在下呼吸道（例如肺臟）中，提供 83860.doc -138 - 1359868 完全免於hMPV和hPIV3兩者感染的保護（表15)。投與安慰劑 之動物在下呼吸道及上呼吸道顯示有高攻毒病毒之力價 (表 15) 〇 本發明之範圍，不受特別說明之具體實施例的限制，其 企圖作為本發明之個別觀點的單一解釋，且任何在功能上 相等的構築體、病毒或酵素，亦在本發明的範圍内。實際 上，除了在本文中出示和描述的那些之外，熟諳此藝者應 可從前述的說明和附錄的圖式中，了解本發明的各種修改 。企圖將這類修改包括在附錄之_請專利範圍的範圍内。 在本又中提及的各種出版物，將其揭示内容全部以引用 的方式併入本文中》 【圖式簡單說明】 圖1.人類間質肺病毒的F蛋白質，與得自不同禽肺病毒 的不同F蛋白質之胺基酸序列的逐對排列。藉著胺基酸的單 一-字母-符號，確認在兩個序列之間相同的胺基酸。以” 符號指出在兩個胺基酸序列之間的保留胺基酸交換，而間 隔表π非-保留性胺基酸交換❶Α)人類間質肺病毒f蛋白質 與分離自Mallard鴨之禽肺病毒之F蛋白質（在外功能部位中 有85.6%同一性）的排列。B)人類間質肺病毒1?蛋白質與分離 自火雞之禽肺病毒之F蛋白質（B亞組；在外功能部位中有 7 5 %同一性）的排列。 圖2.擴大得自衍生自b/hpiV3嵌合型病毒之三種不同分 離株的核芬酸5255至核甞酸6255的PCR片段。利用對人類 PIV3之F基因專一的酵素，消化所得的j处DNA片段。這此 83860.doc -139 - 1359868 ctgctgatca actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agattcgttc 1200 taggagcaat agcactcggt gttgcaactg cagctgcagt tacagcaggt gitgcaattg 1260 ccaaaaccat ccggcttgaa agtgaagtaa cagcaattaa gaatgccctc aaaaagacca 1320 atgaagcagt atctacattg gggaatggag ttcgtgtgtt ggcaactgca gtgagagagc 1380 tgaaagattt tgtgagcaag aatctaacac gtgcaatcaa caaaaacaag tgcgacattg 1440 ctgacctgaa aatggccgtt agcttcagtc aattcaacag aaggttccta aatgttgtgc 1500 ggcaattttc agacaacgct ggaataacac cagcaatatc tttggactta atgacagatg 1560 ctgaactagc cagagctgtt tccaacatgc caacatctgc aggacaaata aaactgatgt 1620 tggagaaccg tgcaatggta agaagaaaag ggttcggatt cctgatagga gtttacggaa 1680 gctccgtaat ttacatggtg caactgccaa tctttggggt tatagacacg ccttgctgga 1740 tagtaaaagc agccccttct tgttcaggaa aaaagggaaa ctatgcttgc ctctlaagag 1800 aagaccaagg atggtattgt caaaatgcag ggtcaactgt ttactaccca aatgaaaaag 1860 actgtgaaac aagaggagac catgtctttt gcgacacagc agcaggaatc aatgttgctg 1920 agcagtcaaa ggagtgcaac ataaacatat ctactactaa ttacccatgc aaagttagca 1980 caggaagaca tcctatcagt atggttgcac tatctcctct tggggctttg gttgcttgct 2040 acaagggagt gagctgttcc attggcagca acagagtagg gatcatcaag caactgaaca 2100 aaggctgctc ttatataacc aaccaagacg cagacacagt gacaatagac aacactgtat 2160 accagctaag caaagttgaa ggcgaacagc atgttataaa aggaaggcca gtgtcaagca 2220 gctttgaccc agtcaagttt cctgaagatc aattcaatgt tgcacttgac caagttttcg 2280 agagcattga gaacagtcag gccttggtgg atcaatcaaa cagaatccta agcagtgcag 2340 agaaaggaaa cactggcttc atcattgtaa taattctaat tgctgtcctt ggctctacca 2400 tgatcctagt gagtgttttt atcataataa agaaaacaaa gagacccaca ggagcacctc 2460 cagagctgag tggtgtcaca aacaatggct tcataccaca taattag 2507
<210>2 -<211> 1596 <212> DNA <213>肺病毒 <220> <221> CDS <222> (1)...(1596) <223>禽肺病毒融合蛋白質基因，部分的Cds <400> 2 atgtcttgga aagtggtact gctattggta ttgctagcta ccccaacgg〇 ggggctagaa 00 gaaagttatc tagaggagtc atgcagtact gttactagag gatacctgag tgttttgagg 120 acaggatggt atacaaatgt gttcacactt ggggttggag atgtgaaaaa tctcacatgt 180 accgacgggc ccagcttaat aagaacagaa cttgaactga caaaaaatgc acttgaggaa 240 ctcaagacag tatcagcaga tcaattggca aaggaagcta ggataatgtc accaagaaaa 300 gcccggtttg ttctgggtgc catagcatta ggtgtggcaa ctgctgctgc tgtgacggct 360 ggtgtagcga tagccaagac aattaggcta gaaggagaag tggctgcaat caaaggtgcg 420 ctcaggaaaa caaatgaggc tgtatctaca ttaggaaatg gcgtgagggt acttgcaaca 480 gctgtgaatg atctcaagga ctttataagt aaaaaattga eacctgcaat aaacaggaac 540 aagtgtgaca tctcagacct taagatggca gtgagctttg.gacaatacaa tcggaggttc 600 ctcaatgtgg taagacagtt ttctgacaat gcaggtatta cgcctgcaaf atctctagat 660 ttaatgactg acgctgagct tgtaagagct gtaagcaaca tgcccacatc ttcaggacag 720 atcaatctga tgcttgagaa tcgggcaatg gtcagaagga aaggatttgg gattttgatt 780 ggagtttatg gtagctctgt ggtctatata gtgcagcttc ctattttcgg tgtgatagat 840 acaccgtgtt ggagggtgaa ggctgctcca ttatgttcag ggaaagacgg gaattatgca 900 tgtctcttgc gagaggacca aggttggtat tgtcaaaatg ctggatccac agtttattat 960 ccaaatgagg aggactgtga agtaagaagt gatcatgtgt tttgtgacac agcagctggg 1020 ataaatgtag caaaggagtc agaagagtgc aacaggaata tctcaacaac aaagtaccct 1080 tgcaaggtaa gtacagggcg tcacccaata agcatggtgg ccttatcacc actgggtgct 1140 83860.doc 1359868 ttggtagcct gttatgacgg tatgagttgt tccattggaa gcaacaaggt tggaataatc 1200 agacctttgg £gaaagggtg ttcatacatc agcaatcaag atgctgacac tgttacaatt 1260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagtt gaaggagaac aacacacaat taaagggaag 1320 ccagtatcta gcaattttga ccctatagag ttccctgaag atcagttcaa cgtagccctg 1380 gatcaggtgt ttgaaagtgt tgagaagagt cagaatctga tagaccagtc aaacaagata 1440 ttggatagca ttgaaaaggg gaatgcagga tttgtcatag tgatagtcct cattgtcctg 1500 ctcatgctgg cagcagttgg tgtgggtgtc ttctttgtgg ttaagaagag aaaagctgct 1560 cccaaattcc caatggaaat gaatggtgtg aacaac 1596 <210〉 3 <211> 1666
<212> DNA <213>肺病毒 <220> <221> CDS <222> (14)...(1627) <223>禽肺病毒分離株lb融合蛋白質mRNA，完整的cds <400〉 3
gggacaagtg aaaatgtctt ggaaagtggt actgctattg gtattgctag ctaccccaac 60 ggsggggcta gaagaaagtt atctagagga gtcatgcagt actgttacta gaggatacct 120 gagtgttttg aggacaggat ggtatacaaa tgtgttcaca cttgaggttg gagatgtgga 180 aaatctcaca tgtaccgacg ggcccagctt aataagaaca gaacttgaac tgacaaaaaa 240 tgcacttgag gaactcaaga cagtatcagc agatcaattg gcaaaggaag ctaggataat 300 gtcaccaaga aaagcccggt ttgttctggg tgccatagca ttaggtgtgg caactgctgc 360 tgctgtgacg gctggtgtag cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggctgc 420 aatcaagggt gcgctcagga aaacaaatga ggctgtatct acattaggaa atggcgtgag 480 ggtacttgca acagctgtga atgatctcaa ggactttata agtaaaaaat tgacacctgc 540 aataaacagg aacaagtgtg acatctcaga ccttaagatg gcagtgagct ttggacaata 600 caatcggagg ttcctcaatg tggtaagaca gttttctgac aatgcaggta ttacgcctgc 660 aatatctcta gatttaatga ctgacgctga gcttgtaaga gctgtaagca acatgcccac 720 atcttcagga cagatcaatc tgatgcttga gaatcgggca atggtcagaa ggaaaggatt 780 tgggattttg attggagttt atggtagctc tgtggtctat atagtgcagc ttcctatttt 840 cggtgtgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgct ccattatgtt cagggaaaga 900 cgggaattat gcatgtctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgtcaaa atgctggatc 960 cacagtttat tatccaaatg aggaggactg tgaagtaaga agtgatcatg tgttttgtga 1020 cacagcagct gggataaatg tagcaaagga gtcagaagag tgcaacagga atatctcaac 1080 aacaaagtac ccttgcaagg taagtacagg gcgtcaccca ataagcatgg tggccttatc 1140 accactgggt gctttggtag cctgttatga cggtatgagt tgttccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcagacctt tggggaaagg gtgttcatac atcagcaatc aagatgctga 1260 cactgttaca attgacaaca cagtgtacca attgagcaaa gttgaaggag aacaacacac 1320 aattaaaggg aagccagtat ctagcaattt tgaccctata gagttccctg aagatcagtt 1380 caacgtagcc ctggatcagg tgtttgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa ggggaatgca ggatttgtca tagtgatagt 1500 cctcattgtc'ctgctcatgc tggcagcagt tggtgtgggt gtcttctttg tggttaagaa 1560 gagaaaagct gctcccaaat tcccaatgga aatgaatggt gtgaacaaca aaggatttat 1620 cccttaattt tagttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666 <210〉 4 <211> 1636 <212> DNA 鼻氣管炎病毒 83860.doc 1359868 <220> <221〉CDS <222〉（13)...(1629) <223〉火雞鼻氣管炎融合蛋白質之基因 (F1和F2次單元），完整的Cds <400>4 gggacaagta ggatggatgt aagaatctgt ctcctattgt tccttatatc taatcctagt 60 agctgcatac aagaaacata caatgaagaa tcctgcagta ctgtaactag aggttataag 120 agtgtgttaa ggacagggtg gtatacgaat gtatttaacc tcgaaatagg gaatgttgag 180 aacatcactt gcaatgatgg acccagccta attgacactg agttagtact cacaaagaat 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatcaagtgg ctaaggaaag cagactatcc 300 tcacccagga gacgtagatt tgtactgggt gcaatagcac ttggtgttgc gacagctgct 360 gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaattagat tagagggaga ggtgaaggca 420 attaagaatg ccctccggaa cacaaatgag gcagtatcca cattagggaa tggtgtgagg 480 gtactagcaa ctgcagtcaa tgacctcaaa gaatttataa gtaaaaaatt gactcctgct 540 attaaccaga acaaatgcaa tatagcagat ataaagatgg caattagttt tggccaaaat 600 aacagaaggt tcctgaatgt ggtgaggcaa ttctctgata gtgcaggtat cacatcagct 660 gtgtctcttg atttaatgac agatgatgaa cttgttagag caattaacag aatgccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aatcgtgcca tggttagaag gaaggggttt 780 ggtatattga ttggtgttta tgatggaacg gtcgtttata tggtacaact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccttg ttggagggtg gtggcagcac cactctgtag gaaagagaaa 900 ggcaattatg cttgtatact gagagaagat caagggtggt actgtacaaa tgctggctct 960 acagcttatt atcctaataa agatgattgt gaggtaaggg atgattatgt attttgtgac 1020 acagcagctg gcattaatgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact 1080 tctaaatacc catgcaaagt cagcacaggt agacaccctg tcagtatggt agccttaacc 1140 cccctagggg gtctagtgtc ttgttatgag agtgtaagtt gctccatagg tagcaataaa 1200 gtagggataa taaaacagct aggcaaaggg tgcacccaca ttcccaacaa cgaagctgac 1260 acgataacca ttgataacac tgtgtaccaa ttgagcaagg ttgtaggcga acagaggacc 1320 ataaaaggag ctccagttgt gaacaatttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgttgcac ttgaccaagt atttgagagt atagatagat ctcaggactt aatagataag 1440 tctaacgact tgctaggtgc agatgccaag agcaaggctg gaattgctat agcaatagta 1500 gtgctagtca ttctaggaat cttcttttta cttgcagtga tatattactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gccacgacag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636 <210>5 <211> 1860 <212> DNA <213>肺病毒 <220> <221〉CDS <222> (1)...(110) <223>禽肺病毒基質蛋白質（M)基因，部分的cds <220> <221>CDS <222> (216)...(1829) <223>禽肺赛毒融合糖蛋白（F)基因，完整的Cds -4 - 83860.doc 1359868 <400> 5 gagttcaggt aatagtggag ttaggggcat acgttcaagc agaaagcata agcagaatct 60 gcaggaactg gagccaccag ggtacgagat atgtcctgaa gtcaagataa acacagagag 120 tacacttacc aaatcacagt aaeaatitcg tttttaaccc tctcatagtt attacctagc 180 ttgatattat ttagaaaaaa ttgggacaag tgaaaatgtc ttggaaagtg gtactgctat 240 tggtattgct agctacccca acgggggggc tagaagaaag ttatctagag gagtcatgca 300 gtactgttac tagaggatac ctgagtgttt tgaggacagg atggtataca aatgtgttca 360 cacttgaggt tggagatgtg gaaaatctca catgtaccga cgggcccagc ttaataagaa 420 cagaacttga actgacaaaa aatgcacttg aggaactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtttgttctg ggtgccatag 540 cattaggtgt ggcaactgct gctgctgtga cggctggtgt agcgatagcc aagacaatta 600 ggctagaagg agaagtggct gcaatcaagg gtgcgctcag gaaaacaaat gaggctgtat 660 ctacattagg aaatggcgtg agggtacttg caacagctgt gaatgatctc aaggacttta 720 taagtaaaaa attgacacct gcaataaaca ggaacaagtg tgacatctca gaccttaaga 780 tggcagtgag ctttggacaa tacaatcgga ggttcctcaa tgtggtaaga cagttttctg 840 acaatgcagg tattacgcct gcaatatctc tagatttaat gactgacgct gagcttgtaa 900 gagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagatcaa tctgatgctt gagaatcggg 960 caatggtcag aaggaaagga tttgggattt tgattggagt ttatggtagc tctgtggtct 1020 atatagtgca gcttcctatt ttcggtgtga tagatacacc gtgttggaag gtgaaggctg 1080 ctccattatg ttcagggaaa gacgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca aaatgctgga tccacagttt attatccaaa tgaggaggac tgtgaagtaa 1200 gaagtgatca tgtgttttgt gacacagcag ctgggataaa tgtagcaaag gagtcagaag 1260 agtgcaacag gaatatctca acaacaaagt acccttgcaa ggtaagtaca gggcgtcacc 1320 caataagcat ggtggcctta tcaccactgg gtgctttggt agcctgttat gacggtatga 1380 gttgttccat tggaagcaac aaggttggaa taatcagacc tttggggaaa gggtgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gacactgtta caattgacaa cacagtgtac caattgagca 1500 aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagccagt atctagcaat tttgacccta 1560 tagagttccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggatca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca agatattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt catagtgata gtcctcattg tcctgctcat gctggcagca gtlggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaatg gaaatgaatg 1800 gtgtgaacaa caaaggattt atcccttaat tttagttact aaaaaattgg gacaagtgaa 1860 <210>6 <211>574 <212>蛋白質 <213>副黏液病毒 <400> 6
Met Glu Leu Leu lie His Arg Leu Ser Ala lie Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 lie Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gin Asn lie Thr Glu Glu Phe 20 25 30
Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val lie Thr lie Glu Leu Ser Asn Ik 50 55 60
Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu He Lys 65 70 75 80
Gin Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gin Leu Leu 85 90 95 • Met Gin Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 83860.doc 1359868
Gin Tyr Met Asn Tyr Thr lie Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125
He Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140
Gly Ser Ala lie Ala Ser Gly lie Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys lie Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr lie Asn Asn Gin Leu Leu Pro lie Val Asn 195 200 205
Gin Gin Ser Cys Arg lie Ser Asn lie Glu Thr Val lie Glu Phe Gin 210 215 220
Gin Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu He Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu .245 250 255
Leu Leu Ser Leu lie Asn Asp Met Pro lie Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gin He Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser lie 275 280 285
Met Ser lie lie Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 290 295 300 lie Tyr Gly Val He Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn lie Lys Glu Gly Ser Asn lie Cys Leu Thr Arg 325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350
Pro Gin Ala Asp Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380
Asp He Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys lie Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400
Asp lie Ser Ser Ser Val lie Thr Ser Leu Gly Ala He Val Ser Cys 405 410 415
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Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 46+0
Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro He lie Asa Tyr Tyr Asp Pro 465 . 470 475 480
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Thr He lie lie Val lie lie Val Val Leu Leu Ser Leu lie Ala lie -6 - 83860.doc 1359868 530 535 540
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Leu Leu Ser Leu He Asn Asp Met Pro lie Thr Asn Asp Gin Lys Lys 260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gin He Val Axg Gin Gin Ser Tyr Ser lie 275 280 285
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Glu Ser lie Glu Asn Ser Gin Ala Leu Val Asp Gin Ser Asn Arg lie 465 470 475 480
Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe lie lie Val lie lie 485 490 495
Leu lie Ala Val Leu Gly Ser Thr Met He Leu Val Ser Val Phe lie 500 505 510 lie lie Lys Lys Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser 515 520 525
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Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala He Ala Lys Thr lie 115 120 125
Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala lie Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160
Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser -10 - 83860.doc 1359868 180 185 190
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Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gin 225 230 235 240
He Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly lie Leu He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr lie Val Gin 260 265 270
Leu Pro He Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Arg Val Lys Ala 275 280 285 .
Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Axg 290 295 · 300
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Leu Asp Ser lie Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 485. 490 495
Leu lie Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510
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Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe He Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
Phe Gly Gin Tyr Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gin Phe Ser • 195 200 205
Asp Asn Ala Gly He Thr Pro Ala He Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp 210 215 220
Ala Glu Leu Val Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ser Gly Gin 225 230 235 240 lie Asn Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Axg Lys Gly Phe 245 250 255
Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr lie Val Gin 260 265 270
Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285
Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
Giu Asp Gin Gly Trp Tyr Cys Gin Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr 305 310 315 320
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Leu Asp Ser lie Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 485 490 495
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Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Asp Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gin -13 - 83860.doc 1359868 260 265 270
Leu Pro lie Phe Gly Val lie Glu Thr Pro Cys Trp Arg Val Val Ala 275 280 285
Ala Pro Leu Cys Arg Lys Glu Lys Gly Asn Tyr Ala Cys lie Leu Arg 290 295 300
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Asn lie Ser Thr Ser Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His 355 360 365
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Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe lie Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 lie Asn Arg Asn Lys Cys Asp lie Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190
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Gly He Leu He Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Val Tyr He Val Gin 260 265 270
Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val Lys Ala 275 280 285
Ala Pro Leu Cys Ser Gly Lys Asp Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg 290 295 300
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Thr Ala Ala Gly lie Asn Val Ala Lys Glu Ser Glu Glu Cys Asn Arg 340 345 350
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Arg Pro Leu Gly Lys Gly Cys Ser Tyr lie Ser Asn Gin Asp Ala'Asp 405 410 415
Thr Val Thr lie Asp Asn Thr Val Tyr Gin Leu Ser Lys Val Glu Gly 420 425 430
Glu Gin His Thr lie Lys Gly Lys Pro Val Ser Ser Asn Phe Asp Pro 435 440 445 lie Glu Phe Pro Glu Asp Gin Phe Asn lie Ala Leu Asp Gin Val Phe 450 455 460
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Leu Asp Ser lie Glu Lys Gly Asn Ala Gly Phe Val lie Val lie Val 485 490 495
Leu He Val Leu Leu Met Leu Ala Ala Val Gly Val Gly Val Phe Phe 500 505 510
Val Val Lys Lys Arg Lys Ala Ala Pro Lys Phe Pro Met Glu Met Asn -15 - 83860.doc 1359868 515 520 525
Gly Val Asn Asn Lys Gly Phe lie Pro 530 535
<210> 14 <2U> 1193 <212> DNA <2B>鼻氣管炎病毒 <220> <221>CDS <222> (16)...(1191) <223>火雞鼻氣管炎病毒（品系CVL 14/1) 附接蛋白質（G)mRNA，完整的cds <400> 14
gggacaagta tctctat〇gg gtccaaacta tatatggctc agggcaccag tgcatatcaa 60 actgcagtgg ggttctggct ggacatcggg aggaggtaca tattggctat agtcctatca 120 gctttcgggc tgacctgcac agtcactatt gcactcactg ttagcgtcat agttgaacag 180 tcagtgttag aggagtgcag aaactacaat ggaggagata gagattggtg gtcaaccacc 240 caggagcagc caactactgc accaagtgcg actccagcag gaaattatgg aggattacaa 300 acggctcgaa caagaaagtc tgaaagctgt ttgcatgtgc aaatttctta tggtgatatg 360 tatagccgca gtgatactgt actgggtggt tttgattgia tgggcttatt ggttctttgc 420 aaatcaggac caatttgtca gcgagataat caagttgacc caacagccct ctgccattgc 480 agggtagatc tttcaagtgt ggactgctgc aaggtgaaca agattagcac taacagcagc 540 accacctctg agccccagaa gaccaacccg gcatggccta gccaagacaa cacagactcc 600 gatccaaatc cccaaggcat aaccaccagc acagccactc tgctctcaac aagtctgggc 660 ctcatgctca catcgaagac tgggacacac aaatcagggc ccccccaagc cttgccgggg 720 agcaacacca acggaaaaac aaccacagac cgagaaccag ggcccacaaa ccaaccaaat 780 tcaaccacca atgggcaaca caataaacac acccaacgaa tgacaccccc gccaagtcac 840 gacaacacaa gaaccatcct ccagcacaca acaccctggg aaaagacatt cagtacatac 900 aagcccacac actctccgac caacgaatca gatcaatccc tccccacaac tcaaaacagc 960 atcaactgtg aacattttga cccccaaggc aaggaaaaaa tctgctacag agtaggttct 1020 tacaactcca atattacaaa gcaatgcaga attgatgtgc ctttgtgttc cacttatagc 1080 acagtgtgca tgaaaacata ctataccgaa ccattcaact gttggaggcg tatctggcgt 1140 tgcttgtgtg atgacggagt tggtctggtt gagtggtgtt gcactagtta act 1193 <210〉 15 <211> 1260 <212> DNA 鼻氣管炎病毒 <220〉 <221〉CDS <222〉（16)...(1260) <223>火雞鼻氣管炎病毒（品系6574) 附接蛋白質（G)，完整的cds <400> 15 gggacaagta tccagatggg gtcagagctc tacatcatag agggggtgag ctcatctgaa 60 atagtcctca agcaagtcct cagaaggagc caaaaaatac tgttaggact ggtgttatca 120 gccttaggct tgacgctcac tagcactatt gttatatcta tttgtattag tgtagaacag 180 gtcaaattac gacagtgtgt ggacacttat tgggcggaaa atggatcctt acatccagga 240 • 16 - 83860.doc 1359868 cagtcaacag aaaatacttc aacaagaggt aagactacaa caaaagaccc tagaagatta 300 caggcgactg gagcaggaaa gtttgagagc tgtgggtatg tgcaagttgt tgatggtgat 360 atgcatgatc gcagttatgc tgtactgggt ggtgttgatt gtttgggctt attggctctt 420 tgtgaatcag gaccaatttg tcagggagat acttggtctg aagacggaaa cttctgccga 480 tgcacttttt cttcccatgg ggtgagttgc tgcaaaaaac ccaaaagcaa ggcaaccact 540 gcccagagga actccaaacc agctaacagc aaatcaactc ctccggtaca ttcagacagg 600 gccagcaaag aacataatcc ctcccaaggg gagcaacccc gcagggggcc aaccagcagc 660 aagacaacta ttgctagcac cccttcaaca gaggacactg ctaaaccaac gattagcaaa 720 cctaaactca ccatcaggcc ctcgcaaaga ggtccatccg gcagcacaaa agcagcctcc 780 agcaccccca gccacaagac caacaccaga ggcaccagca agacgaccga ccagagaccc 840 cgcaccggac ccactcccga aaggcccaga caaacccaca gcacagcaac tccgcccccc 900 acaaccccaa tccacaaggg ccgggcccca acccccaaac caacaacaga cctcaaggtc 960 aacccaaggg aaggcagcac aaecccaact gcaatacaga aaaacccaac cacacaaagt 1020 aatcttgttg actgcacact gtctgatcca gatgagccac aaaggatttg ttaccaggta 1080 ggaacttaca atcctagtca atcgggaacc tgcaacatag aggttccaaa atgttccact 1140 tatgggcatg cttgtatggc tacattatat gacaccccat tcaactgctg gcgcaggacc 1200 aggagatgca tctgtgattc cggaggggag ctgattgagt ggtgctgtac tagtcaataa 1260 <210>·16 <211〉 391 <m>蛋白質 <213>火雞鼻氣管炎病毒 <400〉 16
Met Gly Ser Lys Leu Tyr Met Ala Gin Gly Thr Ser Ala Tyr Gin Thr 1 5 10 15
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Val Leu Ser Ala Leu Gly Leu Thr Leu Thr Ser Thr lie Val lie Ser 35 40 45 lie Cys lie Ser Val Glu Gin Val Lys Leu Arg Gin Cys Val Asp Thr 50 55 60
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Gly lie Leu lie Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val lie Tyr Met Val Gin 260 265 270
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Leu Pro lie Phe Gly Val lie Asp Thr Pro Cys Trp lie Val Lys Ala 275 280 285
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<210> 22 <211> 1620 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 22
atgtcttgga aagtggtgat cattttttca ttgttaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctact tagaagagtc atgtagcact ataactgaag gatatctcag tgttctgagg 120 acaggttggt acaccaatgt ttttacactg gaggtaggcg atgtagagaa ccttacatgt 180 gccgatggac ccagcttaat aaaaacagaa ttagacctga ccaaaagtgc actaagagag 240 ctcagaacag tttctgctga tcaactggca agagaggagc aaattgaaaa tcccagacaa 300 tctagattcg ttctaggagc aatagcactc ggtgttgcaa ctgcagctgc agctacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gaaagtgaag taacagcaat taagaatgcc 420 ctcaaaaaga ccaatgaagc agtatctaca ttggggaatg gagttcgtgt gttggcaact 480. gcagtgagag agctgaaaga ttttgtgagc aagaatctaa cacgtgcaat caacaaaaac 540 aagtgcgaca ttgctgacct gaaaatggcc gttagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600 ctaaatgttg tgcggcaatt ttcagacaac gctggaataa caccagcaat atctttggac 660 ttaatgacag atgctgaact agccagagct gtttccaaca tgccaacatc tgcaggacaa 720 ataaaactga tgttggagaa ccgtgcaatg gtaagaagaa aagggttcgg aatcctgata 780 ggagtttacg gaagctccgt aatttacatg gtgcaactgc caatctttgg ggttatagac 840 acgccttgct ggatagtaaa agcagcccct tcttgttcag gaaaaaaggg aaactatgct 900 tgcctcttaa gagaagacca aggatggtat tgtcaaaatg cagggtcaac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgtga aacaagagga gaccatgtct tttgcgacac agcagcagga 1020 atcaatgttg ctgagcagtc aaaggagtgc aacataaaca tatctactac taattaccca 1080 tgcaaagtta scacaggaag acatcctatc agtatggttg cactatctcc tcttggggct 1140 ttggttgctt gctacaaggg agtgagctgt tccattggca gcaacagagt agggatcatc 1200 aagcaactga acaaaggctg ctcttatata accaaccaag acgcagacac agtgacaata 1260 gacaacactg tataccagct aagcaaagtt gaaggcgaac agcatgttat aaaaggaagg 1320 ccagtgtcaa gcagctttga cccagtcaag tttcctgaag atcaattcaa tgttgcactt 1380 gaccaagttt tcgagagcat tgagaacagt caggccttgg tggatcaatc aaacagaatc 1440 ctaagcagtg cagagaaagg aaacactggc ttcatcattg taataattct aattgctgtc 1500 cttggctcta ccatgatcct agtgagtgtt tttatcataa taaagaaaac aaagaaaccc 1560 acaggagcac ctccagagct gagtggtgtc acaaacaatg gcttcatacc acataattag 1620 <210> 23 <2U> 1620 <212> DNA <2〖3>人類間質肺病毒 <400〉23 atgtcttgga aagtggtgat cattttttca ttgctaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60 gagagctacc tagaagaatc atgtagcact ataactgagg gatatcttag tgttctgagg 120 acaggttggt ataccaacgt ttttacatta gaggtgggtg atgtagaaaa ccttacatgt 180 tccgatggac ctagcctaat aaaaacagaa ttagatctga ccaaaagtgc actaagagag 240 -25 - 83860.doc 1359868
ctcaaaacag tctctgctga ccaattggca agagaggaac aaattgagaa tcccagacaa 300 tctaggtttg ttctaggagc aatagcactc ggtgttgcaa cagcagctgc agtcacagca 360 ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gagagtgaag tcacagcaat taagaatgcc 420 ctcaaaacga ccaatgaagc agtatctaca ttggggaatg gagttcgagt gttggcaact 480 gcagtgagag agctaaaaga ctttgtgagc aagaatttaa ctcgtgcaat caacaaaaac 540 aagtgcgaca ttgatgacct aaaaatggct gttagcttca gtcaattcaa cagaaggttt 600 ctaaatgttg tgcggcaatt ttcagacaat gctggaataa caccagcaat atctttggac 660 ttaatgacag atgctgaact agccagggcc gtttctaaca tgccgacatc tgcaggacaa 720 ataaaattga tgttggagaa ccgtgcgatg gtgcgaagaa aggggttcgg aatcctgata 780 ggggtctacg ggagctccgt aatttacacg gtgcagctgc caatctttgg cgttatagac 840 acgccttgct ggatagtaaa agcagcccct tcttgttccg aaaaaaaggg aaactatgct 900 tgcctcttaa gagaagacca agggtggtat tgtcagaatg cagggtcaac tgtttactac 960 ccaaatgaga aagactgtga aacaagagga gaccatgtct tttgcgacac agcagcagga 1020 attaatgttg ctgagcaatc aaaggagtgc aacatcaaca tatccactac aaattaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acatcctatc agtatggttg cactgtctcc tcttggggct 1140 ctggttgctt gctacaaagg agtaagctgt tccattggca gcaacagagt agggatcatc 1200 aagcagctga acaaaggttg ctcctatata accaaccaag atgcagacac agtgacaata 1260 gacaacactg tatatcagct aagcaaagtt gagggtgaac agcatgttat aaaaggcaga 1320 ccagtgtcaa gcagctttga tccaatcaag tttcctgaag atcaattcaa tgttgcactt 1380 gaccaagttt ttgagaacat tgaaaacagc caggccttag tagatcaatc aaacagaatc 1440 ctaagcagtg cagagaaagg gaatactggc tttatcattg taataattct aattgctgtc 1500 cttggctcta gcatgatcct agtgagcatc ttcattataa tcaagaaaac aaagaaacca 1560 acgggagcac ctccagagct gagtggtgtc acaaacaatg gcttcatacc acacagttag 1620 <210> 24 <211>-1620 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 24 atgtcttgga aagtgatgat catcatttcg ttactcataa caccccagca cgggctaaag 60 gagagttatt tggaagaatc atgtagtact ataactgagg gatacctcag tgttttaaga 120 acaggctggt acactaatgt cttcacatta gaagttggtg atgttgaaaa tcttacatgt 180 actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgatctaa caaaaagtgc tttaagggaa 240 ctcaaaacag tctctgctga tcagttggcg agagaggagc aaattgaaaa tcccagacaa 300 tcaagatttg tcttaggtgc gatagctctc ggagttgcta cagcagcagc agtcacagca 360 ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgagg tgaatgcaat taaaggtgct 420 ctcaaacaaa ctaatgaagc agtatccaca ttagggaatg gEgtgcgggt cctagccact 480 gcagtgagag agctaaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat caacaggaac 540 aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaagattt 600 ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660 ctgatgactg atgctgagtt ggccagagct gtatcataca tgccaacatc tgcagggcag 720 ataaaactga tgttggagaa ccgcgcaatg gtaaggagaa aaggatttgg aatcctgata 780 ggggtctacg gaagctctgt gatttacatg gttcaattgc cgatctttgg tgtcatagat 840 acaccttgtt ggatcatcaa ggcagctccc tcttgctcag aaaaaaacgg gaattatgct 900 tgcctcctaa gagaggatca agggtggtat tgtaaaaatg caggatctac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020 atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctactac caactaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acaccctata agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140 ttggtggctt gctataaagg ggtaagctgc tcgattggca gcaattgggt tggaatcatc 1200 aaacaattac ccaaaggctg ctcatacata accaaccagg atgcagacac tgtaacaatt 1260 gacaataccg tgtatcaact aagcaaagtt gaaggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagtttcaa gcagttttga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380 -26 - 83860.doc 1359868
gatcaagtct tcgaaagcat tgagaacagt caggcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440 ctaaacagtg cagaaaaagg aaacactggt ttcattatcg tagtaatttt ggttgctgtt 1500 cttggtctaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcaiaa tcaagaaaac aaggaagccc 1560 acaggagcac ctccagagct gaatggtgtc accaacggcg gtttcatacc acatagttag 1620 <210〉 25 <211〉 1620 <212> DNA <2丨3>人類間質肺病毒 <400〉 25 atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca cggactaaaa 60 gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120 acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa tcttacatgt 180 actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctgagagaa 240 ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg agagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300 tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctt ggagttgcca cagcagcagc agtcacagca 360 ggcattgcaa tagccaaaac cataagactt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420 ctcaaaacaa ccaacgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccact 480 gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcgat caacaagaac 540 aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaagattc 600 ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660 ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc tgcaggacag 720 ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780 ggggtctacg gaagctctgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840 acaccttgtt ggataatcaa ggcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900 tgcctcctaa gagaggatca agggtggtat tgcaaaaatg caggatccac tgtttactac 960 ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020 atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctaccac caactaccca 1080 tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140 ttggtagctt gctacaaggg ggttagctgc tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200 aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260 gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320 ccagtttcaa gcagttttga tccaatcagg tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380 gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440 ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggt ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500 cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaagccc 1560 acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620 <210> 26 <211>236 <212>蛋白質 ^^人類間質肺病毒 <400> 26
Met Glu Val Lys Val Glu Asn lie Arg Thr lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15
Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30
Leu Val Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser lie Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45
Leu lie lie Asn Tyr Lys Met Gin Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His -27 - 83860.doc 1359868 50 55 60
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Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Axg Thr Lys Thr 130 135 140
Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Thr Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160
His Ser Pro Pro Arg Ala Thr Thr Aig Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175
Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Ήιτ Ala Ser Val Gin 180 185 190
Pro Asp lie Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 205
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Met Glu Val Lys Val Glu Asn He Arg Ala lie Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15
Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30
Leu lie Leu lie Gly lie Thr Thr Leu Ser He Ala Leu Asn lie Tyr 35 40 45
Leu lie lie Asn Tyr Thr lie Gin Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60
His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Pro Asn Lys Glu Ala Ser Thr He 65 70 75 80
Ser Thr Asp Asn Pro Asp He Asn Pro Ser Ser Gin His Pro Thr Gin 85 90 95
Gin Ser Thr Glu Asn Pro Thr Leu Asn Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro 100 105 110
Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Leu Ser 115 120 +125
Ser Val Asp Arg Ser Thr Ala Gin Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140
Lys Pro Thr Val His Thr lie Asn Asn Pro Asn Thr Ala Ser Ser Thr 145 150 155 160
Gin Ser Pro Pro Arg Thr Thr Thr Lys Ala lie Arg Arg Ala Thr Thr 165 170 175
Phe Arg Met Ser Ser Thr Gly Lys Arg Pro Thr Thr Thr Leu Val Gin -28 - 83860.doc 1359868 180 185 190
Ser Asp Ser Ser Thr Thr Thr Gin Asn His Glu Glu Thr Gly Ser Ala 195 200 205
Asn Pro Gin Ala Ser Ala Ser Thr Met Gin Asn 210 215 <210> 28 <211〉224 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 28
Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala lie Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15
Lys lie Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Axg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn lie Phe 35 40 45
Leu lie lie Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met lie Lys Thr Glu Asn 50 55 60
Cys Ala Asn Met Pro Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80
Ser Thr Ala Gly Pro Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 '90 95
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Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gin Thr Ser Asp Thr Thr Ala Pro Gin Gin 115 120 125
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Arg Glu Lys Gly Lys Glu Asn Thr Asn Gin Thr Thr Ser Thr Ala Ala 165 170 175
Thr Gin Thr Thr Asn Thr Thr Asn Gin He Arg Asn Ala Ser Glu Thr 180 185 190 lie Thr Thr Ser Asp Arg Pro Arg Thr Asp Thr Thr Thr Gin Ser Ser 195 200 205
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Met Glu Val Arg Val Glu Asn lie Arg Ala He Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15
Lys Met Lys Asn Arg lie Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30
Leu lie Leu lie Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn He Phe -29 - 83860.doc 1359868 35 40 45
Leu lie lie Asp Tyr Ala Met Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60
Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr 65 70 75 80
Ser Ala Val Asp Leu Asn Thr Lys Pro Asn Pro Gin Gin Ala Thr Gin 85 90 95
Leu Ala Ala Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asp His 100 105 110
Leu His Thr Gly Thr Thr Pro Thr Pro Asp Ala Thr Val Ser Gin Gin 115 120 125
Thr Thr Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Leu Arg Ser Thr Asn Arg Gin Thr 130 135 140
Thr Gin Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Gin Thr Leu Asn 165 170 175
Thr Thr Asn Gin Thr Ser Tyr Val Arg Glu Ala Thr Thr Thr Ser Ala 180 185 190
Arg Ser Arg Asn Ser Ala Thr Thr Gin Ser Ser Asp Gin Thr Thr Gin 195 200 205
Ala Ala Asp Pro Ser Ser Gin Pro His His Thr Gin Lys Ser Thr Thr 210 215 220
Thr Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Ser Ser Pro Ser Ser 225 230 - 235 <210> 30 <211>708 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 30
gaggtgaaag tggagaacat tcgaacaata gatatgctca aagcaagagt aaaaaatcgt 60 gtggcacgca gcaaatgctt taaaaatgcc tctttggtcc tcataggaat aactacattg 120 agtattgccc tcaatatcta tctgatcata aactataaaa tgcaaaaaaa cacatctgaa 180 tcagaacatc acaccagctc atcacccatg gaatccagca gagaaactcc aacggtcccc 240 acagacaact cagacaccaa ctcaagccca cagcatccaa ctcaacagtc cacagaaggc 300 tccacactct actttgcagc ctcagcaagc tcaccagaga cagaaccaac atcaacacca 360 gatacaacaa accgcccgcc cttcgtcgac acacacacaa caccaccaag cgcaagcaga 420 acaaagacaa gtccggcagt ccacacaaaa aacaacccaa ggacaagctc tagaacacat 480 tctccaccac gggcaacgac aaggacggca cgcagaacca ccactctccg cacaagcagc 540 acaagaaaga gaccgtccac agcatcagtc caacctgaca tcagcgcaac aacccacaaa 600 aacgaagaag caagtccagc gagcccacaa acatctgcaa gcacaacaag aatacaaagg 660 aaaagcgtgg aggccaacac atcaacaaca tacaaccaaa ctagttaa 708 <210〉 31 <211〉660 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉 31 atggaggtga aagtagagaa cattcgagca atagacatgc tcaaagcaag agtgaaaaat 60 cgtgtggcac gtagcaaatg ctttaaaaat gcttctttaa tcctcatagg aataactaca 120 -30 - 83860.doc 1359868
ctgagtatag ctctcaatat ctatctgatc ataaactaca caatacaaaa aaccacatcc 180 gaatcagaac accacaccag ctcaccaccc acagaaccca acaaggaagc ttcaacaatc 240 tccacagaca acccagacat caatccaagc tcacagcatc caactcaaca gtccacagaa 300 aaccccacac tcaaccccgc agcatcagcg agcccatcag aaacagaacc agcatcaaca 360 ccagacacaa caaaccgcct gtcctccgta gacaggtcca cagcacaacc aagtgaaagc 420 agaacaaaga caaaaccgac agtccacaca atcaacaacc caaacacagc ttccagtaca 480 caatccccac cacggacaac aacgaaggca atccgcagag ccaccacttt ccgcatgagc 540 agcacaggaa aaagaccaac cacaacatta gtccagtccg acagcagcac cacaacccaa 600 aatcatgaag aaacaggttc agcgaaccca caggcgtctg caagcacaat gcaaaactag 660 <210>32 <211〉675 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 32
atggaagtaa gagtggagaa cattcgagcg atagacatgt tcaaagcaaa gataaaaaac 60 cgtataagaa gcagcaggtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg actaacagcg 120 ttaagcatgg cacttaatat tttcctgatc atcgatcatg caacattaag aaacatgatc 180 aaaacagaaa actgtgctaa catgccgtcg gcagaaccaa gcaaaaagac cccaatgacc 240 tccacagcag gcccaaacac caaacccaat ccacagcaag caacacagtg gaccacagag 300 aactcaacat ccccagtagc aaccccagag ggccatccat acacagggac aactcaaaca 360 tcagacacaa cagctcccca gcaaaccaca gacaaacaca cagcaccgct aaaatcaacc 420 aatgaacaga tcacccagac-aaccacagag aaaaagacaa tcagagcaac aacccaaaaa 480 agggaaaaag gaaaagaaaa cacaaaccaa accacaagca cagctgcaac ccaaacaacc 540 aacaccacca accaaatcag aaatgcaagt gagacaatca caacatccga cagacccaga 600 actgacacca caacccaaag cagcgaacag acaacccggg caacagaccc aagctcccca 660 ccacaccatg catag 675 <210> 33 <211>711 <212〉DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 33 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagacatgt tcaaagcaaa aatgaaaaac 60 cgtataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg attaacagca 120 ttaagtatgg cacttaatat ttttttaatc attgattatg caatgttaaa aaacatgacc 180 aaagtggaac actgtgttaa tatgccgccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc 240 tctgcagtag acttaaacac caaacccaat ccacagcagg caacacagtt ggccgcagag 300 gattcaacat ctctagcagc aacctcagag gaccatctac acacagggac aactccaaca 360 ccagatgcaa cagtctctca gcaaaccaca gacgagtaca caacattgct gagatcaacc 420 aacagacaga ccacccaaac aaccacagag aaaaagccaa ccggagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccacaa ctcgaactac aagcacagct gcaacccaaa cactcaacac taccaaccaa 540 actagctatg tgagagaggc aaccacaaca tccgccagat ccagaaacag tgccacaact 600 caaagcagcg accaaacaac ccaggcagca gacccaagct cccaaccaca ccatacacag 660 aaaagcacaa caacaacata caacacagac acatcctctc caagtagtta a 711 <210> 34 <211> 2005 <212〉蛋白質 <213>人類間質肺病毒 -31 - 83860.doc 1359868 <400〉34
Met Asp Pro Leu Asn Glu Ser Thr Val Asn Val Tyr Leu Pro Asp Ser 1 5 10 15
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Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45
Ala lie Glu Asn Pro Val lie Glu His Val Arg Leu Lys Asn Ala Val 50 55 60
Asn Ser Lys Met Lys lie Ser Asp Tyr Lys lie Val Glu Pro Val Asn 65 70 75 80
Met Gin His Glu lie Met Lys Asn Val His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn He Ser Thr Leu Lys Leu 100 105 110
Asn Met lie Cys Asp Trp Leu Gin Leu Lys Ser Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 125
Ser He Leu Ser Phe lie Asp Val Glu Phe lie Pro Ser Trp Val Ser L30 135 140
Asn Trp Phe Ser Asn Trp Tyr Asn Leu Asn Lys Leu lie Leu Glu Phe 145 150 155 160
Arg Lys Glu Glu Val lie Arg Thr Gly Ser lie Leu Cys Axg Ser Leu 165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe Val Val Ser Ser Tyr Gly Cys lie Val Lys Ser 180 · 185 190
Asn Lys Ser Lys Arg Val Ser Phe Phe Thr Tyr Asn Gin Leu Leu Thr 195 200 205
Trp Lys Asp Val Met Leu Ser Arg Phe Asn Ala Asn Phe Cys lie Trp 210 215 220
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Lys lie Lys Asn Leu Lys Val Leu Ser Lys Arg Trp Thr Met Tyr Phe -32 - 83860.doc 1359868 420 425 430
Lys Ala Lys Ser Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Glu Gin Asp Phe 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala He Gin Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala lie Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Axg Leu He Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Lys 485 490 495 lie Lys Asn Arg Tyr Leu Glu Glu Thr Phe Asn Ala Ser Asp Ser Leu 500 505 510
Lys Thr Arg Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Phe Asp 515 520 525
Gin Lys Glu Leu Lys Ser Tyr Val Val Lys Gin Glu Tyr Leu Asn Asp 530 535 540
Lys Asp His lie Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser Val 545 550 555 560
Gly Arg Met Phe Ala Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin lie Gin lie 565 570 575
Leu Ala Glu Lys Leu Leu Ala Asp Asn lie Val Pro Phe Phe Pro Glu 580 585 590
Thr Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Leu Asp Leu Gin Arg lie Met Glu lie 595 600 605
Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Lys Thr Arg Arg Asa Asp Ser Tyr Asn 610 615- 620
Asn Tyr lie Ala Arg Ala Ser lie Val Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 625 630 635 640
Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala He Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 655
Glu Leu His Gly Thr Gin Ser Leu Phe Cys Trp Leu His Leu lie Val 660 665 670
Pro Met Thr Thr Met lie Cys Ala Tyr Axg His Ala Pro Pro Glu Thr 675 680 685
Lys Gly Glu Tyr Asp lie Asp Lys lie Glu Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 690 695 700
Arg Tyr His Met Gly Gly He Glu Gly Trp Cys Gin Lys Leu Trp Thr 705 710 715 720
Met Glu Ala lie Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg Cys 725 730 735
Gla Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser lie Asp Val Ser 740 745 750
Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly Leu Asp Glu Val Lys Ala Asp Tyr 755 760 765
Ser Leu Ala Val Lys Met Leu Lys Glu lie Arg Asp Ala Tyr Arg Asn 770 775 780 lie Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu Thr Tyr lie Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800
Gin Phe lie Ser Lys Vai lie Gin Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
Pro lie Lys Lys lie Leu Arg Val Gly Pro Trp lie Asn Thr lie Leu 820 825 830
Asp Asp lie Lys Thr Ser Ala Glu Ser He Gly Ser Leu Cys Gin Glu 835 840 845
Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser He lie Val Ser Leu lie Leu Arg Asn -33 - 83860.doc 1359868 850 855 860
Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met His Glu Ser Lys Gin His Pro Leu 865 870 875 880
Ala Gly Lys Gin Leu Phe Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 890 895
Gin Arg Phe Phe Glu lie Lys Lys Glu Asn Glu Val Val Asp Leu Trp 900 905 910
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Arg Ser Phe Tyr Arg Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Glu Ala lie Ser 930 935 940
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Lys lie Ser Phe Phe Lys Ala Leu Leu Ser lie Glu Lys Asn Glu Arg 965 970 975
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Pro Val Tyr Pro His Gly Leu Arg Val Leu Tyr Glu Ser Leu Pro Phe 1045 · 1050 1055
His Lys Ala Glu Lys Val Val Asn Met lie Ser Gly Thr Lys Ser lie 1060 1065 1070
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Arg Ala Val Ser Met Met Leu Glu Asn Leu Gly Leu Leu Ser Arg lie 1090 1095 1100
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Val Lys Pro Leu Leu Pro Arg Phe Met Ser Val Asn Phe Leu His Arg 1250 1255 1260
Leu Ser Val Ser Ser Arg Pro Met Glu Phe Pro Ala Ser Val Pro Ala 1265 1270 1275 1280
Tyr Arg Thr Thr Asn Tyr His Phe Asp Thr Ser Pro lie Asn Gin Ala -34 - 83860.doc 1359868 1285 1290 1295
Leu Ser Giu Arg Phe Gly Asn Glu Asp He Asn Leu Val Phe Gin Asn 1300 1305 1310
Ala lie Ser Cys Gly lie Ser lie Met Ser Val Val Glu Gin Leu Thr 1315 1320 1325
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Gly Asp Gly Phe He Ser Asp His Ala Phe Met Asp Phe Lys lie Phe 1445 1450 1455
Leu Cys Val Phe Lys Thr Lys Leu Leu Cys Ser Trp Gly Ser Gin Gly 1460 1465 1470
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Leu Arg lie Asp Asn Thr Phe Trp Arg Met Phe Ser Lys Val Met Phe 1490 1495 1500
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Arg Ser Ala Glu Leu His Glu Val Pro Trp lie Vai Asn Ala Glu Gly 1540 1545 1550
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Gin Ser Leu Phe Leu Arg lie Thr Val Leu Asn Tyr Thr Asp Met Ala 1570 1575 1580 _
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Gly Lys Leu Met Lys Asp Leu Asn Pro Lys Val Leu Tyr Phe lie Gly 1685 1690 1695
Glu Gly Ala Gly Asn Trp Met Ala Arg Thr Ala Cys Glu Tyr Pro Asp 1700 1705 1710 lie Lys Phe Val Tyr Arg Ser Leu Lys Asp Asp Leu Asp His His Tyr -35 - 83860.doc 1359868 1715 1720 1725
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Glu Ala Leu Glu Asn Thr Tyr Pro Asn Met lie Lys Leu lie Asp Asn 1970 1975 1980
Leu Gly Asn Ala Glu He Lys Lys Leu lie Lys Val Thr Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005 <210> 35 <211> 2005 <2丨2>蛋白質 <2i3>人類間質肺病毒 <400> 35
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Cys Leu Leu Lys Arg Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Asn Thr Ala Lys Val 35 40 45
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Asn Leu Gin Gly Met Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
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Lys Ala Lys Asn Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Glu Gin Asp Phe 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala He Gin Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala lie Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Arg Leu lie Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Thr 485 490 495 -37 - 83860.doc 1359868 lie Lys Asn Arg Tyr Leu Glu Glu Thr Phe Asn Ala Ser Asp Ser Leu 500 505 510
Lys Thr Ar£ Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Phe Asp 515 520 525
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Leu Gly Asn Ala Glu lie Lys Lys Leu He Lys Val Thr Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
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Met Gin His Glu lie Met Lys Asn lie His Ser Cys Glu Leu Thr Leu 85 90 95
Leu Lys Gin Phe Leu Thr Arg Ser Lys Asn lie Ser Ser Leu Lys Leu 100 105 110
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Asn Leu Gin Gly Met Leu Thr Asn Lys Leu Tyr Glu Thr Val Asp Tyr 245 250 255
Met Leu Ser Leu Cys Cys Asn Glu Gly Phe Ser Leu Val Lys Glu Phe 260 265 270
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Leu Ser Val Leu Lys Ala Lys Asn Arg Ser Arg Val Leu Gly Thr lie 305 310 315 320
Leu Glu Asn Asn Asn Tyr Pro Met Tyr Glu Val Val Leu Lys Leu Leu 325 ； 330 335
Gly Asp Thr Leu Lys Ser lie Lys Leu Leu lie Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 350
Asn Ala Ala Glu Leu Tyr Tyr lie Phe Arg lie Phe Gly His Pro Met 355 360 365
Val Asp Glu Arg Glu Ala Met Asp Ala Val Lys Leu Asn Asn Glu lie 370 375 380
Thr Lys He Leu Lys Leu Glu Ser Leu Thr Glu Leu Arg Gly Ala Phe 385 390 395 400 lie Leu Arg lie He Lys Gly Phe Val Asp Asn Asn Lys Arg Trp Pro 405 410 415
Lys lie Lys Asn Leu Lys Val Leu Ser Lys Arg Trp Ala Met Tyr Phe 420 425 430
Lys Ala Lys Ser Tyr Pro Ser Gin Leu Glu Leu Ser Val Gin Asp Phe 435 440 445
Leu Glu Leu Ala Ala Val Gin Phe Glu Gin Glu Phe Ser Val Pro Glu 450 455 460
Lys Thr Asn Leu Glu Met Val Leu Asn Asp Lys Ala lie Ser Pro Pro 465 470 475 480
Lys Lys Leu lie Trp Ser Val Tyr Pro Lys Asn Tyr Leu Pro Glu Thr 485 . 490 495 lie Lys Asn Gin Tyr Leu Glu Glu Ala Phe Asn Ala Ser Asp Ser Gin 500 505 510
Arg Thr Axg Arg Val Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Asp Cys Lys Phe Asp 515 520 525
Gin Lys Glu Leu Lys Arg Tyr Val lie Lys Gin Glu Tyr Leu Asn Asp 530 535 540
Lys Asp His lie Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser Val 545 550 555 560
Gly Arg Met Phe Ala Met Gin Pro Gly Lys Gin Arg Gin He Gin He 565 570 575 -42-- 83860.doc 1359868
Leu Ala Glu Lys Leu Leu Ala Asp Asn lie Val Pro Phe Phe Pro Glu 580 585 590
Thr Leu Thr Lys Tyr Gly Asp Leu Asp Leu Gin Arg He Met Glu He 595 600 605
Lys Ser Glu Leu Ser Ser lie Lys Thr Arg Lys Asn Asp Ser Tyr Asn 610 615 620
Asn Tyr lie Ala Arg Ala Ser lie Val Thr Asp Leu Ser Lys Phe Asn 625 630 635 640
Gin Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Thr Ala lie Cys Ala Asp Val Ala Asp 645 650 . 655
Glu Leu His Gly Thr Gin Ser Leu Phe Cys Trp Leu His Leu lie Val 660 665 670
Pro Met Thr Thr Met lie Cys Ala Tyr Arg His Ala Pro Pro Glu Thr 675 680 685
Lys Gly Glu Tyr Asp lie Asp Lys lie Gin Glu Gin Ser Gly Leu Tyr 690 695 700
Arg Tyr His Met Gly Gly lie Glu Gly Trp Cys Gin Lys Leu Trp Thr 705 710 715 720
Met Glu Ala lie Ser Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg Cys 725 730 735
Gin Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gin Ser He Asp Val Ser 740 745 750
Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly lie Asp Glu Val Lys AJa Asp Tyr 755 760 765
Ser Leu Ala lie Arg Met Leu Lys Glu lie Arg Asp Ala Tyr Lys Asn 770 775 780 lie Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu Thr Tyr He Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800
Gin Phe lie Ser Lys Val lie Gin Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815
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Leu Glu Phe Axg Gly Glu Ser lie Leu Val Ser Leu lie Leu Arg Asn 850 855 860
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Ala Gly Lys Gin Leu Phe Lys Gin Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 890 895
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Met Asn lie Pro Met Gin Phe Gly Gly Gly Asp Pro Val Val Phe Tyr 915 920 .925
Arg Ser Phe Tyr Arg Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Glu Ala lie Ser 930 935 940
His Val Asp Leu Leu Leu Lys Val Ser Asn Asn He Lys Asp Glu Thr 945 950 955 960
Lys lie Arg Phe Phe Lys Ala Leu Leu Ser lie Glu Lys Asn Glu Arg 965 970 975
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Arg Gin Ala Lys Val Thr Ser Asp lie Asn Arg Thr Ala Val Thr Ser 995 1000 1005 • 43 - 83860.doc 1359868 lie Leu Ser Leu Ser Pro Asn Gin Leu Phe Cys Asp Ser Ala He His 1010 1015 1020
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Leu Axg He Asp Asn Thr Phe Trp Arg Met Phe Ser Lys Val Met Phe 1490 1495 1500
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Leu Ser Met Leu Lys Ala Lys Asn Arg Ser Arg Val Leu Gly Thr lie 305 310 315 320
Leu Glu Asn Asn Asp Tyr Pro Met Tyr Glu Val Val Leu Lys Leu Leu 325 330 335 .
Gly Asp Thr Leu Lys Ser lie Lys Leu Leu lie Asn Lys Asn Leu Glu 340 345 350
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Leu Gly Asn Ala Glu lie Lys Lys Leu lie Lys Val Pro Gly Tyr Met 1985 1990 1995 2000
Leu Val Ser Lys Lys 2005
<210〉 38 <211〉6018 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉38 atggatcctc tcaatgaatc cactgttaat gtctatcttc ctgactcata tcttaaagga 60 gtgatttcct ttagtgagac taatgcaatt ggttcatgtc tcttaaaaag accttaccta 120 aaaaatgaca acactgcaaa agttgccata gagaatcctg ttatcgagca tgttagactc 180 aaaaatgcag tcaattctaa gatgaaaata tcagattaca agatagtaga gccagtaaac 240 atgcaacatg aaattatgaa gaatgtacac agttgtgagc tcacattatt aaaacagttt 300 ttaacaagga gtaaaaatat tagcactctc aaattaaata tgatatgtga ttggctgcag 360 ttaaagtcta catcagatga tacctcaatc ctaagtttta tagatgtaga atttatacct 420 agctgggtaa gcaattggtt tagtaattgg tacaatctca acaagttgat tctggaattc 480 aggaaagaag aagtaataag.aactggttca atcttgtgta ggtcattggg taaattagtt 540 tttgttgtat catcatatgg atgtatagtc aagagcaaca aaagcaaaag agtgagcttc 600 ttcacataca atcaactgtt aacatggaaa gatgtgatgt taagtagatt caatgcaaat 660 ttttgtatat gggtaagcaa cagtctgaat gaaaatcaag aagggctagg gttgagaagt 720 aatctgcaag gcatattaac taataagcta tatgaaactg tagattatat gcttagttta 780 tgttgcaatg aaggtttctc acttgtgaaa gagttcgaag gctttattat gagtgaaatt 840 cttaggatta ctgaacatgc tcaattcagt actagattta gaaatacttt attaaatgga 900 ttaactgatc aattaacaaa attaaaaaat aaaaacagac tcagagttca tggtaccgtg 960 ttagaaaata atgattatcc aatgtacgaa gttgtactta agttattagg agatactttg 1020 agatgtatta aattattaat caataaaaac ttagagaatg ctgctgaatt atactatata 1080 tttagaatat tcggtcaccc aatggtagat gaaagagatg caatggatgc tgtcaaatta 1140 aacaatgaaa tcacaaaaat ccttaggtgg gagagcttga cagaactaag aggggcattc 1200 atattaagga ttatcaaagg atttgtagac aacaacaaaa gatggcccaa aattaaaaac 1260 ttaaaagtgc ttagtaagag atggactatg tacttcaaag caaaaagtta ccccagtcaa 1320 cttgaattaa gcgaacaaga ttttttagag cttgctgcaa tacagtttga acaagagttt 1380 tctgtccctg aaaaaaccaa ccttgagatg gtattaaatg ataaagctat atcacctcct 1440 aaaagattaa tatggtctgt gtatccaaaa aattacttac ctgagaaaat aaaaaatcga 1500 tatctagaag agactttcaa tgcaagtgat agtctcaaaacaagaagagt actagagtac 1560 tatttgaaag ataataaatt cgaccaaaaa gaacttaaaa gttatgtigt taaacaagaa 1620 tatttaaatg ataaggatca tattgtctcg ctaactggaa aagaaagaga attaagtgta 1680 ggtagaatgt ttgctatgca accaggaaaa cagcgacaaa tacaaatatt ggctgaaaaa 1740 ttgttagctg ataatattgt accttttttc ccagaaacct taacaaagta tggtgatcta 1800 gatcttcaga gaataatgga aatcaaatcg gaactttctt ctattaaaac tagaagaaat 1860 gatagttata ataattacat tgcaagagca tccatagtaa cagatttaag taagttcaac 1920 caagccttta ggtatgaaac tacagcgatc tgtgcggatg tagcagatga actacatgga 1980 acacaaagcc tattctgttg gttacatctt atcgtcccta tgacaacaat gatatgtgcc 2040 tatagacatg caccaccaga aacaaaaggt gaatatgata tagataagat agaagagcaa 2100 agtggtttat atagatatca tatgggtggt attgaaggat ggtgtcaaaa actctggaca 2160 atggaagcta tatctctatt agatgttgta tctgtaaaaa cacgatgtca aatgacatct 2220 ttattaaacg gtgacaacca atcaatagat gtaagtaaac cagttaagtt atctgagggt 2280 -51 - 83860.doc 1359868 ttagatgaag tgaaagcaga ttatagcttg gctgtaaaaa tgttaaaaga aataagagat 2340 gcatacagaa atataggcca taaacttaaa gaaggggaaa catatatatc aagagatctt 2400 cagtttataa gtaaggtgat tcaatctgaa ggagtaatgc atcctacccc tataaaaaag 2460 atcttaagag tgggaccatg gataaacaca atattagatg acattaaaac cagtgcagag 2520 tcaataggga gtctatgtca ggaattagaa tttagggggg aaagcataat agttagtctg 2580 atattaagga atttttggct gtataattta tacatgcatg aatcaaagca acacccccta 2640 gcagggaagc agttattcaa acaactaaat aaaacattaa catcagtgca gagatttttt 2700 gaaataaaaa aggaaaatga agtagtagat ctatggatga acataccaat gcagtttgga 2760 ggaggagatc cagtagtctt ctatagatct ttctatagaa ggacccctga ttttttaact 2820 gaagcaatca gtcatgtgga tattctgtta agaatatcag ccaacataag aaatgaagcg 2880 aaaataagtt tcttcaaagc cttactgtca atagaaaaaa atgaacgtgc tacactgaca 2940 acactaatga gagatcctca agctgttggc tcagagcgac aagcaaaagt aacaagtgat 3000 atcaatagaa cagcagttac cagcatctta agtctttctc caaatcaact tttcagcgat 3060 agtgctatac actacagtag aaatgaagaa gaggtcggaa tcattgctga caacataaca 3120 cctgtttatc ctcatggact gagagttttg tatgaatcat taccttttca taaagctgaa 3180 aaagttgtga atatgatatc aggaacgaaa tccataacca acttactaca gagaacatct 3240 gctattaatg gtgaagatat tgacagagct gtatccatga tgctggagaa cctaggatta 3300 ttatctagaa tattgtcagt agttgttgat agtatagaaa ttccaaccaa atctaatggt 3360 aggctgatat gttgtcagat atctagaacc ctaagggaga catcatggaa taatatggaa 3420 atagttggag taacatcccc tagcatcact acatgcatgg atgtcatata tgcaactagc 3480 tctcatttga aagggataat cattgaaaag ttcagcactg acagaactac aagaggtcaa 3540 agaggtccaa agagcccttg ggtagggtcg agcactcaag agaaaaaatt agttcctgtt 3600 tataacagac aaattctttc aaaacaacaa agagaacagc tagaagcaat tggaaaaatg 3660 agatgggtat ataaagggac accaggttta agacgattac tcaataagat ttgtcttgga 3720 agtttaggca ttagttacaa atgtgtaaaa cctttattac ctaggtttat gagtgtaaat 3780 ttcctacaca ggttatctgt cagtagtaga cctatggaat tcccagcatc agttccagct 3840 tatagaacaa caaattacca ttttgacact agtcctatta atcaagcact aagtgagaga 3900 tttgggaatg aagatattaa tttggccttc caaaatgcaa tcagctgtgg aattagcata 3960 atgagtgtag tagaacaatt aactggtagg agtccaaaac agttagtttt aatacctcaa 4020 ttagaagaaa tagacattat gccaccacca gtgtttcaag ggaaattcaa ttataagcta 4080 gtagataaga taacttctga tcaacatatc ttcagtccag acaaaataga tatgttaaca 4140 ctggggaaaa tgctcatgcc cactataaaa ggtcagaaaa cagatcagtt cctgaacaag 4200 agagagaatt atttccatgg gaataatctt attgagtctt tgtcagcagc gttagcatgt 4260 cattggtgtg ggatattaac agagcaatgt atagaaaata atattttcaa gaaagactgg 4320 ggtgacgggt tcatatcgga tcatgctttt atggacttca aaatattcct atgtgtcttt 4380 aaaactaaac ttttatgtag ttgggggtcc caagggaaaa acattaaaga tgaagatata 4440 gtagatgaat caatagataa actgttaagg attgataata ctttttggag aatgttcagc 4500 aaggttatgt ttgaatcaaa ggttaagaaa aggataatgt tatatgatgt aaaatttcta 4560 tcattagtag gttatatagg gtttaagaat tggtttatag aacagttgag atcagctgag 4620 ttgcatgagg taccttggat tgtcaatgcc gaaggtgatc tggttgagat caagtcaatt 4680 aaaatctatt tgcaactgat agagcaaagt ttatttttaa gaataactgt tttgaactat 4740 acagatatgg cacatgctct cacaagatta atcagaaaga agttgatgtg tgataatgca 4800 ctattaactc cgattccatc cccaatggtt aatttaactc aagttattga tcctacagaa 4860 caattagctt atttccctaa gataacattt gaaaggctaa aaaattatga cactagttca 4920 aattatgcta aaggaaagct aacaaggaat tacatgatac tgttgccatg gcaacatgtt 4980 aatagatata actttgtctt tagttctact ggatgtaaag ttagtctaaa aacatgcatt 5040 ggaaaactta tgaaagatct aaaccctaaa gttctgtact ttattggaga aggggcagga 5100 aattggatgg ccagaacagc atgtgaatat cctgacatca aatttgtata cagaagttta 5160 aaagatgacc ttgatcatca ttatcctttg gaataccaga gagttatagg agaattaagc 5220 aggataatag atagcggtga agggctttca atggaaacaa cagatgcaac tcaaaaaact 5280 cattgggatt tgatacacag agtaagcaaa gatgctttat taataacttt atgtgatgca 5340 gaatttaagg acagagatga tttttttaag atggtaattc tatggaggaa acatgtatta 5400 tcatgcagaa tttgcactac ttatgggaca gacctctatt tattcgcaaa gtatcatgct 5460 aaagactgca atgtaaaatt accttttttt gtgagatcag tagccacctt tattatgcaa 5520 -52 - 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Leu He Leu Ser Tyr Met Glu Met Ser Lys Thr Pro Ala Ser Leu lie 130 135 140
Asn Asn Leu Lys Lys Leu Pro Arg Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys 145 150 155 160
Leu lie lie Asp Leu Ser Ala Gly Thr Asp Asn Asp Ser Ser Tyr Ala 165 170 175
Leu Gin Asp Ser Glu Ser Thr Asn Gin Vai Gin 180 185
<210〉 46 <211>564 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 46 atgtctcgca aggctccgtg caaatatgaa gtgcggg£ca aatgcaatag aggaagtgag 60 tgcaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaat 120 tatttattaa atcaactttt aaggaacact gatagagctg atggcttatc aataatatca 180 ggagcaggca gagaagatag gacacaagat tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgttacag tctacataat 300 ataatcaaac aactacaaga agttgaagrt aggcaggcta gagataacaa actatctgac 360 agcaaacatg tagcacttca caacttagtc ctatcttata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctttaa tcaacaatct caagagactg ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag 480 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 • 61 -
83860.doc 1359868 564 gaaagcacta atcaagtgca gtga
<210> 47 <211>564 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 47
atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag aggaagtgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctttt aaggaacact gatagagctg atggcctatc aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat tttgttctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg tggcactcca taacttaatc ttatcttaca tggagatgag caaaactccc 420 gcatctttaa tcaacaatct taaaagactg ccgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 480 ctgataattg acttatcagc aggcgctgac aatgactctt catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtga 564 <210> 48 <211>564 <212> DNA <2!3>人類間質肺病毒 <400> 48
atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgat 60 tgcaaattca atcacaatta ctggagttgg cctgatagat atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctttt aagaaacaca gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg atgacaacca aggaataacc aaggctgcag cttgctatag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga aacagaagta agacaggcta gagacaacaa gctttctgat 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210> 49 <211>564 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉 49 atgtctcgca aagctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga aatagaagta agacaggcta gagataataa gctttctgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210〉 50 -62 - 83860.doc 1359868 <211>71 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 50
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Trp Thr His Lys Asp Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45
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Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 - 10 15
Ser Glu His Gly Pro Val Phe He Thr lie Glu Val Asp Glu Met lie 20 25 30
Trp Thr Gin Lys Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45
Ser His Thr Asn lie Tyr Asn Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu He lie 50 55 60
Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210>52 <211>71 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 52
Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15
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Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly lie Val Lys 35 40 45 '
Ser His Thr Asn lie Tyr Ser Cys Tyr Leu Glu Asn lie Glu lie lie 50 55 60
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Met Thr Leu His Met Pro Cys Lys Thr Val Lys Ala Leu lie Lys Cys 1 5 10 15
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Trp Thr His Lys Glu Leu Lys Glu Thr Leu Ser Asp Gly He Val Lys 35 40 45
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Tyr Val Lys Ala Tyr Leu Ser 65 70 <210> 54 <211〉216 <212> DNA <2!3>人類間質肺病毒 <400> 54 atgactcttc atatgccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 ccagttttca ttactataga ggttgatgac atgatatgga ctcacaagga cttaaaagaa 120 gctttatctg atgggatagt gaagtctcat actaacattt acaattgtta tttagaaaac 180 atagaaatta tatatgtcaa ggcttactta agttag 216
<210> 55 <211〉216 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 55 atgactcttc atatgccctg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag tgagcatggt 60 cctgttttca ttactataga ggttgatgaa atgatatgga ctcaaaaaga attaaaagaa 120 gctttgtccg atgggatagt gaagtctcac accaacatu acaattgtta utagaaaac 180 atagaaatta tatatgtcaa ggcttactta agttag 216
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<210> 57 <211>216 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 83860.doc - 64 · 1359868 <400> 57 atgactcttc aiatgccttg caagacagtg aaagcactaa tcaagtgcag taagcatggt 60 cccaaattca ttaccataga ggcagatgat atgatatgga cacacaaaga attaaaggag 120 acactgtctg atgggatagt aaaatcacac accaatattt acagttgtta tttagaaaat 180 atagaaataa tatatgttaa agcttactta agttag 216
<210> 58 <211>727 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 58
atgtctcgca aggctccgtg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag 60 tgcaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaat 120 tatttattaa atcaactttt aaggaacact gatagagctg atggcttatc aataatatca 180 ggagcaggca gagaagatag gacacaagat tttgtcctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgttacag tctacataat 300 ataatcaaac aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagataacaa actatctgac 360 agcaaacatg tagcacttca caacttagtc ctatcttata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctttaa tcaacaatct caagagactg ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag 480 ctcataattg acttatcagc aggtgctgaa aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg tccagttttc attactatag aggttgatga 600 catgatatgg actcacaagg acttaaaaga agctttatct gatgggatag tgaagtctca 660 tactaacatt tacaattgtt atttagaaaa catagaaatt atatatgtca aggcttactt 720 aagttag 727 <210> 59 <211〉727 <212> DNA <2丨3>人類間質肺病毒 <400〉 59 atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag aggaagtgag 60 tgtaagttta accacaatta ctggagttgg ccagatagat acttattaat aagatcaaac 120 tatctattaa atcagctttt aaggaacact gatagagctg atggcctatc aataatatca 180 ggcgcaggca gagaagacag aacgcaagat tttgttctag gttccaccaa tgtggttcaa 240 ggttatattg atgataacca aagcataaca aaagctgcag cctgctacag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga agttgaagtt aggcaggcta gagatagcaa actatctgac 360 agcaagcatg tggcactcca taacttaatc ttatcttaca tggagatgag caaaactccc 420 gcatctttaa tcaacaatct taaaagactg ccgagagaaa aactgaaaaa attagcaaag 480 ctgataattg acttatcagc aggcgctgac aatgactctt catatgccct gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtgagcatgg tcctgttttc attactatag aggttgatga 600 .aatgatatgg actcaaaaag aattaaaaga agctttgtcc gatgggatag tgaagtctca 660 caccaacatt tacaattgtt atttagaaaa catagaaatt atatatgtca aggcttactt 720 aagttag 727
<210> 60 <211>727 <212> DNA <2!3>人類間質肺病毒 <400〉 60 atgtctcgta aggctccatg caaatatgaa gtgcggggca aatgcaacag agggagtgat 60 -65 - 83860.doc 1359868
tgcaaattca atcacaatta ctggagttgg cctgatagat atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttaa atcagctm aagaaacaca gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag aactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg atgacaacca aggaataacc aaggctgcag cttgctatag tctacacaac 300 ataatcaagc aactacaaga aacagaagta agacaggcta gagacaacaa gctttctgat 360 agcaaacatg tggcgctcca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaaacatgg tcccaaattc attaccatag aggcagatga 600 tatgatatgg actcacaaag aattaaaaga aacactgtct gatgggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tatagttgtt acttagaaaa tatagaaata atatatgtta aaacttactt 720 aagttag 727 <210〉 61 <211>727 <212> DNA <213〉人類間質肺病毒 <400〉 61 atgtctcgca aagctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga、aatagaagta agacaggcta gagataataa gctttctgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaagcatgg tcccaaattc attaccatag aggcagatga 600 tatgatatgg acacacaaag aattaaagga gacactgtct gatgggatag taaaatcaca 660 caccaatatt tacagttgu atttagaaaa tatagaaata atatatgtta aagcttactt 720 aagttag 727 <210> 62 <211〉 254 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400〉62
Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15
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Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60
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Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95
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Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr lie Thr Thr Leu Tyr Ala Aia Ser 50 55 60
Gin Ser Gly Pro He Leu Lys Val Asn Ala Ser Ala Gin Gly Ala Ala 65 70 75 80
Met Ser Val Leu Pro Lys Lys Phe Glu Val Asn Ala Thr Val Ala Leu 85 90 95
Asp Glu Tyr Ser Lys Leu Glu Phe Asp Lys Leu Thr Val Cys Glu Val 100 105 110
Lys Thr Val Tyr Leu Thr Thr Met Lys Pro Tyr Gly Met Val Ser Lys 115 120 125
Phe Val Ser Ser Ala Lys Ser Val Gly Lys Lys Thr His Asp Leu lie 130 135 140
Ala Leu Cys Asp Phe Met Asp Leu Glu Lys Asn Thr Pro Val Thr lie 145 150 155 160
Pro Ala Phe lie Lys Ser Val Ser lie Lys Glu Ser Glu Ser Ala Thr 165 170 175
Val Glu Ala Ala lie Ser Ser Glu Ala Asp Gin Ala Leu Thr Gin Ala 180 185 190
Lys He Ala Pro Tyr Ala Gly Leu He Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gin Val He Val 210 215 220
Glu Leu Gly Ala Tyr Val Gin Ala Glu Ser He Ser Lys He Cys Lys -67 - 83860.doc 1359868 225 230 235 240
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Met Glu Ser Tyr Leu Val Asp Thr Tyr Gin Gly lie Pro Tyr Thr Ala 1 5 10 15
Ala Val Gin Val Asp Leu Val Glu Lys Asp Leu Leu Pro Ala Ser Leu 20 25 30
Thr lie Trp Phe Pro Leu Phe Gin Ala Asn Thr Pro Pro Ala Val Leu 35 40 45
Leu Asp Gin Leu Lys Thr Leu Thr He Thr Thr Leu Tyr Ala Ala Ser 50 55 60
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Lys lie Ala Pro Tyr Ala Gly Leu lie Met lie Met Thr Met Asn Asn 195 200 205
Pro Lys Gly lie Phe Lys Lys Leu Gly Ala Gly Thr Gin Vai lie Val 210 215 220
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<2I0> 66 <211>765 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 66
atggagtcct acctagtaga cacctatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctaatag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc tttgtttcag 120 gccaacacac caccagcagt gctgctcgat cagctaaaaa ccctgacaat aaccactctg 180 tatgctgcat cacaaaatgg tccaatactc aaagtgaatg catcagccca aggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa atttgaagtc aatgcgactg tagcactcga tgaatatagc 300 aaactggaat ttgacaaact cacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatacg ggatggtatc aaaatttgtg agctcagcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagctactgt tgaagctgct 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacctta tgcgggatta 600 attatgatca tgactatgaa caatcccaaa ggcatattca aaaagcttgg agctgggact 660 caagtcatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagcaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaagggac aagatatgtc ttgaagtcca gataa 765 <210> 67 <211>765 <2i2> DNA -69 - 83860.doc 1359868 <213>人類間質肺病毒 <400〉 67 atggagtcct atctggtaga cacttatcaa ggcatccctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctagtag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc cttgtttcag 120 gccaatacac caccagcagt tctgcttgat cagctaaaga ctctgactat aactactctg 180 tatgctgcat cacaaagtgg tccaatacta aaagtgaatg catcagccca gggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa gtttgaagtc aatgcgactg tagcacttga cgaatatagc 300 aaattagaat ttgacaaact tacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatatg ggatggtatc aaagtttgtg agcteggcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcattatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc agttacaata 480 ccagcattta tcaaatcagt ttctatcaag gagagtgaat cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caagccaaaa ttgcacctta tgcgggactg 600 atcatgatta tgaccatgaa caatcccaaa ggcatattca agaagcttgg agctgggacc 660 caagttatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagtaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaaggaac aagatatgtg ctgaagtcca gttaa 765
<210> 68 <211>765 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉 68 atggagtcct atctagtaga cacttatcaa ggcattccat atacagctgc tgttcaagtt 60 gacctgg邮 aaaaagattt ^ictgccagca agtttgacaa tatggtttcc tttatttcag 120 gccaacacac caccagcagt tctgcttgat cagctaaaaa ccttgacaat aacaactctg 180 tatgctgcat cacagaatgg tccaatactc aaggtaaatg catctgccca aggtgctgcc 240 atgtctgtac ttcccaaaaa attcgaggta aatgcaactg tagcacttga tgaatacagt 300 aaacttgatt ttgacaagct gacggtctgc gatgttaaaa cagtttattt gacaactatg 360 aaaccgtacg ggatggtgtc aaaatttgtg agttcagcca aatcagttgg caaaaagaca 420 catgatctaa ttgcactatg tgacttcatg gacctagaga aaaatatacc tgtgacaata 480 ccagcattca taaagtcagt ttcaatcaaa gagagtgaat cagccactgt tgaagctgca 540 ataagcagcg aagccgacca agccttgaca caagccaaga ttgcgcccta tgcaggacta 600 attatgatca tgaccatgaa caatccaaaa ggtatattca agaaactagg ggctggaaca 660 caagtgatag tagagctggg ggcatatgtt caggctgaga gcatcagtag gatctgcaag 720 agctggagtc accaaggaac aagatacgta ctaaaatcca gataa 765
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Lys Arg Ser Gin Ser lie lie Gly Glu Lys Val Asa Thr Val Ser Glu 35 40 45
Thr Leu Glu Leu Pro Thr lie Ser Arg Pro Thr Lys Pro Thr lie Leu 50 55 60
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Glu Ala Lys Gly Lys Ala Ala Glu Met Met Glu Glu Glu Met Asn Gin 225 230 235 240
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Glu Glu Glu Glu Pro Lys Asp Thr Gin Glu Asn Asn Gin Glu Asp Asp 275 280 285 -78 - 83860.doc 1359868 lie Tyr Gin Leu He Met 290 <210> 80 <211>294 <212〉蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400> 80
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Glu Leu Asn Lys lie Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Glu Ser Glu 260 265 270
Glu Glu Glu Glu Pro Lys Glu Thr Gin Asp Asn Asn Gin Gly Glu Asp 275 280 285 lie Tyr Gin Leu lie Met 290 <210>81 <211>294 <2^>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 -79 - 83860.doc 1359868 <400〉 81
Met Ser Phe Pro Glu Gly Lys Asp lie Leu Phe Met Gly Asn Glu Ala 1 5 10 15
Ala Lys lie Ala Glu Ala Phe Gin Lys Ser Leu Lys Arg Ser Gly His 20 25 30
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Thr Leu Glu Leu Pro Thr He Ser Lys Pro Ala Arg Ser Ser Thr Leu 50 55 60
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Thr Ser Asn Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Lys Leu Glu Lys Asp Ala Leu 130 135 140
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Glu Ser lie Glu Glu Lys Leu Ser Met lie Leu Gly Leu Leu Arg Thr 180 185 190
Leu Asn lie Ala Thr Ala Gly Pro Thr Ala Ala Arg Asp Gly lie Axg 195 200 205
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Glu Leu Asn Lys lie Val Glu Asp Glu Ser Thr Ser Gly Glu Ser Glu 260 265 270
Glu Glu Glu Glu Pro Lys Glu Thr Gin Asp Asn Asn Gin Gly Glu Asp 275 280 285 lie Tyr Gin Leu lie Met 290
<210> 82 <211>885 <212> DNA <2Π>人類間質肺病毒 <400〉82 atgtcattcc ctgaaggaaa agatattctt ttcatgggta atgaagcagc aaaattagca 60 gaagctttcc agaaatcatt aagaaaacca ggtcataaaa gatctcaatc tattatagga 120 gaaaaagtga atactgtatc agaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctgcaaaa 180 ccaaccatac cgtcagaacc aaagttagca tggacagata aaggtggggc aaccaaaact 240 gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggat cccattgaag aagaagagtc taccgagaag 300 aaggtgctac cctccagtga tg£gaaaacc cctgcagaaa agaaactgaa accatcaact 360 -80 - 83860.doc 1359868 aacaccaaaa agaaggtttc atttacacca aatgaaccag ggaaatatac aaagttggaa 420 aaagatgctc tagatttgct ctcagataat gaagaagaag atgcagaatc ttcaatctta 480 acctttgaag aaagagatac ttcatcatta agcattgagg ccagattgga atcaatagag 540 gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcaggaccc 600 acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggcg taagagagga attaatagca 660 gacataataa aggaagctaa agggaaagca gcagaaatga tggaagagga aatgagtcaa 720 cgatcaaaaa taggaaatgg tagtgtaaaa ttaacagaaa aagcaaaaga gctcaacaaa 780 attgttgaag atgaaagcac aagtggagaa tccgaagaag aagaagaacc aaaagacaca 840 caagacaata gtcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtag 885 <210〉83 <211>885 <212> DNA . <213>人類間f肺病毒 <400〉 83 atgtcattcc ctgaaggaaa agatattctt ttcatgggta atgaagcagc aaaattggca 60 gaagcttttc aaaaatcatt aagaaaacct aatcataaaa gatctcaatc tattatagga 120 gaaaaagtga acactgtatc tgaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctaccaaa 180 ccgaccatat tgtcagagcc gaagttagca tggacagaca aaggtggggc aatcaaaact 240 gaagcaaagc aaacaatcaa agttatggat cctattgaag aagaagagtt tactgagaaa 300 agggtgctgc cctccagtga tgggaaaact cctgcagaaa agaagttgaa accatcaacc 360 aacactaaaa agaaggtctc atttacacca aatgaaccag gaaaatacac aaagttggag 420 aaagatgctc tagacttgct ttcagacaat gaagaagaag atgcagaatc c；tcaatctta 480 accttcgaag aaagagatac ttcatcatta agcattgaag ccagactaga atcgattgag 540 gagaaattaa gcatgatatt agggctatta agaacactca acattgctac agcag-gaccc 600 acagcagcaa gagatgggat cagagatgca atgattggca taagggagga actaatagca 660 gacataataa aagaagccaa gggaaaagca gcagaaatga tggaagaaga aatgaaccag 720 cggacaaaaa taggaaacgg tagtgtaaaa ttaactgaaa aggcaaagga gctcaacaaa 780 attgttgaag acgaaagcac aagtggtgaa tccgaagaag aagaagaacc aaaagacaca 840 caggaaaata atcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtag 885
<210> 84 <211〉 885 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉84 atgtcattcc ctgaaggaaa ggatattctg ttcatgggta atgaagcagc aaaaatagcc 60 gaagctttcc agaaatcact gaaaaaatca ggtcacaaga gaactcaatc tattgtaggg 120 gaaaaagtta acactatatc agaaactcta gaactaccta ccatcagcaa acctgcacga 180 tcatctacac tgctggaacc aaaattggca tgggcagaca acagcggaat caccaaaatc 240 acagaaaaac cagcaaccaa aacaacagat cctgttgaag aagaggaatt caatgaaaag 300 aaagtgttac cttccagtga tgggaagact cctgcagaga aaaaatcaaa-gttttcaacc 360 agtgtaaaaa agaaagtttc ctttacatca aatgaaccag ggaaatacac caaactagag 420 aaagatgccc tagatttgct ctcagacaat gaggaagaag acgcagaatc ctcaatccta 480 acttttgagg agaaagatac atcatcacta agcattgaag ctagactaga atctatagaa 540 gagaagttga gcatgatatt aggactgctt cgtacactta acattgcaac agcaggacca 600 acagctgcac gagatggaat tagggatgca atgattggta taagagaaga gctaatagca 660 gagataatta aggaagccaa gggaaaagca gctgaaatga tggaagaaga gatgaatcaa 720 agatcaaaaa taggaaatgg cagtgtaaaa ctaaccgaga aggcaaaaga gctcaacaaa 780 attgttgaag acgagagcac aagcggtgaa tcagaagaag aagaagaacc aaaagaaact 840 caggataaca atcaaggaga agatatttat cagttaatca tgtag 885 -81- 83860.doc 1359868
<210> 85 <211>885 <2i2> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉85 atgtcattcc ctgaaggaaa agatatcctg ttcatgggta atgaagcagc aaaaatagca 60 gaagctttcc agaaatcact aaaaagatca ggtcacaaaa gaacccagtc tattgtaggg 120 gaaaaagtaa acactatatc agaaactcta gagctaccta ccatcagcaa acctgcacga 180 tcatctacac tgctagagcc aaaattggca tgggcagaca gcagcggagc caccaaaacc*240 acagaaaaac aaacaaccaa aacaacagat cctgttgaag aagaggaact caatgaaaag 300 aaggtatcac cttccagtga tgggaagact cctgcagaga aaaaatcaaa atctccaacc 360 aatgtaaaaa agaaagtttc cttcacatca aatgaaccag ggaaatatac taaactagaa 420 aaagatgccc tagatttgct ctcagacaat gaggaagaag acgcagagtc ctcaatccta 480 acctttgaag agagagacac atcatcacta agcattgagg ctagactaga atcaatagaa 540 gagaagctaa gcatgatatt aggactgctt cgtacactta acattgcaac agcaggacca 600 acggctgcaa gggatggaat cagagatgca atgattggta taagagaaga actaatagca 660 gaaataataa aagaagcaaa gggaaaagca gccgaaatga tggaagagga aatgaatcaa 720 aggtcaaaaa taggtaatgg cagtgtaaaa ctaaccgaga aggcaaaaga acttaataaa 780 attgttgaag acgagagcac aagtggtgaa tcagaagaag aagaagaacc aaaagaaact 840 caggataaca atcaaggaga agatatctac cagttaatca tgtag 885 <210〉 86 <211> 183 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400〉86
Met lie Thr Leu Asp Val lie Lys Ser Asp Gly Ser Ser Lys Thr Cys 1 5 10 15
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Thr lie Asn Tyr lie Lys Val Glu Asn Asn Leu Gin lie Cys Gin Ser 50 55 60
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Thr Thr Lys Thr Thr Leu Asn His Asp lie Thr Gin Tyr Phe Lys Ser 85 90 95
Leu lie Gin Arg Tyr Thr Asn Ser Ala lie Asn Ser Asp Thr Cys Trp 100 105 110
Lys lie Asn Arg Asn Gin Cys Thr Asn lie Thr Thr Tyr Lys Phe Leu 115 120 125
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Met lie Thr Leu Asp Val lie Lys Ser Asp Gly Ser Ser Lys Thr Cys 1 5 10 15
Thr His Leu Lys Lys lie lie Lys Asp His Ser Gly Lys Val Leu lie 20 25 30
Ala Leu Lys Leu He Leu Ala Leu Leu Thr Phe Phe Thr lie Thr lie 35 40 45
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Leu lie Gin Arg Tyr Thr Asp Ser Val lie Asn Lys Asp Thr Cys Trp 100 105 110
Lys lie Ser Arg Asn Gin Cys Thr Asn lie Thr Thr Tyr Lys Phe Leu 1L5 120 125
Cys Phe Lys Pro Glu Asp Ser Lys lie Asn Ser Cys Asp Arg Leu Thr 130 135 140
Asp Leu Cys Arg Asn Lys Ser Lys Ser Ala Ala Glu Ala Tyr His Thr 145 150 155 160
Val Glu Cys His Cys lie Tyr Thr lie Glu Trp Lys Cys Tyr His His 165 170 175
Pro He Asp <210> 88 <211> 177 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400〉88
Met Lys Thr Leu Asp Val lie Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys 1 5 10 15
Asn Gin Leu Lys Lys lie lie Lys Lys His Ser Gly Lys Val Leu lie 20 25 30
Ala Leu Lys Leu lie Leu Ala Leu Leu Thr Phe Phe Thr Ala Thr lie 35 40 45
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Thr lie Arg Pro Thr Pro Asp Pro Thr Val Val His His Leu Lys Arg 85 90 95
Leu lie Gin Arg His Thr Asn Ser Val Thr Lys Asp Ser Asp Thr Cys 100 105 110
Trp Arg lie His Lys Asn Gin Arg Thr Asn lie Lys He Tyr Lys Phe 115 120 125 -83 - 83860.doc 1359868
Leu Cys Ser Gly Phe Thr Asn Ser Lys Gly Thr Asp Cys Glu Glu Pro 130 135 140
Thr Ala Leu Cys Asp Lys Lys Leu Lys Thr lie Val Glu Lys His Arg 145 150 155 160
Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Gly Cys Leu His 165 170 175
Pro <210〉89 <211> 177 <212>蛋白質 <213>人類間質肺病毒 <400〉89
Met Lys Thr Leu Asp Val lie Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys 1 5 10 15
Asn Gin Leu Lys Lys lie lie Lys Lys His Ser Gly Lys Leu Leu He 20 25 30
Ala Leu Lys Leu lie Leu Ala Leu Leu Thr Phe Phe Thr Val Thr He 35 40 45
Thr Val Asn Tyr lie Lys Val Glu Asn Asn Leu Gin Ala Cys Gin Leu 50 55 60
Lys Asn Glu Ser Asp Lys Lys Asp Thr Lys Leu Asn Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80
Thr lie Arg Pro lie Pro Asp Leu Asn Ala Val Gin Tyr Leu Lys Arg 85 90 95
Leu lie Gin Lys His Thr Asn Phe Val lie Lys Asp Arg Asp Thr Cys 100 105 110
Trp Arg lie His Thr Asn Gin Cys Thr Asn lie Lys lie Tyr Lys Phe 115 120 125
Leu Cys Phe Gly Phe Met Asn Ser Thr Asn Thr Asp Cys Glu Glu Leu 130· 135 140
Thr Val Leu Cys Asp Lys Lys Ser Lys Thr Met Thr Glu Lys His Arg 145 150 155 160
Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Trp Cys Tyr Tyr 165 170 175
Leu
<210> 90 <211> 552 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 90 atgataacat tagatgtcat taaaagtgat gggtcttcaa aaacatgtac tcacctcaaa 60 aaaataatta aagaccactc tggtaaagtg cttattgtac ttaagttaat attagcttta 120 ctaacatttc tcacagtaac aatcaccatc aattatataa aagtggaaaa caatctgcaa 180 atatgccagt caaaaactga atcagacaaa aaggactcat catcaaatac cacatcagtc 240 acaaccaaga ctactctaaa tcatgatatc acacagtatt ttaaaagttt gattcaaagg 300 tatacaaact ctgcaacaaa cagtgacaca tgctggaaaa taaacagaaa tcaatgcaca 360 -84 - 83860.doc 1359868 aatataacaa catacaaatt tttatgtttt aaatctgaag acacaaaaac caacaattgt 420 gataaactga cagatttatg cagaaacaaa ccaaaaccag cagttggagt gtatcacata 480 gtagaatgcc attgtatata cacagttaaa tggaagtgct atcattaccc aaccgatgaa 540 acccaatcct aa 552
<210〉 91 <211>540 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400〉91
atgataacat tagatgtcat taaaagtgat g'ggtcttcaa aaacatgtac tcacctcaaa 60 aaaataatca aagaccattc tggtaaagtg cttattgcae ttaagttaat attagcttta 120 ctaacatttt tcacaataac aatcactata aattacataa aagtagaaaa caatctacaa 180 atatgccagt caaaaactga atcagacaaa gaagactcac catcaaatac cacatccgtc 240 acaaccaaga ctactctaga ccatgatata acacagtatt ttaaaagatt aattcaaagg 300 tatacagatt ctgtgataaa caaggacaca tgctggaaaa taagcagaaa tcaatgcaca 360 aatataacaa catataaatt tttatgcttt aaacctgagg actcaaaaat caacagttgt 420 gatagactga cagatctatg cagaaacaaa tcaaaatcag cagctgaagc atatcataca 480 gtagaatgcc attgcatata cacaattgag tggaagtgct atcaccaccc aatagattaa 540 <210> 92 <211>534 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 92 atgaaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacgtgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaagtg cttattgcae taaaactgat attggeetta 120 ctgacatttt tcacagcaac aatcactgtc aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcatgtcaac caaaaaatga atcagacaaa aaggtcacaa agccaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccacacccga iccaactgta gtacatcatt tgaaaaggct gattcagaga 300 cacaccaact ctgtcacaaa agacagcgat acttgttgga gaatacacaa gaatcaacgt 360 acaaatataa aaatatacaa gttcttatgc tctgggttca caaattcaaa aggtacagat 420 tgtgaggaac caacagccct atgcgacaaa aagttaaaaa ccatagtaga aaaacataga 480 aaagcagaat gtcactgtct acatacaacc gagtgggggt gccttcatcc ctaa 534
<210> 93 <211〉534 <212> DNA <213>人類間質肺病毒 <400> 93 atgaaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacatgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaattg ettattgeat taaaactgat attggeetta 120 ttgacgtttt tcacagtaac aattactgtt aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcatgtcaat taaaaaatga atcagacaaa aaggacacaa agctaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccattcctga tetaaatgea gtacagtact tgaaaaggct gattcagaaa 300 cacaccaact ttgtcataaa agacagagat acctgttgga gaatacacac gaatcaatgc 360 acaaatataa aaatatataa gttcttatgt ttcgggttta tgaattcaac aaatacagac 420 tgtgaagaac taacagtttt atgtgataaa aagtcaaaaa ccatgacaga aaaacatagg 480 aaagcagagt gtcactgtct acatacaacc gagtggtggt gttattatet ttaa 534 -85 - 83860.doc

Claims (1)

1359868 公告本 拾、申請專利範圍9月
日修(更)正本 其包括一異源核苷酸序 1. 一種嵌合型第3型牛副流感病毒 列，其中在該第3型牛副流感病毒之基因組中的―個開放 編閱架構已經被該異源核苷酸序列取代，且其中該異源 核甞酸序列編碼一種間質肺病毒多肽，其係選自由⑴間 質肺病毒（MPV)變種A2、扪或⑴之⑭白質：⑼河^ 變種A2、B1或B2之G蛋白質；（iii) MPV變種A2、B1戋 B2之沾蛋白質；（iv)MPV變種A2、B1或B2之N蛋白質； (v)MPV變種A2、B1或B2之P蛋白質；（vi) Mpv變種A2、 B1或B2之M2蛋白質；（νπ) MPV變種A2、]51或32之河21 蛋白質；（viii)MPV變種A2、B1或B2之M2-2蛋白質；及 (匕）]\«^變種八2、81或]32之1^蛋白質組成之群。 2. —種嵌合型第3型人類副流感病毒，其包括一異源核甞酸 序列，其_在該第3型人類副流感病毒之基因組中的一個 開放編閲架構已經被該異源核苷酸序列取代，且其中該 異源核I酸序列編碼一種間質肺病毒多肽，其係選自由 (i)間夤肺病毒（MPV)變種A2、B1或B2之F蛋白質；（ϋ) MPV變種A2、B1或B2之G蛋白質；（iii) MPV變種A2、 B1或B2之SH蛋白質；（iv) MPV變種A2、B1或32之1^蛋 白質；（v) MPV變種A2、B1或B2之P蛋白質；（vi) MPV 變種Α2、Β1或Β2之M2蛋白質；（Vii) MPV變種Α2、B1 或B2之M2-1蛋白質；（viii) MPV變種A2 ' B1或B2之M2-2 蛋白質；及（ix) MPV變種A2、B1或B2之L蛋白質組成之 群。 83860-1000926.doc 3_ —種嵌合型第3型牛副流感病毒/第3型人類副流感病毒， 其包括一異源核苷酸序列，其中在該第3型牛副流感病毒/ 第3型人類副流感病毒之基因組中的一個開放編閱架構已 ，’呈被該異源核甞酸序列取代，且其中該異源核甞酸序列 編碼種間質肺病毒多肽，其係選自由⑴間質肺病毒 (MPV)變種A2、B1或B2之F蛋白質；（Π) MPV變種A2、 則或⑽之砰白質；（出）MPV變種A2、B1或B2之SH蛋 白貝，（iv) MPV變種A2、B1或B2之N蛋白質；（v) MPV 良種八2、：81或B2之f蛋白質；（vi) MPV變種A2、則或… 之⑽蛋白質；（vii) MPV變種A2、B1或B2之M2-1蛋白 質’（viii) MPV變種A2、B1或B2之M2-2蛋白質；及（ix) MPV變種A2、B14B22L蛋白質組成之群。 4.根據申請專利範圍第！、2或3項之病毒，其中該病毒包括 何生自間質肺病毒之相同基因的異源核铝酸序列。 5·根據申請專利範圍第i、2或3項之病毒，其中該病毒包括 何生自間質肺病毒之兩個不同基因的異源核铝酸序列。 6. 根據申請專利範圍第i、2或3項之病毒，其中該病毒另包 含一開放編閱架構，其編碼一或多個⑴禽肺病毒（APV)F 蛋白質；（ii)APV G蛋白質；（iii)APV SH蛋白質；（iv)Apv N蛋白質；（v)APV p蛋白質；（vi)Apv %2蛋白質；（vii)Apv M2-l蛋白質；（viii)Apv MW蛋白質或（ίχ)Αρν⑶白質。 7. 根據申請專利範圍第6項之病毒，其中該禽肺病毒是A型 APV、B型 APV、c型 Apv或 _Apv。 8·根據申請專利範ϋ第丨、2或3項之病毒，其中將該核誓酸 83860-l〇〇〇926.doc 序列加至S亥病毒的完整基因組中。 9. 根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中將該核甞酸 序列加至該副流感病毒基因組之核苷酸位置1〇4 ' 1774和 3724 處。 10. 根據申請專利範圍第i、2或3項之病毒，其中已經以該異 源核甞酸序列取代該副流感病毒的核苷酸序列。 U.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中將該異源序 列插入該副流感病毒的基因組内。 12. 根據申請專利範圍第1或3項之病毒，其中該牛副流感病毒 是堪薩斯-品系的第3型牛副流感病毒。 13. 根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該異源核苷 酸序列係衍生自編碼F蛋白質或G蛋白質的核甞酸序列。 14. 根據申請專利範圍第13項之病毒’其中該ρ蛋白質包括間 質肺病毒之F蛋白質的外功能部位，副流感病毒之ρ蛋白 質的穿透膜功能部位以及副流感病毒之F蛋白質的魯米那 功能部位》 15’根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質肺病 毒多肽包括 SEQ ID NO: 19-21、27-29、35-37、43-45、 51-53、63-65、71-73、79-81 或 87-89之胺基酸序列。 16. 根據申请專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該病毒更包 括衍生自呼吸道融合細胞病毒或呼吸道融合細胞病毒之 突變形式的異源核:y：酸序列。 17. 根據申請專利範圍第16項之病毒’其中該呼吸道融合細胞 病毒是A型呼吸道融合細胞病毒、B型呼吸道融合細胞病 83860-1000926.doc 毒、牛呼吸道融合細胞病毒或禽呼吸道融合細胞病毒β 18·根據申請專利範圍第16項之病毒，其中該序列係衍生自編 碼該呼吸道融合細胞病毒之F蛋白質或g蛋白質的核菩酸 序列。 19·根據申請專利範圍第i、2或3項之病毒，其中該病毒之基 因組除了該異源核甞酸序列之外，尚含有突變或修改，結 果使該嵌合型病毒具有更適合用於疫苗調配物中的表現 魯 型，像是減毒的表現型或具有增強抗原性之表現型。 根據申明專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該異源核菩 酸序列的基因間區域之長度被改變。 21.根據申請專利範圍第丨、2或3項之病毒，其中將該異源核 苷酸序列加至副流感病毒基因組中，選自由下列所組成之 群的位置處： (i)基因組的核甞酸位置104,或者是欲轉錄之病毒基因 組的第一個基因位置； • (ii)基因組的核甞酸位置1774,或者是在天然副流感病毒 的第一和第二個開放編閱架構之間的位置，或者是 欲轉錄之病毒基因組的第二個基因位置； ㈣，因組的核嘗酸位置3724，或者是在天然副流感病 毋的第一和第二個開放編閱架構之間的位置，或者 疋欲轉錄之病毒基因組的第三個基因位置； ㈣：因組的核苷酸位置5042,或者是在天然副流感病 ，的第三和第四個開放編閱架構之間的位置，或者 疋欲轉錄之病毒基因組的第四個基因位置； 83860-1000926.doc (v) f因組的核甞酸位置679〇,或者是在天然副流感病 毒的第四和第五個開放編閱架構之間的位置，或者 疋欲轉錄之病毒基因組的第五個基因位置；及 ⑽f因組的核替酸位置8631，5戈者是在天然副流感病 毒的第五和第六個開放編閱架構之間的位置，或者 是欲轉錄之病毒基因組的第六個基因位置； 且其中該異源核苷酸序列的基因間區域之長度被改變。 22. —種重組的£)]^八或11]^八分子，其編碼根據申請專利範圍第 1、2或3項之病毒的基因組。 23. —種疫苗調配物，其包括根據申請專利範圍第1、2或3項 之嵌合型病毒，以及在藥學上可接受的賦形劑。 24. 根據申請專利範圍第23項之疫苗調配物，其中該嵌合型病 毒包括基因組的修改或突變，結果產生減毒的表現型或增 強的抗原性。 25. 根據申請專利範圍第24項之疫苗調配物，其中該修改或突 變係衍生自天然存在的突變種。 26·根據申s青專利範圍第23項之疫苗調配物，其中該疫苗係用 來調控人類、靈長類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、 禽類或嚅齒類的免疫反應。 2 7.根據申凊專利範圍第2 5項之疫苗調配物，其中該疫苗係用 來調控人類嬰幼兒或兒童的免疫反應。 28· —種根據申請專利範圍第23項之疫苗調配物用於製備醫 藥品的用途，其係用於在哺乳動物中治療或預防因副黏液 病毒科CParawMoWW而e)病毒所引起之呼吸道感染。 83860-1000926.doc 29. 根據申請專利範圍第28項之用途，其中該呼吸道感染是 MPV感染。 30. 根據申請專利範圍第28項之用途，其中該呼吸道感染是 MPV、RSV、hPIV感染或其組合。 31·根據申請專利範圍第28項之用途，其中該哺乳動物是人 類。 32.根據申請專利範圍第31項之用途，其中該人類個體小於5 歲。 3 3 ·根據申請專利範圍第3 1項之用途，其中該人類個體小於2 歲。 34. 根據申凊專利範圍第31項之用途，其中該人類個體罹患呼 吸道感染之外的疾病或病況。 35. 根據申請專利範圍第34項之用途，其中該疾病或病況是胰 囊性纖維變性、白血病、非_霍奇金氏淋巴瘤、氣喘以及 骨髓移植和腎臟移植。 36. 根據申請專利範圍第31項之用途，其中該個體是免疫減弱 的個體。 37. 根據中請專利㈣第31項之用途，其中該個體是老年人。 38. 根據申請專利範圍第卜2或3項之病毒，其中該間質病毒 多肽係一種哺乳動物間質肺病毒多肽，衍生自： (〇哺乳動物赠變種B1之G蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變細之G蛋白質，相較於變種M之原型g蛋白 質（分離物NL/1/00)、A2之原型G蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型G蛋白f (分離物见⑽句於 83860-1000926.doc 系統發生學上與A1之原型G蛋白質（分離物NL/1/99) 之關係更接進； (ii) 哺乳動物MPV變種B1之N蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B1之N蛋白質，相較於變種A1之原型N蛋白 質（分離物NL/1/00)、A2之原型N蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型N蛋白質（分離物NL/1/94)，於 系統發生學上與A1之原型N蛋白質（分離物NL/1/99) 之關係更接進； (iii) 哺乳動物MPV變種B1之P蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B1之P蛋白質，相較於變種A1之原型P蛋白 質（分離物NL/1/00)、A2之原型P蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型P蛋白質（分離物NL/1/94)，於 系統發生學上與A1之原型P蛋白質（分離物NL/1/99) 之關係更接進； (iv) 哺乳動物MPV變種B1之F蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B1之F蛋白質，相較於變種A1之原型F蛋白 質（分離物NL/1/00)、A2之原型F蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型F蛋白質（分離物NL/1/94)，於 系統發生學上與A1之原型F蛋白質（分離物NL/1/99) 之關係更接進； (v) 哺乳動物MPV變種B1之Μ蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種Β1之Μ蛋白質，相較於變種Α1之原型Μ蛋 白質（分離物NL/1/00)、Α2之原型Μ蛋白質（分離物 NL/17/00)或Β2之原型Μ蛋白質（分離物NL/1/94)，於 83860-1000926.doc _1359S68 系統發生學上與A1之原型M蛋白質（分離物NL/l/99) 之關係更接進； (vi)哺乳動物MPV變種B1之M2-1蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種B1之M2-1蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-1蛋白質（分離物NL/1/00)、A2之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/17/00)或B2之原型M2-1蛋白質（分離物 NL/1/94)，於系統發生學上與A1之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/1/99)之關係更接進； 9 (vii)哺乳動物MPV變種B1之M2-2蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種B1之M2-2蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-2蛋白質（分離物NL/1/00)、A2之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/17/00)或B2之原型M2-2蛋白質（分離物 NL/1/94)，於系統發生學上與A1之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/1/99)之關係更接進； (viii) 哺乳動物MPV變種B1之SH蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B1之SH蛋白質，相較於變種A1之原型SH. ^ 蛋白質（分離物NL/1/00)、A2之原型SH蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型SH蛋白質（分離物NL/1/94)，於 系統發生學上與A1之原型SH蛋白質（分離物 NL/1/99)之關係更接進；或 (ix) 哺乳動物MPV變種B1之L蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B1之L蛋白質，相較於變種A1之原型L蛋白 質（分離物NL/1/00)、A2之原型L蛋白質（分離物 NL/17/00)或B2之原型L蛋白質（分離物NL/1/94)，於 83860-1000926.doc 1359868 系統發生學上與A1之原型L蛋白質（分離物NL/l/99) 之關係更接進。 39.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質病毒 多肽係一種哺乳動物間質肺病毒多肽，衍生自： (i) 哺乳動物MPV變種A2之G蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A2之G蛋白質，相較於變種A1之原型G蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型G蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型G蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與A2之原型G蛋白質（分離物NL/17/00) 之關係更接進； (ii) 哺乳動物MPV變種A2之N蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A2之N蛋白質，相較於變種A1之原型N蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型N蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型N蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與A2之原型N蛋白質（分離物NL/17/00) 之關係更接進； (iii) 哺乳動物MPV變種A2之P蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A2之P蛋白質，相較於變種A1之原型P蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型P蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型P蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與A2之原型P蛋白質（分離物NL/17/00)之 關係更接進； (iv) 哺乳動物MPV變種A2之F蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A2之F蛋白質，相較於變種A1之原型F蛋白 83860-1000926.doc 質（分離物NL/1/00)、B1之原型F蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型F蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與A2之原型F蛋白質（分離物NL/17/00)之 關係更接進； (v) 哺乳動物MPV變種A2之Μ蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種Α2之Μ蛋白質，相較於變種Α1之原型Μ蛋 白質（分離物NL/1/00)、Β1之原型Μ蛋白質（分離物 NL/1/99)或Β2之原型Μ蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與Α2之原型Μ蛋自質（分離物NL/17/00) 之關係更接進； (vi) 哺乳動物MPV變種Α2之Μ2-1蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種A2之M2-1蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-1蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/1/99)或B2之原型M2-1蛋白質（分離物 NL/1/94) ’於系統發生學上與A2之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/17/00)之關係更接進； (vii) 哺乳動物MPV變種A2之M2-2蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種A2之M2-2蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-2蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/1/99)或B2之原型M2-2蛋白質（分離物 NL/1/94)，於系統發生學上與A2之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/17/00)之關係更接進； (viii) 哺乳動物MPV變種A2之SH蛋白質，其〜中該哺乳動物 MPV變種A2之SH蛋白質，相較於變種A1之原型Sh 300926.doc 10· 蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型SH蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型SH蛋白質（分離物NL/1/94)，於 系統發生學上與A2之原型SH蛋白質（分離物 NL/17/00)之關係更接進；或 (ix)哺乳動物MPV變種A2之L蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A2之L蛋白質，相較於變種A1之原型L蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型L蛋白質（分離物 NL/1/99)或B2之原型L蛋白質（分離物NL/1/94)，於系 統發生學上與A2之原型L蛋白質（分離物NL/17/00)之 關係更接進。 40.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質病毒 多肽係一種哺乳動物間質肺病毒多肽，衍生自： (i) 哺乳動物MPV變種B2之G蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之G蛋白質，相較於變種A1之原型G蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型G蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型G蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型G蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； (ii) 哺乳動物MPV變種B2之N蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之N蛋白質，相較於變種A1之原型N蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型N蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型N蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型N蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； 83860-1000926.doc _U59編 (iii) 哺乳動物MPV變種B2之P蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之P蛋白質，相較於變種A1之原型P蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型P蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型P蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型P蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； (iv) 哺乳動物MPV變種B2之F蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之F蛋白質，相較於變種A1之原型F蛋白 • 質（分離物NL/1/00)、B1之原型F蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型F蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型F蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； (v) 哺乳動物MPV變種B2之Μ蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種Β2之Μ蛋白質，相較於變種Α1之原型Μ蛋 白質（分離物NL/1/00)、Β1之原型Μ蛋白質（分離物 NL/1/99)或Α2之原型Μ蛋白質（分離物NL/17/00)，於 β 系統發生學上與B2之原型Μ蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； (vi) 哺乳動物MPV變種B2之L蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之L蛋白質，相較於變種A1之原型L蛋白 質（分離物NL/1/00)、B1之原型L蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型L蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型L蛋白質（分離物NL/1/94) 之關係更接進； 83860-1000926.doc •12· 1359868 (vii) 哺乳動物MPV變種B2之M2-1蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種B2之M2-1蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-1蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/1/99)或A2之原型M2-1蛋白質（分離物 NL/17/00)，於系統發生學上與B2之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/1/94)之關係更接進； (viii) 哺乳動物MPV變種B2之M2-2蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種B2之M2-2蛋白質，相較於變種A1之原型 M2-2蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/1/99)或A2之原型M2-2蛋白質（分離物 NL/17/00)，於系統發生學上與B2之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/1/94)之關係更接進；或 (ix) 哺乳動物MPV變種B2之SH蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種B2之SH蛋白質，相較於變種A1之原型SH 蛋白質（分離物NL/1/00)、B1之原型SH蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型SH蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與B2之原型SH蛋白質（分離物 NL/1/94)之關係更接進。 41.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質病毒 多肽係一種哺乳動物間質肺病毒多肽，衍生自： (i) 哺乳動物MPV變種A1之G蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之G蛋白質，相較於變種B2之原型G蛋白 質（分離物NL/1/94)、B1之原型G蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型G蛋白質（分離物NL/17/00)，於 83860-1000926.doc -13- 系統發生學上與分離物BR/2/01 (SEQ ID NO: 134)之 關係更接進； (ii) 哺乳動物MPV變種A1之N蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之N蛋白質，相較於變種B2之原型N蛋白 質（分離物NL/1/94)、B1之原型N蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型N蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進； (iii) 哺乳動物MPV變種A1之P蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之P蛋白質，相較於變種B2之原型P蛋白 質（分離物NL/1/94)、B1之原型P蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型P蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進； (iv) 哺乳動物MPV變種A1之F蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之F蛋白質，相較於變種B2之原型F蛋白 質（分離物NL/1/94)、B1之原型F蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型F蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進； (v) 哺乳動物MPV變種A1之Μ蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種Α1之Μ蛋白質，相較於變種Β2之原型Μ蛋 白質（分離物NL/1/94)、Β1之原型Μ蛋白質（分離物 NL/1/99)或Α2之原型Μ蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進； (vi) 哺乳動物MPV變種A1之L蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之L蛋白質，相較於變種B2之原型L蛋白 83860-1000926.doc -14- 1359868 質（分離物NL/l/94)、B1之原型L蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型L蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進； (vii) 哺乳動物MPV變種A1之M2-1蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種A1之M2-1蛋白質，相較於變種B2之原型 M2-1蛋白質（分離物NL/l/94)、B1之原型M2-1蛋白質 (分離物NL/1/99)或A2之原型M2-1蛋白質（分離物 NL/17/00)，於系統發生學上與分離物BR/2/01之關係 更接進； (viii) 哺乳動物MPV變種A1之M2-2蛋白質，其中該哺乳動 物MPV變種A1之M2-2蛋白質，相較於變種B2之原型 M2-2蛋白質（分離物NL/l/94)、B1之原型M2-2蛋白質 (分離物NL/1/99)或A2之原型M2-2蛋白質（分離物 NL/17/00)，於系統發生學上與分離物BR/2/01之關係 更接進；或 (ix) 哺乳動物MPV變種A1之SH蛋白質，其中該哺乳動物 MPV變種A1之SH蛋白質，相較於變種B2之原型SH 蛋白質（分離物NL/l/94)、B1之原型SH蛋白質（分離物 NL/1/99)或A2之原型SH蛋白質（分離物NL/17/00)，於 系統發生學上與分離物BR/2/01之關係更接進。 42.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質病毒 多肽係一種哺乳動物間質肺病毒多肽，衍生自： (i) 哺乳動物MPV之G蛋白質，其中該G蛋白質係與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28或 SEQ ID NO: 29之G蛋白 83860-1000926.doc • 15· 質之胺基酸序列具有至少90°/。之同一性； (ii) 哺乳動物MPV之N蛋白質，其中該N蛋白質係與SEQ ID NO: 7；l、SEQ ID NO: 72或 SEQ ID NO: 73之N蛋白 質之胺基酸序列具有至少90%之同一性； (iii) 哺乳動物MPV之P蛋白質，其中該P蛋白質係與SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80或 SEQ ID NO: 81 之P蛋白 質之胺基酸序列具有至少90%之同一性； (iv) 哺乳動物MPV之F蛋白質，其中該F蛋白質係與SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 21 之F蛋白 質之胺基酸序列具有至少90%之同一性； (v) 哺乳動物MPV之Μ蛋白質，其中該Μ蛋白質係與SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64或 SEQ ID NO: 65之Μ蛋 白質之胺基酸序列具有至少90%之同一性； (vi) 哺乳動物MPV之L蛋白質，其中該L蛋白質係與SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36或 SEQ ID NO: 37之L蛋白 質之胺基酸序列具有至少90%之同一性； (vii) 哺乳動物MPV之M2-1蛋白質，其中該M2-1蛋白質係 與 SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44或 SEQ ID NCh 45 之M2-1蛋白質之胺基酸序列具有至少90%之同一 性； (viii) 哺乳動物MPV之M2-2蛋白質，其中該M2-2蛋白質係 與 SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或 SEQ ID NO: 53 之M2-2蛋白質之胺基酸序列具有至少90%之同一 性；或 83860-1000926.doc -16- (ix)哺乳動物MPV之SH蛋白質，其中該SH蛋白質係與 SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88 或 SEQ ID NO: 89之 SH蛋白質之胺基酸序列具有至少90%之同一性。 43. 根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該間質肺病 毒多肽係特異於哺乳動物間質病毒（MPV)變種A2或變種 B2。 44. 根據申請專利範圍第43項之病毒，其中該哺乳動物間質病 毒多肽係衍生自： (i) 哺乳動物MPV之G蛋白質，其中該G蛋白質係與SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 29之G蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (ii) 哺乳動物MPV之N蛋白質，其中該N蛋白質係與SEQ ID NO: 71或SEQ ID NO: 73之N蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (iii) 哺乳動物MPV之P蛋白質，其中該P蛋白質係與SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 81之P蛋白質之胺基酸序列 具有至少90°/。之同一性； (iv) 哺乳動物MPV之F蛋白質，其中該F蛋白質係與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21之F蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (v) 哺乳動物MPV之Μ蛋白質，其中該Μ蛋白質係與SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 65之Μ蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (vi) 哺乳動物MPV之L蛋白質，其中該L蛋白質係與SEQ 83860-1000926.doc -17- ID NO: 35或SEQ ID NO: 37之L蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (vii) 哺乳動物MPV之M2-1蛋白質，其中該M2-1蛋白質係 與 SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 45之 M2-1蛋白質之 胺基酸序列具有至少90%之同一性； (viii) 哺乳動物MPV之M2-2蛋白質，其中該M2-2蛋白質係 與 SEQ ID NO: 51 或 SEQ ID NO: 53之M2-2蛋白質之 胺基酸序列具有至少90%之同一性；或 (ix) 哺乳動物MPV之SH蛋白質，其中該SH蛋白質係與 SEQ ID NO: 87或SEQ ID NO: 89之SH蛋白質之胺基 酸序列具有至少90%之同一性。 45. 根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該多肽包括 SEQ ID NO: 19、2卜 27、29、35、37、43、45、51、53、 63、65、71、73、79、81、87或 89之胺基酸序歹|J ° 46. 根據申請專利範圍第45項之病毒，其中該哺乳動物間質病 毒多肽係衍生自： (i) 哺乳動物MPV之G蛋白質，其中該G蛋白質係與SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 29之G蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (ii) 哺乳動物MPV之N蛋白質，其中該N蛋白質係與SEQ ID NO: 71或SEQ ID NO: 73之N蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (iii) 哺乳動物MPV之P蛋白質，其中該P蛋白質係與SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 81之P蛋白質之胺基酸序列 83860-1000926.doc -18- 具有至少90%之同一性； (iv) 哺乳動物MPV之F蛋白質，其中該F蛋白質係與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21之F蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (v) 哺乳動物MPV之Μ蛋白質，其中該Μ蛋白質係與SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 65之Μ蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (vi) 哺乳動物MPV之L蛋白質，其中該L蛋白質係與SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 37之L蛋白質之胺基酸序列 具有至少90%之同一性； (vii) 哺乳動物MPV之M2-1蛋白質，其中該M2-1蛋白質係 與 SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID NO: 45 之 M2-1 蛋白質之 胺基酸序列具有至少90%之同一性； (viii) 哺乳動物MPV之M2-2蛋白質，其中該M2-2蛋白質係 與 SEQ ID NO: 51 或 SEQ ID NO: 53 之 M2-2 蛋白質之 胺基酸序列具有至少90%之同一性；或 (ix) 哺乳動物MPV之SH蛋白質，其中該SH蛋白質係與 SEQ ID NO: 87或SEQ ID NO: 89之SH蛋白質之胺基 酸序列具有至少90%之同一性。 47.根據申請專利範圍第1、2或3項之病毒，其中該多肽包括 SEQ ID NO: 36第500至2005位置之胺基酸序列。 83860-1000926.doc -19- I丨日修D正本 第092103642號專利申請案 中文圖式替換本(97年Π月）
人類 1 MSWKWIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTC 60 MSWKW++ LLTP GL+ESYI£ESCST+T GYI^VUTGWYTNVFTLEVGDVENLTC 禽類 1 MSWKVVULVLLATPTQGLEESYLEESCSTVTRGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTC 60 人類 61 ADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTA 13) OGPSLI+TEL+LTK+AL EL+TV ADQLA+E +1 +PR-HRFVLGAIALGVAT AAVTA 禽類 61 TDGPSLIRTELELTKNALEEUCTVPADQLAKEARIMSPRKARFVLGAIALGVATTMm 120 人類 121 GVAIAKTIRliSEVTAIKNALKKTNEAVSTLBNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKN 180 GVAIAKTIRLE EV A1+ AL+ TNEAVSTLGNGVRVLATAV -HJCDF+SK LT AINKN 禽類 121 GVAIAKTIRLEGEVAAIRGALRNTNEAVSTLGNGVRVLATAVNDLXDFISKKLTPAINKN 180 人類 181 KCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAQQ 240 KCDI+OLKMAVSF (HKRFLNWRQFSDNAGITPAISLDLMTDAEL RAVSNHPTS-»GQ 禽類 181 KCDISDLKMAVSFQQYNRRFLNWRQFSDNAGn^AISLDimDAELVRAVSNMPTSSGQ 240 人類 241 IKLM£NRAMVRRKGFGFLIGVY6SSVIYMVQLPIF6VIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300 I LMLENRAMVRRKGFG LIGVYG SV+YMVQLPIFGVIDTPCW VKAAP CSGK GfYA I 類 241 INLM£NRAMVRRKGFGILIGVYGGSWYKVQLPIFGVIDTPCUKVKAAPLCSGI(OGSYA 300 人類 301 aiREDQGMYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKECNINISTTNYP 360 C LREDQGWYCQNAGSTVYYPNE-H)C R DHVFCDTAAGINVA++S+ECM NISTT YP 禽類 301 εΡΙΛΕΟ〇0^：〇ΝΑ〇5ΤνΥΥΡΝΕΕΟ〇ννΚ50ΗνΡα)ΤΑΑ6ΙΜνΑΚΕ5ΕΕεΝΚΝΙ5ΤΤΚΥΡ 360 人類 361 CICVSTCRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGillKQLNICGCSYITNQDADTVTI 420 CKVSTGRHPISHVALSPLGALVACY GVSCSIGSN+VGII+ L KGCSYI+NQDADTVTI 禽類 361 CKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYDGVSCSIGSMKVGIIRRLGKQCSYISfiQDADTVTI 420 人類 421 DMmQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI 480 DifmQLSKVEGEQH IKGH>VSS+FDP++FPEDQFMMLDQVFES+£ S+ L-HJQSN+I 禽類 421 DNTVYQLSKVEGEQHTIKGKPVSSi^FDPIEFPEDQFNIALDQVFESVEKSKNLIDQSNia 480 人類 481 LSSAEKGMTGFIIVIILIAVLGSTHILVSVFIIIKKTKRPTGAPPELSGVTN 532 L S EICGN GF+IVI LI +L + V +F ήΚΚ K P E++GV N 禽類 481 LOSTEICG^AGFVIVIALIVLLMLAAVGVGIFFVVKKRKAAPKFPMEMNGVNN 532 圖1A 83860-971209.doc 1359868 人類 1 MSWKWIIFSLLITPQrtGlXESYJ£ESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTLEVGDVENLTC e〇 Μ ++++ L+ P ++E+Y EESCST+T 6Y SVLRTGWYTNVF LE-tGfVEM+TC 火雞 1 MDVRiaLLFLISNPSSCIQETYMEESCSTVTRGYKSVLRTGWYTNVFNLEIGNVENITC 60 人類 61 ADGPSLI^TELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQSRFVLGAIALGVATAAAVTA 120 DGPSLI TEL LTK+ALREL+TVSADQ+A+E -h- +PR+ RFVLGAIALGVATAAAVTA 火雞 61 NDGPSLIDTELVLTKNALRELKTVSADQVAKESRLSSPRRRRFVLGAIAL6VATAAAVTA 120 人類 121 GVAIAKTIRLESEVTAIKNALXKTNEAVSTLGNGV-VLATAVRELKDFVSKNLTRAINKN 180
6VA+AKTIRLE EV AIKNAL+ TNEAVSTL6NGVRVUTAV +LK+F+SIC LT AIIW^ 火雞 121 GVAUUaiRLEGEVKAIKNALRNTNEAVSTLGNGVRVLATAVNDLKEFISKKLTPAINQN 180 人類 181 KCDIADLKMAVSFSQFNRRFLNWRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQ 240 KC+IAMCMA+SF Q NRRFLNVVRQFSD+AGIT A+SLOLWTD EL RA++ MPTS-^Q 火雞 181 KCNIADIKMAISFGQN_FLNWRQFSDSAfiITSAVSLOLMrDDELVRAIMRMPTSSGQ 240 人類 241 IKLMLENRAMVRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300 I LML NRAMVRRKGFG LIGVY +V+YMVQLPIF6VI+TPCW V AAP C -H(GNYA 火雞 241 ISLHLNNRAMVRRKGfGILIGVYDGTWYMVQLPIFGVIETPCWRWAAPLCRICEKGNYA 300 ♦ 人類 301 aLREDQGMYCQNAfiSmYPN0CDCETRGDHVFCDTAA6INVAEQSKECNINISTTNYP 360 C+LREDQQMYC NAGST YYPN+ DCE R IHVFCDTAAGINVA + +^N NIST+ YP 火雞 301 CILREDQQMYCTOAGSTAYYPNKDDCEVRDDYVFCDTAAGINVALEVEQCNYNISTSICYP 360 人類 361 CKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGIIKQLNKQCSYITNQDADTVTI 420
CKVSTGRHP+SMVAL+PLG LV-*CY+ ySCSIGSN+VGIIKQL KQC-h-I N +ADT+H 火雞 361 CKVSTGRHPVSHVALTPLGGLVSCYESVSCSIGSNKVGIIKQLGKQCTHIPNNEADTITI 420 人類 421 DMTVYQlSKVEGEQHVIKGI^VSSSFDPVKFProQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRI 480 DMTVYQLSKV GEQ IKG PV ++F-H>+ FPEDQFNVALDQVFESI+ SQ L+O+SN + 火雞 421 DWTVYQLSKWGEQRTIKGAPWNNFNPILFPEOQFNVALDQVFESIDRSQDilDKSNDL 480 人類 481 1$5ΑΕΚ6ΝΤ6ΡΙΐνΐΙίΙΑνΐ£$ΤΜΙϋ^νΡΙΙ··ΙΚΚΤΚΚΡΤ6ΑΡΡΕ15ανΤΝΜβΡΙ 536 L + K G I Ι-η-ι- +LG +L ++ -hKTK P P +G++ 火雞 4€|1 LGADAKSKAGIAIAIWLVILGIFFLLAVIYYCSRVRKTK-PKHDYPAHGHSSMAYV 537 圖IB 83860-971209.doc -2 -
Sac 1 BglU
1359868 1234567 8 9 10 11 83860-971209.doc 1359868
83860-971209.doc -4 - 1359868 RSV G 1 RSV F 1 RSV FI· (N-N) RSV G 2 RSV F 2 bps/hps 1 - ^,>11 - - 1 ^ ill^lii— 0 0 ^^0 s ^ ~ I --1^01 1 - - 11 iisi hpsHN O 1 -〇， I 議 -η =r 1 i i 1 議 1 -n 1 戔 1 83860-971209.doc 1359868 F表現 G表現 質 白 蛋 §1-.-.::-^^7:Ab 3u->SHi ’Id >sQ:i ί >WK i .0.8.8.2 3.9.5.9. 9 4 3 2
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83860-971209.doc -11 - 1359868 RSV FI N-P ie Avr2 soli N GE/P GS AVNb1鋈\1\/ 177 蒼 +29 nts +ants Avr2窆s_Tig I-1— N_p 94 nts Avr2_ ?「*^—h^rsvf^· ZIZ le 86 nts i nts Soli N GE/P GS >vr2 N GE/N GS Soli 65 nts 10 nts Avr2 擦IGR 75 nts 83860-971209.doc -12 - 1359868 s 9(A) 势锻薛48、M命 s§$ MOI = 0.1 41 32
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仿造品 b/h bPIV3 仿造品 b/hhMPVF2#4 b/h hMPV F2 #8—廉 83860-971209.doc -18 - 1359868 LoglOTCID/毫升
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83860-971209.doc -20 - 1359868 S14 I f 藝鬧一含教塗 1 二 1 i 硃异：泳雔岭>SCDNA。 ms :皂神涔掛嶠緙犇含贫赛2-忽靜QWNis4i^IlRSFF螂 m·减>^嘲如^海细+is。 83860-971209.doc -21 - 1359868 b/hPIV3/hMPVF1 液體覆蓋在Vero細胞上 從1(Τ2至1(Τ7限制稀釋 以hMPV gp抗血清免疫染色
圖 15(A) -b/hPIV3/hMPVF2 -曱基纖維素覆蓋在 Vero細胞上 -溶菌斑分析，從1(T2至1〇_7 -以hMPV gp抗血清免疫染色
圖 15(B) 83860-971209.doc -22 - 1359868 32.2 I 40.6 丨 RSV P MAb Numax L1FR-S28 刀 82丨 ®16(A)
...0 PBS 20% Μ 雜 ， 1 2 3 私010)7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 RSVF, 62/0 83860-971209.doc -23 - 1359868 Titer ;L09sp5/ml) 刀 SV F MAb Numax L1FR-S28 刀 RSVPAb miogenesis j-------ύ 力價(l〇gl〇 PFU/毫升） 85丨 85丨 39.7 丨 32.1 I 2 b rv> -^ 〇) o i o>8 10 12 M ^ 100
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3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 1516171OO PBS 20%鲰雜 a16(B) RSVF, 8% 83860-971209.doc -24 1359868 loglopFU/揪半 bpl<3 PAb s 16(c)
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