KR20200010164A - 신규한 글루타미닐 고리화효소 억제제 및 다양한 질환의 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

발명은 유기 물질의 화학, 약물학 및 의학에 관한 것이며, 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질환을 치료하는 것, 보다 구체적으로 폐, 기도 및 복부 질환, 방사선 병 및 통증 증후군 및 또한 다른 질환을 식 (A)의 화합물을 사용함으로써 치료하는 것에 관련된다.
Figure pct00054

식에서,
R1은 -C(O)-R2-C(O)- 또는 -R2-C(O)- 기이고, 여기서 R2는 하나 또는 2개의 C1-C6 알킬로 선택적으로 치환된 -(CH2)n- 기, 또는 페닐이며,
n은 0 내지 4의 정수이고;
화합물은 상세한 설명에서 제시된 화합물들의 군으로부터 선택된다. 이런 화합물들, 뿐만 아니라 이것들의 제약학적으로 허용되는 염은 특히, 케모카인의 번역후 변형 및 단핵세포, 대식세포 및 다른 면역 체계 세포들의 주화성의 과정에 관여하는 글루타미닐 고리화효소를 억제하는 데 매우 효과적이다. 본 발명은 또한 상기에서 정의된 식 (A)의 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 제약학적 조성물에 관련된다.

Description

신규한 글루타미닐 고리화효소 억제제 및 다양한 질환의 치료에서의 이의 용도
발명은 유기 화합물의 화학, 약물학 및 의학에 관한 것이며, 면역 체계 세포의 이상 활성과 관련된 질환을 치료하는 것, 특히 폐, 기도 및 복부 질환을 치료하는 것에 관련된다. 본 발명은 또한, 특히 케모카인의 번역후 변형 및 면역 체계 세포들의 주화성에 관여하는 효소 - 글루타미닐 고리화효소를 억제하는 데 효과적인 화합물들을 사용함으로써 방사선 병 및 통증 증후군, 및 또한 기타 질환을 치료하는 것에 관련된다.
일부 내인성 및 외인성 물질(화학유인물질(chemoattractants))의 농도 구배 후에 면역 체계 세포들의 주화성 또는 방향이 정해진 이동은 면역 체계의 기능화 세포들의 주요 구성요소들 중 하나이다. 면역 체계 세포들의 과도한 유입은 보통 면역 체계 세포들의 과도한 활성 및 주변의 기관 및 조직의 손상(injury)을 유발한다. 주화성 과정과 관련된 참가자 및 과정들에 대한 이해는, 분자 수준에서, 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 많은 질환의 치료 및 예방에서 신규한 효과적인 접근법을 초래할 수 있을 것이다.
CCR2 수용체의 리간드인, CCL 과(CCL2, CCL7, CCL8, CCL13)의 케모카인들은 포유류에서 단핵세포 및 대식세포(Macrophages)의 주화성의 가장 강력한 인자들이다(Biochem J. 2012 Mar 1;442(2):403-12). CCL 과의 케모카인은 호중구(Neutrophils) 및 단핵세포의 활성화에 필요한 사이토카인의 중요한 부류이며, 염증 부위로 이 세포들의 개입을 끌어들인다. 그러나, 고농도의 케모카인은 일반적으로 면역 체계 세포들의 과도한 유입을 유발한다. 면역 체계 세포들의 이상 활성은 주변 기관 및 조직의 심각한 손상을 초래할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 지질 산화 생성물은 혈관 내피 세포(내막)을 활성화시킬 수 있고, 이것은 CCL2의 분리, 결국 염증성 마커들을 분비하는 대식세포의 개입을 초래하여, 동맥 벽의 손상 및 죽상 동맥경화증의 발생을 유발한다(Mol 세포. 1998 Aug;2(2):275-81; Nature. 1998 Aug 27;394(6696):894-7). 유사한 발병 상황은 기도 조직의 방사선 유발의 손상의 경우에 관찰될 수 있다: 폐 및 기도의 상피 세포들의 손상 및 활성화는 CCL2의 분리를 초래하는데, 이것은 결국 면역 세포 및 순환하는 종양 세포의 폐 및 기도으로의 혈관외 유출을 유발한다(Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458).
CCR2+, CD14+ 및 CD16lo 단핵세포의 이상 활성에 의해 매개된 많은 자가면역 및 알레르기성 질병(류머티스성 관절염, 다발성 경화증)의 병리생리학에서 CCL 과의 케모카인의 역할은 알려져 있다. 나아가, CCL 과(특히 CCL2)의 케모카인은 비만, 대사 증후군, 만성 통증, 섬유증, 비알코올성 지방간 질환 및 암의 일부 형태의 발병에 관여한다.
CCL-매개된 주화성을 억제함으로써 면역 체계 세포들의 이상 활성의 억제는 급성 폐 손상, 기관지 천식, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 크론병, 당뇨병성 신증 등과 같은 다양한 질환의 치료에 대단히 필요할 수 있다. 예를 들어, 당뇨병성 신증의 경우에, 고농도의 글루코오스의 영향은 신세뇨관 세포에 의한 CCL2 분비의 증가를 초래하고, 이것은 결국 단핵세포의 이동을 유발한다(Kidney Int. 2006 Jan; 69(1):73-80). 신장 조직에서 단핵세포의 농도의 증가 및 이것들의 대식세포로의 성숙은 주변의 신장 세포를 손상시키는 더 많은 양의 케모카인 및 활성 산소 형태의 분리와 관련된 이상 반응의 발달을 유발한다(Mediators Inflamm. 2012;2012:146154). 신장 조직의 손상은 면역 체계 세포들의 이상 활성의 발달 및 유지 및 신장 조직의 추가의 파괴를 초래하며, 저분자량 길항물질에 의한 CCL2/CCR2의 상호작용의 차단은 병리의 세기를 감소시킨다(Nephrol Dial Transplant. 2013 Jul;28(7):1700-10). 유사한 과정들이 비알코올성 지방간 질환의 발병에 특징적이다: 간세포에서 지방산의 축적은 NF-κB 신호 경로의 활성화 및 IL-6 및 CCL2와 같은 항-염증성 사이토카인의 방출을 유도하는 염증성 반응의 발달을 초래한다. 항-염증성 사이토카인의 방출은 단핵세포의 염증 부위로의 이동 및 주변 세포를 손상시키는 더 많은 양의 케모카인 및 활성 산소 형태의 분리와 관련된 이상 반응의 발달을 초래한다(Int J Exp Pathol. 2013 Jun; 94(3): 217-225).
CCL 과의 구성원들(CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), 프랙탈카인(fractalkine), 뿐만 아니라 다양한 다른 호르몬 및 분비된 단백질은 피로글루탐산 잔기(pE)를 함유하며, 이것의 역할은 아미노펩티다제에 의한 분해에 대해 보호하는 것이다(Chem Immunol. 1999;72:42-56; Biochemistry. 1999 Oct 5;38(40):13013-25). N-말단 잔기의 피로글루타메이션(pyroglutamation)은 효소 - 글루타미닐 고리화효소(QPCT 또는 QC)에 의해 촉매된다(J　Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):49773-9; J Mol Biol. 2008 Jun 20;379(5):966-80). 글루타미닐 고리화효소는 넓은 기질 특이성을 가지며 다양한 펩타이드 분자의 번역후 변형에 참여한다. 글루타미닐 고리화효소의 기질 특이성의 연구에서 효소는 폴리펩타이드 사슬 길이와 관계 없이 상이한 기질들의 피로글루타메이션을 촉매할 수 있는 것으로 나타났다(FEBS Lett. 2004 Apr 9;563(1-3):191-6, J Biol Chem. 2011 Apr 8;286(14):12439-49).
실험 연구에서 글루타미닐 고리화효소의 억제는 CCL2, CCL7, CCL8 및 CCL13 케모카인의 비-피로글루타메이트 형태의 화학유인물질 활성의 급격한 감소를 초래하는 것으로 나타났다(Biochem. J.(2012) 442, 403-412) 및 프랙탈카인(Biosci Rep.　2017 Aug 23;37(4)). 그러므로, 글루타미닐 고리화효소 억제제는 광범위한 질환, 및 특히 폐 및 기도 질환, 예컨대 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 폐기종, 비염, 비부비동염 및 만성 폐쇄성 폐 질환의 치료법에 사용될 수 있는 것이 명백하다. 질환의 발병은 과도한 사이토카인 생성 및 특히 단핵세포 화학유인물질 단백질 CCL2 및 CCL7(Am J Respir 세포 Mol Biol. 2014 Jan;50(1):144-57) 및 프랙탈카인(Expert Opin Ther Targets. 2010 Feb;14(2):207-19)과 관련되며, 이것들은 글루타미닐 고리화효소 기질이다(Biosci Rep. 2017 Aug 23;37(4). pii: BSR20170712; EMBO Mol Med. 2011 Sep;3(9):545-58). 항체의 사용으로 CCL2 및 CCL7의 중화는 실험 동물의 기도로의 백혈구(Leukocytes), 단핵세포 및 호중구의 유입을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다(Am J Respir 세포 Mol Biol. 2014 Jan;50(1):144-57). 호흡기 시스템의 점막에 대한 박테리아 리포다당, 리포테이코산 또는 다른 자극물질의 영향은 기관지 평활근 세포에 의한 CCL2 분비의 증가를 초래하고(Am J Physiol Lung 세포 Mol Physiol. 2012 Apr 15;302(8):L785-92) 기관지폐포 세척에서 CCL2 농도의 증가를 초래한다(Mol Immunol. 2011 Jul;48(12-13):1468-76). CCL2 농도의 증가는 결국 호산구(Eosinphils), 단핵세포 및 호염기성 세포의 이동 및 기관지 및 호흡기 기관의 주변 세포를 손상시키는 더 많은 양의 케모카인(TNFα, IL-1, IL-6, IL-4) 및 활성 산소 형태의 분리와 관련된 이상 반응의 발달을 유발한다(Immunobiology. 2016 Feb;221(2):182-7; Int J Biol Sci. 2012;8(9):1281-90; Mol Immunol. 2013 Nov;56(1-2):57-63). 기관지의 손상은 면역 체계 세포들의 이상 활성의 발달 및 유지 및 호흡기 조직의 추가의 파괴를 초래한다. 알레르기성 천식의 생체내 모델에 따르면, 저분자량 길항물질에 의한 CCL2/CCR2의 상호작용의 차단은 유의한 효능을 나타냈다(Int Arch Allergy Immunol. 2015;166(1):52-62).
호중구 염증의 CCL2-매개된 발달 및 발열성 사이토카인(IL-1, TNFα, IL-6)의 방출과 관련된 이상 반응의 발달은 온도의 증가 및 열의 발생을 초래하는 것을 주지하는 것이 중요하다(J Infect Dis. 1999 Mar;179 Suppl 2:S294-304; Front Biosci. 2004 May 1;9:1433-49).
발열 및 상승된 온도에 더불어, 통증 증후군은 또한 다양한 질환의 극히 공통되는 증상이다. 주변 조직을 손상시키는 활성 산소 형태의 증가된 수의 방출과 관련된 이상 반응의 세기의 감소는 자체적으로 통증 증후군의 세기의 감소를 초래해야 한다. 그러나, 최근 작업에서는, 만성 통증의 발병에서 프랙탈카인의 핵심 역할이 나타났다(J Neurochem. 2017 May;141(4):520-531).
글루타미닐 고리화효소 억제제는 다양한 자가면역 질환, 특히 류머티스성 관절염 및 건선의 치료법에 사용될 수 있다. 프랙탈카인은 자가면역 질환의 발달에 연루된 핵심적인 전염증성 매개자들 중 하나이다. 프랙탈카인과 이것의 특유한 수용체(CX3CR1) 사이의 상호작용은 세포 부착, 주화성 및 세포 생존을 유도한다(Mol Interv. 2010 Oct;10(5):263-70). 프랙탈카인 수준은 류머티스성 관절염(PA)(Mod Rheumatol. 2017 May;27(3):392-397) 및 건선(Ann Clin Lab Sci. 2015 Fall;45(5):556-61) 환자들에서 증가되며 질환의 활성과 상관이 있다. 프랙탈카인은 류머티스성 관절염 환자들의 활막 조직의 섬유모세포-유사 활막세포 및 내피 세포 상에서 발현된다. 건선의 경우에, 고수준의 프랙탈카인 생성은 진피 유두 및 항원-제공 세포에서 관찰된다(Br J Dermatol. 2001 Jun;144(6):1105-13). 프랙탈카인의 발현은 종양-α 괴사 인자 및 인터페론-γ에 의해 향상되며 류머티스성 관절염의 경우에 단핵세포, T-세포 및 파골세포 전구체의 활막 조직으로의 이동을 촉진한다(Mod Rheumatol. 2017 May;27(3):392-397). 진피 유두에서 프랙탈카인의 증가된 발현은 건선의 경우 이 부위들에서 T-세포의 이동 및 축적을 설명해줄 가능성이 있다(Br J Dermatol. 2001 Jun;144(6):1105-13). 프랙탈카인은 또한 대식세포, T-세포 및 섬유모세포-유사 활막세포에 의한 염증성 매개자들의 형성을 유도한다. 게다가, 프랙탈카인은 혈관신생 및 파골세포 형성을 촉진한다. 콜라겐-유도된 관절염의 모델에서, 항-프랙탈카인 항체의 사용은 병리 과정이 상당히 완화되는 것을 가능하게 하였다(Mod Rheumatol. 2017 May;27(3):392-397).
최근의 조사 연구의 결과들을 기반으로, CCL-매개된 주화성의 억제가 방사선 병의 치료를 위한 새로운 시각의 치료 접근법이라는 것을 주장하는 것이 가능하다(Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458, Int J Radiat Biol. 2015 Jun;91(6):510-8). 동물 모델에서 혈관의 방사선 유발의 기능질병의 세기는 CCL-매개된 신호 경로의 억제로 인해 효과적으로 감소될 수 있는 것으로 나타났다. CCL2 수용체 유전자에 의해서뿐만 아니라 상기 수용체의 길항물질의 사용의 경우에 수를 감소시키는 동물의 사용은 형태의 방사선 유발의 변경 및 내피 세포의 파괴를 차단하고, 방사선 후의 직접적인 기도 염증의 발달을 방지한다(Antioxid Redox Signal. 2018 Apr 2. doi: 10.1089/ars.2017.7458). 게다가, CCL-매개된 신호 경로의 억제는 방사선의 주요 "유예된" 부작용들 중 하나인 방사선 유발의 폐 섬유증의 세기가 유의하게 감소하는 것을 허용한다.
그러므로, 문헌의 데이터를 기반으로, 글루타미닐 고리화효소의 억제로 향한 전략은 자가면역 질환, 비만, 폐, 기도 및 복강의 질환, 방사선 병 및 통증 증후군의 치료에 대한 가능한 접근법이라고 결론내리는 것이 가능하다.
현재 황지질(WO 2017/046256), 플라보노이드 유도체(Bioorg Med Chem. 2016 May 15;24(10):2280-6), 피리딘 유도체(US　2015/0291632) 및 최근 작업에서 기술된 일부 작은 분자(J Med Chem. 2017 Mar 23;60(6):2573-2590; WO 2014/193974, US　2015/0291557)를 포함하는 글루타미닐 고리화효소 억제제가 알려져 있다. 본 발명의 목적인 화합물과 가장 가까운 유사체는 Probiodrug Aktiengesellschaft의 출판물에서 제시된다(J Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):49773-9). 이 작업은 이미다졸 유도체를 기반으로 한 글루타미닐 고리화효소 억제제를 기술한다. 그러나, Probiodrug Aktiengesellschaft사에 의해 공개된 화합물들의 구조에서 이미다졸은 이미다졸 고리의 질소 원자들 중 하나에 의한 지방족 치환기를 포함한다. 지방족 치환기의 도입은 화합물들의 대사 안정성을 감소시킨다. 나아가, 지방족 치환기의 도입은 화합물들의 소수성을 증가시키고 혈액-뇌 장벽을 통한 화합물의 관통을 용이하게 하며, 이것은 면역 체계 세포들의 이상 활성을 억제하기에는 분명히 불필요하고 잠재적으로 부작용을 유발할 수 있다.
지금까지 면역 체계 세포들의 이상 활성에 관련된 질환의 치료법에 사용될 수 있을 글루타미닐 고리화효소 억제제로서 작용하는 약물은 없었고, 그러므로 글루타미닐 고리화효소 억제제를 기반으로 한 새로운 효과적인 약물의 개발 및 실제적인 적용에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 기도 및 복강 질환, 방사선 병 및 다양한 종류의 통증 증후군, 및 또한 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 기타 질환을 치료하는 데 있어 글루타미닐 고리화효소를 억제하는 데 효과적인 화학적 화합물들의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 글루타미닐 고리화효소 억제제이고 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질환, 특히 폐, 기도 및 복부 질환, 방사선 병 및 통증 증후군, 및 또한 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 기타 질환을 치료하는 데 효과적인 신규한 의약을 제공하는 것이다.
발명의 기술적 결과는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질환, 특히 폐 및 기도 질환, 예컨대 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 비염(특히 알레르기성 비염), 비부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 이것의 징후들(특히 폐기종, 기관지 폐쇄); 복부 기관의 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 복막염 및 신증(특히 당뇨병성 신증); 방사선 병 및 통증 증후군, 및 또한 면역 체계 세포들의 이상 활성, 특히 면역 세포의 이상 주화성과 관련된 기타 질환을 치료하기 위해 글루타미닐 고리화효소 억제제를 사용하는 것을 허용하는 높은 억제 활성을 특징으로 하는 효과적인 글루타미닐 고리화효소 억제제의 개발 및 획득이다.
표시된 보조 기술적 결과는 식 (A)의 화합물을 적용함으로써 이루어진다:
Figure pct00001
식에서,
R1은 -C(O)-R2-C(O)- 또는 -R2-C(O)- 기이고, 여기서 R2는 하나 이상의 C1-C6 알킬로 선택적으로 치환된 -(CH2)n- 기, 또는 페닐이며,
n은 0 내지 4의 정수이다.
여기서 식 (A)의 표시된 화합물은 글루타미닐 고리화효소 억제제로서, 화합물 I 내지 X 중 임의의 화합물, 및 이것들의 조합 또는 이것들의 제약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
I
Figure pct00002
, II
Figure pct00003
,
III
Figure pct00004
, IV
Figure pct00005
,
V
Figure pct00006
, VI
Figure pct00007
,
VII
Figure pct00008
, VIII
Figure pct00009
,
IX
Figure pct00010
, X
Figure pct00011
.
표시된 기술적 결과는 또한 글루타미닐 고리화효소 활성과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하기 위한 화합물 I 내지 X 중 임의의 화합물 또는 이것들의 제약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물로부터 선택된 식 (A)의 화합물의 사용에 의해 이루어진다.
표시된 기술적 결과는 또한 면역 체계 세포들의 이상 활성, 특히 면역 체계 세포들의 이상 주화성과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하기 위한 화합물 I 내지 X 중 임의의 화합물 또는 이것들의 염, 수화물, 용매화물의 사용에 의해 이루어진다.
나아가, 발명은 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성, 특히 면역 체계 세포들의 이상 주화성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것이고, 발명에 따르는 화합물의 유효량 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물을 제공한다. 발명의 일부 구체예에서, 보조제는 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제이다.
발명은 또한 발명에 따르는 제약학적 조성물을 신체에 투여하는 단계를 포함하는, 신체의 글루타미닐 고리화효소의 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 포함한다. 글루타미닐 고리화효소 활성과 관련된 그러한 질병은 면역 체계 세포들의 이상 활성, 특히 면역 체계 세포들의 이상 주화성과 관련된 질환, 특히 폐 및 기도 질환이다. 발명의 특정한 비제한적 구체예에서, 폐 및 기도 질환은 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 폐기종, 비염, 비부비동염, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이다. 발명의 구체예의 특정한 경우에, 신체는 인간 또는 동물이다.
도 1은 기니 피그에서 급성 천식 모델에 대한 화합물 1의 특이적 약물학적 활성을 연구하는데 있어 기관지폐포 공간에서의 염증성 세포의 유입을 도시한다(M±m, n=10마리).
화합물 I 내지 X, 뿐만 아니라 많은 다른 화학적 화합물의 제조는 발명에 대한 출원 RU 2013/116822에서 기술된다. 표시된 특허 출원은 금속 이온을 착체형성하거나 킬레이트화하는 능력을 가지는 다이카르복실산 비스아미드 유도체, 및 또한 바이러스성 간염, HIV 감염, 암; 신경퇴행성, 심혈관, 염증성 질환; 당뇨병, 노인 질환, 미생물의 독소에 의해 유발된 질환, 및 또한 알코올 의존증, 알코올성 간경변, 빈혈, 만발성 포르피린증, 전이금속 염에 의한 중독을 예방 및/또는 치료하기 위한 작용제로서의 이것들의 사용을 개시한다.
식 (A)의 화합물의 특정 약물학적 활성의 연구 과정에서, 본 발명의 저자들은 놀랍게도 식 (A)의 화합물들이 면역 체계 세포들의 주화성에 영향을 미치는 것으로 나타난 것을 발견하였다. 면역 체계 세포들의 유입의 감소는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 많은 질환, 특히 폐 및 기도 질환, 예컨대 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 비염(특히 알레르기성 비염), 비부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 이것의 징후(특히, 폐기종, 기관지 폐쇄); 및 또한 복부 기관 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 복막염 및 신증(특히 당뇨병성 신증); 및 방사선 병의 치료에 사용될 수 있다.
주화성에 대한 영향이 금속 이온을 착체를 형성하거나 킬레이트화하는 화합물의 능력에 의해 예측되거나 설명될 수 없기 때문에, 잠재적인 치료적 표적을 찾고자 하는 시도가 이루어졌다. 연구 과정에서, 본 발명의 저자들은 식 (A)의 화합물들의 관찰된 치료 효과가 이들 화합물이 글루타미닐 고리화효소의 활성을 억제하는 능력과 관련되는 것을 발견하였다. 이어지는 연구 과정에서, 글루타미닐 고리화효소의 활성을 억제하는 능력은 또한 화합물 III, IV, V, VI, VII, VIII, IX 및 X에 대해서도 나타났다.
그러므로, 화합물 I 내지 X는 면역 체계 세포들의 주화성에 영향을 미치며 면역 체계 세포들의 세포의 이상 활성과 관련된 질환, 특히 폐 및 기도 질환, 예컨대 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 비염(특히 알레르기성 비염), 비부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 이것의 징후(특히, 폐기종, 기관지 폐쇄); 및 또한 복부 기관 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 복막염 및 신증(특히 당뇨병성 신증); 및 또한 방사선 병 및 통증 증후군의 치료법에 사용될 수 있는 신규한 글루타미닐 고리화효소 억제제이다.
용어 및 정의
용어 ≪화합물 I≫은 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]옥살아미드에 관한 것이다:
Figure pct00012
용어 ≪화합물 II≫는 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]아이소프탈아미드에 관한 것이다:
Figure pct00013
용어 ≪화합물 III≫은 또한 하기 구조식으로 표시되는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]카바미드에 관한 것이다:
Figure pct00014
용어 ≪화합물 IV≫는 또한 하기 구조식으로 표시되는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]말론아미드에 관한 것이다:
Figure pct00015
용어 ≪화합물 V≫는 또한 하기 구조식으로 표시되는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]석신아미드에 관한 것이다:
Figure pct00016
용어 ≪화합물 VI≫은 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]글루타르아미드에 관한 것이다:
Figure pct00017
용어 ≪화합물 VII≫은 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]아디파미드에 관한 것이다:
Figure pct00018
용어 ≪화합물 VIII≫은 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]-3-메틸펜탄다이아미드에 관한 것이다:
Figure pct00019
용어 ≪화합물 IX≫는 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]-3,3-다이메틸펜탄다이아미드에 관한 것이다:
Figure pct00020
용어 ≪화합물 X≫은 하기 구조식에 상응하는 N,N'-비스[2-(1H-이미다졸-4-일)에틸]테르프탈아미드에 관한 것이다:
Figure pct00021
용어 "C"는 온도와 관련하여 사용될 때 백분도 온도 등급이거나 섭씨 온도 규모를 의미한다.
용어 "IC 50 "은 효소의 최대 억제의 절반이 이루어지는 때의 테스트 화합물의 농도를 의미한다.
용어 "제약학적으로 허용되는 염" 또는 "염"은 상대적으로 무독성 산으로 제조되는 활성 화합물의 염을 포함한다. 제약학적으로 허용되는 무독성 염의 실례로는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산에 의해 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 석신산, 시트르산 또는 말론산과 같은 유기산에 의해 형성된, 또는 당업계에서 사용된 기타 방법에 의해 얻어진, 예컨대 이온 교환에 의해 얻어진 염을 포함한다. 다른 제약학적으로 허용되는 염으로는 아디프산염, 알긴산염, 아스코르브산염, 아스파르트산염, 벤젠설폰산염, 벤조산염, 중황산염, 붕산염, 부티르산염, 장뇌산염, 캄포설폰산염, 시트르산염, 사이클로펜탄프로피온산염, 다이글루콘산염, 도데실황산염, 에탄설폰산염, 포름산염, 푸마르산염, 글루코헵토네이트, 글리세로인산염, 글루콘산염, 헤미황산염, 헵타노에이트, 헥사네이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설폰산염, 락토비오네이트, 락트산염, 라우르산염, 라우릴 황산염, 말산염, 말레산염, 말론산염, 메탄설폰산염(메실레이트), 2-나프탈렌설폰산염, 니코틴산염, 질산염, 올레산염, 옥살산염, 팔미트산염, 파모산염, 펙틴산염, 과황산염, 3-페닐프로피온산염, 인산염, 피크레이트, 피발산염, 프로피온산염, 헤미푸마르산염, 스테아르산염, 석신산염, 황산염, 타르타르산염, 티오시안산염, p-톨루엔설폰산염(토실레이트), 운데칸산염, 발레르산염, 등을 들 수 있다.
용어 "용매화물"은 발명에 따르는 화합물 및 제약학적으로 허용되는 용매, 예를 들어 에탄올의 하나 이상의 분자를 포함하는 분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다. 용어 "수화물"은 상기 용매가 물일 때 사용된다.
용어 면역 체계 세포들의 "이상 활성"은 본원에서 병리가 없을 때 신체의 면역 체계 세포들의 기본적인 활성 수준과 유의하게 상이한 활성을 의미한다. 이상 활성은 면역 체계 세포들의 기관 또는 조직으로의 과도한 유입, 면역 체계 세포들의 활성화를 초래하는 과정들의 비정상, 면역 체계 세포들의 사멸과 관련된 과정들의 규제 완화에 의해, 뿐만 아니라 기타 인자들에 의해 유발될 수 있다.
용어 "보조제"는 의약의 일부이거나 제조 과정, 필요한 물리적 및 화학적 특성을 의약에 부여하기 위한 의약의 제조에 사용되는 무기 또는 유기 기원의 임의의 제약학적으로 허용되는 물질을 의미한다.
용어 "RPMI 배지"(Engl. Roswell Park Memorial Institute medium)는 세포 및 조직 배양을 위한 배지를 의미한다. RPMI는 전통적으로 인간 림프계 세포의 배양을 위해 사용된다. 배지는 실질적인 양의 인산염을 함유하며 5% 이산화탄소를 함유하는 대기에서의 배양을 위한 제형을 가진다.
용어 "글루타미닐 고리화효소"는 상이한 펩타이드 기질에서 N-말단 글루타민의 피로글루타민으로의 전환에 참여하는 효소 - 아미노아실트란스퍼라제를 의미한다. N-말단 피로글루타메이트의 형성은 생물학적으로 활성인 펩타이드, 호르몬 및 케모카인(예컨대, 갑상선 자극호르몬-방출 호르몬, β-케모카인 리간드-2)을 엑소펩티다아제에 의한 분해로부터 보호하며, 일부 경우에 리간드의 이것들의 수용체에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다.
용어 "주화성"은 화학적 자극에 대한 반응으로 세포의 방향이 정해진 이동을 의미한다. 주화성의 중심에는 세포가 주화성 매개제의 농도 구배에 반응하는 능력이 있다. 주화성은 면역 체계 세포들이 이로 인해 혈류를 벗어나 손상된 조직으로 이동하게 되는 과정이다. 주화성 물질(화학유인물질)은 주화성에서 주도적 역할을 한다. 단핵세포 및 대식세포에 대한 가장 강력한 화학유인물질 중 하나는 케모카인 CCL2이다.
용어 "치료", "치료법"은 포유류, 바람직하게는 인간에서 병리적 상태의 치료를 포함하며, a) 질환의 저하, b) 질환의 차단(지연), c) 질환 중증도의 완화, 즉 질환 퇴행의 유도, d) 그 용어가 적용되는 질환 또는 상태, 또는 그 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 반전을 포함한다.
용어 "예방", "방지"는 질환의 임상 단계의 시작 가능성의 감소에 관련된, 표유류, 바람직하게는 인간에서 위험 인자의 제거, 뿐만 아니라 질환의 준임상 단계의 예방적 치료를 포함한다. 환자들은, 공지의 데이터를 기반으로, 일반 집단에 비교한 질환의 임상 단계의 시작의 증가된 위험을 수반하는 인자들을 기반으로 한 예방적 치료법에 대해 선택된다. 예방적 치료법은 a) 일차 예방 및 b) 이차 예방일 수 있다. 일차 예방은 아직 질환이 발생하지 않은 임상 단계에 있는 환자들에 대한 예방적 치료로서 정의된다. 이차 예방은 질환의 동일하거나 유사한 임상 단계가 재발하는 것을 예방하는 것이다.
화합물 I 내지 X는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질환, 특히 면역 체계 세포들의 이상 주화성과 관련된 질환의 치료, 특히 폐 및 기도 질환, 예컨대 기관지 천식, 급성 및 만성 기관지염, 인두염, 비염(특히 알레르기성 비염), 비부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 이것의 징후(특히, 폐기종, 기관지 폐쇄); 복부 기관 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 복막염 및 신증(특히 당뇨병성 신증); 방사선 병 및 일차 병리적 변화에 의해 제공된 또는 상이한 질환 또는 일부 의약의 장기간 섭취와 관련된 것을 포함한, 전신성 및 국지성 특징을 모두 가지는 통증 증후군의 치료에 대한 관점이다. 일부 특정 구체예에서, 발명에 따르는 화합물은 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 다른 질환의 치료에 사용될 수 있다.
화합물의 치료적 사용 방법
발명의 주제는 또한 적절한 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 발명에 따르는 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은 환자에게 투여되거나 전달되는 하나 이상의 화합물의 그러한 양을 의미하며, 이때 환자는 치료(예방)에 대한 원하는 반응을 나타낼 가능성이 가장 크다. 필요한 양의 정확한 양은 환자의 연령, 체중 및 일반적인 상태, 질환의 중증도, 투여 방법, 다른 약물과의 조합 치료, 등에 따라 대상체마다 다를 수 있다.
발명에 따르는 화합물 또는 하나 이상의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물은, 질환을 치료 또는 예방하기 위해 효과적인 임의의 양으로(바람직하게는 활성 성분의 일일 용량은 1일당 환자에 대해 최대 0.5 g이고, 가장 바람직하게는 일일 용량은 5 내지 50 mg/일임) 및 임의의 투여 방법에 의해(바람직하게는, 경구 투여 방법) 환자에게 투여될 수 있다.
의약을 원하는 투여량으로 특정한 적합한 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합한 후, 발명의 본질을 나타내는 조성물은 인간 또는 다른 동물에게 경구로, 비경구로, 국소적으로, 등의 방법으로 투여될 수 있다.
투여는 하루에, 또는 한 주에 한 번 및 여러 번으로(또는 임의의 다른 시간 간격으로), 또는 가끔씩 수행될 수 있다. 나아가, 하나 이상의 화합물은 환자에게 일일 특정한 날의 기간(예컨대 2 내지 10일)에 걸쳐 투여된 후, 물질을 받지 않는 기간(예컨대 1 내지 30일)이 이어질 수 있다.
발명에 따르는 화합물이 조합 치료법의 양생법의 일부로서 사용되는 경우에, 조합 치료법의 각 성분의 용량은 필요한 치료 기간 동안 투여된다. 조합 치료법을 구성하는 화합물들은 모든 성분들을 함유한 투여 형태로 한 번에 및 성분들의 개별적인 투여 형태로 환자에게 투여될 수 있다.
제약학적 조성물
발명은 또한 식 (A)의 화합물, 특히 화합물 I 내지 X(또는 선구약물 형태 또는 다른 제약학적으로 허용되는 유도체) 및, 예컨대 발명의 본질을 나타내는 화합물과 함께 환자에게 투여될 수 있고 화합물의 약물학적 활성에 영향을 미치지 않으며, 화합물의 치료적 양의 전달에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물에 관련된다.
본 발명에 따라 청구되는 제약학적 조성물은 특정 투여 형태에 적합한 임의의 용매, 희석제, 분산제 또는 현탁제, 계면활성제, 등장성 작용제, 증점제 및 유화제, 보존제, 결합제, 윤활제, 등을 포함할 수 있는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 하나 이상의 식 (A)의 화합물들을 포함한다. 제약학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질로는, 한정하는 것은 아니지만, 단일- 및 올리고당 및 이것들의 유도체; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약용 왁스; 오일, 예컨대 땅콩 기름, 면실유, 홍화유, 참깨 기름, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 발열원-유리 물; 등장성 용액, 링거액; 에틸 알코올, 및 인산염 완충 용액을 들 수 있다. 조성물은 또한 다른 무독성 부합성 윤활제, 예컨대 라우릴 황산 나트륨 및 스테아르산 마그네슘, 및 또는 염료, 필름 형성제, 감미제, 풍미 및 방향제, 보존제 및 항산화제를 포함할 수 있다.
발명의 목적은 또한 투여 형태 - 제약학적 조성물의 부류로, 이것의 제형은 치료적 유효량으로 신체에 투여되는 특정 방법, 예컨대 권장된 투여량으로, 경구 투여, 국소 투여, 또는 예컨대 흡입 스프레이 형태로 흡입에 의한 투여, 또는 혈관내 방법에 의해, 비내로, 피하로, 근육내로, 뿐만 아니라 주입 방법에 의한 투여에 대해 최적화된다.
발명의 투여 형태는 리포좀, 미세캡슐화 기법, 의약의 나노형태의 제조 방법 또는 제약학에 공지되어 있는 다른 방법들의 사용 방법에 의해 얻어진 제형들을 포함할 수 있다.
조성물의, 예를 들어 정제 형태로의 제조시, 유효 성분은 하나 이상의 제약학적 부형제, 예컨대 젤라틴, 전분, 락토오스, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 실리카, 아라비아 고무, 만니톨, 미정질 셀룰로오스, 하이프로멜로스(hypromellose) 등과 혼합된다.
정제는 수크로오스, 셀룰로오스 유도체로 또는 코팅을 적용하기에 적합한 다른 물질로 코팅될 수 있다. 정제는 직접 압축, 건식 또는 습식 과립화 또는 고온 상태에서의 고온 융합과 같은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
젤라틴 캡슐 형태의 제약학적 조성물은 유효 성분을 다른 물질과 혼합하고, 얻어진 혼합물로 연질 또는 경질 캡슐을 충전함으로써 제조될 수 있다.
비경구 투여의 경우, 약물학적으로 부합하는 작용제, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜을 함유한 수성 현탁액, 등장성 염수 용액 또는 멸균된 주사 용액이 사용된다.
제약학적 조성물의 실례
발명에 기술된 식 (A)의 화합물들은 인간 질환 또는 동물 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 다음의 조성물의 형태로 사용될 수 있다(식 (A)의 화합물은 "물질"인 것을 의미한다):
정제 I mg/정제
물질...............................0.5
미정질 셀룰로오스..................66.5
카르복시메틸 나트륨 전분...........2.3
스테아르산 마그네슘................0.7
정제 II mg/정제
물질...............................5.0
미정질 셀룰로오스..................62.0
카르복시메틸 나트륨 전분...........2.3
스테아르산 마그네슘................0.7
정제 III mg/정제
물질...............................50
미정질 셀룰로오스..................62.0
카르복시메틸 나트륨 전분...........23
스테아르산 마그네슘................7
정제 IV mg/정제
물질...............................50
락토오스 Ph. Eur...................223.75
크로스카르멜로스 나트륨............6.0
옥수수 전분........................15
폴리비닐 피롤리돈(5% v. 페이스트)..2.25
스테아르산 마그네슘................3.0
정제 V mg/정제
물질...............................200
락토오스 Ph. Eur...................182.75
크로스카르멜로스 나트륨............12.0
옥수수 전분(5% v. 페이스트)........2.25
스테아르산 마그네슘................3.0
캡슐 mg/캡슐
물질...............................10
락토오스 Ph. Eur...................488.5
마그네시아.........................1.5
주사용 제형 I (50 mg/ml)
물질...............................5.0% w/v
1 M 수산화 나트륨 용액.............15.0% w/v
1 M 황산 용액......................pH 7.6까지
폴리에틸렌 글리콜 400..............4.5% w/v
주사용 물..........................100%까지
연고 ml
물질...............................40 mg
에탄올.............................300 μl
물.................................300 μl
1-도데실아자사이클로헵탄온.........50 μl
프로필렌 글리콜....................1 ml까지
이 조성물들은 표준 제약 기법에 따라 제조될 수 있다. 정제 (I) 내지 (II)는, 예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트를 사용하여 장용 껍질(enteric shell)에 의해 코팅될 수 있다.
조합 치료법에서의 화합물 I 내지 X의 사용
화합물 I 내지 X가 개별적인 활성 제약학적 작용제로서 투여될 수 있다는 사실에도 불구하고, 이것은 또한 하나 이상의 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있고, 특히, 다른 작용제는 항생물질, NSAID 또는 다른 항-염증제, 항고혈압제, 글루코코르티코스테로이드, 단클론성 항체, 등일 수 있다. 조합 흡수의 경우, 치료제들은 동시에 또는 순차적으로 상이한 시간에 투여되는 상이한 투여 형태를 나타낼 수 있거나, 또는 치료제들은 하나의 투여 형태로 조합될 수 있다.
다른 제약학적 작용제와 조합된 발명의 화합물들과 관련하여 구절 "조합 치료법"은 어떻게든 약물의 조합의 유익한 효과를 제공하는 모든 작용제의 순차적이거나 동시의 섭취이다. 조합된 투여는, 특히, 예컨대 하나의 정제, 캡슐, 주사 또는 활성 물질의 고정 비율을 가지는 기타 형태로의 조합된 전달, 뿐만 아니라 각 화합물에 대한 각각의 여러 별도의 투여 형태로의 동시 전달을 의미한다.
그러므로, 발명의 화합물 I 내지 X의 투여는, 항균제, 세포증식 억제 및 세포독성 약물, 한 의약의 증상 또는 부작용을 억제하기 위한 의약의 사용을 포함한, 상응하는 질환의 예방 및 치료 분야에서 당업자들에게 알려져 있는 추가적인 치료법과 함께 수행될 수 있다.
만약 의약이 고정된 용량이라면, 그러한 조합은 적합한 투여향 범위로 발명의 화합물을 사용한다. 발명에 따르는 화합물 I 내지 X는 또한, 이런 의약들의 조합이 불가능한 경우에, 다른 작용제들과 순차적으로 환자에게 투여될 수 있다. 발명은 투여 순서에 제한되지 않으며; 발명의 화합물들은 환자에게 또 다른 의약의 투여와 함께, 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
실시예
발명에 따르는 화합물들의 획득
화합물 I 내지 X의 제조 방법은 발명에 대한 출원 RU 2013/116822에서 개시된다. 금속 이온을 착체를 형성하거나 킬레이트화하는 유사한 화합물의 능력은 동일한 출원에서 기술된다.
발명에 따르는 화합물들의 생물학적 활성의 특징
화합물 I 내지 X의 생물학적 활성은 상이한 시험관내 및 생체내 실험으로 연구되었다. 특히, 다양한 시험관내 및 생체내 모델에서 화합물 I 및 II의 활성의 연구는 단핵세포, 대식세포 및 다른 면역 체계 세포의 주화성에 대한 화합물 I 및 II의 억제 효과를 보여주었다. 화합물 I 및 II의 생물학적 효과는 금속 이온의 킬레이트화의 화합물 I 및 II의 능력에 대한 선행 지식을 기반으로 예측되거나 설명될 수 있다.
화합물 III 내지 X의 생물학적 활성의 시험관내 연구는 화합물 III 내지 X가 또한 효소 - 글루타미닐 고리화효소의 억제제이고 따라서 면역 체계 세포들의 주화성에 미치는 화합물 III 내지 X의 영향이 글루타미닐 고리화효소의 활성의 억제에 의해 매개될 수 있음을 드러냈다.
시험관내에서 인간 글루타미닐 고리화효소의 효소 활성에 미치는 화합물 I 내지 X의 영향의 연구
시험관내에서 글루타미닐 고리화효소의 효소 활성에 미치는, 본 발명의 목적인 화합물 I 내지 X의 영향에 대한 연구 중에, 재조합 세포내 인간 글루타미닐 고리화효소에 미치는 화합물 I 내지 X의 직접적인 억제 효과가 처음 발견되었다.
화합물 I 내지 X의 다양한 농도에서의 글루타미닐 고리화효소 활성은 25℃에서 형광 기질인 L-글루타미닐 2-나프틸 아미드(Gln-bNA)를 사용하여 연구하였다(Anal Biochem. 2002 Apr 1;303(1):49-56). 100-μl의 부피를 가진 반응 혼합물은 50 mM 트리스아미노메탄-HCl 및 5% 글리세롤 중의 50 μM의 형광발색 기질; 약 0.2 유닛의 인간 피로글루타미닐 아미노펩티다제(1 유닛은 1분당 1 마이크로몰의 pGlu-bNA를 가수분해하는 양으로서 정의됨), 및 부분표본액의 재조합 세포내 인간 글루타미닐 고리화효소(gQC)를 함유하였고, pH는 8.0이다. 반응은 반응 혼합물에 5분 동안 화합물 I 내지 X와 함께 인큐베이션한 부분표본액의 글루타미닐 고리화효소를 첨가함으로써 시작되었다.
시험관내에서 인간 글루타미닐 고리화효소의 효소 활성에 미치는 화합물 I 내지 X의 영향
번호 화합물 IC50, μM Ki, μM
I
Figure pct00022
 1.4 0.8
II
Figure pct00023
 2.9 1.61
III
Figure pct00024
 3.5 2
IV
Figure pct00025
 6.3 3.50
V
Figure pct00026
 20 11
VI
Figure pct00027
 5.4 3
VII
Figure pct00028
 4.4 2
VIII
Figure pct00029
 7.3 4
IX
Figure pct00030
 5.7 3.17
X
Figure pct00031
 0.8 0.44
반응의 추가 과정을 분광광도계로 모니터링하였다(여기 및 방출의 파장은 320 및 410 nm였음). 효소 활성을, 보정 곡선으로부터 계산한, 방출된 2-나프틸 아미드(bNA)의 양에 의해 측정하였다. IC50 값을 "억제제 농도"-"효소 활성" 곡선의 비선형 회귀를 사용하여 계산하였다. 참조 물질로서, 글루타미닐 고리화효소의 공지된 억제제 - 화합물 PBD150 -를 사용하였다(J Med Chem. 2006 Jan 26;49(2):664-77).
연구 결과로서, 화합물 I 내지 X는 0.8 내지 20 μM 범위의 글루타미닐 고리화효소의 활성을 억제하는 것으로 확립되었다(표 1 참조).
시험관내에서 단핵세포의 이동에 미치는 화합물 I 및 II의 영향의 연구
시험관 내에서 단핵세포의 이동에 미치는 화합물 I 및 II의 영향을 10% 열-비활성화된 소태아 혈청이 첨가된 배지 RPMI 1640에서 (2-3)×106개 세포/ml의 농도로 배양된 세포주 U937을 사용하여 연구하였다(Biochem J. 2012 Mar 1;442(2):403-12). 약 1×107개의 U937 세포를 상이한 농도의 화합물 I 및 II(모든 화합물의 각각에 대해 7가지 농도)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 리포다당 대장균(O111:B4)로 처리하였다. 상층액(조건화 배지)을 단핵세포의 이동을 연구하는 데 사용하였다.
U937 세포의 새로운 배치를 형광 염료 칼세인 AM으로 1시간 동안 7℃에서 착색시켰다. 이후에, 부분표본액의 착색된 세포를 평판의 BD FalconTM HTS FluoroBlok의 구멍의 상부 섹션에 놓는데, 거기에서 세포를 광학적으로 불투명한 반투과성 막에 의해 분리한다. 세포를 억제제 및 리포다당과 인큐베이션한 후에 얻어진 조건화 배지를 평판의 구멍의 하부 섹션에 넣었다. 평판을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 구멍의 하부 섹션으로 이동한 세포의 양(억제제 없는 연구에 대한 %)을 형광광도계로 측정하였다. 참조 물질로서, 글루타미닐 고리화효소의 공지 억제제 - 화합물 PBD150 -가 사용되었다(J Med Chem. 2006 Jan 26;49(2):664-77).
실험의 결과로서 마이크로몰 범위의 농도의 화합물 I 및 II가 시험관내에서 단핵세포의 이동에 대해 억제 효과를 가지는 것이 확립되었다. 화합물 I은 1 μM 내지 300 μM의 광범위한 농도에서 60%에 가까운 효율로 단핵세포의 이동을 억제한다. 동일한 범위의 농도에서, 화합물 II는 50 내지 70%의 효율로 단핵세포의 이동을 억제한다.
기니 피그에서 기관지 천식 모델에 대해 생체내에서 백혈구의 주화성에 미치는 화합물 I의 영향의 연구.
기니 피그에서 기관지 천식의 유도를 표준 과정에 따라 수행하였다(Current Drug Targets. 2008 Jun; 9(6):452-65). 동물들을 100 μg/ml 오브알부민(Sigma) 및 100 mg/ml 하이드록시알루미늄을 함유한 0.5 ml 용액의 단일 복강내 주사에 의해 면역화하였다. 무손상 동물(intact animal)을 0.5 ml의 부피의 염수 용액으로 복강내 주사하였다.
실험의 29, 30 및 31일째에, 기도의 과다반응의 유발을 증가하는 농도 - 0.1, 0.3 및 0.5 mg/mL(각각 29, 30 및 31일째에)의 오브알부민의 흡입 투여에 의해 수행하였다. 흡입은 5분 동안 또는 질식(측면 발생)의 외관상 신호가 나타날 때까지 수행하였다. 32일째에, 동물에게 시험 용량 - 1 mg/ml의 오브알부민으로 5분 동안 투여하였고, 기관지 경련을 평가하였다.
테스트 화합물을 10일 동안 1일 1회 동물의 위내로 투여하였고, 시험 용량의 항원의 투여전 24시간 전에 마쳤다.
시험 용량의 오브알부민의 투여 후 24시간 후에 기관지폐포 세척액(BAL)을 동물로부터 수집하였다. BAL 획득을 주사기 디스펜서를 사용하여 기관을 통해 사전에 37℃로 가온하여 놓은 5 ml의 염수 용액으로 폐를 세척함으로써 마취 하에 수행하였다.
기관지폐포 세척액에서, 1 μl의 세척액에서의 세포 요소들의 절대 수를 Goryaev 카메라를 사용하여 계산하였다. 그런 후, 기관지폐포 세척액을 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 침강물로부터 얼룩을 제조하고, 그 얼룩을 추가로 메탄올에 고정시키고 내부폐 사이토그램을 계수하기 위하여 Romanowsky-Giemsa에 의해 염색하였다.
기관지폐포 세척액(BAL)의 세포학적 분석은 민감화된 기니 피그의 BAL에서 세포 요소들의 다중 증가를 나타냈다(도 1). 그러므로, 모델은 실험 동물의 기도의 염증 반응을 특징으로 한다. 개별적인 세포 유형의 분석은 세포의 가장 뚜렷한 유입이 호산구에 대한 것임을 보여주었다. 얻어진 결과는 문헌의 데이터를 확인시켜주고 시뮬레이션된 염증이 알레르기성인 것이라고 결론내리는 것을 가능하게 한다.
10일 동안 화합물 I의 매일 위내 투여는 기관지폐포 공간에 염증성 세포의 유입을 감소시켰다. 화합물 I은 연구 하의 용량 범위 전체(0.14 내지 14 mg/kg)에서 치료 효과를 나타내며, 백혈구의 총 수 및 개별적인 세포 유형: 호산구, 호중구, 대식세포의 양 두 가지를 모두 감소시켰다(도 1).
그러므로, 도 1에서, 기호*는 무손상 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한(p <0.05) 차이를 표시하고; 기호 &는 대조군(control) 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한(p <0.05) 차이를 표시한다.
얻어진 결과는 화합물 I이 기관지 천식에 대해 치료 효과를 나타낸 것을 가리킨다.
비-감염성 폐 염증의 래트 모델에서 생체내에서 대식세포, 호중구, 및 호산구의 주화성에 미치는 화합물 I의 영향의 연구
세파덱스-유도된 폐기관지염의 래트 모델을 표준 과정에 의해 구현하였다(Int Arch Allergy Immunol. 2011; 154(4):286-94). Wistar 수컷 래트에 5 mg/kg의 용량의 세파덱스 G-200(Pharmacia, Sweden)의 흡입에 의해 단일 투여하였다. 테스트 화합물을 동물에게 4중으로 위내로 투여하였다: 세파덱스의 투여 전 24시간 및 1시간 전과 투여 후 24시간 및 45시간 후. 참조 의약인 부데소니드(budesonide)를 동일한 방식으로 0.5 mg/kg의 용량으로 흡입에 의해 투여하였다. 세파덱스의 흡입 후 48시간 후에, 기관지폐포 세척액의 획득을 수행하였다. 세척액에서 백혈구의 총 수를 평가하고 백혈구 식(leukocytic formula)을 측정하였다.
기관지폐포 세척액의 분석은 세파덱스 G-200의 래트에 대한 단일 흡입 투여가 폐로의 백혈구의 뚜렷한 유입을 유발하는 것을 보여주었다. 모든 세포 유형의 양은 무손상 그룹에 비교하여 대조군 그룹에서 증가하였다(표 2).
래트에서 세파덱스-유도된 기관지염의 모델에 대한 기관지폐포 세척액의 세포 요소들의 양(M±m, n=10마리)
그룹 1 μL의 BAL에서 세포 요소들의 양
백혈구 호중구 호산구 대식세포 림프구
무손상 2209±348 270±54 0±0 1975±346 0±0
대조군 4617±582* 989±135* 248±65* 3209±397* 0±0
화합물 I
(0.18 mg/kg)		 3833±525* 283±75 & 0±0 & 3127±351* 0±0
화합물 I
(1.8 mg/kg)		 4133±454* 846±101* 0±0 & 3287±381* 0±0
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
화합물 I의 래트에 대한 위내 투여는 무손상 동물의 수준에 비해 BAL에서 호중구 및 호산구의 함량을 감소시켰다. 얻어진 결과는 화합물 I이 하부 기도의 염증, 특히 기관지염에 치료 효과를 가지는 것을 나타낸다.
담배 연기 추출물에 의해 유도된 비-감염성 폐렴의 모델에 대한 화합물 I의 활성의 연구
마우스에서 비-감염성 폐렴의 유도를 표준 과정에 따라 수행하였다[Exp Lung Res. 2013 Feb;39(1):18-31]. 수컷 Balb/c 마우스에 담배 연기 추출물(CSE, 0.45 ml/20 mg)로 제 0, 11, 15, 17. 19 및 22일에 복강내 투여하였다. CSE를 다음과 같이 제조하였다: 5개의 담배를 진공 펌프를 사용하여 태우고, 연기를 여과하여 입자를 제거하고 인산염 염수 완충액을 함유한 용기에 수집하였다. 화합물 I을 위내로, 일일, 제 7일부터 27일까지 하루에 한 번 투여하였다. 안락사를 제 28일에 수행하였다. 우측 폐엽을 10% 중성 포르말린 용액에 고정시키고, 증가하는 농도의 알코올을 통해 크실렌으로 통과시키고, 표준 과정에 의해 파라핀에 삽입하였다. 파라핀을 제거한 5-마이크론 도말 표본(smear)을 헤마토크실린-에오신으로 염색하고 조직학적 분석을 수행하였다.
각각의 병변을 5-점 척도에 따라 평가하였다: 1점 - 염증 침윤물이 연구 하의 조직학적 제제의 면적의 0 내지 20%를 차지함, 2점 - 염증 침윤물이 연구 하의 조직학적 제제의 면적의 21 내지 40%를 차지함, 3점 - 염증 침윤물이 연구 하의 조직학적 제제의 면적의 41 내지 60%를 차지함, 4점 - 염증 침윤물이 연구 하의 조직학적 제제의 면적의 61 내지 80%를 차지함, 5점 - 염증 침윤물이 연구 하의 조직학적 제제의 면적의 81 내지 100%를 차지함. 폐포의 총 수에 대한 손상된 폐포의 백분율로서 폐포 파괴 지수(DI)를 또한 계산하였다.
연구 결과는 담배 연기 추출물의 마우스로의 다수의 복강내 투여가 혈관주위염(perivasculitis), 기관지주위염(peribronchitis), 폐포염(alveolitis) 및 간질성 폐렴(interstitial pneumonia)의 형성을 유도한 것을 보여주었다(표 3).
화합물 I의 위내 투여는 혈관주위염, 기관지주위염, 폐포염 및 간질성 폐렴의 발생을 유의하게 감소시켰다(표 3). 얻어진 결과는 화합물 I이 혈관주위염 및 폐포염의 경우에 치료 효과를 가질 것이라고 결론내리는 것을 가능하게 만든다.
담배 연기 추출물에 의해 유도된 비-감염성 폐렴의 모델에 대한 조직학적 연구의 결과(M±m, n=12마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 혈관주위염, 지점 기관지주위염, 지점 폐포염(DI, %) 간질성 폐렴, 지점
무손상 - 0.71±0.20 0.51±0.19 11.50±1.20 0.99±0.20
대조군 - 1.50±0.24* 1.29±0.18 30.90±2.30* 1.81±0.27*
화합물 I 0.3 0.38±0.13& 1.09±0.24 17.70±2.00*& 1.08±0.26
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
폐기종의 마우스 모델에 대한 생체내에서의 화합물 I의 활성의 연구
염증 및 폐기종은 돼지 췌장 엘라스타아제의 단일 기관내 주입에 의해 유발되었다. 엘라스타아제는 30 μl의 NaCl 0.9% 중의 0.6 U/마우스의 용량으로 1회 기관내 투여하였다. 펜토바르비탈을 수술 중 마취를 위해 30 mg/kg의 용량으로 복강내로 사용하였다. 수술 부위를 70% 에탄올 용액으로 처리하였고 헤어-커버링(hair-covering)으로부터 드러내었다.
목의 중간 선에서, 피부, 피하조직 및 목의 자체 근막을 절개하였다. 근육들은 기관의 복부 상에서 비절개 박리조직 방식에 의해 따로 움직였다.
돼지 췌장 엘라스타아제의 주입은 흡입 중에 바람 흐름을 따라 Hamilton 주사기를 사용하여 수행하였다. 상처 봉합 후 수술 부위를 소독제로 처리하였다. 엘라스타아제의 투여를 실험의 0일로서 정하였다.
화합물 I을 0.3 mg/kg의 용량으로 실험의 제 8일부터 21일에 1일 1회 위내로 투여하였다. 제 21일에 동물을 CO2 챔버에서 안락사시키고 폐를 분리하였다. 좌측 폐의 폐 조직에서 기종의 역학 및 중증도를 평가하기 위하여, 조직학적 시편을 만들었다. 이것을 위해, 폐를 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 후 표준 과정에 따라 파라핀에 삽입하였다. 5 마이크론의 두께를 가지는 폐의 정점, 중간 폐 영역 및 하부 폐 영역의 시편들을 파라핀 제거된 도말 표본으로부터 얻었고 헤마톡실린 및 에오신으로 표준 과정에 의해 염색하였다. 다음에 폐의 정점, 중간 및 하부 폐 영역의 사진들을 제작하였다. 컴퓨터 그래픽 처리 도구를 사용하여, 확대된 기종성 폐 조직의 정위 및 면적(정상 조직의 %)을 조사하였고, 혈관 및 기관지는 계산으로부터 배제하였다(Int J Biomed Imaging. 2012;2012:734734; Front Physiol. 2015 May 12;6:14).
마우스의 폐의 모든 면적에서 엘라스타아제의 투여 후 제 21일에 조직학적 조사는, 치조간 중격(interalveolar septa)의 마이크로원형관 및 모세관의 혈관의 적당히 명백한 충혈을 드러냈다. 나아가, 엘라스타아제는 림프-대식세포 침윤으로 인한 폐포 벽의 비후 및 또한 간질 조직의 염증성 침윤을 초래하였다. 개별적인 폐포의 루멘은 또한 대식세포 및 림프구로 채워진다. 폐 실질의 세기관지, 폐포관 및 폐포의 탄성 섬유에 미치는 손상제의 영향의 결과로서, 폐포 중격의 폐포 팽창 및 파괴가 관찰되었고, 미만성 폐기종이 발생하였다. 시편의 분석은 실험의 제 21일에, 좌측 폐 조직의 유의한 부분이 폐포간 중격의 파괴로 팽창된 기종성 폐포들로 복잡해졌음을 보여주었다. 기종은 모든 폐 영역에 국지화되었다. 가장 명백한 병변들은 하부 폐 영역에서 관찰되었다(표 4).
실험의 제 21일에 엘라스타아제의 기관내 투여의 조건 하에 마우스에서 팽창된 기종성 폐 조직의 면적(정상의 %)(M±m, n=5마리)
그룹 상부 폐 영역 중간 폐 영역 하부 폐 영역
무손상 대조군 0 0 0
병리적 대조군 24.06 ±6.12* 63.76 ±5.02 * 82.90 ±2.88 *
화합물 I(3 mg/kg) 11.76 ±1.48 * 37.09 ±5.86 *● 35.28 ±5.81 *●
주:
1 - * - 차이는 무손상 대조군에 비교하여 신뢰할만하다(p<0.05);
2 - ● - 차이는 병리적 대조군에 비교하여 신뢰할만하다(p< 0.05).
화합물 I의 투여는 폐 실질의 염증성 침윤의 세기를 감소시켰고 폐포간 중격의 미세원형관 및 모세관의 혈관의 명백한 충혈은 병리적 대조군의 그룹과 비교하여 팽창된 기종성 폐포의 상대 면적을 감소시켰다(표 4). 얻어진 데이터는 화합물 I이 폐기종의 경우에 치료 효과를 가지는 것으로 결론내릴 근거를 제공한다.
기니 피그에서 COPD 모델에 대한 화합물 1의 치료 활성의 연구
연구를 수컷 기니 피그에 대해 수행하였다. 만성 폐쇄성 폐 질환은 대장균 세포벽 리포다당(LPS) 및 담배 연기 추출물(TSE)의 내부기관 투여에 의해 유발되었다(Biol Pharm Bull. 2009 Sep;32(9):1559-64). TSE를 Hi-Lite 담배(일본)로부터 제조하였다(1개 담배의 제형: 타르 17 mg/담배, 니코틴 1.4 mg/담배). 추출물의 제조 전에, 담배 필터를 제거하였고, 필터를 포함한 담배의 길이는 80 mm인 판편, 필터를 제거한 후에는 55 mm이다. 추출은 불이 붙은 담배의 연기를 PBS를 통해, 진공 펌프(40 ml/40개 담배)를 사용하여 일정한 속도로 끌어당김으로써 수행하였다. 한 개의 담배를 태우는 시간은 180초였다. 입자를 제거하기 위하여, 결과적으로 얻어진 추출물을 45 nm의 기공 크기를 가진 박테리아 필터를 통해 여과하였다. TSE를 기니 피그에게 일일 하루에 한 번 1 내지 4, 6 내지 9, 11 내지 14, 16 내지 19시간에 흡입시켰다(0.3 ml/분, 40 분). LPS를 기니 피그에게 제 5, 10 및 15일에 하루에 한 번 흡입시켰다(25 μg/ml, 0.3 ml/분, 1시간). TSE의 마지막 흡입 전에, TSE의 마지막 흡입 직후에 및 TSE의 마지막 투여 후 1.5시간 후에, 호흡 기능을 평가하였다(15분 동안). 호흡 기능을 평가한 직후에, 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집하였다. BAL 포획을, 주사기 디스펜서를 사용하여 기관을 통해 37℃로 가열된 5 ml의 염수 용액으로 폐를 세척함으로써 마취 하에 수행하였다.
기관지폐포 세척액에서, 1 μl의 세척액(사이토시스)에서 세포 요소들의 절대 수를 Goryaev 카메라를 사용하여 계산하였다. 그런 다음, BAL을 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 도말 표본을 세포 침강물로부터 제조하였고, 그 도말 표본을 추가로 메탄올에 고정시키고 내부폐 사이토그램을 계수하기 위하여 Romanovsky-Giemsa에 의해 염색하였다.
화합물 I을 연구의 제 10일 내지 19일에 하루에 한 번 일일 동물에게 위내로 투여하였다(마지막 투여 - TSE의 마지막 흡입 전 1시간 전). 거짓 병리 그룹은 TSE 및 LPS 대신 염수 용액을 흡입하게 하였다. 대조군 동물은 테스트 물질 대신 동등한 부피의 용매를 받았다.
수행된 연구는 COPD 모델에 대해 화합물 1이 기니 피그의 기관폐포 공간으로의 염증 세포의 유입을 감소시키는 것을 보여주었다. 화합물 I은 호중구, 대식세포, 및 호산구의 유입을 감소시키는 것이 가장 명백하다(표 5).
기니 피그의 COPD 모델에 대한 기관지폐포 세척액의 세포 요소들의 양(M±m, n=10마리)
그룹 1 μl의 기관지폐포 세척액 중의 세포 요소들의 양
백혈구 호중구 호산구 대식세포 림프구
거짓 병리 2488±154 2876±27 184±65 2016±120 48±15
대조군 7925±1458# 1632±319# 676±187# 4789±782# 168±60
화합물 I
(0.014 mg/kg)		 2748±174 & 684±62#& 171±32 & 1805±123 #& 88±29
화합물 I
(0.14 mg/kg)		 3422±434 & 937±141# 287±64 # 2064±313 & 134±60
화합물 I
(1.4 mg/kg)		 4149±357#& 931±166# 245±55 # 2820±273& 71±29
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 거짓 병리 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
얻어진 결과를 요약하면, 화합물 I이 COPD의 경우에 명백한 치료 효과를 가지는 것으로 결론내리는 것이 가능하다.
알레르기성 비염의 기니 피그 모델에 대한 생체내에서 화합물 I의 활성의 연구
알레르기성 비염의 모델을 표준 방법에 의해 구현하였다(Int Immunopharmacol. 2013 Sep;17(1):18-25). 기니 피그(250 내지 300 그램)를 염수 용액에 희석되고 현탁된 오브알부민(100 μg/피그)과 수산화 알루미늄(5 mg/피그)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 4중으로(제 0, 7, 14 및 21일에) 면역화하였다. 연구의 제 28일에, 오브알부민 용액(60 mg/ml)을 각 콧구멍으로 20 μl씩 동물에게 비내로 투여하였다. 제 35일에, 동물을 등의 피부 구역을 깨끗하게 예비 면도한 후에, 오브알부민 용액(200 μg/ml, 25 μl)으로 피내 주사하였다. 민감화의 존재의 확인은 주사 부위에서의 부종 및 홍반의 형성이었다. 연구의 제 42일에, 오브알부민 용액(60 mg/ml, 20 μl/콧구멍)의 비내 투여를 수행하였다. 알레르기성 염증의 형성을 제어하기 위하여, 특히, 거짓으로 면역화된 동물의 그룹을 형성하였다: 제 0, 7, 14, 및 21일에 피그들에게 수산화 알루미늄 용액(5 mg/피그)을 주었다; 제 28일 및 35일에는 염수 용액을 주었고, 제 42일에는 오브알부민(60 mg/ml, 20 μl/콧구멍)을 주었다.
화합물 I, III, IV(0.14, 1.4 mg/kg)를 한 번, 오브알부민의 마지막 비내 투여 전 3시간 전에 위내로 투여하였다. 오브알부민의 마지막 투여 후 2시간 동안, 비염의 임상적 징후들을 평가하였다: 재채기 및 코의 긁적거림의 횟수를 계수하였다.
조사 결과를 표 6 내지 8에 제시한다.
오브알부민의 동물로의 마지막 비내 투여 후 2시간 동안 알레르기성 비염의 임상적 징후들에 대한 계수는 실험 동물에서 재채기 및 코의 긁적거림 횟수의 명백한 증가를 보여주었고, 이것은 알레르기성 비염의 구현된 모델의 정확성을 나타낸다.
화합물 I로 동물을 치료할 때 기니 피그에서 알레르기성 비염의 임상적 징후들(M±m, n=10 마리)
그룹 재채기의 양/2시간 코의 긁적거림의 양/2시간
거짓 면역화 5.9±1.3 12.5±3.1
대조군 17±1.8* 69±7.4*
화합물 I(0.14 mg/kg) 9.3±1.7 37.3±7.8*&
화합물 I(1.4 mg/kg) 12.1±1.5 41.0±12.0
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
화합물 III으로 동물을 치료할 때 기니 피그에서 알레르기성 비염의 임상적 징후들(M±m, n=10 마리)
그룹 재채기의 양/2시간 코의 긁적거림의 양/2시간
거짓 면역화 5.9±0.3 10.3±2.2
대조군 20.6±0.9* 75.4±6.5*
화합물 III(0.14 mg/kg) 17.8±0.7*& 32.5±8.0*&
화합물 III(1.4 mg/kg) 19.0±1.1* 39.9±9.5*&
화합물 IV로 동물을 치료할 때 기니 피그에서 알레르기성 비염의 임상적 징후들(M±m, n=10 마리)
그룹 재채기의 양/2시간 코의 긁적거림의 양/2시간
거짓 면역화 3.2±1.06 6.5±2.33
대조군 15.2±2.1* 20.8±4.2*
화합물 IV(0.14 mg/kg) 1.4±0.67 & 5.3±1.14
화합물 IV(1.4 mg/kg) 1.4±0.6 & 1.8±1&
화합물 I, III, IV의 기니 피그로의 위내 투여는 비염의 임상적 징후의 양을 현저하게 감소시켰다. 얻어진 결과는 화합물 I, III, IV가 알레르기성 비염의 경우에 명백한 치료 효과를 가지는 것으로 결론내릴 수 있는 근거를 제공한다.
포르말린-유도된 급성 비부비동염의 래트 모델에 대한 생체내에서 화합물 I의 활성의 연구
급성 비부비동염의 유도를 수컷 Wistar 래트에서 20 μl의 7.5% 포르말린의 각각의 비강 통로로의 비내 투여에 의해 수행하였다. 화합물 I을 1.8 mg/kg 및 18 mg/kg의 용량으로 일일 하루에 한 번, 포르말린의 투여 후 24시간 후에 시작하여 투여하였고, 마지막 투여는 제 7일에 있었다. 덱사메타손(0.6 mg/kg)을 동일한 방식으로 투여하였다. 제 8일에, 비강 세척액을 수집하였다. 비강 세척액에서, 백혈구의 총량을 평가하고 백혈구 식을 측정하였다.
비강 세척액의 분석은 급성 비부비동염에 백혈구의 비강 안으로의 명백한 유입이 수반되는 것을 보여주었다. 최대 증가는 대식세포의 양과 관련하여 주지되었다(표 9).
테스트 화합물의 래트로의 위내 투여는 무손상 동물의 수준에 대해 비강 세척액 중의 대식세포 및 호중구의 함량을 감소시켰다. 효과의 세기의 관점에서, 화합물 I은 덱사메타손과 동등하였다(표 9).
급성 비부비동염의 모델에 대한 래트의 비강 세척액 중의 세포 요소들의 양(M±m, n=10마리)
그룹 1 μl의 비강 세척액 중의 세포 요소들의 양
백혈구 호중구 호산구 대식세포 림프구
무손상 3420±641 3313±632 7±5 67±16 0±0
대조군 5568±1015 5217±980 16±10 291±72* 0±0
화합물 I(1.8 mg/kg) 5410±1143 5132±1096 11±11 231±49* 0±0
화합물 I(18 mg/kg) 2490±339& 2461±339 & 0±0 28±7& 0±0
덱사메타손(0.6 mg/kg) 1735±451*& 1664±433*& 0±0 68±23& 0±0
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
그러므로, 얻어진 결과는 화합물 I이 비부비동염의 경우에 명백한 치료 효과를 가지는 것을 보여주었다.
비-감염성 인두염의 래트 모델에 대한 생체내에서 화합물 I의 활성의 연구
비-감염성 인두염의 모델을 수컷 Wistar 래트에서 구현하였다. 래트를 티오펜톤 나트륨(50 mg/kg, 복강내로)으로 마취시키고 RenaSil® 실리콘 고무 튜브가 달린 캐뉼라(SIL 037, Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA)를 헤파린처리된 염수 용액(40 U/ml)을 사용하여 외경정맥에 삽입하였다.
에반스 블류 염료(Evans Blue, EB)(30 mg/kg)를 모든 동물에게 카테터를 통하여 정맥내로 투여하였다; 10분 후에 EB 염료를 투여하였고, 30% 포르말린 용액을 인두 점막의 표면에 다음과 같이 적용하였다: 혀를 약간 잡아당기고, 인두 구역을 끝이 뭉툭한 포셉으로 입안 깊이 개방시키고, 멸균된 면패드를 사용하여, 부드럽게 형성 용액(50 μl)을, 이것이 적용되는 시점에 각각 5초 동안 적용하였다. 무손상 그룹에서는 생리 염수를 사용하였다.
30% 포르말린 용액의 적용 후 60분 후에, 동물들을 방혈에 의해 안락사시켰다. 각 래트의 머리를 헤파린처리된 염수 용액(40 U/ml)으로 관류시켜서 혈관내 EB 염료를 제거하였다.
염증 정도를 에반스 블루(EB) 염료의 삼출 테스트에 의해 평가하였다. 근육 조직으로부터의 EB 염료를 55℃에서 포름아미드로 24시간 동안 추출하였고, 흡수를 620 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 직물에서의 염료의 양을 에반스 블루 염료에 대한 표준 곡선을 사용하여 계산하였고, 습식 직물 중량의 그램당 염료의 마이크로그램으로 표시하였다(μg/g).
화합물 I을 6 및 18 mg/kg의 용량으로 포름알데하이드의 적용 전 24시간 및 1시간 전에 위내로 투여하였다. 30%의 농도를 가진 포름알데하이드 용액을 대조군 그룹에 투여하였다. 덱사메타손 및 다이클로페낙을 참조 작용제로서 사용하였다. 덱사메타손(0.6 mg/kg) 및 다이클로페낙(8 mg/kg)을 포름알데하이드의 적용 전 24시간 및 1시간 전에 위내로 투여하였다. 연구 결과를 표 10에 제시한다.
표 9로부터 포름알데하이드의 투여(대조군)는 조직에서의 염료의 농도의 유의한 증가를 초래하는 것이 분명하고, 이것은 래트에서 인두 염증 - 인두염을 나타낸다. 테스트 화합물은 포름알데하이드에 의해 유발된 인두염에 대한 유의한 보호를 보여주었다. 화합물 I은 모든 테스트된 용량(6 및 18 mg/kg)에서 효과를 나타냈다 - 조직에서의 염료의 농도는 각각 대조군과 비교하여 2.8 및 6.4배 감소하였다. 덱사메타손(0.6 mg/kg)의 투여 또한 염증에서 감소를 초래하였다: 염료의 농도는 2.1배로 감소하였다. 다이클로페낙은 영향을 나타내지 않았다.
그러므로, 얻어진 결과는 화합물 I이 인두염의 경우에 명백한 항-염증성 효과를 가지는 것을 보여주었다.
래트의 인두 조직에서의 에반스 블루 염료의 농도
그룹 조직에서의 염료의 농도, μg/mg
무손상 0.029±0.004
대조군(포름알데하이드 - 30%) 0.141±0.015*
화합물 I(6 mg/kg) 0.051±0.016*&
화합물 I(18 mg/kg) 0.022±0.003 &
덱사메타손 0,6 mg/kg 0.066±0.009*&
다이클로페낙 8 mg/kg 0.112±0.031*
주:
* - 무손상 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p<0.05);
& - 대조군 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p<0.05).
블레오마이신-유도된 폐 손상의 모델에 대한 화합물 II의 활성의 연구
블레오마이신-유도된 폐 손상의 모델을 표준 방법에 의해 구현하였다[Am J Respir Cell Mol Biol.　2009 V. 41(1). P. 50-58]. 블레오마이신 용액을 수컷 Balb/c 마우스에 한 번 기관내로 투여하였다(50 μl의 부피로 4 유닛/kg). 화합물 II를 C57BL/6 마우스에 2회: 블레오마이신의 투여 전 1시간 전 및 블레오마이신의 투여 후 12시간 후에 위내로 투여하였다. 기관지폐포 세척액을 블레오마이신의 투여 후 24시간 후에 수집하였다. 세척액에서, 백혈구의 총 양을 평가하였고 백혈구 식을 측정하였다.
연구 결과는 화합물 II의 위내 투여가 염증성 세포의 기관지폐포 공간 안으로의 유입을 감소시키는 것을 보여주었다(표 11). 이것은 화합물 II가 폐 손상에 대해 항-염증 효과를 가지는 것으로 결론내릴 근거를 제공한다.
블레오마이신-유도된 급성 폐 손상의 모델에 대한 마우스의 기관지폐포 세척액에서 세포 요소들의 양(M±m, n=10마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 1 μl의 기관지폐포 세척액에서 세포 요소들의 양
백혈구 호중구 호산구 대식세포 림프구
무손상 - 151.32±23.85 8.51±4.12 0.40±0.30 122.15±14.69 0.00±0.00
대조군 - 412.13±65.00* 212.39±37.00* 0.00±0.00 199.74±34.00 0.00±0.00
화합물 II 3 122.34±15.96 & 82.77±16.87 *& 0.00±0.00 39.57±7.91*& 0.00±0.00
30 199.12±46.59 & 55.21±12.53* & 0.00±0.00 143.90±39.26 0.00±0.00
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
리포다당-유도된 급성 폐 손상의 래트 모델에 대한 화합물 IV의 활성의 연구
리포다당-유도된 급성 폐 손상의 모델을 표준 방법을 사용하여 구현하였다[Lin Tong, Jing Bi, Xiaodan Zhu, Guifang Wang, Jie Liu, Linyi Rong, Qin Wang, Nuo Xu, Ming Zhong, Duming Zhu, Yuanlin Song, Chunxue Bai. Keratinocyte growth factor-2 is protective inlipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats // Respiratory Physiology & Neurobiology. 2014. V. 201. P. 7-14]. 염수 용액으로 제조한 리포다당(LPS) 용액을 암컷 Wistar 래트에 기관내로 투여하였다. 거짓 병리 그룹의 동물들에 동일한 부피의 염수 용액으로 주사하였다. LPS의 투여 후 48시간 후에 동물들로부터 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집하였다. BAL 포획을, 주사기 디스펜서를 사용하여 기관을 통해 37℃로 가열된 5 ml의 염수 용액으로 폐를 세척함으로써 마취 하에 수행하였다.
기관지폐포 세척액에서, 1 μl의 세척액에서 세포 요소들의 절대 수를 Goryaev 카메라를 사용하여 계산하였다. 그런 다음, 기관지폐포 세척액을 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 도말 표본을 세포 침강물로부터 제조하였고, 그 도말 표본을 추가로 메탄올에 고정시키고 내부폐 사이토그램을 계수하기 위하여 Romanovsky-Giemsa에 의해 염색하였다.
화합물 IV를 래트에게 두 번, LPS의 투여 전 1시간 전 및 LPS의 투여 후 24시간 후에 위내로 투여하였다.
연구 결과는 화합물 IV의 위내 투여가 염증성 세포의 기관지폐포 공간 안으로의 유입을 감소시키는 것을 보여주었다(표 12). 이것은 화합물 IV가 폐 손상의 경우에 항-염증 효과를 가지는 것으로 결론내릴 근거를 제공한다.
LPS-유도된 급성 폐 손상의 모델에 대한 래트의 기관지폐포 세척액에서 세포 요소들의 양(M±m, n=10마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 1 μl의 기관지폐포 세척액에서 세포 요소들의 양
백혈구 호중구 호산구 대식세포 림프구
무손상 - 2263±311 199±59 0±0 2063±265 0±0
거짓 병리 3434±351 825±115 0±0 2609±302 0±0
대조군 - 12937±1837.5*# 3304±597*# 0±0 9633±1502*# 0±0
화합물 IV 1.8 4485±815* & 785±181& 0±0 3699±653& 0±0
주:
* - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
# - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 거짓 병리 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
발열 반응의 래트 모델에 대한 화합물 II, 화합물 IV, 화합물 VI, 화합물 I의 활성의 연구
발열 반응의 모델을 표준 방법을 사용하여 구현하였다[J Neurosci Methods. 2005. V. 147. P. 29-35]. Wistar 래트를 빵 효모의 20% 현탁액(12 ml/kg)으로 피하 주사하였다. 화합물 I, II, IV, VI, VIII을 효모의 투여 후 14시간 후에 한 번 위내로 투여하였다. 직장 온도를 발열원의 투여 전에 및 열 반응 발생의 최고점 - 투여 후 19시간 후에 전자체온계에 의해 측정하였다. 화합물들의 항발열 효과를 2 내지 7개 실험으로 연구하였다.
연구 결과는 연구된 화합물들의 위내 투여가 래트의 신체의 직장 온도의 증가를 감소시켰음을 보여주었다(표 13 내지 17). 얻어진 데이터는 화합물 I, II, IV, VI, VIII이 항발열 효과를 가지는 것으로 결론내리는 것을 허용한다.
래트에 대한 효모의 피하 투여 후 19시간 후의 신체 직장 온도의 증가, ℃(M±m, n=30 내지 90마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 신체 직장 온도의 증가, oC
무손상 - 70마리 0.05±0.05
대조군 - 90마리 1.70±0.06*
화합물 II 0.18 40마리 1.18±0.08*&
0.6 30마리 0.78±0.07*&
1.8 70마리 1.09±0.06*&
주:
* - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
래트에 대한 효모의 피하 투여 후 19시간 후의 신체 직장 온도의 증가, ℃(M±m, n=30 내지 90마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 신체 직장 온도의 증가, oC
무손상 - 70마리 0.30±0.10
대조군 - 90마리 1.90±0.10*
화합물 VI 0.018 40마리 0.90±0.10*&
0.18 30마리 1.00±0.20*&
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
래트에 대한 효모의 피하 투여 후 19시간 후의 신체 직장 온도의 증가, ℃(M±m, n=40 내지 70마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 신체 직장 온도의 증가, oC
무손상 - 50마리 0.01±0.08
대조군 - 70마리 1.70±0.07*
화합물 I 0.018 40마리 1.01±0.09*&
0.06 40마리 0.88±0.11*&
0.18 50마리 1.01±0.08*&
0.6 40마리 0.88±0.11*&
1.8 50마리 1.14±0.09*&
주:
* - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
래트에 대한 효모의 피하 투여 후 19시간 후의 신체 직장 온도의 증가, ℃(M±m, n=40 내지 70마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 신체 직장 온도의 증가, oC
무손상 - 50마리 0.03±0.07
대조군 - 70마리 1.75±0.07*
화합물 IV 0.018 40마리 1.18±0.08*&
0.06 40마리 1.28±0.07*&
0.18 50마리 1.36±0.05*
0.6 40마리 1.27±0.09*&
주:
* - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
래트에 대한 효모의 피하 투여 후 19시간 후의 신체 직장 온도의 증가, ℃(M±m, n=40 내지 70마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 신체 직장 온도의 증가, oC
무손상 - 10마리 0.32±0.21
대조군 - 10마리 1.83±0.11*
화합물 VIII 1.8 10마리 1.16±0.12*&
주:
* - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 Kruskall-Wallis 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
복막의 화학적 자극 방법에 의한 특이적 통증 반응의 모델에 대한 화합물 I 및 화합물 IV의 활성의 연구("복부 수축" 테스트)
복막의 화학적 자극 방법에 의한 특이적 통증 반응("복부 수축" 테스트)의 모델을 표준 과정에 따라 수행하였다. "복부 수축" 테스트를 수행하기 위하여, Balb/c 마우스를 동물의 체중 kg당 10 ml의 부피의 1% 아세트산으로 복강내 투여하였다. 화합물 I,IV, VII, IX, X를 한 번, 아세트산의 투여 전 1시간 전에 위내로 투여하였다. 수축의 양(후구(hind quarters)의 신장 및 아칭(arching)이 수반되는 복부 근육의 경련성 연축)을 아세트산의 투여 후 15분 후에 평가하였다.
연구 결과는 화합물 I,IV, VII, IX, X의 위내 투여가 마우스에서, 아세트산의 복강내 투여에 의해 유발된 수축의 양을 유의하게 감소시키는 것을 보여주었다(표 18 및 19). 얻어진 결과는 화합물 I,IV, VII, IX, X가 통증 증후군의 경우에 명백한 치료 효과를 가지는 것으로 결론내리는 것을 허용한다.
복막의 화학적 자극 방법에 의한 특이적 통증 반응의 모델에 대한 아세트산 수축의 양(M±m, n=10 내지 31마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 15분 동안 수축의 양
대조군 31마리 34.68±2.40
화합물 I 0.03 10마리 22.70±2.14*
0.3 20마리 13.90±2.23*
3 20마리 18.65±2.44*
30 20마리 21.15±2.97*
화합물 IV 0.03 10마리 23.60±2.54*
0.3 10마리 15.50±2.63*
3 10마리 19.20±3.43*
30 10마리 15.30±3.10*
케토롤 15 20마리 23.60±1.87*
주:
* - p<0.05에서 학생 t- 검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
복막의 화학적 자극 방법에 의한 특이적 통증 반응의 모델에 대한 아세트산 수축의 양("복부 수축" 테스트)(M±m, n=10 내지 31마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 그룹의 동물의 양 15분 동안 수축의 양
대조군 10마리 48±5.71
화합물 VII 0.3 10마리 17.6±2.81*
화합물 IX 0.3 10마리 11.6±3.5*
화합물 X 0.3 10마리 17.2±3.4*
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는대조군 그룹으로부터의 차이.
열 통즉 자극 "고온 플레이트"의 모델에 대한 화합물 1의 활성의 연구
열 통즉 자극 "고온 플레이트"의 모델을 표준 과정에 따라 수행하였다[Barrot M. Tests and Models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012 Jun 1;211:39-50.]. 화합물 I 및 화합물 II를 Balb/c 마우스에 위내로 한 번 투여하였다. 제제의 투여 후 1시간 후에, "고온 플레이트" 테스트를 수행하였다. "고온 플레이트" 테스트를 수행하기 위하여, 마우스를 고온 플레이트에 놓고, 이것의 온도(+55±1℃)를 일정하게 유지하였다.
마우스에서 통증 반응의 제 1 징후(발 핥기, 점핑)의 시간을 등록하고 각 그룹의 통증 민감도의 한계값(TPS, 초)의 평균 잠복 시간을 계산하였다.
연구 결과는 연구 하의 화합물의 위내 투여가 "고온 플레이트" 테스트에서 마우스의 통증 민감도의 한계값을 1.5배 증가시켰음을 보여주었다. 화합물의 1의 약물학적 효과는 적어도 24시간 동안 지속되었다(표 20). 얻어진 데이터는 화합물 I 및 화합물 II가 통증 증후군의 경우에 명백한 진통 효과를 가지는 것으로 결론내리는 것을 허용한다.
열 통증 자극 "고온 플레이트"의 모델에 대한 통증 민감성의 한계값(TPS), 제제의 투여 전 값에 대한 %(M±m, n=20마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 1시간 후, 배경에 대한 %
대조군 72.51±5.80
화합물 I 0.3 101.13±9.64*
3 95.28±6.79*
30 104.55±8.52*
화합물 II 0.3 97.43±6.43*
3 90.54±6.59*
30 110.18±11.9*
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
db/db 마우스에서 자발적 비만의 모델에 대한 화합물 II의 활성의 연구
자발적 비만을 모델화하기 위하여, 렙틴 수용체 -Leprdb-(db) 열성 유전자(제 8 결합군, 제 4 염색체)를 갖고 있는 db/db 마우스를 사용하였다[Cardiovasc. Diabetol. 2012. V.11. P. 139-147; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016. V. 472. P. 603-609].
화합물 II를, 동물 생애의 제 7주로부터 시작하여, 위내로 투여하였다. 생애의 6 내지 12주에, 주마다 동물들을 체중에 대해 측정하였다.
연구 결과는 비만 모델에서 7.5 mg/kg의 용량의 화합물 II의 마우스로의 위내 투여가 db/db 마우스의 체중 증가를 감소시키는 것을 보여주었다(표 21).
얻어진 결과는 비만의 경우에 화합물 II의 치료 효과를 시사한다. 치료 효과는 화합물 II를 사용하는 초기 4주에 시작한다.
대사 증후군의 모델에 대한 화합물 II의 활성의 연구
대사 증후군 모델을 고지방 식이("카페테리아 식이")에 대해 16주 동안 수컷 Wistar 래트를 유지함으로써 구현하였다[Rothwell N.J., Stock M.J., Warwick B.P. Energy balance and brown fat activity in rats fed cafeteria diets or high-fat, semisynthetic diets at several levels of intake // Metabolism. 1985. Vol. 34(5). P. 474-480].
식이의 제 10주부터 제 16주까지, 화합물 II를 실험 그룹의 동물들에게 하루에 한 번 위내로 투여하였다. 테스트 화합물의 활성의 평가를 체중의 매주 측정을 사용하여 수행하였다.
연구 결과는 화합물 II의 위내 투여가 동물의 체중 증가를 감소시키는 것을 보여주었다. 약물학적 효과는 치료법의 제 5주부터 나타나기 시작한다(표 22).
그러므로, 대사 증후군 모델에서 화합물 II는 동물의 비만을 감소시킨다.
db/db 마우스에서 자발적 비만의 모델에 대한 화합물 II의 투여의 시작과 관련된 동물의 체중의 증가(M±m)
그룹 화합물의 용량,
mg/kg		 지표를 택하는 시점에 동물의 나이, 주
6 7 8 9 10 11 12
화합물 II의 투여 주
0 1 2 3 4 5 6
무손상
(db/m)		 100.0±4.4 100.0±0.9 103.30±.9 106.6±0.9 109.81±.5 113.3±1.1 116.5±1.5
대조군
(db/db)		 100.0±2.9 109.6±3.1* 118.3±3.3* 126.2±3.3* 131.0±3.4* 134.2±4.2* 139.2±4.8*
화합물 II 0.75 100.0±1.7 108.5±1.5* 119.6±3.7* 123.9±3.8* 126.5±4.0* 126.5±4.2* 129.8±5.2*
7.5 100.0±2.3 111.4±2.9* 119.9±2.6* 122.1±2.5* 121.7±2.5*& 121.7±3.1*& 109.4±4&
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이
대사 증후군의 모델에서 래트의 체중(M±m, n=12마리)
연구의 주 치료법의 주 무손상 대조군 화합물 II(1.5 mg/kg)
0 - 245.50±5.30 250.17±3.95 239.67±3.27
1 - 259.08±5.80 312.83±8.84*# 292.08±4.70* #
2 - 276.42±6.20# 325.33±7.60*# 307.33±5.53* #
3 - 305.00±7.30# 345.08±9.84*# 327.25±7.81* #
4 - 327.92±6.50# 374.75±11.28*# 355.50±9.05* #
5 - 348.00±5.70# 409.25±12.37*# 379.42±7.41* #
6 - 354.83±5.60# 471.33±12.88*# 443.00±7.70* #
7 - 321.00±5.60# 498.25±13.08*# 469.08±6.38* #
8 - 341.08±5.60# 520.83±13.77*# 491.83±6.04* #
9 - 359.17±6.00# 546.50±14.78*# 518.25±6.04* #
10 1 374.17±6.60# 559.08±16.87*# 528.08±6.01* #
11 2 394.75±6.80# 571.92±18.62*# 547.92±8.27* #
12 3 393.33±7.90# 579.50±18.66*# 551.00±8.36* #
13 4 394.17±8.50# 592.58±18.47*# 553.58±8.52* #
14 5 396.83±10.20# 613.17±18.86*# 563.67±9.75*&#
15 6 398.42±9.50# 631.50±18.94*# 570.75±9.13*&#
16 7 397.42±8.30# 627.17±18.72*# 572.08±8.23*&#
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이;
# - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 연구의 0주에서의 값으로부터의 차이.
건선의 마우스 모델에 대한 화합물 I 및 화합물 II의 활성의 연구
마우스에서 건선의 유도를 표준 방법에 따라 수행하였다[European Journal of Pharmacology. 2015. V. 756. P. 43-51]. 알다라 크림(5% 이미퀴모드(imiquimod))을 암컷 Balb/c 마우스에 우측 귀의 내측에, 30 mg/마우스의 양으로 7일 동안(제 0일 내지 6일) 하루에 한 번 적용하였다. 바셀린을 무손상 동물에 적용하였다. 화합물 I, 화합물 II 및 참조 약물(사이클로스포린)을 동물에게, 일일 하루에 한 번, 6일 동안(제 0일 내지 5일) 위내로 투여하였다. 안락사를 알다라 크림의 마지막 적용 후 24시간 후에(제 6일) 수행하였다. 제 0, 2, 3, 4, 5일에, 일일 아침, 다음 알다라 크림의 적용 전에 및 안락사 전에, 우측 귀의 두께를 측정하였다.
건선의 중증도의 평가를 시간 경과에 따라 영향을 받은 귀의 두께의 증가를 측정함으로써 수행하였다.
연구 결과를 표 23에 제시한다.
건선의 마우스 모델에서 제 0일에 대한 연구의 특정한 날에서의 영향을 받은 귀의 두께의 증가, %(M±m, n=10마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 제 0일에 대한 연구의 특정한 날에서의 영향을 받은 귀의 두께의 증가, %
제 3일 제 4일 제 5일 제 6일
무손상 - 4.86±0.9 7.8±0.98 9.81±1.83 14.8±1.3
대조군 - 40.3±5.3* 67.7±7.9* 82.6±9.5* 101±9.8*
화합물 I 0.3 38.3±5.8* 45.2±4.1*& 57.3±3.9*& 62.8±5.4*&
화합물 II 0.3 35.3±2.1* 48.1±2.8*& 59.6±4.5*& 70.6±4.4*&
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
연구 결과는 건선의 마우스 모델에 대한 화합물 I 및 화합물 II의 위내 투여가 동물들의 영향을 받은 귀의 두께의 증가를 감소시키는 것을 보여주었다. 이것은 건선의 경우에 화합물 I 및 화합물 II의 치료 효과를 증명한다.
그러므로, 건선의 마우스 모델에서, 화합물 I 및 화합물 II는 명백한 치료 효과를 가진다.
아토피 피부염의 마우스 모델에 대한 화합물 I 및 화합물 II의 활성의 연구
아토피 피부염의 모델을 표준 방법에 의하여 구현하였다[J Ginseng Res. 2011. Vol.4. - P. 479-86]. 아토피 피부염을 수컷 balb/c 마우스에 대해 모델화하였다. 1-클로로-2,4-다이니트로벤젠(DNHB)을 접촉 피부염의 유발물질로서 사용하였다. 실험의 제 0일 및 12일에, 100 μl의 2% DNHB 용액을 동물의 사전 면도한 등 구역에 적용하여 신체를 감작시켰다. 제 17일에, 20 μl의 DNHB의 2% 알코올성 용액을 우측 "실험" 귀에 1시간의 간격을 두고 2회 적용하였다. 에탄올을 DNHB 용액 대신 무손상 동물에게 적용하였다. 거짓 면역화 그룹의 동물들을 에탄올로 감작시켰다. 화합물 I 및 화합물 II를 하루에 한 번 제 8일부터 17일까지 위내로 투여하였다. 제 18일에, 동물들을 도살하였다. 안락사 후 부종의 정도를 평가하기 위하여, "실험" 및 "대조군" 귀의 무게를 측정하였다. 반응 지표(RI)는 계산된 "실험" 및 "대조군" 귀의 무게 사이의 차이의 백분율로서 나타냈다.
연구 결과를 표 24에 제시한다.
마우스에서 "실험" 및 "대조군" 귀의 무게 사이의 차이 및 아토피 피부염의 마우스 모델에 대한 반응 지표(M±m, n=12마리)
그룹의 명칭 "실험" 및 "대조군" 귀의 무게 사이의 차이(mg) 반응 지표(%)
무손상 -0.001±0.002 -0.82±5.3
거짓 면역화 0.018±0.003* 57.8±11.3*
병리의 대조군 0.029±0.002*# 83.3±6.1*
화합물 I(3 mg/kg) 0.007±0.003 #& 25.4±10.2*#&
화합물 II(3 mg/kg) 0.013±0.002* & 38.1±7.7* &
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
# - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 거짓 면역화 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
연구 결과는 아토피 피부염의 마우스 모델에 대한 화합물 I 및 화합물 II의 위내 투여가 병리 과정의 반응 지표를 감소시키는 것을 보여주었다. 이것은 아토피 피부염에 대한 화합물 I 및 화합물 II의 치료 효과를 증명한다.
그러므로, 아토피 피부염 모델의 마우스 모델에서, 화합물 I 및 화합물 II는 명백한 치료 효과를 가진다.
카라기난 공기 파우치에서 생체내에서 대식세포 주화성에 미치는 화합물 II의 영향의 연구
연구의 전임상 단계에서 면역 체계 세포들의 활성에 미치는 약물의 유효성을 평가하기 위하여, 일반적으로, 급성 염증 과정의 다양한 모델을 사용하였다. 현재, 가장 빈번하게 사용된 모델은 병리 과정이 한정된 공동(cavity)에서 발생하는 것들이다. 이런 모델들은 면역 체계 세포들의 이상 활성이 특이적 공동에 국한되는 질환(복막염, 담관염, 관절염)을 아주 밀접하게 시뮬레이션하는 것을 가능하게 한다(J Pharmacol Toxicol Methods. 1994 Nov;32(3):139-47). 카라기난 공기 파우치 모델은 종종, 분리된 공동에 국한된 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 병리 과정들을 연구하기 위한 조사의 전임상 단계에서 사용된다. 이런 모델에서, 분리된 파우치는 마우스 또는 래트의 등의 낭내 영역(intracapsular region)으로 공기의 피하 주입에 의해 형성된다. 등 구역으로의 공기의 피하 주입은 여러 날 동안 파우치의 세포 라이닝의 형태적 변화를 초래한다. 파우치는 주로 대식세포 및 섬유세포로 구성되며 혈관이 잘 발달되어 있다. 공기 파우치의 형성 순간으로부터 제 6일째에, λ-카라기난 용액을 공기 파우치의 공동에 투여한다. 카라기난은 파우치의 낭내 영역을 라이닝하고 있는 대식세포의 표면에서 TLR4 수용체와 상호작용하여, 이것들의 활성화 및 케모카인 및 기타 매개자들(IL-1; IL-6; TNFα, IL-8, 프로스타글란딘 및 류코트라이엔, NO)의 후속되는 합성 및 또한 파우치 내부에서 면역 체계 세포들의 이동을 유발한다.
화합물 II의 활성의 연구를 수컷 Balb/c 마우스에 대해 표준 방법에 따라 수행하였다(Curr Protoc Pharmacol. 2012 Mar;Chapter 5:Unit5.6). 화합물 II를 실험 그룹에 3 mg/kg의 용량으로 카라기난의 투여 직전에 및 그런 다음에는 10 내지 12시간마다 위내로 투여하였다. 마지막 투여는 도살 전 12시간 전이었다.
CO2의 흡입에 의한 안락사를 λ-카라기난의 주사 후 48시간 후에 동물의 개별 그룹과 관련하여 수행하였다. 안락사 직후에, 상온의 5.4 mM의 EDTA를 함유한 1 ml의 염수 용액을 멸균된 주사기 25G를 사용하여 파우치 안으로 도입하였다. 공기 파우치 영역을 부드럽게 주물러준 후, 파우치를 가로질러 시상 절개를 하고 삼출물을 디스펜서에 의해 15 ml의 부피를 가지는 멸균된 바이알에 수집하였다. 삼출물에서, 1 μl의 세척액(사이토시스) 당 세포 요소들의 절대 수를 Goryaev 챔버를 사용하여 측정하였다. 그런 다음 삼출물을 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 도말 표본을 세포 펠릿으로부터 제조하고, 그 도말 표본을 이어서 메탄올에 고정시키고(5분) Romanovsky-Giemsa에 따라 염색하였다(20 내지 22oC에서 40분). 기본적으로 현미경 Olympus bx51(배율 100)을 사용하는 도말 표본에서 대식세포의 수를 계수하였다. 세포 계산을 최대 100 pcs까지 시행하였다.
수행된 연구는 화합물 II의 사용이 백혈구와 대식세포의 유입을 10배 감소시켰음(무손상 대조군의 수준에 대해)을 보여주었다(표 25). 그러므로, 화합물 II는 광범위한 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 복막염, 및 관절염을 치료하는 잠재력을 가질 수 있다.
대식세포 주화성의 모델(카라기난 공기 파우치)에 대한 화합물 II의 활성의 연구 하에 카라기난 파우치로부터의 삼출물에서 면역 체계의 세포 수, ×109/l(M±m, n=10마리)
그룹 1 μl의 삼출물에서 세포 요소들의 수, ×109/l
백혈구 대식세포
무손상 0.9±0.2 0.6±0.1
대조군 9.9±1.5* 7.7±1.5*
화합물 II(3 mg/kg) 1.0±0.1 & 0.5±0.1 &
* ― 무손상 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05);
& ― 대조군 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05).
티오글리콜레이트 복막염의 모델에 대한 생체내에서 대식세포 주화성에 미치는 화합물 II의 영향의 연구
연구를 수컷 balb/c 마우스에 대해 표준 방법을 사용하여 수행하였다(J Leukoc Biol. 2009 Aug;86(2):361-70). 대조군 그룹의 마우스를 1개월 동안 저장한 2 ml의 3% 티오글리콜산 배지로 복강내 투여하였다. 무손상 동물들을 2 ml의 염수 용액으로 복강내로 주입하였다. 화합물 II를 실험 그룹의 동물에게 티오글리콜레이트의 투여 전 1시간 전에, 티오글리콜레이트의 투여 후 24 및 48시간 후에 1 mg/kg의 용량으로 위내로 투여하였다. 72시간 후에, 동물들을 CO2 챔버에서 안락사시키고, 복막 구역을 70% 알코올로 보습하고, 피부를 복강에서 조심스럽게 절단하고, 0.1% EDTA를 함유한 5 ml의 저온 인산염-염수 완충액을 주사기를 사용하여 복강내로 주사하였다. 복강을 부드럽게 주물러준 후, 삼출물을 주사기를 사용하여 테스트 튜브에 수집하고, 수집된 삼출물의 부피를 측정하였다.
삼출물에서, 1 μl의 세척액(사이토시스)당 세포 요소들의 절대 수를 Goryaev 챔버를 사용하여 측정하였다. 그런 후 삼출물을 200 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 도말 표본을 세포 펠릿으로부터 제조하고, 그 도말 표본을 이어서 메탄올에 고정시키고(5분) Romanovsky-Giemsa에 따라 염색하였다(20 내지 22oC에서 40분). 기본적으로 현미경 Olympus bx51(배율 100)을 사용하여 도말 표본에서 단핵세포/대식세포의 양을 계수하였다. 세포 계산을 최대 100 pcs까지 시행하였다.
수행된 연구는 화합물 II의 사용이 3% 티오글리콜산 배지에 의해 유도된 대식세포의 래트의 복강으로의 유입을 감소시켰고, 티오글리콜산 배지의 투여에 의해 유도된 병리의 중증도를 감소시킨 것을 보여주었다(표 26). 그러므로, 화합물 II는 복막염, 크론병, 및 궤양성 대장염을 치료하는 잠재력을 가질 수 있다.
대식세포 주화성의 모델(티오글리콜레이트 복막염)에 대한 화합물 II의 활성의 연구에서 복강으로부터의 삼출물에서 면역 체계의 세포 수, ×109/l(M±m, n=10마리)
그룹 1 μl의 삼출물에서 세포 요소들의 수, ×109/l
백혈구 단핵세포
무손상 0.71±0.09 0.61±0.07
대조군 3.99±0.42* 3.66±0.44*
화합물 II(1 mg/kg) 1.97±0.36*& 0.65±0.12&
* ― 무손상 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05);
& ― 대조군 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05).
프로인트 완전 보조제의 투여에 의해 유도된 보조 관절염의 모델에 대한 화합물 II 및 화합물 I의 활성의 연구조사
보조 관절염의 모델을 이계교배된 수컷 래트에 대해 표준 방법을 따라 구현하였다[Chem Pharm Bull(Tokyo).　2018. V.66(4). P.410-415]. 제 0일 및 5일에, 프로인트 완전 보조제(Freund's Adjuvant,　Complete(Pierce))를 우측 뒷다리에 동물당 100 μl의 부피로 동물에게 발바닥 아래로 투여하였다. 우측 뒷발(병에 걸림) 및 좌측 뒷발(반대쪽)의 부피를 제 0, 14, 16, 18, 21, 25, 28, 및 30일에 체적변화유량계(Ugo Basel)를 사용하여 측정하였다. 본 발명자들은 일차(염증성) 반응을 영향을 받은 발의 부피를 변화시킴으로써 추정하였고, 이차(면역) 반응을 반대쪽 발의 부피를 변화시킴으로써 추정하였다. 화합물 II를 일일, 하루에 한 번, 연구의 제 14일로부터 30일까지 위내로 투여하였다.
연구 결과를 표 27 및 28에 제시한다.
수행된 연구는 투여된 화합물 II의 사용이 영향을 받은 발 및 반대쪽 발 둘 다의 부피의 증가를 감소시킨 것을 보여주었다. 이것은 화합물 II가 항-염증성 효과 및 면역굴성 효과를 둘 다를 가지는 것으로 결론내리는 것을 허용한다. 그러므로, 화합물 II는 류머티스성 관절염 및 다른 종류의 관절염, 및 관절증을 치료하는 높은 치료적 잠재력을 가진다.
프로인트 완전 보조제의 투여에 의해 유도된 보조 관절염의 모델에 대한 영향을 받은 발의 부피의 증가, %(M±m, n=10마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 영향을 받은 발의 부피의 증가, 초기 수준에 대한 %
제 14일 제 16일 제 18일 제 21일 제 25일 제 28일 제 30일
무손상 1.8±0.8 1.9±0.7 1.4±0.3 1.9±0.4 2.2±0.2 2.7±0.2 3±0.2
대조군 122.3±6.4* 118.7±5.6* 114.3±2.1* 98.9±3.2* 100.6±2.6* 102.5±1.8* 101.4±2.8*
화합물 II 0.5 118.8±3.6* 105±3.2* 104.4±2.7*& 86.3±3.9*& 88.5±2.4*& 86.9±2.3*& 83.2±2.2*&
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
프로인트 완전 보조제의 투여에 의해 유도된 보조 관절염의 모델에 대한 반대쪽 발의 부피의 증가, %(M±m, n=10마리)
그룹 화합물의 용량, mg/kg 반대쪽 발의 부피의 증가, 초기 수준에 대한 %
제 14일 제 16일 제 18일 제 21일 제 25일 제 28일 제 30일
무손상 1.27±0.3 1.59±0.48 1.77±0.25 1.62±0.31 2.18±0.3 2.76±0.16 2.98±0.3
대조군 5.48±0.58* 7.08±1.24* 21.69±1.28* 25.29±1.69* 20.16±1.66* 18.75±1.13* 17.51±1.59*
화합물 II 0.5 5.39±1.67* 6.75±1.58* 18.48±1* 19.77±1.67*& 15.45±1.21*& 14.04±1.75*& 13.02±0.94*&
주:
* - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 무손상 그룹으로부터의 차이;
& - p<0.05에서 학생 t-검정에 따르는 대조군 그룹으로부터의 차이.
카라기난 부종의 모델에 대한 화합물 II의 활성의 연구
화합물 II의 면역 체계의 기능성 상태에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 카라기난-유도된 래트 발 부종의 모델을 사용하였다. 실험들을 250 내지 270 g의 체중의 수컷 백색 비선형 래트에 대해 수행하였다. 래트에서 급성 발 염증은 0.1 ml의 부피의 1.5% 카라기난 용액의 우측 발로의 발바닥내 투여(피하)에 의해 유발되었다. 연구된 화합물을 카라기난의 투여 전 1시간 전에 위내로 투여하였다. 화합물 II 및 대조군 물질(다이클로페낙)의 영향을 무손상 좌측 발과 비교하여 발 부종의 감소 정도에 의해 평가하였다. 발 부피를 화합물 II의 투여 전 및 카라기난의 평가 후 2시간 후에 평가하였다.
연구 결과를 표 29에 제시한다.
카라기난-유도된 부종의 모델에서 래트 발 부종의 성장을(대조군과 비교하여) 억제하는 화합물 II의 효과
그룹 병리의 유도 제제의 투여 평가의
소요 시간		 부종 성장의
억제, %
무손상 　 　 카라기난의 투여 후 2시간 후 0
대조군 0.1 ml의 부피 중의 1.5% 카라기난 용액의 우측 발로의 발바닥내 투여 카라기난의 투여 전 1시간 전 위내로, 한 번 0
화합물 II
(1.8 mg/kg)		 34
화합물 II
(0.18 mg/kg)		 34
다이클로페낙 나트륨(8 mg/kg) 42
제시된 결과로부터 화합물 II가 발 부종의 성장에 직접적인 억제 효과를 가지며 면역 체계 세포들의 활성과 관련된 광범위한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것이 분명하다.
당뇨병성 신증의 래트 모델에서 화합물 II의 활성의 연구
당뇨병성 신증의 래트 모델을 동물들에게 고지방 식이의 섭취를 연장시켜 유지하고 30 mg/kg의 용량의 스트렙토조토신의 단일 또는 이중 복강내 투여에 의해 유도하였다(Int J Clin Exp Med. 2015 Apr 15;8(4):6388-96).
동물들을 고지방 식이를 16일 동안 유지시켰다; 제 9주에, 스트렙토조토신을 복강내로 30 mg/kg의 용량으로 2회(연속적으로 2일) 투여하였다. 스트렙토조토신의 투여 후 7일 후에, 화합물 II의 투여를 시작하였다. 물질을 일일 하루에 한 번 50 mg/kg의 용량으로 위내로 투여하였다.
연구의 제 10일부터 시작한 화합물 II의 위내 투여는 실험 동물의 소변에서 일일 단백질 함량을 무손상 대조군의 수준으로 감소시켰다(표 30). 결과는 화합물 II가 당뇨병성 신증의 경우에 치료 효과를 가지는 것으로 결론내리는 것을 허용한다.
고지방 식이 및 스트렙토조토신의 투여(고지방 식이의 15주)에 의해 유도된 당뇨병성 신증의 모델에서 래트에 대한 화합물 II의 위내 투여의 6주 후 소변의 생화학적 분석
그룹 스트렙토조토신의 투여 용량 및 양생법 동물의 양 다이어레시스(Dieresis), ml/18 시간 일일 단백질, μg/18시간 ACR(단백질(μg/l)/
크레아티닌(mg/l)
무손상 - 8마리 4.35±0.5 1041.2±153.5 273.2±68.0
대조군 30 mg/kg, 이중 14마리 8.32±1.5 3718.2±572.7* 952.8±186.4*
화합물 II
(5 mg/kg)		 30 mg/kg, 이중 12마리 7.45±1.0 1846.3±337.6*& 202.3±26.8 &
* ― 무손상 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05);
& ― 대조군 그룹에 비교하여 통계적으로 유의한 차이(p <0.05).
비록 발명이 개시된 구체예들을 참조로 기술되었지만, 당업자들에게는 상세하게 기술된 특정 실험들이 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다는 것이 명백하다. 본 발명의 본질로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형들을 구현하는 것이 가능하다는 것이 분명하다.

Claims (15)

  1. 하기 일반식 (A)의 화합물의 용도:
    Figure pct00032

    식에서,
    R1은 -C(O)-R2-C(O)- 또는 -R2-C(O)- 기이고, 여기서 R2는 하나 또는 2개의 C1-C6 알킬로 선택적으로 치환된 -(CH2)n- 기, 또는 페닐이며,
    n은 0 내지 4의 정수이고;
    화합물은 다음 식의 화합물들로 구성되는 군으로부터 선택된다:
    I
    Figure pct00033
    , II
    Figure pct00034
    ,
    III
    Figure pct00035
    , IV
    Figure pct00036
    ,
    V
    Figure pct00037
    , VI
    Figure pct00038
    ,
    VII
    Figure pct00039
    , VIII
    Figure pct00040
    ,
    IX
    Figure pct00041
    , X
    Figure pct00042
    .
    또는 이것의 제약학적으로 허용되는 염, 수화물, 또는 용매화물의 글루타미닐 고리화효소 억제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    글루타미닐 고리화효소 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 화합물의 용도.
  3. 제 1 항에 있어서,
    면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 화합물의 용도.
  4. 제 3 항에 있어서,
    면역 체계 세포들의 이상 주화성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 화합물의 용도.
  5. 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 제약학적 조성물로서, 제 1 항에서 기술된 화합물의 치료적 유효량 및 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 제약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 폐, 기도 및 복부 질환, 방사선 병, 및/또는 통증 증후군으로부터 선택되는 질환인 제약학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 기관지 천식, 급성 또는 만성 기관지염, 인두염, 폐 기종, 비염, 비부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 또는 급성 폐 손상인 것인 제약학적 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 발열인 것인 제약학적 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 아토피 피부염인 것인 제약학적 조성물.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 자가면역 질환, 특히 건선, 크론병 및 궤양성 대장염인 것인 제약학적 조성물.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 대사성 질병, 특히 비만, 대사성 증후군 및 비알코올성 지방간 질환, 신증(특히, 당뇨병성 신증)인 것인 제약학적 조성물.
  12. 제 5 항에 있어서,
    상기 글루타미닐 고리화효소의 활성 및/또는 면역 체계 세포들의 이상 활성과 관련된 질병은 복막염인 것인 제약학적 조성물.
  13. 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 활성제를 더 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 다른 활성제는 항균제, 세포증식 억제제 및 세포독성제, 활성제의 증상 또는 부작용을 억제하는 작용제, 및 이것들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  15. 글루타미닐 고리화효소 활성에 의해 매개된 질환의 치료 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 식 (A)의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00043

    식에서,
    R1은 -C(O)-R2-C(O)- 또는 -R2-C(O)- 기이고, 여기서 R2는 하나 또는 2개의 C1-C6 알킬로 선택적으로 치환된 -(CH2)n- 기, 또는 페닐이며,
    n은 0 내지 4의 정수이고;
    화합물은 다음의 화합물들로 구성되는 군으로부터 선택된다:
    I
    Figure pct00044
    , II
    Figure pct00045
    ,
    III
    Figure pct00046
    , IV
    Figure pct00047
    ,
    V
    Figure pct00048
    , VI
    Figure pct00049
    ,
    VII
    Figure pct00050
    , VIII
    Figure pct00051
    ,
    IX
    Figure pct00052
    , X
    Figure pct00053
    .
    또는 이것의 제약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물.
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