CN108026515B - 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体 - Google Patents

用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体 Download PDF

Info

Publication number
CN108026515B
CN108026515B CN201680033797.2A CN201680033797A CN108026515B CN 108026515 B CN108026515 B CN 108026515B CN 201680033797 A CN201680033797 A CN 201680033797A CN 108026515 B CN108026515 B CN 108026515B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
influenza
protein
leu
influenza virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680033797.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108026515A (zh
Inventor
安德烈·尤里耶维奇·叶戈罗夫
博里斯·费尔科
阿尔乔姆·亚历山德罗维奇·克罗欣
尤利安·罗曼诺芙娜·罗曼诺娃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Biotechnology Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Pharmaceutical Co ltd filed Critical Biotechnology Pharmaceutical Co ltd
Publication of CN108026515A publication Critical patent/CN108026515A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108026515B publication Critical patent/CN108026515B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及医学和病毒学领域。公开了可用于预防和/或治疗感染性疾病的减毒甲型流感病毒、基于所述病毒的流感病毒载体、以及包含所述病毒的药物组合物。本发明另外涉及可用于治疗肿瘤疾病的减毒甲型流感病毒、基于所述病毒的流感病毒载体、以及包含所述病毒的药物组合物。

Description

用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减 毒流感病毒载体
技术领域
本发明涉及医学和病毒学领域，特别地涉及减毒的嵌合甲型病毒(A virus)、基于所述病毒的减毒流感病毒载体、及其用于预防和/或治疗感染性疾病和用于治疗肿瘤疾病的用途。
背景技术
现今，针对病毒感染和用于限制其传播的最重要保护措施是预防性疫苗接种。现代疫苗通常诱导形成针对表面病毒抗原的抗体。疫苗有效性直接取决于疫苗中所包含病毒株与群体中循环的毒株的抗原结构之间匹配的程度。大多数病毒的表面蛋白经历不断的抗原性变异(抗原性漂移 (antigen drift))，从而需要不断更新疫苗株组成。开发诱导广泛作用谱的免疫应答、免疫原性高且安全的疫苗是当前高效流感预防中遇到的主要问题之一。
在所有病毒性呼吸道疾病中，流感引起最严重的病理状况并且对群体健康和经济造成的损失最大。缺乏针对周期性出现的新流行性流感病毒株的群体免疫力使得流感感染变得尤其危险。已知，在1918年西班牙流感导致3000至5000万人死亡。目前，根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的数据，每年全球约有20％的人口(包括5至10％的成年人和20至30％的儿童)在季节性大流行期间患上流感(世界卫生组织)(URL：http：//www.who.int/biologicals/vaccines/influenza/en/(访问日期：2016年3月28日))。记录到300至500万例严重疾病形式，并且 250,000至500,000例是致死的。由流感和其他急性呼吸道病毒感染(acute respiratory viral infection，ARVI)造成的经济损失占由所有感染性疾病引起的总损失的约77％。重大损失不但涉及患者治疗和康复的直接费用，而且还涉及由生产力下降和企业利润降低造成的间接损失。流感和急性呼吸道病毒感染占暂时性残疾病例的总数的12％至14％。
现有的疫苗可细分为两种类型：减毒型(活的，含有显示出低致病性的整个活性病毒)和灭活型(含有病毒颗粒的片段或整个失活病毒)。可在受感染宿主中复制的活病毒引起针对这些病毒之表达抗原的强效并且持久的免疫应答。其有效地诱导体液和细胞免疫应答两者，并且刺激细胞因子和趋化因子介导的免疫应答。因此，活的减毒病毒相对于通常仅刺激免疫系统之体液部分的基于灭活免疫原或免疫原之单独亚基的疫苗组合物具有某些优势。
为了对动物和人进行疫苗接种以针对不同感染性疾病，可使用不同科的病毒作为表达外来基因组序列的载体。载体可用于其中传统的灭活疫苗或活疫苗不能产生或者其有效性不能控制疾病的情况。在现有的抗原递送系统中，病毒载体由于以下特性而占据特殊的地位：其具有与细胞相互作用并渗透入其中的自然机理，将外来遗传物质转移到细胞的细胞质或细胞核且能够提供持久的抗原表达，并且病毒包膜保护编码所引入转基因的核酸。
并非所有的病毒都具有构建用于产生有效减毒重组疫苗的载体所需的特性。目前，对于开发基于病毒载体的疫苗，最广泛使用的病毒是痘病毒(痘病毒科(Poxviridae))[J.Gen.Virol.2005.第86卷.第11期.第 2925-2936页]、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)[Virol.2001. 第75卷.第23期.第11868-11873页]和腺病毒(腺病毒科(Adenoviridae)) [Biotechnology.2007.第5卷，第38-44页]。在用作病毒载体的痘病毒中，最流行的病毒是痘苗病毒，其具有例如简单和生产成本低以及包装能力高 (高至25kbp)的优点[J.Gen.Virol.2005.第86卷.第11期.第 2925-2936页]。基于痘苗病毒的载体的一个严重缺点是部分人群中由于针对天花进行免疫接种而存在针对这种病毒的预先存在免疫力。因此，建议使用基于痘病毒如金丝雀痘痘病毒(Canarypox)和家禽痘病毒(Flowpox) 的载体。然而，与痘苗病毒相比，Canarypox和Flowpox诱导针对靶抗原的较弱的免疫应答，并且需要重复施用或使用佐剂[Vaccine.1991.第9 卷.第5期，第303-308页]。NDV疫苗载体的一个显著缺点是：施用重组 NDV的效果尚未得到充分研究并且尚不清楚基于NDV的疫苗对人是否安全。此外，NDV的特征在于包装能力低并且难以产生携带数种靶抗原的载体[Chem.Biodivers.2010.第7卷.第3期.第677-689页]。腺病毒也具有很多限制其用作基因转移载体的缺点。腺病毒载体的主要缺点如下：(1)病毒受体在体内细胞表面分布不均匀，这使得很多细胞对腺病毒感染不敏感；(2)群体中存在针对已知腺病毒载体的强大保护性免疫；以及(3)将腺病毒DNA基因组整合到人染色体中的理论可能性(Stephen SL，Montini E，Sivanandam VG，Al-Dhalimy M，Kestler HA，Finegold M， Grompe M，KochanekS.Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo.J Virol.2010年10月；84(19)：9987-94.doi： 10.1128/JVI.00751-10.电子出版于2010年8月4日)。
基于流感病毒构建的载体相对于其他病毒载体具有数个优点，因为：
-流感病毒在其复制周期中不具有DNA阶段并且不能插入到人或动物基因组中；
-流感病毒在感染人呼吸道细胞之后引发针对其抗原的全身和黏膜 B细胞和T细胞应答；
-可利用多种不同的流感病毒亚型。由于针对所述不同亚型的抗体不具有交叉反应性，因此可避免宿主中具有针对病毒载体的预先存在免疫力，这在其他活载体的情况下常常是一个问题。还可用表达相同抗原的不同流感病毒亚型进行有效的加强免疫接种；
-存在数种类型的用于鼻内施用的活流感疫苗(活尿囊流感疫苗
Figure BDA0001500359090000031
(RF)和
Figure BDA0001500359090000032
(USA))以及通过使用10日龄鸡胚胎进行其生产的工业技术(Guideline on Influenza Vaccines-Quality Module，European MedicinesAcency，2014年4月25日[电子资源]URL： http：//www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guide line/2014/06/WC500167817.pdf(访问日期：2015年1月11日))。
流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，其包括以下属：甲型、乙型和丙型流感病毒。甲型和乙型流感病毒的基因组在结构上相似，并且由8个负极性的RNA基因组区段组成：PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、 M和NS(Chou YY，Vafabakhsh R，
Figure BDA0001500359090000033
S，Gao Q，HaT，Palese P.One influenza virus particle packages eight unique viral RNAs asshown by FISH analysis.Proc Natl Acad Sci U S A.2012年1月5日；109(23)：9101-6.doi：10.1073/pnas.1206069109.电子出版于2012年4月30日)。聚合酶复合物PB2、PB1和PA从每个基因组片段转录一个mRNA，其被翻译成相同名称的蛋白质。基因组区段M和NS的信使RNA可选择性剪接以形成分别编码M2和NEP蛋白的mRNA。除NS1和PB1-F2之外的所有蛋白质(不是在所有毒株中都可获得)都是病毒颗粒的结构组分。非结构蛋白 NS1在受感染细胞的细胞质中积累，并且用作干扰素抑制剂(Krug RM. Functions of the influenza A virusNS1 protein in antiviral defense.Curr Opin Virol.2015年1月；12：1-6.doi：10.1016/j.coviro.2015.01.007.电子出版于2015年1月29日.Review.)。
流感病毒基因组的区段化结构是作为重配过程之结果的新不同毒株的来源。这是流感病毒的天然抗原多样性和发生流感大流行的机理之一。
流感病毒的抗原特性由在病毒粒子(virion)表面上形成刺突的表面糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)决定。HA分子负责使病毒与细胞上的唾液酸受体结合并使病毒膜与细胞膜融合以使基因组透入细胞的细胞质和细胞核中的机理。在病毒复制的过程中，HA被细胞蛋白酶切割(HA活化)成仍然通过二硫键连接的两个亚基-HA1和HA2(Bullough PA，Hughson FM，Skehel JJ，Wiley DC.Structure of influenza haemagglutinin at the pHof membrane fusion.Nature 1994；371，37-43)。 HA分子由两部分组成：包含HA1亚基的球状部分和主要由HA2形成并且部分由HA1亚基形成的茎区。球状部分包含受体结合位点和五个抗原位点，并且用作抗体形成的主要靶标。阻断病毒与细胞受体结合的抗体是中和性的。HA1亚基的特征在于高可变性。紧位于病毒膜附近的HA茎高度保守并且以低免疫原性为特征。HA2亚基的主要功能是确保病毒膜与内体膜融合；该亚基高度保守。根据抗原特异性，迄今已知甲型流感病毒(influenza A virus)的18种HA亚型和11种NA亚型。H1、H2、H5、 H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18亚型属于第一组、 H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型属于第二组。与此同时，仅在人群中循环的甲型流感病毒的H1、H2和H3亚型以及乙型流感病毒(influenza B virus)的不同抗原性变种引起大流行和季节性流感大流行。
在由于一种甲型流感病毒亚型患病后或在通过一种甲型流感病毒亚型进行疫苗接种后产生的特异性免疫无法很好地保护免于其他病毒亚型的感染。针对任何甲型流感病毒亚型的免疫力不能保护免受乙型流感病毒的感染，反之亦然-针对乙型流感病毒的免疫接种对甲型流感病毒也不具有效果。在这方面，迫切需要开发对甲型和乙型流感病毒的所有已知抗原性变种都有效的通用流感疫苗。
两种机理使得流感病毒能够具有极高的变异性，并且因此使其能够逃脱中和抗体：1)点突变的累积，导致表面糖蛋白的抗原结构改变(抗原性漂移)；和2)基因组区段的重配。其导致出现可引起大流行的新病毒亚型 (抗原性转变)。
现有的所有流感疫苗在老人和婴儿中都具有低效率(Jefferson T， Rivetti A，Di Pietrantonj C，Demicheli V，Ferroni E.Vaccines for preventing influenza inhealthy children.Cochrane Database Syst Rev 2012；8，CD004879；Osterholm MT，Kelley NS，Sommer A，Belongia EA. Efficacy and effectiveness of influenzavaccines：a systematic review and meta-analysis.Lancet Infect Dis 2011；12，36-44；Pfleiderer M，Trouvin JH， Brasseur D，Granstrom M，Shivji R，Mura M，CavaleriM.Summary of knowledge gaps related toquality and efficacy of currentinfluenza vaccines.Vaccine 2014；32，4586-91)。此外，这些疫苗只有在疫苗病毒与流行性毒株具有相同的抗原特性时才能抵御循环病毒。流感病毒的表面抗原(HA和NA)的高变异性使得需要每年接种疫苗并且更新疫苗组成。应提及的是，根据WHO建议开发的季节性疫苗在出现与所有循环毒株根本不同的新流感流行性病毒株的情况下不具有效果，如2009年在出现流行性病毒A/加利福尼亚/7/2009(H1N1pdm09)时发生的。另一个实例可以是季节性疫苗2014的H3N2组分的低效率，这是由于这种病毒亚型由于抗原性漂移而出现新抗原性变种(Skowronski DM，Chambers C， Sabaiduc S，De Serres G，Dickinson JA，Winter AL，Drews SJ，Fonseca K， Charest H，Gubbay JB，Petric M，Krajden M，Kwindt TL，Martineau C， Eshaghi A，Bastien N，Li Y.Interim estimates of 2014/15 vaccineeffectiveness against influenza A(H3N2)from Canada′s Sentinel PhysicianSurveillance Network，2015年1月.Euro Surveill 2015；20)。在过去的60 年间，开发了很多具有一定优势和缺点的疫苗；然而，现有的疫苗由于其不能够诱导针对不断演化的流感病毒的交叉保护性免疫而都不能解决流感发病率控制的问题。在这方面，迫切需要开发提供持久的广泛交叉保护性免疫并且能够针对所有已知亚型的甲型和乙型流感病毒提供保护的有效通用流感疫苗。
所有已知流感疫苗(灭活的(整个病毒粒子(virion)、裂解物或亚基) 或活的(减毒的冷适应性的(cold adapted)))的功能都是产生针对HA 的球状部分的免疫力。与可变的球状部分形成相比，甲型(组I和II)和乙型流感病毒的HA茎部分远远更加保守。已知针对该HA部分诱导的抗体存在数种直接和间接中和的机理。直接中和的一种机理归因于阻止HA构象变化，所述HA构象变化是融合肽释放和后续内体膜与病毒膜融合从而将病毒基因组递送到细胞中所必需的。直接中和的第二种机理归因于通过抗体与位于切割位点附近的HA部分相互作用而阻止HA被切割成HA1 和HA2亚基。间接中和机理中涉及抗体依赖性和补体依赖性细胞毒性 (Terajima M，Cruz J，Co MD，Lee JH，Kaur K，Wrammert J，Wilson PC，Ennis FA.Complement-dependent lysis of influenza a virus-infected cells bybroadly cross-reactive human monoclonal antibodies.J Virol 2011；85， 13463-7；Jegaskanda S，Weinfurter JT，Friedrich TC，Kent SJ. Antibody-dependent cellularcytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virusinfection of macaques.J Virol 2013；87， 5512-22)。
疫苗接种实际上不诱导针对HA茎区的抗体，而在天然感染后可检测到少量的这些抗体(Moody MA，Zhang R，Walter EB，Woods CW， Ginsburg GS，McClain MT，Denny TN，Chen X，Munshaw S，Marshall DJ， Whitesides JF，Drinker MS，Amos JD，Gurley TC，Eudailey JA，Foulger A， DeRosa KR，Parks R，Meyerhoff RR，Yu JS，Kozink DM，Barefoot BE， Ramsburg EA，Khurana S，Golding H，Vandergrift NA，Alam SM， TomarasGD，Kepler TB，Kelsoe G，Liao HX，Haynes BF.H3N2 influenza infection elicits morecross-reactive and less clonally expanded anti-hemagglutinin antibodies thaninfluenza vRccination.PLoS ONE 2011；6，e25797)。
目前正在开发的产生通用疫苗的大多数方法靶向流感病毒蛋白的保守区。针对保守蛋白PB2、PB1、PA、NP和M1的抗体不具有中和活性，但可通过抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cytotoxicity，ADCC) 在病毒消除中起重要作用。
产生通用疫苗的数个实例基于HA2亚基。用代表HA2胞外域(第 23至185位氨基酸残基)的肽或与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)和弗氏佐剂缀合的融合肽(第1至38位氨基酸残基)) 对小鼠进行三重免疫接种在用致死剂量的异源病毒株攻击时诱导交叉反应性免疫，从而实现降低动物死亡率(Stanekova Z，Kiraly J，Stropkovska A，Mikuskova T，Mucha V，Kostolansky F，Vareckova E.Heterosubtypic protectiveimmunity against influenza A virus induced by fusion peptide of thehemagglutinin in comparison to ectodomain of M2 protein.Acta Virol 2011；55，61-7)。在用嵌合HA构建体免疫接种的情况下发生更有效的保护。Krammer等表明在免疫接种有嵌合蛋白的小鼠中诱导异亚型体液免疫，所述嵌合蛋白包含来自不同亚型病毒的HA球状部分与相同病毒的HA茎区的组合(Krammer F，Palese P，Steel J.Advances inuniversal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapiesbased on conserved regions of the hemagglutinin.Curr Top Microbiol Immunol2014；386，301-21.；Krammer F，Hai R，Yondola M，Tan GS，Leyva-Grado VH，Ryder AB，Miller MS，Rose JK，Palese P，Garcia-Sastre A，Albrecht RA.Assessment ofinfluenza virus hemagglutinin stalk-based immunity in ferrets.J Virol 2014；88，3432-42)。这种方法的缺点是复杂的免疫接种方案，其包括使用DNA进行动物电穿孔，以及用补充有佐剂poly(I：C)的蛋白质构建体进行双重肌内和鼻内免疫接种。
作为产生通用流感疫苗的不同方法的一个实例，是基于H1N1病毒之 HA茎区的氨基酸序列，使用通过基因改造产生的稳定化结构(微HA， mini-HA)。从大文库中仅选择了对具有广泛中和活性范围的抗体具有最高亲和力的结构。用这些结构对小鼠进行免疫接种在用H5N1亚型的高致病性禽流感病毒攻击时也保护动物免于死亡(Impagliazzo A，MilderF， Kuipers H，Wagner MV，Zhu X，Hoffman RM，van Meersbergen R， Huizingh J，Wanningen P，Verspuij J，de Man M，Ding Z，Apetri A， Kukrer B，Sneekes-Vriese E，Tomkiewicz D，Laursen NS，Lee PS， Zakrzewska A，Dekking L，Tolboom J，Tettero L，van Meerten S，Yu W， Koudstaal W，Goudsmit J，Ward AB，Meij berg W，Wilson IA，Radosevic K.A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadlyprotective immunogen.Science 2015；349，1301-6)。通过用30μg补充有Novavax生产的Matrix-M佐剂的纯化mini-HA蛋白进行双重肌内免疫接种实现完全保护小鼠免于死亡。
在通用流感疫苗的开发中，另一个前瞻性方向基于设计显著增强HA 的免疫原性的自组装纳米颗粒(Kanekiyo M，Wei CJ，Yassine HM， McTamney PM，Boyington JC，Whittle JR，Rao SS，Kong WP，Wang L， Nabel GJ.Self-assembling influenzananoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies.Nature2013；499，102-6)。用补充有新佐剂 SAS(Sigma佐剂系统)的纳米颗粒肌内免疫接种动物2或3次。尽管在用纳米颗粒免疫接种后缺乏中和抗体，但小鼠和白鼬(ferret)证明在用高致病性H5N1禽病毒感染时被完全保护免于死亡。
用于产生活疫苗的现代技术之一基于构建能够通过一种病毒表达另一种病毒的抗原的疫苗载体。使用不同的含DNA病毒(即：腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒或痘病毒)作为表达流感病毒抗原的载体(Dudek T， Knipe DM.Replication-defective viruses asvaccines and vaccine vectors. Virology 2006；344，230-9；He F，Madhan S，KwangJ.Baculovirus vector as a delivery vehicle for influenza vaccines.Expert RevVaccines 2009；8， 455-67；Draper SJ，Cottingham MG，Gilbert SC.Utilizing poxviralvectored vaccines for antibody induction-progress and prospects.Vaccine 2013；31，4223-30.Price GE，Soboleski MR，Lo CY，Misplon JA，Pappas C， Houser KV，TumpeyTM，Epstein SL.Vaccination focusing immunity on conserved antigens protectsmice and ferrets against virulent H1N1 and H5N1 influenza A viruses.Vaccine2009；27，6512-21)。因此，用腺病毒载体进行的实验表明，用含有甲型流感病毒保守蛋白NP和M2的序列的质粒(50μg)进行三重免疫接种，然后用表达相同蛋白质的两种腺病毒载体进行鼻内感染使得对用病毒A/FM/1/47(H1N1)或被高致病性禽流感病毒H5N1亚型感染的小鼠和白鼬提供了完全保护以免于死亡和体重减轻。
因此，靶向针对流感病毒抗原之保守区的免疫应答的所有讨论方法均证明了产生保护免于被不同甲型流感病毒变种感染的疫苗的可能性。然而，为了实现这个目的，使用了通过使用不同性质的免疫佐剂对动物进行多重疫苗接种的复杂方案。此外，通用流感疫苗的已知实验性制剂均未提供针对乙型流感病毒的保护。对此应补充的是，上述实验性制剂需要复杂的技术方法用于产生多组分疫苗，这与最终产品的不可接受的高成本相关。
已知鼻腔细胞中抗原的表达诱导全身和局部黏膜B细胞和T细胞免疫应答。已经进行很多尝试以使用流感病毒作为载体在动物的呼吸道细胞中递送并表达外来基因组序列。在甲型或乙型流感病毒的8个基因组片段中，只有NS基因组片段能够在NS1非结构蛋白的阅读框架中稳定容纳超过800个核苷酸的基因组插入物(insertion)，而不破坏所得病毒粒子的结构(Kittel C，Sereinig S，Ferko B，Stasakova J，Romanova J， Wolkerstorfer A，Katinger H，Egorov A.Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1reading frame.Virology.2004年1月20日； 324(1)：67-73.PubMed PMID：15183054)。此外，在所有的流感病毒蛋白中，仅通常包含230至237个氨基酸残基的NS1蛋白可在羧基端被截短至50％，而不显著影响病毒在细胞培养物、鸡胚胎或动物的呼吸道中的复制活性(Egorov A，Brandt S，Sereinig S，Romanova J，Ferko B， Katinger D，Grassauer A，Alexandrova G，Katinger H，Muster T. Transfectant influenza A viruses with longdeletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells.J Virol.1998年8月；72(8)：6437-41.PubMed PMID：9658085；PubMed Central PMCID：PMC109801)。NS1蛋白的这种截短提供空间以用于引入外来基因组序列的长插入物而不破坏病毒的形态和基本功能，从而使得可以构建遗传上稳定的载体。就此而言，产生了基于甲型流感病毒的流感病毒载体，其编码NS1蛋白的第80至126位氨基酸残基的截短阅读框，其中所述截短阅读框可被多种细菌和病毒病原体的抗原序列插入物，例如通过结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、流产布鲁氏菌(brucella abortus)或人类免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiency virus)的蛋白质序列插入物延长(Tabynov K， Sansyzbay A，Kydyrbayev Z，Yespembetov B，Ryskeldinova S，Zinina N， Assanzhanova N，Sultankulova K，Sandybayev N，Khairullin B， Kuznetsova I，Ferko B，EgorovA.Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins asvaccines against B.abortus infection.Virol J.2014年4月10日；11：69.doi：10.1186/1743-422X-11-69. PubMed PMID：24716528；PubMed Central PMCID：PMC3997475；Sereinig S，Stukova M，Zabolotnyh N，Ferko B，Kittel C，Romanova J， Vinogradova T，Katinger H，Kiselev O，Egorov A.Influenza virus NS vectors expressing themycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Th1 immune response andprotect animals against tuberculosis challenge.Clin Vaccine Immunol.2006年8月；13(8)：898-904.PubMed PMID：16893990；PubMed Central PMCID：PMC1539114；FerkoB， Stasakova J，Sereinig S，Romanova J，Katinger D，Niebler B，Katinger H， EgorovA.Hyperattenuated reconmbinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specificsystemic and mucosal immune responses in mice. J Virol.2001年10月；75(19)：8899-908.PubMed PMID：11533153； PubMed Central PMCID：PMC114458)。携带截短至124个氨基酸残基的 NS1蛋白的构建体(下文，NS1-124载体)由于在鸡胚胎中的复制和在动物中的免疫原性的参数而表现最佳(FerkoB，Stasakova J，Romanova J， Kittel C，SereinigS，Katinger H，Egorov A.Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes.J Virol.2004年12月；78(23)：13037-45.PubMed PMID： 15542655；PubMed Central PMCID：PMC524997)。
具有更加截短的NS1蛋白的构建体在干扰素活性细胞(MDCK细胞， A549)(包括10日龄的鸡胚胎)中生长的能力降低并且适合于仅在干扰素缺陷型Vero细胞中生产。在另一方面，具有由124至126个氨基酸残基组成的NS1蛋白的载体在减毒方面不同并且在动物中不够安全。例如，在特定位置携带ESAT-6分枝杆菌蛋白的病毒载体的复制水平在小鼠的肺中可达到接近于致病性流感病毒的值(每克肺组织104以及更多个病毒颗粒)。此外，在感染剂量>5.0log/小鼠的情况下，NS1-124载体可在受感染小鼠的肺组织中引起病毒的显著复制并形成可见的肺病理(Egorov A， Brandt S，Sereinig S，Romanova J，Ferko B，Katinger D，Grassauer A， Alexandrova G，Katinger H，Muster T.Transfectantinfluenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficientlyin Vero cells.J Virol. 1998年8月；72(8)：6437-41.PubMed PMID：9658085；PubMedCentral PMCID：PMC109801；Stukova MA，Sereinig S，Zabolotnyh NV，Ferko B， KittelC，Romanova J，Vinogradova TI，Katinger H，Kiselev OI，Egorov A. Vaccine potentialof influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6protein.Tuberculosis(Edinb).2006年5月-7月； 86(3-4)：236-46.PubMed PMID：16677861)。因此，具有被截短至124个氨基酸残基的NS1阅读框的流感病毒载体不能用于人的疫苗接种，因为其不符合针对活流感疫苗开发的安全性参数，其中必要条件是病毒的温度敏感性(在39℃下的复制能力降低)和病毒在动物的下呼吸道中活跃复制的缺乏(Maassab HF，Bryant ML.The development of live attenuated cold-adaptedinfluenza virus vaccine for humans.Rev Med Virol.1999年 10月-12月；9(4)：237-44.Review.PubMed PMID：10578119；Gendon IuZ. [Live cold-adapted influenzavaccine：state-of-the-art].Vopr Virusol.2011 年1月-2月；56(1)：4-17.Review.Russian.PubMed PMID：21427948； Aleksandrova GI，Gushchina MI，KlimovAI，Iotov VV.[Genetic basis for construction of the life influenza type Avaccine using temperature-sensitive mutants].Mol Gen Mikrobiol Virusol.1990年3月； (3)：3-8.Review.Russian.PubMed PMID：2194119；Kendal AP. Cold-adapted liveattenuated influenza vaccines developed in Russia：can they contribute tomeeting the needs for influenza control in other countries？Eur JEpidemiol.1997年7月；13(5)：591-609.Review.PubMed PMID：9258574)。
与许可的活流感疫苗(活尿囊流感疫苗
Figure BDA0001500359090000101
(RF)或
Figure BDA0001500359090000111
(USA))不同，已知的流感病毒载体NS1-124及其相关构建体不具有表型温度敏感性标志物(ts表型)并且在小鼠的肺中具有接近全长 NS1蛋白之野生型病毒的复制水平。
在20世纪50至60年代，曾尝试使用流感病毒作为溶瘤剂，这基于医生对个别病例在从流感感染恢复之后癌症缓解的观察(Lindenmann J， Klein PA.Viral oncolysis：increased immunogenicity of host cellantigen associated with influenzavirus.J Exp Med.1967年7月1日； 126(1)：93-108)。
由于在90年代后期开发了用于流感病毒的遗传工程技术，这已创造了产生具有经修饰NS1蛋白的溶瘤性流感病毒载体的可能性。经显示，当向肿瘤内引入重组病毒时，截短NS1蛋白可使得溶瘤效果增强，这是由于刺激了NS1蛋白作为拮抗剂的先天性免疫系统(Sturlan S，Stremitzer S，Bauman S，Sachet M，Wolschek M，Ruthsatz T，Egorov A，Bergmann M. Endogenous expression of proteases in colon cancer cellsfacilitate influenza A viruses mediated oncolysis.Cancer Biol Ther.2010年9月15 日；10(6)：592-9；Ogbomo H，Michaelis M，Geiler J，van Rikxoort M， Muster T，Egorov A，Doerr HW，Cinatl J Jr.Tumor cells infected with oncolytic influenza Avirus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells.MedMicrobiol Immunol.2010年5月；199(2)：93-101.doi： 10.1007/s00430-009-0139-0.电子出版于2009年12月15日.PubMed PMID： 20012989；Efferson CL，Tsuda N，Kawano K，Nistal-Villán E，Sellappan S， Yu D，Murray JL，García-Sastre A，IoannidesCG.Prostate tumor cells infected with a recombinant influenza virusexpressing a truncated NS1 protein activate cytolytic CD8+ cells to recognizenoninfected tumor cells. J Virol.2006年1月；80(1)：383-94)。
此外，对流感病毒NS1蛋白的长度进行遗传工程操作的可能性允许开发这样的的载体，其由于存在免疫增强剂(例如白介素-15)的表达而得以增强有效性(van RikxoortM，Michaelis M，Wolschek M，Muster T，Egorov A，Seipelt J，Doerr HW，Cinatl JJr.Oncolytic effects of a novel influenza A virus expressing interleukin-15from the NS reading frame. PLoS One.2012；7(5)：e36506)。
遗憾的是，这些工作使用能够在一些细胞培养物中进行有限复制的流感病毒，其不具有转基因在鸡胚胎中大规模产生所需的遗传稳定性，而鸡胚胎是用于流感疫苗制剂生产的最佳基质。
因此，仍然需要新的有效病毒载体，特别是减毒的流感病毒载体，其以病毒在动物生物体中缺乏活跃复制为特征且具有温度敏感性表型，并且可用于预防和/或治疗感染性病以及用于治疗肿瘤疾病。
发明内容
本发明涉及诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒甲型流感病毒，其包含具有NS1蛋白的截短阅读框与Nep基因异源序列的嵌合NS片段，所述Nep基因异源序列来源于不同于所述减毒甲型流感病毒的亚型的甲型流感病毒亚型。
特别地，本发明涉及减毒甲型流感病毒，其中所述截短阅读框编码由 80至130个氨基酸残基组成的NS1蛋白，更优选地其中所述截短阅读框编码由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白。
本发明的一个实施方案涉及减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白的所述截短阅读框来源于H1N1流感病毒亚型，并且所述Nep基因异源序列来源于H2N2流感病毒亚型。
根据本发明的另一个实施方案，减毒甲型流感病毒包含聚有NS1蛋白的截短阅读框与Nep基因异源序列的嵌合NS片段，其中NS1蛋白的所述截短阅读框来源于H1N1流感病毒亚型且所述Nep基因异源序列来源于H2N2流感病毒亚型，并且其中所述截短阅读框编码由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白。
本发明还涉及减毒流感病毒载体，其表达选自来自细菌、病毒和原生动物的蛋白质或其片段的蛋白质或其片段，其中所述载体是根据本发明的减毒甲型流感病毒，在所述减毒甲型流感病毒中NS1蛋白基因的截短阅读框被编码来自细菌、病毒和原生动物之蛋白质或其片段的至少一个转基因之序列的插入物延长。
本发明的一个实施方案涉及减毒流感病毒载体，其表达选自以下的蛋白质或其片段：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、疱疹病毒 (herpes virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus)、疟原虫(malaria parasite)、毛滴虫属(Trichomonas)、锥虫属(Trypanosoma)、利什曼虫属 (Leishmania)、衣原体属(Chlamydia)、布鲁氏菌病致病原(brucellosiscausative agent)的蛋白质，或其组合。
本发明的另一个实施方案涉及减毒流感病毒载体，其表达来自致病性细菌、病毒或原生动物的蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段由 10至400个氨基酸组成。
根据本发明的另一个实施方案，减毒流感病毒载体其中插入物编码来自流感病毒的HA蛋白区，优选地其中HA蛋白区是选自以下部分的HA2 亚基区：来自甲型流感病毒的第1至185位氨基酸(amino acid，aa)、来自乙型流感病毒的第1至186位aa、来自甲型流感病毒的第23至185 位aa或来自甲型流感病毒的第65至222位aa。
本发明的下一个实施方案是减毒流感病毒载体，其中插入物编码甲型或乙型流感病毒HA2亚基区的第1至21位aa的序列，和甲型流感病毒 NP蛋白区的第243至251位aa的序列。
本发明的另一个实施方案涉及减毒流感病毒载体，其中插入物编码结核分枝杆菌的ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4或10.4 蛋白或其片段，特别地，其中病毒基因组序列还包含有在编码NS1-124 和ESAT6的序列之间的编码自我切割2A肽的序列。
本发明还涉及表达蛋白质或其片段的减毒流感病毒载体，其中所述载体是包含具有NS1蛋白的截短阅读框与Nep基因异源序列的嵌合NS片段的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白的所述截短阅读框来源于H1N1 流感病毒亚型且所述Nep基因异源序列来源于H2N2流感病毒亚型，并且其中所述截短阅读框编码由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白，其中 NS1蛋白基因的所述截短阅读框被编码乙型流感病毒HA2蛋白之第1至 21位aa和甲型流感病毒NP蛋白之第243至251位aa的序列的插入物延长。
本发明还涉及具有溶瘤活性的减毒流感病毒载体，其中所述载体是根据本发明的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白基因的截短阅读框被编码来自细菌、病毒或原生动物之蛋白质或其片段的至少一个转基因之序列的插入物延长。
本发明的一个实施方案是具有溶瘤活性的减毒流感病毒载体，其中插入物编码选自以下的蛋白质或其片段：来自甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、锥虫属、利什曼虫属、衣原体属的蛋白质或其片段，或其组合。
本发明的下一个实施方案是具有溶瘤活性的减毒流感病毒，其中所述蛋白质或其片段由10至400个氨基酸组成。
本发明的一个优选实施方案是具有溶瘤活性的减毒流感病毒载体，其中插入物编码结核分枝杆菌的ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、 Mtb8.4或10.4蛋白或其片段，特别地，其中NS1蛋白基因的截短阅读框被编码结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的序列的插入物延长，更优选地，其中 NS1蛋白基因的截短阅读框被编码自我切割2A肽的序列和编码结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的序列的插入物延长。
本发明还涉及诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒流感病毒载体，其包含：
来源于甲型流感病毒(influenza A)/PR/8/34(H1N1)的PB2蛋白基因的核苷酸序列或与PB2蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的PB1蛋白基因的核苷酸序列或与PB1蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的PA蛋白基因的核苷酸序列或与PA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NP蛋白基因的核苷酸序列或与NP蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的M蛋白基因的核苷酸序列或与M蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/加利福尼亚/7/09样(H1N1pdm)的HA蛋白基因的核苷酸序列或与HA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/加利福尼亚/7/09样(H1N1pdm)的NA蛋白基因的核苷酸序列或与NA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；以及
包括以下的NS蛋白嵌合基因的核苷酸序列或与NS嵌合基因的所述序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列：
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS1蛋白阅读框，其中所述阅读框是截短的并且编码由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白，
和来源于甲型流感病毒/新加坡/1/57样(H2N2)的Nep基因序列；
其中所述NS1蛋白截短阅读框被编码乙型流感病毒HA2亚基区之融合肽的核苷酸序列和编码甲型流感病毒核蛋白(NP)之保守B细胞表位的核苷酸序列的插入物延长。在一个具体实施方案中，NS蛋白嵌合基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：21中。
本发明还涉及用于在对象中治疗和/或预防感染性疾病的药物组合物，其包含有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
本发明还提供了用于预防流感的药物组合物，其包含有效量的根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
特别地，根据本发明的药物组合物包含6.5至10.5log EID50/ml的减毒甲型流感病毒和缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5wt.％的单价盐、 0至5wt.％的含咪唑化合物、0至5wt.％的碳水化合物组分、0至2wt.％的蛋白质组分、0至2wt.％的氨基酸组分和0至10wt.％的羟乙基化淀粉。
本发明的一个优选实施方案是药物组合物，其中缓冲溶液包含0.5至 1.5wt.％的单价盐、0.01至5wt.％的含咪唑化合物、1至5wt.％的碳水化合物组分、0.1至2wt.％的蛋白质组分、0.01至2wt.％的氨基酸组分和 1至10wt.％的羟乙基化淀粉；优选地所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是蔗糖、海藻糖或乳糖，所述蛋白质组分是人重组白蛋白、酪胨、乳白蛋白水解物或明胶，所述氨基酸组分是精氨酸、甘氨酸或谷氨酸钠，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N，N′-双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
本发明的另一个实施方案是用于治疗和/或预防感染性疾病的药物组合物，其中所述感染性疾病由选自以下的病原体引起：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属、利什曼虫属或布鲁氏菌病致病原。在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是哺乳动物或鸟类；特别地，所述对象是人对象。
本发明还涉及针对感染性疾病的疫苗，其包含有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
本发明还提供了针对流感的疫苗，其包含有效量的根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
特别地，根据本发明的疫苗包含6.5至10.5log EID50/ml的减毒流感病毒载体和缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5wt.％的单价盐、0至5 wt.％的含咪唑化合物、0至5wt.％的碳水化合物组分、0至2wt.％的蛋白质组分、0至2wt.％的氨基酸组分和0至10wt.％的羟乙基化淀粉。
本发明的另一个实施方案是疫苗，其中缓冲溶液包含0.5至1.5wt.％的单价盐、0.01至5wt.％的含咪唑化合物、1至5wt.％的碳水化合物组分、0.1至2wt.％的蛋白质组分、0.01至2wt.％的氨基酸组分和1至10 wt.％的羟乙基化淀粉。在一个优选实施方案中，在所述缓冲溶液中，所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是蔗糖、海藻糖或乳糖，所述蛋白质组分是人重组白蛋白、酪胨、乳白蛋白水解物或明胶，所述氨基酸组分是精氨酸、甘氨酸或谷氨酸钠，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N，N′- 双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
本发明的一个实施方案是针对感染性疾病的疫苗，其中所述感染性疾病由选自以下的病原体引起：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属、利什曼虫属或布鲁氏菌病致病原。
本发明还涉及根据本发明的减毒甲型流感病毒、根据本发明的减毒流感病毒载体或根据本发明的药物组合物用于在对象中治疗和/或预防感染性疾病，特别地用于治疗和/或预防由选自以下的病原体引起的疾病的用途：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属、利什曼虫属或布鲁氏菌病致病原。在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是哺乳动物或鸟类；特别地，所述对象是人对象。
本发明还涉及根据本发明的减毒流感病毒载体或药物组合物用于在对象中预防流感的用途。
本发明还涉及用于在有此需要的对象中治疗和/或预防感染性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒、根据本发明的减毒流感病毒载体或根据本发明的药物组合物，优选地，本发明还涉及治疗由选自以下的病原体引起的疾病的方法：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属、利什曼虫属或布鲁氏菌病致病原。在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是哺乳动物或鸟类；特别地，所述对象是人对象。
本发明还提供了用于在对象中治疗肿瘤疾病的药物组合物，其包含有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒载体，以及可药用运载体。
本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含8.5至10.5log EID50/ml根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒甲型流感病毒载体，以及缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5wt.％的单价盐、0 至5wt.％的含咪唑化合物、0至5wt.％的碳水化合物组分、0至2wt.％的蛋白质组分、0至2wt.％的氨基酸组分和0至10wt.％的羟乙基化淀粉，其中在本发明的一个优选实施方案中，缓冲溶液包含0.5至1.5wt.％的单价盐、0.01至5wt.％的含咪唑化合物、1至5wt.％的碳水化合物组分、 0.1至2wt.％的蛋白质组分、0.01至2wt.％的氨基酸组分和1至10wt.％的羟乙基化淀粉。
本发明的另一个实施方案是药物组合物，其中在缓冲溶液中，所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是淀粉，所述蛋白质组分是人白蛋白，所述氨基酸组分是精氨酸，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N，N′-双 [2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
本发明还涉及根据本发明的减毒病毒载体、根据本发明的减毒流感病毒载体或根据本发明的药物组合物用于在对象中治疗肿瘤疾病，特别是选自以下的疾病的用途：结直肠癌、贲门食管癌、胰腺癌、胆管细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤和黑素瘤。在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是人对象。
本发明还涉及用于在有此需要的对象中治疗肿瘤疾病的方法，其包括施用有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒、根据本发明的减毒流感病毒载体或根据本发明的药物组合物；优选地，本发明还涉及用于治疗选自以下的肿瘤疾病的方法：结直肠癌、贲门食管癌、胰腺癌、胆管细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤和黑素瘤。
在本发明的一个实施方案中，所述施用是瘤内施用、向在外科手术移除肿瘤后形成的腔施用或静脉内施用。
本发明的技术结果是产生在人和动物中具有高度安全性的包含嵌合 NS基因组片段的流感病毒及对应的流感病毒载体，特别是以在动物生物体中缺乏活跃病毒复制为特征、具有温度敏感性表型并且并可用于预防和 /或治疗感染性疾病的载体。本发明的另一个技术结果是产生包含嵌合NS 基因组片段的流感病毒，其在不存在佐剂的情况下在黏膜施用中具有通用流感疫苗的特性。此外，技术结果是产生的流感病毒和流感病毒载体在 10日龄鸡胚胎中的高生长潜力。另一个技术结果是产生具有通用流感疫苗的特性的流感病毒载体。技术结果还有产生具有溶瘤活性的流感病毒和流感病毒载体。另一个技术结果是由于不使用佐剂而降低生产流感疫苗所需的成本。
附图说明
图1示出了设计减毒流感病毒载体的原理。图1A示出了甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS基因组片段的方案。图1B示出了经遗传修饰的嵌合NS基因组片段的方案，其中NS1阅读框被截短并且可被外来序列插入物延长。编码Nep蛋白的序列被来源于另一种甲型流感病毒亚型的异源序列替代。
图2示出了野生型病毒和两个嵌合遗传构建体的实例的NS基因组片段的核苷酸序列。图2A示出了甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS片段。图2B示出了甲型流感病毒的嵌合NS片段，其中NS1蛋白的阅读框被截短，并且Nep序列(以粗体标出)来源于A/新加坡/1/57(H2N2)病毒。
图2C示出了甲型流感病毒的嵌合NS片段，其中NS1蛋白的阅读框被截短并且Nep序列(以粗体标记)来源于A/列宁格勒/134/47/57(H2N2) 病毒。
图3示出了在包含来自病毒A/列宁格勒/134/47/57(H2N2)病毒的异源Nep的NS1嵌合流感病毒载体的阅读框中翻译的蛋白质的氨基酸序列。
图4示出了表明带有异源Nep基因的病毒的致病性和ts表型的数据。图4A示出了在Vero细胞中在34℃的最佳温度下和在39℃温度的升高温度下病毒复制的数据。图4B示出了在感染后第2天小鼠肺中病毒复制的数据。
图5示出了表明在异源致病性流感病毒株的控制感染中用从NS1阅读框表达HA2亚基区的载体对小鼠进行单次免疫接种的保护效果的图。图5A示出了A/密西西比/85/1(H3N2)病毒的控制感染中的致死率，并且图5B示出了B/Lee/40病毒的控制感染中的致死率。
图6示出了重组流感病毒对通过向后爪的足中引入1×106个B16细胞在小鼠中诱导的黑素瘤的溶瘤效果的数据。在肿瘤植入后第5天通过瘤内施用病毒进行治疗。图6A示出了肿瘤植入并用溶瘤性载体进行四次处理后第20天的平均足尺寸；图6B示出了用溶瘤性载体处理四次后小鼠的存活。
图7示出了减毒流感病毒载体的结构。示出了病毒基因组的八个片段及其特征。
经显示，基因组片段PB2、PB1、PA、Np和M来源于A/PR/8/34(H1N1) 病毒；表面糖蛋白HA和NA基因来源于A/加利福尼亚/7/09样 (H1N1pdm)病毒；NS基因组片段具有编码以下两组蛋白质的嵌合结构： 1)截短至124个氨基酸残基的NS1蛋白，其被乙型流感病毒HA2蛋白的 N端区域的序列插入物并被甲型流感病毒NP蛋白的保守B细胞表位插入物延长；和2)具有来源于异源甲型流感病毒株(H2N2A/新加坡/1/57样血清亚型)的序列的Nep蛋白。
图8示出了疫苗载体的基因组片段的核苷酸序列：来自A/PR/8/34 (H1N1)病毒的PB2、PB1、PA、NP和M；来自A/加利福尼亚/7/09样 (H1N1pdm)病毒的HA和NA；和嵌合NS(NS1阅读框中的插入物以粗体出)。
图9示出了反映针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的不同变种对小鼠进行鼻内免疫接种之后疫苗载体的保护特性的结果。附图示出了与对照动物相比，在指定甲型流感病毒或乙型流感病毒血清型的控制感染后经疫苗接种小鼠的死亡率(以％计)。疫苗施用一次(1x)或两次(2x)。
图10示出了显示在白鼬的鼻内免疫接种后疫苗载体的保护特性的数据。图A示出了在经疫苗接种动物和对照动物中在A/圣彼得堡/224/2015 (H3N2)病毒的控制感染后温度波动的平均值的动力学。图B示出了在感染后第2、4和6天来自白鼬鼻洗液(nasalwashing)的对照病毒的接种结果。滴度表示为鼻洗液中的平均病毒浓度，表示为在MDCK细胞上滴定后为的50％致细胞病变剂量/ml。疫苗施用一次(1x)或两次(2x)。
具体实施方式
本发明涉及通过基因工程方法产生并且可用于治疗和/或预防感染性疾病、以及用于治疗肿瘤疾病的减毒甲型流感病毒。
特别地，本发明涉及诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒甲型流感病毒，其包含具有NS1截短阅读框和Nep基因的异源序列的嵌合NS片段，所述异源序列来源于不同于所述减毒甲型流感病毒的亚型的甲型流感病毒亚型。因此，编码截短NS1蛋白的序列的甲型流感病毒亚型不同于Nep蛋白序列所来源的病毒亚型。特别地，本发明的一个实施方案涉及减毒甲型流感病毒，其中所述NS1截短阅读框来源于 H1N1流感病毒亚型并且Nep基因的异源序列来源于H2至H18亚型人或动物流感病毒亚型。
所述截短阅读框编码包含80至130个氨基酸残基的NS1蛋白，更优选地所述截短阅读框编码包含124个氨基酸残基的NS1蛋白。
本发明特别地基于以下事实：发明人已经发现流感病毒载体(特别是载体NS1-124)的减毒不足(不具有温度敏感性和在小鼠肺中高复制水平) 的问题可通过修饰流感病毒之NS基因组片段的第二剪接蛋白质产物-Nep 蛋白(NS2)来解决。用来源于异源流感病毒株，例如来源于A/新加坡/1/57 (H2N2)或A/列宁格勒/134/47/57(H2N2)病毒的Nep序列替代甲型流感病毒(特别是甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1))的Nep基因组序列使得甲型流感病毒(特别是A/PR/8/34(H1N1)病毒)中出现温度敏感性表型和减毒。基于这一现象，构建了流感病毒的嵌合NS片段，其编码与来源于H2N2血清亚型的Nep蛋白阅读框组合的A/PR/8/34(H1N1)病毒的截短阅读框NS1-124。无论表面抗原H1N1、H5N1或H1N1pdm的来源，携带嵌合NS基因组片段的基于A/PR/8/34病毒的重配流感病毒均不能够在39℃下和在小鼠肺中提供活跃复制，但是在10日龄的鸡胚胎中仍能提供高滴度的复制。
本发明还涉及表达抗原或其片段的减毒流感病毒载体，所述抗原或其片段选自来自细菌、病毒和原生动物的抗原或其片段，其中所述载体是根据本发明的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白基因的截短阅读框被编码来自细菌、病毒和原生动物的抗原或其片段的至少一个抗原之序列的插入物延长。一般来说，可将减毒病毒插入编码来自对动物和人具有致病性或不具有致病性之任何细菌、病毒或原生动物的蛋白质或其片段的转基因中，特别地，所述蛋白质可选自：来自甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、流产布鲁氏菌、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、锥虫属、利什曼虫属、衣原体属、布鲁氏菌病致病原的蛋白质或其片段，或其组合。特别地，插入物的序列可编码流感病毒的HA蛋白片段、结核分枝杆菌ESAT-6、Ag85A、 Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4或10.4蛋白，或其片段。根据本发明的减毒载体的基因组序列还可包含有在编码NS1-124与ESAT6的序列之间编码自我切割2A肽的序列。
由插入物的序列编码的抗原或其片段可具有任何大小，其仅受基因组片段“接收”编码抗原或其片段的核苷酸序列的能力限制。优选地，抗原的大小为10至400个氨基酸。例如，所述插入物可编码代表选自以下序列的HA2亚基区的HA蛋白片段：甲型流感病毒的第1至185位氨基酸、乙型流感病毒的第1至186位氨基酸、甲型流感病毒的第23至185位氨基酸、或甲型流感病毒的第65至222位氨基酸。氨基酸的编号根据转基因来源于的流感病毒的HA2亚基区中氨基酸的位置给出。
根据本发明的减毒流感病毒载体的另一个具体实施方案是以下载体，其中插入物编码甲型或乙型流感病毒HA2亚基区的序列的第1至21位氨基酸和甲型流感病毒NP蛋白区的序列的第243至251位氨基酸。这些载体变体尽管其中具有短插入物，但已经令人惊讶地发现在单次免疫接种小鼠后显示出针对乙型流感病毒和甲型流感病毒的异源抗原性亚型的最佳保护有效性，即其表现出通用流感疫苗的特性。
发明人发现，插入在NS1阅读框中(例如在第124位氨基酸之后) 的外来抗原序列插入物不显著影响根据本发明产生的嵌合病毒的减毒表型。因此，根据活流感疫苗的需要，获得了具有所需的产生特征并且表现出减毒的表型和基因型标志物的不同流感病毒载体。无论插入物的性质，病毒都显示其对实验室动物无害，并且表现出所显现减毒表型标志物的相似性(存在ts表型)。通过NS1蛋白的截短阅读框的存在并且通过来源于另一种甲型流感病毒亚型之Nep基因的异源序列的不存在确定了其减毒遗传标志物的相似性。根据插入物，所得载体显示出通用流感疫苗、针对结核的疫苗等的特性。
特别地，本发明涉及通过遗传工程方法获得的甲型流感病毒疫苗载体，其可用于预防由包括甲型和乙型流感病毒在内的所有已知毒株引起的流感。特别地，本发明涉及诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒甲型流感病毒，其包含具有NS1蛋白的截短阅读框与来源于 H2N2甲型流感病毒亚型的Nep基因异源序列的嵌合NS片段。因此，具有编码截短NS1蛋白的序列的甲型流感病毒亚型不同于编码Nep蛋白的序列所来源的病毒亚型。特别地，在疫苗载体中，NS1截短阅读框来自 H1N1流感病毒亚型，并且Nep异源序列来自H2N2流感病毒亚型。
在一个实施方案中，本发明涉及诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒流感病毒载体，其包含：
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的PB2蛋白基因的核苷酸序列或与PB2蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如， 96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的PB1蛋白基因的核苷酸序列或与PB1蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如， 96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的PA蛋白基因的核苷酸序列或与PA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、 97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NP蛋白基因的核苷酸序列或与NP蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、 97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的M蛋白基因的核苷酸序列或与M蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、 97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/加利福尼亚/7/09样(H1N1pdm)的HA蛋白基因的核苷酸序列或与HA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；
来源于甲型流感病毒/加利福尼亚/7/09样(H1N1pdm)的NA蛋白基因的核苷酸序列或与NA蛋白基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列；以及
含有以下的NS蛋白嵌合基因的核苷酸序列或与NS嵌合基因的所述核苷酸序列具有至少95％或更高(例如，96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列：
来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS1蛋白阅读框，其中所述阅读框是截短的并且编码由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白，
以及来源于甲型流感病毒/新加坡/1/57样(H2N2)的Nep基因序列；
其中所述NS1蛋白的截短阅读框被编码乙型流感病毒HA2亚基区之融合肽的核苷酸序列和编码甲型流感病毒核蛋白(NP)之保守B细胞表位的核苷酸序列的插入物延长。
该截短阅读框编码具有124个氨基酸残基的NS1蛋白，其被两个甘氨酸、乙型流感病毒的第二血凝素亚基HA2的N端区域的插入物(23个氨基酸残基)和甲型流感病毒的保守B细胞表位的序列的插入物(7个氨基酸残基)延长。
该载体的表面糖蛋白基因来源于A/加利福尼亚/7/09(H1N1pdm)流感病毒。内部蛋白PB2、PB1、RA、NP和M的基因来源于甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)。因此，根据本发明的流感病毒载体是由不同流感病毒株的基因组序列组成的复合遗传构建体，即：1)编码PB2、PB1、PA， NP和M的基因来自A/PR/8/34(H1N1)病毒(PB2(Genbank登录号：AB671295)、PB1(Genbank登录号：CY033583)、PA(Genbank登录号：AF389117)、NP(Genbank登录号：AF389119)、M(Genbank登录号：AF389121))；2)编码HA和NA的基因来自A/加利福尼亚/7/09样 H1N1pdm病毒(HA(GenBank：KM408964.1)和(NA GenBank： KM408965.1))；3)NS基因是嵌合的，其中A/PR/8/34(H1N1)病毒的 NS蛋白阅读框被截短至124个氨基酸残基并被编码乙型流感病毒HA2 亚基区之融合肽的序列插入物和编码甲型流感病毒核蛋白(NP)之保守 B细胞表位的序列插入物延长，并且NEP蛋白阅读框来自H2N2流感病毒亚型。
本发明特别地基于以下事实：发明人出乎意料地发现，在没有佐剂下用具有所述结构的载体对小鼠和白鼬进行鼻内免疫接种为动物提供了针对不仅甲型流感病毒(H1N1)而且还有甲型流感病毒(H3N2)和乙型流感病毒的控制感染的保护。因此，该疫苗载体具有通用流感疫苗的特性。
在本发明上下文中的术语“通用疫苗”意指能够针对所有已知和未知的流感病毒变种提供保护的疫苗。通常的“季节性疫苗”仅提供针对与疫苗组合物中包含的病毒类似的病毒的保护。
术语“黏膜疫苗”是指疫苗可被施用到呼吸道和消化道的腔中并且施用于口和鼻的粘膜，即鼻内施用、经口施用或舌下施用。
基于携带嵌合NS基因组片段的A/PR/8/34病毒的流感病毒载体不能够在39℃下和在小鼠肺中提供活跃复制(减毒表型)，但在10日龄鸡胚胎中仍提供高滴度的复制。
本发明还涉及具有溶瘤活性的减毒流感病毒载体，其包含根据本发明的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白基因的截短阅读框被编码致病性细菌、病毒和原生动物的抗原或其片段的至少一个转基因的序列的插入物延长。所述抗原可来源于对动物具有致病性的任何细菌、病毒或原生动物，特别地所述抗原可选自以下的抗原：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、锥虫属、利什曼虫属、衣原体属，或其组合。特别地，插入的转基因可编码结核分枝杆菌ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、 HspX、Mtb8.4或10.4蛋白，或其片段；此外，NS1蛋白基因的截短阅读框可被编码结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的序列的插入物延长。
由插入物的序列编码的抗原或其片段可具有任何大小，其仅受NS基因组片段“接收”编码抗原或其片段的核苷酸序列的能力限制。优选地，抗原的大小为10至400个氨基酸。
发明人出乎意料地发现，携带嵌合NS基因组片段的减毒流感病毒载体由于并入异源Nep基因而具有增强的溶瘤活性，条件是由NS1蛋白阅读框表达致病性抗原，特别是细菌抗原。例如，编码结核分枝杆菌蛋白 Esat6的病毒载体比具有截短NS1蛋白但没有插入物的已知重组病毒具有更高的活性。不受任何理论的束缚，可认为哺乳动物中的强抗结核免疫力有助于被表达结核蛋白的病毒感染的肿瘤的免疫攻击。
本发明还涉及药物组合物，其含有有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。根据本发明的药物组合物可用于在对象中治疗和/或预防感染性疾病，特别是由选自以下的病原体引起的感染性疾病：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属或利什曼虫属。
此外，根据本发明的药物组合物可用于治疗不同的肿瘤疾病；特别地，肿瘤疾病可选自由结直肠癌、贲门食管癌、胰腺癌、胆管细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤和黑素瘤。
根据本发明的药物组合物可被配制为疫苗，其包含有效量的根据本发明的减毒甲型流感病毒或根据本发明的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
本文所用的术语“对象”或“动物”意指易发生由致病性细菌、病毒或原生动物引起的感染的脊椎动物(包括鸟类(水禽、鸡等))和多种哺乳动物物种的代表，例如狗、猫、狼、白鼬、啮齿动物(大鼠、小鼠等)、马、牛、绵羊、山羊、猪和灵长类。在本发明的一个实施方案中，所述对象是人对象。
术语“有效量”是指当以单剂量或作为治疗周期的一部分施用于对象时对治疗和/或预防有效的治疗结果的病毒或载体的量。该量可根据患者的健康状态和身体状况、其年龄、所治疗对象的分类学组群、配方、主治医生对医疗情况的评估以及其他重要因素而变化。应该认为，该量可在相当宽的范围内变化，技术人员可通过标准方法来对其进行确定。药物组合物可包含6至10.5log EID50/ml，更特别地6.5至10.5log EID50/ml，特别地6至9.5log EID50/ml，更特别地6.5至8.5log EID50/ml的根据本发明的嵌合甲型流感病毒或根据本发明的流感病毒载体。
本文使用的术语“可药用运载体”意指本领域中使用的任何载体，特别是水、生理盐水、缓冲溶液等。在一个实施方案中，可药用运载体是缓冲溶液，其包含0至1.5wt.％的单价盐、0至5wt.％的含咪唑化合物、0 至5wt.％的碳水化合物组分、0至2wt.％的蛋白质组分、0至2wt.％的氨基酸组分和0至10wt.％的羟乙基化淀粉；优选地所述缓冲溶液包含0.5至1.5wt.％的单价盐、0.01至5wt.％的咪唑化合物、1至5wt.％的碳水化合物组分、0.1至2wt.％的蛋白质组分、0.01至2wt.％的氨基酸组分和 1至10wt.％的羟乙基化淀粉；最优选地，所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是蔗糖、海藻糖或乳糖，所述蛋白质组分是人重组白蛋白、酪胨、乳白蛋白水解物或明胶，所述氨基酸组分是精氨酸、甘氨酸或谷氨酸钠。
所述含咪唑化合物是L-肌肽或N，N′-双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺，其具有下式：
Figure BDA0001500359090000261
人白蛋白可以是重组白蛋白或供体白蛋白。
本发明还涉及根据本发明的减毒甲型流感病毒、减毒流感病毒载体或药物组合物用于在对象中治疗和/或预防感染性疾病，特别是由选自以下的病原体引起的感染性疾病的用途：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属或利什曼虫属。
本发明还涉及根据本发明的减毒流感病毒载体或药物组合物用于预防流感的用途。
另外，本发明还涉及治疗方法，其包括向对象施用根据本发明的减毒甲型流感病毒、减毒流感病毒载体或药物组合物。所述方法旨在用于治疗和/或预防由病原体病毒、细菌或原生动物引起的感染性疾病，特别是由选自以下的病原体引起的感染性疾病：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属或利什曼虫属。另外，所述方法旨在用于在对象中治疗肿瘤疾病，特别地，肿瘤疾病可选自结直肠癌、贲门食管癌、胰腺癌、胆管细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤和黑素瘤。
可通过任何标准方法施用于对象，特别是肌内、静脉内、经口、舌下、吸入或鼻内。流感病毒载体或药物组合物可向对象施用一次、两次或更多次；优选单次施用。
另外，在治疗癌症的情况下，施用可以是瘤内施用、向在外科手术移除肿瘤后形成的腔施用或静脉内施用。
在下文，通过本发明的一些实施方案来对本发明进行举例说明，这些实施方案并不意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1
具有经修饰NS基因组片段的流感病毒载体的产生
在几个步骤中组装重组病毒。在第一步，通过使用来自遗传库的数据合成产生甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的所有八个基因组片段的互补 DNA(cDNA)拷贝：pHbank-PR8-HA(Genbank登录号：EF467821.1)、 pHW-PR8-NA(Genbank登录号：AF389120.1)、pHW-PR8-PB2(Genbank 登录号：AB671295)、pHW-PR8-PB1(Genbank登录号：CY033583)、 pHW-PR8-PA(Genbank登录号：AF389117)、pHW-PR8-NP(Genbank 登录号：AF389119)、pHW-PR8-M(Genbank登录号：AF389121) pHW-PR8-NS(Genbank登录号：J02150.1))。在第二步，将合成的序列克隆到基于双向质粒pHW2000的载体中(Hoffmann E，Neumann G， Kawaoka Y，HobomG，Webster RG，A DNA from eight plasmids，Proc Natl Acad Sci USA.2000；97(11)：6108-13)。由于Pol I和Pol II启动子的存在，该质粒载体在转染哺乳动物细胞之后提供病毒和对应信使RNA的同时细胞内转录。
产生编码PB1、PB2、PA、HA、NA、NP和M而无修饰的7个质粒克隆，以及具有修饰的NS基因组片段的变体组，其原理在图1中给出。
图1A示出了甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS基因组片段的方案。负极性病毒RNA(vRNA)的全长基因组片段的长度为230个核苷酸 (nt)。通过流感病毒聚合酶复合物转录NS片段导致形成2种类型的信使RNA：1.直接转录物，其是编码具有230个氨基酸残基(aa)的NS1 蛋白的NS1蛋白mRNA；以及Nep蛋白的剪接mRNA，其编码具有121 个aa的蛋白质。图1B示出了经遗传修饰的嵌合NS基因组片段的方案，其中NS1蛋白的阅读框包含多至398nt，并且可以被以三联终止密码子封端的外来序列插入物延长。编码Nep蛋白的序列被替换为来源于另一种甲型流感病毒亚型的异源序列。作为修饰的结果，嵌合NS基因组片段的长度取决于插入NS1阅读框中的外来序列插入物的长度。
使用包括编码区以及5’和3’端非编码区的甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)的核苷酸序列(GenBank数据库中的序列号J02150)作为用于开发NS基因组区段的嵌合构建体的基础。根据目的，构建了NS基因组片段的嵌合构建体的多种变体，其具有以下共同特征：1)用来源于H2N2 流感病毒亚型(毒株：A/新加坡/1/57和A/列宁格勒/134/47/57)的序列替代编码A/PR/8/34(H1N1)病毒的Nep蛋白的序列(图2B和2C)；2) 从NS1编码区缺失由30个核苷酸(第499至428位nt)组成的序列，直至Nep剪接位点；3)通过在第399位核苷酸后插入三联连续终止密码子 (TGATAATAA)的盒将NS1蛋白的阅读框限制至124个氨基酸残基(图 2A和图2B)；4)插入到NS1阅读框中第398位核苷酸之后，恰好终止密码子盒之前的外来基因序列，该外来基因序列存在或不存在。
图2A示出了甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)的NS片段的SEQ ID NO：1的序列，其中为产生B和C构建体而缺失的由30nt组成的序列被突出显示并加有下划线。被来自另一种甲型流感病毒亚型的异源类似物替代的Nep基因序列以粗体标出。图2B示出了甲型流感病毒的重组NS片段的SEQ ID NO：2的序列，其中NS1蛋白的阅读框通过由三个连续终止密码子(加有下划线)组成的插入物而被截短至398nt，并且Nep序列(以粗体标出)借用自A/新加坡/1/57(H2N2)病毒。图2C示出了甲型流感病毒的重组NS片段的SEQ ID NO：3的序列，其中NS1蛋白的阅读框通过由三个连续终止密码子(加有下划线)组成的插入物而被截短至398nt，并且Nep序列(以粗体标出)借用自A/列宁格勒/134/47/57(H2N2) 病毒。
Figure BDA0001500359090000281
Figure BDA0001500359090000291
Figure BDA0001500359090000301
因此，当由流感病毒聚合酶复合物转录时，构建的嵌合NS基因组片段形成两种类型的信使RNA：1)以NS1蛋白的形式翻译的NS1 mRNA，所述NS1蛋白被截短至124个氨基酸残基并且被终止密码子限制或被不同来源的序列转基因插入物延长，其翻译受终止密码子盒限制；2)来源于另一种抗原亚型的甲型流感病毒的异源Nep mRNA。具有插入物的重组 NS1蛋白的翻译变体示于图3和下表1中。
表1
具有来自A/列宁格勒/134/47/57(H2N2)病毒的异源Nep的重组病毒在 NS1阅读框中翻译的蛋白质的氨基酸序列
Figure BDA0001500359090000302
Figure BDA0001500359090000311
Figure BDA0001500359090000321
Figure BDA0001500359090000331
如下组装重组病毒：通过质粒DNA电穿孔方法(Cell Line
Figure BDA0001500359090000332
Kit V(Lonza))根据使用说明书用编码流感病毒之基因组未修饰片段的七种质粒并用嵌合NS基因组片段的一种变体转染VERO 细胞。在转染之后，将细胞在添加1μg/ml胰蛋白酶下，在34℃下的Optipro 培养基(Invitrogen)中孵育96小时以确保血凝素前体被翻译后切割为HA1和HA2亚基。使用来自Vero细胞的病毒收获物感染10日龄鸡胚胎 (SPF)。将胚胎在34℃下孵育48小时，在此之后将在血细胞凝集反应中具有阳性滴度的尿囊液用于在鸡胚中进行第二次传代。将第二代的尿囊液等分并储存在-80℃下。使用第二代材料通过产生RT-PCR产物并对其进行测序来控制嵌合NS片段的遗传结构和转基因的存在。另外，将第二代材料用于确定重组病毒株和载体的表型标志物，以及用于确定转基因在鸡胚胎中传代5次的遗传稳定性。
实施例2
异源Nep携带重组病毒的温度敏感性表型和减毒的确定
通过在96孔板中在34℃的最佳温度和39℃的升高温度下病毒对Vero细胞的感染活性的比较滴定来确定病毒的温度敏感性。考虑到多孔板中致细胞病变效应的发生，在孵育96小时后通过Reed-Muench方法计数病毒滴度(Reed，LJ，Muench，H.(1938).″The Asimple method of estimating fifty percent endpoints.″The American Journal ofHygiene 27： 493-497.)。图4A示出了在这些温度下的病毒滴度，其以50％组织致细胞病变剂量(Log TCD50/ml)表示。与34℃的最佳温度相比，携带来自A/ 新加坡/1/57(H2N2)或A/列宁格勒/134/47/57(H2N2)毒株的异源Nep 的两种病毒令人惊讶地显示在39℃下感染滴度显著降低超过4log。对照毒株(野生型A/PR/8/34(H1N1)病毒)以及具有截短NS1蛋白和同源 Nep蛋白的重组NS124/Nep PR8病毒未显示出温度敏感性，在高温下有效地复制。因此，Nep的替代使得在病毒中出现ts表型。
此外，在轻度麻醉下用所述病毒以6log/小鼠的剂量鼻内感染小鼠中，与野生型病毒或具有同源Nep的NS124/Nep PR8病毒相比，异源Nep基因的载体的病毒在肺组织中的复制能力降低(p＜0.002)(图4B)。通过在 Vero细胞中滴定澄清的肺匀浆来在感染动物后2天评估肺中的病毒滴度。肺滴度以log TCD50/g肺组织表示。因此，将嵌合NS基因组片段引入甲型流感病毒/PR/8/34(H1N1)株中使得病毒减毒，表现为其在动物的下呼吸道中复殖能力降低。
实施例3
携带嵌合NS基因组片段并且在NS1蛋白的阅读框中携带不同插入物的载体的ts表 型和减毒的确定
产生编码不同性质的插入物的一大组载体，以确定向NS1蛋白的阅读框中插入外来序列对包含嵌合Nep基因之病毒的ts表型的影响。研究了具有图3所示的插入物的病毒。如下研究ts表型：在10日龄鸡胚胎 (ChE)中在34℃和39℃的温度下滴定病毒感染活性，确定在孵育后48 小时收集的尿囊液的血细胞凝集活性。通过Reed-Muench方法计数滴度，并以50％胚胎感染剂量(log EID50/ml)的log表示。从表2所示的数据可以看出，与野生型A/PR/8/34(H1N1)病毒相反，所有载体在高温下均具有显著降低的复制能力，并且ts表型标志物对应于不具有插入物但携带异源Nep的原型嵌合毒株。
表2
Figure BDA0001500359090000351
标示：＊在插入物之前的天然NS1蛋白序列的长度(以氨基酸残基数计)；＊＊Nep基因的来源来自以下毒株：A/PR/8/34(H1N1)或A/新加坡/1/57(H2N2)或A/列宁格勒/134/47/57 (H2N2)；＊＊＊如果在34℃和39℃下的病毒生长差异超过2log，则认为ts表型是阳性的。
为了确定插入物对载体毒株对动物的减毒(att)的影响，在轻度麻醉下用经图3所示病毒或载体感染的鸡胚胎的含病毒尿囊液鼻内攻击小鼠。尿囊液初步以其中所包含感染性病毒滴度的水平来表征。滴度以 logEID50/ml表示。向小鼠注射0.05ml的每种病毒样品。每组小鼠均包括8只动物。评估病毒的致死活性12天。发现，与使用滴度为3.2 logEID50/ml的材料时产生50％致死效应的野生型A/PR/8/34(H1N1)病毒不同，载体均未在超过7.5log的感染剂量下在小鼠中显示出50％致死活性。因此，携带嵌合NS基因组片段的所有载体无论插入物如何都对小鼠高度减毒(表3)。
表3
小鼠-病毒的致死剂量
Figure BDA0001500359090000361
＊减毒表型通过在超过7.0log EID50/小鼠的保护剂量下不存在致死活性来确定。
实施例4
小鼠的控制感染中针对异源甲型和乙型流感病毒株的保护性应答
通过使用携带具有来自A/列宁格勒/134/47/57(H2N2)病毒之Nep 序列的嵌合NS基因组片段具有来自A/PR/8/34(H1N1)病毒的表面抗原的病毒来确定针对流感病毒的异源抗原性变种的保护活性。使用在NS1 阅读框中编码血凝素HA2亚基区的下列重组病毒：1)表达全长甲型流感病毒HA2胞外域的185个氨基酸残基的NS124-HA2(A)-185载体(图3， SEQID NO：5)；2)表达全长乙型流感病毒HA2胞外域的186个氨基酸残基的NS124-HA2(A)-185载体(图3，SEQ ID NO：8)；3)表达由HA2 之N端21个氨基酸残基与来自甲型流感病毒NP蛋白之保守B细胞表位的序列之组合所组成的序列(融合结构域)的NS124-Fus(A)-NP载体(图 3，SEQ ID NO：9)；以及4)在NS基因组片段之核苷酸序列的第399位具有终止密码子盒从而使NS1蛋白的翻译限于124个氨基酸残基的 NS124/Nep-Len病毒(图3，SEQ ID NO：4)。对照组包括用未经遗传修饰的野生型A/PR/8/34(H1N1)病毒感染的小鼠或接受不含活性成分的磷酸盐缓冲溶液的小鼠。在轻度麻醉下，用6.5log/小鼠的单病毒剂量鼻内免疫接种小鼠。在28天后，分别用小鼠致病性异源流感病毒株：A/密西西比/85/1(H3N2)或B/Lee/40以对应于3至5LD50的剂量对动物进行控制感染。
从图5A中可以看出，用病毒(H3N2)对未免疫小鼠进行控制感染在80％的情况下导致其死亡。同时，经病毒制剂免疫接种的小鼠被充分保护免于由异源甲型流感病毒(H3N2)毒株感染引起的死亡。用野生型病毒进行免疫接种也产生统计学上显著水平的针对异源毒株感染的保护。当使用B/Lee/40流感病毒进行控制感染时，用野生型A/PR/8/34(H1N1) 病毒对小鼠进行免疫接种不能保护动物免于死亡，并且在免疫接种中接受磷酸盐缓冲溶液的小鼠也如此(图5B)。令人惊讶地发现，在NS1蛋白的阅读框中携带插入物的重组病毒具有针对乙型流感病毒的保护性。 NS124-Fus(A)-NP载体显示出最佳的保护水平。因此，在小鼠的单次鼻内免疫接种中，携带嵌合NS基因组片段的载体毒株显示出对甲型和乙型流感病毒二者的异源抗原亚型都有效的通用流感疫苗的特性。
实施例5
产生具有编码乙型流感病毒HA2区和H1N1pdm病毒表面糖蛋白的序列的经修饰NS 基因组片段的流感病毒载体
在几个步骤中组装重组病毒。在第一步，产生甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)的5个基因组片段(PB2、PB1、PA、NP、M)的互补DNA(cDNA) 拷贝(PB2(Genbank登录号：AB671295)、PB1(Genbank登录号： CY033583)、PA(Genbank登录号：AF389117)、NP(Genbank登录号： AF389119)、M(Genbank登录号：AF389121))，并产生A/加利福尼亚 /7/09样病毒的2个基因组片段(HA、NA)(HA(GenBank：KM408964.1) 和(NA GenBank：KM408965.1))，合成由以下序列构成的嵌合NS基因组片段：与H1N1病毒(NS1基因)、H2N2病毒(Nep基因)相关的序列，以及来自乙型流感病毒HA2区和甲型流感病毒NP区的两个肽的序列。
在第二步，将合成的序列克隆到基于双向质粒pHW2000的载体中 (Hoffmann E，Neumann G，Kawaoka Y，Hobom G，Webster RG，A DNA from eight plasmids，Proc NatlAcad Sci USA.2000；97(11)：6108-13.)。由于Pol I和Pol II启动子的存在，该质粒载体在转染哺乳动物细胞之后提供病毒和对应信使RNA的同时细胞内转录。图7示出了流感病毒的遗传图。图8示出了疫苗载体的全部八个基因组片段的核苷酸序列。
基因组PB2的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000391
Figure BDA0001500359090000401
Figure BDA0001500359090000411
基因组PB1的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000421
Figure BDA0001500359090000431
Figure BDA0001500359090000441
基因组PA的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000442
Figure BDA0001500359090000451
Figure BDA0001500359090000461
基因组NP的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000462
Figure BDA0001500359090000471
基因组M的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000481
基因组HA的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000491
Figure BDA0001500359090000501
基因组NA的核苷酸序列
Figure BDA0001500359090000511
Figure BDA0001500359090000521
嵌合NS片段基因的核苷酸序列(插入物以粗体示出)
Figure BDA0001500359090000522
如下组装重组病毒：通过质粒DNA电穿孔方法(Cell Line
Figure BDA0001500359090000523
Kit V(Lonza))根据使用说明书用编码流感病毒之基因组未修饰片段的八种质粒并用嵌合NS基因组片段转染VERO细胞。在转染之后，将细胞在添加1μg/ml胰蛋白酶下，在34℃下的Optipro培养基 (Invitrogen)中孵育96小时以确保血凝素前体被翻译后切割为HA1和 HA2亚基。使用来自Vero细胞的病毒收获物感染10日龄鸡胚胎(SPF)。将胚胎在34℃下孵育48小时，在此之后将在血细胞凝集反应中具有阳性滴度的尿囊液用于在鸡胚中进行第二次传代。将7次传代的尿囊液用切向流过滤纯化并冻干储存。在用等体积的蒸馏水溶解冻干物之后对动物进行免疫接种。
实施例6
小鼠的控制感染中针对异源甲型和乙型流感病毒株的保护性应答
在轻度麻醉下用流感病毒载体以6.8log EID50/小鼠的剂量以50μl 的体积对小鼠进行鼻内免疫接种，以3周的时间段进行一次或两次。在最后一次免疫接种后21天，分别用以下小鼠致病性异源流感毒株：同源A/ 加利福尼亚/7/09(H1N1pdm)或异源A/爱知/2/68(H3N2)、A/密西西比 /85/1(H3N2)或B/Lee/40流感病毒，以对应于3至5LD50的剂量对动物进行控制感染。
从图9A中可以看出，用H1N1pdm病毒对未免疫小鼠进行控制感染在90％的情况下导致其死亡。然而，用病毒制剂免疫接种一次或两次的小鼠被可靠地保护免于死亡。
从图9B中可以看出，用A/爱知/2/68(H3N2)病毒对未免疫小鼠进行控制感染在100％的情况下导致其死亡。然而，用病毒制剂免疫接种一次或两次的小鼠被可靠地保护免于死亡。
从图9C中可以看出，用A/密西西比/85/1(H3N2)病毒对未免疫小鼠进行控制感染在100％的情况下导致其死亡。然而，用病毒制剂免疫接种两次的小鼠获得100％保护。
从图9D中可以看出，用B/Lee/40流感病毒对未免疫小鼠进行控制感染在100％的情况下导致其死亡。然而，用病毒制剂免疫接种两次的小鼠获得显著不同于对照的60％保护。
因此，携带嵌合NS基因组片段的流感病毒载体显示出对甲型流感病毒和乙型流感病毒二者的异源抗原亚型都有效的通用流感疫苗的特性。
实施例7
白鼬的控制感染中针对异源甲型流感病毒(H3N2)毒株的保护性应答
白鼬是WHO推荐用于研究流感疫苗和药物的有效性的最佳模型。通过用实施例5中制备的流感病毒载体以7.5log EID50/白鼬的剂量如下免疫接种白鼬(每组9只动物)来确定针对流感病毒的异源抗原性变种的保护活性：在轻度麻醉下以500μl的体积以3周的时间段鼻内施用一次或两次。在最后一次免疫接种后21天，用白鼬致病性A/圣彼得堡/224/2015(H3N2)病毒对动物进行控制感染。如图10A所示，未免疫动物的控制感染导致在感染后第2天体温升高，而经疫苗接种的动物没有温度响应。
使用在第2、4和6天在动物中采集的鼻洗液来研究疫苗接种对于对照病毒在白鼬呼吸道中复制的作用，以通过在MDCK细胞培养物中50％致细胞病变剂量的滴定来确定感染性病毒的浓度。从图10B中可以看出，对未免疫白鼬的控制感染导致病毒的活跃复制，直到第6天滴度仍没有显著降低。在白鼬的单次免疫接种中，在攻击后第4和6天观察到病毒滴度显著降低。在双重免疫接种之后，在动物感染后第2天，已经记录到病毒滴度的显著的超过100倍的降低。
因此，即使用流感病毒载体对白鼬进行单次疫苗接种也导致获得使动物免受温度反应形式的临床表现的保护，并且有利于从呼吸道中加速清除对照异源毒株。重复免疫接种加速病毒消除过程。
实施例8
编码分枝杆菌蛋白Esat6的流感病毒载体的溶瘤效果
如下确定携带具有异源Nep基因之嵌合NS基因组片段的减毒流感病毒载体的溶瘤潜能：用病毒处理通过向右后足的皮下间隙施用30μl体积的106B16细胞诱导的小鼠黑素瘤。每组包含10只动物。在施用肿瘤细胞后第5天通过将30μl的病毒制剂或磷酸盐缓冲溶液直接注射到肿瘤生长区中来进行治疗。每3天进行注射，进行4次，在此之后评估受影响足的体积增加率和动物的存活率，持续85天。出于伦理原因，对肿瘤达到 2000mm3的动物实施安乐死，并认为死亡。
用在这样的设计中表达分枝杆菌抗原Esat6的载体处理黑素瘤，所述设计使得对Esat-6蛋白从NS124-2A-Esat6流感病毒之截短NS1蛋白的C 端区域(图3，SEQ ID NO：12)进行2A介导的翻译后切割的设计中。对照治疗剂是不包含分枝杆菌蛋白质的插入物的NS124/Nep-Len病毒。
图6A示出了在施用肿瘤细胞后第19天测量足体积的结果。令人惊讶地发现，在接受表达Esat6蛋白之载体的治疗的小鼠中平均足体积最小。发现该结果与小鼠在由85天组成的长观察期内的存活相关(图6B)。发现来自NS124-2A-Esat6组的10只动物的3只处于肿瘤生长的缓解中，而其他组中的动物至60天死亡。因此，所获得的数据证明了编码细菌抗原的溶瘤性载体的优点。
实施例10
用于鼻内免疫接种的基于流感病毒的疫苗的配制
疫苗包含6.5至8.5log 50％胚胎感染剂量(EID50)/ml的量的实施例1或实施例5中制备的流感病毒载体，以及缓冲稳定化溶液，其包含 0.9wt.％氯化物溶液、0.5wt.％L-肌肽、2.5wt.％蔗糖、1wt.％重组白蛋白、1wt.％L-精氨酸和3wt.％羟乙基淀粉130/0.4(分子量为130kDa，摩尔取代度0.4)。
实施例11
用于鼻内免疫接种的基于流感病毒的疫苗的配制
疫苗包含6.5至8.5log 50％胚胎感染剂量(EID50)/ml的量的实施例1或实施例5中制备的流感病毒载体，以及缓冲稳定化溶液，其包含 0.9wt.％氯化物溶液、0.1wt.％L-肌肽、2.5wt.％蔗糖、1wt.％重组白蛋白、1wt.％L-精氨酸和3wt.％羟乙基淀粉130/0.4(分子量为130kDa，摩尔取代度0.4)。
实施例12
用于溶瘤目的的基于流感病毒的疫苗的配制
疫苗包含6.5至10.5log 50％胚胎感染剂量(EID50)/ml的量的实施例1或实施例5中制备的流感病毒载体，以及缓冲稳定化溶液，其包含 1.35wt.％氯化物溶液、0.5wt.％L-肌肽、1wt.％重组白蛋白、1wt.％L- 精氨酸和3wt.％羟乙基淀粉130/0.4(分子量为130kDa，摩尔取代度0.4)。
序列表
<110> 生物技术制药有限责任公司
<120> 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体
<130> 2420-301559RU/061
<140>
<141>
<150> 2015147703
<151> 06.11.2015
<150> 2016111907
<151> 30.03.2016
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 890
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒（Influenza A virus）
<220>
<223> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)的NS片段
<400> 1
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180
tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taaaaacatc atactgaaag 420
cgaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attgctaagg gctttcaccg 480
aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc tcttccagga catactgctg 540
aggatgtcaa aaatgcagtt ggagtcctca tcggaggact tgaatggaat gataacacag 600
ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660
ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720
gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacaaactga aggtaacaga gaatagtttt 780
gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840
actttctcat ttcagcttat ttaataataa aaaacaccct tgtttctact 890
<210> 2
<211> 869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有NS1蛋白的截短阅读框和来源于A/新加坡/1/57 (H2N2)病毒的Nep序列的重组NS片段
<400> 2
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180
tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgtg ataataaagt gtgatttttg 420
accggctgga gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg 480
aaatttcacc attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg 540
gggtcctcat cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac 600
agagattcgc ttggtgaaac agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga 660
aacggaaaat ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa 720
gaagtgagac acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatgcaa 780
gccttacagc tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt 840
taataataaa aaacaccctt gtttctact 869
<210> 3
<211> 869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有NS1蛋白的截短阅读框和来源于A/列宁格勒/134/47/57 (H2N2)病毒的Nep序列的甲型流感病毒的重组NS片段
<400> 3
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180
tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgtg ataataaagt gtgatttttg 420
accggctgga gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg 480
aaatttcacc attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg 540
gggtcctcat cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac 600
agagattcgc ttggagaagc agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga 660
aacggaaaat ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa 720
gaagtgagac acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatacaa 780
gccttacagc tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt 840
taataataaa aaacaccctt gtttctact 869
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 未插入外来序列的截短NS1蛋白
<400> 4
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met
<210> 5
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被甲型流感病毒HA2亚基片段的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 5
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
125 130 135
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
140 145 150
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys
155 160 165
Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr
170 175 180
Val Ile Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu
185 190 195
Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val
200 205 210
Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
215 220 225
Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn
230 235 240
Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn
245 250 255
Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
260 265 270
Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr
275 280 285
Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp
290 295 300
Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln
305 310
<210> 6
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被甲型流感病毒HA2亚基片段的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 6
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
125 130 135
Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
140 145 150
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu
155 160 165
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
170 175 180
Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile
185 190 195
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys
200 205 210
Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser
215 220 225
Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu
230 235 240
Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val
245 250 255
Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
260 265 270
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
275 280
<210> 7
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被甲型流感病毒HA2亚基片段的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 7
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly
125 130 135
Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn
140 145 150
Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu Lys Met Asn Ile
155 160 165
Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys Arg
170 175 180
Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
185 190 195
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
200 205 210
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
215 220 225
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
230 235 240
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
245 250 255
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser
260 265 270
Lys Leu Asn Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met
275 280 285
Gly Ile Tyr Gln
<210> 8
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被乙型流感病毒HA2亚基片段的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 8
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
125 130 135
Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr
140 145 150
Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys
155 160 165
Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser
170 175 180
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala
185 190 195
Met Asn Gly Leu His Asp Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val
200 205 210
Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala
215 220 225
Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His
230 235 240
Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser
245 250 255
Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys
260 265 270
Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala
275 280 285
Gly Asp Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp
290
<210> 9
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被甲型流感病毒HA2亚基片段的序列和甲型流感病毒NP蛋白之B细胞表位的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 9
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
125 130 135
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Gly Gly Arg
140 145 150
Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala
155
<210> 10
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被甲型流感病毒HA2亚基片段的序列和甲型流感病毒NP蛋白之B细胞表位的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 10
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
125 130 135
Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp Gly Gly Arg
140 145 150
Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala
155
<210> 11
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）蛋白质Esat6蛋白的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 11
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala
125 130 135
Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser
140 145 150
Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu
155 160 165
Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val
170 175 180
Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu
185 190 195
Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala
200 205 210
Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
215 220
<210> 12
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被自我切割2A肽的序列和结核分枝杆菌蛋白质Esat6蛋白的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 12
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Gly Gly Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
125 130 135
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn
140 145 150
Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val
155 160 165
Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr
170 175 180
Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln
185 190 195
Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn
200 205 210
Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala
215 220 225
Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
230 235
<210> 13
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被I和II型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）之T细胞表位的序列延长的截短NS1蛋白
<400> 13
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu
1 5 10 15
Trp His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala
20 25 30
Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
50 55 60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu
65 70 75
Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu
80 85 90
Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg Glu Trp Ser Met Leu
95 100 105
Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
110 115 120
Gln Ala Ile Met Ala Ala Ala Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe
125 130 135
Thr Ala Ala Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ala Ala
140 145 150
Ala Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Ala Ala Ala Arg Met
155 160 165
Leu Gly Asp Val Met Ala Val
170
<210> 14
<211> 2341
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)
<220>
<223> PB2基因组片段的核苷酸序列
<400> 14
agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg 60
tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc 120
aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg 180
gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat 240
gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta 300
tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat 360
ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420
cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat 480
gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540
gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600
gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660
gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720
ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780
aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840
gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900
attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960
aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag 1020
agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1080
ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca 1140
gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa 1200
cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata 1260
aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg 1320
catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380
gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc 1440
gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500
gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta 1560
ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac 1620
tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa 1680
tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740
tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800
tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860
accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920
cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980
aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040
gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100
aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2160
gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220
gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280
aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 15
<211> 2288
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)
<220>
<223> PB1基因组片段的核苷酸序列
<400> 15
atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca 60
actttccctt atactggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg 120
gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa 180
actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt 240
ggttatgccc aaacagattg tgtattggag gcgatggctt tccttgagga atcccatcct 300
ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac 360
aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactctaa atagaaacca acctgctgca 420
acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtct 480
ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaacaaaga agaaatgggg 540
atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata 600
acacagagaa caatgggtaa aaagaagcag agattgaaca aaaggagtta tctaattaga 660
gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca 720
attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg 780
agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 840
aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc 900
accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc 960
atgatcacat atatgaccag aaatcagccc gaatggttca gaaatgttct aagtattgct 1020
ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag 1080
agtatgaaac ttagaactca aatacctgca gaaatgctag caagcatcga tttgaaatat 1140
ttcaatgatt caacaagaaa gaagattgaa aaaatccgac cgctcttaat agaggggact 1200
gcatcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaata tgttaagcac tgtattaggc 1260
gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt 1320
cttcaatcct ctgacgattt tgctctgatt gtgaatgcac ccaatcatga agggattcaa 1380
gccggagtcg acaggtttta tcgaacctgt aagctacttg gaatcaatat gagcaagaaa 1440
aagtcttaca taaacagaac aggtacattt gaattcacaa gttttttcta tcgttatggg 1500
tttgttgcca atttcagcat ggagcttccc agttttgggg tgtctgggat caacgagtca 1560
gcggacatga gtattggagt tactgtcatc aaaaacaata tgataaacaa tgatcttggt 1620
ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga 1680
tgccatagag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg 1740
gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac 1800
attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac 1860
caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1920
aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt 1980
gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga 2040
ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc 2100
cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc 2160
agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc 2220
actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atagtgaatt 2280
tagcttgt 2288
<210> 16
<211> 2233
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)
<220>
<223> PA基因组片段的核苷酸序列
<400> 16
agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60
attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca 120
aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac 180
ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg 240
aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac 300
agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360
aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420
gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg 480
gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa 540
accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt 600
cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc 660
aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat 720
gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa 780
gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat 840
gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt 900
gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga 960
acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca 1020
aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag 1080
aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag 1140
aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa 1200
tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg ctagcaagtt ggattcagaa tgagtttaac 1260
aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgtg 1320
gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac 1380
tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca 1440
tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag 1500
gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg 1560
aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620
gaaccacata aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tataagaagt 1680
gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa 1740
attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt 1800
gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860
gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc 1920
attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct 1980
ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt 2040
agggacaacc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100
tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca 2160
catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220
ccttgtttct act 2233
<210> 17
<211> 1027
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)
<220>
<223> NP基因组片段的核苷酸序列
<400> 17
agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 18
<211> 1027
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/PR/8/34 (H1N1)
<220>
<223> M基因组片段的核苷酸序列
<400> 18
agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 19
<211> 1701
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/加利福尼亚/09样 (H1N1pdm)
<220>
<223> HA基因组片段的核苷酸序列
<400> 19
atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60
tgtataggtt atcatgcaaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120
gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180
ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240
aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agttcatggt cctacattgt ggaaacatct 300
agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatca attatgagga gctaagagag 360
caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaaaac aagttcatgg 420
cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcacgctgg agcaaaaagc 480
ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagccaa 540
tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctgt ggggcattca ccatccatct 600
actactgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggaca 660
tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa 720
gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa 780
gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcacaa tggaaagaaa tgctggatct 840
ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca gacacccgag 900
ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt 960
ccaaagtatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct 1020
attcaatcta gaggcctatt cggggccatt gccggcttca ttgaaggggg gtggacaggg 1080
atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1140
gacctgaaga gcacacaaaa tgccattgac aagattacta acaaagtaaa ctctgttatt 1200
gaaaagatga atacacagtt cacagcagtg ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1260
atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc 1320
gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accatgattc aaatgtgaag 1380
aacttgtatg aaaaggtaag aaaccagtta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1440
tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1500
tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaaaaaat agatggggta 1560
aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620
ttggtgctgg tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680
cagtgtagaa tatgtattta a 1701
<210> 20
<211> 1410
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒/加利福尼亚/09样(H1N1pdm)
<220>
<223> NA基因组片段的核苷酸序列
<400> 20
atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct 60
aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaagtt 120
gggaatcaaa gtcagatcga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact 180
tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg gcagccagtg 240
gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac 300
agtaaagaca acagtgtaag agtcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca 360
ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta 420
aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cttaatgagc 480
tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca 540
gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacagt 600
ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacggc ataataacag acactatcaa gagttggaga 660
aacgatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttacc 720
ataatgaccg atggaccaag tgatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag 780
ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc 840
tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat 900
cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgcagtggg 960
attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct 1020
aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg 1080
agaactaaaa gcattagttc aagaaaaggt tttgagatga tttgggatcc aaatggatgg 1140
actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca 1200
ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct 1260
tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagtggg 1320
agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1380
gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa 1410
<210> 21
<211> 979
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合NS片段基因的核苷酸序列
<400> 21
agcaaaagca gggtgacaaa gacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
attgctttct ttggcatgtc cgcaaacgag ttgcagacca agaactaggt gatgccccat 120
tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagc actcttggtc 180
tggacatcga gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaaccg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggaat ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatggg aggaggtttc ttcggagcta 420
ttgctggttt cttggaagga ggatgggaag gaatgattgc aggttgggga ggaagagaga 480
gccggaaccc agggaatgct tgataataag cggccgcagt gtgatttttg accggctgga 540
gactctaata ttgctaaggg ctttcaccga agagggagca attgttggcg aaatttcacc 600
attgccttct cttccaggac atactaatga ggatgtcaaa aatgcaattg gggtcctcat 660
cggaggactt gaatggaatg ataacacagt tcgagtctct aaaactctac agagattcgc 720
ttggagaagc agtaatgaga atgggagacc tccactcact ccaaaacaga aacggaaaat 780
ggcgagaaca attaggtcaa aagttcgaag aaataagatg gctgattgaa gaagtgagac 840
acaaattgaa gataacagag aatagttttg agcaaataac atttatacaa gccttacagc 900
tactatttga agtggaacaa gagataagaa ctttctcgtt tcagcttatt taataataaa 960
aaacaccctt gtttctact 979
1

Claims (38)

1.诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒甲型流感病毒，其包含含有NS1蛋白的截短阅读框和Nep基因异源序列的嵌合NS片段，其中NS1蛋白的所述截短阅读框来源于H1N1流感病毒亚型，并且所述Nep基因异源序列来源于H2N2流感病毒亚型，并且其中所述截短阅读框编码SEQ ID NO:4所示由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白。
2.减毒流感病毒载体，其表达蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段选自来自细菌、病毒和原生动物的蛋白质或其片段，其中所述载体是权利要求1所述的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白基因的所述截短阅读框被编码所述来自细菌、病毒和原生动物之蛋白质或其片段的至少一个转基因之序列的插入物延长，其中所述细菌、病毒和原生动物是致病性的。
3.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，其中所述蛋白质或其片段选自：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属（Trichomonas sp.）、锥虫属（Trypanosoma sp.）、利什曼虫属（Leishmania sp.）、衣原体属（Chlamydia sp.）、布鲁氏菌病致病原的蛋白质，或其组合。
4.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，其中所述蛋白质或其片段由10至400个氨基酸组成。
5.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，其中所述插入物编码来自流感病毒的HA蛋白区。
6.根据权利要求5所述的减毒流感病毒载体，其中所述HA蛋白区是选自以下的HA2亚基区：来自SEQ ID NO:5的第127至311位氨基酸、来自SEQ ID NO:8的第127至294位氨基酸、来自SEQ ID NO:7的第127至289位氨基酸、或来SEQ ID NO:6的第127至284位氨基酸。
7.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，其中所述插入物编码SEQ ID NO:9的第127至147位氨基酸的序列或SEQ ID NO:10的第127至147位氨基酸的序列，和SEQ ID NO:9或10的第150至158位氨基酸的序列。
8.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，其中所述插入物编码结核分枝杆菌的ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Mpt64、HspX、Mtb8.4或10.4蛋白，或其片段。
9.根据权利要求8所述的减毒流感病毒载体，其中病毒基因组序列还包含在编码NS1蛋白基因的所述截短阅读框和所述插入物编码蛋白ESAT6之间的编码自我切割2A肽的序列。
10.表达流感病毒蛋白或其片段的减毒流感病毒载体，其中所述载体是根据权利要求1所述的减毒流感病毒，其中NS1蛋白基因的所述截短阅读框被编码SEQ ID NO:10的第127至147位氨基酸和SEQ ID NO:10的第150至158位氨基酸的序列的插入物延长。
11.具有溶瘤活性的减毒流感病毒载体，其中所述载体是权利要求1所述的减毒甲型流感病毒，其中NS1蛋白基因的所述截短阅读框被编码结核分枝杆菌ESAT-6蛋白或其片段之序列的插入物延长。
12.根据权利要求11所述的减毒流感病毒载体，其中所述结核分枝杆菌ESAT-6蛋白或其片段由10至400个氨基酸组成。
13.根据权利要求11所述的减毒流感病毒载体，其中NS1蛋白基因的所述截短阅读框被编码自我切割2A肽的序列的插入物进一步延长。
14.诱导针对甲型和乙型流感病毒的交叉保护性应答的减毒流感病毒载体，其包含：
SEQ ID NO:14的PB2蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:15的PB1蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:16的PA蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:17的NP蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:18的M蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:19的HA蛋白基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO:20的NA蛋白基因的核苷酸序列；以及
SEQ ID NO:21的NS蛋白嵌合基因的核苷酸序列，其包括：
来源于甲型流感病毒/PR/8/34（H1N1）的NS1蛋白阅读框，其中所述阅读框是截短的并且编码SEQ ID NO:4所示由124个氨基酸残基组成的NS1蛋白，
和来源于甲型流感病毒/新加坡/1/57样（H2N2）的Nep基因序列；
其中所述NS1蛋白截短阅读框被编码乙型流感病毒亚基HA2区域之融合肽的核苷酸序列和编码甲型流感病毒核蛋白（NP）之保守B细胞表位的核苷酸序列的插入物延长。
15.用于在对象中诱导针对感染性病原体的免疫应答的免疫原性组合物，其包含有效量的根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
16.用于预防流感疾病的药物组合物，其包含有效量的根据权利要求14所述的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
17.根据权利要求15所述的免疫原性组合物或根据权利要求16所述的药物组合物，其分别包含6.5至10.5 log EID50/ml的所述减毒甲型流感病毒和缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5 wt.%的单价盐、0至5 wt.%的含咪唑化合物、0至5 wt.%的碳水化合物组分、0至2wt.%的蛋白质组分、0至2 wt.%的氨基酸组分和0至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述缓冲溶液包含0.5至1.5 wt.%的单价盐、0.01至5 wt.%的含咪唑化合物、1至5 wt.%的碳水化合物组分、0.1至2 wt.%的蛋白质组分、0.01至2 wt.%的氨基酸组分以及1至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其中所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是蔗糖、海藻糖或乳糖，所述蛋白质组分是人重组白蛋白、酪胨、乳白蛋白水解物或明胶，所述氨基酸组分是精氨酸、甘氨酸或谷氨酸钠，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N,N'-双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
20.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中所述感染性病原体选自：甲型流感病毒、乙型流感病毒、结核分枝杆菌、I和II型单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、疟原虫、毛滴虫属、衣原体属、锥虫属、利什曼虫属或布鲁氏菌病致病原。
21.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中所述对象是哺乳动物或鸟类。
22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述对象是人。
23.抵抗流感的疫苗，其包含有效量的根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
24.抵抗流感的疫苗，其包含有效量的根据权利要求14所述的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
25.根据权利要求23或24所述的疫苗，其包含6.5至10.5 log EID50/ml的所述减毒流感病毒载体和缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5 wt.%的单价盐、0至5 wt.%的含咪唑化合物、0至5 wt.%的碳水化合物组分、0至2 wt.%的蛋白质组分、0至2 wt.%的氨基酸组分和0至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
26.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述缓冲溶液包含0.5至1.5 wt.%的单价盐、0.01至5 wt.%的含咪唑化合物、1至5 wt.%的碳水化合物组分、0.1至2 wt.%的蛋白质组分、0.01至2 wt.%的氨基酸组分和1至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
27.根据权利要求26所述的疫苗，其中所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是蔗糖、海藻糖或乳糖，所述蛋白质组分是人重组白蛋白、酪胨、乳白蛋白水解物或明胶，所述氨基酸组分是精氨酸、甘氨酸或谷氨酸钠，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N,N'-双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
28.根据权利要求2所述的减毒流感病毒载体用于制备用于在有此需要的对象中治疗和/或预防流感疾病的药物的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述流感疾病由选自以下的病原体引起：甲型流感病毒和乙型流感病毒。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述对象是哺乳动物或鸟类。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述对象是人。
32.用于在对象中治疗肿瘤疾病的药物组合物，其包含有效量的根据权利要求11所述的减毒流感病毒载体，以及可药用运载体。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其包含8.5至10.5 log EID50/ml所述减毒流感病毒载体，以及缓冲溶液，所述缓冲溶液包含0至1.5 wt.%的单价盐、0至5 wt.%的含咪唑化合物、0至5 wt.%的碳水化合物组分、0至2 wt.%的蛋白质组分、0至2 wt.%的氨基酸组分和0至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含0.5至1.5 wt.%的单价盐、0.01至5 wt.%的含咪唑化合物、1至5 wt.%的碳水化合物组分、0.1至2 wt.%的蛋白质组分、0.01至2 wt.%的氨基酸组分和1至10 wt.%的羟乙基化淀粉。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述单价盐是氯化钠，所述碳水化合物组分是淀粉，所述蛋白质组分是人白蛋白，所述氨基酸组分是精氨酸，并且所述含咪唑化合物是L-肌肽或N,N'-双[2-(1H-咪唑-5基)乙基]丙二酰胺。
36.根据权利要求11所述的减毒流感病毒载体用于制备用于在有此需要的对象中治疗肿瘤疾病的药物的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述肿瘤疾病选自结直肠癌、贲门食管癌、胰腺癌、胆管细胞癌、胶质瘤和黑素瘤。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述胶质瘤是胶质母细胞瘤。
CN201680033797.2A 2015-11-06 2016-11-03 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体 Active CN108026515B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147703 2015-11-06
RU2015147703A RU2628690C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
PCT/RU2016/050066 WO2017078577A2 (ru) 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108026515A CN108026515A (zh) 2018-05-11
CN108026515B true CN108026515B (zh) 2022-03-11

Family

ID=58662984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680033797.2A Active CN108026515B (zh) 2015-11-06 2016-11-03 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10392604B2 (zh)
EP (1) EP3382010A4 (zh)
JP (1) JP6692835B2 (zh)
KR (1) KR102604877B1 (zh)
CN (1) CN108026515B (zh)
AU (1) AU2016350939B9 (zh)
BR (1) BR112017025435A8 (zh)
CA (1) CA2991023A1 (zh)
CU (1) CU24580B1 (zh)
HK (1) HK1251616A1 (zh)
IL (1) IL255259B (zh)
MA (1) MA43314A (zh)
MX (1) MX2017015462A (zh)
RU (1) RU2628690C2 (zh)
SG (1) SG11201709122VA (zh)
UA (1) UA125333C2 (zh)
WO (1) WO2017078577A2 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240035919A (ko) * 2017-05-26 2024-03-18 엘티디 "발렌타-인텔렉트" 신규한 글루타미닐 고리화효소 억제제 및 다양한 질환의 치료에서의 이의 용도
BR112020012241A2 (pt) * 2017-12-22 2020-11-24 Codagenix Inc. vírus recombinante com a região não otimizada com codon-par e usos para o tratamento do câncer
EP3851120A4 (en) * 2018-09-11 2022-04-27 Shanghai Public Health Clinical Center IMMUNOGEN FOR BROAD-SPECTRUM INFLUENZA VACCINE, AND APPLICATION THEREOF
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
RU2726106C1 (ru) * 2019-07-18 2020-07-09 федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России) Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8-NS124-TB10.4-2A-HspX и способ специфической профилактики туберкулеза легких с использованием вакцины мукозального применения на его основе
CN116390748A (zh) * 2020-09-11 2023-07-04 佐治亚大学研究基金会股份有限公司 用于预防和治疗流感感染的组合物及其使用方法
AU2021378792A1 (en) * 2020-11-11 2023-05-04 California Institute Of Technology Multivalent carriers and related vaccine compositions
CN113430178B (zh) * 2021-06-21 2022-10-11 武汉大学 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796190A (zh) * 2007-06-27 2010-08-04 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 用于表达异源序列的复制缺陷型流感病毒
WO2011014504A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
CN103068835A (zh) * 2010-06-06 2013-04-24 西奈山医学院 重组rna 病毒及其用途
EP2708552A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-19 Medizinische Universität Wien Influenza virus

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1086207T3 (da) * 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
DE69937999T2 (de) * 1998-06-12 2009-01-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Interferon induzierende genetisch veränderte attenuierte viren
RU2280690C2 (ru) * 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
US7709190B2 (en) * 2005-12-02 2010-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Influenza A virus vaccines and inhibitors
EP2072058A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
WO2011014645A1 (en) * 2009-07-30 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza viruses and uses thereof
WO2011130652A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 George Baer Compositions and methods for vaccinating humans and animals against enveloped viruses
WO2012072088A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Bionor Immuno As Peptide scaffold design

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796190A (zh) * 2007-06-27 2010-08-04 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 用于表达异源序列的复制缺陷型流感病毒
WO2011014504A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
CN103068835A (zh) * 2010-06-06 2013-04-24 西奈山医学院 重组rna 病毒及其用途
EP2708552A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-19 Medizinische Universität Wien Influenza virus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Attenuation of Equine Influenza Viruses through Truncations of the NS1 Protein";Michelle Quinlivan et al.;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20050731;第79卷(第13期);第8431-8439页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016350939A2 (en) 2018-02-08
KR102604877B1 (ko) 2023-11-23
CA2991023A1 (en) 2017-05-11
CU24580B1 (es) 2022-02-04
JP2018531578A (ja) 2018-11-01
BR112017025435A8 (pt) 2019-08-20
HK1251616A1 (zh) 2019-02-01
RU2628690C2 (ru) 2017-08-21
US10392604B2 (en) 2019-08-27
WO2017078577A3 (ru) 2017-06-29
IL255259B (en) 2020-03-31
US20180245052A1 (en) 2018-08-30
MX2017015462A (es) 2018-03-07
AU2016350939B9 (en) 2021-07-22
RU2015147703A (ru) 2017-05-16
JP6692835B2 (ja) 2020-05-13
AU2016350939B2 (en) 2021-07-08
EP3382010A2 (en) 2018-10-03
UA125333C2 (uk) 2022-02-23
SG11201709122VA (en) 2017-12-28
KR20180067464A (ko) 2018-06-20
WO2017078577A2 (ru) 2017-05-11
CN108026515A (zh) 2018-05-11
AU2016350939A1 (en) 2017-11-23
EP3382010A4 (en) 2019-03-27
BR112017025435A2 (pt) 2018-09-11
CU20180035A7 (es) 2018-07-05
IL255259A (en) 2018-04-30
MA43314A (fr) 2018-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108026515B (zh) 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体
JP6870017B2 (ja) インフルエンザウイルス変異体およびその使用
ES2813347T3 (es) Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero
JP3545418B2 (ja) インフルエンザの新規組換え温度感受性変異体
JP2019520338A (ja) ウマインフルエンザウイルス弱毒生ワクチン
JP2023166432A (ja) インフルエンザに対する免疫原性組成物
RU2660562C2 (ru) Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
US20220401549A1 (en) Novel prime-boost influenza vaccine
Lee et al. Current status for influenza control

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1251616

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant