CN111269895B

CN111269895B - 甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用

Info

Publication number: CN111269895B
Application number: CN202010078674.9A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 王洋; 潘蔚绮
Original assignee: Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-02-03
Also published as: CN111269895A

Abstract

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用。该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：PB2的127‑2217位碱基片段；NP的106‑1422位碱基片段；NS的166‑495位碱基片段。采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。此外，该病毒株经过验证可以作为骨架基因的供体，与其他病毒株进行重组，以获得流感病毒疫苗候选株。

Description

甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用

技术领域

本发明涉及人畜共患传染病学领域，具体而言，涉及一种甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用。

背景技术

甲型流感病毒(英语：Influenza A virus，常简称甲流)是一种流感病毒，包含多种亚型，可感染野生鸟类、驯养家禽，以及猪、马和人等多种哺乳类动物并导致流行性感冒。该病毒是正黏液病毒科、甲型流感病毒属下的唯一一个物种。在全世界，流感病毒不仅每年发生季节性流行，而且间或暴发大流行。在过去的几十年里，各国家主要选择利用全病毒灭活疫苗和减毒活疫苗预防流感感染，它们主要刺激机体产生体液免疫抵抗相同亚型的血凝素表面糖蛋白。

目前较为常用的流感病毒减毒活疫苗为MedImmue公司上市的FluMist疫苗。该疫苗的亲本供体株为冷适应(ca)A/AnnArbor/6/60毒株，是由患者体内分离出来的野毒株在逐步低温条件下传代获得的。冷适应毒株在33℃条件下可以高效复制，但是在37℃条件下复制能力显著减弱，因此仅能够在人类的鼻腔中复制，而无法在下呼吸道复制，从而达到减毒的效果。采用“6+2”模式将冷适应亲本株的6个内部骨架基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)与流行株的两个表面蛋白基因(HA和NA)重组，即可以获得具有减毒特性的流感病毒疫苗株。冷适应亲本株的由PB1、PB2、NP这三个基因片段上的5个突变氨基酸位点协同作用产生。由于突变位点较少，因此存在回复突变导致病毒毒力返强的风险。并且2016-2017流感季冷适应减毒活疫苗的有效性显著降低，因此新的减毒活疫苗亲本株的研制十分急迫。

采用基因组密码子或密码子对重编码的方法制备的流感病毒减毒活疫苗表现出了令人振奋的结果，并且用该策略制备减毒活疫苗亲本株也具有一定的减毒效果。有研究对季节性人流感病毒基因组6个内部基因节段进行禽流感病毒化改造，共引入280个突变。将该亲本株内部基因与PR8病毒或HK68病毒表面基因重组得到的重组病毒株在体内和体外均表现出一定的毒力减弱。但是目前没有直接采用流感病毒使用率低的密码子对流感病毒基因组内部基因进行改造的研究，并且流感病毒内部基因所是否能够容纳更多的突变，这些突变是否会发生回复突变也并不清楚。

发明内容

本发明采用基因组密码子去流感病毒化重编码策略，向流感病毒PB2、NP、NS基因中共引入924个沉默突变，其他基因(例如PB1、PA、M、HA和NA中的一种或其组合)采用野生型病毒基因，得到了一株体内外复制能力、体内致病力均明显减弱的新型流感病毒减毒活疫苗亲本株(以下可简称RP)。RP作为减毒活疫苗单次免疫小鼠后能够诱导足够的免疫应答、免疫保护。不仅如此，该减毒活疫苗对异源病毒攻毒也能够提供完全保护。并且，RP可以与H1N1以及H3N2流感病毒表面基因重组，表现出作为亲本株的良好潜力。

具体地，本发明涉及一种甲型流感病毒减毒株，该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:3。

采用去病毒化策略重编码病毒基因组能够降低流感病毒的致病力；并且重组流感病毒依然具有良好的免疫原性，其制备得到的疫苗可对同源和异源攻毒能够提供完全保护力。此外，该病毒株经过验证可以作为骨架基因的供体，与其他病毒株进行重组，以获得流感病毒疫苗候选株。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种产生用于制备病毒疫苗的重组的子代病毒株的方法，包括：

将甲型流感病毒第一基因组节段和第二基因组节段共同引入宿主细胞中，在适于所述基因组节段转录和每个基因组节段的编码区表达的条件下孵育所述宿主细胞；

其中，所述第一基因组节段中包含SEQ ID NO:1～3所示核酸片段中的一种或多种，所述第二基因组节段来自至少一种作为亲本的甲型流感病毒，且二者能够重组以产生子代病毒。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述方法所产生的重组的子代病毒株。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及包含所述重组流感病毒和/或所述重组的子代病毒株的疫苗及试剂盒。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中重编码流感病毒亲本株RP与野生型PR8病毒在MDCK细胞上的噬斑形态；

图2为本发明一个实施例中重编码流感病毒亲本株RP免疫小鼠在X31(H3N2)毒株攻毒后的体重变化(A)和存活率(B)。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种甲型流感病毒减毒株，该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:3。

本发明所提供的病毒主要通过沉默突变以减毒。如本文所用的，术语“沉默突变”是指在生物的基因组中核苷酸的变化，其不显著改变生物的表型。沉默突变可发生在非编码区(内含子内的基因的外侧)，或它们可发生在外显子内。当它们发生在外显子或编码区内时，它们不导致编码的氨基酸序列的变化(即，同义取代)，或导致插入具有与原始氨基酸类似性质的备选氨基酸，在任一情况下表型不存在显著变化。

在一些实施方式中，甲型流感病毒减毒株为A/Puerto Rico/8/1934(A/PR/8/34)株流感病毒。

在一些形式中，当与野生型病毒在各个宿主中的复制相比，甲型流感病毒减毒株在哺乳动物宿主中，和/或禽类宿主中具有较慢的复制。在一些形式中，甲型流感病毒减毒株产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫。在一些形式中，甲型流感病毒减毒株产生类似于由野生型病毒产生的细胞-介导的免疫。在一些形式中，甲型流感病毒减毒株产生类似于由野生型病毒产生的抗体-介导的免疫和细胞-介导的免疫。在一些形式中，甲型流感病毒减毒株在33℃和37℃下以基本上相同的速率复制。

根据本发明的再一方面，本发明涉及一种产生用于制备病毒疫苗的重组的子代病毒株的方法，包括：

其中子代病毒是在被两个或多个亲本病毒株感染，或被它们的遗传物质转染的细胞或生物体中产生的，该子代的遗传材料是亲本株的遗传材料的混和。术语“亲本病毒株”意思是指群体中两个或多个病毒株，它们通过重组机制，将遗传材料提供给该群体中的突变子代病毒株。

例如，子代病毒中融合有所述甲型流感病毒减毒株PB2片段、NP片段、NS片段中的至少一种，以及另外一种作为亲本的甲型流感病毒的其他片段(例如HA，NA，PA，PB1和MP，或其组合)。

术语“宿主细胞”是指能够允许亲本病毒将病毒的基因组核酸片段组装到病毒颗粒中，和/或基因组核酸片段发生复制的细胞。

宿主细胞可以是病毒的天然宿主或非天然宿主的细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为禽类和哺乳动物的细胞，包括它们的卵(蛋)或胚胎细胞等。

禽类例如野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、鸽子、天鹅、大雁、鹌鹑，其中特别是各种水禽。

哺乳动物例如人、猴、猪、马、猫、犬、海豹、鲸鱼等。

在一些实施方式中，人的细胞选自CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞。

在一些实施方式中，犬的细胞选自MDCK细胞。

在一些实施方式中，猴的细胞选自Vero细胞。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞中分离突变的子代病毒株。

子代序列与亲本序列相比，可包括任何数量的核苷酸改变，包括一个或多个核苷酸改变，如2-5，5-10，10-20，20-50，50-100，100-500，500或更多改变，通常是在给定长度的核酸内两个或多个核酸链之间，如两个核苷酸或更多，如3-5，5-10，10-100，100-1kb，1kb-10kb，10kb或更多，或任何范围或其间隔内由重组，如拷贝选择性重组产生。

在一些实施方式中，所述亲本病毒株可以是在最近(如1个月，2个月，3个月，4个月，6个月，1年，2年，3年，4年，5年，或更长)分离的病毒群体中存在的一个、两个或多个病毒株。在一个示例性实施方案中，在本发明所述方法中使用的病毒来自一个大流行(pandemic)季，如一个流感季的野生型病毒流行株。根据一个方面，所述流行株是指在上述定义的最近分离的病毒群体中最多见的病毒株。另一个方面，所述亲本病毒株也可以是群体中最多样化的序列。

在一些实施方式中，所述基因组节段以质粒和/或病毒的形式引入宿主细胞中。

病毒进一步可以为如上所述的甲型流感病毒减毒株和至少另外一种甲型流感病毒作为亲本病毒株。

在一些实施方式中，也可以采用反向遗传技术，将所述基因组节段以质粒的形式引入宿主细胞中。

在一些实施方式中，也可以采用上述技术的结合，或本领域任何公知的技术(例如脂质体转染等)将所述基因组节段引入宿主细胞中。

在一些实施方式中，所述病毒(作为亲本的甲型流感病毒)的血清型选自H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H6N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2和H10N7中的一种或多种。

根据本发明的再一方面，本发明涉及如上所述方法所产生的重组的子代病毒株。

本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的甲型流感病毒减毒株，和/或如上所述的重组的子代病毒株。

上述，本领域技术人员应当理解，与所述甲型流感病毒减毒株在遗传上基本上相同的病毒，或与所述重组病毒在碱基替换方式上基本相同的病毒，或含有与所述重组流感病毒在遗传上基本上相同的病毒的疫苗也在本申请的保护范围内。如本文所用的，术语“在遗传上基本上相同”是指病毒颗粒，其中它们的基因组的核酸序列，或由它们的基因组产生的氨基酸序列，显示至少98％或至少99％序列同源性。

本发明所提供的疫苗优选地还包括佐剂。适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对所述重组流感病毒中B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述重组流感病毒中T细胞表位的反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的。

在一些实施方式中，所述佐剂选自明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)，以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。

其中完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烷和明矾一般不用于人。

可与本发明所述重组流感病毒一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。尤其适用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶，诸如AlhydrogelTM。对氢氧化铝凝胶而言，是将所述嵌合体蛋白与该佐剂混合，使每一剂量含有大约50到大约800微克铝，优选含有大约400到大约600微克铝。另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector，Denmark的商标为Adju-PhosTM的磷酸铝。初期的磷酸铝颗粒具有板状形态，直径为大约50到大约100nm，产物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10μ。磷酸钙毫微粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)研制的一种佐剂。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

本发明的另一个实施方式涉及成套试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

接种容器优选为医用注射器或者滴鼻器。

本发明进一步提供了保护动物免于流感病毒、特别是甲型流感病毒的方法，其包括给所述动物施用有效量的根据本发明的疫苗。

在一些实施方式中，所述动物为如上所定义的禽类和哺乳动物。

有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量，导致在个体中针对所述疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。针对疫苗的所述分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒流感病毒株的攻击也是有效的。

所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

1.流感病毒基因组密码子重编码策略

根据流感病毒密码子使用的偏好性，选择流感病毒基因组使用率较低的密码子对A/Puerto Rico/8/1934(A/PR/8/34)流感病毒基因组进行重编码设计。密码子改造区域避开非编码区和包装信号，并且保持氨基酸不变，设计原则见下(表1)。共向基因组PB2、NP、和NS节段中引入924个沉默突变(表2)。

表1密码子改造设计原则

表2重编码病毒基因节段特征

2.重编码流感病毒亲本株的体外复制能力

本发明通过反向遗传技术拯救了PB2、NP、和NS节段密码子重编码，其他节段来自于野生型A/PR/8/34的重编码流感病毒亲本株(RP)。通过测序证明所得到的RP病毒基因组与预期相符，并且在鸡胚中进行5次传代不会出现回复突变。将RP与实验室保存的野生型PR8病毒在MDCK细胞上进行噬斑试验，结果显示病毒在MDCK孵育5天后，RP噬斑大小显著小于野生型PR8病毒(图1)。表明重编码流感病毒亲本株体外复制能力降低。

3.重编码流感病毒亲本株在小鼠体内的致病性

分别将不同剂量重编码流感病毒亲本株RP以鼻腔途径感染小鼠，感染后连续记录小鼠的体重和死亡率14天。根据Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(MLD₅₀)，结果如表3。结果表明重编码流感病毒亲本株MLD₅₀比野生型PR8病毒高2083倍，即重编码流感病毒亲本株毒力显著低于野生型PR8病毒。

表3小鼠半数致死量和半数保护量

4.重编码流感病毒亲本株在小鼠体内的同源保护力

分别将不同剂量重编码流感病毒亲本株RP或PR8病毒以鼻腔途径感染小鼠，感染后14天以1000×MLD₅₀剂量PR8病毒对小鼠进行攻毒，攻毒后续记录小鼠的体重和死亡率14天。结果显示如表3所示，PR8病毒和RP减毒株的MPD₅₀均<1PFU，能够对同源病毒攻毒提供完全保护。

5.重编码流感病毒亲本株的异源保护力

为了分析重编码流感病毒亲本株免疫后是否能够提供异源保护，将重编码流感病毒亲本株RP以鼻腔途径接种的小鼠以10×MLD₅₀剂量A/Aichi/68(H3N2,X31)毒株进行攻毒。攻毒结果如图2所示，10³PFU RP接种的小鼠在攻毒后没有明显的体重下降，并且小鼠存活率为100％这些结果提示，重编码流感病毒亲本株能够对异源病毒的攻毒提供完全保护。

6.重编码流感病毒亲本株与流行株的重组

为了确认该流感病毒亲本株骨架基因是否能够与其他流感病毒表面基因重组并包装成为有活性的流感病毒。将重编码流感病毒亲本株分别与H1N1流行株A/Califonia/04/2009(H1N1,CA09)和H3N2流行株A/Texas/50/2012(H3N2,TX12)表面HA、NA基因进行重组，重组病毒分别命名为CA09^RP和TX12^RP。通过血凝试验对重组病毒的生物学活性进行验证，结果如表4，表明重编码流感病毒亲本株可以与不同亚型流感病毒流行株重组成为具有生物学活性的流感病毒。因此，重编码流感病毒亲本株与流行株的重组流感病毒可以作为流感病毒疫苗候选株。

表4重组流感病毒血凝活性

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 甲型流感病毒减毒株及其作为骨架病毒和疫苗的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2091

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tacacgtcgg gccgtcagga gaagaacccg gcgttacgta tgaagtggat gatggcgatg 60

aagtacccga tcacggcgga caagcgtatc acggagatga tcccggagcg taacgagcag 120

ggccagacgt tatggtcgaa gatgaacgac gcgggctcgg accgtgtcat ggtctcgccg 180

ttagcggtca cgtggtggaa ccgtaacggc ccgatcacga acacggtcca ctacccgaag 240

atctacaaga cgtactttga gcgtgtcgag cgtttaaagc acggcacgtt tggcccggtc 300

cactttcgta accaggtcaa gatccgtcgt cgtgtcgaca tcaacccggg ccacgcggac 360

ttatcggcga aggaggcgca ggacgtcatc atggaggtcg tctttccgaa cgaggtcggc 420

gcgcgtatct taacgtcgga gtcgcagtta acgatcacga aggagaagaa ggaggagtta 480

caggactgta agatctcgcc gttaatggtc gcgtacatgt tagagcgtga gttagtccgt 540

aagacgcgtt ttttaccggt cgcgggcggc acgtcgtcgg tctacatcga ggtcttacac 600

ttaacgcagg gcacgtgttg ggagcagatg tacacgccgg gcggcgaggt ccgtaacgac 660

gacgtcgacc agtcgttaat catcgcggcg cgtaacatcg tccgtcgtgc ggcggtctcg 720

gcggacccgt tagcgtcgtt attagagatg tgtcactcga cgcagatcgg cggcatccgt 780

atggtcgaca tcttacgtca gaacccgacg gaggagcagg cggtcgacat ctgtaaggcg 840

gcgatgggct tacgtatctc gtcgtcgttt tcgtttggcg gctttacgtt taagcgtacg 900

tcgggctcgt cggtcaagcg tgaggaggag gtcttaacgg gcaacttaca gacgttaaag 960

atccgtgtcc acgagggcta cgaggagttt acgatggtcg gccgtcgtgc gacggcgatc 1020

ttacgtaagg cgacgcgtcg tttaatccag ttaatcgtct cgggccgtga cgagcagtcg 1080

atcgcggagg cgatcatcgt cgcgatggtc ttttcgcagg aggactgtat gatcaaggcg 1140

gtccgtggcg acttaaactt tgtcaaccgt gcgaaccagc gtttaaaccc gatgcaccag 1200

ttattacgtc actttcagaa ggacgcgaag gtcttatttc agaactgggg cgtcgagccg 1260

atcgacaacg tcatgggcat gatcggcatc ttaccggaca tgacgccgtc gatcgagatg 1320

tcgatgcgtg gcgtccgtat ctcgaagatg ggcgtcgacg agtactcgtc gacggagcgt 1380

gtcgtcgtct cgatcgaccg ttttttacgt atccgtgacc agcgtggcaa cgtcttatta 1440

tcgccggagg aggtctcgga gacgcagggc acggagaagt taacgatcac gtactcgtcg 1500

tcgatgatgt gggagatcaa cggcccggag tcggtcttag tcaacacgta ccagtggatc 1560

atccgtaact gggagacggt caagatccag tggtcgcaga acccgacgat gttatacaac 1620

aagatggagt ttgagccgtt tcagtcgtta gtcccgaagg cgatccgtgg ccagtactcg 1680

ggctttgtcc gtacgttatt tcagcagatg cgtgacgtct taggcacgtt tgacacggcg 1740

cagatcatca agttattacc gtttgcggcg gcgccgccga agcagtcgcg tatgcagttt 1800

tcgtcgttta cggtcaacgt ccgtggctcg ggcatgcgta tcttagtccg tggcaactcg 1860

ccggtcttta actacaacaa ggcgacgaag cgtttaacgg tcttaggcaa ggacgcgggc 1920

acgttaacgg aggacccgga cgagggcacg gcgggcgtcg agtcggcggt cttacgtggc 1980

tttttaatct taggcaagga ggacaagcgt tacggcccgg cgttatcgat caacgagtta 2040

tcgaacttag cgaagggcga gaaggcgaac gtcttaatcg gccagggcga c 2091

<210> 2

<211> 1317

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

aacgcgacgg agatccgtgc gtcggtcggc aagatgatcg gcggcatcgg ccgtttttac 60

atccagatgt gtacggagtt aaagttatcg gactacgagg gccgtttaat ccagaactcg 120

ttaacgatcg agcgtatggt cttatcggcg tttgacgagc gtcgtaacaa gtacttagag 180

gagcacccgt cggcgggcaa ggacccgaag aagacgggcg gcccgatcta ccgtcgtgtc 240

aacggcaagt ggatgcgtga gttaatctta tacgacaagg aggagatccg tcgtatctgg 300

cgtcaggcga acaacggcga cgacgcgacg gcgggcttaa cgcacatgat gatctggcac 360

tcgaacttaa acgacgcgac gtaccagcgt acgcgtgcgt tagtccgtac gggcatggac 420

ccgcgtatgt gttcgttaat gcagggctcg acgttaccgc gtcgttcggg cgcggcgggc 480

gcggcggtca agggcgtcgg cacgatggtc atggagttag tccgtatgat caagcgtggc 540

atcaacgacc gtaacttttg gcgtggcgag aacggccgta agacgcgtat cgcgtacgag 600

cgtatgtgta acatcttaaa gggcaagttt cagacggcgg cgcagaaggc gatgatggac 660

caggtccgtg agtcgcgtaa cccgggcaac gcggagtttg aggacttaac gtttttagcg 720

cgttcggcgt taatcttacg tggctcggtc gcgcacaagt cgtgtttacc ggcgtgtgtc 780

tacggcccgg cggtcgcgtc gggctacgac tttgagcgtg agggctactc gttagtcggc 840

atcgacccgt ttcgtttatt acagaactcg caggtctact cgttaatccg tccgaacgag 900

aacccggcgc acaagtcgca gttagtctgg atggcgtgtc actcggcggc gtttgaggac 960

ttacgtgtct tatcgtttat caagggcacg aaggtcttac cgcgtggcaa gttatcgacg 1020

cgtggcgtcc agatcgcgtc gaacgagaac atggagacga tggagtcgtc gacgttagag 1080

ttacgttcgc gttactgggc gatccgtacg cgttcgggcg gcaacacgaa ccagcagcgt 1140

gcgtcggcgg gccagatctc gatccagccg acgttttcgg tccagcgtaa cttaccgttt 1200

gaccgtacga cgatcatggc ggcgtttaac ggcaacacgg agggccgtac gtcggacatg 1260

cgtacggaga tcatccgtat gatggagtcg gcgcgtccgg aggacgtctc gtttcag 1317

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gcagcaccct cggcttagac atcgagacgg cgacgcgtgc gggcaagcag atcgtcgagc 60

gtatcttaaa ggaggagtcg gacgaggcgt taaagatgac gatggcgtcg gtcccggcgt 120

cgcgttactt aacggacatg acgttagagg agatgtcgcg tgactggtcg atgttaatcc 180

cgaagcagaa ggtcgcgggc ccgttatgta tccgtatgga ccaggcgatc atggacaaga 240

acatcatctt aaaggcgaac ttttcggtca tctttgaccg tttagagacg ttaatcttat 300

tacgtgcgtt tacggaggag ggcgcgatcg 330

Claims

1.甲型流感病毒减毒株，该病毒基因组被引入如下基因区域突变而被减毒：

PB2的127-2217位碱基片段替换为SEQ ID NO:1；

NP的106-1422位碱基片段替换为SEQ ID NO:2；

NS的166-495位碱基片段替换为SEQ ID NO:3；

其中，所述流感病毒减毒株为A/PR/8/34株流感病毒。

2.一种产生用于制备病毒疫苗的重组的子代病毒株的方法，包括：

其中，所述第一基因组节段为权利要求1所述的甲型流感病毒减毒株的PB2基因、NP基因、NS基因、PB1基因、PA基因和M基因，所述第二基因组节段为至少一种甲型流感病毒的HA基因和NA基因，且二者能够重组以产生子代病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括从所述宿主细胞中分离突变的子代病毒。

4.根据权利要求2所述的方法，所述基因组节段以质粒和/或病毒的形式引入宿主细胞中。

5.根据权利要求4所述的方法，所述病毒的血清型选自H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H6N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2和H10N7中的一种或多种。

6.权利要求2~5任一项方法所产生的重组的子代病毒株。

7.疫苗，其含有权利要求1所述的甲型流感病毒减毒株，和/或权利要求6所述的重组的子代病毒株。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

9.成套试剂盒，其包含权利要求7或8所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。