UA125333C2 - Атенуйований грипозний вектор для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань - Google Patents

Атенуйований грипозний вектор для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань Download PDF

Info

Publication number
UA125333C2
UA125333C2 UAA201709223A UAA201709223A UA125333C2 UA 125333 C2 UA125333 C2 UA 125333C2 UA A201709223 A UAA201709223 A UA A201709223A UA A201709223 A UAA201709223 A UA A201709223A UA 125333 C2 UA125333 C2 UA 125333C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
virus
influenza
protein
sequence
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
UAA201709223A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Андрєй Юрьєвіч Єгоров
Андрей Юрьевич Егоров
Борис ФЕРКО
Артьом Алєксандровіч Крохін
Артём Александрович Крохин
Юлія Романовна Романова
Юлия Романовна Романова
Original Assignee
Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Фармінтерпрайсез Біотех"
Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Фармінтерпрайсез Біотех", Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" filed Critical Общєство С Огранічєнной Отвєтствєнностью "Фармінтерпрайсез Біотех"
Publication of UA125333C2 publication Critical patent/UA125333C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Галузь техніки
Даний винахід стосується галузі медицини і вірусології, зокрема, атенуйованого химерного вірусу групи А, атенуйованого грипозного вектора на основі зазначеного вірусу і їхнього застосування для профілактики і/або лікування захворювань інфекційної природи, а також для лікування онкологічних захворювань.
Рівень техніки
Сьогодні найважливішим засобом захисту від вірусної інфекції й обмеження її поширення є вакцинопрофілактика. Сучасні вакцини, як правило, індукують утворення антитіл до поверхневих антигенів вірусів. Ефективність вакцин прямо залежить від ступеня відповідності антигенної структури штамів вірусу, що входять до складу вакцини, і штамів, що циркулюють серед популяції. Поверхневі білки більшості вірусів піддаються постійній антигенній варіації (антигенний дрейф), що вимагає регулярного відновлення штамового складу вакцин. Розробка високоїмуногенних і безпечних вакцин, які індукують імунну відповідь широкого спектра дії, є нині однією з основних проблем ефективної профілактики вірусних захворювань.
З усіх респіраторних вірусних захворювань грипозна інфекція характеризується найбільш важкою патологією і завдає найбільший збиток здоров'ю населення й економіці. Періодично з'являються нові пандемічні штами, до яких відсутній популяційний імунітет, і перетворюють грип в особливо небезпечну інфекцію. Відомо, що іспанський грип 1918 року став причиною смерті від 30 до 50 млн осіб. В даний час, за даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (В0О3), під час сезонних епідемій щорічно в усьому світі занедужує на грип до 20 95 населення, зокрема 5-10 90 дорослих і 20-30 Фо дітей (Умогід Неакп Огдапігайоп (Електронний ресурс|. ОК: пОр/Лимли лупо,пі/ріоіодіса!в/иассіпев/іпішепга/еп/ (дата звертання 28.03.2016)). Важкі форми відзначаються в 3-5 млн. випадків, летальні випадки становлять від 250 000 до 500 000 випадків. Економічні втрати, викликані грипом і іншими гострими респіраторними вірусними інфекціями (ГРВІ), становлять близько 77 95 від збитку, що припадає на частку всіх інфекційних хвороб. Значні збитки пов'язані як із прямими витратами на лікування і реабілітацію, так і з непрямими втратами виробничого характеру, викликаними зниженням продуктивності праці і скороченням прибутку підприємств. Із загального числа випадків тимчасової непрацездатності на грип і ГРВІ припадає 12-14 Фр.
Зо Існуючі вакцини можна розділити на два види: атенуйовані (живі, що містять цільні й активні віруси, що виявляють низьку патогенність) і інактивовані (що містять фрагменти вірусних частинок або цільні неактивні віруси). Живі віруси, здатні реплікуватися в інфікованому хазяїні, викликають сильну і тривалу імунну відповідь проти антигенів цих вірусів, що експресуються.
Вони ефективно викликають як гуморальну, так і клітинну імунну відповіді, а також стимулюють імунологічні реакції, опосередковувані цитокінами і хемокінами. Тому живі атенуйовані віруси мають визначені переваги порівняно з композиціями вакцин, основаними або на інактивованих імуногенах, або на окремих субодиницях імуногенів, що, як правило, стимулюють лише гуморальну частину імунної системи.
Для вакцинації тварин і людей від різних інфекційних захворювань віруси різних сімейств можуть використовуватися як вектори, що експресують чужорідні геномні послідовності.
Застосування векторів можливе в тих випадках, коли традиційні убиті або живі вакцини не можуть бути отримані, або їхня ефективність не дозволяє контролювати те або інше захворювання. Серед існуючих систем доставки антигенів вірусні вектори займають особливе місце, оскільки мають наступні властивості: мають природний механізм взаємодії з клітиною і проникнення в неї, переносять чужорідний генетичний матеріал у цитоплазму або ядро клітини, здатні забезпечувати тривалу експресію антигену, вірусна оболонка захищає нуклеїнову кислоту, що кодує введений трансген.
Не всі віруси мають властивості, необхідні для створення векторів для одержання ефективних атенуйованих рекомбінантних вакцин. Для створення вакцин на основі вірусних векторів у даний час найбільш широко використовуються поксвіруси (Рохмігідає) |У. Сеп. Мігої. 2005. М. 86. Мо 11. Р. 2925-2936), вірус хвороби Ньюкасла (МОМ) |МігоІ. 2001. М. 75. Мо 23. Р. 11868-11873)| і аденовіруси (Адепомігідає) (Біотехнологія. 2007. 7.5. С. 38-44). Серед поксвірусів, використовуваних як вірусний вектор, найбільш популярний вірус вісповакцини, до переваг якого належать простота і дешеве одержання, а також висока пакувальна ємність (до 25 т. п. н.)
І. Сеп. МігоЇ. 2005. М. 86. Мо 11. Р. 2925-2936). Серйозний недолік векторів на основі вірусу вісповакцини - передіснуючий імунітет до цього вірусу, що є присутнім у частині в людській популяції в результаті імунізації проти віспи. Тому доцільно використовувати вектори на основі таких поксвірусів, як вірус віспи канарки (Сапагурох) і вірус віспи домашнього птаха (Ріожрох).
Однак Сапагурох і Ріожмрох індукують більш слабку імунну відповідь на цільові антигени, ніж бо вірус вісповакцини, і вимагають багаторазового введення або використання ад'ювантів (Массіпе.
1991. М.9. Мо 5. Р. 303-308). Істотним недоліком вакцинного вектора МОМ є те, що наслідки введення рекомбінантних МОМ недостатньо вивчені, і не зрозуміло чи безпечні вакцини на основі МОМ для людини. Крім того, МОМ характеризується низькою пакувальною ємністю і складністю одержання векторів, що несуть кілька цільових антигенів |Спет. Віодімегв5. 2010. М 7.
Мо 3.Р.677-689|. Аденовіруси також мають ряд недоліків, які обмежують їхнє застосування як векторів для перенесення генів. Основними недоліками аденовірусних векторів вважають: (1) неоднорідність розподілу вірусних рецепторів на поверхні клітин в організмі, що робить множину клітин нечутливими до аденовірусної інфекції, (2) наявність могутнього захисного популяційного імунітету до відомих аденовірусних векторів, (3) теоретичну можливість інтеграції
ДНК-ого геному аденовірусів у хромосоми людини (5іерпеп 5І, Мопіїпі Е, 5імапапдат МО, АЇ!-
ОПаїїту М, Кезіег НА, Ріпедоїд М, Стотре М, Коспапек 5. Спготозотаї іпіедгайоп ої адепоміга! месіог ОМА іп мімо. / Мігої. 2010 Осі:;84(19):9987-94. дої: 10.1128/0МІ.00751-10. Ериб 2010 Аца 4.)
Вектори, отримані на основі вірусу грипу, мають ряд переваг порівняно з іншими вірусними векторами, тому що: - Віруси грипу не мають ДНК-ої фази у своєму реплікаційному циклі і не можуть вбудовуватися в геном людини або тварини. - Вірус грипу викликає системну і мукозальну В і Т клітинну відповідь до своїх антигенів при зараженні клітин респіраторного тракту людини. - Множина різних підтипів вірусу грипу є доступною. Оскільки антитіла проти різновиду зазначених підтипів не мають перехресної реактивності, передіснуючий імунітет до вірусного вектора в хазяїна, що найчастіше є проблемою у випадку інших живих векторів, можна обійти.
Можливі також ефективні бустерні імунізації різними підтипами вірусів грипу, що експресують ті самі антигени. - Існує кілька типів живих грипозних вакцин для інтраназального введення (УЛЬТРАВАКФ
ВАКЦИНА ГРИПОЗНА АЛАНТОЇСНА ЖИВА (РФ) і РіштівіФ (О5А)) і індустріальна технологія їхнього виробництва із застосуванням 10-денних курячих ембріонів (спцідеїйпе оп Іпйпепа
Массіпез-Оцаїйу Моаше, Еигореап Медісіпе5 Асепсу, 25 Аргії 2014 (Електронний ресурс|. ОК: пЕру/Лимли. ета. еигора.ец/досв/єп. сВ/доситепі ІІргагу/бсіепійіс ацідейпе/2014/06ЛиС500167817 «раї (дата звертання 01.11.2015)).
Зо Віруси грипу належать до сімейства Огіотухомігідає, що включає роди ІпПчепга А, В, с.
Геноми вірусів грипу А і В мають схожу структуру, що складається з 8 геномних фрагментів РНК негативної полярності: РВ2, РВІ1, РА, НА, МА, МР, М і М5 (Спои УУ, Магтабакиняй В, Родапау 5,
Сао О, На Т, Раїезе Р. Опе іпПшепла мігив рапісіє расКкадез еїЇдні ипідне міга! АМАв» аз зпом/п ру
РІЗН апаїувів. Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А. 2012 дип 5;109(23):9101-6. дої: 10.1073/рпаз.1206069109.
Ериб 2012 Арг 30). Полімеразний комплекс РВ2, РВІ, РА транскрибує одну матричну РНК (МРНК) з кожного геномного фрагмента, трансльовану в однойменний білок. У геномних фрагментів М і М5 матричні РНК можуть бути альтернативно сплайсовані, утворюючи мРНК, що кодують білки М2 і МЕР, відповідно. Усі білки, за винятком білка М5 і РВ1-02 (є не у всіх штамів), є структурними компонентами вірусних частинок. Неструктурний білок М51 накопичується в цитоплазмі заражених клітин і має функцію інгібітора системи інтерферону (Кгид ЕМ. Еипсійоп5 ої Ше іпїмепла А міпи М51 ргоївїп іп апіїміга! деїепве. Сицт Оріп Мігої. 2015 дип; 12:1-6. адої: 10.1016/.соміго.2015.01.007. Ериб 2015 дап 29. Немієму).
Фрагментована природа геному вірусу грипу дає можливість утворення реасортантів вірусу грипу - вірусів, що мають фрагменти геному змішаного походження від різних штамів. Це є одним із механізмів антигенного різноманіття вірусів грипу в природі і причиною виникнення пандемій вірусу грипу.
Антигенні властивості вірусу грипу визначаються поверхневими глікопротеїнами, що утворюють шипи на поверхні віріонів, - гемаглютиніном (НА) і нейрамінідазою (МА). Молекула
НА відповідальна за механізми прикріплення вірусу до сіалових рецепторів клітини і злиття вірусної і клітинної мембран для проникнення геному в цитоплазму і ядро клітини. У процесі репродукції вірусу відбувається розщеплення (активація) НА клітинними протеазами на дві субодиниці - НАТ ї НА2, що залишаються з'єднаними дисульфідним зв'язком (ВиПоЧчойп РА,
Нидизоп ЕМ, 5Кепеї! У, УМієу ОС. Бютисішиге ої іпїнепга наетаддішіпіп аї Ше р ої тетбргапе
Тибвіоп. Маїште 1994; 371, 37-43. Молекула НА складається з двох частин: глобулярної, утвореної субодиницею НАТ, і стовбурової, яка складається в основному із субодиниці НА? і частково НАТ. Глобулярна частина включає рецептор-зв'язувальний сайт і п'ять антигенних сайтів і є основною мішенню для утворення антитіл. Антитіла, що блокують зв'язування вірусу з рецептором, є нейтралізуючими. Для НА! субодиниці характерна висока мінливість.
Стовбурова частина НА розташована в безпосередній близькості від вірусної мембрани і 60 відрізняється слабкою імуногенністю. Субодиниця НА2 відіграє основну роль у забезпеченні злиття вірусної мембрани з ендосомальною і відрізняється високою консервативністю.
Відповідно до антигенної специфічності до даного моменту для вірусу грипу А відомо 18 підтипів НА і 11 підтипів МА. Підтипи НА НІ, Н2, Н5, Нб, Нв, Не, НІ1, НІ12, НІ13, НІ16, НІ17, НІВ відносять до першої групи, а НЗ, Н4, Н7, НІ0О, НТ14 ї НІ15 - до другої групи. При цьому тільки серопідтипи НІ, Н2 ї НЗ вірусу грипу А ії різні антигенні варіанти вірусу грипу В здатні до поширення в людській популяції, викликаючи пандемії або сезонні епідемії грипу.
Специфічний імунітет, що виробляється після перенесеного захворювання або вакцинації одним серопідтипом, слабко захищає від інфекції іншим серопідтипом вірусу грипу А. Імунітет до будь-якого серопідтипу вірусу грипу А не захищає від вірусу грипу В, і навпаки: імунізація проти грипу В неефективна відносно вірусу грипу А. У зв'язку з цим існує нагальна потреба створення універсальної грипозної вакцини, ефективної відносно усіх відомих антигенних різновидів вірусу грипу А і В.
В основі надзвичайно швидкої мінливості вірусу грипу, а отже, і його вислизання від дії нейтралізуючих антитіл, лежать два механізми: 1) нагромадження точкових мутацій, що приводять до зміни антигенної структури поверхневих глікопротеїнів (антигенний дрейф) і 2) реасортація геномних сегментів. Вони приводять до появи нових антигенних варіантів вірусу (антигенний шифт), що можуть викликати пандемію.
Для всіх грипозних вакцин, застосовуваних у даний час, характерний ризик низької ефективності при імунізації людей похилого віку і маленьких дітей (ЧеПегзоп Т, Кімеці А, Оі
Ріеігапюпі С, Оетіснеїї М, Ретопі Е. Массіпев ог ргемепіїпа іпїшепга іп Неайну спіїагеп. СосНгапе
Раїаразе Бузі Нем 2012; 8, С0О004879.;
О5іетоїт МТ, КеПеу М5, бБоттег А, ВеІопдіа ЕА. ЕпПісасу апі еПесіїмепев55 ої іпПШепга массіпев: а зузіетаїййс гемівем/ апа теїа-апаїувів. І апсеї Іптесі біб 2011; 12, 36-44; РІвїідегег М,
Ттоцміп ОН, Вгаззецг О, Стапвігот М, 5Німі АВ, Мига М, Самаїеті М. Зиттагу ої КпомЛедде дар геіатей ю диаїйу апа ейісасу ої ситепі іпПшеплга массіпе5. Массіпе 2014; 32, 4586-91). Крім того, ці вакцини захищають від циркулюючих штамів тільки у випадку збігу епідемічного вірусу з вакцинним штамом за антигенними властивостяями. Саме високою мінливістю поверхневих антигенів вірусу грипу, НА їі МА, зумовлена необхідність проведення щорічної вакцинації і обновлення складу вакцин. Потрібно зазначити, що сезонні вакцини, формовані на підставі
Зо рекомендацій ВООЗ, неефективні у випадку раптової появи нового пандемічного штаму, що кардинально відрізняється від усіх циркулюючих варіантів, як це відбулося в 2009 р. з появою пандемічного вірусу А/СаїЇйогпіа/7/2009 (НІМІратоО9). Ще одним прикладом може служити низька ефективність компонента НЗМ2 сезонної вакцини 2014 р., зумовлена появою нового антигенного варіанта цього серопідтипу в результаті антигенного дрейфу (ЗКомтоп5Кі ОМ,
Спатрбегз С, Зараїдис 5, Ое беїтев С, РісКіпзоп УА, М/іпіег А, Огему5 5, Еопзеса К, Спагезві Н,
Сиррау ОВ, Реїгіс М, Кгта|їдеп М, Кулпаї ТІ, Мапіпеай С, ЕзНасні А, Вазійєп М, її У. Іпегіт езійпаїез ої 2014/15 массіпе епПесіїмепе55 адаїп5ї іпїйцепла А(НЗМ2) їот Сапада5 зЗепііпеї
Рпузісіап ЗигмейШапсе Меїймжоїк, ЧФапиагу 2015. Его Зигмей! 2015; 20). За останні 60 років розроблена множина варіантів живих і інактивованих грипозних вакцин, що мають визначені переваги і недоліки, однак жоден з відомих препаратів не вирішує проблеми контролю над захворюваністю грипом через їхню нездатність викликати крос-протективний імунітет до вірусів грипу, що постійно еволюціонують. У зв'язку з цим існує нагальна потреба у створенні універсальної грипозної вакцини, що викликає широкий крос-протективний тривалий імунітет, здатний протистояти усім відомим відомим циркулюючим серопідтипам вірусів грипу А і В.
Усі відомі протигрипозні вакцини - інактивовані (цільновіріонні, спліт або субодиничні) або живі (атенуйовані холодоадаптовані) - в основному спрямовані на створення імунітету до глобулярної частини НА. На відміну від мінливої глобулярної частини, стовбурова частина НА відрізняється консервативністю серед вірусів грипу А (І і ІІ групи) і В. Для антитіл, індукованих до цього району НА, відомо кілька механізмів як прямої, так і непрямої нейтралізації. Один із механізмів прямої нейтралізації пов'язаний із запобіганням конформаційній зміні НА, що необхідно для вивільнення пептиду злиття і подальшого об'єднання ендосомальної і вірусних мембран для доставки вірусного геному в клітину. Другий механізм прямої нейтралізації пов'язаний із запобіганням активаційному розщепленню НА на субодиниці НАї і НА2 з допомогою антитіл, які взаємодіють із ділянкою НА в безпосередній близькості від сайту розщеплення. У механізмах непрямої нейтралізації задіяні антитілозалежна «і« комплементозалежна цитотоксичність (Тега|йта М, Сти? У, Со МО, Г ее УН, Кашг К, Мугаттегі У,
Муївоп РОС, Еппів ГА. Сотріетепі-дерепаеєпі увів ої іпПшепла а мігив-іптесієд сеї Бу БгоаадіІу сго55-геасіїме питап топосіопаї! апіїбодієв. У Міго! 2011; 85, 13463-7.; УедазКапаа 5, М/еіптипег
УТ, Епеагпсн ТС, Кепі 5. Апіроду-дерепаеєпі сеїЇшміаг суїоїохісйу із авззосіаївей м/йй сопіго! ої бо рапаєтіс НІМІ іпПмепла мігив іптесіоп ої тасаднев. У Міго! 2013; 87, 5512-22).
Антитіла до стовбурової ділянки НА при вакцинації практично не утворюються і виявляються в невеликій кількості тільки після природної інфекції (Мосду МА, 2папд К, М/анег ЕВ, Уумосаз СУМУ,
Сіпзригу 5, МеСіаїіп МТ, Оєппу ТМ, Спеп Х, МипеНнам 5, МагїзНаї! БУ, М/піезідез УРЕ, ОппКег М5,
Атоз 20, Сипеу ТС, Єйдайеу УА, Роцідег А, ОеКоза КВ, Раїк5 В, Меуептоїй ВВ, Ми 95, Когіпк
ОМ, Вагеїоої ВЕ, Натвригуд ЕА, Кпигапа 5, Соїдіпуд Н, Мапаегупй МА, АіІат ЗМ, Тотагаз СО,
Керієг ТВ, Кеїзоє С, І іао НХ, Наупез ВЕ. НЗМ2 іпїшеплга іп'есійоп еїїсії5 тоге сго55-геасіїме апа
Іеєз5 сіопайу ехрапаєа апіі-петаодадішіпіп апіїбодієвз їйпап іп'їшепга массіпайоп. Ріо ОМЕ 2011; 6, е25797).
Більшість розроблювальних у даний час підходів до одержання універсальної вакцини основано на фокусуванні імунної відповіді до консервативних ділянок білків вірусу грипу.
Антитіла до консервативних внутрішніх білків РВ2, РВІ, РА, МР і М! не належать до нейтралізуючих, але можуть відігравати важливу роль у забезпеченні елімінації вірусу за рахунок антитілозалежної цитотоксичності (АОСС).
Відомо кілька прикладів створення універсальної вакцини на основі субодиниці НА2.
Триразова імунізація мишей пептидами, що представляють ектодомен НА2 (23-185 амінокислотні залишки) або пептид злиття (1-38 амінокислотні залишки), у комбінації з ад'ювантами КІН (Кеупоїе Іптреї петосуапіп) і Фрейнда індукувала крос-реактивний імунітет, що знижує загибель тварин при летальній інфекції гетерологічним штамом (5іапекома 7, Кігаїу
У, зорКомзКа А, МікизКома Т, Мисна М, КовюїапзКу Е, Магескома Е. Неїегозибіуріс ргоїесіїме іттипйу адаїп5ві іпїшепга А мігив5 іпдисейд Бу Тивіоп реріїде ої Ше петааддішіпіп іп сотрагізоп ї0 есіодотаїп ої Ме ргоївєїп. Асіа Мігої 2011; 55, 61-7). Більш ефективний захист розвивався при вакцинації химерними конструкціями НА. Ктгаттег зі співаторами показав, що гетеросубтиповий гуморальний імунітет у мишей індукується при імунізації химерними білками, які містять глобулярні частини НА від штамів різних серопідтипів і однакову стовбурову частину НА (Кгаттег Е, Раїезе Р, еїевєї У. Адмапсез іп ипімегза! іпїшнепла міги5 массіпе дезідп апа апіїбоду теаіаїейд ІНегарієз Базейд оп сопзегуєй гедіоп5 ої Ше петадаішіпіп. Си Тор Містобіо! Іттипої) 2014; 386, 301-21.; Кгаттег Е, Наї В, Мопаоїіа М, Тап С5, І еуха-Стадо УН, Вудег АВ, МіШег М5,
Возе УК, Раїезе Р, Сагсіа-5авіге А, АЇІбгеспї ВА. Ав5зеззтепі ої іпїшеплга мігив петаддішіпіп 5іаїк- разей іттипйу іп Тегтеїв. / Мік! 2014; 88, 3432-42). До недоліків цього підходу варто віднести
Зо складну схему імунізації, що включає електропорацію тварин за допомогою ДНК ї дворазову імунізацію білковими конструкціями внутрішньом'язово й інтраназально з ад'ювантом роїу (І: С).
Іншим прикладом служить використання стабільних конструкцій (міні-НА), отриманих генно- інженерним способом на основі амінокислотної послідовності стовбурової частини НА вірусу серопідтипу НІМ1. З великої колекції відбирали тільки конструкції із найвищою афінністю до антитіл, що мають нейтралізуючу активність широкого спектра. Імунізація мишей такими конструкціями також захищала тварин від загибелі при інфікуванні штамом !/ групи - високопатогенним вірусом грипу птахів серопідтипу Н5МІ1 (Ітрадііа72о А, Міїдег Е, Киїрег5 Н,
Мадпег МУ, 2пи Х, Нойтап ВАМ, мап Меегзбрегдеп ВН, Ниїгіпон У, Уаппіпдеп Р, Меїзриї) У, де Мап
М, біпад 7, Ареїгі А, КиКгег В, ЗпееКе5-Міієзе Е, ТотКієміс: 0, І ашувеп М5, І еє РБ5, 7аКілемвКа А,
БеккКіпо ГІ, Тоіроот У, Тецего І, мап Меепеп 5, Ми МУ, Коцавіаа! М, Ссоцавзтії У), УМага АВ, Меїїрегу
М, Мізоп ІА, Надоземіс К. А 5іабіє їітетгіс іпПнеп2а петаддішіпіп 5ієт аз а Бргоадіу ргоїесіїме іттиподеп. Зсієпсе 2015; 349, 1301-6). Стовідсотковий захист мишей від загибелі досягався в результаті дворазової внутрішньом'язової імунізації очищеним білком міні-НА в дозі 30 мкг з ад'ювантом Маїйгіх-М виробництва компанії Момамах.
Ще один із перспективних напрямків у розробці універсальної грипозної вакцини оснований на створенні наночастинок, що самозбираються, які, як показано раніше, значно підвищують імуногенні властивості НА (КапекКіуо М, Умеї СУ, Маззіпе НМ, МсТатпеу РМ, Воуїпдюп УС, УУпіше
УВА, Вао 55, Копуд М/Р, УУапа І, Мабе! су). Зеї-аззетбіїпуд іпїшепга папорапісіє массіпев еїїсії
Бгоадіу пецшігаїїгіпа НІМІ апііїрбодіе5. Маїште 2013; 499, 102-6). Тваринам дворазово або триразово внутрішньом'язово вводили наночастиноки з додаванням нового ад'юванту 5А5 (Зідта Адіимапі Зузіет). Незважаючи на відсутність вироблення нейтралізуючих антитіл після імунізації наночастинками, як миші, так і тхори виявилися повністю захищеними від загибелі при зараженні високопатогенним вірусом грипу птахів серопідтипу НОМ.
Одна із сучасних технологій одержання живої вакцини основана на конструюванні вакцинних векторів, у якому один вірус експресує антигени іншого вірусу. Як вектори, що експресують грипозні антигени, використовують різні ДНК-вмісні віруси, а саме: аденовірус, герпесвірус, бакуловірус або поксвірус (ЮОцдек Т, Кпіре ОМ. Керіїсайоп-деїесіме мігибзе5 ав массіпез5 апа массіпе месіоге. Мігоїоду 2006; 344, 230-9.; Не Е, Маднап 5, Кулапу У. Васиомікги5 месіюог аз а деїїмегу мепісіє їог іпПшепла массіпез. Ехреп Вем Массіпез 2009; 8, 455-67.; Огарег 5, 60 Соціпдапат МО, СПрепй ЗО. (Ліїїгіпу рохміга! месіогейд массіпев5 ог апіїроду іпдисіоп-ргодгев55 апа ргозресів. Массіпе 2013; 31, 4223-30. Ріісе СЕ, БороїезКі МА, Го СУ, Мізріоп ЧА, Рарраз С,
Ноизег КУ, Титреу ТМ, Ерзівіп 5. Массіпайоп госивіпд іттипйу оп сопзегуєй апіїдеп5 ргоїесів тісе апа Теїтеї5 адаїпві мігшепі НІМІ апа НЬМІ іпПшепга А мігизе5. Массіпе 2009; 27, 6512-21).
Так, при застосуванні аденовірусного вектора показано, що триразова імунізація плазмідою (50 мкг), що містить послідовності консервативних білків МР і М2 вірусу грипу А, з подальшим інтраназальним зараженням двома аденовірусними векторами, що експресують ці ж білки, повністю захищала мишей і тхорів від загибелі і втрати ваги при зараженні вірулентним вірусом
А/ЕМ/1/47 (НІМІ) або високопатогенним штамом вірусу грипу птахів серопідтипу Н5М1.
Таким чином, усі перераховані підходи фокусування імунної відповіді відносно консервативних антигенів вірусу грипу підтверджують принципову можливість створення грипозної вакцини, що здатна захищати від зараження різними варіантами вірусу грипу А.
Однак, для досягнення цієї мети використовувалися складні схеми багаторазової вакцинації тварин із застосуванням імунологічних ад'ювантів різної природи. Крім того, жоден із відомих експериментальних препаратів універсальної грипозної вакцини не забезпечував захист від вірусу грипу В. До цього варто додати, що перераховані вище експериментальні препарати вимагають складних технологічних процесів виробництва багатокомпонентних вакцин, пов'язаних із неприйнятно високою вартістю кінцевого препарату.
Відомо, що експресія антигенів у клітинах носової порожнини призводить до індукції системної і локальної респіраторної мукозальної В- і Т-клітинної імунної відповіді. Були здійснені численні спроби використання вірусів грипу як векторів для доставки й експресії сторонніх геномних послідовностей у клітинах респіраторного тракту тварин. Серед 8 геномних фрагментів вірусів грипу А або В тільки М5 геномний фрагмент здатний стабільно утримувати геномні вставки більше 800 нуклеотидів у складі рамки зчитування неструктурного білка М51, без порушення структури віріонів, що утворюються (Кійе! С, бегеїпід 5, Регко В, 5іазакома /,
Вотапома у, УМоїКегзіопег А, Каїїпдег Н, Едогом А. Незсиє ої іпїшеплга мігив ехргез5віпд СЕР тот
Ше М51 геадіпд їтате. Мігоіоду. 2004 дип 20;324(1):67-73. РибМей РМІЮО: 15183054). Більше того: з усіх білків вірусу грипу тільки МО1 білок, що в нормі містить 230-237 амінокислотних залишків, може бути підданий 5095 укороченню з карбоксильного кінця без істотного порушення репродукційної активності вірусу в культурі клітин, курячих ембріонах або у респіраторному тракті тварин (Едогом А, Вгапаї 5, Зегеїіпід 5, Котапома .), Регко В, Каїїпдег О, Сгаззацег А,
АІехапагома С, Каїїпдег Н, Мивіеєг Т. Тгапвіесіапі іпїшеплга А мігивев м/йй Іопу ае!їеїйопв іп Ше М51 ргоїєїп дгому ейісіепЦу іп Мего сеїЇ5. / МігоІ. 1998 Ацйд;72(8):6437-41. РибМей РМІЮ: 9658085;
РирМей Сепігаї РМСІЮ: РМС109801). Таке укорочення М51 білка створює простір для імплементації тривалих уставок чужорідних геномних послідовностей без порушення морфології й основних функцій вірусу, що дозволяє конструювати генетично стабільні вектори.
У зв'язку з цим були отримані грипозні вектори на основі вірусу грипу А, що кодували укорочену рамку зчитування від 80 до 126 амінокислотних залишків М51 білка, що могла бути продовжена вставками послідовностей антигенів різних патогенів бактеріальної і вірусної природи, наприклад послідовності білків мікобактерії туберкульозу, бруцели абортус або вірусу імунодефіциту людини (Табрупом К, Запзубау А, Куауграуєм 7, Мезретрейм В, Кузкеїдіпома 5, 7іпіпа М, Аззап2напома М, Зийапкиома К, Запаурауєм М, КнНаїгиПп В, Кигпеїзома І, Регко В,
Едогом А. ІпПшеплга міга! месіої5 ехргезвіпд Ше Вгисейа ОМРІ6 ог І7/112 ргоївіп5 а5 массіпев5 адаіпві В. аропйивб іпіесіоп. Міго! У. 2014 Арі 10:11:69. дої: 10.1186/1743-422Х-11-69. РибМей
РМІО: 24716528; РирМей Сепіга! РМСІЮ: РМОЗ3997475; БЗегеїпід 5, 5іШКома М, 7ароіоїпуй М,
Ееко В, Кіне! С, Вотапома у, Міподгадома Т, Каїїпдег Н, КізеЇєм О, Едогом А. ІпПшепга мігив М5 месіогз ехргез5віпуд Ше тусобасіевгцт іШрегсціовзів ЕБАТ-6б ргоївїп іпдисе СО4-ТН1 іттипе тевропзе ап ргоїєсі апіта!є адаїп5і їШбрегсціовів спайепде. Сійп Массіпе Іттипої. 2006
Ац9;13(8):898-904. РОБМей РМІЮ: 16893990; РирМей Сепігаї РМСІО: РМС1539114; Режко В,
ЗіазакКома У, 5егеїіпід 5, Вотапома .), Каїїпдег 0, Міерієг В, Каїїпдег Н, Едогом А. Нуреганепиаїеай гесотбріпапі іпбиепла А мігиб5 / попбігисійгаІ-ргоївєїп-епсодіпд месіог5 іпдисе | Питап іттипоавеїсієпсу мігив5 їуре 1 Меї-5ресіїіс зузіетіс апа тисозаї іттипе гезропзез іп тісе. У Мігої. 2001 Осі:;75(19):8899-908. РибМей РМІЮ: 11533153; РибМеа Сепіга! РМСІО: РМС114458). При цьому оптимальними за параметрами репродукції в курячих ембріонах і імуногенності у тварин виявилися конструкції, що несуть М51 білок, укорочений до 124 амінокислотних залишків (далі - вектори М51-124)(Регко В, 5іазакома у, Котапома .), Кійе! С, Зегеїіпід 5, Каїїпдег Н, Едогом А.
Іттиподепісіу апа ргоїесіюп ейісасу ої геріїсайоп-аеїсіепі іпїЯмепга А мігибзе5 м/йй апйегей М51 депев. У Мігї. 2004 ЮОес; 78(23):13037-45. РОБМей РМІО: 15542655; РирМей Сепіга! РМОСІЮ:
РМО524997).
Конструкції з великим укороченням М51 білка мали знижену здатність до росту в інтерферон бо компетентних клітинах (клітини МОСК, А5Б49), включаючи 10-денні курячі ембріони, і були придатні для виробництва тільки в інтерферон-дефіцитних клітинах Мего. З іншого боку, вектори з довжиною М51 у 124-126 амінокислотних залишків варіювали за рівнем атенуації і були недостатньо безпечні у тварин. Наприклад, рівень репродукції вірусних векторів, що несуть у зазначеній позиції мікобактеріальний білок ЕБАТ-б6, у легенях мишей міг досягати значень, близьких до показників патогенних вірусів грипу (107 ї більше вірусних частинок на грам тканини легені). Більше того: вектори М51-124 при заражувальній дозі »5.0 Ісд/мишу могли викликати істотну репродукцію вірусу в легеневій тканині інфікованих мишей і утворення видимої легеневої патології (Едогом А, Вгапаї 5, Зегеїіпід 5, Котапома ., Регко В, Каїіпдег О, Сгаззацег
А, АІехапагома С, Каїїпдег Н, Мивіег Т. Тгапегесіапі іпПшепла А мігизе5 м/ййп Іопду аеїеїйопв іп їе
МО1 ргоївїіп дгом ейПісіепіу іп Мего сеїІв. У Мігоі. 1998 Ацо;72(8):6437-41. РирМей РМІЮ: 9658085;
РибМеа Сепігаї РМСІЮ: РМС109801; 5іиКома МА, Зегевіпід 5, 2ароіоїпуп МУ, Регко В, Кінеї! с,
Вотапома у), Міподгадома ТІ, Каїіпдег Н, Кізеїєм ОЇ, Едогом А. Массіпе роїепіаї! ої іпПшепга месіогв ехрге55іпд Мусобасіегішт іШбрегсціовів ЕБАТ-6 ргоївіп. Тибегсціовів (Едіпр). 2006 Мау-9и1;86(3- 4):236-46. РирМей РМІО: 16677861). Таким чином, грипозні вектори з укороченою рамкою зчитування білка МЗІ1 до 124 амінокислотних залишків не можуть використовуватися для вакцинації людей, оскільки не відповідають параметрам безпеки, розробленим для живих грипозних вакцин, де неодмінною умовою є температурочутливість вірусу (знижена здатність розмножуватися при температурі 39 "С) і відсутність активної репродукції вірусу в нижньому респіраторному тракті тварин (Маахзаб НЕ, Вгуапі МІ. Тпе аемеІортепі ої Іїме абепиагей соїа- адарієд іпЯмепла міги5 массіпе ог питапе. Нем Мей МігоІ. 1999 Осі-Оес;9(4):237-44. Вемієм.
РибМей РМІЮ: 10578119; Сепадоп 1Іш2. (ме соїд-адарієд іпПшепга массіпе: 5іасе-ої-Іпе-апі|. Морг
Мігивої. 2011 дап-Рер;56(1):4-17. Вемієж. Вивзіап. РиОбМейдй РМІО: 21427948; АІеКзапагома а,
Сизпспіпа МІ, Кіїтом АЇ, Іоїом УМ. (Сепеїїс Бавів Тог сопвігисійп ої Пе Іїе іп'їшепга їуре А массіпе ивіпа Тетрегаїшге-зеп5ййме тиїапів|. Мої Сеп Мікгобіо! Мігизої. 1990 Маг (3):3-8. Веміем/. Вивзіап.
РибМей РМІЮ: 2194119; Кепааї! АР. Соїд-адарієд Іме ацепицагїей іпіїшепга массіпе5 демеіореа іп
Вивзвзіа: сап Шеу сопігірше юю тееїпуд Ше пеєдз ог іпПшепла сопігої іп оїег соцпійе5? Єшг У
Еріаетіої. 1997 9и1І;13(5):591-609. Немієж. РибМеа РМІЮ: 9258574).
На відміну від ліцензованих живих грипозних вакцин (УЛЬТРАВАКФ ВАКЦИНА ГРИПОЗНА
АЛАНТОЇСНА ЖИВА (РФ) або РіитівіФ (О5А)), відомі грипозні вектори М51-124 і близькі до них
Зо конструкції не мали фенотипового маркера температурочутливості (15 фенотипу) і мали рівень репродукції в легенях мишей, близький до рівня вірусу дикого типу з повнорозмірним М51 білком.
Спроби використання вірусів грипу з онколітичними цілями починалися ще в 50-60-ті роки
ХХ сторіччя і грунтувалися на спостереженнях практичних лікарів про окремі випадки ремісії ракових захворювань після того, коли перехворіли на грип (Гіпаептапп У, Кієїп РА. Ммігаї опсоїувів: іпстєазед іттиподепісйу ої пові сеПапіїдеп аззосіаївй м/йп іпПнепга мігиб5. У Ехр Мед. 1967 ди! 1;126(1):93-108).
З моменту розробки генно-інженерних методів для вірусу грипу наприкінці 90-х років з'явилася можливість створення онколітичних грипозних векторів із модифікованим М51 білком.
Було показано, що укорочення М51 білка може приводити до посилення онколітичного ефекту при введенні рекомбінантного вірусу в пухлину за рахунок стимуляції системи уродженого імунітету, антагоністом якого є М51 білок (Зішгіап 5, Зігетйлег 5, Ваштап 5, Заспеї М, Моівспек
М, Ашкбзаї? Т, Єдогом А, Вегдтапп М. Епдодепоих ехргеввіоп ої ргоїєазев іп соїоп сапсег сеї
Тасіййатє іпбиепла А мігпизез тедіаїєд опсоїувіз. Сапсег Віо! Тег. 2010 бер 15:10(6):592-9; Одрото Н, Міснавєїї5 М, Сеїйег У, мап Вікхоої М, Мивівг Т, Едогом А, Роеєїт НМУ, Сіпаї! У Ук. Титог сеїї5 іптесіва м/йп опсоїуїс іпПшепга А міги5 ргіте пашгаї КіПег сеїї5 Тог увів ої гезівтапі Штог сеїЇв5.
Меа Місгобіо! Іттипої. 2010 Мау;199(2):93-101. дої: 10.1007/500430-009-0139-0. Ериб 2009 Оес 15. РоОрМей РМІЮ: 20012989; Емнегзоп СІ, Тецаа М, Камапо К, МівіїаІ-МіІап Е, ЗеМПаррап 5, Ми 0,
Миггау УГ,, Сагсіа-Завіге А, Ісаппіде5 Са. Рговіаїе Штог сеїЇ5 іптесієд м/йй а гесотбіпапі іпїшепга міги5 ехргезвіпу а ипсаїєд М51 ргоївїп асіїмаїе суїюїуїс СОВ8 «сеї Юю гесодпіге попіпіесієд Шштог сеїв5. / Мітої. 2006 дап;80(1):383-94).
Більше того: можливість генно-інженерних маніпуляцій із довжиною М51 білка вірусу грипу дозволила створити вектори, ефективність яких підсилювалася наявністю експресії імунопотенціюючого агента, наприклад, інтерлейкіну-15 (мап Нікхоої М, Міспаєїї М, УУоівспек
М, Мивіег Т, Едогом А, бвірей У, Юоєїт НМУ, Сіпаї! У Ук. Опсоїуїсс енесів ої а помеї іпїшепла А міги5 ехргезвіпд іптепейКіп-15 тот їйе М5 геадіпд їтате. Рі о Опе. 2012:7(5):е36506).
На жаль, у цих роботах, використовувалися віруси грипу, здатні до обмеженої репродукції в деяких культурах клітин, що не мають необхідної генетичної стабільності трансгена для широкомасштабного виробництва в курячих ембріонах - субстраті оптимальному для 60 напрацювання грипозних вакцинних препаратів.
Таким чином, зберігається потреба в нових ефективних вірусних векторах, зокрема, атенуйованих грипозних векторах, що характеризуються відсутністю активної репродукції вірусу в організмах тварин і мають фенотип температурочутливості, що можуть бути використані для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань.
Розкриття винаходу
Даний винахід стосується атенуйованого вірусу грипу А, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусу грипу А і В, що містить химерний М5 фрагмент, що включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, яка походить від підтипу вірусу грипу А, що відрізняється від підтипу зазначеного атенуйованого вірусу грипу А.
Зокрема, даний винахід стосується атенуйованого вірусу грипу А, у якому зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М51 розміром 80-130 амінокислотних залишків, більш переважно, у якому зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки.
Один із варіантів здійснення даного винаходу стосується атенуйованого вірусу грипу А, у якому зазначена укорочена рамка зчитування білка М51 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу Н2М2.
Ще один варіант здійснення даного винаходу стосується атенуйованого вірусу грипу А, який містить химерний Ме фрагмент, що включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, причому зазначена укорочена рамка зчитування білка М5О1 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу Н2М2, і де зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок
М51 розміром 124 амінокислотні залишки.
Винахід стосується також атенуйованого грипозного вектора, який експресує білок або його фрагмент, вибраний із групи, яка складається з білків або їхніх фрагментів бактерій, вірусів або найпростіших, що являє собою атенуйований вірус грипу А за винаходом, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності щонайменше одного трансгена, який кодує білок або його фрагмент бактерій, вірусів або найпростіших.
Один із варіантів здійснення винаходу стосується атенуйованого грипозного вектора, який
Зо експресує білок або його фрагмент, що вибрані з групи, яка складається з білків вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу герпесу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії, хламідій, збудника бруцельозу або їхніх комбінацій.
Наступним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, який експресує білок або його фрагмент патогенних бактерій, вірусів або найпростіших, де розмір зазначеного білка або його фрагмента становить від 10 до 400 амінокислот.
Ще одним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, у якому вставка кодує ділянку білка НА вірусу грипу, переважно, де ділянка більа НА являє собою ділянку субодиниці НА2, вибрана із групи, яка складається з 1-185 а.к. з вірусу грипу А, 1-186 а.к. з вірусу грипу В, 23-185 а.к. з вірусу грипу А або 65-222 а.к. з вірусу грипу А.
Наступним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, у якому вставка кодує послідовність ділянки субодиниці НА2 вірусу грипу А або вірусу грипу В від 1 до 21 а.к. і послідовність ділянки білка МР вірусу грипу А від 243 до 251 а.к.
Ще одним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, де вставка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ-6, А985А, Аде5В, Мріба, НерхХ, МІБВВ.4 або 10.4 або їхні фрагменти, зокрема, де геномна послідовність вірусу додатково містить послідовність, що кодує 2А-пептид, який саморозщеплюється, між послідовностями, що кодують М51-124 і ЕБАТб.
Винахід також стосується атенуйованого грипозного вектора, який експресує білок або його фрагмент вірусу грипу, що являє собою атенуйований вірус грипу А, який містить химерний М5 фрагмент, що включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, причому зазначена укорочена рамка зчитування білка М5О1 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу
Н2Ма, і де зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує 1-21 а.к. білка НА2 вірусу грипу В і 243-251 а.к. білка МР вірусу грипу А.
Іншим об'єктом винаходу є атенуйований грипозний вектор, який має онколітичну активність, що являє собою атенуйований вірус грипу А за винаходом, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності щонайменше одного трансгена, який кодує білок або його фрагмент бактерій, вірусів або найпростіших. бо Одним із варіантів здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, що має онколітичну активність, у якому вставка кодує білок або його фрагмент, вибрані з групи, яка складається з білків або їхніх фрагментів вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу герпесу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії, хламідій або їхніх комбінацій.
Наступним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, що має онколітичну активність, де розмір кодованого білка або його фрагмента становить від 10 до 400 амінокислот.
Переважним варіантом здійснення винаходу є атенуйований грипозний вектор, що має онколітичну активність, де вставка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ-6, Аа85А, А9858В,
Мріб4, НерХ, МІВВ8.4 або 10.4 або їхні фрагменти, зокрема, де укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ- б, ще більш переважно, де укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує 2А-пептид, що саморозщеплюється, і послідовності, яка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕЗАТ-6.
Об'єктом винаходу також є атенуйований грипозний вектор, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусів грипу А і В, що містить: нуклеотидну послідовність гена білка РВ2, яка походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність яка має щонайменше 95595 ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка РВ2; нуклеотидну послідовність гена білка РВІ, яка походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність яка має щонайменше 95595 ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка РВ1; нуклеотидну послідовність гена білка РА, яка походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність яка має щонайменше 95595 ідентичності зазначеної послідовності білка РА; нуклеотидну послідовність гена білка МР, яка походить від вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність яка має щонайменше 95595 ідентичності зазначеної послідовності білка МР;
Зо нуклеотидну послідовність гена білка М, яка походить від вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 ідентичності зазначеної послідовності гена білка М; нуклеотидну послідовність гена білка НА, яка походить від вірусу грипу А/Саїйогпіа/7/09-ІїкКе (НІМІрат), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка НА; нуклеотидну послідовність гена білка МА, яка походить від вірусу грипу А/Саїйогпіа/7/09-ІїкКе (НІМІрат), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка МА; і нуклеотидну послідовність химерного гена білка М5, що включає рамку зчитування білка МЗ1, що походить від вірусу А/РК/8/34 (НІМІ), де зазначена рамка зчитування є укороченою і кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки, і послідовність гена білка Мер, яка походить від вірусу грипу А/5іпдароге/1/57-ІКе (Н2М2), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 9595 ідентичності зазначеної послідовності химерного гена М5; де зазначена укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою нуклеотидної послідовності, яка кодує пептид злиття субодиниці НА2 від вірусу грипу В, і нуклеотидної послідовності, яка кодує консервативний В-клітинний епітоп нуклеопротеїну (МР) вірусу грипу А. У приватному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність химерного гена
БО білка М5 представлена в 5ЕО ІЮ МО: 21.
Ще одним об'єктом даного винаходу є фармацевтична композиція для лікування і/або профілактики інфекційного захворювання в суб'єкта, яка містить в ефективній кількості атенуйований вірус грипу А за винаходом або атенуйований грипозний вектор за винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Також об'єктом винаходу є фармацевтична композиція для профілактики грипу, що містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Зокрема, фармацевтична композиція за винаходом містить 6,5-10,5 од БІД 50/мл атенуйованого грипозного вектора і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 96 моновалентної 60 солі, 0-5 мас. 956 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. 96 вуглеводного компонента, 0-2 мас. 9о білкового компонента, 0-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
Переважним варіантом винаходу є фармацевтична композиція, де буферний розчин містить 0,5-1,5 мас.9о5 моновалентної солі, 0,01-5 мас.95 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. о вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 96 білкового компонента, 0,01-2 мас. 96 амінокислотного компонента і 1-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю, переважно, де моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою сахарозу, трегалозу або лактозу, білюовий компонент являє собою людський альбумін, казитон, гідролізат лактальбуміну або желатин, амінокислотний компонент являє собою аргінін, гліцин або глутамат натрію, і імідазоловмісна сполука являє собою і-карнозин або М, М'-біс(2-(1Н-імідазол-5-іл)етил|- пропандіамід.
Ще одним варіантом здійснення винаходу є фармацевтична композиція для лікування і/або профілактики інфекційного захворювання, де інфекційне захворювання викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми, лейшманії або збудника бруцельозу. У переважному варіанті здійснення винаходу суб'єкт являє собою ссавця або птаха, зокрема, суб'єкт являє собою людину.
Винахід також стосується вакцини проти інфекційного захворювання, яка містить в ефективній кількості атенуйований вірус грипу А за винаходом або атенуйований грипозний вектор за винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Ще одним об'єктом даного винаходу є вакцина проти грипу, яка містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Зокрема, вакцина за винаходом містить 6,5-10,5 Ід ЕЇД 50/мл атенуйованого грипозного вектора і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас.95 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. вуглеводного компонента, 0-2 мабс.95 білкового компонента, 0-2 мас.9о амінокислотного компонента і 0-10 мас.9о гідроксіетилованого крохмалю.
Ще одним варіантом винаходу є вакцина, у якій буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 95 моновалентної солі, 0,01-5 мас.9о імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас.9о вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 95 білкового компонента, 0,01-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 1- 10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю. У переважному варіанті здійснення в зазначеному буферному розчині моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою сахарозу, трегалозу або лактозу, білюоовий компонент являє собою людський рекомбінантний альбумін, казитон, гідролізат лактальбуміну або желатин, амінокислотний компонент являє собою аргінін, гліцин або глутамат натрію, і імідазоловмісна сполука являє собою І -карнозин або М, М'-біс(2-(1Н-імідазол-5-іл)етил|-пропандіамід.
Один із варіантів здійснення винаходу стосується вакцини проти інфекційного захворювання, де інфекційне захворювання викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 112 типів, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми, лейшманії або збудника бруцельозу.
Винахід також стосується застосування атенуйованого вірусу грипу А за винаходом, атенуйованого грипозного вектора за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань у суб'єкта, зокрема, для лікування і/або профілактики захворювання, викликаного патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-синцитіального вірусу і вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми, лейшманії або збудника бруцельозу. У переважному варіанті здійснення винаходу суб'єкт являє собою ссавця або птаха, зокрема, суб'єкт являє собою людину.
Ще одним об'єктом даного винаходу є застосування атенуйованого грипозного вектора або фармацевтичної композиції за винаходом для профілактики грипу в суб'єкта.
Винахід також стосується способу лікування і/або профілактики інфекційного захворювання в суб'єкта, який потребує цього, що включає введення в ефективній кількості атенуйованого вірусу грипу А за винаходом, атенуйованого грипозного вектора за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом зазначеному суб'єкту, переважно способу лікування захворювання, яке викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, бо вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-
синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії або збудника бруцельозу. У переважному варіанті здійснення винаходу суб'єкт являє собою ссавця або птаха, зокрема, суб'єкт являє собою людину.
Наступним об'єктом винаходу є фармацевтична композиція для лікування онкологічних захворювань у суб'єкта, яка містить атенуйований вірус грипу А за винаходом або атенуйований вектор за винаходом в ефективній кількості і фармацевтично прийнятний носій.
Одним із варіантів здійснення винаходу є фармацевтична композиція, яка містить 8,5-10,5 од ЕІД 50/мл атенуйованого вірусу грипу А за винаходом або атенуйованого грипозного вектора за винаходом і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 96 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. вуглеводного компонента, 0-2 мабс.95 білкового компонента, 0-2 956 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю, причому в переважному варіанті здійснення винаходу буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 95 розчину моновалентної солі, 0,01-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. 96 вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 95 білкового компонента, 0,01-2 95 амінокислотного компонента і 1-10 мас. до гідроксіетилованого крохмалю.
Іншим варіантом здійснення є фармацевтична композиція, у якій у буферному розчині моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою крохмаль, білковий компонент являє собою людський альбумін, амінокислотний компонент являє собою аргінін, і імідазоловмісна сполука являє собою І-карнозин або М, М'-біс(2-(1Н-імідазол-5- іл)етил|-пропандіамід.
Наступним об'єктом даного винаходу є застосування атенуйованого вектора за винаходом, атенуйованого грипозного вектора за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом для лікування онкологічних захворювань у суб'єкта, зокрема, захворювань, вибраних із групи, яка складається з колоректального раку, кардіоезофагеального раку, панкреатичного раку, холангіоцелюлярного раку, гліоми, гліобластоми і меланоми. У переважному варіанті здійснення винаходу суб'єкт являє собою людину.
Даний винахід також стосується способу лікування онкологічних захворювань у суб'єкта, який потребує цього, що включає введення в ефективній кількості атенуйованого вірусу грипу А за винаходом, атенуйованого грипозного вектора за винаходом або фармацевтичної композиції
Зо за винаходом, переважно, способу лікування онкологічного захворювання, вибраного з групи, яка складається з колоректального раку, кардіоезофагеального раку, панкреатичного раку, холангіоцелюлярного раку, гліоми, гліобластоми і меланоми.
В одному з варіантів здійснення винаходу зазначене введення являє собою внутрішньопухлинне введення, введення в лакуну, що утворилася після хірургічного видалення пухлини, або внутрішньовенне введення.
Технічним результатом даного винаходу є одержання химерних вірусів грипу за М5 геномним фрагментом і відповідних грипозних векторів, які мають високу безпеку для людей і тварин, зокрема, векторів, що характеризуються відсутністю активної репродукції вірусу в організмі тварини й мають фенотип температурочутливості, і які можуть бути використані для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань. Також технічним результатом даного винаходу є одержання химерного за М5 геномним фрагментом грипозного вектора, що має властивості універсальної грипозної вакцини при мукозальному введенні за відсутності ад'ювантів. Крім того, технічним результатом є високий потенціал росту отриманих вірусів грипу і грипозних векторів у 10-денних курячих ембріонах. Ще одним технічним результатом є одержання грипозних векторів, які мають властивості універсальної грипозної вакцини. Також технічним результатом є одержання вірусів грипу і грипозних векторів, які мають онколітичну активність. Ще одним технічним результатом є зниження вартості виробництва вакцини проти грипу через невикористання ад'ювантів.
Короткий опис креслень
На Фіг.1 показаний принцип конструювання грипозного атенуйованого вектора. В А представлена схема М5 геномного фрагмента вірусу грипу А/РК/8/34 (НІ1МІ1). У Б представлена схема генетично модифікованого химерного МО геномного фрагмента, де рамка зчитування білка М51 укорочена і може продовжуватися вставкою чужорідної послідовності. Послідовність, що кодує білок Мер, замінена на гетерологічну від іншого підтипу вірусу грипу А.
На Фіг. 2 представлені нуклеотидні послідовності геномних М5 фрагментів вірусу дикого типу і приклади двох генетичних конструкцій химерної природи. В А представлений М5 фрагмент вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМ1). У Б представлений химерний М5 фрагмент вірусу грипу А, де рамка зчитування білка М51 укорочена, а послідовність Мер, виділена жирним шрифтом, запозичена від вірусу А/Зіпдароге/1/57 (Н2М2). бо У В представлений химерний М5 фрагмент вірусу грипу А, де рамка зчитування білка М51 укорочена, а послідовність Мер, виділена жирним шрифтом, запозичена від вірусу
АЛ епіпогаа/л1 34/47/57 (Н2М2).
На Фіг. З представлені амінокислотні послідовності білків, трансльованих у рамці зчитування
М51 химерних грипозних векторів, що містять гетерологічний Мер від вірусу
АЛ епіпоагаа/134/47/57 (Н2М2).
На Фіг.4 представлені дані, які демонструють патогенність і ї5-фенотип вірусів із гетерологічним Мер геном. В А показані дані репродукції вірусів при оптимальній 34 "с і підвищеній 39 С температурі в клітинах Мего. У Б представлені дані репродукції вірусів у легенях мишей на 2-у добу після зараження.
На Фіг. 5 наведені графіки, що демонструють захисний ефект одноразової імунізації мишей векторами, які експресують частини субодиниці НА? з рамки зчитування білка М51, при контрольному зараженні гетерологічними патогенними штамами вірусу грипу. В А показана летальність при контрольному зараженні вірусом А/Міз5і55іррі/85/1 (НЗМ2), у В - летальність при контрольному зараженні вірусом У/ І ее/40.
На Фіг.б представлені дані з онколітичної дії рекомбінантних вірусів грипу відносно меланоми мишей, індукованої введенням 1х106 клітин В1б у стопу задньої лапи. Терапія проводилася шляхом внутрішньопухлинного введення вірусу на 5 день після імплементації пухлини. В А представлений середній розмір стопи на 20 день після імплементації пухлини і 4- кратної терапії онколітичними векторами, у Б - виживаність мишей після проведеної 4-кратної терапії онколітичними векторами.
На Фіг. 7 показана структура грипозного атенуйованого вектора. Позначені 8 фрагментів геному вірусу і їхні особливості.
Показано, що фрагменти геному РВ2, РВІ, РА, Мр і М мають походження від вірусу
А/РЕ/8/34 (НІМ1); гени поверхневих глікопротеїнів НА і МА мають походження від вірусу
А/Саїйогпіа/7/09-їКе (НІМІТрат); М5 геномний фрагмент має химерну структуру, що кодує два білки: 1) укорочений до 124 амінокислотних залишків білок М51, продовжений вставкою послідовності М-термінальної області НА2 вірусу грипу В і вставкою консервативного В- клітинного епітопу МР білка вірусу грипу А, 2) білок Мер, що має послідовність від гетерологічного штаму вірусу грипу А, серопідтипу Н2М2 А/5іпдароге/1/57-ІїКе.
Зо На Фіг. 8 представлені нуклеотидні послідовності геномних фрагментів вакцинного вектора:
РВ2, РВІ, РА, МР, М - що мають походження від вірусу А/РК/8/34 (НІМІ); НА їі МА, що мають походження від вірусу А/Саїйогпіа/7/09-іКе (НІМІрат); химерного М5 (вставка в рамці зчитування М51 виділена жирним шрифтом).
На Фіг. 9 представлені результати, що відображають протективні властивості вакцинного вектора після інтраназальної імунізації мишей відносно різних варіантів вірусу грипу А і вірусу грипу В. На графіках показаний 96 летальності у вакцинованих мишей після контрольного зараження вказаними серопідтипами вірусу грипу А або вірусом грипу В порівняно з контрольними тваринами. Вакцина вводилася одноразово - їх або дворазово - 2х.
На Фіг. 10 представлені дані, які демонструють протективні властивості вакцинного вектора після інтраназальної імунізації тхорів. На графіку А представлена динаміка середнього значення температурних коливань після контрольного зараження вірусом А/5І.Регегзриго/224/2015 (НЗМ2) у вакцинованих і контрольних тварин. На графіку В представлені результати висівання контрольного вірусу з носових змивів тхорів на 2, 4 і 6 день після зараження. Титри виражені у вигляді середнього значення концентрації вірусу в носових змивах, виражених у вигляді значення 50 9о цитопатичних доз/мл після титрування на клітинах МОСК. Вакцина вводилася одноразово - їх або дворазово - 2х.
Докладний опис винаходу
Даний винахід стосується отриманих генно-інженерними методами атенуйованих вірусів грипу А, які можуть застосовуватися для лікування і/або профілактики інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань.
Зокрема, даний винахід стосується атенуйованого вірусу грипу А, який індукує крос- протективну відповідь проти вірусу грипу А і В, що містить химерний Ме фрагмент, який включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, яка походить від підтипу вірусу грипу А, що відрізняється від підтипу зазначеного атенуйованого вірусу грипу А. Таким чином, підтип вірусу А для послідовності, яка кодує укорочений білок М51, відрізняється від підтипу вірусу А, з якого отримано послідовність, яка кодує білок Мер. Зокрема, один із варіантів здійснення даного винаходу стосується атенуйованого вірусу грипу А, у якому зазначена укорочена рамка зчитування білка М51 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу від Н2 до НІ18 60 людського або тваринного походження.
Зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М51 розміром 80-130 амінокислотних залишків, більш переважно, зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки.
Даний винахід оснований зокрема на тому, що автори несподівано виявили, що проблема недостатньої атенуації (відсутність температурочутливості і високий рівень репродукції в легенях мишей) грипозних векторів, зокрема вектора М51-124, може бути вирішена з допомогою модифікації другого сплайсованого білкового продукту МО геномного фрагмента вірусу грипу - білка Мер (М52). Виявилося, що заміна геномної послідовності Мер вірусу грипу А, зокрема, вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМ1), на послідовності Мер, взяті від гетерологічних штамів вірусу грипу, наприклад, вірусу А/Зіпдароге/1/57 (Н2М2) або АЛ епіпдгад/1 34/47/57 (Н2М2), приводить до появи у штаму грипу А, зокрема А/РК/8/34 (НІ1М1), фенотипу температурочутливості й атенуації. Використовуючи цей феномен, були сконструйовані химерні М5-фрагменти вірусу грипу, які кодують укорочену рамку зчитування М51-124 від вірусу А/РЕ/8/34 (НІМІ) у комбінації з рамкою зчитування білка Мер, взятої від вірусу серопідтипу Н2М2. Реасортантні віруси грипу на основі вірусу А/РК/8/34, незалежно від походження поверхневих антигенів НІМІ, НЬМ1 або
НІМІрат, що несуть химерний МО геномний фрагмент, виявилися нездатними до активної репродукції при 39 С і в легенях мишей (фенотип атенуації), але при цьому як і раніше репродукувалися до високих титрів у 10-денних курячих ембріонах.
Даний винахід стосується також атенуйованого грипозного вектора, який експресує антиген або його фрагмент, вибраний із групи, яка складається з антигенів або їхніх фрагментів бактерій, вірусів або найпростіших, що містить атенуйований вірус грипу А згідно із даним винаходом, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності щонайменше одного трансгена, який кодує антиген або його фрагмент бактерій, вірусів або найпростіших. Загалом, в атенуйований вірус згідно із даним винаходом може бути вставлений трансген, що кодує білок або його фрагмент із будь-яких бактерій, вірусів або найпростіших, як патогенних, так і непатогенних відносно тварин і людей, зокрема, білок може бути вибраний із групи, яка складається з білків або їхніх фрагментів вірусу грипу А, вірусу грипу
В, мікобактерії туберкульозу, бруцели абортус, вірусу герпесу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії, хламідій, збудника бруцельозу або їхніх комбінацій. Зокрема, послідовність вставки може кодувати ділянку білка НА вірусу грипу, білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ-6, АдВБА, Ада5В, Мріб4, НерХ, МІБ8.4 або 10.4 або їхні фрагменти. При цьому геномна послідовність атенуйованого вектора згідно із даним винаходом може додатково містити послідовність, яка кодує 2А-пептид, що саморозщеплюється, між послідовностями, які кодують М51-124 і ЕБАТб.
Розмір антигену або його фрагмента, кодованого послідовністю вставки, може мати будь- який розмір, що обмежений лише здатністю геномного фрагмента "приймати" нуклеотидну послідовність, яка кодує антиген або його фрагмент. Переважно, розмір антигену становить від 10 до 400 амінокислот. Наприклад, вставка може кодувати ділянку білка НА, що являє собою ділянку субодиниці НА2, вибрану із групи, яка складається з 1-185 амінокислот із вірусу грипу А, 1-186 амінокислот із вірусу грипу В, 23-185 амінокислот із вірусу грипу А або 65-222 амінокислот із вірусу грипу А. Нумерація амінокислот дана відповідно до положень амінокислот у ділянці субодиниці НА2 вірусу грипу, з якого походить трансген.
Ще одним приватним випадком атенуйованого грипозного вектора згідно із даним винаходом є вектор, у якому вставка кодує послідовність ділянки субодиниці НА?2 вірусу грипу А або вірусу грипу В від 1 до 21 амінокислоти і послідовність ділянки білка МР вірусу грипу А від 243 до 251 амінокислоти. Несподівано було виявлено, що ці варіанти векторів, незважаючи на коротку тривалість вставки, виявили найкращу захисну ефективність відносно вірусу грипу В і гетерологічних антигенних підтипів вірусу грипу А, після одноразової імунізації мишей, тобто виявляли властивості універсальної грипозної вакцини.
Автори виявили, що вставки чужорідних антигенних послідовностей у рамку зчитування білка М51, наприклад, після амінокислотної позиції 124 не здійснювали істотного впливу на фенотип атенуації химерного вірусу, отриманого згідно із даним винаходом. Таким чином, були отримані різноманітні грипозні вектори, які мають необхідні виробничі характеристики і виражені фенотипові і генотипові маркери атенуації відповідно до вимог, пропонованих до живих грипозних вакцин. Незалежно від природи вставок, віруси показали свою нешкідливість для лабораторних тварин і схожість прояву фенотипового маркера атенуації - наявність і5 фенотипу. Спільність їхніх генетичних маркерів атенуації визначалася наявністю укороченої рамки зчитування білка М51 і наявністю гетерологічної послідовності гена Мер, взятої від іншого бо субтипу вірусу грипу А. Залежно від вставки, отримані вектори виявляли властивості універсальної грипозної вакцини, вакцини проти туберкульозу, т. д.
Зокрема, даний винахід стосується отриманого генно-інженерним методом вакцинного вектора на основі вірусу грипу А, який може застосовуватися для профілактики грипу, викликаного усіма відомими штамами, включаючи віруси грипу А і В. Більш конкретно, даний винахід стосується атенуйованого вірусу грипу А, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусу грипу А і В, що містить химерний М5 фрагмент, який включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, яка походить від підтипу вірусу грипу А Н2М2. Таким чином, підтип вірусу А для послідовності, яка кодує укорочений білок М51, відрізняється від підтипу вірусу А, з якого отримана послідовність, яка кодує білок
Мер. Зокрема, у вакцинному векторі укорочена рамка зчитування білка М51 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу від Н2М2.
В одному з варіантів здійснення, даний винахід стосується атенуйованого грипозного вектора, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусів грипу А і В, що містить: нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок РВ2, що походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка РВ2; нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок РВІ1, що походить від вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка РВІ1; нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок РА, що походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної послідовності білка РА; нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок МР, що походить від вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної послідовності білка МР; нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок М, що походить від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної послідовності гена білка М;
Зо нуклеотидну послідовність гена, яка кодує білок НА, що походить від вірусу грипу
А/Саїйогпіа/7/09-ІїКке (НІМІТрат), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка НА; нуклеотидну послідовності гена, яка кодує білок МА, що походить від вірусу грипу
А/Саїйогпіа/7/09-ІїКке (НІМІТрат), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної нуклеотидної послідовності гена білка МА; і нуклеотидну послідовність химерного гена білка М5, що включає рамку зчитування білка МО1, що походить від вірусу А/РЕ/8/34 (НІМІ), де зазначена рамка зчитування є укороченою і кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки, і послідовність гена білка Мер, яка походить від вірусу грипу А/5іпдароге/1/57-ІКе (Н2М2), або нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 95 95 або більше (наприклад, 96, 97, 98 або 99 95) ідентичності зазначеної послідовності химерного гена М5; де зазначена укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою нуклеотидної послідовності, що кодує пептид злиття субодиниці НА2 від вірусу грипу В, і нуклеотидної послідовності, що кодує консервативний В-клітинний епітоп нуклеопротеїну (МР) вірусу грипу А.
Зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок М5З1 розміром 124 амінокислотні залишки, який продовжений двома гліцинами, вставкою М-термінальної області другої субодиниці гемаглютиніну НА? вірусу грипу В (23 амінокислотні залишки) і вставкою послідовності консервативного В клітинного епітопу вірусу грипу А (7 амінокислотних залишків).
Гени поверхневих глікопротеїнів зазначеного вектора походять від вірусу грипу
А/Саїїгогпіа/7/09 (НІМІрат). Гени внутрішніх білків РВ2, РВІ, РА, МР ї М походять від вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ). Таким чином, грипозний вектор за винаходом являє собою складну генетичну конструкцію, яка складається з геномних послідовностей різних штамів вірусу грипу, а саме: 1) гени, які кодують РВ2, РВІ, РА, МР і М, мають походження від вірусу А/РК/8/34 (Н1ТМ1) (РВ2 (Сепрапк ассезвзіоп питбрег: АВб671295), РВІ (Сепрапк ассезвзіоп питрег: СМО33583), РА (СепрапкК ассезвзіоп питбег: АЕ389117), МР (СепрапкК ассеззіоп питбрег: АЕ389119), М (депрапк бо ассеззіоп питбрег: АЕЗ389121)), 2) гени, що кодують НА і МА, мають походження від вірусу
А/Саїйогпіа/7/09-ІїКке (НІМІТрат) (НА (СепВапк: КМ408964.1) і (МА СепВапк: КМ408965.1), 3) ген
М5 має химерну природу, де рамка зчитування білка М51 від вірусу А/РК/8/34 (Н1ТМІ1) укорочена до 124 амінокислотних залишків і продовжена вставкою послідовності, яка кодує пептид злиття субодиниці НА2 від вірусу грипу В, і послідовності, яка кодує консервативний В-клітинний епітоп нуклеопротеїну (МР) вірусу грипу А, а рамка зчитування білка МЕР походить від вірусу грипу підтипу Н2М2.
Даний винахід оснований зокрема на тому, що автори несподівано виявили, що вектор із зазначеною структурою при інтраназальній імунізації мишей і тхорів без застосування ад'ювантів викликає захист тварин від контрольного зараження не тільки вірусами грипу А (НІМІ), а й вірусами грипу А (НЗМ2) і грипу В. Отже, вакцинний вектор має властивості універсальної грипозної вакцини.
Термін "універсальна вакцина" у контексті даного винаходу означає вакцину, здатну захищати від усіх відомих і невідомих варіантів вірусу грипу. Звичайні "сезонні вакцини" захищають тільки від вірусів, подібних до тих вірусів, що входять до їхнього складу.
Термін "мукозальна вакцина" означає, що вакцину можна вводити в порожнини респіраторного і травного тракту та наносити на слизуваті оболонки рота і носа, тобто застосовувати інтраназально, перорально, під'язиково.
Грипозний вектор на основі вірусу А/РК/8/34, що несе химерний МЗ5 геномний фрагмент, виявився нездатним до активної репродукції при 39 "С і в легенях мишей (фенотип атенуації), але при цьому як і раніше репродукувався до високих титрів у 10-денних курячих ембріонах.
Даний винахід стосується також атенуйованого грипозного вектора, який має онколітичну активність, що містить атенуйований вірус грипу А згідно із даним винаходом, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності щонайменше одного трансгена, який кодує антиген або його фрагмент патогенних бактерій, вірусів або найпростіших. Зазначений антиген може походити з будь-яких бактерій, вірусів або найпростіших, патогенних відносно тварин, зокрема, антиген може бути вибраний із групи, яка складається з антигенів вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу герпесу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії, хламідій або їхніх комбінацій. Зокрема, вставлений трансген може кодувати білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ-6, Ад8В5А, А9д858,
Мріб4, НерхХ, МІБВВ8.4 або 10.4 або їхні фрагменти, додатково, укорочена рамка зчитування гена білка М51 може бути продовжена вставкою послідовності, яка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕЗАТ-6.
Розмір антигену або його фрагмента, кодованого послідовністю вставки, може мати будь- який розмір, що обмежений лише здатністю геномного М5 фрагмента "приймати" нуклеотидну послідовність, яка кодує антиген або його фрагмент. Переважно, розмір антигену становить від 10 до 400 амінокислот.
Автори несподівано виявили, що атенуйовані грипозні вектори, які несуть химерний М5 геномний фрагмент за рахунок включення гетерологічного Мер гена, мають підвищену онколітичну активність за умови експресії антигену патогену, зокрема, бактеріального антигену з рамки зчитування білка М51. Наприклад, вірусний вектор, який кодує білок Е5ЗАТ6Є мікобактерії туберкульозу, мав більш високу активність, порівняно з відомим рекомбінантним вірусом з укороченим М51 білком, але без вставки. Не прив'язуючись до якої-небудь теорії, можна припустити, що наявність у ссавців напруженого протитуберкульозного імунітету робить внесок в імунну атаку пухлини, зараженої вірусом, що експресує туберкульозний білок.
Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять в ефективній кількості атенуйований вірус грипу А згідно із даним винаходом або атенуйований грипозний вектор згідно із даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції згідно із даним винаходом призначені для лікування і/або профілактики інфекційного захворювання в суб'єкта, зокрема, інфекційного захворювання, яке викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми або лейшманії.
Крім того, фармацевтичні композиції згідно із даним винаходом призначені для лікування онкологічних захворювань різної етіології, зокрема, онкологічне захворювання може бути вибране з групи, яка складається з колоректального раку, кардіоезофагеального раку, панкреатичного раку, холангіоцелюлярного раку, гліоми, гліобластоми і меланоми.
Фармацевтична композиція згідно із даним винаходом може бути складена у вигляді бо вакцини, що містить в ефективній кількості атенуйований вірус грипу А згідно із даним винаходом або атенуйований грипозний вектор згідно із даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Термін "суб'єкт" або "тварина" у контексті даного опису означає хребетних, які піддані інфекції, що викликається патогенними бактеріями, вірусами або найпростішими, включаючи птахів (водоплавні, кури і т. д.) і представників різних видів ссавців, таких як собачі, котячі, вовки, тхори, гризуни (щури, миші і т. д.), коні, корови, вівці, кози, свині і примати. В одному з варіантів здійснення винаходу суб'єкт являє собою людину.
Під "ефективною кількістю" мається на увазі така кількість вірусу або вектора, що при введенні суб'єкту, в одноразовій дозі або як частини циклу лікування, є ефективною для лікування і/або профілактики з одержанням терапевтичного результату. Ця кількість може варіюватися залежно від стану здоров'я і фізичного стану пацієнта, віку, таксономічної групи індивіда, що піддається лікуванню, препаративної форми, оцінки медичної ситуації лікуючим лікарем і іншими важливими факторами. Вважають, що кількість може варіювати у відносно широкому діапазоні, що фахівець у даній галузі може визначити стандартними способами.
Фармацевтична композиція може містити 6-10,5 І0д ЕІД 50/мл, більш конкретно, 6,5-10,5 Ід БІД 50/мл, зокрема, 6-9,5 Ід ЕІД 50/мл, більш конкретно, 6,5-8,5 Ід ЕЇД 50/мл химерного вірусу грипу А відповідно до винаходу або грипозного вектора відповідно до винаходу.
Термін "фармацевтично прийнятний носій" у контексті даного винаходу означає будь-який носій, використовуваний у даній галузі, зокрема, воду, фізіологічний розчин, буферний розчин і т. п. В одному з варіантів здійснення фармацевтично прийнятний носій являє собою буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 95 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. 96 вуглеводного компонента, 0-2 мас. 95 білкового компонента, 0-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю, переважно, зазначений буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 95 моновалентної солі, 0,01-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. У вуглеводного компонента, 0,1-2 мас.95 білкового компонента, 0,01-2 мас. о амінокислотного компонента і 1-10 мас.95 гідроксіетилованого крохмалю, у найбільш переважному варіанті, моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою сахарозу, трегалозу або лактозу, білюоовий компонент являє собою людський альбумін, казитон, гідролізат лактальбуміну або желатин, амінокислотний компонент являє
Зо собою аргінін, гліцин або глутамат натрію.
Імідазоловмісна сполука являє собою І-карнозин або М, М'-біс(2-(1Н-імідазол-5-іл)етил|- пропандіамід, що має формулу:
М
СА
-
МН МН М
НН.
Людський альбумін може являти собою рекомбінантний альбумін або донорський альбумін.
Даний винахід стосується також застосування атенуйованого вірусу грипу А, атенуйованого грипозного вектора або фармацевтичної композиції згідно із даним винаходом для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань у суб'єкта, зокрема, інфекційного захворювання, яке викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно- синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми або лейшманії.
Даний винахід стосується також застосування атенуйованого грипозного вектора або фармацевтичної композиції згідно із даним винаходом для профілактики грипу.
Додатково, даний винахід також стосується способів лікування, у яких для введення суб'єкту використовують атенуйований вірус грипу А, атенуйований грипозний вектор або фармацевтичну композицію згідно із даним винаходом. Способи призначені для лікування і/або профілактики інфекційних захворювань, що викликаються патогенними вірусами, бактеріями або найпростішими, зокрема, інфекційних захворювань, які викликаються патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми або лейшманії.
Крім того, способи призначені для лікування онкологічних захворювань у суб'єкта, зокрема, онкологічне захворювання може бути вибране з групи, яка складається з колоректального раку, кардіоезофагеального раку, панкреатичного раку, холангіоцелюлярного раку, гліоми, гліобластоми і меланоми.
Введення суб'єкту може здійснюватися будь-якими стандартними методами, зокрема, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, перорально, сублінгвально, інгаляційно або інтраназально. Грипозний вектор або фармацевтичну композицію можна вводити суб'єкту один, два або більше разів, переважним є одноразове введення.
Додатково, у випадку лікування онкологічних захворювань введення може являти собою внутрішньопухлинне введення, введення в лакуну, що утворилася після хірургічного видалення пухлини, або внутрішньовенне введення.
Далі винахід проілюстрований прикладами здійснення, які не обмежують обсяг винаходу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Одержання грипозних векторів із модифікованим М5 геномним фрагментом
Збирання рекомбінантних вірусів здійснювалося в кілька етапів. На першому етапі синтетичним шляхом були отримані комплементарні ДНК (кДНК) копії усіх восьми геномних фрагментів вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ), використовуючи дані генетичного банку (рРНМУ-РАВ8-
НА (Сепрапк ассевзвіоп питрег ЕР467821.1), рНУУ-РА8-МА (Сепрапк ассевзвіоп питрбег:
АгЕЗ389120.1), рНМУ-РА8-РВ2 (Сепрапк ассезвзіоп питбег: АВб671295), рНМУ-РА8-РВІ (Сепрапк ассеввіоп питрег: СУО33583), РНУУ-РА8-РА (Сепрапк ассевзвіоп питбрег: АЕЗ389117), рНМу-РАВ8-
МР (Сепбапк ассезвіоп питбрег: АЕ389119), рНМуУ-РАВ8-М (Сепбапк ассезвіоп питбрег: АЕЗ389121), рНУУ-РА8-М5 (СепрапкК ассезбзіоп питрег 902150.13). На другому етапі синтезовані послідовності були клоновані в двонаправлений вектор на основі плазміди РНУМ2000 (Нойтапп
Е, Мештапп с, Кажаока У, Нобот Сі, УМервієї На. А ОМА ігапвтесіюп зувієт ог депегаййоп ої іпїЯшепла А мігив їїот еєїдні ріаєтідв5. Ргос Маї! Асад бсі ОБА. 2000; 97(11):6108-13.). Зазначений плазмідний вектор завдяки наявності РоЇ | ії РоЇ І промоторів забезпечує одночасну внутрішньоклітинну транскрипцію вірусних і відповідних матричних РНК при трансфекції клітин ссавців.
Було отримано 7 плазмідних клонів, які кодують РВІ, РВ2, РА, НА, МА, МР, М без модифікацій, і набір варіантів МЗ геномного фрагмента з модифікаціями, принцип яких представлений на Фіг. 1.
На Фіг. 1А представлена схема М5 геномного фрагмента вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ).
Повнорозмірний геномний фрагмент вірусної РНК (вРНК) негативної полярності має довжину 230 нуклеотидів (нт). Транскрипція М5 фрагмента полімеразним комплексом вірусу грипу
Зо приводить до утворення 2 типів матричних РНК: 1. Прямого транскрипту - мРНК білка М51, що кодує білок М51 довжиною в 230 амінокислотних залишків (ак), і сплайсовану мРНК білка Мер, що кодує білок довжиною в 121 ак. На Фіг. 1Б представлена схема генетично модифікованого химерного МЗ5 геномного фрагмента, де рамка зчитування білка М51 до 398 нт і може продовжуватися вставкою чужорідної послідовності, що закінчується потрійним стоп-кодоном.
Послідовність, яка кодує білок Мер, замінена на гетерологічну від іншого підтипу вірусу грипу А.
У результаті модифікації химерний геномний ММЗ фрагмент має невизначену довжину, залежно від довжини вставки чужорідної послідовності в рамку зчитування М51.
Як основа для створення химерної конструкції геномного сегмента М5 була використана нуклеотидна послідовність вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), включаючи кодуючу, а також 5'ї 3" некодуючі кінцеві ділянки (номер послідовності в базі зепВапк 902150). Залежно від мети були сконструйовані різні варіанти химерних конструкцій М5 геномного фрагмента, де загальними ознаками були: 1) заміна послідовності, що кодує білок Мер, вірусу А/РК/8/34 (НІМІ) на послідовність, що має походження від вірусів грипу підтипу Н2М2 (штами: А/Зіпдароге/1/57 і
АЛ епіпдогаа/л 34/47/57) (Фіг. 25 і 28); 2) делеція послідовності з 30 нуклеотидів (позиції 499-428 нт) У ділянці, що кодує М51, до сайту сплайсування Мер; 3) обмеження рамки зчитування білка
М51 до 124 амінокислотних залишків шляхом впровадження касети з трьох послідовних стоп- кодонів (ТСАТААТАА) після нуклеотидної позиції 399 (Фіг. 2А і фіг. 2Б); 4) наявність або відсутність послідовності чужорідної генетичної послідовності, введеної в рамку зчитування М51 після нуклеотидної позиції 398, безпосередньо перед касетою стоп-кодонів.
На Фіг. 2А наведена послідовність 5ЗЕО ІЮ МО:1 М5 фрагмента вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ), у якій виділена і підкреслена послідовність з ЗО нт, що підлягає делеції при конструюванні Б і В. Жирним шрифтом виділена послідовність Мер гена, що підлягає заміні на гетерологічний аналог від іншого підтипу вірусу грипу А. На Фіг. 25 наведена послідовність зЕО
ІЮ МО:2 рекомбінантного М5 фрагмента вірусу грипу А, де рамка зчитування білка М51 укорочена до 398 нт, за допомогою вставки, що складається з трьох послідовних стоп- кодонів(підкреслено), і послідовність Мер, виділена жирним шрифтом, запозичена від вірусу
А/5іпдароге/1/57 (Н2М2). На Фіг. 28 наведена послідовність зЗЕО ІЮ МО: З рекомбінантного М5 фрагмента вірусу грипу А, де рамка зчитування білка М51 укорочена до 398 нт, за допомогою вставки, що складається з трьох послідовних стоп-кодонів(підкреслено), і послідовність Мер, бо виділена жирним шрифтом, запозичена від вірусу АЛ епіпагайд/1 34/47/57 (Н2М2).
АЧВСАААдаСАаа,ТаАСАААпАСАТААТавАТоСАААСАСстТаТататСААасСтттСсАсатАаАТ тасттсотаасСсАТаТатсСасСАААСаАаТТаСАпАССААаААСТАаатаАТасссСАТТОСТТаА тосавесттсасСаАпАТСАЧаАААТОСССТААладасаАдАлс,ассасСсАаасСАсттаатстасАсСАТСИада
АСАВССАСАСОСТаСтТапйАААаСАаАтТАаатасааСасцсАтСстаАААаААаААТоСаАдтадаасСАс ТТААААТаАССАТОСаСсСТОТатАоСстасатоасаТТАССТААССОаАСАТаАСТОТТаАасСАААТО
ТСАдСасААТааТоСАТаСТСАТАСССАдаСАпаАААХ,атТааСАв,ЧассєтттТатАТСАСААТтас
АССАСИаСапАТСАТааАТАААААСАТСАТАСТа ДДДаССаСААСТТСАСсТатаАттттаАССссваст ааАпАСТСТААТАТТаСтТААд,ааастГтсАССаААдаАавасвАаСААТтТаИттаасСаАААТТТСАССАТ тасстстстсСсАпОпАСАТАСТОаСтТаОдОасСАТаТСсАААААТаСсАсттасАаТтоСстТеАТеавВада
САСТТОДАТаСААТаАТААСАСАаТТСОАДаИтТСсСТСТаАДААСТСТАСАСАСАТТСаСТТасСАСАА
ССАСТААТОАСААТаСОАаАССТоСАСТСАСТОСААДААСАСАддАСаАдаАдААТавСаспСсААСА
АТТАСИТСАСААСТТТОДАСАААТААСАТасСТТаАТТОААСААаТаАпАСАСААДАСТОаАдАдааТ
ААСАСАСААТАСТТ ТТ ОДаСАААТААСАТТТАТаСААаССТТАСАТСТАТТОСТТОАдАДОстТасСАа
СААДСАСАТААСААСТТТСТСАТТТСАО,СТТАТТТААТААТАААДАДАСАСССТТаТтТТТСТАСТ (5ЕО
ІО МО)
АЧВСАААдаСАаа,ТаАСАААпАСАТААТавАТоСАААСАСстТаТататСААасСтттСсАсатАаАТ тасттстаасСсАТаТатсСасСАААСаАаТТасСАпАССААпаААСТАсСатаАТасСсссСАТТОСТТаА тосавесттсасСаАпАТСАЧаАААТОСССТААладасаАдАлс,ассасСсАаасСАсттаатстасАсСАТСИада
АСАВССАСАСОСТаСтТапйААА,САаАтТАатаса,СасцсАтСстаАААаААаААтТоСадтадавасСАс ТТААААТаАССАТОСССТОТИатТАССТаАСатоасСсаТттТАССТААССОаАСАТаАСТОТТаАСасСАААТО
ТСАДССОСААТааТтСсСАТаСТСАТАСССАлДасСАаАААда,а ТасСасассстстТатТАТСАСААТтас
АССАСОаСаАТСАТаТаАТААТАААСТОТаАТтт тт ТаАдсСв,састацпАвАСТСТААТАТТаСТАдОаС асСТТТсАССаААсАсапАасСААТТаттаасСаАААТТТСАССАТТаССТТСТСТТоСАсСаАСАТАС
ТААТтТОдаСАТаТСАААААТаСААТТОСОаТССТСАТСОпАаСсАСТТОаААТаСААТОАТААСАС АСТТСОАСТСсТСсТААААСТСТАСАСАсСАТтсаСсТТаТаАААСАсСтТААтТаАдаААтТааадОаАСс
ТССАСТСАСТОССААДААСАСААДАСасСААДААТаасСаАСААСААТТАСИСТСААДААаТТСОДАСАдА
ТААСАТааССТаАТТаАДАсСААаТаАсСАСАСАДАТТОаДАСАТААСАСАСААТАСТТТТаДаСАдА
ТААСАТТТАТаСАДаССТТАСАОСТАСТАТТТОдАСТаСААСААСАСАТААСААСТТТСТСИТТ
ТСАССТТАТТТААТААТААААДАДАСАСССТТаТтТТТСстТАСТ (5ЕО ІЮ МО:2)
Коо) АЧВСАААдаСАаа,ТаАСАААпАСАТААТавАТоСАААСАСстТаТататСААасСтттСсАсатАаАТ тасттсотаасСсАТаТатсСасСАААСаАаТТаСАпАССААаААСТАаатаАТасссСАТТОСТТаА тосавесттсасСаАпАТСАЧаАААТОСССТААладасаАдАлс,ассасСсАаасСАсттаатстасАсСАТСИада
АСАВССАСАСОСТаСтТапйАААаСАаАтТАаатаса,СасцсАтСстаАААаААаААТоСаАтадаасСАс
ТТААААТАССАТОСССТОТИаТАССТаАСатоасатТАССТААССОаАСАТаАСТОТТаАСасСАААТО
ТСААдСасААТааЙТССАТасСтТоАТАСССААдаСАаАдАдАдата,аСАааСсстстТТаТАТСАСААТИаС
АССАСОаСаАТСАТаТаАТААТАААСТО ТАТ ТаАдсСв,састацпАвАСТСТААТАТТаСТАдОаС асСТТТсАССаААсАсапАасСААТТаттаасСаАААТТТСАССАТТассСтІ сто ТоСАСОСАСАТАС
ТААТтТОдаСАТаТСАААААТаСААТТОСОаТССТСАТСОпАаСсАСТТОаААТаСААТОАТААСАС
АСТТСОСАСТСТСТААААСТСТАСАСАасАТттсасттапАвпАдАдаСАаТААтТаАсаААтасаапдОаАСс
ТоСАСТСАСТОССААДААСАСААДАСасСААдААТаасСОпАОААСААТТАСИТСААДААаТТСОДАСАдДА
ТААдСАТааССТаАТТаАДАсСААаТаАсСАСАСАДАТТОаДАСАТААСАСАСААТАСТТТТОАаСАдА
ТААСАТТТАТАСАДИССТТАСАОСТАСТАТТ ТО ДаТасСААСААдпАпАТААСААСТТТоТтоИТттт
САССТТАТТТААТААТААААДААСАСССТТаТтТТСтТАСТ (5ЕО ІЮ МОЗ)
Таким чином, сконструйовані химерні М5 сгеномні фрагменти, при їх транскрипції полімеразним комплексом вірусу грипу, формували два типи матричної РНК: 1) М51 мРНК, трансльована у формі укороченого до 124 амінокислотних залишків МО1 білка, що обмежений стоп-кюодонами або продовжується вставкою послідовностей трансгенів різного походження, трансляція яких обмежується касетою зі стоп-кодонів; 2) Мер мРНК гетерологічного походження від вірусу грипу А іншого антигенного підтипу. Варіанти трансляції рекомбінантного М51 білка зі вставками представлені на Фіг. З і в Таблиці 1 нижче.
Таблиця 1
Амінокислотні послідовності білків, трансльованих у рамці зчитування М51, рекомбінантних вірусів, що мають гетерологічний Мер від вірусу АЛ епіпдгай/134/47/57 (Н2М2)
МОРМТУ55ЕРОМОСЕІ МИНУАВКАМАВОБЕЇГ СОАРЕ |. .
Меіод/меріеп | ОВІАВРОКВІНСВОВТІ СІ. ОЕТАТААОКО МЕ кра мкою зчитування МЕ!
ВІЄСКЕЕБОЕАІ КМТМАБУРАБАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 біпка без вставки
ВЕМ5МІ ІРКОКМАСРІ СІАМООА!М (5ЕО ІО пи й .
МО 4 чужорідної послідовності
МОРМТУ55ЕРОМОСРІ МИНУВКАМАВСОБГ СОАРЕ
ГОВІАВРОКБІ ВОВО5ТІ СІ ОІЕТАТААОКОЇМЕ | 2. .
ВІ.КЕЕВОЕАІКМТМАБУРАВАУ! ТОМТІ ЕМО | ВІРУС з вкороченою до о
ВЕМ5МІ ІРКОКМАСРІ СІАВМОСАІМ-ОИ- бі р У
СІ РСАІАДСРІЕССМ/ ТОМІОСМ/ УСУНН їлка, що продовжується
М5124-НАФ(А)-185| ОМЕОСЗОУААРОКОТОМАІМСІТМКУМТУІЕКМ |рансльованою
МІОЕТАМОКЕЕМКІ ЕКВМЕМІ МККУООСЕІ ОМУТ жирним шрифтом НА.
УМАЕГІГ МО ЕМЕВТ ОРЄНОЗМУКМІ МЕКМУМКБОЇ К ві й г ий А з 1 по 185
ММАКЕІСМОСРЕРУНКСОМЕСМЕБУВМСТУЮУ | МРУСУ ГРИПУ 7»
РКУБЕЕБКІ МАЕКМОСОСМУКІ ЕБМСЇТМО(5ЕО 10 І
МО:5
МОРМТУ55ЕРОМОСРІ МИНУВКАМАВСОБГ СОАРЕ
ГОВІАВРОКБІ ВОаВО5ТІ СІ ОІЕТАТААОКОЇМЕ | Вірус зі вкороченою до 124
ВІСКЕЕБОЕАІ КМТМАБУРАБВАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 |ак рамкою зчитування М51
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАОРІ СІВМООСАІМ-Сс(- білка, що продовжується
М5124-НАД(А)-65- | АЛОКЕРМКІ ЕКАМЕМІ МККМОБИ РІ І трансльованою 222 М/ТУМАЕГІ МОГЕМЕВТІ ОЄЕНОБМУКМІ МЕКУКЗ5 | послідовністю (виділено
ОЇ КММАКЕЯМОаСЕеЕРУНКСОМЕСМЕБУВМИТ | жирним шрифтом) НА2
МОМРКУБЗЕЕЗКІ МАЕКУРаИмкКІ ЕЗМИІМОЇІ АЇМ | субодиниці вірусу грипу А, з
ЗТМАББІ МІ М5І САІЗЕМУМОСМаБІ ОСВІСІ(ЗЕ | 65 по 222 ак
ОО МО:6
МОРМТУ55ЕРОМОСРІ МИНУВКАМАВСОБГ СОАРЕ
ГОВІАВРОКБІ ВОаВО5ТІ СІ ОІЕТАТААОКОЇМЕ | Вірус зі вкороченою до 124
ВІСКЕЕБОЕАІ КМТМАБУРАБВАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 |ак рамкою зчитування М51
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАОРІ СІВМООСАІМ-Сс(- білка, що продовжується
М5124-НАД(А)-23- | ЕУННОМЕОС5аУААРОКТОМАІМИ трансльованою 185 ТУМКУММТМЕКММІОСЕ ТАМОКЕРМКІ ЕКАМЕМІ МК | послідовністю (виділено
КМОранггорІМмТММАЕГІ МІГ ЕМЕВТІ СЕНОБМУК | жирним шрифтом) НА2
МІ. МЕКУКБОЇ КММАКЕІЯ МЕ СЕЕЕМНКСОМЕСМ | вірусу грипу А, з 23 по 185
ЕЗБМАМОаТУОМРКУБЕЕБКІ МВЕКМОСУМУКІГ ЕМ |ак
СІМО (ЗЕО ІЮ МО:7
МОРМТУ55ЕРОМОСРІ МИНУВКАМАВСОБГ СОАРЕ
ГОВІАВРОКБІ ВОВО5ТІ СІ ОІЕТАТААОКОЇМЕ | Вірус зі вкороченою до 124
ВІГСКЕЕБОЕАІ КМТМАБУРАБАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 |ак рамкою зчитування М51
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАдОИРІ СІВМООСАІМ-Сс(- білка, що продовжується
М5124-НА2(В)-186 СЕРСАІДСРІ ЕССУУЕСМІАДСУУ НО УТ трансльованою
ЗНОаАНОМАМААОІ КОТОЕАЇІМКІТКМІ М5І ЗЕ Е | послідовністю (виділено
МКМ ОВІ 5САММИїІ НОБЇ ЕІ ОЕКМООПІ ВАСТІЗ | жирним шрифтом) НА2
ЗОЇІЕГ АМІ ЇЇ ЗМЕСТИМЗЕОЕНІ ГАГЕВКІ ККМІ СР | субодиниці вірусу грипу В, з
ЗАМЕІЯМОСЕРЕТКНКОМОТСІ ОВІААСТЕМАСО |1 по 186 ак
ЕБІРТЕО (5ЕО ІЮ МО:8
МОРМТУ55ЕРОМОСЕІ МИНУВКАМАСВОЕЇГ ООАРЕ | Вірус зі вкороченою до 124
М5124-Рив(А)-МР | ОВ ААрОКбБІ НаВавхті аі ОІТЕТАТВАСКОЇМЕ | ак рамкою зчитування М51
ВІСКЕЕБОЕАІ КМТМАБУРАБНАУ ТОМТІ ЕЕМЗ5 |білка, що продовжується
Таблиця 1
Амінокислотні послідовності білків, трансльованих у рамці зчитування М51, рекомбінантних вірусів, що мають гетерологічний Мер від вірусу АЛ епіпдгай/134/47/57 (Н2М2)
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАдОИРІ СІВМОСАІМ-Сс(- трансльованою
СІГЕСАІАСБІЕСаТм ТаміІраму-аа- послідовністю (виділено
ВЕЗАМРОМА (5ЕО 10 МО:9) жирним шрифтом) НА2 субодиниці вірусу грипу А, з 1 по 21 ак, і послідовністю консервативного В- клітинного епітопу МР білка вірусу грипу А. СО-гліцинові вставки, що розділяють компоненти конструкції.
Вірус зі вкороченою до 124 ак рамкою зчитування М51 білка, що продовжується
МОРМТУ55ЕОМОСЕЇМНУВКАВМАООБЇІ СОАРЕ дивна вів лено
Гов'АврОКБІВавазхті І ОІЕТАТААСОКОЇМЕ жирним шрифтом) НА?
М5124-Рив(В)-МР ВІСКЕЕЗОЕАІ КМТМАБУРАЗАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 субодиниці вірусу грипу В, з
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАаИРІ СІВМОСАІМ-С(- 1 по 21 акі послідовністю.
СЕРСАІДСРІ ЕССУУЕСМІДОИМУу-ва- консервативного В-
ВЕЗАМРОМА (ЗЕО ІЮ МО210) клітинного епітопу МР білка вірусу грипу А. СО-гліцинові вставки, що розділяють компоненти конструкції.
МОРМТУЗЗЕОМОСЕ МНУВКАМАРОЕГОбАРЕ | Вірус зі вкороченою до 124
ГоА'АВрОКБІВИавазхтіаІ ОІЕТАТААСКОЇМЕ | ак рамкою зчитування М51
ВІСКЕЕЗОЕАІЇ КМТМАБУРАЗАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 |білка, що продовжується
М5124-Евзаїб ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАОРІ СІВМООСАІМ-Сс(- трансльованою
МТЕОСОСМУМЕАСІЕАДАБАІОСММУТ5ІНОІ І ОЕСК | послідовністю (виділено
ОБ5І ТК АДАМС О5БаЗЕАМОСМУОДОКМУОАТАТЕЇ | жирним шрифтом) білка
ММАГОМІ АВТІЗЕАДЙОАМАЗТЕИМУТаМЕА Езаїб мікобактерії
ЗЕО ІЮ МО:11 туберкульозу
Вірус зі вкороченою до 124
МОРМТУЗЗЕОМОСЕ МНУВКАМАРОЕГ СбАРЕ | ак рамкою зчитування М51
ГоА'АВНрОКБІвавазхтіІ ОТЕТАТААСКОЇМЕ | білка, що продовжується
ВІСКЕЕЗОЕАІЇ КМТМАБУРАЗАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 | трансльованою
ВЕМ5МІ ІРКОКМАСРІ СІАВМООСАІМ-СИ- послідовністю (виділено
М5124-2А-Езаїб |МЕОІ І КГ АСОМЕБЗМРаР- жирним шрифтом) пептиду
МТЕООСУУМЕАСТЕАААБЗАІОСММУТОІНОІ І ОБСОК |2А, що саморозщеплюється
О5І ТК АААМ/СИБОаЗЕАМОСМООКМПАТАТЕЇ | (походження з
ММАГОМІ АВТІЗЕАЙОАМАЗТЕИМУТаМЕА пікорнавірусів), і (ЗЕО ІЮ МО 12) послідовністю білка Езаїб мікобактерії туберкульозу
Вірус зі вкороченою до 124 ак рамкою зчитування М51
МОРМТУЗЗЕОМОСЕ МНУВКАМАРОЕГОбАРЕ | білка, що продовжується
ГовА'АврОКБІВавазхті І ОІЕТАТААСКОЇМЕ | трансльованими
Ме124-НеУ-?АбУ ВІСКЕЕБОЕАЇ КМТМАБМУМРАБВАМІ ТОМТІ ЕЕМ5 | послідовностями (виділено
ВЕМ ЗМІ ІРКОКУАаРІ СІВМООАІМ-АДА- жирним шрифтом) Т-
МІ СТТРКЕТ-АДА-АМІ ЧОММАМ-АДА- клітинних епітопів вірусу
МІ СТТРКЕТ-ААДА-АМІ ЯЧОММАМ(ЗЕО ІО МО:13) | простого герпесу (НМ) 1 і 2 типів. Вставки епітопів зроблені із повтором
Збирання рекомбінантних вірусів здійснювалося шляхом трансфекції клітин МЕКО сімома плазмідами, що кодують геномні немодифіковані фрагменти вірусу грипу, і одним із варіантів
М5 геномного фрагмента химерної природи, використовуючи метод електропорації плазмідної
ДНК (СеїЇ пе МисієоїтесіогО Кії М (Гопла)) відповідно до інструкції до застосування. Після трансфекції клітини інкубувалися у середовищі Оріїрго (Іпмігодеп) протягом 96 годин при 34 70 із додаванням трипсину 1 мкг/мл для забезпечення посттрансляційного розщеплення попередника гемаглютиніну на субодиниці НАїТ і НА2. Вірусний врожай із клітин Мего використовувався для зараження 10-денних курячих ембріонів (РЕ). Ембріони інкубувалися протягом 48 годин при 34 "С, після чого алантоїсні рідини, що мають позитивний титр у реакції гемаглютинації, використовувалися для проведення другого пасажу на курячих ембріонах.
Аплантоїсні рідини другого пасажу аліквотувалися і зберігалися при -80 "Сб. Матеріал другого пасажу використовувався для контролю генетичної структури химерного М5 фрагмента і присутності трансеена шляхом одержання ЗТ-ПЛР продукту і його секвенування. Крім того, матеріал другого пасажу використовувався для визначення фенотипових маркерів рекомбінантних вірусних штамів і векторів і визначення генетичної стабільності трансгена протягом 5 пасажів на курячих ембріонах.
Приклад 2
Визначення фенотипу температурочутливості й атенуації рекомбінантних вірусів, які несуть гетерологічний Мер
Температурочутливість вірусів визначали шляхом порівняльного титрування інфекційної активності вірусів на клітинах Мего при оптимальній 34 "С і підвищеній 39 "С температурах, у 96- ямкових планшетах. Титри вірусів підраховували методом Ріда і Мюнча після інкубації протягом 96 годин з урахуванням розвитку цитопатичного ефекту в ямках планшета (Кеєа, Г.3.; Миепси,
Н. (1938). "А зітріє тео ої езіїтацйпод їйпу регсепі епароіпів". Те Атетгісап Уоигпаї ої Нудієпе 27: 493-497.). На Фіг. 4А представлені титри вірусів, при зазначених температурах, виражені в тканиних 50 95 цитопатичних дозах (09 ТЦД5О/мл). Несподівано виявилося, що в обох вірусів, які несуть гетерологічний Мер, від штамів А/Зіпдароге/1/57 (Н2М2) або АЛепіпдогад/1 34/47/57 (Н2Мг), спостерігається істотне » 4І0д зниження інфекційних титрів при температурі 39 70, порівняно з оптимальною температурою 34 "б. Контрольні штами - вірус дикого типу А/РЕ/8/34
Зо (НІМІ) їі рекомбінантний вірус М5124/Мер РЕ8 з укороченим М51 білком і гомологічним Мер - не мали ознаки температурочутливості, ефективно розмножуючись при високій температурі. Таким чином, заміна Мер приводила до появи у вірусів ї5 фенотипу.
Більше того: при інтраназальному зараженні мишей під легкою анестезією зазначеними вірусами, взятими в дозі 6 Іод/мишу, у вірусів - носіїв гетерологічного гена Мер спостерігалася знижена здатність репродукції в тканинах легені (р«е0,002), порівняно з вірусом дикого типу або вірусом М5124/Мер РК8, що має гомологічний Мер (Фіг. 4Б). Титри вірусів у легенях оцінювалися через 2-і доби після зараження тварин шляхом титрування в клітинах Мего освітлених гомогенатів легені. Легеневі титри виражали в бд ТЦД5БО/г тканини легені. Таким чином, інтродукція химерного М5 геномного фрагмента в штам вірусу грипу А/РК/8/34 (НІМІ) приводила до атенуації вірусу, що виражається в зниженні його здатності до розмноження в нижньому респіраторному тракті тварин.
Приклад З
Визначення ї5 фенотипу й атенуації векторів, які несуть химерний М5 геномний фрагмент і різні вставки в рамці зчитування білка М51
Для визначення впливу вставок чужорідних послідовностей у рамку зчитування білка М51 на 15 фенотип вірусів, химерних за геном Мер, був отриманий широкий набір векторів, які кодують вставки різної природи. Були вивчені віруси зі вставками, відображеними на Фіг. 3. ї5-Фенотип вивчався шляхом титрування інфекційної активності вірусів при температурах 34 і 39 "С у 10- денних курячих ембріонах, шляхом визначення гемаглютинуючої активності алантоїсних рідин, зібраних через 48 годин інкубації. Титр підраховувався методом Ріда і Мюнча і виражався в І0д
Ембріональних 50 95 інфекційних доз (09 ЕІДво/мл). Як видно з даних, представлених у Таблиці 2, усі вектори, на відміну від вірусу дикого типу А/РК/8/34 (НІМІ), відрізнялися істотно зниженою здатністю до репродукції при високій температурі і відповідали за фенотиповим маркером ї5 прототипним химерним штамам, які не мають вставки, але несуть гетерологічний Мер.
Таблиця 2 : й жж зас 97 (аю Мер від штаму
А/РН/В8/34 лева 0 1аю 0 му | 6195 м5124-Рив(А)-МР | 124 | їеп// | 80 2 2 ЩщЩ | 28 4 так ом5124-2А-Еваїб | 124 | їеп | 98 2 щЩ | 40 | так м5124-НБМ-2АВЗУ | 124 | ївп/ | 80 | 25 | так
Позначення: "Довжина (в амінокислотних залишках) натуральної послідовності білка М51 до вставки; ""Походження гена Мер від штаму: А/РЕ/8/34 (НІМІ) або А/5іпдароге/1/57(Н2Мг) або
АЛ епіпдогаа/1 34/47/57 (Н2М2); ""Чв8-фенотип вважається позитивним, якщо різниця в рості вірусу при 34 і 39 "С перевищує 2 Ібд
Для визначення впливу вставок на атенуацію (ай) векторних штамів для тварин мишей заражали інтраназально, під легкою анестезією, вірусовмісними алантоїсними рідинами курячих ембріонів, заражених вірусами або векторами, представленими на Фіг. 3. Алантоїсні рідини були попередньо охарактеризовані за вмістом в них інфекційних титрів вірусів. Титри виражали в од ЕІДво/ мл. Мишам вводили по 0,05 мл кожної вірусної проби. Кожна група мишей містила 8 тварин. Протягом 12 днів оцінювалася летальна активність вірусів. Виявилося, що на відміну від вірусу дикого типу А/РК/8/34 (НІМІ), який викликав 50 95 летальний ефект при використанні матеріалу з титром 3,2 0д ЕїІДво/ мл, жоден із векторів не демонстрував 50 905 летальної активності в мишей при використанні доз зараження »7,5 І0д. Таким чином, усі вектори, з химерною природою М5 геномного фрагмента, незалежно від вставки, були високо атенуйованими для мишей (Таблиця 3)
Таблиця 3.
Значення летальної дози для мишей вірусів . 50 95 летальна доза вірусу ж "фенотип атенуації визначається відсутністю летальної активності при заражувальній дозі, що перевищує значення 7,0 Ід ЕІДоо/мишу.
Приклад 4
Протективна відповідь відносно гетерологічних штамів вірусу грипу А і В при контрольному зараженні мишей
З метою визначення протективної активності відносно гетерологічних антигенних варіантів вірусу грипу для імунізації мишей були використані віруси з поверхневими антигенами від вірусу
А/РЕ/8/34 (НІМІ), що несуть химерний М5 геномний фрагмент із послідовністю Мер від вірусу
АЛ епіпдодгаа/1 34/47/57 (Н2М2). Були використані наступні рекомбінантні віруси, що кодують, у рамці зчитування М51, ділянки субодиниці гемаглютиніну НА2: 1) вектор М5124-НАД(А)-185, що експресує повний ектодомен НА2 вірусу грипу А, довжиною в 185 амінокислотних залишків (Фіг. 3, 5ЕО ІЮ МО:5), 2) вектор М5124-НАД(А)-185, що експресує повний ектодомен НА2 вірусу грипу В, довжиною в 186 амінокислотних залишків (Фіг. 3, 5Е6ЕО ІЮО МО:8), 3) вектор М5124-
Еив(А)-МР, що експресує послідовність, що складається з М-термінальних 21 амінокислотних залишків НА2 (ф'южн-домен) у комбінації з послідовністю консервативного В-клітинного епітопу
МР білка вірусу грипу А (Фіг. 3, ЗЕО ІЮ МО'9), і 4) вірус М5З124/Мер-І еп, що має касету зі стоп- кодонів у позиції 399 нуклеотидої послідовності МО геномного фрагмента, що обмежує трансляцію М51 білка 124 амінокислотними залишками (Фіг. 3, БЕО ІЮ МО:4). Для формування контрольних груп використовувався вірус дикого типу А/РК/8/34 (НІМІ), що не має генетичних модифікацій, або миші одержували фосфатний буферний розчин, що не містить активного інгредієнта. Миші були імунізовані інтраназально, під легкою анестезією, дозою вірусів 6,5
Іосд/мишу, одноразово. Через 28 днів тварини були піддані контрольному зараженню патогенними для мишей гетерологічними штамами вірусу грипу: А/Мів5і55іррі/85/1 (НЗМ2) або
В/ ее/40, узятими в дозі, що відповідає 3-5 ЛдДб5о, відповідно.
Як видно з Фіг. БА, контрольне зараження не імунних мишей вірусом (НЗМ2) приводило до їхньої загибелі у 80 95 випадків. У той же час миші, імунізовані вірусними препаратами, були повністю захищені від загибелі, що викликається інфекцією гетерологічним штамом вірусу грипу
А (НЗМ2). Імунізація вірусом дикого типу також приводила до статистично вірогідного рівня захисту від інфекції гетерологічним штамом. При використанні для контрольного зараження вірусу грипу В/ ее/40 імунізація мишей вірусом дикого типу А/РК/8/34 (НІМІ) не приводила до
Зо захисту тварин від загибелі поряд із мишами, які одержали при імунізації фосфатний буферний розчин (Фіг. 5Б). Несподівано, рекомбінантні віруси, що несуть вставки в рамці зчитування білка
М51, виявилися протективними відносно вірусу грипу В. При цьому найкращим показником протективності вирізнявся вектор М5124-Рив(А)-МР. Таким чином, векторні штами, що несуть химерний М5 геномний фрагмент, при одноразовій інтраназальній імунізації мишей виявили ознаки універсальної грипозної вакцини, ефективної відносно як гетерологічних антигенних підтипів вірусу грипу А, так і відносно вірусу грипу В.
Приклад 5
Одержання грипозного вектора з модифікованим М5 геномним фрагментом, що кодує послідовність НА2 вірусу грипу В і поверхневі глікопротеїни вірусу НІМтрат
Збирання рекомбінантного вірусу здійснювалося в кілька етапів. На першому етапі синтетичним шляхом були отримані комплементарні ДНК (кДНК) копії 5 геномних фрагментів (РВ2, РВІ, РА, МР, М) вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМІ) (РВ2 (СепрапкК ассевзвіоп питрбег:
АВб71295), РВІ (СепрапкК ассевзбвіоп питбрег: СУ033583), РА (СепрапкК ассеввіоп питрбег":
АРЕЗ389117), МР (СепрапК ассевзбвіоп питбрег: АЕЗ89119), М (Сепрапк ассезвзіоп питрег:
АЕЗ389121)) і 2 геномні фрагменти (НА, МА) вірусу А/Саїйогпіа/7/09-іКе (НА (СепВапк:
КМ408964.1) і (МА СепВапк: КМ408965.1)), а також синтезований химерний геномний фрагмент
М5, складений з послідовностей, що стосуються вірусу НІМІ (ген М51), вірусу Н2МО2 (ген Мер) і послідовностей двох пептидів від НА2 вірусу грипу В і МР вірусу грипу А.
На другому етапі синтезовані послідовності були клоновані в двонаправлений вектор на основі плазміди РНУМ2000 (Нойтапп Е, Мештапп С, КаулаоКа У, Нобот С, Умереіег КО. А ОМА тапвтесіп зувбієт ог депегаїййоп ої іпїшеплга А мігив їтот еїдні ріаєтіав. Ргос Маї! Асай 5сі ОА. 2000; 97(11):6108-13.). Зазначений плазмідний вектор завдяки наявності Рояї І ії РОЇ ІІ промоторів забезпечує одночасну внутрішньоклітинну транскрипцію вірусних і відповідних матричних РНК при трансфекції клітин ссавців. На Фіг. 7 представлена генетична схема грипозного вектора. На
Фіг. 8 представлені нуклеотидні послідовності всіх 8 геномних фрагментів грипозного вектора.
Нуклеотидна послідовність геномного РВ2 1 адсдааадса ддісаайнаї ансааіа дааадааїаа аадаасіасу аааїсіааід 61 іІсдсадієсіс дсасссдсда даїасісаса аааассассд ддассаїаї ддссаїааїс 121 аадаацдіаса саїсаддаад асаддадаад аасссадсас наддадаа аюдатдад бо 181 осаадаааї аїссаацас адсадасаад аддаїаасда аааїдансс юададаааї
241 дадсааддас ааасша!д дадіаааа ааїшдаїдссо даїсадассо адідашюдіа 301 Іїсассіс4д сющдасагд діддаагадад ааддассаа іаасаааїас аднсанаї 361 ссаааааї!сі асаааасна Шідааада дісдаааддс їіааадсадд аассшадс 421 ссідіссаїї Падааасса адісаааага сдісддадад Ноасаїааа іссіддісаї 481 одсадаїсіса ддссаадда досасаддаї діааїсадуд ааанднції сссіаасдаа 541 ддддадсса одаїасіаас аіїсддааїсд саасіаасда іІаассааада даадааадаа 601 даасіссада айосааааї псіссща аддносаї асаднода дададаасіа 661 діссдсаааа сдадайссі сссадіоддсії ддаіддаасаа дсадідщіа сайдаадзчід 721 ноасашоа сісааддаас адсіддоаа садащіайа сіссаддаду дааадчідадд 781 ааюдаюа!й Нодаїсааад сіданайн дсідсіадда асаїадщдаяд аададсідса 841 діаісадсаяд аїссасіадс аїсшанод дадаїцідсс асадсасаса чзайддодда 901 апададада іадасаїссі їІаддсадаас ссаасадаад адсаадссодї ддаїагацдс 961 ааддсдсаа дддасщад аанадсіса ісснсадії Падіддай сасашаад 1021 адаасааодсяа даїсаїсаді саадададад даададдіюдс Пасддосаа ісйсаааса 1081 пКдаадаїаа дадідсаюа доддаїаюдаа дадісасаа юуноддад аададсааса 1141 дссаїасіса даааадсаас саддадана айсадсіда їадщдадідд чададасдаа 1201 садісданд ссдаадсааї аандіддсс аддіаші сасаададда нотаюаїа 1261 ааадсадіса дзаддаюаїсі даашсдіс ааіаддодсда аїсаасдай дааїссіаїд 1321 саїсаасій іІаадасайй іІсадааддаї дсдааадідс НЕсаааа Ноддаасвчії 1381 даассіаїсд асааюющаї дддааїюдаїй додаїацодс ссдасаїдас іІссаадсаїс 1441 дадащісаа дададададї дадааїсадс ааааодвдід гадаїдацдіа сіссадсасд 1501 дадададіад юдшоасдсаї щассоції ндадааїсс дддассаасоу аддааащіа 1561 сіасідісіс ссдаддадодї саддаааса садддаасад адааасідас ааіааснас 1621 іІсаїсдісаа юадютюода данаадаої ссідааісад Нодісаа їассіаїсаа 1681 ддагїсаїса дааасіддда аасіднааа ансадоадї сссадаассс іІасааідсіа 1741 їіасааіаааа (ддаашоа ассашсад ісшадіас сіааддссаї іїіададассаа 1801 їасадюдаї Ндіаадаас Ісюйнссаа саааюадаяд ашіодсідо дасашоаї 1861 ассдсасада іааїаааасі ісйсссне дсадссдсіс сассааадса аадіадаа 1921 саднеїссї сашасюії дааюдацда одаїсаддаа Ідадааїасі іааддддс
Зо 1981 аайсіссід їіансаасіа іІідасааддсс асдаададас ісасаднсї сддаааддаї 2041 дсіддсасії Іаасюаада сссадашюаа доасасадсід дадіддадіс сосіднсїд 2101 аддддансс ісайнсіддд сааадаадас аададаїаюд доссадсасі аадсаїсааї 2161 даасідадса асспдсдаа аддададаад дсіаацідс їіаапддаса аддадасодд 2221 діднподіаа щааасддаа асодддасісії адсаїасна сідасадсса дасадсдасс 2281 аааадаайс ддадаоссаї саанадідї сдааіадійї ааааасдасс пушсіас 2341 1 (5ЕО І МО:14)
Нуклеотидна послідовність геномного РВ1 1 аїддащіса аїссдассії асішсна ааадідссад сасаааадс їіаїаадсаса 61 асшсссії азасюдада сссісснНас адссаїддда саддаасадо аїасассаїд 121 даїасшдіса асаддасаса іІсадіасіса даааадддаа дадасаас ааасассдаа 181 асюдадсас сдсаасісаа сссдандаї дддссасідс садаадасаа ідаассаацдці 241 доцагдссс ааасадацо іаноддад дсдадсії Іссндадоа аїсссаїссі 301 даїтаншяа аааасісоїд їайдааасо аддадоцо Нсадсааас асдадіадас 361 аадсідасас ааддссдаса дассіаїдас ддасісіаа аїадааасса ассідсідса 421 асадсайц9д ссаасасааї адаадіднс адаїсааацд дссісасддс сааюацдісі 481 ддаадодсіса їадасіїссі їІдзаддашіа аїддадісаа даасааада адааашюдаа 541 аїсасаасіс айшсадад ааададасд9у ддададаса агашдасіаа дааааюдаїа 601 асасададаа сааідддіаа ааадаадсад адайдааса аааддадна ісіаайада 661 дсайдассс даасасааї дассааадаї асідададад ддаадсіааа асддададса 721 апдсаассс садддаїса ааїаададоад Шоіаїасі пупдадас асіддсаада 781 адіазашід адааасіда асааісадду Поссаоцно даддсааюда даадааадса 841 аадноддсаа анодіаад даадащаїйо ассаайсіс аддасассда асшещшес 901 ассаїсасід дадаіаасас саааддаас даааагсада аїссісддаї ЧйщНодсс 961 адагсасаї аіа(дассад аааїсадссс даадюойса дааацйісі аадіацносі 1021 ссаагіаащі ісісааасаа ааддсдада сідддаааад доіазащції (дададсааа 1081 адіаюдааас Надаасіса ааїассідса дааадсіад саадсаїсда шодаааїаї 1141 йсааюай саасаадааа даадайцоаа ааааїссдас сдсісіааї ададдддасі 1201 дсаїсанда дсссіддааї дадатюодас ашнсааа даадсас щіанаддс 1261 дісіссаїсс дааїснода асаааадада іасассаада сіаснасід аюдаадаї 60 1321 сісааїссі сідасдацш госісюаї! дідааідсас ссааїсаїда адддайсаа
1381 дссддадісу асадаїщша іІсдаассіді аадсіасцу дааїсаааї дадсаадааа 1441 аадіснаса іІааасадаас аддіасай даайсасаа чИщшісіа Іісанаюда 1501 Шоподсса ашсадсаї ддадснссс адішаадада шісідддаї саасдадіса 1561 дсддасада діайддацді їасідісаїс ааааасааїа даїааасаа юаїснодаї 1621 ссадсаасад сісааадас сснсадно йсаїсааад айасаддіа сасдіассда 1681 Ідссаїадад дідасасаса ааіасааасс сдаадаїсаї нНдаааїааа дааасідіда 1741 дадсааассс діиссааадс ддасідсід дісіссдасоа даддсссааа Шаїасаас 1801 ападаааїс іІссасайсс Юаадісідс сіаааадюдао аандада юдададайнас 1861 саддддсдйі їадсаассс асідаассса Шдісадсс аїааадааа! Юааїсааїд 1921 аасааюсад даїдащюсс адсасащаї ссадссаааа асаддацвдіа щдадсції 1981 дсаасаасас асіссіддаї ссссаааада ааїсодаїсса ІснНдааїас аадісааада 2041 ддадіасцо аддаюааса аашіассаа аддаідсдса ашашоа аааайснс 2101 сссадсадії сазасадаад ассадісдоду аїаїссадіа (даюдадодс їаїддшес 2161 ададсссдаа Ндаїдсасу дзандаше дааісіддаа ддаїааадаа адаададнс 2221 асідада!са Юаадаїсід носассай! даададсіса дасддсаааа агадідааїй 2281 тїадсної (ЗЕО І МО:15)
Нуклеотидна послідовність геномного РА 1 адсдааадса ддіасідаїс саааадаа даїшоюдс дасаащсії сааіссдаж 61 анпдісдадс Пдсддаааа аасааіщдааа дадіадддода аддассідаа ааісдаааса 121 аасааашо садсаага сасісасно даадіацдсі їісаюіанс адашісас 181 йсаїсааід адсааддсода дісааїааїс діадаасцо дідаїссааа дсасша 241 аадсасадаї Кдаааїаа! сдадддаада даїсосасаа (ддссіддас адіадіааас 301 адїашоса асасіасадуд ддсідадааа ссаваадшс їассадайі діаїданас 361 ааддадааїйа дайсаїсда аайоддадіа асааддадад аадіїсасаї аїасіасід 421 даааадодсса аїаааайнаа аїсідадааа асасасаїсс асашісіс даіїсасідда 481 даадаааїд9д ссасаааддс адасіасасі сісдадаад ааадсадддс їаддаїсааа 541 ассадасіаї Ісассаїаад асаадаааю дссадсадад дссісіддда Посшеді 601 садіссдада даддадаада дасаайдаа даааддшо аааїіїсасаду аасааідсдс 661 аадснодссу ассааацдісі сссдссдаас Нсіссадсс Ноаааайі їІададссіаї
Зо 721 дюдаюддаї ісдаассдаа сдосіасаїї дадддсаадс ідісісаааї діссааадаа 781 діаааюсіа даандаасс ШШОааа асаасассас дассаснад асіссдааї 841 додссісссі днсісадса діссааайс сідсідаща асснааа айаадсаїй 901 даддасссаа дісадаадод ададддааїа ссдсіаїзаід аїдсааїсаа агдсаїдада 961 асайсща дадодаадда асссаайщції днпааассас асдаааад9дод ааіаааїсса 1021 аацаїснсе щісаюдаа дсаадіасід дсадаасідс аддасайода заададдад 1081 аааанссаа адасіааааа іаїдаадааа асаадісадс їіааадіюдас аспдаащдад 1141 аасаюддсас садааааддї адасшодас дасідіааад ашіадаїда Шодаадсаа 1201 їагдагадія аїдаассада айдадодісо сіадсаації ддансадаа Ідадшаас 1261 ааддсаюсяа аасщдасада псаадсіда аїададсісу ашадайод адаадацід 1321 дсіссаацу аасасацодс аадсадада аддаайцай ісасаїсада доїщісісас 1381 Ідсададсса садааіасаї аадаад9д9до доіасаїса аїасідссії дснааюса 1441 іспоїдсад сааддаїда Шшссаана айссаащюа іаадсаадід їадаасіаад 1501 дадддааддс дааадассаа сндіадаої нсаїсаїаа ааддаадаїс ссаснаада 1561 аадасассу асаїддіааа стоуюдаєдс адчдаднії сісісасіда сссаадасії 1621 даассасаїа ааюддодадаа діасідщії сідадаїад дадаїащдсі іаїаадааці 1681 дссаїаддсс аддшсаад дсссаїдне Ноїаціда даасааа!до аассісаааа 1741 апйааваюа ааддаддааї ддадащдада сойцоссісс іссадісасі Ісаасааай 1801 дададіаюа Ппоаасдсіда діссісідіє ааададааад асадассаа ададнсш 1861 дадаасаааї садааасаїд дсссанода дадіссссса аааддадідда ддаааднсс 1921 апдддаадо ісідсаддас Шанадса аадісддіаї Ісаасадсії стаюсаїсі 1981 ссасаасіад ааддайціс адсідааіса адаааасідс НеНаїсді Ісаддсісії 2041 адддасаасс Ндаассщо дасстшодаї снаддадодс їаіаїдаадс аандадаад 2101 дссідана аїдаїсссю адішосії аасійсії ддансаасіс снсснНаса 2161 садсанда днадногю дсадіосіас їашодсіаї ссагасідіє саааааадіа 2221 сспашсї асі (ЗЕО 10 МО:16)
Нуклеотидна послідовність геномного МР 1 адсдааадса даїадаїан дааадащдадз існсіаасс дададісдааа сдіасдіасі 61 сісіаїсаїс ссдісаддсс сссісааадс сдадаїсдса сададасно аадащцісйї 121 їдсадддаад аасасідаїс пдадодісі саддааїдо сіааадасаа дассааїссі бо 181 дісассісід астїаадддда ІШаддаїй (дднсасо сісассдідс ссадідадсд
241 аддасідсаяд сдіадасодсі Ндіссаааа ідсссійааї дддаас9999 аїссаааїаа 301 саїддасааа дсаднааас щіаїаддаа одсісаададо дадаїаасаї Іссаддадс 361 сааадаааїйс іІсасісадії айсідсщда дсасідсс адноїаща дссісаїаїа 421 саасаддаю ддодосідіда ссасюдаавді ддсашоддс сіюдіацід саассідщта 481 асаданосі дасісссадс аїсддісіса їІаддсаааїд дідасаасаа ссааїссасі 541 ааісадасаї дадаасадаа ддішадс садсасіаса дсіаадасіа ддадсаааї 601 досіюддаїса адідадсаад садсададдс саїдадаой дсіадісадод сіадасаааї 661 ддюсааодсо ададаасса пдаодасіса Іссіадсісс адідсюдіс дааааашда 721 їІснендаа аашодсада ссіаїсадаа асдаащдада дідсададс аасодунсаа 781 дюаїссісї сдсіаносс дсааазаіса нНдодаїсії дсасндаса Поїдданс 841 Нноаїсдісї ШШсааа дсашасс дісдсшаа агасддасід аааддададс 901 снсіасдда аддадідсса аадісіаїда дддаадаага Іісдаааддаа садсададід 961 сдюддайс щдасодагювої сайоіса дсаададсі ддадіааааа астасснадї 1021 Неїасі (БЕО ІО МО:17)
Нуклеотидна послідовність геномного М 1 адсдааадса ддіадаїан дааадаюдаод існсіаасс дадаїсдааа сдіасодїасі 61 сісіаїсаїс ссдісаддсс сссісааадс сдадаїсоса сададасно аадайцдісй 121 дсадддаад аасасідаїс Пдадодісі саїддаадад сіааадасаа дассааїссі 181 дісассісід асіаадддда Шаддай щіднсасод сісассдідс ссадідадсд 241 аддасдсаяд сдіадасодсі Пдіссаааа ідссснааї дддаас9999 аїссаааїаа 301 саддасааа дсадіааас шіагаддаа дсісаададо дадаїаасаї іссаїддддас 361 сааадаааїйс ісасісадії айсідсідд юсасндсс адіоіаща одссісаїаїа 421 саасаддаю даадсідіда ссасідааді ддсашодадс сіддіаюдю саассідщда 481 асадацосі дасісссадс аїсоддісіса їаддсааад дідасаасаа ссааїссасі 541 ааісадасаї дадаасадаа юдіШадс садсасіаса дсіааддсіа юдадсаааї 601 ддасюддаїсяа адідадсаад садсададдс саюддадаїй дсіадісада сіадасаааї 661 ддаосааодсод ададаасса ндоддасіса Іссіадсісс адідсіддіс Ідааааашюа 721 їІспендаа аашосада ссіаїсадаа асдаадюдада дідсадащдс аасдайсаа 781 дюдаїссісї сдсіаносс дсаааїаїса пддоаїсії дсасіїдаса паїадайс
Зо 841 Нноаїсдісі ШШсааа дсашасс дісасшаа агасддасію аааддададс 901 сісіасдда аддадідсса аацдісїаюда дддаадааїа ісдааадодаа садсададід 961 сююда!йцс Ідасдащдвї саннаоїса дсагададсі ддадіааааа асіасснаї 1021 Неїасі (ЗЕО ІЮ МО:18)
Нуклеотидна послідовність геномного НА 1 аїдааддсаа їасіадіаді Ісідсіазаї асашодсаа ссдсаааїдс адасасана 61 шагадції аїсадсааа саайсааса дасасщіад асасадіасі адаааадааї 121 діаасадіаа сасасісіді іаассіїсіа даадасаадс аїаасдддаа асіаїдсааа 181 сіаададода їіадссссаїї дсашодаї ааашіааса пПосідодсід даїссіддда 241 ааїссададі дідааїсасі сіссасадса аднсаїщаї ссіасацої ддааасаїсі 301 адісадаса аддаасоїд Насссадда дайсаїса анпададда одсіаадададч 361 саайдадсі садідісаїс айдааадао Шоадаїаї Іссссаааас аадісаа 421 сссааїсаїд асісдаасаа аддідіаасд дсадсаїціс сісасосіду адсааааадс 481 йсіасаааа ашааїаю дсіаднааа аааддаааїй саїасссааа осісадссаа 541 Ісстасаца ашаїааада дааадаацдієс сісдідсюї дддодсайса ссаїссаїсі 6О01 асіасідсід ассаасааад ісісіаїсад ааіюдсадайд саїгашнії діддддаса 661 Ісаадаїаса дсаадаацдії саадссоддаа агадсааїаа дасссаааді дадддаїсаа 721 даадддадаа Юаасіаца сюдасасіа діададсс99 дадасааааї аасансдаа 781 дсаасюдаа аїсіадщдї ассдадаїаї дсансасаа (ддааадааа їдсіддаїсі 841 дотанаїса Шсадаїас ассадіссас дайдсааїа саасндіса дасасссдад 901 даюсіаїаа асассадссі сссашсад ааїаасаїс содаїсасааї ддааааці 961 ссааацдіаї їіааааадсас аааанодада сіддссасад дайдадаоаа ідісссаїсі 1021 айсааєсіа даддссіайї сддддссайн дссддснса НКдаадоадаа аіддасадоад 1081 аїддтада даюддасоа Паїсассаї сааааюадс аддоддісада аїагдсадсс 1141 дассідаада дсасасаааа дссандас аадайцасіа асааадіааа сістюнай 1201 даааадайща аїасасацдії сасадсадід ддіааадацді Ісаассассі ддаааааада 1261 аіададааїй іаааіааааа адндаюаї ддшссідд асашоддас Насааїдсс 1321 даасюнода йсіайдда ааадааада асшддасі ассаїданс ааацідаад 1381 аасцпдіа ааааддіаад ааассадна ааааасааїд ссааддаааї їіддааасадс 1441 4дсшоааї Шассасаа аїдсодаїаас асдідсаща ааадіцісаа ааададасі бо 1501 їагдасіасс саааайїасіс ададдаадса ааацаааса дадааааааї адашюдаддіа
1561 аадсюддааї саасааддаї Нассадаїйї Ппддсдаїсі айсаасщі сдссаднса 1621 пдодсіда їадісісссї дддддсааїс адсіїсідда щідсісіаа ддроісіста 1681 садідіадаа гаїдтащша а (5ЕО ІО МО: 19)
Нуклеотидна послідовність геномного МА 1 аїдааіссаа ассаааадаї ааїіаассай допсодісії дїадасааї ддаацдасі 61 ааснааїйаї їіасааанодд ааасаїаагс іІсааіадда Надссасіс аайсаади 121 дддааісааа дісадаїсда аасадсааї сааадсаїса Часнаюа ааасаасасі 181 ддогаааїс адасаїащці іаасаїсадс аасассаасі Пдсідсідд дсадссавіа 241 дшссдщда аацйадсдду саанссісі сісідсссід Надідда досіагаас 301 адіааадаса асадшщіаад адісдданос ааддаддаю юшоісаї аадддаасса 361 Нсаїагсаї дсісссссії ддааюсада асснснсі дасісаадд ддоснодсіа 421 аадасааас айссааїдд аассанааа дасаддасдсс саїаісдаас спаададс 481 Ідіссіац9у ддааднсс сісіссаїас аасісаадаї Подадісаді соснодіса 541 дсаадіосії дісаїдаща саїсаацодд сіаасаацу даашсіда сссадасаді 601 ддадсадідо сідіюнааа діасаасодс аіааїіаасад асасіаїсаа задунодада 661 аасдаїааї (дадаасаса ададісідаа щідсаїіо їааададйнс йдсшШасс 721 аїааїдассяо аїддассаад Юаїддасад оссісаїаса адаїснсад ааїадаааад 781 ддааадаїад ісаааісаді сдаааюддааї дссссіааї! аїсасіаюа оддаадсісс 841 юнаїссю айсіадща ааїсасащі дощса9дод агаасіддса ддсісдааї 901 сдассоюда щісшсаа ссадааїсід дааїагсада їаддаїасаї асадідаа 961 ашсоддад асааїссасод сссіаашдаї аадасаддса оідідаісс адіаїсаїсі 1021 ааддадсаа аїддадіааа аддашіса йсааагасду дсааадіюї нподагадчод 1081 адаасіаааа дсацаднсе аадааааддаі Шодадаюа Шодоаїсс ааадаца 1141 асіюдддасад асааїаасії сісааіааад саадаїаїсяа іаддааіааа Ідадіодіса 1201 ддагаіадсу ддаднної ісадсаїсса даасіаасад досіддано їаїаадассі 1261 їдсне999 Поаасіааї сададддосда сссааадада асасааїсід дасіадчіддд 1321 адсадсаїаї ссішаїщ99 дааасаді дасасідща оподісно дссадасаді 1381 дсюаднос сашассаї Ідасаадчіаа (ЗЕО ІЮ МО: 20)
Нуклеотидна послідовність гена химерного М5 фрагмента (вставка виділена жирним
Зо шрифтом)
АЧВСАААдаСАаа,ТаАСАААпАСАТААТавАТоСАААСАСстТаТататСААасСтттСсАсатАаАТ тасттсотаасСсАтТаТатссСасСАААСаАаТТаСсАпАССААпААСТАсСатаАТасСсссСАТТОСТТаА тосавесттсасСаАпАТСАЧаАААТОСССТААладасаАдАлс,ассасСсАаасСАсттаатстасАсСАТСИада
АСАВССАСАСОСТаСтТапйААА,САаАтТАатаса,СасцсАтСстаАААаААаААтТоСадтадавасСАс
ТТААААТАССАТОСССТОТИаТАССТаАСатоасатТАССТААССОаАСАТаАСТОТТаАСасСАААТО
ТСАдвасААТааТоСАТаСТСАТАСССАдаСАспАААда,а таасА,чассстттаТатАТСАСААТИаС
АссАдсасоАтсАТОаСсАХасаасаттсттоесАастАттастасттсттавдАдасдасдтааа
АдасСААтТАТттасАааста,авасАдапААдаАдаАадасСсапААСССАпасСААтТасСТТОАТААТАА сссессеасАаататаАлттттадсСссвсасСставАаАСТСТААТАТТастАдасаасСТТтсАССОААаА саспАаСААТТаттаасСаАААТТТСАССАТТаССТтТТСоТСТТоСАсСаАСАТАСТААТаАаасАТатсСА
ААААТасСсААТТаССССТОСТСАТССИВА,аАСТТаААТапААТИаАТААСАСАСТТОСАСТСТОТААА
АСТСТАСАСАСАТТСОЯСТТасАСААаСАаТААТаАаААТа,СаАаАССТОСАСТСАСТОСААААСА
САДАСапААААТаасаАпААСААТТАЧИТСААААСТТопААСАААТААаАТаасСсТаАТТаААСАА асТаАпАСАСАААТТаААсСАТтТААСАСАСпААТАИТ ТТ аАаСААДАТААСАТТТАТАСААИаССТТАСАСа
СТАСТАТТТОААДИТаспААСААСпАСАТААаААСТТ ТТ ТТ САаСТТАТТТААТААТААДААААСАС
ССтТТаттТсСтТАСТ (5ЕО ІО МО: 21)
Збирання рекомбінантних вірусів здійснювалося шляхом трансфекції клітин МЕКО вісьмома плазмідами, що кодують геномні немодифіковані фрагменти вірусу грипу, і химерний М5 геномний фрагмент, використовуючи метод електропорації плазмідної ДНК (Сеї! іпе
Мисіеоїесіого КІії М (ІГопла)) відповідно до інструкції до застосування. Після трансфекції клітини інкубувалися у середовищі Оріїрго (Іпмігодеп) протягом 96 годин при 34 "С із додаванням трипсину 1 мкг/мл для забезпечення посттрансляційного розщеплення попередника гемаглютиніну на субодиниці НА! і НА2. Вірусний врожай із клітин Мего використовувався для зараження 10-денних курячих ембріонів (ЗРЕ). Ембріони інкубувалися протягом 48 годин при 34 б, після чого алантоїсні рідини, що мають позитивний титр у реакції гемаглютинації, використовувалися для проведення наступних пасажів на курячих ембріонах. Алантоїсні рідини 7 пасажу очищалися за допомогою тангенціальної фільтрації і ліофілізувалися для зберігання.
Імунізація тварин проводилася після розчинення ліофілізату дистильованою водою в еквівалентному об'ємі. 60 Приклад 6
Протективна відповідь відносно гетерологічних штамів вірусу грипу А і В при контрольному зараженні мишей
З метою визначення протективної активності відносно гетерологічних антигенних варіантів вірусу грипу для імунізації мишей був використаний грипозний вектор у дозі 6,8 І0д ЕІДзхо /мишу, що вводився інтраназально в об'ємі 50 мкл під легкою анастезією, одноразово або дворазово з періодом у З тижні. Через 21 день після останньої імунізації тварини були піддані контрольному зараженню патогенними для мишей штамами вірусу грипу: гомологічним А/Саїйогпіа/7/09 (НІМІрат) або гетерологічними А/Аїспі/2/68 (НЗМ2), А/Мів5ізвіррі/85/1 (НЗМ2) або вірусом грипу
В/ ее/40, взятими в дозі, що відповідає 3-5 ЛдДбо, відповідно.
Як видно з Фіг. 9А, контрольне зараження не імунних мишей вірусом НІМІрат приводило до їхньої загибелі в 90 95 випадків. У той же час, миші, імунізовані вірусним препаратом одноразово або дворазово, були вірогідно захищені від загибелі.
Як видно з Фіг. 9В, контрольне зараження не імунних мишей вірусом А/Аїіспі/2/68 (НЗМ2) приводило до їхньої загибелі в 100 95 випадків. У той же час, миші, імунізовані вірусним препаратом одноразово або дворазово, були вірогідно захищені від загибелі.
Як видно з Фіг С, контрольне зараження не імунних мишей вірусом
А/Мів5і55іррі/85/1 (НЗМ2) приводило до їхньої загибелі в 100 95 випадків. У той же час, миші, імунізовані вірусним препаратом дворазово, мали 100 95 захист.
Як видно з Фіг. 90, контрольне зараження не імунних мишей вірусом грипу В/ ее/40 приводило до загибелі тварин у 100 95 випадків. У той же час, миші, імунізовані вірусним препаратом дворазово, мали 60 95 захисту, що вірогідно відрізняється від контролю.
Таким чином, грипозний вектор, що несе химерний М5 геномний фрагмент, виявляв ознаки універсальної грипозної вакцини, ефективної відносно як гетерологічних антигенних підтипів вірусу грипу А, так і відносно вірусу грипу В.
Приклад 7
Протективна відповідь відносно гетерологічного штаму вірусу грипу А (НЗМ2) при контрольному зараженні тхорів
Тхори є оптимальною, рекомендованою ВООЗ моделлю для вивчення ефективності протигрипозних вакцин і препаратів. З метою визначення протективної активності відносно
Зо гетерологічного антигенного варіанта вірусу грипу для імунізації тхорів (9 на групу) був використаний грипозний вектор, отриманий у Прикладі 5, у дозі 7,5 І0д ЕІДво/тхора, що вводився інтраназально в об'ємі 500 мкл під легкою анастезією, одноразово або дворазово з періодом у З тижні. Через 21 день після останньої імунізації тварини були піддані контрольному зараженню патогенним для тхорів вірусом грипу А/51.Регег5Бригд/224/2015 (НЗМ2). Як видно з Фіг.10А, контрольне зараження не імунних тварин приводило до підняття температури тіла на 2-у добу після зараження, у той час як вакциновані тварини не мали температурної реакції.
З метою вивчення ефекту вакцинації на репродукцію контрольного вірусу в респіраторному тракті тхорів у тварин були узяті носові змиви на 2, 4 і б день з метою визначення в них концентрації інфекційного вірусу шляхом титрування 50 95 цитопатичної дози в культурі клітин
МОСК. Як видно з Фіг. 108, контрольне зараження не імунних тхорів приводило до активної репродукції вірусу без істотного зниження титрів до б дня. При одноразовій імунізації тхорів вірогідне зниження вірусного титру спостерігалося на 4 і 6 день після контрольного зараження.
Після дворазової імунізації вірогідне, більш ніж 100-кратне, зниження вірусного титру реєструвалося вже на 2-ий день після зараження тварин.
Таким чином, навіть одноразова вакцинація тхорів грипозним вектором приводила до захисту тварин від клінічних проявів у вигляді температурної реакції і сприяла прискореній елімінації контрольного гетерологічного штаму з респіраторного тракту. Повторна імунізація сприяла прискоренню процесу вірусної елімінації.
Приклад 8
Онколітичний ефект грипозного вектора, що кодує мікобактеріальний білок Езаїб
З метою визначення онколітичного потенціалу атенуйованих грипозних векторів, що несуть химерний М5 геномний фрагмент із гетерологічним геном Мер, віруси були використані для терапії меланоми мишей, індукованої шляхом введенням 105 клітин В1б в об'ємі 30 мкл у підшкірний простір правої задньої стопи. Використовувалося 10 тварин на групу. Терапія проводилася на 5 день після введення пухлинних клітин шляхом ін'єкції 30 мкл вірусного препарату або фосфатного буферного розчину безпосередньо в зону пухлинного росту. Ін'єкції проводилися 4 рази кожний третій день, після чого оцінювалися швидкість збільшення об'єму ураженої стопи і виживаність тварин протягом 85 днів. Тварин з пухлинами, що досягли 2000 мм, присиплялися з етичних розумінь і вважали загиблими. бо Для лікування меланоми був використаний вектор, який експресує мікобактеріальний антиген Езаїб у дизайні, що передбачає 2А опосередковане посттрансляційне відщеплення білка Езаїб від С-термінальної частини укороченого М5ЗІ1 білка вірусу грипу М5124-2А-Езаїб (Фіг. 3, БЕО ІЮ МО:12). Як контрольний терапевтичний агент використовувався вірус М5124/Мер-
І еп, що не має вставки мікобактеріального білка.
На Фіг. бА представлені результати вимірювання об'єму стопи на 19 день після введення пухлинних клітин. Несподівано виявилося, що найменший середній об'єм мали стопи мишей, що одержували терапію вектором, який експресує білок Езаїб. Цей результат виявився в кореляції з виживаністю мишей протягом тривалого терміну спостереження 85 днів (Фіг. 6Б). З з тварин групи М5124-2А-Езаїб виявилися в стадії ремісії пухлинного росту, у той час як 10 тварини в інших групах загинули до 60 дня. Таким чином, отримані дані свідчать про перевагу онколітичного вектора, який кодує бактеріальний антиген.
Приклад 10
Склад вакцини на основі грипозного вектора для інтраназальної імунізації
Вакцина, яка містить грипозний вектор, отриманий у Прикладі 1 або Прикладі 5, у кількості від 6,5 до 8,5 Ід ембріональних 50 95 інфекційних доз (ЕІДво)/мл, і буферний стабілізуючий розчин, що містить 0,9 мас. 96 розчину хлориду натрію, 0,5 мас. 95 І -карнозину, 2,5 мас. Фо сахарози, 1 мас.95 рекомбінантного альбуміну, 1 мас. І-аргініну і З мабс. 95 гідроксіетилованого крохмалю 130/0,4 (молекулярна маса - 130 кДа, ступінь молярного заміщення - 0,4).
Приклад 11
Склад вакцини на основі грипозного вектора для інтраназальної імунізації
Вакцина, яка містить грипозний вектор, отриманий у Прикладі 1 або Прикладі 5, у кількості від 6,5 до 8,5 Ід ембріональних 50 95 інфекційних доз (ЕІДво)/мл, і буферний стабілізуючий розчин, що містить 0,9 мас. 96 розчину хлориду натрію, 0,1 мас. 95 І -карнозину, 2,5 мас. Фо сахарози, 1 мас.95 рекомбінантного альбуміну, 1 мас. І-аргініну і З мабс. 95 гідроксіетилованого крохмалю 130/0,4 (молекулярна маса - 130 кДа, ступінь молярного заміщення - 0,4).
Приклад 12
Склад вакцини на основі грипозного вектора для онколітичних цілей
Вакцина, яка містить грипозний вектор, отриманий у Прикладі 1, у кількості від 6,5 до 10,5
Ід ембріональних 50 95 інфекційних доз (ЕІДво)/мл, і буферний стабілізуючий розчин, що містить 1,35 мас. 95 розчину хлориду натрію, 0,5 мас. 95 І -карнозину, 1 мас. 95 рекомбінантного альбуміну, 1 мас. 95 І -аргініну і З мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю 130/0,4 (молекулярна маса - 130 кДа, ступінь молярного заміщення - 0,4).
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ «ФАРМІНТЕРПРАЙСЕЗ» «1205 АТЕНУЙОВАНІ ГРИПОЗНІ ВЕКТОРИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ І/АБО ЛІКУВАННЯ
ІНФЕКЦІЙНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ, А ТАКОЖ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ОНКОЛОГІЧНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ «1305 2420-30155980/061 «1405 «1415 «1505 2 2015147703 «1515 06.11.2015 «1505 2016111907 «1515 30.03.2016 «1605 21 «1705 РавепсІпПп уекгквзіоп 3.5 «2105 1 «2115 890
Гс10) «2125» ДНК «213» Вірус грипу А
«223» М5 фрагмент вірусу грипу А/РЕ/8/34 (НІМ1) «4005 1 адсаааадса доддеЕдасааа дасаєаасдда аєссааасас єДдЕдЕСВаадс ЕЕЕєСсСадатвад (216) асгєсєдсЕвеєсеЕ єєЧддсаєдес сдсааасдад Ссдсадасса адаассаддс даєсдссссає 120
ЕссеЕєдаєсуд дсЕЄсодссда даєсадааає ссссаададда ааддддсадс асссеЕсддЕс 180
БЕддасаєсда дасадссаса сдєдссддаа адсадасадс ддадсододасс ссдааадаад 240 ааєссдаєда доасасеєсааа аєдчассаєсддуд ссеЕССдвасс сдсооєсдяасуаєЄ гасстгаассд Зоо асаєдасеєсе єдаддаааєд Єсаадддаає ддсссасдсс сасасссаад садааадес 949 3З6о саддсссссс ссдсассада асддассадд сдаєсаєдда гбааааасаєс агсасеєдааад 420 сдаассссад Єдедассссс дассддссдуа адасестаає ассдссаадда дсеЕсссассд 480 аачадоададс ааєєдеЕєсддс даааєсссас сассдссссс ссеЕсссадда сасбассдссд 540 адчаєдеЕсаа ааасодсадеє ддадссссса СсоодадчдасеЕ Єдааєсддаасє дасаасасад 60
ЕЕСсСЧдадеЕсеєс Єдааасеста садачасссд сссодадаад садсааєдад ааєддоададасєс 6бо ссссасссас сссаааасад ааасдадааа сддсдддаас аассаддеса даадессдаа 720 чаааєаачає доадєєдаєєда адаадсдада сасааассда аддсаасада даасадесссес 78о0 чадсаааєсаа саєєвтаєдса адссеЕсасає ссассдсссд аадсоддадса ададасаада 840 асЕєєсеєсає сеЕСсСадсесвтає єсааєсаасаа аааасасссє ЄдеЕесссасяе 890 «2105 2 «2115» 869 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Рекомбінантний М5 фрагмент вірусу грипу А з укороченою рамкою зчитування білка М5Б1 і послідовністю Мер, отриманою від вірусу
А/5іпдароге/1/57 (Н2М2)
Зо «4005 2 адсаааадса доддеЕдасааа дасаєааєдда аєссааасас єДдЕдЕСВаадс ЕЕЕєСсСадатвад (216) асгсєдсЕсеєсеЕ ЕєЄдсаєдес содсааасддад Єсдсадасса адаассадає даєсдссссає 120
ЕссеЕєдаєсу дсеЕєсодссда даєсадааає сссгаададда ааддддсадс асеЕсеЕтроддеЕс 180
Еддасаєсдда дасадссаса сдєдсЕддаа адсадасадс ододадсодаєє седааадаад 240 ааєссдаєда ддсасеєсааа аєдассаєдда ссеЕСЕЧдрасс гдсдеЕСдсудЕ гасстгаассд Зоо асаєдасесе Еєдаддаааєд єсаадддаає ддессаєрдсе сагбасссаад садааадес9д9у 3З6о саддсссссс ссдсассада асддассадда сдаєсаєдєд асаасаааде деЧдасссесд 420 ассддсеєдда дасеєЕстааса єєдсвааддд сЕсЕсассда ададодоададса асрсєдеЕсдвоасд 480 ааарєссасс ассдсссссе сЕєЄССсСаддас асассааєда ододаєдеЕсСааа ааєдсааєссд 540 чадЕСсСсСЕСає содаддасеє дааєддааєд асаасасаде ЕсдадеЕсься аааасестас 60 ачачаєєсдс ЕЄєдЧдЕЧааас адсааєдада асдоададасс сссасесасес ссаааасада 6бо аасоддаааає досдадааса аєсаддеєсаа аадесссдаадч аааєсаачаєд дссєдаєсдваа 720 чаадеєдадас асаааєєдаа даєсаасадад аасадеЕсссд адсааасаас асссаєсдсаа 78о0 дсесЕсбасадс басстаєссда адеддаасаа дадаєаадаа СЕСССЕСЯЄЄ Єсадсетасяе 840 бааєааєааа ааасасссєє дясеЕссвасе 869 «2105 З «2115» 869 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Рекомбінантний М5 фрагмент вірусу грипу А з укороченою рамкою зчитування білка М5Б1 і послідовністю Мер, отриманою від вірусу
А/Ттепіпдгад/134/47/57 (Н2М2) «4005 З адсаааадса доддеЕдасааа дасаєааєдда аєссааасас єДдЕдЕСВаадс ЕЕЕєСсСадатвад (216) (516) асстдссееєсс єєддсасдеЕс сдсааасддад ЄсСдсадасса адаастадчдеЕ даєдссссає 120
ЕссеЕєдаєсу дсеЕєсодссда даєсадааає сссгаададда ааддддсадс асеЕсеЕтроддеЕс 180
Еддасаєсда дасадссаса счдєдсеЕддаа адсадчасаде ддадсододаєє седааадаад 240 ааєссдаєда ддсасеєсааа аєдассаєдда ссеЕСЕЧдрасс гдсдеЕСдсудЕ гасстгаассд Зоо асаєдасесе Еєдаддаааєд єсаадддаає ддессаєрдсе сагбасссаад садааадес9д9у 3З6о саддсссссс ссдсассада асддассадда сдаєсаєдєд асаасаааде деЧдасссесд 420 ассддсєдда чассстааса СЕдссаадду ССЕЕсСассдда ададодчадса асгєдссд9асд 480 ааарсєєсасс арєсєдссеЕєсеЕ сЕєСсССсаддас агсасгааєда ддаєдесааа аардсааєвд 540 чадЕСсСсСЕСає содаддасеє дааєддааєд асаасасаде ЕсдадеЕсься аааасестас 60 ачачаєєсдс ЕєєЧддадаадс адсааєдада асдоададасс сссасесасес ссаааасада 6бо аасоддаааає досдадааса аєсаддеєсаа аадесссдаадч аааєсаачаєд дссєдаєсдваа 720 чаадеєдадчас асаааєсдаа даєаасадад аасадсеЕссд адсааасаас арєсагасаа 78о0 дессЕсасадс басвтаєєєда адесддаасаа дадчаєаадаа сСЕСЕссСЕсСЯєЄє Єсадсесаєсс 840 бааєааєааа ааасасссєє дясеЕссвасе 869 «2105 4 «2115 124 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок без вставки чужорідної послідовності «4005 4
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 в) 10 15
Тер Нів Уаі Акуд Гпув Агуд Уаі Аза Авр сіп бій ІТец о1у АвБр Аїа 20 25 30
Рко Рпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агд Авр о біп ув бек Гей Агд 1У
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза
Зо 50 з9 (210) с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90 35 ТПЕ Авр Меє ТБПг Іїей сбіц бій Месє бек Акуд бій Тгр бек Меє Гец 95 100 105
ІТ1е Рго пув біп Гуз Маії Аза сіу Рго Іїеп Сув Іїе Агд Меє Авр 110 115 120 сіп Аїа І1е Меє 40 «2105 15 «2115 311 «212» Білок 45 «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю частини субодиниці НА? вірусу грипу А «4005 15
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 в) 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рко Рпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агд Авр о біп ув бек Гей Агд 1У 35 40 45
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза 50 з9 (210) (516) сі1у Ппув біп Іїе Уаі бій Агуд І1е Гецш Ппув бій бій бек АБр біц 65 70 75
Зо
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Гей 95 100 105
ІТїе Рго Пув біп Ппув Уаі Аїа с1іу Ркго Гей Сув Іїе Акуд Меє Авр 110 115 120 біп Аї1а І1е Меє сіу сіу сіу Гей Рпе сіу Аїа І1е Аза с1у РБПе 125 130 135
І1е сіц сіу б1у Тер ТПпг сіу Меє І1е АвБр с1у Тгр Тук 01Уу Туг 140 145 150
Нів Нів сбіп Авп о біц біп б1і1у бек с1іу Туг Аї1а А1а Авр сіп Гув 155 160 165 зек ТПг біп АБп Азїа І1е АвБп біу І1е ТПг АвБп о Гпув Уаі Авп о ТПг 170 175 180
Уаї І1е сбіцш Ппув Меє АвБп І1е сбіп Рпе ТПг Аза Уаї с1у Ппув с1ци 185 190 195
Рпе Авп пуб ІТец б1цп Гпув Агуд Меє бій Авп Гей Авп о Гпув Гпув Уаї 200 205 210
Авр Авр с1і1у Рпе Іецшц Авр І1е Тр ТПг Туг АБп Аза сіц Гей Іей 215 220 225
Уаї Гей Гей бій Авп бій Агуд ТПг Гей Авр Рбе Нібв Авр 5ег Авп 230 235 240
Уаї пув Авп Гей Тук бій пув Уа1і Ппув бек біп Гей пуб АвБп Авп 245 250 255
А1ї1а Ппув сій Іїе б1у АвБп сіу Сув Рпе бій Робе Тук Нів Ппув Сув 260 265 270
Авр Авп осбіц Сув Меє біц бек Уаі Агд АвБп о с1іу ТПг Туг Авр Туг 275 280 285
Ркго Ппув Тук бек біц бій Бек Гув Тецй АвБп Агд бій Гпув Уа1 Авр
Зо 290 295 300 сі1у Маї Гпув Гей бій Бек Меє с1у І1їе Тук сіп 305 310 «2105 6
З5 «211» 284 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» 40 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю частини субодиниці НА? вірусу грипу А «4005 6
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 45 1 в) 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рко Рпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агд Авр о біп ув бек Гей Агд 1У
Агуд сбіу бек ТПг Гей с1іу Гей Авр І1їе сій ТБПг Аїа ТПг Агуд Аїа 50 55 бо с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Гей 95 100 105
ІТ1е Рго пув біп Гуз Маії Аза сіу Рго Іїеп Сув Іїе Агд Меє Авр 110 115 120 (516) сіп Аїа І1е Меє сіу сіу Аїа Уа1ї с1у Ппув бій Рбе Авп ГПув Гей 125 130 135 бі гув Акуд Меє бій Авп Гей Авп о Гув пув Уаі Авр Авр с1у РІПе 140 145 150
Тец Авр І1е Тер ТПг Туг Авп Аза бій Гей Гей Уаї Ггец Гец сій 155 160 165
Авп обі Акуд ТБг Гей Авр Рпе Нів Авр бек Авп Уаї! Гпув Авп ТІецй 170 175 180
Тук біц пув Уаї Ппув бек біп Гей пув АвБп АБп Аїа Гув бій Ше 185 190 195 б1у Авп сб1іу Сув Рпе бій Рпбе Тук Нів Ппув Сув Авр АвБп бій Сув 200 205 210
Меє сій бек Уаі Агуд Авп сіу ТПг Тукг Авр Тук Рго Ппув Тукг вег 215 220 225 бі бій бек Ппув Гей Авп Акуд бій Ппув Уаі Авр сіу Уаї Ппув Іей 230 235 240 сій бек Месє с1іу І1їе Туг сбіп І1е еп Аза І1їе Туг бек ТПг Уаї 245 250 255
А1їа бек бек Ггец Уаї Іец Іец Уаї бек Іец б1у А1ї1а І1е бек РПе 260 265 270
Тер Меє Сув Бек Авп біу бек Гец біп Суб Агуд І1е Сув Ше 275 280 «2105 7 «211» 289 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю частини субодиниці НА? вірусу грипу А
Зо «4005 7
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рго Рпе Гей Авр Агд Гецп Агуд Агуд Авр біп Гуз бек Геч Агкд с1Уу 35 40 45
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза 50 55 бо с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Гей 95 100 105
ІТїе Рго Пув біп Ппув Уаі Аїа с1іу Ркго Гей Сув Іїе Акуд Меє Авр 110 115 120 біп А1ї1а чІ1е Меє сіу сіу сіу Тук Нів Нів біп Авп біц біп с1Уу 125 130 135 зек сіу Туг Аї1а Аза Авр біп Гув бек ТПг біп АБп Аза Ії1їе Авп 140 145 150 б1у І1е ТПг Авп о Гпув Уаі1 Авп ТБПг Уаії І1ї1е сій пув Месє АвБп І1е 155 160 165 біп Рпе ТпПг Азїа Уаі1і с1у пув сій Рпе Авп пув Гей біц Гув Агд 170 175 180
Меє бій АвБп Гей Авзп о Гув Ппув Маі! Авр Авр сбіу РоПе Гей Авр І1е 185 190 195
ТЕр ТпПг Туг Авп Аза біц Іецш Гей Уаї Гец Те б1цп АБп бій Агд 200 205 210
ТПЕ гей Авр Рбе Нібв Авр бек Авп Уаі! пуб Авп Гей Тук сій Гув 60 215 220 225
Уаї Ппув Бек біп Гей пув Авп А5п Аїа пув біц І1е б1у АБп щЩ1У
230 235 240
Сув Рпе бій Рпе Тук Нів Ппув Сув Авр Авп бій Сув Меє біц 5ег 245 250 255
Уаї Агкд Авп б1іу ТПкг Тук Авр Тук Рго Ппув Тук бек біц сіц 5ег 260 265 270
Тув теп Авп Агуд бій Ппув Уаі1і Авр сіу Уа1 пув Гей біц бек Меє 275 280 285 с1у І1е Тук сіп «2105 8 «2115» 294 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «220» «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю НА? субодиниці вірусу грипу В «4005 8
Меє Авр Рго Авп ТПг о Уа! бек бек Рпе сбіп Уаі Авр Сув Рре Гей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рко Ріпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агуд Авр біп пув бек Гец Агд с1Уу
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза бо сб1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув біц бій бек АБр с1и 65 70 75
Зо А1ї1а Ггечп пув Меє ТПг Месє Аза бек Уаі Рго Аїа бБег Агд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Іеєц 95 100 105
ІТ1е Рго Ппув біп Гуз УМаї Аза сб1у Ркго Іїеп Сув Іїе Агд Меє Авр
З5 110 115 120 біп А1ї1а чІ1е Меє сіу сіу сіу Рпе Рпе сіу Аїа І1е Аза с1у РБПе 125 130 135
Тецп б1п с1у с1у ТЕр біш сіу Меє І1ї1е Аза с1іу Тер Нів сі1у Туг 140 145 150 40 ТПг Бек Нів с1у Аїа Ні сіу Маі Аїа Уаі Аза А1ї1а Авр Геч Гув 155 160 165 зек ТПг біп біц Аза І1е АБп Гу І1е ТПг Гув Авп Гей Авп о бег 170 175 180
Тецп бек бій Гей бі Уаі1! Ппув Авп Гей біп Агд Гей бег С1у А1а 45 185 190 195
Меє Ап с1у гейш Нів Авр сіц Іїе гейш сій Гей Авр бі Гув Уаї 200 205 210
Авр Авр Гей Агуд Аза АвБр ТПг І1е бег бек біп І1е сій Гей Аїа 215 220 225 50 Уаї Гей Гей бек Авп бій с1у І1е І1е Авп бек бій АБр бій Нів 230 235 240
Тецп теп Аї1а Гей бій Агуд пув Гей Ппув Ппув Меє Гей с1іу Рго 5ег 245 250 255
А1їа Уа1 сіц І1ї1е с1у Авп б1у Сув Рпе бій ТПг Ппув Нів Гпув Сув 55 260 265 270
Авп обіп ТБг Сув Гец Авр Агуд І1е Аїа Аза сб1у ТПпг Рпе АБп Аїа 275 280 285 б1у Авр Рпе бек Гей Рго ТПг Рпе Авр 290 60 «2105 19
«211» 158 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю частини субодиниці НА? вірусу грипу А ї послідовністю В-клітинного епітопу МР білка вірусу грипу А «4005 9
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рго Рпе Гей Авр Агд Гецп Агуд Агуд Авр біп Гуз бек Геч Агкд с1Уу 35 40 45
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза 50 55 бо с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бек Агуд сій Тгр Бек Меє ГІец 95 100 105
ІТїе Рго Пув біп Ппув Уаі Аїа с1іу Ркго Гей Сув Іїе Акуд Меє Авр 110 115 120 біп Аї1а чІ1е Меє сіу сіу сіу Гей Рпе сіу Аїа І1е Аї1а с1у РПе 125 130 135
І1е сіц сіу б1у Тер ТПпг сіу Меє І1е АБр с1у Тгр б01у с01у Аг4д
Зо 140 145 150 бі бек Агд АвБп Рго с1у Ап Аїа 155 «2105 10
З5 «211» 158 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю частини субодиниці НА? вірусу грипу В і послідовністю
В-клітинного епітопу МР білка вірусу грипу А. «4005 10
Меє Авр Рго Авп ТПг о Уа! бек бек Рпре сбіп Уаі Авр Сув Рре Гей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рко Ріпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агуд Авр біп пув бек Гец Агд с1Уу 35 40 45
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза 50 55 бо сб1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гец пув біц б1іц бек АБр с1и 65 70 75
А1ї1а Ггечп пув Меє ТПг Месє Аза бек Уаі Рго Аїа бБег Агд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє ГІец 95 100 105
ІТ1е Рго Ппув біп Гуз УМаї Аза сб1у Ркго Іїеп Сув Іїе Агд Меє Авр (516) 110 115 120 біп А1ї1а чІ1е Меє сіу сіу сіу Рпе Рпе сіу Аїа І1е Аза с1у РБПе
125 130 135
Тецп б1п с1у с1у ТЕр біш сіу Меє І1ї1е Аїа с1іу Тер сС1у с1у Агд 140 145 150 бі бек Агд АвБп Рго с1у Ап Аїа 155 «2105 11 «2115 221 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю білка Еваєб мікобактерії туберкульозу «4005 11
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30
Рко Рпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агд Авр о біп ув бек Гей Агд 1У 35 40 45
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза 50 55 бо сі1у Ппув біп Іїе Уаі бій Агуд І1е Гецш Ппув бій бій бек АБр біц 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Гей
Зо 95 100 105
ІТ1е Рго Ппув біп Гуз Маї Аза сіу Рго Гей Сув І1е Агкд Меє Авр 110 115 120 біп Аї1а І1е Меє сіу сіу Меє ТП бі біп сбіп Тгр АвБп Робе А1а 125 130 135 с1у І1е бі Аза Аза Аза бек Аїа І1е сіп сб1у АвБп Уаії ТПкг 5ег 140 145 150
І1е Нів бек Іец ІТец Авр бій біу Ппув біп бек Гей ТПг Ппув Гей 155 160 165
Аза Аза Аза Тгр сіу біу бек сбіу бек біц Азїа Тук бі1іп сіу Уаї 170 175 180 біп бі1іп гув Тер Авр Аїа ТПг Аза ТПг бій Гей Ап Ап Аїа Іей 185 190 195 біп АвБп Гей Аза Агуд ТпПг Іїе Бек бій Аїа сіу сіп Аїа Меє А1за 200 205 210 зек ТпПг бі б1у АвБп Уа! ТПг сіу Меє Рібе А1а 215 220 «2105 12 «211» 238 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовністю пептиду 2А, що саморозщеплюється, і послідовністю білка Еваєб мікобактерії туберкульозу «4005 12
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей (516) 1 в) 10 15
Тер Нів Уа1 Агд Пув Агд Уаі Аза АвБр сбіп сій Геш С1у Авр Аї1а
20 25 30
Рко Рпе Гец Авр Агд Тецй Агуд Агд Авр о біп ув бек Гей Агд 1У 35 40 45
Акуд сіу бек ТПг Іец б1у Гей АвБр І1е сій ТПг Аза ТіПг Агд Аза 50 з9 бо с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 65 70 75
А1їа гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аї1а бек Агуд Тукг Іей 80 85 90
ТПЕ Авр Меє ТБПг Іїей сбіц бій Месє бек Акуд бій Тгр бек Меє Гец 95 100 105
ІТ1е Рго Ппув біп Гуз УМаї Аза сб1у Ркго Іїеп Сув Іїе Агд Меє Авр 110 115 120 біп А1ї1а І1е Меє сіу с1у Авп Рпе Авр Гей Гей пув Гец Аїа с1Уу 125 130 135
Авр Уаі1 сіц бек Авп Рго б1у Ркго Меє ТПпг бій сбіп біп Тер Авп 140 145 150
Рпе Аїа сіу І1е б1п Аза Аза Аза бек Аза ч1І1е сбіп с1у Авп Уаї 155 160 165
ТПЕ Бек Іїе Нів бек Гецй Гей АвБр сій с1у Гув біп Бек Ге ТПг 170 175 180 пуб Теп Аза Аза Аза Тер сіу сіу Бек сіу Бек бій Аза Тукг сіп 185 190 195 сі1у Маї біп сбіп пув Тер Авр Аїа ТПг Аїа ТПг сій Гец АвБп АвБп 200 205 210
А1їа гей сбіп Авп Тец Аза Агуд ТПг І1е бек б1цш Аза сС1у сіп Аїа 215 220 225
Мен АзТа бек ТПг сій с1у Авп Уаі1і ТПг сіу Месє Рібе А1а 230 235
Зо «2105 13 «2115 172 «212» Білок «2135 Штучна послідовність
З5 «220» «223» Укорочений М51 білок, що продовжується послідовностями
Т-клітинних епітопів вірусу простого герпесу (НБУ) 1 1 2 типів 40 «4005 13
Ме Авр Рго Авп о ТПг Уа1 бек бек Рпе біп Уаі Авр Сув РПе Іей 1 5 10 15
Тер Нів Уа1 Агуд Пув Агд Уаі Аза Авр сбіп біцш Іец с1у АБр Аїа 20 25 30 45 Рго Рпе Гей Авр Агд Гецп Агуд Агуд Авр біп Гуз бек Геч Агкд с1Уу
Акуд сбіу бек ТПг Гец б1у Тецй Авр І1е біцш ТПг Аза ТПг Агуд Аза бо с1у гув біп І1е Уаі бій Акуд чІ1е Гей пув бій бій бек АвБр бій 50 65 70 75
Аза гей пув Месє ТПг Меє Аза бек Уаі Рго Аза бек Агуд Тук Іец 80 85 90
ТПгЕ Авр Меє ТПг Ггец біц біц Меє бБег Агуд біц Тгр бек Меє Гей 95 100 105 55 ІТїе Рго Пув біп Ппув Уаі Аїа с1іу Ркго Гей Сув Іїе Акуд Меє Авр 110 115 120 біп Аї1а І1е Меє Аза Аза Аїа АБп Гей Гей ТПг ТПг Рго пув РБе 125 130 135
ТП Аза Аза Аза Акуд Меє Іец б1у Авр Уаі Месє Аї1а Уа1ї Аза Аза 60 140 145 150
Аза Авп Гей Гец ТПг ТБ Рго пув Рое ТПг Азїа А1а А1а Агу Меє
Зб
155 160 165
Тец б1у Авр Уаі1і Меє Аїа Уаї 170 «2105 14 «2115» 2341 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/РВ/8/34 (НІМ1) «220» «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента РВ2 «4005 14 адсдааадса ддеєсааєсає аєєсаасаєд дааадаасаа аадаассасуд аааєссааєд (216)
Есдсадесес дсасссусуда дасасесаса аагвгассассу Єддассаває ддссаєЄааєс 120 аачаадсаса саєсаддаад асаддадаад аасссадсас Ссаддаєдаа асдддаєдаєд 180 чдсааєдааає аєссааєсас адсадасаад аддасаасдда аааєдасссс сдададааає 240 чадсааддас ааасеЕєсаєд дадеаааасд аасдаєдсся даєсадасся адсдаєоаваса Зоо
ЕсассеЕсєдд сеЕдЕеЕЧдасаєд деддаасадда аасддассаа Саасааасас адесссаєтсає 3З6о ссааааасєсє асаааасеєса ЄС дааада дЕсСдаааддудс Сааадсаєдуа аассЕстсодс 420 ссбдсссасс сСсадааасса адссаааага содссододадад Єсдасаєсааа Есстьддесає 480 чдсадаєсєса деЕдссаадда додсасаддає дсаассаєдуад аассдЕссс ссссаасдаа 540 чЧЕЧдоддадсса ддаєсассаас аєсодддаассду саассаасда Саассааада даадааадаа 60 чаасеєссадд аєєдсаааає ЄЄСЕССЕСс9 асддеЕсдсає асаєсдессдда дададаассд 6бо дЕссдсааага счадаєсссе сссадеддсЕ ддЕодддаасаа дсадедсдса саєсдаадесд 720
Еєдсаєєєда сесааддаас аєдседддаа садаєдсаса ссссаддадда ддаадсдадд 78о0 ааєчаєчдчаєд ЄєЄЧчаєсааад сеЕєЄЧчаєсасс дссдссадда асасадсдад аададсесдса 840 чЧдЕаєсадсад аєссастадс аєсеЕєсаєсс дадасдсдсс асадсасаса чаєссодсовдва 900 аєсаддаєдда бадасаєссє баддсадаас ссаасадаад адсаадссдс ддасагсаєсдс 960
Зо ааддсєдсаа Єдддассдад ааєсадссса СссеЕссадеЕє Есоодесддасє сасаєстєаад 1020 адаасаадсуд даєсаєсаде саадададад даададдсдс Ссасдддсаа Ссоссаааса 1080 бЕдаадаєаа дадедсаєда додасаєдаа дадеЕссасаа бддЕсддчад аададсааса 1140 дссаєасеєса даааадсаас саддадаєєд аєссадседа бадедадедуд дададасдаа 1200 садеЕсдаєсд ссддаадсаає ааєсдеЕддсесс аєддараєьс сасаададда ЄЕДдеаєдаєва 1260 ааадсадесса дадоаєдчаєсеЕ дааєсєсаєс аагадддсда ассаасдчаєс дааєсстаєд 1320 саєсаасесЕеЕ Еаадасаєєє єсадааддає дсдааадедс ЕСЕсСЕСаааа ЄЕдддачаднсе 1380 чаассвтаєсд асааєудєдає додааєдаєс додасаєсьєдс ссдасаєдас Ессаадсаєс 1440 чачаєдеЕСсаа ЄдададдадеЕ дадааєссадс ааааєдддед бадаєдадса сеЕссадсасду 1500 чачадддеад ЄддЕдадсає ЕдассЯяєсес сеЕдадааєсс додадассаасу аддаааєдка 1560 сеасєдесссс ссдаддаддс садсдаааса садддаасад адааасеєдас аасаасесас 1620
Єсаєсдєсаа ЄдчаєдеЕдддда даєєсааєдудє ссєдааєсад ЕдДЕєдЧдЕєсСаа гасстаєсаа 1680 бддаєсаєса даааседдда аасєдесвааа аєссадсддеЕ сссадаассс гасааєсдста 1740 басааєсаааа Єддааєсеєда ассаєсесад ссеЕесадрас сеааддссає гададдссаа 1800 басадедоддЕ ЄЕдЕаадаас ЕСЕДдДЕеЕсссаа саааєдаддад аєдеЕдссвду дасаєседває 1860 ассдсасада СаасаааасеЕ ЕЄсЕсєссссЕесС дсадссудсеЕс сассааадса аадеадааєд 1920 садеЕєсєссь саєстассдЕ дааєдеЕдаду ддаєсаддаа Едадаавасеі сдсаадддас 1980 ааєєсьссьд басесаасса баасааддсс асдаададас Єсасадеесь сддаааддає 2040 чдсЕддсасьс Саассдаада сссадаєдаа ддсасадсвед дадеЕддадесс сдсЕдеєсвд 2100 аддддаєєсс ссаєсссудду сааадаадас аададасаєд ддссадсасе аадсаєсаає 2160 чаасєдадса ассеЕсдсдаа аддададаад дссааєдеЕдс Єааєєсдддаса аддадасдаєд 2220 чЧЕДдЕєдудєаа Єдааасддаа асудддасессї адсасасеса сеєдасадсса дасадсдасс 2280 аааадааєес ддаєддссає сааєтадедЕ сдаасадеЕсе ааааасдасс ЕсУУсЕЄсССсас 2340 є 2341 «2105 15 «2115» 2288 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/РВ/8/34 (НІМ1) 60 «2205 «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента РВІ
«4005 15 аєддаєдеса аєссдассеє асеЕсєесссса ааадсдссад сасаааасдс басаадсаса (216) асЕсєеєсссеЕє аєасеєддада сссессссас адссасддуда саддаасадд асбасассаєд 120 часассдеЕса асаддасаса Ссадсассса даааадуддаа даєсдддасаас ааасассддаа 180 асеєддадсас сдсаасеєсаа сссдасєсдає дддссассдс садаадасаа Сдаассаадес 240
ЧдаЕсаєдссс ааасадаєєд єдеаєсодад дсдасддсессс сссссдадда ассссаєссяо Зоо чдавгаєєєсєвд аааасеєсдєд баєєдааасу асддаддссд СсСсадсааас асдадсадас 3З6о аадсєдасас ааддссдаса дассбаєдас Єддасеєссаа асадааасса асссдссдса 420 асадсаєсєєсдуд ссаасасаає адаадеЕдсеєс адассааасуд дссеЕсасодддс сааєдчадессяе 480 чддааддсеєса бадасеєєссе Єааддчаєдса асддадссаа Сдаасааада адаааєсд9адд 540 аєсасаасес аєсєесеєсадад ааададасдд дсдададаса асасдассаа дааааєдаєа 60 асасададаа сааєдддеєаа ааадаадсад адассдааса аааддадесса Сссааєссада 6бо чдсаєєдассс Єдаасасаає дассааадає дссдададад ддаадссааа асддададса 720 асєсдсаассс саддчдасдса аагаадддоад СЕЄЧдсавасеЕ ЄсСоЯєсдадас ассддасаавд 78о0 адеаєсаєдед адааасеєєда асааєсаддд Ссдссадссд даддсаасда даадааадса 840 аадеЕєддсаа аєдеЕсдеєаад даачаєдаєд ассаассссс аддасассда асссссесесс 900 ассаєсасед дадаєаасас саааєддаас даааассада асссссддає дссЕсессддаес 960 аєдаєсасає аграєдассад аааєсадссс дааєсддеЕєса даааєдеЕєсеЕ аадраєсдсе 1020 ссаасааєдеЕ ЕєСсСЕСааасаа ааєддсдада ссдддаааад ддсагаєдеЕс сдададсаад 1080 адсаєдааас Сгадаасеса аасассрдса даааєдстад саадсаєсда ЕсЕЧдаааєає 1140 бЕсааєдаєс саасаадааа даадаєєдаа ааааєсссдас сдсЕСЕсаає ададдаддасе 1200 чдсаєсаєєда дссссддаає даєдаєддоас аєдеЕссааса ЕдеЕєаадсас ЕдЕаєсаддас 1260 дЕСЕССаєсс Єдааєсссєду асаааадада сСасассаада сеасеєвасс дедоадаєаЧе 1320 сЕЄСсСааєссює седасчдаєєє єдсеЕседасє дсдааєдсас ссааєсаєда аддчаєеєсаа 1380 дссддадесуд асаддеЕсеєса єсдаассвдЕ аадссасесд дааєсаарає дадсаадааа 1440 аадесеЕваса бааасадаас аддбасаєсьс дааєссасаа ЧЯФЕСЕЕЕЕЄсССа ЕСУоєЄтаєда9а 1500 гЕєдЕєдсса арсеЕсадсає ддадсевессс адсеЕседодда єдеЕСєдддає саасдадеса 1560 чдсоддасаєда деаєсоддадеЕ басєдесаєс ааааасааса Єдаєааасаа ЄдаєсеЕсоддвЧе 1620
Зо ссадсаасад сссаааєддс ссеЕссадеЕсд Ессаєсааад ассасаддбра сасдбассда 1680 бдссабадад деЕдасасаса аагсасааасс судаадаєсає ЄєЄдаааєсааа дааассдсд 1740 чадсааассс дЕсссааадс Еддасєдсьд дЕСЕСсСсдасу даддсссааа ЕсСгагасаас 1800 аєсадаааєс Єссасаєсеєсс Едаадессдс сеЕааааєддад ааєєдаєдда Едаддаєсас 1860 садддасЯсЕ гаєдсаассс асеєдаассса ЕСЕдЕСадсс асааадааає Єдааєсааєд 1920 аасааєдсад Єчаєдаєсдсс адсасаєддс ссадссаааа асаєддадса єдасосеЕдвес 1980 дсаасаасас ассссрддає ссссаааада ааєсдаєсса ЄсеЕсдаасас аадесааада 2040 ччадеасевд аддаєдааса ааєдбассаа аддеЕдссдса аєсваєсьда ааааєсссвс 2100 сссадсадее сагасадаад ассадесудду асаєссадта єЕдасодадддс сасодеЕвссс 2160 ачадсссдаа сЄЕДаєдсасу даєєдаєсес дааєсєддаа ддаєааадаа адаададеьєс 2220 асєдачдаєса Єдаадаєссд Есссассаєс даададсеєса дасддсаааа асадеЕдааєє 2280
ЄадсеЕвєве 2288 «2105 16 «2115 2233 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/РВ/8/34 (НІМІ) «2205 «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента РА «4005 16 адсдааадса додбасеєдаєс саааасддаа дассссдсдс дасаасдсессс сааєссддаєд (216) аєєдеЕсдадс єєдсодддаааа аасаасдааа дадсасдддад аддасссдаа аассдаааса 120 аасаааєєєд садсаасаєд сасеєсасссдд даадртаєдсе єсаєдраєеєс адарееессас 180
Ессаєсааєд адсааддсда дЕсааєааєс дгадаасссуд дсдаєссааа Єдсасеєсев 240 аадсасадає єЄдаааєаає сдадоадаада дассдсасаа Сддсссддас адгсадсааас Зоо адеаєєєдса асасрасадуд додседадааа ссааадсессс сСассадассс дсасдаєсас 3З6о ааддадчааса даєєсаєсда ааєєддадса асааддадад аадсссасає абастсаєссд 420 чааааддсса абааааєсаа аєсєдадааа асасасаєсс асасєсєсссєс дЕсСсастс9д99а 480 (516) чаачаааєдд ссасаааддс адассасасе сеЕсдаєдаад ааадсадддс гаддаєсааа 540 ассадасває Єсассаєаад асаадаааєд дссадсадад дсссссддда ССссЕссс9ає 60 садсссдада даддадаада дасааєсдаа даааддеЕссд аааєссасадда аасааєсдсдс 6бо аадсеєєдссу ассааадесе сссдссдаас СсСссссадсес сСсдаааассс сададсстає 720 чЧчЕддаєддає єсдаассдаа соддстасасс дадддсаадс ЄдеЕсссааає дсссааадаа 78о0
ЧдЕаааєдста дааєєдаасс ЄЕЕЕеєсдааа асаасассас дассасссад асссссдаає 840 чадссссссс дЕССЕСадсу дЕССаааєсєс сЕЧдссдаєдо асдссссааа аєсаадсаєєе 900 чаддасссаа деЕсаєдааду ададодааса ссдссасаєсд асдсаассаа асдсаєсдада 960 асавєсеЕсвд даєсдддаадда асссааєдес дЕсСааассас асдааааддд аагаааєсса 1020 ааєтаєсьєс єдссаєддаа дсаадсасьд дсадааседс аддасаєєда дааєсдадвдвад 1080 ааааєеєссаа адассааааа баєдаадааа асаадесадс гааадедддс асеЕсддЕдад 1140 аасаєддсас садааааддЕ адасеЕєєдас дассдсааад аєдеаддєда ЄЕсдаадсаа 1200 баєдаєадед аєдаассада асєдаддєсд сгадсаадеє ддаєєссадаа ЕдадеЕстаас 1260 ааддсаєдсд аасеЕдасада Ессаадссдд агададсесу аєдадаєєдуа адаачаєдед 1320 дсЕССсСааєєд аасасаєєдс аадсаєдада аддааєвтавєс ссасаєсада ддєдЕсЕсас 1380 бдсададсса садааєгасає ааєдаадддд деЕдсасаєса агаседссее дсеЕсааєдса 1440
ЄсЕсдЕдсад сааєддаєда ЕСЕССааєта аєсссааєда Єаадсаадесд гадаасеаад 1500 чаддодааддс дааадассаа сеЕЕдваєдуає сЕСаєсаєбаа ааддаадаєс ссасеЕсаадд 1560 ааєдасассд асдеЕддсааа сСЕЕсЧдєЄдадс агддадеЕвее сеЕсеєСсаседа сссаадасьє 1620 даассасаєа аасоддддадаа дсасЕдЕдьс сеЕсЧдадаєад дадасаєдсе гаєаадааде 1680 дссаєаддсес аддЕсЕсаад дсссасдеєеєс сЕдваєдеда даасаааєду аассесаааа 1740 аєсааааєда аасододаає ддадаєдадуд сдеЕсдссссс сссадеЕсасе Єсаасаааєсе 1800 чачадеаєда ЄЕдаадседа дЕсСсЕСсСЕдЕеЕСсС ааададааад асаєдассаа ададеЕСссте 1860 чадаасааає садааасаєд дсссассдда дадсссссса ааддадсдда ддааадсссс 1920 аєєсдодадаадд Ессдсаддас Есгаєсадса аадесудтає Есаасадссе дсаєсдсаєсь 1980 ссасаасьад ааддаєєсєес адсєдааєса адааааседс ЕссСЕваєсує ссаддсеЕсьє 2040 адддасаасс ЄЕдаассвдуа дассЕсєдає сеЕсододдадс басаєдаадс ааєсоаодад 2100
Єдссеєдаєта аєдасєссстуд ддЕСЕсСусЕС аасусеЕссье ддєєсаасес сеЕссеваса 2160 саєдсаєєда дегадеседед дсадедссас гарсєвєдсває ссасаседеЕс саааааадна 2220
ССЕБЕДЕСЕСЕ ась 2233
Зо «2105 17 «2115 1027 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/РВ/8/34 (НІМ1) «2205 «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента МР «4005 17 адсдааадса доабадаваєє дааачаєдад СсЕсссаасс даддссдааа сдсасддбасес (216) сЕСсаєсаєс ссудєсаддсес сссесааадс сдадчассоса садачассту аачасдчдєссе 120
Едсадодадаад аасасєдаєс єєЧчЧаддЕссо сасддаасдда ссааадасаа дассаасссс 180
ЧдЕСассеєСсвд асеаадддда ЄЄесаддасс содсдсссасду сссассдбдс ссадесдадсд 240 аддасєдсад содбадасдсе ЄєдЕССаааа Сдсссосааєс дддаасдддад асссаааєсаа Зоо сасддасааа дсадссааас Сдсасаддаа дсесаададуд дадасаасає сссаєддддас 3З6о сааадааасєс ссасеєсадчеЕс аєсстудссоод СдсасеЕєдсес адеЕєдсаєдуа дссесасата 420 саасаддчаєсд додддссдсда ссассдааде ддсасрєссддс срддраєдед саасстдеда 480 асадчаєєдсеЕ дасеєсссадс аєсоддсссса сСаддсааасд дсдасаасаа ссаасссасео 540 ааєсадасає дадаасадаа ЄдЧдЕесСсадс садсассаса дссааддсса Єддадсааає 60 часЕддаєсд адедадсаад садсададдс сасддаддеЕс дссадссадда ссадасааає 6бо чдаєдсаадсуд аєдадаасса СЕддддассса Ссссадсссс адедссдЧдЕсС Едаааааєда 720
ЕСсСЕєсСЕєдаа ааєєеєдсадд ссраєсадаа асчаасдддад дсдсадаєсдс аасддесссаа 78о0 чЧЕЧдЧаєссеЕсе содсраєєдсс дсааасаєса сСсдддассєс дсасессдаса Єсдвсддвдвасес 840 геЧсассуєсеЕЮ єс єЄсааа Єдсаєссасс дссдссссаа асасодадассд аааддадддас 900 сЕсссасодда аддадсдсса аадсстаєда додаадааса ссдаааддаа садсададчед 960 сЕДдЕЯддаєдс Едасдаєддає саєєєвєдеЕСса дсаєбададсе ддадсааааа асрассеЕєде 1020
СЕСсасе 1027 «2105 18 «2115 1027
Гс10) «2125» ДНК «213» Вірус грипу А/РВ/8/34 (НІМ1)
«223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента М «4005 18 адсдааадса доабадаваєє дааачаєдад СсЕсссаасс даддссдааа сдсасддбасес (216) сессассаєс ссдссаддес сссссааадс сдадаєсдса сададасеєсд аадасдеЕсее 120
Едсадодадаад аасасєдаєс єєЧчЧаддЕссо сасддаасдда ссааадасаа дассаасссс 180
ЧдЕСассеєСствд асгааддодада ЄЄЕеЕгадчдаєє єдеЕдеЕссасу сесассудрдс ссадедадсд 240 адчдассдсад содсадасдсеЕ СЕдсссаааа СдсссЕгаає доддаасдддд аєссааасєсаа Зоо сасддасааа дсадссааас Сдсасаддаа дсесаададуд дадасаасає сссаєддддас 3З6о сааадааасєс Ссасссадесс ассссдсвдда єдсасеЕсдсес адеЕсдсаєд4оа десессагсага 420 саасаддчаєсд додддссдсда ссассдааде ддсасрєссддс срддраєдед саасстдеда 480 асадчаєєдсеЕ дасеєсссадс аєсоддсссса сСаддсааасд дсдасаасаа ссаасссасео 540 ааєссадасасє дадаасадаа СодЧдссСЕсСадс садсастаса дсгааддсса гддадсааає 60 часЕддаєсд адедадсаад садсададдс сасддаддеЕс дссадссадда ссадасааає 6бо чдаєдсаадсуд аєдадаасса Єєдоодассса Сссгтадсссс адсдссддесс Сдаааааєда 720
ЕСсСЕєсСЕєдаа ааєєеєдсадд ссраєсадаа асчаасдддад дсдсадаєсдс аасддесссаа 78о0 чЧЕЧдЧаєссеЕсе содсраєєдсес дсааасаєса ЕєдоддаєсьЕє дсасеЕєдаса ЕЕЧдгодасес 840 гЕсдаєсєсуєсс єЕСЕееєСяаа Сдсасеєсасс дЕСдСсСЕєСсСаа асасоддасед аааддаддас 900 сЕсссасодда аддадсдсса аадсстаєда додаадааса ссдаааддаа садсададчед 960 сЕдЕдДЧдаєдс Едасдаєдудє саєєеєдеЕса дсаєсададсе ддадеааааа астассеЕєде 1020
СЕСсасе 1027 «2105 19 «2115 1701 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/Са1ітогпіа/09-11ке (Н1ІМІрают) «2205
Зо «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента НА «4005 19 аєдчааддсаа басвсадеадеЕ ЄсЕдстасає асасссдсаа ссдсаааєсдс адасасаєса (216)
ЕдеаєсадЧдесє аєсаєдсааа сааєєсааса дасассдсад асасадсасс адаааадааєс 120
Чдсаасадсаа сасасеєссде Саассесста даадасаадс асаасдддаа ассаєбдсааа 180 ссаададддд Садссссасс дсасстєдддс ааасдсааса Ссдссддссд дассссддва 240 ааєссададе деЕдааєсасе сеЕссасадса адсссаєсддс сссасаєссдс ддааасаєссс Зоо адеЕєсадаса аєддаасудєд Єсасссадда дассссаєса ассасдадда дссаададад 3З6о саасєсдадсс садсдссаєс асссдааадда ЕЄесЧдадаває єссссаааас аадесссає9ада 420 сссааєсаєд асеЕсдаасаа аддсдсаасд дсадсасдес сесасудссду адсааааадс 480
БбЕСвасаааа аєєсаавсаєд дсвадссааа аааддаааєс сасасссааа дсоссадссаа 540
Ессвбасаєса аєдаєааадуд дааачаадсс сссдасдссдс ддддсаєссса ссаєсссаєсе 60 асбрасеєдсед ассаасааад ЄсЕСтаєсад аасдсадаєд сасасдеЕссс соадсодддаса 6бо
Есаадаєаса дсаадаадеє саадссддаа асадсаасаа дасссааадс дадддаєсаа 720 чаачодоадачаа Єдчаастасста сеЕддасасста дгададссду дадасаааасї аасаєсеєсддаа 78о0 чдсаасєддаа аєссадедЧдеЕ ассдадасає дсасссасаа Єддааадчааа Єдссддассе 840 чдабаєстаєса єсссадаєас ассадсссас дассдсааса саасссдсса дасасссддад 900
Чдаєдсраєаа асассадссеє сссаєсссад аасасасаєс сддаєсасаає Сддааааєсдеі 960 ссааадсаєд бааааадсас аааарєдада сєддссасад даєсдаддаа ЄдЕСССДЕСЕ 1020 аєссааєсвта дадассстасеЕ сдддддссаєсє дссодссєса Еєдааддоада дсодасадад 1080 аєддєадаєд даєсддеасду Есаєсассає сааааєдадс аддддеЕсадуд асасдсадсс 1140 чассєдаада дсасасаааа Едссаєєдас аадаєтасса асааадсааа сессдстаєє 1200 чаааадаєда асасасадесє сасадсадесд додсааададс Єсаассассс ддаааааача 1260 асачдадааєсє бааасааааа адеЕєдаєдає дуосеЕссстду асаєєвєддас Есасааєдсс 1320 чдаасеЕдеЕсєдд ЄєСсСваєсода аааєдааада ассеєсоодасе ассаєдаєєсс аааєсосоавад 1380 аасеЕєднаєд аааадудєсаад ааассадсва ааааасааєд ссааддааає соддааасоддс 1440
ЄдсЕєєдаає сЕеЕсСассасаа аєдсдаєаас асдеЕдсаєдуд ааадеєдессаа аааєсддадасе 1500 баєдасвасс саааарассс ададдаадса аааєсаааса дадаааааає адаєсддоаднеа 1560 аадсєддаає саасааддає Есассадавс сеЕддсудаєсьі аєссаасьдеЕ сдссадеєса 1620 (516) ЄЕЧдоЯдєдседоа бадесесссе дддддсааєс адсеЕсссддда ЄдеЕдсеЕСсСтаа ЕдОоДдЕСЕСТа 1680 садеЕднадаа гаєднаєста а 1701
«2105 20 «2115 1410 «2125 ДНК «213» Вірус грипу А/Са1ітогпіа/09-11ке (Н1ІМІрают) «2205 «223» Нуклеотидна послідовність геномного фрагмента МА «4005 20 аєдааєссаа ассаааадає ааєсаассасс дасссоадссс дсасдасаає Сддаасддсс (216) аасеєсааєсає басаааєєдуа ааасасєаасєс сСсаасаєдда Ссадссассс аасссаадесс 120 чадааєсааа деЕсадаєсда аасаєдсааєс сааадсдсса Ссасессаєда ааасаасасе 180
Едддсаааєс адасаєсаєде Єаасаєсадс аасассаасс Єсдседссда дсадссадед 240 дЕЕЕСсСоЯєЄЧда аассадсдду саассссєсяє сЕССдссссд Єсадесддаєд ддссаєаєсас Зоо адеааадаса асадедеєаад адесоддЕссс ааддддадаєд СДдЕссдссає аадддаасса 3З6о
БбЕсаєаєсає дсеЕсСсссстЕє ддааєдсада ассссссссс сдасссаадда ддссесдстга 420 ааєдасааас аєєссааєдуа аассассааа дасаддадсс сасаєсєсдаас сесааєсдадсес 480
ЕдеЕССтаєвєд дедаадеЕсєсс сеЕСЕССасбас аасссаадає ссдадессадс сдсесддеса 540 чдсаадсдсЕс дЕСаєчаєду саєсааєсдуа ссаасааєєд чаасеєєссоддд сссадасаде 60 чадасадедоа сЕдЕдЕеЕсааа десасаасддс асаасаасад асассаєссаа дадссддада 6бо аасчаєаєає єдадаасаса ададеЕссдаа Сдсдсаєсдєд СааасддеЕсс ссдсессасс 720 аєааєдассуд аєддассаад єдчаєддасад дссссасаса адасєссссад аагсадаааад 78о0 чддааачаєад Єсаааєсаде сдааасдаає дссссстаасс ассассаєда ддаасдсссс 840
ЕдеЕвасєсстд аєсстадсда аассасаєсдеЕ дЕЧдЧсдсадду асаассддса гддсеЕсдаає 900 счассдсддд СдДдЕсЕсСсЕссСсаа ссадааєстд даасаєсада гаддаєсасає аєдсадес9д99у 960 авсєеЕєсуддад асааєссасу сссєааєдає аадасаддса дчЕЄєдЕддЕСС адгаєсдєсяе 1020 ааєддадсаа аєддадсааа аддаєсєвесса сЕСааасасу дсааєддедЕ Есодаєсад9ад 1080 адаассаааа дсаєсадеЕсс аадаааадачє СЕсЧдадаєда ЕЄсдоддаєсс ааасодаєда 1140
Зо асєдддасад асаасаассє сссаасааад саадасаєсд сСаддаасааа Єдадсоддеса 1200 ччаєаєадсд дчадзеЕеЕсвдЕеЕ єсадсаєсса даассаасад додасеЕддаєсдд гаєаадассяе 1260 бдсЕєсвдодд ЄЕдаассаає сададддсда сссааадада асасааєссу дассадед9ад 1320 адсадсаває сссеЕсеЕдеЕду Єдеааасадс дасасеЕдеду ЧЕєдЯдЕСЕСд дссадасдде 1380 чсЕдадеЕєдс саєеєсассає Едасаадеєаа 1410 «2105 21 «2115 979 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Нуклеотидна послідовність гена химерного М5 фрагмента «4005 21 адсаааадса доаодсдасааа дасасаасдуд асссааасас гдсдЕСВаадс СЕєсСадаєад (216) асгєсєдсЕвеєсеЕ єєЧддсаєдес сдсааасдад Ссдсадасса адаассаддс даєсдссссає 120
ЕссеЕєдаєсуд дсЕЄсодссда даєсадааає ссссаададда ааддддсадс асссеЕсддЕс 180
БЕддасаєсда дасадссаса счдєдссддаа адсадасадс ддадсододаєє седааадаад 240 ааєссдаєда додсасеєсааа аєдассаєсдд сссссдсасс сдсдассдсдає басссаассд Зоо асаєдасеЕсс єдчаддаааєд Ссаадддаає ддессаєдсеЕ сагбасссаад садааадес9д9 3З6о саддсссссс ссдсассада асддассадд сдаєсаєддва аддаддеЕсєсєс єссодадста 420 гЕгдсСЕдЧЧєЄ сЕєдддаадда додаєдоадаад дааєсдаєссдс аддссдддада ддаададада 480 дссоддаассс адодоадааєдсе Єдаєаасаад сддссдсадс дедасєссссдд ассоддстсдда 540 часеЕСстааса єєЄдсеєааддд сЕсЕссассда ададддадса ассдесддасдд аааєсєсєссасс 60 астдссеЕсс сЕсСссаддас агбгассааєда ддаєдссааа аасдсааєсту додеЕссьсає 6бо сддаддассс даасддаасд асаасасадес єсдадеЕсесст аааасестас ададаєєссд9дс 720
Еєддадаадс адесааєдада аєдоададасс сссасссасо ссаааасада аасддааааєс 78о0 чдасдадааса аєсаддеєсаа аадессдаад ааасаадчаєд дссдассдаа даадесдадас 840 асаааєєдаа даєаасадад аасадссссдд адсааасаас асссасасаа дссегсасадс 900 (516) бастассєєда адсддаасаа дачасаадаа СЕЄССЕСУЯЄЕ Єсадссстаєс гаасаасааа 960 ааасасссьє дЕсСЕСТасе 979
А

Claims (31)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Атенуйований вірус грипу А, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусу грипу А і В, що містить химерний М5-фрагмент, який включає укорочену рамку зчитування білка М51 і гетерологічну послідовність гена білка Мер, причому зазначена укорочена рамка зчитування білка М51 походить від вірусу грипу підтипу НІМІ, а гетерологічна послідовність гена білка Мер походить від вірусу грипу підтипу Н2М2, і де зазначена укорочена рамка зчитування кодує білок МО1 розміром 124 амінокислотні залишки, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 4.
2. Атенуйований грипозний вектор, який експресує білок або його фрагмент, вибраний із групи, яка складається з білків або їхніх фрагментів бактерій, вірусів або найпростіших, що являє собою атенуйований вірус грипу А за п. 1, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності щонайменше одного трансгена, який кодує білок або його фрагмент бактерій, вірусів або найпростіших.
3. Атенуйований грипозний вектор за п. 2, де білок або його фрагмент вибраний із групи, яка складається з білків вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу герпесу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, трипаносоми, лейшманії, хламідій, збудника бруцельозу або їхніх комбінацій.
4. Атенуйований грипозний вектор за п. 2 або 3, де розмір білка або його фрагмента становить від 10 до 400 амінокислот.
5. Атенуйований грипозний вектор за п. 2 або 3, де вставка кодує ділянку білка НА вірусу грипу.
6. Атенуйований грипозний вектор за п. 5, де ділянка білка НА являє собою ділянку субодиниці НАЗ2, вибрану із групи, яка складається з 1-185 амінокислот з вірусу грипу А, 1-186 амінокислот з вірусу грипу В, 23-185 амінокислот з вірусу грипу А або 65-222 амінокислот з вірусу грипу А.
7. Атенуйований грипозний вектор за п. 2 або 3, де вставка кодує послідовність ділянки субодиниці НА2 вірусу грипу А або вірусу грипу В від 1 до 21 амінокислот і послідовність ділянки білка МР вірусу грипу А від 243 до 251 амінокислот.
8. Атенуйований грипозний вектор за п. 2 або 3, де вставка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕЗАТ-6, А985А, Ад858, Мріб4, НерХ, МІбВ8.4 або 10.4 або їхні фрагменти.
9. Атенуйований грипозний вектор за п. 8, де геномна послідовність вірусу додатково містить послідовність, яка кодує 2А-пептид, що саморозщеплюється, між укороченою рамкою зчитування гена білка М51 і вставкою, яка кодує ЕБАТб.
10. Атенуйований грипозний вектор, який експресує білок або його фрагмент вірусу грипу, що являє собою атенуйований вірус грипу за п. 1, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує 1-21 амінокислот білка НА2 вірусу грипу В і 243-251 амінокислот білка МР вірусу грипу А.
11. Атенуйований грипозний вектор, який має онколітичну активність, що являє собою атенуйований вірус грипу А за п. 1, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує білок мікобактерії туберкульозу ЕБАТ-6 або його фрагмент.
12. Атенуйований грипозний вектор за п. 11, де розмір білка або його фрагмента становить від 10 до 400 амінокислот.
13. Атенуйований грипозний вектор за п. 11, у якому укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою послідовності, яка кодує 2А-пептид, що саморозщеплюється.
14. Атенуйований грипозний вектор, який індукує крос-протективну відповідь проти вірусів грипу А і В, що містить: нуклеотидну послідовність гена білка РВ2 з 5ЕО ІЮ МО: 14 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності ЗЕО ІЮ МО: 14; БО нуклеотидну послідовність гена білка РВІ1 з 5ЕО ІЮ МО: 15 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності ЗЕО ІЮ МО: 15; нуклеотидну послідовність гена білка РА з БЕО ІЮ МО: 16 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності ЗЕО ІЮ МО: 16; нуклеотидну послідовність гена білка МР з 5ЕО ІЮ МО: 17 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності ЗЕО ІЮ МО: 17; нуклеотидну послідовність гена білка М з 5ЕО ІЮО МО: 18 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності БЕО ІЮ МО: 18; нуклеотидну послідовність гена білка НА з 5ЕО ІЮ МО: 19 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності ЗЕО ІЮ МО: 19;
нуклеотидну послідовності гена білка МА з 5ЕО ІО МО: 20 або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності БЕО ІЮ МО: 20; і нуклеотидну послідовність химерного гена білка М5 з ЗЕО ІЮО МО: 21, що включає: рамку зчитування білка М51, що походить від вірусу А/РК/8/34 (НІМІ), де зазначена рамка зчитування є укороченою і кодує білок М51 розміром 124 амінокислотні залишки, і послідовність гена білка Мер, яка походить від вірусу грипу А/5іпдароге/1/57-ІїКе (Н2М2), або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичності зЕО ІЮ МО: 21; де зазначена укорочена рамка зчитування гена білка М51 продовжена вставкою нуклеотидної послідовності, яка кодує пептид злиття субодиниці НА2 від вірусу грипу В, їі нуклеотидної послідовності, яка кодує консервативний В-клітинний епітоп нуклеопротеїну (МР) вірусу грипу А.
15. Атенуйований грипозний вектор за п. 14, де нуклеотидна послідовність химерного гена білка М5 представлена в 5ЕО ІЮО МО: 21.
16. Імуногенна композиція для індукції імунної відповіді проти інфекційного патогена у суб'єкта, яка містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за п. 2 і фармацевтично прийнятний носій.
17. Фармацевтична композиція для профілактики грипу, яка містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за п. 14 або 15 і фармацевтично прийнятний носій.
18. Імуногенна і фармацевтична композиція за п. 16 або 17, відповідно, яка містить 6,5-10,5 Ід ЕІД 50б/мл атенуйованого грипозного вектора і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 905 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. 95 вуглеводного компонента, 0-2 мас. 95 білкового компонента, 0-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
19. Імуногенна композиція за п. 16, де буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 965 моновалентної солі, 0,01-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. 95 вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 90 білкового компонента, 0,01-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 1-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
20. Імуногенна композиція за п. 19, де моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою сахарозу, трегалозу або лактозу, білюювий компонент являє собою людський альбумін, казитон, гідролізат лактальбуміну або желатин, Зо амінокислотний компонент являє собою аргінін, гліцин або глутамат натрію, і імідазоловмісна сполука являє собою І -карнозин або М,М'-біс(2-(1 Н-імідазол-5-іл)етил|-пропандіамід.
21. Імуногенна композиція за п. 16, де інфекційне захворювання викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А, вірусу грипу В, мікобактерії туберкульозу, вірусу простого герпесу 1 і 2 типів, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу гепатиту С, малярійного плазмодія, трихомонади, хламідії, трипаносоми, лейшманії або збудника бруцельозу.
22. Імуногенна композиція за п. 16, де суб'єкт являє собою ссавця або птаха.
23. Фармацевтична композиція за п. 22, де суб'єкт являє собою людину.
24. Вакцина проти грипу, яка містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за п. 2 і фармацевтично прийнятний носій.
25. Вакцина проти грипу, яка містить в ефективній кількості атенуйований грипозний вектор за п. 14 або 15 і фармацевтично прийнятний носій.
26. Вакцина за п. 24 або 25, що містить 6,5-10,5 Ід ЕІД 50/мл атенуйованого грипозного вектора і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 95 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. 96 вуглеводного компонента, 0-2 мас. 95 білкового компонента, 0-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
27. Вакцина за будь-яким із пп. 24-26, де буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 95 моновалентної солі, 0,01-5 мас. 905 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. 905 вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 95 білкового компонента, 0,01-2 мас. 95 амінокислотного компонента і 1- 10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
28. Вакцина за п. 27, де моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою сахарозу, трегалозу або лактозу, білюоовий компонент являє собою людський альбумін, казитон, гідролізат лактальбуміну або желатин, амінокислотний компонент являє собою аргінін, гліцин або глутамат натрію, і імідазоловмісна сполука являє собою І -карнозин або М,М'-біс|(2-(1 Н-імідазол-5-іл)етил|-пропандіамід.
29. Спосіб лікування і/або профілактики грипу у суб'єкта, який потребує цього, що включає введення в ефективній кількості атенуйованого грипозного вектора за п. 2 зазначеному суб'єкту.
30. Спосіб за п. 29, де інфекційне захворювання викликається патогеном, вибраним із групи, яка складається з вірусу грипу А і вірусу грипу В. 60 31. Спосіб за п. 30, де суб'єкт являє собою ссавця або птаха.
32. Спосіб за п.
31, де суб'єкт являє собою людину.
33. Фармацевтична композиція для лікування онкологічного захворювання у суб'єкта, яка містить атенуйований грипозний вектор за п. 11 в ефективній кількості і фармацевтично прийнятний носій.
34. Фармацевтична композиція за п. 33, яка містить 8,5-10,5 Ід ЕІД 50/мл атенуйованого вірусу грипу А за будь-яким із пп. 1-5 або атенуйованого грипозного вектора за будь-яким із пп. 6-14 і буферний розчин, який містить 0-1,5 мас. 96 моновалентної солі, 0-5 мас. 95 імідазоловмісної сполуки, 0-5 мас. 95 вуглеводного компонента, 0-2 мас. 95 білкового компонента, 0-2 95 амінокислотного компонента і 0-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
35. Фармацевтична композиція за п. 34, де буферний розчин містить 0,5-1,5 мас. 95 розчину моновалентної солі, 0,01-5 мас. 905 імідазоловмісної сполуки, 1-5 мас. 905 вуглеводного компонента, 0,1-2 мас. 95 білкового компонента, 0,01-2 95 амінокислотного компонента і 1-10 мас. 95 гідроксіетилованого крохмалю.
36. Фармацевтична композиція за п. 35, де моновалентна сіль являє собою хлорид натрію, вуглеводний компонент являє собою крохмаль, білюоюовий компонент являє собою людський альбумін, амінокислотний компонент являє собою аргінін, і імідазоловмісна сполука являє собою І -карнозин або М,М'-бісІ(2-(1 Н-імідазол-5-іл)етил|-пропандіамід.
37. Спосіб лікування онкологічного захворювання у суб'єкта, який потребує цього, що включає введення в ефективній кількості атенуйованого грипозного вектора за п. 11.
38. Спосіб лікування за п. 37, де введення являє собою внутрішньопухлинне введення, введення в лакуну, що утворилася після хірургічного видалення пухлини, або внутрішньовенне введення.
39. Спосіб за п. 37, де онкологічне захворювання вибране з групи, яка складається з колоректального раку, кардіоезофагеального раку, панкреатичного раку, холангіоцелюлярного раку, гліоми, гліобластоми і меланоми.
(А) оуа й що шо рай Роїу а Шия (Б) ТОДТААТААД в 1 393-нк вк Ще Роїха мРНК Мер. Ф-- Шк ! у Шк я
".З-- є ш! ЕЗ Роїма ТОАТААТАА Й
Фіг. 1
(А) АССААДААССАСОСТОАСАААСАСАТААТОСАТССАААСАСТО ТОТСААОСТПТТСАОСОТАСА ТТОСТТТСТТТООСАТОТССОСААДАСОАСТТОСАСАССААСААСТАССТОАТОССССАТТС СТПОАТСООСТТСОССОАСАТСАСАААТСССТААСАООСААОоОСОСАОСсСАСТСОТТОСТСТО САСАТСОСАСАСАОССАСАССОТОСТОСАААОСАСАТАСТОСАОСОСАТТСТОАААСААСАА ТОСОАТОАСОСАСТТААААТСАССАТОСССТСТОТАССТОСОТСОССТТАССТААССОСАСА ТОАСТСТТОАОСАААТОТСААСОСААТООТССАТОСТСАТАСССААОССАСАААОТООСАС ОСССТСТТТОТАТСАВААТОЗАССАВаСОАТСАТОВАТАААААСАТСАТАСТОАААССОА АСТТСАСТОТОАТ ТТ ТОАССООСТОСАСАСТСТААТАТТОСТААОООСТТТСАССОААСА СОБАССААТТОТТООСОАААТТСАССАТТОССТТСТСОТТССАССАСАТАСТОСТОдДОСАТ СТСАДААДАТОСАСТТОСАСТОСТСАТСОСАССАСТТОААТОСААТСАТААСАСАСТТСО АОТСТСТОДААСТСТАСДСАОАТ СОС ОСАвАДОСАОТААТОАвААТОвАвАССТОо САСТСАСТОСААААСАСАААССАСАДАТОСССССААСААТТАССТСАСААСТТТСААСА ААТААБАТСОТТОАТ ОДА ОАсСАСАААСТО ДАТА АСАСАОААТтАСТТТТО ДССААДАТААСАТТТАТОСААСССТТАСАТСТАТТОСТТСААСТОСАССААСАСАТААСДА СТТТСТСАТТТСАОСТТАТТТААТААТААААААСАСССТТОТТТСТАСТ (5ЕО І МО:1) (Б) АССАДААССАСОСТОАСАААСАСАТААТОСАТССАААСАСТО ТО ТСААОСТПТТСАСОТАСА ГОСТ ТС ТОССАТОТССОСАААССВАСТТОСАСАССААСААСТАООТОАТОССССАТТС СТПТОАТСООСТТСОССОАСАТСАСАААТСССТААСАОСААСОСОСАОСсСАСТСОТТОСТСТО САСАТСОСАСАСАОССАСАСОТОСТОБАААОСАСАТАСТОБАССО(САТТСТОАААСААСАА ТОСОАТОАСОСАСТТААААТОАССАТОСССТСТОТАССТОСОТОСОСОТТАССТААССОАСА ТОАСТСТТОАООАААТОСТСААСОСААТООТОСАТОСТСАТАСССААОСАСАААСТОССАС ССССТСТТТОТАТСАСААТОСАССАСОССАТСАТСТОАТААТАААСТОТОСАТТТТТОАССО ССТОаСАСАСТСТААТАТТОСТААСОССТТТСАССОДАСАСОСАССААТТОТТОССОАААТТ ТСсСАССАТОССТТСТСТТССАОБАСАТАСТАА ТОД С АТО ТСАДДАДАТаСААТТООСОО То СТСАТСОвАБОАСТТОДАТООДАТОАДТААСАСАСТТООАОТСТСТАДААСТСТАСАСАСА ТТСОСТТОСТОСДААСАСТААТСАСААТОССАСАССТОСАСТСАСТОСАДААСАСАдАСС СДАААТОСОДОДАСААТТАВО ТСДАДАВТ ТА ДААТААОАТООСТОАТТОДАОДА СТСАСАСАСАААТТСААСАТААСАСАСААТАСТТТТОАССАААТААСАТТТАТОСААССС ТАСАОСТАСТАТ ІОВ ТО ДАСАДА ДАО ДТААДО ДАС ТТ ТСТСО ТТ ТСАОСТТАТТТААТ ААТААААААСАСССТТОТТТСТАСТ (5ЕО ІЮ МО:2) (В) АССААДААССАСООТОАСАААСАСАТААТОСАТССАААСАСТО ТОТСААОСТПТТСАООТАвА ТТастттстТТООсСАТаТоСОСАААСОАСТТОСАСАССААСААСТАССТОАТОССССАТТС СТПТОАТСООСТТСОССОАСАТСАСАААТСССТААСАСОСААООСОСАОСсСАСТСТТООСТОСТО САСАТСОСАСАСАСССАСАССТОСТОВАААССАСАТАСТОСАССОВАТТСТОДААОААСАА ТОСОАТЗАСОСАСТТААААТЗАССАТООССТСОТОТАССТОСОТСОСОТТАССТААССОСАСА ТОАСТСТТОАОСАААТОТСААСОСБААТООТССАТОСТСАТАСССААССАСАААОСТООСАС ОСССТСОТПТОТАТСАСААТООСАССАСОСОАТСАТОТОАТААТААДАСТОТОАТ ТТТОАССО ССТОСАСАСТСТААТАТТОСТААСОССТТТСАССОДАСАСОСАССААТТОТТООСОАААТТ ТСАССАТОССТІСТСТТССАОБАСАТАСТААТОАдООДдТО ТСАААдААТОСААТТоОаСвОоТо СТСАТСОСАССАСТТОДАТОСААТОАТААСАСАСТТОСАСТСТСТААААСТСТАСАСАСА ТТСОСТТоСАСААССАСТААТСАСААТОССАСАССТОСАСТСАСТОСААААСАСАдАСо СДАААТаСОДОАдАСААТТАСО ТСДАДАВТТСОДАОДААТААОАТОаСТОАТТОдАдОдА СТОАСАСАСАДАТТОААСАТААСАСАСААТАСТТТТОАОСАААТААСАТТТАТАСААОСС ТАСАОСТАСТАТ ТІТОВ ТС ДАСДАСАСАТААОДАСТІ ТСТОСО ТТ ТСАОСТТАТТТААТ ААТААААААСАСССТТОТТТСТАСТ (5ЕО ІЮ МОЗ)
Фіг. 2
Ме аМаркі ев МОРУТУЄ УСЕ АНУ ВУАСОВІ СПРАВ ОМ ВЕСОК В ВОКОВТОЦМЕТАТВ АСКОЕ ВИК ЕООГ А КМТ МАВУРА ЗАУСТОМ ЕЕ МНЕ мМ РОК УА РЗЯ МСА (ЗЕ М МОХИ МмхіменААНІВВ МОРГ УЗ ЕЛУВСТ А НУВКАМАСОЄІ СР АВ ОВ НВО ОК У ВОСТІ ОЦЕТ АТАК ОМЕВИ КЕКВ А КМТ М АУРА свллеМмтЕЕМвЕ мем рРКсКУАСТИВ МО ЧМ Од КОВАНІ ООМТСМНОСУУЄУНН МЕЗО АВОСКУГ ЦВІТ КУМ ЛЕКММОРТАМСКЕРВКІВ КА МЕМ МКК УВОСТ ТУМАН НЕМЕВНОЕ НОБМУКВИ УВКУКО ОМ АКЕ МСЕ УНКСОМЕСВ УВС У УРК ТЕКИ МКЦЕЕМ МО (5ЕОНО Мк МІ НААН ЯВ-232 МОР УЧ УСТА НУНКЕМАСЗВІ СОАРИ ОВНА ПОКВ ВКОТ ОЦЕТ АТАК ОУЕ НИ КВК АК МТМ АУРА ЗВО ТІ ЕЕ МВА М еКОХ У АОС ВІ СІЯ МІСЬКА ОЗ АМКЕВМКІ ЕКВМЕМ АСК УВО МТУМАВ У ЕМЕВТОРНОВА УКВ ТЕКУ КСЬКИМАКЕМОСРЕРУНКСОМЕСЬН МИМО УВУРКУ ВЕУ МАЕ УКВ МОСТУ М МКМ ЛІР СО МС ОБ Е Ю МС, Мазда НАХ 23-38 МОР Т УКУСУ НУВКЕ МАЕ КРАВЦОВ ВІ ВОК З ОБО ОЦЗЕТАТВ АСКОЕ КЕ АСК МТ МАВУРА ЗБК ЕЕ А КО У ЛЕ СТАТУС ЧО ЕС АКТОРА ТЕКУ УК МОСТА УСКЕЕМКІ КВ МЕН КК ОСА ТЕ А ЕМЕВ ТТ ОЄНОЗМУКМІ ТЕКУКО В КММАКЕ БМОСЕЕРИНКСС ЧЕМ УВУ ЕК ВЕК УВО УК ЦЕ МО БЕН МОСТІ Меіла-нНАзіВІЯВ МОРГ УВК УСЕ АН УЯКАМАТЕІ ОВАВЕ ВІ ВВВОК В ОВО ЕТ АТЕ АСКОЕ КЕ ЕП КМТ МАУВА БАМСТОМ ТЕМНЕ ЛЕМ АТР СТВ МЕНА НЯ- Ві БЕРЕЗА ОСА ВЕ НОХТ НЕАНСУВУААТ КОТ ЕК КМ М ЕЦ ук ОВ вам НОВЕ ЕЦОЕКУ ВО НАШТ ВОСТІ МЕНЕ НЕБДКЕВКЕККАН ОА ВІ ВСКЕТКНЕСМатСіВНЕаатТ Ем ОЕРТЕО ЕВ З Мо МІ 2а-Еч Аме МОРУТ УК ВКУСИЛА НУЯКИ МАСІ СВ АВНО В ВИДИ ВІКО ОЦ ЧЕТ АТАК ОМ ВІККА МТМ АЗУРА ЗМ аМ ЕЕ МОВАМИ РОК УАСРЕСВ МОДІ сь гОАІАСНЕсСУ ТЕМНО ссьнЕвачАСВА ОО МО Мети ВІ-МЕ МОРГ УХЕЛ УЮ А УВК УАСОВІ СР АРЕЦОВ АВСОК В ВОВОЗ ТОНЕ ТАТИ АСКОЕ КЕВООг А КМТ МАБУРА ВЕНИ ТІ ЕМВ УМ РКО УВО РА МСА ИМ- с. ВЕРСАІАСЕ ОО ЕОМНАСМ о ВВЗВАЄмА ГБО МІ хат МОРМТуУ ЗУ ВСТАНУВКАУ АОС ВАР ОВ Кар ОК КВК ОВТ АТВ АСКОЕ КО АК М АУРА ЗВУК ТОМ ЕЕ ВЕ А М РКО УА РЬСТЯ МЕС С МТС МЕД ААЗАЮВМУ ТОННА ОККО КЕ ЛААМИ СОВА У СК АВАТАТ ЕММА АВК СВМАЗТ ВОМУ ВА (ЗК Мав зАкхаНЕ МОРМТУ ЕК ЛУССВЛАУНУВКАМАСОКІ ЗОАРВ ОВ ВОК ОКО С НЕ ТАТИАОКОМЕВП ЕКЗОД КМТ МАЗУР А ЗАКО МТ ЕМВ Е Ам Р КОК МАРС МЕНА С ЕВ КК АСОМЕОМРОВ- МТ ВОДО МЕДЕНЕ А ВАЛУ ТЗН ОВК ОК ТК АЛОЕ ВО УСИКА АТЕМЧАКОМІ АНТЕЕАСОА мавтесмутоМмка ЕС МОЇ МІ НУ АХ МОРЕ ЛВС УВК ВАК СПАРТІ ВК ВОК ОЦЕТ АТВАОК ОТ КВИ КВЕД КМТ М АУРА БЕЛА ТЕ Е МОВАМ РЕОК У АС РМ ВМ СО АЛАНА ТЕР АКА ВМО УМА У ДАВ ТТЕКЕТ ВАД. виз оУмам ЕсЦЮ Мо
Фіг. З
(А) - в | Й шен Й зас а щЩ я й Ка й в " а ях КЗ -? ща г (Б) а ше нини ЗІ а о Ре її ща : з он ш шо ши не й Ко й и е М т ж Ки що а? -2 -
Фіг. 4
7 го Її ік повінні нів мивйс С Зівае вік - вв ПУХУ й зо ! - кантропь вв- в ПИ Чи - Аджея то -ке МОЗМ МЕР. еп Ж мч Е см, ві ку ж з т ех ком ВО ее ше «аж МО124- НАЖА-18Б ОВО ча зх яви ши - М8124- НАД(В)-186 З зв --- ЧА РОМА та» й |: Е: Е Е Ге; їх Я 5 В 18 17 4 Дні 1995 | й 38 ні Су ну З «зав КОНТрОЛЬ зв ІД ження а АЮВ/ВІЗА В тв - пппнннннннтнннеенетннннно ск- МЕ12АМЕР- реп шо ач к шж. М3126- НАМА)-185 в м | -енн МБЗ124- НАД(ОВ-1 ВВ с че ! ян МА БищАР щУх В Е 29 зач 4 й ЕВ) Ж й й г т їх 14 Дні
Фіг. 5
1565 нн ! ЕЕ Контролі» ж ВБЕя ШОО551545-ЗА-Ехат ба | ШО МОУ Ичеєен вав Фебнниннинрнниннинінннниннрнннннннннрниннньня «005 вт «же Контроль шк сан МЕ12А-оА-ЕвВіВ - | : : - МА Мертеп жо 0 ; реф Ен : : с
І. 2 я б що ЗК Де
Фіг. 0 Жримае ІБ БЕ НОМУ ВИПОЯНЕОС БЕКТОрЯ гва дурвувиза й походження сегментів ще ПАЛІ ер і - - . а нИшНВшеиШЕ Л/РК/В/ЗА - ЕВНОМУ ВІД штамів в усу НА ШІ АС и в ТЕЛЕ ЕВНТЕ ма ОЇ дисевюгвізутою (німарат) Я а щаї па НАЖІВІ НМР А в ер г 1 Мер білок вілтетералонічного шва НІМ
Фіг. 7 зникав са насам анна нави моно не о Ка КК УК о Е Ка ома с ЗК КУ ЯК я хо в ож РЕ ОХ НОВ НУ В КН ЕЕ КВ МОВ ОКУ ЗЕ о З СК З СКЗ Гея З ЕП КВК В Я З НО КК НЯ ха Не КК Уа НО Ма ЕсЯ в в І З КВК я В ЕК ОК ЕТ СОТ В ЕСЕ ОТ скакати коки нік вості со ско ат коди кісок ав аку ваїх відн нікого ка нн Ос нок я м в ок вда давав мювивиава а ое нКи ниви надати налсвоаданикника Ето в в о ово ов р НОВО КВ НН ВККС ВККС ОВК КВ ВУ В СВІ ВОМКОК КМВ ВО НІ ВВ В СК ВН В Ве ВЕН КУКИ КВ НН и КК В Ки ОВО Ки КОКО ЧК А КО Я КК в ТК о Я ЗК ка Я ЕТ НК, КУ Я М Я СИ СВ В ТЕКУ Нео Вав Ки БЕН КВК КВК ОХ СВК ОК НЯ Но ООН ВВА ВЕ НОЯ о: и в В В о ВК В КВ Я А ВН ЕС ЗАТ РУ АК веж кві дксв нка ЗЕ І КОКО НЕ ВОД АН Я ПИВ ок ВОВНИ НИ вегижанедкулатсюн вн акті соток и Вк дак іо КВ ОВК ке Кс З ЯК НУО МНОЖИН У о ЕПОПЕЯ рен нн и р с о т кв в о в заз завів нив ючиврин аовосни а сзвиавікаса аа скине ЗК но вовк хи Зх КЕ ЗЕ Кая Я КК кр іх Ж о ПК о пеки ЕК М ихвк о: Гек ювк с ХК ЕК імя сесвиес нак Сас В а ЕЕ НС и В декани ЕК Ву кеша ковими вен Кн нін кожи аа км и А Я ВА ЕТО МО КМ Ж НМУ жормжоекананжаксииз вана нев ни ит вка МЕ сни ни в в в п ЕМ ви о СЕНС ДК ВТО ЕК ВК Вус зір Ні УТ ВД с усе Кт Ко ДН ВЕК ДІВ ння Орди с в тояя к ек ок и В ККОХ Ек в с с Коен КО ОАЕ ОКІСТ ЕЦИ ЕК ЕС Ме вні Ко в рю ке На КИ ЕК КУ ЕХ Уск ж ем с ко НИХ Т Ж ук Ко их ре вка во ве ков озию НТ ПК Ки НС К ПЕС КУ КЕ КК КК З ЯК во ка ква Я КО ПК КЕ Ен заявках вано ооо ис аа ск ксов кан еВ крав су акти ера в Пд НК ов В у ВК Я СВ Два ВК ВЕ ВОК НАСЕ ЕЕ КК КОС ПИ ВІ С Іа ОЗ ОК В І М ВЕ ЕК ЕІ ОН ЕК ЕМ ета КУ КОС М як ЖК В МКК ЕК ВУЗ ЕМ ко о КК в УК ЗК ЖУК ков КВН зве вино ки конк м мне сан една к діа ахз кова ва івана вна спвизиваозгпизхсвама кави ізаа заварка кавове а ВЕН НОВО ВК ЕВ ВА ВИ Ва Ва ТВ Вані СО Оса Ве Ва ВВ В Ва вада Протасів з я Я мо ою МК НЕ як кажи кож фв ти Сея а с ЗК ЧЕКА не Теж ух с Коко ККУ Ка азс вв вві іноді все и кі ав а іш за Е ск а вау св Вага ЕКО Кн Кн КЕ ко ВЕ Ко В Я ВИС БЕТА КК ЕК ОК сне КО СМ ок о В КК Ух ПОМ КК виганееизаюк тами ванииризсв вана ин КЕ я Нв ЕВ як Соя Я М кв ек Я ЗА ЕК В КЕ ПВ ОВО КО ВОВК ВЕ КК Кв ЕТ КМ НСЕ і КК о А В ЕЕ Не сПЕЕ ВЕК ККя клю вк ви канон ДЯ да ока ас ак ас В ПЕ ВЕ ТЯ пен НЕ КК с р о КО БД есе РКК ЯН ЖК о ТК ок ЗЕ ТУ СЕ ЗО СЯ КОКС З КК У БЕ Я СЮ си ек хх ЕЗЖ В ПО ЕК в Ю ПТ ЖЕК вка вже ав КВ и Во в ЕН в Сід Ко ка ду хв кв вда за аа дане у ВЕК С ККУ НО КТ о ЕХ БМП Зк В В КАСУ ПЕТ ПЕ В ВТ СЕ КТ ОС АСК м я ВО КК БІКя ее во а о а ЗК в КТ Кв с ЕК ЗК еВ Кв ск Ж У Се Кт КОЖ Я КК КОЖ Кф Я А КАК М КТ КТЖ НКУ ХАО ЖЕ ВЖК жо коня БАЖЖ КЕСККО акаде іди нео ставкою да ее Оу кожи а я жа а ВК се ко я ва ВК ВНХ «ав БЕ Ю МО: 15 Фіг 8
УГ.
РА, зквазанави стиха свавави мін квас зав вра ав оааніваааВяЯ ЕУСоК се ЗІ Я Пе Ж КК Ко Я о ЗМК НЕ Кв Я СКК КС ПЕС ТЕ КК ХЕ ек ре НК я ди увнанснак вка прдін ква учи ас нам сови океан си таріздікз сані вона е нина всязані ких німи сних ця, евінасизовани моні нина вс азам Ка СЯ МКК ТК кккЕВцнксновиавви смів ванням вий свававиасі сягав неаа ик РІ УК о Кк и Ко Не А АК В НП З Я ЛК о КК У жом носив дано ати ши ев хвала мн наве авистстя ззішссазадиадіа кни даси зааасн своем тада раза дєтисс ве адовкх КОНКУ ЗВУ НЕЗАКОННЕ ТВ НЕК ВОК ИН р Я З ви р еВ ЗУ Коти а о кн Ж ЗЕ Я ДЕ КК З ЕВ Кр ре нку ка Б КУ І Моно сдгвявнсаі дав вадЕнквзаі сиза і аааан вони ааспнн ви аз вик пд ин сив Во хавазаанн ав хна авава в ва ваза и БІ мив ники встав аа ва вата писав нок и ква ие вази нива віках свои ДЕ ЕКЗ ЕЕ ЕСЕ ЗНЯВ ЕТ КК ОВ ТЕ ТУ СК ВЕУ ЕК КК ПАК Я Васеа усе а на кекс ватрвауаєєва ів вн: няні нккоа в ання ве ассвас т НЕ У ВОЕЯе КЗ КЕ З НЕ КУ КК М ЕН ПЕ НК КУ Я КУ А КК З СА ВК З я КОЖ КК ККУ вевакневін нс сонники вівса вес Козака вероніка зекказвааанвнуа ни кикиваів синонім ксавіхат нена вив авимЕвшав ва НЕО КК Не КЕТІ ПЕКИ ВЕ КЕКЕЛЕ ПОТ Ве УТ ВК УК КЕН креезарикт ве мана инснасав інн кхнв вени вика вааа Екежкя си ХНУ Ск Вк ЗК Хв я С Ка ОК ПЕ КОЖ вв Ки ПЕ НК ТЕКИ вве ге сват внески вихнак оо не вівеа КнВ ин ВЕ в за сівкосвааавивка скпямаає ЗЕ МО 16 ще КЕ ЕК ПЕВ ВВ ЕВ ЗК У КК БЕК ЕС о ВИК А У ТЕ КУ КК ЯКУ КУ шефа скксики нів ее ква ви винесе сно яв сивая ре Те ЗЕ: Неон ЗМІ ЕЕ ТЕС Ке я ко НЕК ЗК ЕК Ксеня Фк слері ехК КТКВ Кукок КОЖНУ вас кки рони тааваннясівнакине ав анняваві невизнання зсийвраанянн ин на уко ення зи ни вва ви: соків гвхішН ев с В сова шідшНІДСМН ТК сядАниВс зн кв асо и а о ОВК ТЕКИ. ОКУ Я ЯК НН В З ке КТК КК З ТУ вели нависунзаансзваа несе ннавиа дани кіс ваавививнЕ ск во назад ав КЕ ККД КК: НИМ КЕ ЖК ГО ЕК НЕК З ЕК Ко я ех ТЕ ве Коен ПИСК я КА ОКО АК с у ВИТ З ВЕ КО ОК ОН З я З З КВН НЕ С НН У З КК Но ОН ЗКУ ТЯ вра еро на азасвухєввків и авс івана сааанаравн каса авша ка в вові агави ср двавастазивникаакссн аванс оси и Ева сте они иеаВ Сас дазазізсевакн кві каса вини сави козака сани вими т вав ЗЕ ми асани анаснюмв сосна све аа Не аефсвиЗи ан ис ос кова нагавіясвзанасана ник вини КОЗВЖ ЕЕ З У КО В БК ЗКУ КК Ки ЯК НУ ЗЛЕ КЗЗ НОЯ Я ЛОН КОК Я зді всясмкламаззиезнваізсос тиків ЕС МО: 17
Фіг. 8 (Продовження!
м ЕЕ М ВКОНТАКТІ НЯ ке НК у ХА с КК ХВ ВЕ ЕК ЯН Те ХУ А В ж БІО с ве мя ОДУ САМУ У З НВК КК НК Ко и в ЕК Ж ККУ ККУ пкссвнтаж нумо свде анна осанки нисв сс ки к ня вваанкмимиюни няня стиск арки сріВсв всипте заріни а Вис р са ва ОХ у КК КК ВК А и В ТЯ КОН ско ЗЕ Я З ЯК З ЕК Пе: С ко За Ж ЗЕ ЕЕ ВВЕ о Кс прахом дки астми кати аджика нив мання кс ЗНис киска сва ние ОН ПІХОК КІ Сен я КК Я кН я НК КА БАД ВУ СН МА ВЕК СА Я Я КК Заява Є СЕС езвацкже мив ми в вк каві нні ванна и и ее здав ви вис рес вк ува аккасттиивкстаюх БЕСИО МО: 18 НА АОПАЧАВОКОСОННОВАААМ АВ ВАСС ВА Ар Юга ас рив ас Вих паз аванс З Це вам жа ав ВА НК акова м пев аква асня вижене нан ст нанесена ксВ Вес а ввела КОН ех КК АЕН КВ НИ КС ЗА ск Но КЕ ИН НК І спав кненена ес века саван ав ввениствав века нні вс БІО АКА рек о Фе Ж КАТЯ ЯКА НОЖА КО КН и Є Я Еко ес вив Кара кв та ЕК аен й ин КСО Встав кави ка нев жарка о ик коник асан а вва як ан и пилок цаса варена азс анонс ват ання рана нка ака ар а кидка авсв ване роза вн Ваня КТ АНА КО ВР З СКК С НЕО НИХ ОК Кос ІХЕЦех ЦК ПІІ оо Ж пе З ЛЕ и тк ВК Кв ПЕК М ВЕБ БТ КЗЗ ЕК слаонеанасзнссви и надвванснанйисянк вування сив ВЕ РЕК Я З ОК КИ НА и ТР ОВ А КО В НК КО Ка ун ТУ я ЕН ЕН КІ С Са а Я ЗЕ Є НЕ Ко су ся о КЕ ЧЕТЕЯ БУКА А в КВ ПУЕ НЕ КК ОВК ИН НОВЕ В КЕН БИК омана ав жа БамнииКоат кова Ве Кан КК и ка а на сет Зенон мус ше спа а ее ЗеВН ЕНН в ВК іду ВИ заназіври с ннівасізсссзаав ні свинка исва за аввинаввни звивина сини панкнашникат ие вовки ВК Енн Кваси КВ КИ ВВ ВТК ОО ВАН ВКА ТВА З НОВНИХ ПОВЕ, ТТеГяТСтАЄТ ЗЕСО МО
Фіг. 8 (Продовження!)
МА ВсеадавосвсссвАдалтвавиа вас ува иааиисаі ста жк сти кваак ас кв онассвонка Есаввсаса мате атак аєси зва ватсва сце сатана сво вина завдаа кавова свсе ЕН и ек в і еи а неявно ис вані ека ВЕ шия ВиЗя канві вва сєсисвасан Вінс Віки аваспаи сне сявкиая сел екаквнн а и розами ит саа в еОои еи жна ние ка засзаксатвнсссамся нс снааснва інвес аасестввасвава свв са ана вневсіемазавнав вва са асооваави сви ссання н а вагван ок внае аа ТИ КК ие Вебсаксвиса ясен вссайсвзаіс сова вса в мс ее код ее вес: зеЕмеезЕссккааа рив ема вини кави кава касти слави носика асахяніхаси наве саасдсни вінка нс озсапіЕяашна сне інн ан сазштясасвавтсесванесваєаненисевавосване в стаівавсясавос иозиванисакссвх неснамеряза ни ссяжа ві вява арка сви реа тва свиик вив Етапи вата а ВиеКгакенкнехе аск воссЕс вав от екв в ви тва ква ка сис есе вася ВиЕеісзвв асан тв ав есвоквазвт ни авансами авіа засесасинтониноикув нан тса сенат нава аа вас ия зва зншсеснасані єси саме аванказараа мінвата сс ва ся заг ва авнассоаї йнзаведезаваанесавктазиваснаи оса вна виживе саенянЕвовнікасяе ко трезванісвиванив на вставав кавихакансваа івано вказав рда ава вас рис скаже вва КК ІК м ок Ес Ви иа КК тевіЕ нозі и ВВ са В а АГ ТВА ПОВНА ПАТ АКВА АСВ ЗО ОО МО; 20 Ме ОСАДУ АСВ АНА В САН АСТОТОТСААОКТ ТТ САС АВАНС ТД СТЕ ТС ГПО АВС В ТО АТО КС ТОВ ТОН ТЕО АВАКОВ АТОГОСТ АЛАНА АСК АСТЕТ ТОВ ТОННА КА ВОВИХ ОС АВ АССТСАТВНИН СВИЗС КМТ ЕК ПОМЬВ В ВА ТОВ САТ АКВА САТ ВС КТС ЕТ ТАКТИ СМОКТАННЯ ВТО ПАТОКА ТВА ТОК ока соня и спін аанипи вини анна ний ка як ЯК оч Сея всі квт я я ак я дя Зк и ся я НЕ ЕК ВЕК ВТЕРТИ КОВАНА ВАК КОКО АКТ КТ ЕКО САН ПОВСАТ КОТ ТЕЛК ТОСКИ АСИСТ А САН ТОМАТ СТА ТС ВАНІ ПОУМАТКИЗУА ТАНКУ АТЕСТАТ ПАС ВОМ ГИМОНС ТЗ КВ ОСАС АТО ВАТ СВО ТО ССАААА СЛІД АЛСТУКІАННА ОХ СК АСВАТ ТАН ОВК ВАС ТТВАКІА ТАЛОАКВ ПЕВЕ ТА ВАКАНТНІ АСААААС ПДВ АВК ВАТ ВО ПОВ ВАТА ОА ТА А ТВ ПОНХ са БА ВСТЕСАК САБО ТАТ ТАТ АТЛАС СВТ СТАС ЗЕСІЮ МО: 21
Фіг. 5 (Продовження)
(0 дусаногпівлот/ обро т зав у -й- ж о-а- Контроль за --- Бакцина хі Е і -іе Бакцина хе з 68 - в ав й кооранн в х 4 Б і: жк В УК Ян
В у. . АЛЛА ЗІБ (НІЗЧІ ги ши зе Кантрі ше" й «ше Вакцина хі жо во ; Уріегеденеетнвнай Ж ск КМИН хе Ж ; Ж : ва - шо то т а К- ся й Ес! ча оожж о чя че Ди після ко нтюльного зараження
Фіг. 9
(С) еивк тя ізкї А/Мівеі рр, 5/1 (ЗК 10- ж ! - Контроль що -я- Бакцина х2 щ Ше З В го. Ж 2 й» в 8 10 32 4 6 Дні шісля хожтрального зараження ів) (0) ВЛ ее/до "0-х ! Ще - Контроль во | -- Бакцина х2 с Ше «04 ! 4 Я н К і й 2 4 56 8 0 8 4 в Дн після контрольного зараження
Фіг. 9 (Продовження)
(А) 1 ва . ог | М «в КИ х 084 Ше Ва щ ! о слнійн ікдинахе ї- 044 ; ; тк я у жа -й- Контроль КІ ж розайц нка у » ; з й ; туя Го Ч ля Я да о 2 МИХ «4 ней Ко ши нин ни ни пн нн пн п нн п пн он 0 15 34567 о 115 Дн після коБтрОолЬьного зараження (Б)
8. я ! в '«- ! ; Я Б ни я й Тв т . ГА р о - : ри Ж ЩІ кох ШИН 52 | г й | ща КО ши гі Аж Б В Б ще Й ВЕ ві ар КК ї й 6 2 4 ге щі 4 5 Контраль Вакцина хі Вакцина ке
Фіг. 10
UAA201709223A 2015-11-06 2016-11-03 Атенуйований грипозний вектор для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань UA125333C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147703A RU2628690C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
PCT/RU2016/050066 WO2017078577A2 (ru) 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125333C2 true UA125333C2 (uk) 2022-02-23

Family

ID=58662984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201709223A UA125333C2 (uk) 2015-11-06 2016-11-03 Атенуйований грипозний вектор для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10392604B2 (uk)
EP (1) EP3382010A4 (uk)
JP (1) JP6692835B2 (uk)
KR (1) KR102604877B1 (uk)
CN (1) CN108026515B (uk)
AU (1) AU2016350939B9 (uk)
BR (1) BR112017025435A8 (uk)
CA (1) CA2991023A1 (uk)
CU (1) CU24580B1 (uk)
HK (1) HK1251616A1 (uk)
IL (1) IL255259B (uk)
MA (1) MA43314A (uk)
MX (1) MX2017015462A (uk)
RU (1) RU2628690C2 (uk)
SG (1) SG11201709122VA (uk)
UA (1) UA125333C2 (uk)
WO (1) WO2017078577A2 (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7293114B2 (ja) * 2017-05-26 2023-06-19 リミテッド・”ヴァレンタ－インテレクト” 新規のグルタミニルシクラーゼ阻害剤及び様々な疾患の治療におけるそれらの使用
EP3727442A4 (en) * 2017-12-22 2022-04-13 Codagenix Inc. RECOMBINANT VIRUS WITH DEOPTIMIZED CODON PAIR REGION AND ITS USES IN THE TREATMENT OF CANCER
US20220118077A1 (en) * 2018-09-11 2022-04-21 Shanghai Public Health Clinical Center Immunogen for broad-spectrum influenza vaccine and application thereof
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
RU2726106C1 (ru) * 2019-07-18 2020-07-09 федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России) Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8-NS124-TB10.4-2A-HspX и способ специфической профилактики туберкулеза легких с использованием вакцины мукозального применения на его основе
US20230355740A1 (en) * 2020-09-11 2023-11-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for prevention and treatment of influenza infections
JP2023549017A (ja) * 2020-11-11 2023-11-22 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 多価担体および関連するワクチン組成物
CN113430178B (zh) * 2021-06-21 2022-10-11 武汉大学 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4531255B2 (ja) * 1998-06-12 2010-08-25 マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー ワクチンおよび医薬として使用される、改変されたインターフェロン拮抗活性を有する弱毒（−）鎖ウイルス
ES2301241T3 (es) * 1998-06-12 2008-06-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Virus de influenza a atenuados, y composiciones inmunogenicas y formulaciones de vacunas que los contienen.
DE60112050T2 (de) * 2000-03-02 2006-04-27 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Rekombinantes influenza a virus
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
US7709190B2 (en) * 2005-12-02 2010-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Influenza A virus vaccines and inhibitors
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
WO2011014504A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
US8828406B2 (en) * 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
WO2011130652A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 George Baer Compositions and methods for vaccinating humans and animals against enveloped viruses
CA2836977A1 (en) * 2010-06-06 2011-12-15 Benjamin R. Tenoever Recombinant rna viruses and uses thereof
EA025152B1 (ru) * 2010-12-02 2016-11-30 Бионор Иммуно Ас Конструкция пептидного каркаса
EP2708552A1 (en) 2012-09-12 2014-03-19 Medizinische Universität Wien Influenza virus

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016350939A1 (en) 2017-11-23
KR20180067464A (ko) 2018-06-20
RU2015147703A (ru) 2017-05-16
WO2017078577A3 (ru) 2017-06-29
IL255259B (en) 2020-03-31
AU2016350939B2 (en) 2021-07-08
CU20180035A7 (es) 2018-07-05
IL255259A (en) 2018-04-30
AU2016350939A2 (en) 2018-02-08
WO2017078577A2 (ru) 2017-05-11
HK1251616A1 (zh) 2019-02-01
US10392604B2 (en) 2019-08-27
EP3382010A4 (en) 2019-03-27
MX2017015462A (es) 2018-03-07
SG11201709122VA (en) 2017-12-28
AU2016350939B9 (en) 2021-07-22
RU2628690C2 (ru) 2017-08-21
CU24580B1 (es) 2022-02-04
CN108026515A (zh) 2018-05-11
CN108026515B (zh) 2022-03-11
BR112017025435A2 (pt) 2018-09-11
EP3382010A2 (en) 2018-10-03
CA2991023A1 (en) 2017-05-11
KR102604877B1 (ko) 2023-11-23
JP2018531578A (ja) 2018-11-01
JP6692835B2 (ja) 2020-05-13
US20180245052A1 (en) 2018-08-30
MA43314A (fr) 2018-10-03
BR112017025435A8 (pt) 2019-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6870017B2 (ja) インフルエンザウイルス変異体およびその使用
UA125333C2 (uk) Атенуйований грипозний вектор для профілактики і/або лікування інфекційних захворювань, а також для лікування онкологічних захворювань
US20230414745A1 (en) Influenza virus encoding a truncated ns1 protein and a sars-cov receptor binding domain
JP2023166432A (ja) インフルエンザに対する免疫原性組成物
ES2913063T3 (es) Ensayo y medicamento
US20220401549A1 (en) Novel prime-boost influenza vaccine
CN110573613B (zh) 流感b病毒突变体及其用途
US20230295582A1 (en) Influenza virus backbone
RU2660562C2 (ru) Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
Pizzuto Avian influenza virus as an oncolytic therapy for pancreatic cancer