UA124636C2 - Інгібітори глутамінілциклаз і їх застосування для лікування різних захворювань - Google Patents

Abstract

Винахід стосується хімії органічних сполук, фармакології і медицини і стосується терапії захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема для терапії захворювань легенів, дихальних шляхів і черевної порожнини, променевої хвороби і больового синдрому, а також інших захворювань за допомогою застосування сполук формули (А): , (A) у якій R1 являє собою групу -С(O)-R2-C(O)- або -R2-C(O)-, де R2 являє собою групу -(СН2)n-, необов'язково заміщену одним або двома С1-С6-алкілами, або феніл, n являє собою ціле число від 0 до 4; причому сполуки вибрані з групи, що складається з групи сполук, як представлено в описі. Дані сполуки, а також їх фармацевтично прийнятні солі, мають високу ефективність в інгібуванні глутамінілциклази, залученої, зокрема, у процеси посттрансляційної модифікації хемокінів і хемотаксису моноцитів, макрофагів і інших клітин імунної системи. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять терапевтично ефективну кількість сполук формули (А), визначеної вище.

Description

НМ ше МН і; | і х я | і

І х при я -е Ка ж, А с

В че М" "М" Ме. М у якій

Ві являє собою групу -С(0)-Н2-С(О0)- або -Н2-С(0)-, де НВ? являє собою групу -(СН5з)к-, необов'язково заміщену одним або двома С.1-Св-алкілами, або феніл, п являє собою ціле число від 0 до 4; причому сполуки вибрані з групи, що складається з групи сполук, як представлено в описі. Дані сполуки, а також їх фармацевтично прийнятні солі, мають високу ефективність в інгібуванні глутамінілциклази, залученої, зокрема, у процеси посттрансляційної модифікації хемокінів і хемотаксису моноцитів, макрофагів і інших клітин імунної системи. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять терапевтично ефективну кількість сполук формули (А), визначеної вище.

ДІ МН у, МОМ М

Н Н

Галузь техніки

Даний винахід стосується хімії органічних сполук, фармакології і медицини і стосується терапії захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема для терапії захворювань легенів, дихальних шляхів і черевної порожнини. Також даний винахід стосується терапії променевої хвороби і больового синдрому, а також інших захворювань за допомогою застосування сполук, що мають ефективність в інгібуванні ферменту глутамінілциклази, залученої, зокрема, у процеси посттрансляційної модифікації хемокінів і хемотаксису клітин імунної системи.

Рівень техніки

Хемотаксис або спрямований рух клітин імунної системи по градієнту концентрації деяких ендогенних і екзогенних речовин (хемоатрактантів) є однією з найважливіших складових частин функціонування клітин імунної системи. Надлишковий приплив клітин імунної системи як правило викликає надлишкову активність клітин імунної системи і ушкодження оточуючих органів і тканин. Розуміння учасників і процесів, пов'язаних з процесом хемотаксису, на молекулярному рівні може привести до нових ефективних підходів у лікуванні і профілактиці цілого ряду захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи.

Хемокіни сімейства ССІ (ССІ12, ССІ7, ССІ18, ССІ 13), що є лігандами рецептора ССК2, є найбільш потужними факторами хемотаксису моноцитів і макрофагів в організмі ссавців (Віоспет. у., 2012 Маг 1; 442(2):403-12). Хемокіни сімейства ССІ складають важливий клас цитокінів, необхідних для активації нейтрофілів і моноцитів і залучення цих клітин у осередок запалення. Однак високі концентрації хемокінів як правило викликають надлишковий приплив клітин імунної системи. Аберантна активність клітин імунної системи може привести до серйозних ушкоджень оточуючих органів і тканин. Наприклад, у ряді випадків продукти окиснення ліпідів можуть активувати клітини ендотелію судин (інтиму), що приводить до виділення ССІ2, залучення макрофагів, які, у свою чергу, виділяють маркери запалення, що провокують ушкодження артеріальної стінки і розвиток атеросклерозу (Мої. СеїЇ, 1998 Ацод; 2(2):275-81; Маїшге., 1998 Ацд 27; 394(6696):894-7). Аналогічну патогенетичну картину можна спостерігати у випадку радіаційно-індукованого ушкодження тканин дихальних шляхів: ушкодження і активація клітин епітелію легенів і дихальних шляхів приводить до виділення

Зо ССІ2, що у свою чергу викликає екстравазацію імунних клітин і циркулюючих пухлинних клітин у легені і дихальні шляхи (Апійохід. Кедох зЗідпаї!., 2018 Арг 2. дої: 10.1089/аг5.2017.7458).

Відома роль хемокінів сімейства СС. у патофізіології цілого ряду аутоімунних і алергічних станів, опосередкованих аберантною активністю моноцитів ССО, СОр14- і СОр161І0 (ревматоїдний артрит, розсіяний склероз). Крім того, хемокіни сімейства СС (зокрема, ССІ2) залучені в патогенез ожиріння, метаболічного синдрому, хронічного болю, фіброзу, неалкогольної жирової хвороби печінки і деяких форм раку.

Пригнічення аберантної активності клітин імунної системи, за рахунок інгібування СС - опосередкованого хемотаксису, може бути дуже необхідне для терапії цілого ряду захворювань, таких як гостре ушкодження легенів (ГУЛ), бронхіальна астма, бронхіт, хронічна обструктивна хвороба легенів, хвороба Крона, діабетична нефропатія і т. д.

Наприклад, у випадку діабетичної нефропатії вплив глюкози у високих концентраціях приводить до збільшення секреції ССІ2 тубулярними клітинами нирок, що у свою чергу викликає міграцію моноцитів (Кідпеу пі, 2006 дап; 69(1):73-80). Збільшення концентрації моноцитів у тканинах нирок і їх дозрівання в макрофаги викликає розвиток аберантної відповіді, асоційованої з виділенням більшої кількості хемокінів і активних форм кисню, що ушкоджують оточуючі клітини нирок (Медіасге ІпПатт., 2012; 2012:146154). Ушкодження тканини нирок приводить до розвитку і збереження аберантної активності клітин імунної системи і подальшого руйнування тканин нирок, а блокада взаємодії ССІ 2/ССК2 низькомолекулярними антагоністами знижує виразність патології (Мерпгої. ОіаІЇ. Тгапе5ріапі, 2013 ші; 28(7):1700-10). Аналогічні процеси характерні для патогенезу неалкогольної жирової хвороби печінки: накопичення жирних кислот у клітинах печінки приводить до активації сигнального шляху МЕ-кВ і розвитку запальної реакції, індукуючої вивільнення прозапальних цитокінів, таких як //-6 і СС12.

Вивільнення прозапальних цитокінів приводить до міграції моноцитів у осередок запалення і розвитку аберантної відповіді, асоційованої з виділенням більшої кількості хемокінів і активних форм кисню, що ушкоджують оточуючі клітини (Іпі. У. Ехр. Раїйпої. 2013 дип; 94(3):217-225).

Члени сімейства ССІ (ССІ12, ССІ 7, ССІ 8, ССІ 13), фракталкін, а також ряду інших гормонів і секретованих білків містять залишок піроглутамінової кислоти (рЕ), роль якого полягає в захисті від деградації амінопептидазами (Спет. Іттипої., 1999; 72:42-56; Віоспетівігу., 1999 Осі 5; 38(40):13013-25). Піроглутамінування М-кінцевого залишку каталізується ферментом (510) глутамінілциклазою (ОРСТ або ОС) (9. Віої. Спет., 2003 Оес 12; 278(50):49773-9; 9). Мої. Віої.,

2008 дип 20; 379(5):966-80). Глутамінілциклаза має широку субстратну специфічність і бере участь у посттрансляційній модифікації цілого ряду пептидних молекул. У дослідженнях субстратної специфічності глутамінілдиклази було показано, що фермент може каталізувати піроглутамінування різних субстратів, незалежно від довжини поліпептидного ланцюга (РЕВ5

І ен., 2004 Арг 9; 563(1-3):191-6, 9. Віої. Снет., 2011 Арг 8; 286(14):12439-49).

У ході експериментальних досліджень було показано, що інгібування глутамінілциклаз приводить до різкого зниження хемоатракторної активності непіроглутамінованих форм хемокінів СС1І2, ССІ17, СС18 ї ССІ 13 (Віоспет. у. (2012), 442, 403-412) і фракталкіну (Віовсі

Вер., 2017 А!д23; 37(4)) Таким чином інгібітори глутамінілдиклази очевидно можуть застосовуватися для терапії широкого ряду захворювань, зокрема захворювань легенів і дихальних шляхів, таких як бронхіальна астма, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, емфізема легені, риніт, риносинусит і хронічна обструктивна хвороба легенів. Патогенез зазначених захворювань пов'язаний з надлишковим виробництвом цитокінів і, зокрема, моноцитарних хемоатрактантних білків ССІ2 і ССІ7 (Ат. У. Кезріг. СеїЇ Мої. ВіоіІ., 2014 дап; 50(1):144-57) і фракталкіну (Ехрег Оріп. Тег. Тагдеї5., 2010 Бер; 14(2):207-19), що є субстратами глутамінілциклази (Віозсі Кер., 2017 Ацад 23; 37(4). рі: В5К20170712; ЕМВО Мої. Мед., 2011 бер; 3(9):545-58). Було показано, що нейтралізація ССІ12 і ССІ 7 з використанням антитіл значно зменшує приплив лейкоцитів, моноцитів і нейтрофілів у дихальні шляхи експериментальних тварин (Ат. 9. Кезріг. Сеї! Мої. Віо!., 2014 дап; 50(1):144-57).

Вплив бактеріальних ліпополісахаридів, ліпотейхоєвої кислоти або інших подразників на слизову оболонку органів дихальної системи приводить до збільшення секреції ССІ 2 клітинами гладкої мускулатури бронхів (Ат. .). Рпузіої. І пд. Сеї! Мої. Рпузіої!., 2012 Арг 15; 302(8) 1785-92) і росту концентрації ССІ2 у бронхоальвеолярному лаважі (Мої. Іттипої., 2011 ди! 48(12- 13):1468-76). Збільшення концентрації ССІ2 у свою чергу викликає міграцію еозинофілів, моноцитів і базофілів і розвиток аберантної відповіді, асоційованої з виділенням більшої кількості хемокінів (ТМЕа, 1-1, 1/-6, 1-4) ї активних форм кисню, що ушкоджують оточуючі клітини бронхів і органів дихання (Іттипобіоіоду, 2016 Рер; 221(2):182-7; Іпі. У. Віої. 5сі., 2012; 8(9):1281-90; Мої. ІттипоїЇ., 2013 Мом; 56(1-2):57-63). Ушкодження бронхів приводить до розвитку і збереження аберантної активності клітин імунної системи і подальшого руйнування тканин органів дихання. В іп мімо моделях алергічної астми блокада взаємодії ССІ 2/ССН2 низькомолекулярними антагоністами показала значну ефективність (Іпі. Агсп. АПегду Іттипої., 2015; 166(1):52-62).

Важливо відзначити, що ССІ2-опосередкований розвиток нейтрофільного запалення і розвиток аберантної відповіді, асоційованої з виділенням пірогенних цитокінів (ТМЕРа, І -1, ПІ -6), приводить до підвищення температури і розвитку пропасниці (у. Іптесі. Оі5., 1999 Маг; 179 Зи,ррі. 2:5294-304; ЕРгопі Віозсі. 2004 Мау 1; 9:1433-49).

Крім пропасниці і підвищеної температури, больовий синдром також є дуже розповсюдженим симптомом різних захворювань. Очевидно, що зниження виразності аберантної відповіді, асоційованої з виділенням більшої кількості активних форм кисню, що ушкоджують оточуючі тканини, саме по собі повинно приводити до зниження виразності больового синдрому. Однак у нещодавніх роботах була показана ключова роль фракталкіну в патогенезі хронічного болю (9. Меигоспет., 2017 Мау; 141(4):520-531).

Інгібітори глутамінілциклази можуть застосовуватися для терапії різних аутоімунних захворювань, зокрема ревматоїдного артриту і псоріазу. Фракталкін є одним з ключових прозапальних медіаторів, що бере участь у розвитку аутоімунних захворювань. Взаємодія між фракталкіном і його унікальним рецептором (СХЗСКІ) індукує клітинну адгезію, хемотаксис і виживаність клітин (Мої. Іпіегм., 2010 Ос 10(5):263-70). Рівень фракталкіну, підвищений у пацієнтів з ревматоїдним артритом (РА) (Моа. Кпештаїйо!., 2017 Мау; 27(3):392-397) і псоріазом (Апп. Сіїп Гар. 5сі., 2015 Раї!; 45(5):556-61), корелює з активністю захворювання. Фракталкін експресується на фібробластоподібних синовіоцитах і ендотеліальних клітинах у синовіальній тканині пацієнтів з ревматоїдним артритом. При псоріазі, високі рівні продукції фракталкіну спостерігаються в дермальних сосочках і в антигенпредставляючих клітинах (Вг. У. Оептайі., 2001 дип; 144(6)1105-13). Експресія фракталкіну підсилюється фактором некрозу пухлини-а і інтерферономч-у і, при ревматоїдному артриті, сприяє міграції моноцитів, Т-клітин і попередників остеокластів у синовіальну тканину (Мод. КПпешитаїйо!., 2017 Мау; 27(3):392-397). Підвищена експресія фракталкіну в дермальних сосочках дає правдоподібне пояснення міграції і накопичення Т-клітин у цих місцях при псоріазі (Вг. У. ЮОепгтаїйо!., 2001 дип; 144(6):1105-13).

Фракталкін також індукує утворення запальних медіаторів макрофагами, Т-клітинами і фібробластоподібними синовіоцитами. Більше того, фракталкін сприяє ангіогенезу і бо остеокластогенезу. У моделі колаген-індукованого артриту у мишей використання антитіл до фракталкіну дозволило суттєво полегшити перебіг патології (Мод. ВАНпейтаї!йо!., 2017 Мау; 27(3):392-397).

На підставі результатів нещодавніх наукових досліджень можна стверджувати, що інгібування ССіІ-опосередкованого хемотаксису є новим перспективним терапевтичним підходом до лікування променевої хвороби (Апійохій. Кедох бБідпа!., 2018 Арг 2. дої: 10.1089/аг5.2017.7458, Іпі. У. Вадіаї. Вісі, 2015 дип; 91(6):510-8). У моделях на тваринах було показано, що виразність радіаційно-індукованої дисфункції судин може бути ефективно знижена за рахунок інгібування ССіІ-опосередкованих сигнальних шляхів. Використання тварин, накаутних по гену рецептора ССІ2, так само як при використанні антагоністів зазначеного рецептора блокує радіаційно-індуковану зміну морфології і деструкцію ендотеліальних клітин і запобігає розвитку запалення дихальних шляхів безпосередньо після радіаційного опромінення (Апійохід. Кедох зідпаї!., 2018 Арг 2. адої: 10.1089/аг5.2017.7458). Більше того, пригнічення ССІ - опосередкованих сигнальних шляхів дозволяє суттєво знизити виразність радіаційно- індукованого фіброзу легенів, що є одним з основних "відкладених" побічних ефектів радіаційного опромінення.

Таким чином, на підставі літературних даних можна зробити висновок, що стратегія, спрямована на інгібування глутамінілциклази, є можливим підходом до лікування аутоїмунних захворювань, ожиріння, захворювань легенів, дихальних шляхів і черевної порожнини, променевої хвороби і больового синдрому.

До даного часу відомі інгібітори глутамінілдиклази, що включають сульфоліпіди (М/о 2017/046256), похідні флаваноїдів (Вісогдо. Мед. Спет., 2016 Мау 15; 24(10)2280-6), похідні піридину (05 2015/0291632) і деякі невеликі молекули, описані в роботах останнього часу (..

Мей. Спет., 2017 Маг 23; 60(6) 2573-2590; УМО 2014/193974, 5 2015/0291557). Найбільш близькі аналоги сполуки, що є предметом даного винаходу, наведені в публікаціях компанії

Ргобісдгид АКіепдезеїІвзснай (9. Віої Спет., 2003 Оес 12; 278(50):49773-9). У даній роботі описані інгібітори глутамінілциклази на основі похідних імідазолу. Однак, у структурах сполук, опублікованих компанією Ргобіодгид АКіепдезеїЇї5снпай імідазол містить аліфатичний замісник по одному з атомів азоту імідазольного циклу. Введення аліфатичного замісника знижує метаболічну стабільність сполук. Крім того, введення аліфатичного замісника збільшує

Зо гідрофобність сполук і полегшує проникнення сполуки через гематоенцефалічний бар'єр, що явно є зайвим для пригнічення аберантної активності клітин імунної системи і потенційно може привести до виникнення побічних ефектів.

На сьогоднішній день немає жодного препарату, що діє як інгібітор глутамінілциклази, який би застосовували в терапії захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, тому зберігається потреба в створенні і впровадженні для використання в терапії нових ефективних лікарських засобів на основі інгібіторів глутамінілциклази.

Даний винахід стосується застосування хімічних сполук, які мають ефективність в інгібуванні глутамінілциклази, у терапії захворювань дихальних шляхів і черевної порожнини, променевої хвороби і різних видів больового синдрому, а також інших захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи.

Короткий опис креслень

Фіг. 1. Приплив клітин запалення в бронхоальвеолярний простір при вивченні специфічної фармакологічної активності Сполуки І на моделі гострої астми у морських свинок (Мет, п--10).

Розкриття винаходу

Задачею даного винаходу є розробка нових лікарських засобів, які є інгібіторами глутамінілдиклази і є ефективними для лікування захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, особливо захворювань легенів, дихальних шляхів і черевної порожнини, променевої хвороби і больового синдрому, а також інших захворювань пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи.

Технічним результатом даного винаходу є розробка і одержання ефективних інгібіторів глутамінілдиклази які характеризуються високою інгібуючою активністю, що дозволяє використовувати дані інгібітори для лікування захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема захворювань легенів і дихальних шляхів, таких як бронхіальна астма, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, риніт (зокрема, алергічний риніт), риносинусит, хронічна обструктивна хвороба легенів і її прояви (зокрема, емфізема легені, бронхіальна обструкція); захворювань органів черевної порожнини, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, перитоніти і нефропатії (зокрема, діабетична нефропатія); променевої хвороби і больового синдрому, а також інших захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема з аберантним хемотаксисом клітин імунної системи. бо Зазначений технічний результат досягається шляхом застосування сполук формули (А)

Нм МН

М мм «4

Н Н ;, (А) у якій

Ві являє собою групу -С(0)-Н2-С(0)- або -Н2-С(0)-, де Ко являє собою групу -(СНг)п-, необов'язково заміщену одним або двома С1-Св-алкілами, або феніл, п являє собою ціле число від 0 до 4

При цьому зазначені сполуки формули (А) вибрані з групи, що складається з будь-якої зі

Сполук І-Х і їх комбінацій щі о о р ук Ге) о нету

Й бо Км АДАМ КИ я й

М. о М. 5 М М 5 Ї М М

М би М МІ М ту М

М М МО; М М м; в) М о М / о і у о о) нау чено; - Же й ів і й Н ї же

М (о) що МН (е)

Ба Я М і

М 7 бут, Х 4 у ак а й або їх фармацевтично прийнятних солей, гідратів, сольватів як інгібіторів глутамінілциклази.

Зазначений технічний результат досягається також за допомогою застосування сполук формули (А), вибраних з будь-якої зі Сполук І-Х або їх фармацевтично прийнятних солей, гідратів, сольватів, для одержання фармацевтичної композиції для попередження і/або лікування розладу, пов'язаного з активністю глутамінілциклази.

Зазначений технічний результат досягається також за допомогою застосування будь-якої зі

Сполук І-Х або їх солей, гідратів, сольватів для одержання фармацевтичної композиції для попередження і/або лікування розладу, пов'язаного з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема з аберантним хемотаксисом клітин імунної системи.

Крім того, винахід передбачає фармацевтичні композиції для попередження і/або лікування розладу, пов'язаного з активністю глутамінілциклази і/або з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема з аберантним хемотаксисом клітин імунної системи, які характеризуються тим, що вони містять ефективну кількість сполуки за винаходом і щонайменше одну фармацевтично прийнятну допоміжну речовину. У деяких варіантах втіленнях винаходу допоміжна речовина являє собою фармацевтично прийнятний носій і/або ексципієнт.

Винахід також включає спосіб попередження і/або лікування розладу, пов'язаного з активністю глутамінілциклази в організмі який включає введення в зазначений організм фармацевтичної композиції за винаходом. Такий розлад, пов'язаний з активністю глутамінілдиклази, являє собою захворювання, пов'язане з аберантною активністю клітин

Зо імунної системи, зокрема з аберантним хемотаксисом клітин імунної системи, особливо захворювання легенів і дихальних шляхів. У деяких необмежувальних варіантах втілення винаходу захворювання легенів і дихальних шляхів являє собою бронхіальну астму, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, емфізему легені, риніт, риносинусит або хронічну обструктивну хворобу легенів. В окремих випадках втілення винаходу організм являє собою людину або тварину.

Докладне розкриття винаходу

Одержання Сполук І-Х, як і ряду інших хімічних сполук, описане в заявці на винахід КО 2013/116822. У зазначеній патентній заявці описані похідні бісамідів дикарбонових кислот, що мають здатність до комплексоутворення або хелатування іонів металів, а також їх застосування як засобу для профілактики і/або лікування вірусного гепатиту, ВІЛ-інфекції, онкологічних, нейродегенеративних, серцево-судинних, запальних захворювань, діабету, геронтологічних захворювань, захворювань, що викликаються токсинами мікроорганізмів, а також алкоголізму, алкогольного цирозу печінки, анемії, пізньої порфірії, отруєнь солями перехідних металів.

У ході досліджень специфічної фармакологічної активності сполуки формули (А) авторами даного винаходу було несподівано виявлено, що Таким чином, показано, що Сполуки формули (А) впливають на хемотаксис клітин імунної системи. Зниження припливу клітин імунної системи може застосовуватися в терапії цілого ряду захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема захворювань легенів і дихальних шляхів, таких як бронхіальна астма, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, риніт (зокрема, алергічний риніт), риносинусит, хронічна обструктивна хвороба легенів і її прояви (зокрема, емфізема легені, бронхіальна обструкція); а також захворювань органів черевної порожнини, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, перитоніти і нефропатії (зокрема діабетична нефропатія); і променевої хвороби.

Оскільки вплив на хемотаксис не може бути передбачений або пояснений здатністю сполуки до комплексоутворення або хелатування іонів металів, була здійснена спроба пошуку можливих терапевтичних мішеней. У ході досліджень автори даного винаходу виявили, що спостережуваний терапевтичний ефект сполук формули (А) пов'язаний зі здатністю даних сполук пригнічувати активність глутамінілдциклази. У ході подальших досліджень здатність пригнічувати активність глутамінілциклази була показана також для сполук ПІ, ЇМ, М, МІ, МІ, МІ,

ІХіХ.

Таким чином, Сполуки І-Х є новими інгібіторами глутамінілциклази, які впливають на хемотаксис клітин імунної системи і можуть застосовуватися для терапії захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, зокрема захворювань легенів і дихальних шляхів, таких як бронхіальна астма, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, риніт (зокрема, алергічний риніт), риносинусит, хронічна обструктивна хвороба легенів і її прояви

Зо (зокрема, емфізема легені, бронхіальна обструкція); а також захворювань органів черевної порожнини, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, перитоніти і нефропатії (зокрема, діабетична нефропатія); а також променевої хвороби і больового синдрому.

Терміни і визначення

Термін "Сполука І" стосується М,М'-біс(2-(1Н-імідазол-4-іл)уетил|оксаламіду, що відповідає наступній структурній формулі: / о й М ().

Термін "Сполука ІІ" стосується М,М'-бісІ(2-(1 Н-імідазол-4-іл)етиліізофталаміду, що відповідає наступній структурній формулі: -ша вл

НМ МН

Між о о МІ).

Термін "Сполука Ш" стосується /-М,М'-бісІ2-(1Н-імідазол-4-іл)етилікарбаміду, також представленого структурною формулою:

М М

Н Н Н НО (у.

Термін "Сполука ІМ" стосується /М,М'-бісІ(2-(1 Н-імідазол-4-іл)етил|малонаміду, також представленого структурною формулою:

Ба Ї | г

М ро М

Н Н н НО (м).

Термін "Сполука М" стосується /-М,М'-біс(2-(1 Н-імідазол-4-іл/уетил|сукцинаміду, також представленого структурною формулою: по | М М

М М

М М о МО (М).

Термін "Сполука МІ" стосується М,М'-біс(2-(1Н-імідазол-4-іл)/етил|глутараіміду, що відповідає наступній структурній формулі:

МН (в) (в) НМ 7 ТУ д-кЕЖКх Ж

М М щі) Н (МІ).

Термін "Сполука МІ" стосується М,М'-біс(2-(1Н-імідазол-4-іл)уетил|адипаміду, що відповідає наступній структурній формулі:

М

(в)

Б М М

М М

М М н Н тр у; (в)

М (МІЇ).

Термін "Сполука МІ" стосується М,М'-біс(2-(1Н-імідазол-4-іл)етил|-З-метилпентанедіаміду, відповідного структурній формулі: ун (в) (в) нку

М М

-щ- Ха

М М щі Н (МІ).

Термін "Сполука ЇХ" стосується М,М'-біс(2-(1Н-імідазол-4-іл)уетил|-3,3- диметилпентанедіаміду, відповідного структурній формулі: фун (в) (в) не

М М

-щ-- Ж

М М

Н Н (І

Термін "Сполука Х" стосується /М,М'-біс(2-(1 Н-імідазол-4-іл)уетил|ігерефталаміду, що відповідає наступній структурній формулі: 0 щ и о

Я м ї ї

М

Н (Х).

Термін "С", коли він використовується з посиланням на температуру, означає стоградусну шкалу або температурну шкалу Цельсія.

Термін "ІСво" означає концентрацію тестованої сполуки, при якій досягається напівмаксимальне інгібування ферменту.

Термін "фармацевтично прийнятні солі" або "солі" включає солі активних сполук, які одержані за допомогою відносно нетоксичних кислот. Прикладами фармацевтично прийнятних нетоксичних солей можуть служити солі, утворені неорганічними кислотами, такими як соляна, бромоводнева, фосфорна, сірчана і хлорна кислоти, або органічними кислотами, такими як оцтова, щавлева, малеїнова, винна, бурштинова, лимонна або малонова кислоти, або одержані іншими методами, використовуваними в даній галузі, наприклад за допомогою іонного обміну.

До інших фармацевтично прийнятних солей належать адипінат, альгінат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бісульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецилсульфат, етансульфонат, форміат, фумарат, глюкогептонат, гліцерофосфат, глюконат, гемісульфат, гептанат, гексанат, гідройодид, гідроксіетансульфонат, лактобіонат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат (мезилат), 2-нафталінсульфонат, нікотинат, нітрат, олеат, оксалат, пальмітат, памоат, пектинат, персульфат, З-фенілпропіонат, фосфат, пікрат, півалат, пропіонат, напівфумарат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тіоціанат, п-толуолсульфонат (тозилат), ундеканат, валеріат і подібні.

Термін "сольват" використовується для опису молекулярного комплексу, який містить сполуку за винаходом і одну або більше молекул фармацевтично прийнятного розчинника, наприклад етанолу. Термін "гідрат" використовується, коли зазначеним розчинником є вода.

Термін "аберантна активність" клітин імунної системи в даному документі означає активність, яка суттєво відрізняється від базового рівня активності клітин імунної системи в організмі за відсутності патології. Аберантна активність може бути викликана надлишковим припливом клітин імунної системи до органа або тканини, порушенням процесів, що приводять до активації клітин імунної системи, дерегулюванням процесів, пов'язаних з загибеллю клітин імунної системи, а також іншими факторами.

Термін "допоміжна речовина" означає будь-яку фармацевтично прийнятну речовину неорганічного або органічного походження, яка входить до складу лікарського препарату або використовується в процесі виробництва, виготовлення лікарського препарату для надання йому необхідних фізико-хімічних властивостей.

Термін "середовище КРМІ" (англ. Козмжей! РаЖж МетогіаІ Іпбійше теаїшт) означає середовище для культур клітин і тканин. КРМІ традиційно використовується для вирощування лімфоїдних клітин людини. Середовище містить значну кількість фосфату і має склад для вирощування в атмосфері з вмістом вуглекислого газу 5 95.

Термін "глутамінілциклаза" означає фермент аміноацилтрансферазу, що бере участь у перетворенні М-кінцевого глутаміну в піроглутамін у різних пептидних субстратах. Утворення М- кінцевого піроглутамату захищає біологічно активні пептиди, гормони і хемокіни (наприклад,

Зо тиреотропінвивільняючий гормон, В-хемокіновий ліганд-2) від деградації екзопептидазами і у деяких випадках може збільшувати афінність лігандів до їх рецепторів.

Термін "хемотаксис" означає спрямований рух клітин у відповідь на хімічний подразник. В основі хемотаксису лежить здатність клітини відповідати на градієнт концентрації хемотаксичного медіатора. Хемотаксис є тим процесом, завдяки якому клітини імунної системи залишають судинне русло і мігрують в ушкоджену тканину. Провідну роль у хемотаксисі відіграють хемотаксичні речовини (хемоатрактанти). Одним з найбільш потужних хемоатрактантів для моноцитів і макрофагів є хемокін ССІ 2.

Терміни "лікування", "терапія" охоплюють лікування патологічних станів у ссавців, переважно у людини, і включають: а) зниження, б) блокування (припинення) перебігу захворювання, в) полегшення тяжкості захворювання, тобто індукцію регресії захворювання, г) реверсування захворювання або стану, до якого даний термін застосовується, або одного або більше симптомів даного захворювання або стану.

Терміни "профілактика", "запобігання" охоплюють усунення факторів ризику, а також профілактичне лікування субклінічних стадій захворювання у ссавців, переважно у людини, спрямоване на зменшення ймовірності виникнення клінічних стадій захворювання. Пацієнти для профілактичної терапії відбираються на основі факторів, які, на підставі відомих даних, призводять до збільшення ризику виникнення клінічних стадій захворювання в порівнянні з загальним населенням. До профілактичної терапії належать а) первинна профілактика і б) вторинна профілактика. Первинна профілактика визначається як профілактичне лікування пацієнтів, клінічна стадія захворювання яких ще не настала. Вторинна профілактика - це попередження повторного настання того ж або близького клінічного стану захворювання.

Сполуки І-Х перспективні для лікування захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, особливо захворювань, пов'язаних з аберантним хемотаксисом клітин імунної системи, зокрема для терапії захворювань легенів і дихальних шляхів, таких як бронхіальна астма, гострий і хронічний бронхіт, фарингіт, риніт (зокрема, алергічний риніт), риносинусит, хронічна обструктивна хвороба легенів і її прояви (зокрема, емфізема легені, бронхіальна обструкція); захворювань органів черевної порожнини, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, перитоніти і нефропатії (зокрема, діабетична нефропатія); променевої хвороби і больового синдрому, які мають як системний, так і локальний характер, у тому числі, бо обумовлених первинними патологічними змінами або пов'язаних з різними захворюваннями або тривалим прийманням деяких лікарських препаратів. У деяких окремих варіантах сполуки за винаходом можуть бути використані для лікування інших захворювань, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи.

Спосіб терапевтичного застосування сполук

Предмет даного винаходу також включає введення суб'єкту, що потребує відповідного лікування, терапевтично ефективної кількості однієї або декількох сполук за винаходом. Під терапевтично ефективною кількістю мається на увазі така кількість однієї або декількох сполук, що вводиться або доставляється пацієнту, при якій у пацієнта з найбільшою ймовірністю виявиться бажана реакція на лікування (профілактику). Точна необхідна кількість може мінятися від суб'єкта до суб'єкта залежно від віку, маси тіла і загального стану пацієнта, тяжкості захворювання, методики введення препарату, комбінованого лікування з іншими препаратами і т. п.

Сполука за винаходом або фармацевтична композиція, яка містить одну або декілька сполук, може бути введена в організм пацієнта в будь-якій кількості (переважно добова доза діючої речовини становить до 0,5 г на пацієнта на добу, найбільш переважно добова доза становить 5-50 мг/добу) і будь-яким шляхом введення (переважним є пероральний шлях введення), ефективним для лікування або профілактики захворювання.

Після змішування лікарського препарату з конкретним придатним фармацевтично допустимим носієм у бажаному дозуванні, композиції, що складають суть винаходу, можуть бути введені в організм людини або інших тварин перорально, парентерально, місцево і т. п.

Введення може здійснюватися як один раз, так і декілька разів на день, тиждень (або будь- який інший часовий інтервал) або час від часу. Крім того, одна або декілька сполук можуть вводитися в організм пацієнта щодня протягом визначеного періоду днів (наприклад, 2-10 днів), а потім іде період без приймання речовини (наприклад, 1-30 днів).

У тому випадку, коли сполуки за винаходом використовуються як частина режиму комбінованої терапії, доза кожного з компонентів комбінованої терапії вводиться протягом необхідного періоду лікування. Сполуки, що складають комбіновану терапію, можуть вводитися в організм пацієнта як одноразово, у вигляді дозування, що містить усі компоненти, такі у вигляді індивідуальних дозувань компонентів.

Зо Фармацевтичні композиції

Винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять сполуки формули (А), зокрема сполуки І-Х (або пролікарську форму, або інше фармацевтично прийнятне похідне) і один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв, ад'ювантів, розчинників і/або наповнювачів, таких, які можуть бути введені в організм пацієнта разом зі сполукою, що складає суть даного винаходу, і які не впливають на фармакологічну активність цієї сполуки і є нетоксичними при введенні в дозах, достатніх для доставки терапевтичної кількості сполуки.

Фармацевтичні композиції, які заявляються в даному винаході, містять одну або декількох сполук формули (А) разом з фармацевтично прийнятними носіями, які можуть включати будь- які розчинники, розріджувачі, дисперсії або суспензії, поверхнево-активні речовини, ізотонічні агенти, загусники і емульгатори, консерванти, в'яжучі речовини, ковзні матеріали і т. д., придатні для конкретної форми дозування. Матеріали, які можуть служити фармацевтично прийнятними носіями, включають, але не обмежуються, моно- і олігосахариди, а також їх похідні; желатин; тальк; ексципієнти, такі як какао-масло і віск для супозиторіїв; олії, такі як арахісова, бавовняна, сафлорова, кунжутна, оливкова, кукурудзяна і соєва олії; гліколі, такі як пропіленгліколь; складні ефіри, такі як етилолеат і етиллаурат; агар; буферні речовини, такі як гідроксид магнію і гідроксид алюмінію; альгінову кислоту; апірогенну воду; ізотонічний розчин, розчин Рінгера; етиловий спирт і фосфатні буферні розчини. Також у складі композиції можуть бути інші нетоксичні сумісні ковзні речовини, такі як лаурилсульфат натрію і стеарат магнію, а також барвники, плівкоутворювачі, підсолоджувачі, смакові добавки і ароматизатори, консерванти і антиоксиданти.

Предметом даного винаходу є також лікарські форми - клас фармацевтичних композицій, склад яких оптимізований для визначеного шляху введення в організм у терапевтично ефективній дозі, наприклад для введення в організм орально, місцево, інгаляційно, наприклад у вигляді інгаляційного спрею, або внутрішньосудинним способом, інтраназально, підшкірно, внутрішньом'язово, а також інфузійним способом, у рекомендованих дозуваннях.

Лікарські форми даного винаходу можуть містити склади, одержані методами використання ліпосом, методами мікрокапсулювання, методами приготування наноформ препарату або іншими методами, відомими у фармацевтиці.

При одержанні композиції, наприклад у формі таблетки, активне начало змішують з одним 60 або декількома фармацевтичними ексципієнтами, такими як желатин, крохмаль, лактоза,

стеарат магнію, тальк, кремнезем, аравійська камедь, маніт, мікрокристалічна целюлоза, гіпромелоза або аналогічні сполуки.

Таблетки можна покрити сахарозою, целюлозним похідним або іншими речовинами, придатними для нанесення оболонки. Таблетки можуть бути одержані різними способами, такими як безпосереднє стиснення, сухе або вологе гранулювання або гаряче сплавлення в гарячому стані.

Фармацевтичну композицію у формі желатинової капсули можна одержати, змішуючи активне начало з іншими речовинами і заповнюючи одержаною сумішшю м'які або тверді капсули.

Для введення парентеральним шляхом використовуються водні суспензії, ізотонічні сольові розчини або стерильні розчини для ін'єкцій, які містять фармакологічно сумісні агенти, наприклад пропіленгліколь або бутиленгліколь.

Приклади фармацевтичних композицій

Сполуки формули (А), описані в даному винаході, можуть бути використані для профілактики і/або лікування хвороб людини або тварин у вигляді наступних складів (під "Речовиною" розуміється Сполука формули (А)):

Таблетка | мг/таблетка

Речовина 0,5

Мікрокристалічна целюлоза 66,5

Карбоксиметилкрохмаль натрію 2,3

Магнію стеарат 0,7

Таблетка ЇЇ мг/таблетка

Речовина 5,0

Мікрокристалічна целюлоза 62,0

Карбоксиметилкрохмаль натрію 2,3

Магнію стеарат 0,7

Таблетка ПІ мг/таблетка

Речовина 50

Мікрокристалічна целюлоза 620

Карбоксиметилкрохмаль натрію 23

Магнію стеарат 7

Таблетка ІМ мг/таблетка

Речовина 50

Лактоза РИ. ЕЄиг 223,75

Кроскармелоза натрію 6,0

Кукурудзяний крохмаль 15

Полівінілпіолідон (5 95 об. паста) 2,25

Стеарат магнію 3,0

Таблетка М мг/таблетка

Речовина 200

Лактоза РИ. ЕЄиг 182,75

Кроскармелоза натрію 12,0

Кукурудзяний крохмаль (5 95 об. паста) 2,25

Стеарат магнію 3,0

Капсула мг/таблетка

Речовина 10

Лактоза РИ. ЕЄиг 488,5

Магнезія 1,5

Склад для ін'єкцій І (50 мг/мл)

Речовина 5,0 95 М/у 1М розчин гідроксиду натрію 15,0 95 М/м 1М розчин соляної кислоти до рН 7,6

Полієтиленгліколь 400 4,56 М/У

Вода для ін'єкцій до 100 95

Мазь мл

Речовина 40 мг

Етанол 300 рл

Вода 300 рл 1-Додецилазациклогептанон 50 рл

Пропіленгліколь до 1 мл.

Дані склади можуть бути приготовлені згідно зі стандартними фармацевтичними методиками. Таблетки (1)-(І) можуть бути покриті кишковорозчинною оболонкою з використанням, наприклад, фталату ацетату целюлози.

Застосування Сполук І-Х у комбінованій терапії

Незважаючи на те, що Сполуки І-Х можуть вводити як індивідуальний активний фармацевтичний засіб, їх також можна використовувати в комбінації з одним або декількома іншими агентами, зокрема, інший агент може являти собою антибіотик, НПЗЗ або інший протизапальний засіб, антигіпертензивний засіб, глюкокортикостероїд, моноклональне антитіло і т. д. При спільному прийманні усередину терапевтичні агенти можуть являти собою різні лікарські форми, які вводяться одночасно або послідовно в різний час, або терапевтичні агенти можуть бути об'єднані в одну лікарську форму.

Фраза "комбінована терапія" відносно сполук даного винаходу в комбінації з іншими фармацевтичними агентами означає одночасне або послідовне приймання всіх агентів, які так чи інакше забезпечать сприятливий вплив комбінації ліків. Спільне введення має на увазі, зокрема, спільну доставку, наприклад в одній таблетці, капсулі, ін'єкції або в іншій формі, що має фіксоване співвідношення активних речовин, також як і одночасну доставку в декількох окремих лікарських формах для кожної сполуки, відповідно.

Таким чином, введення сполук І-Х може бути здійснене в комбінації з додатковими методами лікування, відомими фахівцям в галузі профілактики і лікування відповідних захворювань, які включають застосування антибактеріальних, цитостатичних і цитотоксичних препаратів, препаратів для пригнічення симптомів або побічних ефектів одних з ліків.

Якщо лікарський засіб являє собою фіксовану дозу, така комбінація використовує сполуки даного винаходу в прийнятному дозовому діапазоні. Сполуки І-Х за даним винаходом також можуть бути введені в організм пацієнта послідовно з іншими агентами, у тому випадку, коли комбінація цих препаратів неможлива. Винахід не обмежений послідовністю введення; сполуки даного винаходу можуть бути введені в організм пацієнта спільно, до або після введення іншого препарату.

Приклади

Одержання сполук за винаходом

Способи одержання Сполук І-Х розкриті в заявці на винахід КО 2013/116822. У тій же заявці описана здатність подібних сполук до комплексоутворення або хелатування іонів металів.

Характеристика біологічної активності сполук за винаходом

Біологічна активність Сполук І-Х була вивчена в різних іп мійго і іп мімо експериментах.

Зокрема, при вивченні активності Сполук І і Ії у різних іп міїго і іп ммо моделях була показана інгібуюча дія Сполук І і ІЇ на хемотаксис моноцитів, макрофагів і інших клітин імунної системи.

Дана біологічна дія Сполук І і ІЇ не може бути передбачена або пояснена на основі попередніх знань про здатність Сполук І і ІЇ до хелатування іонів металів.

Дослідження біологічної активності Сполук ПІ-Х іп міго, дозволили встановити, що Сполуки

ІІ-Х так само є інгібіторами ферменту глутамінілциклази і, таким чином, дія Сполук П-Х на хемотаксис клітин імунної системи може бути опосередкована інгібуванням активності глутамінілциклази.

Дослідження впливу Сполук І-Х на ферментативну активність глутамінілциклази людини іп міго

У ході досліджень впливу Сполук І-Х, які є предметом даного винаходу, на ферментативну активність глутамінілциклази іп міго уперше була виявлена пряма інгібуюча дія Сполук І-Х на рекомбінантну внутрішньоклітинну глутамінілциклазу людини.

Активність глутамінілциклази при різних концентраціях Сполук І-Х вивчалася при 257 з використанням флуоресцентного субстрату І-глутамініл-2-нафтиламіду (Сіп-СМА) (Апаї.

Віоспет., 2002 Арі 1; 303(1):49-56). Реакційна суміш об'ємом 100 мл містила 50 ММ флуорогенного субстрату; «0,2 одиниці піроглутамініламінопептидази людини (1 одиниця визначається як кількість, що гідролізує 1 мікромоль роішШ-БМА на хвилину) і аліквоту рекомбінантної внутрішньоклітинної глутамінілциклази людини (90) в 50 мМ трисамінометан-

НСІ ї 5 95 гліцерині, рН 8,0. Реакцію ініціювали додаванням до реакційної суміші аліквоти глутамінілциклази, інкубованої зі Сполуками І-Х протягом 5 хвилин.

Таблиця 1

Вплив Сполук І-Х на ферментативну активність глутамінілциклази людини іп міго

Ме | 7777/7771 Сполука | МЮемкмМ | К,імкмМо б

М о

М М

М й М 14

М з н Й м; о М ук о о ну

М М

Що жлєруєх 29 1!

М о М

Ба Ж р; З 2

М о Ге! М я а г о о зво

Н їх і Н

М о

Ба М М

У ї М й М 20 11 н | | у;

М ук о о нету

М, М

М КАКАО за З

М (в) щи М М

МІ М М М М 44 2

ГО

М і ХХХ /

М, М ук о о нау

М, М же

М Мн в)

Хх - 0,44 о ни. а о) 5 Подальше протікання реакції відслідковували спектрофотометрично (довжини хвиль збудження і емісії становили 320 і 410 нм). Ферментативну активність визначали по кількості 2- нафтиламіду (БМА), що виділився, розрахованій по калібрувальній кривій. Значення ІСвхо розраховували за допомогою нелінійної регресії кривої "концентрація інгібітору"- "ферментативна активність". Як речовину порівняння використовували відомий інгібітор глутамінілциклаз - сполуку РВО150 (У. Мей. Спет., 2006 дап 26; 49(2):664-77).

У результаті експерименту було встановлено, що Сполуки 1-Х інгібують активність глутамінілциклази з ІСво у діапазоні від 0,8 до 20 мкМ (див. Таблицю Помилка! Джерело посилання не знайдено.).

Дослідження впливу Сполук І і ІЇ на міграцію моноцитів іп міго

Вплив Сполук І і ІЇ на міграцію моноцитів іп міго був вивчений з використанням клітин лінії 0937, підрощених до концентрації (2-3)х105 клітин/мл на середовищі КРМІ 1640 з додаванням 10 95 термоінактивованої фетальної коров'ячої сироватки (Віоспет. у., 2012 Маг 1; 442(2):403- 12). Приблизно 1х107 клітин ШОЗ37 інкубували з різними концентраціями Сполук І і ЇЇ "усього 7 концентрацій для кожної зі сполук) при 37" С протягом 2 годин і потім обробляли ліпополісахаридом Е. сої (0111:84). Супернатант (кондиціоноване середовище) використовували для вивчення міграції моноцитів.

Свіжу порцію клітин Ше37 забарвлювали флуоресцентним барвником Саїсеїп АМ протягом 1 години при 37 "С. Після цього аліквоту забарвлених клітин поміщали у верхній відсік ямок планшета ВО РаісопТтМ НТ РіногоВіІоК, комірки якого розділені напівпроникними оптично непрозорими мембранами. У нижнє відділення ямок планшета поміщали кондиціоноване середовище, одержане після інкубування клітин з інгібітором і ліпополісахаридом. Планшети інкубували 2 години при 37 "С, кількість (96 відносно експерименту без інгібітору) клітин, що мігрували в нижній відсік ямок визначали флуориметрично. Як речовину порівняння використовували відомий інгібітор глутамінілциклаз - сполуку РВО150 (У. Мед. Спет., 2006 дап 26; 49(2):664-77).

У результаті експерименту було встановлено, що Сполука І і Сполука ІІ у мікромолярному діапазоні концентрацій виявляють інгібуючий ефект на міграцію моноцитів іп міго. Сполука пригнічує міграцію моноцитів у широкому діапазоні концентрацій від 1 до 300 мкМ з ефективністю, близькою до 60 95. У тому ж діапазоні концентрацій Сполука ІІ пригнічує міграцію моноцитів з ефективністю 50-70 95.

Дослідження впливу Сполуки І на хемотаксис лейкоцитів іп мімо на моделі бронхіальної астми у морських свинок

Індукцію бронхіальної астми у морських свинок здійснювали за стандартною методикою (Сйцтепі Огид Тагоєїв.2008 Шип; 9(6):452-65)3. Тварин імунізували однократним внутрішньоочеревинним введенням 0,5 мл розчину, що містить 100 мкг/мл овальбуміну (Зідта) і 100 мг/мл гідрокису алюмінію. Інтактним тваринам внутрішньоочеревинно вводили фіз. розчин в об'ємі 0,5 мл.

На 29, 30 ї 31 день експерименту проводили провокацію гіперреактивності дихальних шляхів шляхом інгаляційного введення овальбуміну в зростаючих концентраціях - 0,1, 0,3 і 0,5 мг/мл (на 29, 30 ії 31 день, відповідно). Інсаляцію здійснювали протягом 5 хвилин або до появи виражених ознак асфіксії (падіння на бік). На 32-ий день тваринам вводили більшу дозу овальбуміну - 1 мг/мл, протягом 5 хвилин з оцінкою бронхоспастичної реакції.

Зо Досліджувану сполуку вводили тваринам внутрішньошлунково щодня один раз на день протягом 10 діб, закінчуючи за 24 год. до введення більшої дози антигену.

Через 24 години після введення більшої дози овальбуміну у тварин відбирали бронхоальвеолярний лаваж (БАЛ). Узяття БАЛ проводили під наркозом шляхом промивання легенів 5 мл підігрітого до 37 "С фізіологічного розчину через трахею за допомогою шприцевого

З5 дозатора.

У рідині бронхоальвеолярного змиву за допомогою камери Горяєва підраховували абсолютну кількість клітинних елементів в 1 мкл змиву. Потім бронхоальвеолярний лаваж центрифугували при 200 д протягом 10 хвилин. З осаду клітин приготовляли мазки, які надалі фіксували в метанолі і забарвлювали по Романовському-Гимзі для підрахунку ендопульмональної цитограми.

Цитологічний аналіз бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ) виявив багаторазове збільшення клітинних елементів у БАЛ сенсибілізованих морських свинок (малюнок 1). Таким чином, дана модель характеризується запальною реакцією респіраторного тракту експериментальних тварин. Аналіз окремих типів клітин показав, що найбільш виражений приплив клітин припадав на еозинофіли. Одержані результати підтверджують літературні дані і дозволяють зробити висновок про те, що змодельоване запалення носить алергічний характер.

Щоденне внутрішньошлункове введення Сполуки І протягом 10 днів знизило приплив клітин запалення в бронхоальвеолярний простір. Сполука | виявляла терапевтичний ефект у всьому тестованому діапазоні доз (0,14-14 мг/кг), знижувала як загальну кількість лейкоцитів, так і кількість окремих клітинних типів: еозинофілів, нейтрофілів, макрофагів (Фіг. 1).

При цьому на фігурі 1 знаком " позначені відмінності, статистично значимі в порівнянні з інтактною групою (р«0,05); і знаком 4. - відмінності, статистично значимі в порівнянні з групою контролю (р«е0,05).

Одержані результати свідчать про те, що Сполука | виявляє виражений терапевтичний ефект при бронхіальній астмі.

Дослідження впливу Сполуки І на хемотаксис макрофагів, нейтрофілів і еозинофілів іп мімо на моделі сефадекс-індукованого бронхіту легенів у щурів

Модель сефадекс-індукованого бронхіту легенів у щурів реалізували за стандартною методикою (Іпї. Агсй. АйПегду Іттипої., 2011; 154(4):286-94). Щурам-самцям лінії Вістар бо однократно інгаляційно вводили Сефадекс (3-200 (РПагтасіа, Змедеп) у дозі 5 мг/кг.

Досліджувані сполуки вводили тваринам внутрішньошлунково чотирикратно: за 2411 год. до, а також 24 і 45 год. після введення сефадексу. Препарат порівняння будесонід вводили за тією ж схемою інгаляційно в дозі 0,5 мг/кг. Через 48 год. після інгаляції сефадексу робили забір бронхоальвеолярного лаважу. У лаважі оцінювали сумарну кількість лейкоцитів і визначали лейкоцитарну формулу.

Аналіз бронхоальвеолярного лаважу показав, що однократне інгаляційне введення

Сефадексу 5-200 щурам викликає виражений приплив лейкоцитів у легеню. Кількість усіх клітинних типів була збільшена в групі контролю в порівнянні з інтактними (Таблиця 2).

Таблиця 2

Кількість клітинних елементів у бронхоальвеолярному лаважі на моделі сефадекс-індукованого бронхіту у щурів (Мет, п--10)

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Внутрішньошлункове введення Сполуки І щурам знизило вміст нейтрофілів і еозинофілів у

БАЛ до рівня інтактних тварин. Одержані результати свідчать про те, що Сполука | виявляє терапевтичний ефект при запаленні нижніх дихальних шляхів, зокрема при бронхіті.

Дослідження активності Сполуки І на моделі неінфекційного запалення легені, індукованого екстрактом сигаретного диму

Індукцію неінфекційного запалення легені мишей здійснювали за стандартною методикою

ІЕХр. Гипа. Нез., 2013 Рер; 39(1):18-31| Мишам-самцям лінії ВаІр/с внутрішньоочеревинно вводили екстракт сигаретного диму (ЕСД, 0.45 мл/20 мг) на 0, 11, 15, 17, 19 ї 22 добу. ЕСД одержували наступним чином: 5 сигарет спалювали, за допомогою вакуумного насоса дим фільтрували для видалення частинок і збирали в посудину, що містить фосфатно-сольовий буфер. Сполуку І вводили внутрішньошлунково, щодня, 1 раз на добу з 7 по 27 добу. Евтаназію проводили на 28 добу. Праву частку легені фіксували в 10 95 розчині нейтрального формаліну, проводили через спирти висхідних концентрацій до ксилолу і заливали в парафін за стандартною методикою. Депарафінізовані зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали гематоксилін- еозином і проводили гістологічний аналіз.

Кожне ураження було оцінене по 5-бальній шкалі: 1 бал - запальний інфільтрат займає 0-20

Фо площі досліджуваного гістологічного препарату, 2 бали - запальний інфільтрат займає 21-40

Фо площі досліджуваного гістологічного препарату, З бали - запальний інфільтрат займає 41-60

Фо площі досліджуваного гістологічного препарату, 4 бали - запальний інфільтрат займає 61-80

Зо Фо площі досліджуваного гістологічного препарату, 5 балів - запальний інфільтрат займає 81-100

Фо площі досліджуваного гістологічного препарату. Також обчислювали індекс деструкції альвеол (01) - відсоток ушкоджених альвеол відносно загального числа альвеол.

Результати дослідження показали, що багаторазове внутрішньоочеревинне введення екстракту сигаретного диму мишам індукує формування периваскуліту, перибронхіту, альвеоліту і інтерстиціальної пневмонії.

Внутрішньошлункове введення Сполуки !/ значно знизило розвиток периваскуліту і альвеоліту (Таблиця 3). Одержані результати дозволяють зробити висновок, що Сполука виявляє терапевтичний ефект при периваскуліті і альвеоліті.

Таблиця З

Результати гістологічного дослідження на моделі неінфекційної пневмонії, індукованої екстрактом сигаретного диму (М--т, п-12) ше ее лев яр Поея

Група Й мг/кг бали бали ОЇ, до пневмонія, бали інтактні | 7/7 - | 0715020 | б5їоме | 11505120 | 0995020

Контроль | - | 150ж50,247 | Т2ожом8 | 30,90ж52,307 | 810,27"

Примітка: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки І іп мімо на моделі емфіземи легені у мишей

Запалення і емфізему легенів викликали однократною інтратрахеальною ін'єкцією свинячої панкреатичної еластази. Еластазу вводили однократно інтратрахеально в дозі 0,6 Од/мишу в 30 мкл Мас! 0,9 95. Для анестезії під час операції використовували пентобарбітал інтраперитонеально в дозі 30 мг/кг. Операційне поле дезінфікували 70 95 розчином етанолу і звільняли від волосяного покриву. По середній лінії шиї розсікали шкіру, підшкірну клітковину і власну фасцію шиї. Методом тупого розсування тканин розсували м'язи на вентральній стороні трахеї. По ходу струменя повітря на вдиху робили ін'єкцію свинячої панкреатичної еластази за допомогою шприца Гамільтона. Після ушивання рани операційне поле обробляли антисептиком. Введення еластази приймали за 0 день експерименту.

Сполуку І вводили в дозі З мг/кг щодня внутрішньошлунково один раз на добу на 21 добу експерименту. На 21 добу дослідження тварин евтаназували в СОг-камері і виділяли легені.

Для оцінки динаміки і виразності розвитку емфіземи в тканині легенів з лівої легені виготовлялися гістологічні препарати. Для цього легеню фіксували в 10 95 розчині нейтрального формаліну і потім заливали в парафін за стандартною методикою. З депарафінізованих зрізів одержували препарати верхівки легені, середнього легеневого поля і нижнього легеневого поля товщиною 5 мкм і забарвлювали гематоксиліном і еозином за стандартною методикою. Далі робили фотографії верхівки легені, середнього легеневого поля і нижнього легеневого поля. За допомогою засобів комп'ютерної обробки графічних даних досліджували локалізацію і площу емфізематозно розширеної тканини легенів (96 від нормальної тканини), з розрахунків виключалися судини і бронхи (Іпі. У. Віотеа Ітадіпа., 2012; 2012:734734; Егопі РНпузіо!ї. 2015 Мау 12; 6:14).

При гістологічному дослідженні на 21 добу після введення еластази у всіх зонах легені мишей виявлялося помірно виражене повнокров'я судин мікроциркулярного русла і капілярів міжальвеолярних перегородок. Крім цього, еластаза приводила до стовщення стінок альвеол за рахунок лімфо-макрофагальної інфільтрації, а також запальної інфільтрації інтерстиціальної тканини. Просвіт окремих альвеол також заповнений макрофагами і лімфоцитами. У результаті

Зо дії ушкоджуючого агента на еластичні волокна бронхіол, альвеолярних ходів і альвеол у паренхімі легенів відзначалися розтягання альвеол і розриви альвеолярних перегородок, розвивалася дифузійна емфізема. Аналіз препаратів показав, що на 21 добу дослідження значна частина тканини лівої легені була зайнята емфізематозно розширеними альвеолами з руйнуванням міжальвеолярних перегородок. Емфізема локалізувалася у всіх легеневих полях.

Найбільш виражені ураження спостерігалися в нижньому легеневому полі (Таблиця 4).

Таблиця 4

Площа емфізематозно розширеної тканини легенів (95 від нормальної) у мишей в умовах інтратрахеального введення еластази на 21 добу експерименту (Мет, п-5) легеневе поле легеневе поле легеневе поле

Інтактнийконтрольу////Ї777777711710111111111111111110111111Ї11111110

Примітки: 1-7 - відмінності достовірні в порівнянні з інтактним контролем (р«0,05); 2 - е - відмінності достовірні в порівнянні з патологічним контролем (р«0,05).

Введення Сполуки І знижувало інтенсивність запальної інфільтрації паренхіми легенів і виразності повнокров'я судин міикроциркуляторного русла і капілярів міжальвеолярних перегородок, зменшувало відносну площу емфізематозно розширених альвеол у порівнянні з групою патологічного контролю (Таблиця 4). Одержані дані дають підставу зробити висновок, що Сполука ІЇ виявляє терапевтичний ефект при емфіземі легені.

Дослідження терапевтичної активності Сполуки І на моделі ХОБЛ у морських свинок

Дослідження проводили на самцях морських свинок. Хронічну обструктивну хворобу легенів викликали курсовим ендотрахеальним введенням ліпополісахариду клітинної стінки Б. соїї (ЛПС) і екстрактом тютюнового диму (ЕТД) (Віої. Рпагт. Ви. 2009 Бер; 32(9):1559-64). ЕТД одержували з сигарет марки Ні-І йе (Японія) (склад 1 сигарети: смола 17 мг/сиг., нікотин 1,4 мг/сиг.). Перед одержанням екстракту видаляли сигаретний фільтр, довжина сигарети з фільтром 80 мм, при видаленні фільтра 55 мм. Екстракцію здійснювали шляхом протягування диму запаленої сигарети через РВ5 з постійною швидкістю, за допомогою вакуумного насоса (40 мл/40 сигарет). Час спалювання однієї сигарети становив 180 секунд. Для видалення частинок одержаний екстракт фільтрували через бактеріальний фільтр з величиною пори 45 нм.

ЕСД інгалювали морським свинкам (0,3 мл/хв., 40 хв.) щодня один раз на добу на 1-4, 6-9, 11- 14, 16-19 доби. ЛІС інгалювали морським свинкам (25 мкг/мл, 0,3 мл/хв., 1 год.) один раз на добу на 5, 10 і 15 добу. До останньої інгаляції ЕСД, відразу після останньої інгаляції ЕСД і через 1,5 год. після останньої інгаляції ЕСД проводили оцінку функції дихання (протягом 15 хв.).

Відразу після оцінки функції дихання проводили забір бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ).

Узяття БАЛ проводили під наркозом шляхом промивання легенів 5 мл підігрітого до 37 "С фізіологічного розчину через трахею за допомогою шприцевого дозатора.

У рідині бронхоальвеолярного змиву за допомогою камери Горяєва підраховували абсолютну кількість клітинних елементів в 1 мкл змиву (цитоз). Потім БАЛ центрифугували при 200 д протягом 10 хвилин. З осаду клітин приготовляли мазки, які надалі фіксували в метанолі і забарвлювали по Романовському-Гимзі для підрахунку ендопульмональної цитограми.

Сполуку | вводили тваринам внутрішньошлунково щодня 1 раз на добу на 10-19 доби дослідження (останнє введення - за 1 год. до останньої інгаляції ЕСД). Групі хибної патології замість ЕТД і ЛПС інгалювали фіз. розчин. Контрольні тварини замість досліджуваної речовини одержували розчинник в еквівалентному об'ємі.

Проведене дослідження показало, що на моделі ХОБЛ Сполука І знижує приплив клітин запалення в бронхоальвеолярний простір морських свинок. Найбільш виражено Сполука знижує приплив нейтрофілів, макрофагів і еозинофілів (Таблиця 5).

Таблиця 5

Кількість клітинних елементів у бронхоальвеолярному лаважі на моделі ХОБЛ у морських свинок (Миет, п--10) ти нен неон нен нен пеня

Примітки:

Я - відмінність від групи хибної патології по ї-критерію Стьюдента при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Узагальнюючи одержані результати, можна зробити висновок, що Сполука ІІ виявляє виражену терапевтичну дію при ХОБЛ.

Дослідження активності Сполуки І іп мімо на моделі алергічного риніту у морських свинок

Модель алергічного риніту реалізували за стандартною методикою (Іпі. ІттипорнНаптасо!ї., 2013 бер; 17(1):18-25). Морських свинок (250-300 гр) імунізували 4-кратним (на 0, 7, 14 ії 21 добу) внутрішньоочеревинним введенням суміші овальбуміну (100 мкг/свинку) і гідроксиду алюмінію (5 мг/свинку), розведених і суспендованих у фізіологічному розчині. На 28 добу дослідження розчин овальбуміну (60 мг/мл) тваринам вводили інтраназально по 20 мкл у кожну ніздрю. На 35 добу тваринам вводили розчин оовальбуміну (200 мкг/мл, 25 мкл) внутрішньошкірно, попередньо виголивши ділянку шкіри на спині. Підтвердженням наявності сенсибілізації було формування набряку і почервоніння в місці ін'єкції. На 42 добу дослідження проводили інтраназальне введення розчину овальбуміну (60 мг/мл, 20 мкл/ніздрю). З метою контролю формування саме алергічного запалення була сформована група хибноіїмунізованих тварин: на 0, 7, 14 і 21 добу свинки одержували розчин гідроксиду алюмінію (5 мг/свинку), на 28 і 35 добу - фіз. розчин, на 42 добу - овальбумін (60 мг/мл, 20 мкл/ніздрю).

Сполуки І, ПІ, ІМ (0,14, 1,4 мг/кг) вводили тваринам внутрішньошлунково однократно за З год. до останнього інтраназального введення овальбуміну.

Протягом 2 год. після останнього введення овальбуміну проводили оцінку клінічних проявів риніту: підраховували кількість чхань, почісувань носа. Результати досліджень представлені в

Таблицях 6-8.

Облік клінічних проявів алергічного риніту протягом 2 годин опісля останнього інтраназального введення овальбуміну тваринам показав виражене збільшення у експериментальних тварин кількості чхань і почісувань носа, що свідчить про коректність реалізованої моделі алергічного риніту.

Таблиця 6

Клінічні прояви алергічного риніту у морських свинок при терапії тварин Сполукою І (Мет, п-10)

Примітки: 7 - відмінність від інтактної групи по Ї-критерію Стьюдента при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Таблиця 7

Клінічні прояви алергічного риніту у морських свинок при терапії тварин Сполукою ІЇЇ (Мет, п-10)

Кількість чхань/2години Кількість почісувань носа/2 години

Хибна імунізація 5,90,3 10,322,2 20,6:0,97 75,426,57

Сполука ПІ (0,14 мг/кг) 17,8--0,778 32,528,078

Сполука ПІ (1,4 мг/кг) 19,0--1,17 39,929,578

Таблиця 8

Клінічні прояви алергічного риніту у морських свинок при терапії тварин Сполукою ЇМ (Мет, п-10)

Кількість чхань/2години Кількість почісувань носа/2 години

Хибна імунізація 3,25-1,06 6,5:2,33 15,22 20,844,2

Сполука ІМ (0,14 мг/кг) 1,4-0,678. 5,3ж-1,14

Сполука ІМ (1,4 мг/кг) 1,4-0,68 1,8-185

Внутрішньошлункове введення морським свинкам Сполук І, І, ЇМ виражено знижувало кількість клінічних проявів риніту. Одержані результати дають підставу зробити висновок, що

Сполуки І, ІП, ІМ виявляють виражену терапевтичну дію при алергічному риніті.

Дослідження активності Сполуки ! іп мімо на моделі формалін-індукованого гострого риносинуситу у щурів

Індукцію гострого риносинуситу проводили у щурів-самців Вістар шляхом інтраназального введення 20 мкл 7,5 96 формаліну в кожний носовий хід. Сполуку І вводили в дозах 1,8 мг/кгі18 мг/кг щодня один раз на добу, починаючи через 24 год. після введення формаліну, останнє введення відбувалося на 7 добу. Дексаметазон (0,6 мг/кг) вводили в тому ж режимі. На 8 добу здійснювали забір назального змиву. У назальному змиві оцінювали сумарну кількість лейкоцитів і визначали лейкоцитарну формулу.

Аналіз назального змиву показав, що гострий риносинусит супроводжується вираженим припливом лейкоцитів у порожнину носа. Максимальне збільшення було відзначене відносно кількості макрофагів (Таблиця 9).

Внутрішньошлункове введення досліджуваної сполуки щурам знизило вміст макрофагів і нейтрофілів у назальному змиві до рівня інтактних тварин. По виразності дії Сполука | не уступала дексаметазону (Таблиця 9).

Таблиця 9

Кількість клітинних елементів у назальному змиві щурів на моделі гострого риносинуситу (Мет, п-10) гоупи

РУ

34202641 33132632 67-16 55881015 52175980 16210 2915727

М ГИ,в 5а10ж1143 | 51321096 1111 231449

М Цив 249043398. | 24613398 28418.

Дексаметазон 1735ж45178. | 1664-4337. 0-0 68238. 0-0 (0,6 мг/кг)

Примітки: 7 - відмінність від інтактної групи по Ї-критерію Стьюдента при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю по і-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Таким чином, одержані результати показали, що Сполука І виявляє виражену терапевтичну дію при риносинуситі.

Дослідження активності Сполуки І іп мімо на моделі неінфекційного фарингіту у щурів

Модель неінфекційного фарингіту реалізували на щурах-самцях лінії Вістар. Щурам робили анестезію натрій-тіопентоном (50 мг/кг, внутрішньоочеревинно) і в зовнішню яремну вену вставляли канюлю з трубкою з силіконового каучуку Кепавікю (5ІЇ 037, Вгаіпігее Зсіепійіс, Іпс.,

Вгаіпігее, МА) за допомогою гепаринізованого фізіологічного розчину (40 Од/мл). Барвник Еванс блакитний (Емап5 Віце, ЕБ) (30 мг/кг) вводили всім тваринам внутрішньовенно через катетер; через 10 хв. після введення барвника ЕБ на поверхню слизової глотки наносили 30 95 розчин формаліну наступним чином: язик злегка витягали, область глотки відкривали глибоко в порожнині рота за допомогою тупих щипців і обережно стерильним ватяним тампоном 3 рази наносили розчин формаліну (50 мкл) протягом 5 сек. при кожному нанесенні. В інтактній групі застосовували фізіологічний розчин.

Через 60 хвилин після нанесення 30 96 розчину формаліну тварин евтаназували шляхом знекровлювання. Головну частину кожного щура перфузували гепаринізованим фізіологічним розчином (40 Од/мл), щоб видалити внутрішньосудинний барвник ЕБ.

Ступінь запалення оцінювали по тесту ексудації барвника Еванса блакитного (ЕБ). Барвник

ЕБ з тканини екстрагували у формамід при 55 "С протягом 24 годин, і поглинання визначали спектрофотометрично при 620 нм. Кількість барвника в тканині розраховували, використовуючи стандартну криву для барвника Еванса блакитного, і виражали в мікрограмах барвника на грам сирої ваги тканини (мкг/г).

Сполуку І вводили внутрішньошлунково за 24 і 1 год. до нанесення формальдегіду в дозах 6 і 18 мг/кг. Контрольній групі вводили розчин формальдегіду з концентрацією 30 95. Як препарати порівняння використовували дексаметазон і диклофенак. Дексаметазон (0,6 мг/кг) і диклофенак (8 мг/кг) вводили внутрішньошлунково за 24 і 1 год. до нанесення формальдегіду. Результати дослідження представлені в Таблиці 10.

З Таблиці 9 видно, що введення формальдегіду (контроль) приводить до значного збільшення концентрації барвника в тканині, що говорить про запалення глотки у щурів - фарингіт. Досліджувана сполука виявила значний захист від фарингіту, що викликається

Зо формальдегідом. Сполука І виявила дію у всіх тестованих дозах (6 і 18 мг/кг) - концентрація барвника в тканині знизилася в 2,8 і 6,4 разу, відповідно, у порівнянні з контролем. Введення дексаметазону (0,6 мг/кг) також приводило до зменшення запалення: концентрація барвника знизилася в 2,1 разу. Диклофенак ефекту не виявив.

Таким чином, одержані результати показали, що Сполука ! виявляє виражену протизапальну дію при фарингіті

Таблиця 10

Концентрації барвника Еванса блакитного в тканині глотки щурів

Примітки: 1-7 - відмінності статистично значимі в порівнянні з інтактними (р«е0,05); 2 - б - відмінності статистично значимі в порівнянні з інтактними (р«е0,05).

Дослідження активності Сполуки ЇЇ на моделі блеоміцин-індукованого ураження легенів

Модель блеоміцин-індукованого ураження легенів реалізували за стандартною методикою

ІАт. 9. Везріг. Сеї! Мої. Віо!., 2009, М. 41(1). Р. 50-58). Мишам-самцям лінії ВаІр/с однократно ендотрахеально вводили розчин блеоміцину (4 одиниці/кг в об'ємі 50 мкл). Сполуку ЇЇ вводили мишам лінії С57ВІ /Є внутрішньошлунково, дворазово - за 1 год. до введення блеоміцину і через 12 год. після введення блеоміцину. Через 24 год. після введення блеоміцину проводили забір бронхоальвеолярного лаважу. У лаважі оцінювали сумарну кількість лейкоцитів і визначали лейкоцитарну формулу.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполуки ЇЇ знижує приплив клітин запалення в бронхоальвеолярний простір (Таблиця 11).

Це дає підставу зробити висновок, що Сполука ІЇ виявляє протизапальну дію при ураженні легені.

Таблиця 11

Кількість клітинних елементів у бронхоальвеолярному лаважу мишей на моделі блеоміцин-індукованого гострого ураження легенів (М--т, п-10)

Доза Кількість клітинних елементів в 1 мкл бронхоальвеолярного лаважу тин еру (Інтактні | 000-001 151,32523,85 8,512412 0,40-20,30 122,15414,69 0,0020,00 (Контроль | 0-1 412,13265,007 | 212,39237,007 0,00-0,00 199,7434,00 0,0020,00 сполука | 122,34415,968 | 82,77416,8778 0,0020,00 39,5757,9178 0,0020,00

У 199,12246,598. | 55,215212,5378. 0,0020,00 143,90239,26 0,00-0,00

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки ІМ моделі ліпополісахарид-індукованого гострого ураження легенів у щурів

Модель ліпополісахарид-індукованого гострого ураження легенів реалізували за стандартною методикою |Гіп Топо, щіпд Ві, Хіаодап пи, сийапуд УМапод, Уе ім, Гіпуї Копод, Оіп

М/апд,Мио Хи, Міпд 2попо, Оитіпа 2пи, Миапіїп 50п9, Спипхиє Ваї. Кегаїїпосуїе доми Тасіог-2 ів ргоїесіїме іпіророіузассНпагіде-іпдисей асшіе Ішпа іпішту іп гаїв // Вебзрігайїгту РНузіоду 8

Мешгобіоіоду, 2014, М. 201. Р. 7-14). Самкам щурів лінії Вістар ендотрахеально вводили розчин ліпополісахариду (ЛПС), приготовлений на фізіологічному розчині. Тваринам групи хибної патології вводили фізіологічний розчин у тому ж об'ємі. Через 48 год. після введення ЛПС. у тварин відбирали бронхоальвеолярний лаваж (БАЛ). Узяття БАЛ проводили під наркозом шляхом промивання легенів 5 мл підігрітого до 37 "С фізіологічного розчину через трахею за допомогою шприцевого дозатора.

У рідині бронхоальвеолярного змиву за допомогою камери Горяєва підраховували абсолютну кількість клітинних елементів в 17 мкл змиву. Потім бронхоальвеолярний лаваж центрифугували при 200 д протягом 10 хвилин. З осаду клітин приготовляли мазки, які надалі фіксували в метанолі і забарвлювали по Романовському-Гимзі для підрахунку цитограми.

Сполуку ІМ вводили щурам дворазово, внутрішньошлунково, за 1 год. до введення ЛПС і через 24 год. після введення ЛПС.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполуки ЇМ знижує приплив клітин запалення в бронхоальвеолярний простір (Таблиця 12).

Це дає підставу зробити висновок, що Сполука ІМ виявляє протизапальну дію при ураженні легені.

Таблиця 12

Кількість клітинних елементів у бронхоальвеолярному лаважі щурів на моделі ЛПС-індукованого гострого ураження легенів (Мт, п--10)

Доза Кількість клітинних елементів в 1 мкл бронхоальвеолярного лаважу тин | соду інтактні | 7-07 22635311 199259 20632265 патологія

Контроль | - (12937 51837,5'44| З304ж597 96331502 4485581578. 78551818 369926538.

Зо

Примітки: 7 - відмінність від інтактних за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05;

Я - відмінність від групи хибної патології за критерієм Краскела-Уолліса при р«еб0,05; а - відмінність від групи контролю за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки Ії, Сполуки ІМ, Сполуки МІ, Сполуки І на моделі пропасної реакції у щурів

Модель пропасної реакції реалізували за стандартною методикою |У. Мешйгозсі. МеїтоаФв., 2005, М. 147. Р. 29-35). Щурам лінії Умізїаг підшкірно вводили 20 9о суспензії пекарських дріжджів (12 мл/кг). Сполуки І, Ії, ЇМ, МІ, МІ вводили однократно, внутрішньошлунково, через 14 год. після введення дріжджів. Ректальну температуру вимірювали електротермометром до введення пірогену і на найвищій точці розвитку термічної реакції - через 19 год. після нього. Антипірогенна дія сполук досліджувалася в 2-7 експериментах.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення досліджуваних сполук знизило приріст ректальної температури тіла щурів (Таблиці 13-17). Одержані дані дозволяють зробити висновок, що Сполуки І, ЇЇ, ІМ, МІ, МІ виявляють антипірогенну дію.

Таблиця 13

Приріст ректальної температури тіла через 19 год. після підшкірного введення дріжджів щурам, "С (Мі-т, п-30-90) є. . Приріст ректальної

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі температури тіла, "С інтактні Ї77777777717117-11111111Ї1111111111170111 0,05:0,05

Контроль | -:(::р(/-77777777/ ЇЇ 777771717171717179011171 | 1,7020,067 1,18х0,0878.

Сполука І! 11111066 11111130 21 0,78ж0,0778, 1,0920,0678.

Примітки: 7 - відмінність від інтактних за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05.

Таблиця 14

Приріст ректальної температури тіла через 19 год. після підшкірного введення дріжджів щурам, "С (Мі-т, п-30-90) 2. . Приріст ректальної

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі температури тіла, "С інтактні Ї 77777771 Ї11111111111701 0,30ж0,10

Контроль | -:(:О/- 77777 ЇЇ 77777171717179017с1С 1,9020,107

Спопука М 0,018 0,9020,1078. у 1,0020,2078.

Примітки: 7 - відмінність від інтактних по Ї-критерію Стьюдента при р«0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Таблиця 15

Приріст ректальної температури тіла через 19 год. після підшкірного введення дріжджів щурам, "С (Мт, п-40-70) 2. : Приріст ректальної

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі температури тіла, "С інтактні Ї777777777171717-111111111Ї11111111111501111717С1 0,01:50,08

Контроль// | -:(::0г- 77777 ЇЇ 77777771711770111с1с1 1,7020,077 0,018 1,0150,0978. 777111.1006 | 4 г щФ В | 0,8820,1178.

Сполука | 1,0120,0878. 11111066 Її 4 г щ | 0,88ж0,1178. 1,1450,0978.

Примітки: 7 - відмінність від інтактних за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05.

Таблиця 16

Приріст ректальної температури тіла через 19 год. після підшкірного введення дріжджів щурам, "С (Мт, п-40-70) є. . Приріст ректальної

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі температури тіла, "С інтактні Ї777777777171717-111111111Ї11111111111501111717С1 0,03ж0,07

Контроль// | -:(::0г- 77777 ЇЇ 77777771711770111с1с1 1,750,077 0,018 1,18х0,0878. сполєжам 23323231303006........ | ...Ю.Ю.ЮюЮ.Ю.Б.40. | 1,2820,0778. у 1,36:20,057 11117106 Її 4 г щ( 1,2750,0978.

Примітки: 7 - відмінність від інтактних за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05.

Таблиця 17

Приріст ректальної температури тіла через 19 год. після підшкірного введення дріжджів щурам, "С (Мт, п-40-70) 2. : Приріст ректальної

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі температури тіла, "С інтактні Ї77777777717117-11111111Ї11111111111101111 0,320,21

Контроль | («БО - ЇЇ 77777071. 1,8320,117

Сполука МІЇ 1.1620,1278.

Примітки: 7 - відмінність від інтактних за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05; а - відмінність від групи контролю за критерієм Краскела-Уолліса при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки І і Сполуки ЇМ на моделі специфічної больової реакції методом хімічного подразнення очеревини (тест "оцтові корчі")

Модель специфічної больової реакції методом хімічного подразнення очеревини (тест "оцтові корчі") реалізували за стандартною методикою. Для проведення тесту "оцтові корчі" мишам лінії ВаІр/с інтраперитонеально вводили 1 95 оцтову кислоту в об'ємі 10 мл на 1 кг маси тварини. Сполуки І, ІМ, МІЇ, ЇХ, Х вводили внутрішньошлунково, однократно, за 1 год. до введення оцтової кислоти. Оцінювали кількість корчів (судомні скорочення черевних м'язів, що супроводжуються витягуванням задніх кінцівок і прогинанням спини) за 15 хвилин після введення оцтової кислоти.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполук І, ЇМ, МІ, ІХ, Х виражено знижує кількість корчів у мишей, викликаних внутрішньоочеревинним введенням оцтової кислоти (Таблиці 18-19). Одержані результати дозволяють зробити висновок, що

Сполуки І, ІМ, МІЇ, ЇХ, Х виявляють виражену терапевтичну дію при больовому синдромі.

Таблиця 18

Кількість оцтових корчів на моделі специфічної больової реакції методом хімічного подразнення очеревини (тест "оцтові корчі") (Мат, п--10-31) є. й Кількість корчів за 15

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі ХВИПИН

Контроль | (77777771 34,68х2,40 22105214"

Сполука! 13,90х2,237 у 18,65:52,44" 21,15:22,97" 23,60ж52,54"7 сполука М 15,50х2,637 у 19,2053,43" 15,3053,10" 23,6051,87"

Примітки: " - відмінність від групи контролю по Ї-критерію Стьюдента при ре0,05.

Таблиця 19

Кількість оцтових корчів на моделі специфічної больової реакції методом хімічного подразнення очеревини (тест "оцтові корчі") (Мея, п-10-31) є. й Кількість корчів за 15

Група Доза сполуки, мг/кг Кількість тварин у групі ХВИПИН

Контроль | (:567777777777777/Ї777171717171171710с1С у 485,71

Сполука МІ! 17,6ж2,81"

Сполука ІХ 11,6х3,5" 17,23,

Примітки: " - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при ре0,05.

Дослідження активності Сполуки І і Сполуки ЇЇ на моделі термічного больового подразнення "гаряча пластина"

Модель термічного больового подразнення "гаряча пластина" реалізували за стандартною методикою (Вагтої М., Тев5і5 апа тоадеї!5 ої посісеріїоп апа раїп іп годепіб5. Меигозсіепсе, 2012 дип 1; 211:39-501. Сполуку І і Сполуку ЇЇ вводили мишам лінії Ваїр/с внутрішньошлунково, однократно. Через 1 год. після введення препарату проводили тест "гаряча пластина". Для проведення тесту "гаряча пластина" мишей поміщали на гарячу пластину, температура (ї55:1 С) якої постійна. Реєстрували час перших проявів больової реакції у мишей (облизування лап, підскакування) і обчислювали середній латентний час порога больової чутливості (ПБУ, сек.) у кожній групі.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення досліджуваних сполук в 1,5 разу збільшило поріг больової чутливості мишей при проведенні тесту "гаряча пластина" (Таблиця 20).

Одержані дані дозволяють зробити висновок, що Сполука І і Сполука ЇЇ виявляють виражений анальгетичний ефект при больовому синдромі.

Таблиця 20

Поріг больової чутливості (ПБУ) на моделі термічного больового подразнення "гаряча пластина", 9о до значень до введення препарату (М-і-т, п-20)

Через 1 годину, 95 до фону

Контроль.///1777777111111111111111111111111сСсС 12,515,80 101,13х9,647

Сполука | 95,2826,797 104,5558,527 97432643"

Сполука І! 90,5426,597 110,18х11,97

Примітки: " - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при ре0,05.

Дослідження активності Сполуки ІЇ на моделі спонтанного ожиріння у мишей лінії ар/ар

Для моделювання спонтанного ожиріння використовували мишей лінії ар/аБ, які несуть рецесивний ген Іеріїп гесеріог-І ергар-(ар) (8-ма група зчеплення, 4-та хромосома) |Сагаїомазс. ріареті|., 2012, М. 11. Р. 139-147; Віоспет. Віорпуз. Ве5. Соттип., 2016, М. 472. Р. 603-609).

Сполуку ІЇ вводили внутрішньошлунково, починаючи з 7 тижня життя тварин. Щотижня на 6- 12 тижнях життя тварин вимірювали масу тіла тварин.

Результати дослідження показали, що на моделі ожиріння внутрішньошлункове введення

Сполуки ІІ у дозі 7,5 мг/кг мишам знижує приріст маси тіла дБ/46-мишей (Таблиця 21).

Одержані результати говорять про терапевтичну дію Сполуки ІІ при ожирінні. Терапевтичний ефект починається вже на 4 тижні застосування Сполуки ІІ.

Дослідження активності Сполуки ІІ на моделі метаболічного синдрому

Модель метаболічного синдрому реалізували шляхом тримання щурів-самців лінії Умієїаг протягом 16 тижнів на високожировій дієті ("дієта кафетерію") згідно зі стандартною методикою

ІВоїпмеї! М.)., 2госК М.у., Магміск В.Р., Епегуду Баіапсе апа Бргоулп гаї асіїміну іп гаїв тей саїеїегіа дівїє ог підн-таї, зетізупіпеїййс аїеї:5 аї земегаї! Ісмеї5 ої іпіаКе // Меїароїїєт., 1985, Мої. 34(5). Р. 474-4801.

З 10 по 16 тиждень дієти тваринам досліджуваних груп внутрішньошлунково один раз на добу вводили Сполуку ІЇ. Оцінку активності досліджуваної сполуки проводили за допомогою щотижневого вимірювання маси тіла.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполуки І! знижує приріст маси тіла тварин. Фармакологічна дія починає проявлятися, починаючи з 5 тижня терапії (Таблиця 22).

Таким чином, на моделі метаболічного синдрому Сполука ЇЇ знижує ожиріння тварин.

Таблиця 21

Приріст маси тіла тварин відносно початку введення Сполуки ЇЇ на моделі спонтанного ожиріння у мишей лінії 4Б/а6 (Мат)

Групи слона 76 ЇЇ 7 ЇЇ 8 ЇЇ 9 | 70 ЇЇ чт | 12

РУ мл 12200010 ТижнівведенняСполум!.д 00101011 70 ЇЇ 1 1 2 | з | 44 | 5 | 6 70 звоня | ооюв | оаюе | пбоюе| пови | нзаит | паси зюоне |неввл | пеаюх пваах| птовж | ягня | тазик у

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Таблиця 22

Маса тіла щурів на моделі метаболічного синдрому (Мет, п-12) дослідження |Мюітералї Знтаті | Конютоль | ему . Тижні терапії Інтактні Контроль дослідження (1,5 мг/кг) 707 Ї71111- 11111711 245,5045,30 | 25017:3,95 | 239675327 11771111 - 11111111 259,08145,080 | 312,835в,84ч | 29208347 72721111 - 1711 27642620 | 325337 бОчЮ | 30733553 28771111 - 11171 зо5.бЖлЗОю | з45085984чю | Зотова 77477711 - 11111111 3з27.бовОю | зале | 55503950 25171117 - 17 з48,0057Оож | 4095 | зтодожтА 9 7776 |. - 1 з5483к5,бОй | 47133-12,88ЯЮ | 44300570 27771111 - 11111171 забою | 4985138 | 46908638 778. - 17 заїовк5Ою | 52083137 | 491,83360Ж 778, - 1 з597жво0ж | 546,5051478Я; | Бівбобавогя 7715. | .ЮюЮмБ6 юю з984ожо5Ою | б315Оіво | 57О5оЗ'яя

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05;

Я - відмінність від значень на 0 тижні дослідження по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки І і Сполуки ЇЇ на моделі псоріазу у мишей

Індукцію псоріазу у мишей здійснювали за стандартною методикою (Ешгореап Уоигпаї ої

Рпаптасоіоду, 2015, М. 756. Р. 43-51). Мишам-самкам лінії ВаІБ/с наносили крем Алдара (5 90 іміквімод) на внутрішню сторону правого вуха 1 раз на добу по 30 мг/мишу протягом 7 днів (0-6 доба). Інтактним тваринам наносили вазелін. Сполуку І, Сполуку ІЇ ї препарат порівняння (циклоспорин) вводили тваринам внутрішньошлунково, щодня, 1 раз на добу протягом 6 днів (0- 5 доба). Евтаназію проводили через 24 год. (б доба) після останнього нанесення крему

Альдара. Щодня на 0, 2, 3, 4, 5 добу вранці перед черговим нанесенням крему Алдара і перед евтаназією вимірювали товщину правого вуха.

Оцінку виразності псоріазу проводили по вимірюванню приросту товщини ураженого вуха в динаміці.

Результати дослідження представлені в Таблиці 23.

Таблиця 23

Приріст товщини ураженого вуха у визначений день дослідження до 0 дня на моделі псоріазу у мишей, 95 (Мет, п--10) мг/кг інтактні | -- | 486:09 | 7,8х0б98 | 981:183 | 148313

Контроль | -- 1 40,3ж5,37 | 6775797 | 82,659,5 | 2 0159,87

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполуки І і Сполуки ЇЇ на моделі псоріазу у мишей знижує приріст товщини ураженого вуха тварин. Це свідчить про терапевтичну дію Сполук І і ІІ при псоріазі.

Таким чином, на моделі псоріазу у мишей Сполуки І і ІЇ виявляють виражений терапевтичний ефект.

Дослідження активності Сполуки І і Сполуки ІЇ на моделі атопічного дерматиту у мишей

Модель атопічного дерматиту реалізували за стандартною методикою |У. Сіпхепд. Кезв., 2011. Мої. 4. - Р. 479-86)|. Атопічний дерматит моделювали на мишах-самцях лінії Браїр/с. Як індуктор контактного дерматиту використовували 1-хлор-2,4-динітробензол (ДНХБ). На 0 ії 12 добу експерименту тваринам на попередньо виголені ділянки спини наносили 100 мкл 2 95 розчину ДНХБ з метою сенсибілізації організму. На 17 добу на праве "досліджуване" вухо тваринам наносили 20 мкл 2 95 спиртового розчину ДНХБ двічі з інтервалом 1 год. Інтактним тваринам замість розчину ДНХБ наносили етанол. Тварин у групі хибної імунізації сенсибілізували етанолом. Сполуку І і Сполуку ІІ вводили внутрішньошлунково один раз на добу з 8 по 17 добу. На 18 добу проводили забій тварин. Для оцінки ступеня набряку після евтаназії визначали масу "досліджуваного" і "контрольного" вуха. Обчислювали індекс реакції (ІР), виражений у відсотках різниці в масах "досліджуваного" і "контрольного" вуха.

Результати дослідження представлені в Таблиці 24.

Таблиця 24

Різниця маси "досліджуваного" і "контрольного" вуха мишей і індекс реакції на моделі атопічного дерматиту у мишей (Мет, п-12) контрольного" вуха (мг)

Примітки: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05;

Я - відмінність від групи хибної імунізації по Ї-критерію Стьюдента при реб0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Результати дослідження показали, що внутрішньошлункове введення Сполуки І і Сполуки ІЇ на моделі атопічного дерматиту у мишей знижує індекс реакції патологічного процесу. Це свідчить про терапевтичну дію Спольук І і ІІ при атопічному дерматиті.

Таким чином, на моделі атопічного дерматиту у мишей Сполуки І і ІЇ виявляють виражений терапевтичний ефект.

Дослідження впливу Сполуки ЇЇ на хемотаксис макрофагів іп мімо на моделі карагенінового мішечка

Для оцінки ефективності дії лікарського препарату на активність клітин імунної системи на доклінічному етапі досліджень як правило використовуються різні моделі гострого запального процесу. На сьогоднішній день найбільш часто використовують моделі, у яких патологічний

Зо процес розвивається в обмеженій порожнині. Дані моделі дозволяють досить близько зімітувати захворювання при якому аберантна активність клітин імунної системи локалізується в певній порожнині (перитоніт, холангіт, артрит) (9. Рпагтасої. Тохісої. Меїподз, 1994 Мом; 32(3):139-47).

Модель карагенінового мішечка часто використовується на доклінічному етапі досліджень для дослідження патологічних процесів, пов'язаних з аберантною активністю клітин імунної системи, локалізованою в ізольованій порожнині. У цій моделі, ізольований мішечок формується підшкірною ін'єкцією повітря у внутрішньокапсульну область спини миші або щура. Підшкірна ін'єкція повітря в область спини за декілька днів приводить до морфологічних змін у клітинній вистілці мішечка. Мішечок складається головним чином з макрофагів і фібробластів і добре васкуляризований. На шостий день від моменту формування повітряного мішечка в порожнину повітряного мішечка вводять розчин А-карагеніну. Карагенін взаємодіє з рецепторами ТКА на поверхні макрофагів, що вистилають внутрішньокапсульну область мішечка, що викликає їх активацію і наступний синтез хемокінів і інших медіаторів (1-1; 11 -6; ТМЕа, І--8, простагландинів і лейкотриєнів, МО) і так само міграцію клітин імунної системи усередину мішечка.

Дослідження активності Сполуки ІІ виконували на мишах-самцях лінії ВаІр/с за стандартною методикою (Сигт. Ргоїос. Рпаптасої., 2012 Маг; Спаріег 5:Опії5.6). Досліджуваним групам тварин внутрішньошлунково вводили Сполуку Ії у дозі З мг/кг відразу перед введенням карагеніну і потім кожні 10-12 год. Останнє введення - за 12 год. до забою.

Через 48 годин після ін'єкції А-карагеніну окремі групи тварин піддавалися евтаназії інгаляцією СО». Відразу ж після евтаназування усередину мішечка стерильним шприцом 250 вводили 1 мл фізіологічного розчину, що містить 5,4 ММ ЕОТА, кімнатної температури. Після легкого масажу області повітряного мішечка робили сагітальний розріз поперек мішечка і дозатором збирали ексудат у стерильні пробірки об'ємом 15 мл. В ексудаті за допомогою камери Горяєва визначали абсолютну кількість клітинних елементів на 1 мкл змиву (цитоз).

Потім ексудат центрифугували при 200 д протягом 10 хвилин. З осаду клітин приготовляли мазки, які надалі фіксували в метанолі (5 хв.) і забарвлювали по Романовському-Гимзі (40 хв. при 1 20-22 "С). На мазках рутинним способом під мікроскопом ОІутризх Бх51 (на збільшенні 100) підраховували кількість макрофагів. Підрахунок клітин робили до 100 шт.

Проведені дослідження показали, що застосування Сполуки Ії в 10 разів знизило приплив лейкоцитів і макрофагів (до рівня інтактного контролю) (Таблиця 25). Таким чином, Сполука ІЇ може мати потенціал для терапії широкого ряду захворювань, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, перитоніти і артрити.

Таблиця 25

Кількість клітин імунної системи в ексудаті з карагенінового мішечка при дослідженні активності

Сполуки ЇЇ на моделі хемотаксису макрофагів (карагеніновий мішечок), х109/л (Мет, п--10) 7 - відмінності статистично значимі в порівнянні з інтактними (р«е0,05); а - відмінності статистично значимі в порівнянні з контрольними (р«е0,05).

Дослідження впливу Сполуки ЇЇ на хемотаксис макрофагів іп ммо на моделі тіогліколятного перитоніту

Дослідження виконане на мишах-самцях лінії баіІр/с за стандартною методикою (у. І ейКос.

Віо!., 2009 Ацо; 86(2):361-70). Мишам контрольної групи внутрішньоочеревинно вводили 2 мл З

Фо тіогліколевого середовища, що зберігалося протягом 1 місяця. Інтактним тваринам внутрішньоочеревинно вводили 2 мл фізіологічного розчину. Досліджуваним групам тварин внутрішньошлунково вводили Сполуку ЇЇ за 1 год. до введення тіогліколяту, 24 і 48 год. після введення тіогліколяту в дозі 1 мг/кг. Через 72 год. тварин евтаназували в СОг-камері, область очеревини змочували 70 95 спиртом, акуратно зрізали шкіру на черевній порожнині, шприцом

Зо внутрішньоочеревинно вводили 5 мл холодного фосфатно-сольового буфера, що містить 0,1 95

ЕДТО. Після легкого масажу черевної порожнини ексудат збирали шприцом у пробірки, визначали об'єм зібраного ексудату. В ексудаті за допомогою камери Горяєва визначали абсолютну кількість клітинних елементів на 1 мкл змиву (цитоз). Потім ексудат центрифугували при 200 д протягом 10 хвилин. З осаду клітин приготовляли мазки, які надалі фіксували в метанолі (5 хв.) і забарвлювали по Романовському-Гимзі (40 хв. при Її 20-22 С). На мазках рутинним способом під мікроскопом ОіІутри5 рх51 (на збільшенні 100) підраховували кількість моноцитів/макрофагів. Підрахунок клітин робили до 100 шт.

Проведені дослідження показали, що застосування Сполуки ІЇ знижує приплив макрофагів у перитонеальну порожнину щурів, індукований З 95 тіогліколевим середовищем, і знижує тяжкість патології, індукованої введенням тіогліколевого середовища (Таблиця 26).

Таким чином, Сполука І може мати потенціал для терапії перитонітів, хвороби Крона і виразкового коліту.

Таблиця 26

Кількість клітин імунної системи в ексудаті з черевної порожнини при дослідженні активності

Сполуки ІЇ на моделі хемотаксису макрофагів (тіогліколятний перитоніт), х109У/л (Мет, п-10)

Групи Кількість клітинних елементів в 1 мкл ексудату, х109У/л

РУ Лейкоцити Моноцити 0,71ж0,09 0,6120,07

Контроль 3,99530,427 3,660,447

Сполука ІІ (1 мг/кг) 1,97-0,3678. 0,65:0,1285. 7 - відмінності статистично значимі в порівнянні з інтактними (р«е0,05); а - відмінності статистично значимі в порівнянні з контрольними (р«е0,05).

Дослідження активності Сполуки ІІ і Сполуки І на моделі ад'ювантного артриту, індукованого введенням повного ад'юванту Фрейнда

Модель ад'ювантного артриту реалізували на безпородних щурах-самцях за стандартною методикою (Спет. Рпапт. Виї. (ТоКусо), 2018, М.66(4). Р.410-415). На 0 ї 5 добу в праву задню кінцівку тварин субплантарно вводили повний ад'ювант Фрейнда (Ргейпа5 Адімапі, Сотрівєїє (Ріегсе)) в об'ємі 100 мкл на тварину. Об'єм правої задньої лапи (ураженої) і лівої задньої лапи (контрлатеральної) вимірювали на 0, 14, 16, 18, 21, 25, 28 і 30 добу за допомогою плетизмометра (до Вазеї). По зміні об'єму ураженої лапи робили висновок про первинну (запальну) реакцію, по зміні об'єму контрлатеральної лапи робили висновок про вторинну (імунну) реакцію. Сполуку ЇЇ вводили внутрішньошлунково, щодня, 1 раз на добу, з 14 по 30 дослідження.

Результати дослідження представлені в Таблицях 27-28.

Проведене дослідження показало, що застосування Сполуки І знижує приріст об'єму як ураженої лапи, так і контрлатеральної лапи. Це дозволяє зробити висновок про наявність у

Сполуки ІЇ як протизапальної дії, так і імунотропної дії. Таким чином, Сполука ІЇ має високий терапевтичний потенціал для лікування ревматоїдного артриту і інших видів артритів, а також артрозів.

Таблиця 27

Приріст об'єму ураженої лапи на моделі ад'ювантного артриту, індукованого введенням повного ад'юванту Фрейнда, 9о (Мет, п-10)

Доза Приріст об'єму ураженої лапи, 95 до вихідного рівня

Група м 14 доба 16 доба 18 доба 21 доба 25 доба 28 доба 30 доба

Я нтактнії | | 850,8 1,9:50,7 1.450,3 1.9ж0,4 2.250,2 2їх0,2 (Контроль | 00001 122,3-6,47 | 118,7-5,67 | 1143821" 98,9-3,27 | 100,6ж2,6и | 102,5.41,87 | 101,4ж2,87

Сполука ЇЇ 118,8ж53,67 | 105253,2и | 104,4ж2,778 | 86,3ж3,98: | 88,5ж2,4785: | 86,9-2,3785. | 83,252,278

Примітка: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по ї-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Таблиця 28

Приріст об'єму контрлатеральної лапи на моделі ад'ювантного артриту, індукованого введенням повного ад'юванту Фрейнда, 95 (Ме-т, п--10)

Доза Приріст об'єму контрлатеральної лапи, 95 до вихідного рівня

Група м 14 доба 16 доба 18 доба 21 доба 25 доба 28 доба 30 доба

ІІнтактні (| 00000001 71,2750,3 | 1,59-40,48 | 1,77-0,25 1,6250,31 2,1850,3 2,16-0,16 2,9850,3 (Контроль | 0001 5,4820,587 | 7,08.1,247 | 21,6941,287 | 25,2941,697 | 20,1621,667 | 18,751,137 | 17,5141,597

Сполука ЇЇ 5,39-1,677 | 6,75ж1,587 | 1848-15 | 19,77к1,6778, |15,45541,2158|14,04ж21,7578|13,0220,9478,

Примітка: " - відмінність від групи інтактних по І-критерію Стьюдента при ре0,05; а - відмінність від групи контролю по І-критерію Стьюдента при р«е0,05.

Дослідження активності Сполуки ІІ на моделі карагенінового набряку

Для оцінки впливу Сполуки ІЇ на функціональний статус імунної системи була використана модель карагенін-індукованого набряку лапи щурів. Експерименти виконані на білих нелінійних самцях щурів масою 250-270 г. Гостре запалення лапи у щурів викликали інтраплантарним введенням (підшкірно) в об'ємі 0,1 мл у праву лапу 1,5 95 розчину карагеніну. Досліджувану сполуку вводили внутрішньошлунково за 1 годину до введення карагеніну. Дію Сполуки І і контрольної речовини (диклофенак) оцінювали по ступеню зниження набряку лапи в порівнянні з інтактною лівою лапою. Об'єм лапи оцінювали до введення Сполуки ЇЇ і через 2 год. після введення карагеніну.

Результати дослідження представлені в Таблиці 29.

Таблиця 29

Вплив Сполуки ІІ на гальмування приросту набряку лапи щурів (відносно контролю) у моделі карагенін-індукованого набряку оте ф|ченинння! ЖЕО подо (Рені

Група Індукція патології : проведення |приросту набряку, препаратів й 5 оцінки /о пнтактнї///// ЇЇ 77771111 0 0 мг/кг) введення в об'ємі шлунково, введення

Сполука І (0,18 0,1 мл у праву лапу) однократно, за 1 й карагеніну 34 1,5 95 розчину год. до введення НЕ . 42 натрію (8 мг/кг)

З наведених результатів видно, що Сполука ІЇ має пряму гальмуючу дію на приріст набряку лапи і може бути використана для лікування широкого ряду захворювань, пов'язаних з активністю клітин імунної системи.

Вивчення активності Сполуки ІІ у моделі діабетичної нефропатії у щурів

Модель діабетичної нефропатії у щурів індукували тривалим триманням тварин на раціоні високожирової дієти і одноразовим або дворазовим внутрішньоочеревинним введенням стрептозотоцину в дозі 30 мг/кг (Іпі. У. Сіїп. Ехр. Меа., 2015 Арг 15; 8(4):6388-96).

Тварин тримали на високожировій дієті протягом 16 тижнів, на 9 тижні щурам внутрішньоочеревинно вводили стрептозотоцин дворазово (2 дня підряд) у дозі ЗО мг/кг. Через 7 днів після введення стрептозотоцину починали введення Сполуки Ії. Субстанцію вводили щодня внутрішньошлунково один раз на день у дозі 50 мг/кг.

Внутрішньошлункове введення Сполуки ІЇ починаючи з 10 тижня дослідження, знизило добовий вміст білка в сечі експериментальних тварин до рівня інтактного контролю (Таблиця 30). Одержані результати дозволяють зробити висновок, що Сполука ІЇ виявляє терапевтичну дію при діабетичній нефропатії.

Коо)

Таблиця 30

Біохімічний аналіз сечі після 6 тижня внутрішньошлункового введення Сполуки ІЇ щурам у моделі діабетичної нефропатії, індукованої високожировою дієтою і введенням стрептозотоцину (15 тижнів високожирової дієти)

Доза і режим Кількість | й, Добовий білок, | АСК (білок(мкг/л)

Групи введення тварин Діурез, мл/18 год. мкг/8 го /креатинін(мг/л) стретозотоцину р д. Р інтактні | 7-77 8 | ющ 435:50,5 1041,25153,5 273,2468,0 дворазово

Сполука 30 мг/кг, 12 7,451, 1846,34337,6'8. | 202,3526,88

ІІ (5 мг/кг) дворазово " -відмінності статистично значимі в порівнянні з інтактними (р«0,05); а -відмінності статистично значимі в порівнянні з контрольними (р«е0,05).

Незважаючи на те, що винахід описаний з посиланням на варіанти втілення, що розкриваються, для фахівців у даній галузі повинно бути очевидно, що конкретні докладно описані експерименти наведені лише з метою ілюстрації даного винаходу і їх не слід розглядати як яким-небудь чином обмежуючі обсяг винаходу. Повинно бути зрозуміло, що можливе здійснення різних модифікацій без відхилення від суті даного винаходу.

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування сполук загальної формули (А): нм МН « Кк АХ К ех М Н н А) у якій Ві являє собою групу -С(0)-Н2-С(О0)- або -Н2-С(0)-, де Ко» являє собою групу -(СНг)п-, необов'язково заміщену одним або двома С1-Св-алкілами, або феніл, п являє собою ціле число від 0 до 4; причому сполуки вибрані з групи, що складається зі сполук формул: ул о о нау ,;- о о -- Мі М лк ни у жлєруєх МІ КА МАХ р, М о М о І! М м м, МІ ї ї м; ! що, ; Й, М М / Ї о Ї Х ие (е) о и, ПІ МИ -щ- со, М / Ї (є) (в) | У у о о чу ІМ ІХ -щ- в

У о / о що Мн о сі : : і М М М м; х ке о М ши; та й з або їх фармацевтично прийнятних солей, гідратів або сольватів для попередження і/або лікування розладу, вибраного із больового синдрому, бронхіальної астми, гострого або хронічного бронхіту, фарингіту, емфіземи легені, риніту, риносинуситу, хронічної обструктивної хвороби легенів або гострого ушкодження легенів, пропасниці, атопічного дерматиту, псоріазу, хвороби Крона, виразкового коліту, ожиріння, метаболічного синдрому, неалкогольної жирової хвороби печінки, нефропатії і перитоніту.

2. Застосування фармацевтичної композиції за п. 1, яке відрізняється тим, що розлад являє собою діабетичну нефропатію.

3. Застосування за п. 1 або 2, де лікування розладу додатково включає застосування іншого активного агента.

4. Застосування за п. 3, де інший активний агент вибраний із групи, що включає антибактеріальні, цитостатичні, цитотоксичні засоби, засоби пригнічення симптомів або побічних ефектів активних агентів і їх комбінації.

5. Спосіб лікування розладу, вибраного із больового синдрому, бронхіальної астми, гострого або хронічного бронхіту, фарингіту, емфіземи легені, риніту, риносинуситу, хронічної обструктивної хвороби легенів або гострого ушкодження легенів, пропасниці, атопічного дерматиту, псоріазу, хвороби Крона, виразкового коліту, ожиріння, метаболічного синдрому, неалкогольної жирової хвороби печінки, нефропатії і перитоніту, який включає введення суб'єкту, що потребує лікування, терапевтично ефективної кількості сполуки формули (А): 1 Х «і - А Ж раки М МОм М Н Н ;(д) у якій Ві являє собою групу -С(0)-Н2-С(О0)- або -Н2-С(0)-, де Ко» являє собою групу -(СНг)п-, необов'язково заміщену одним або двома С1-Св-алкілами, або феніл, п являє собою ціле число від 0 до 4; причому сполуки вибрані з групи, що складається з наступних сполук: фін о о ня МН о о не рома рив; 7" ту І М М МІ - с М М Н Н ; М о М о Ба М Ще Ба Н Нн М М М І! М М м, МІ М М М; н ! як, ; й, М (о) М МН о о ни / Ї Ї х Гл ту ПІ МІ! - с М (о) (в) М МН (9) о ни / ГУ 7 щ ІМ ІХ -- по у вл / | о ще чн (о) « : : У М м тр; х 4 ке М ше та й з Зо або її фармацевтично прийнятної солі, гідрату або сольвату.

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що розлад являє собою діабетичну нефропатію. 20006 з ГТ інтактні 18000 - т ШІ Контроль - 1900- вв Сполука! (ЛЯ ме ше Мої Ше КЗ Сполука! (14 мин ай ода в: ще р ик ща оо пок Спопука! 114 мок в Б дя лап Бо ие я Й Ж -- 0 вдо Ох Ж Ж - й ТОВ КИ І 57. ще -к 800. хо Ж жк ніш ше а а вуука ва СН 1 Бу щи пове Ех ч со: хх кАд ля В моб ВЕ «ув ! С ак па г. с: вен жо ВВ А Я ще Я ОЗ ше що є а що Я 0 НВ , Ето МАКИ Се ннтріїн ОК ша я ЧУ г НК сх: ВОМ Хм я о То КРАВ ЗУ шк Дейкоцити Еозинофіли Нейрофіли Макрофаги

Фіг. 1