WO2017078577A2 - Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний - Google Patents

Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2017078577A2
WO2017078577A2 PCT/RU2016/050066 RU2016050066W WO2017078577A2 WO 2017078577 A2 WO2017078577 A2 WO 2017078577A2 RU 2016050066 W RU2016050066 W RU 2016050066W WO 2017078577 A2 WO2017078577 A2 WO 2017078577A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
influenza
protein
attenuated
vector
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/050066
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2017078577A3 (ru
Inventor
Андрей Юрьевич ЕГОРОВ
Борис ФЕРКО
Артем Александрович КРОХИН
Юлия Романовна РОМАНОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EA201792083A priority Critical patent/EA037571B1/ru
Priority to CU2018000035A priority patent/CU24580B1/es
Priority to JP2017560329A priority patent/JP6692835B2/ja
Priority to UAA201709223A priority patent/UA125333C2/ru
Priority to KR1020177036573A priority patent/KR102604877B1/ko
Priority to CA2991023A priority patent/CA2991023A1/en
Priority to EP16862552.3A priority patent/EP3382010A4/en
Priority to MX2017015462A priority patent/MX2017015462A/es
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority to SG11201709122VA priority patent/SG11201709122VA/en
Priority to CN201680033797.2A priority patent/CN108026515B/zh
Priority to AU2016350939A priority patent/AU2016350939B9/en
Priority to US15/566,202 priority patent/US10392604B2/en
Priority to BR112017025435A priority patent/BR112017025435A8/pt
Publication of WO2017078577A2 publication Critical patent/WO2017078577A2/ru
Publication of WO2017078577A3 publication Critical patent/WO2017078577A3/ru
Priority to IL255259A priority patent/IL255259B/en
Priority to ZA201803649A priority patent/ZA201803649B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • This invention relates to the field of medicine and virology, in particular, to an attenuated chimeric virus of group A, an attenuated influenza vector based on the virus and their use for the prevention and / or treatment of diseases of an infectious nature, as well as for the treatment of cancer.
  • influenza infection is characterized by the most severe pathology and causes the greatest damage to public health and the economy. Periodically appearing new pandemic strains, to which there is no population immunity, turn the flu into a particularly dangerous infection. It is known that the Spanish flu of 1918 caused the death of 30 to 50 million people. Currently, according to the World Health Organization (WHO), during seasonal epidemics, up to 20% of people with influenza get sick every year around the world. of the population, including 5-10% of adults and 20-30% of children (World Health Organization [Electronic resource]. URL: http: // www. who .int / biologicals / vaccines / influenza / en / (accessed 28.03. 2016)).
  • Existing vaccines can be divided into two types: attenuated (live, containing whole and active viruses that exhibit low pathogenicity) and inactivated (containing fragments of viral particles or whole inactive viruses).
  • live viruses capable of replicating in the infected host elicit a strong and lasting immune response against the expressed antigens of these viruses. They effectively elicit both humoral and cellular immune responses, and also stimulate immunological responses mediated by cytokines and chemokines. Therefore, live attenuated viruses have certain advantages over vaccine compositions based either on inactivated immunogens or on individual immunogen subunits, which, as a rule, stimulate only the humoral part of the immune system.
  • viruses of different families can be used as vectors expressing foreign genomic sequences.
  • the use of vectors is possible in cases where traditional killed or live vaccines cannot be obtained, or their effectiveness does not allow to control a particular disease.
  • viral vectors occupy a special place because of antigens: they have a natural mechanism of interaction with the cell and penetration into it, transfer foreign genetic material to the cytoplasm or the nucleus of the cell, are capable of providing long-term expression of the antigen, the viral membrane protects the nucleic acid encoding the transgene introduced.
  • Poxviridae poxviridae
  • NDV Newcastle disease virus
  • AdV adenoviruses
  • the vaccinia virus is the most popular, the advantages of which include the simplicity and low cost of production, as well as its high packing capacity (up to 25 kb) [J. Gen. Virol. 2005. V. 86. N! 11. P. 2925-2936].
  • a serious drawback of vaccinia virus-based vectors is the preexisting immunity to this virus, which is present in parts in the human population as a result of vaccination against smallpox. Therefore, it is advisable to use vectors based on poxviruses such as canary pox virus (Sapaguroch) and poultry smallpox virus (Flo pox).
  • NDV vaccine vector A significant drawback of the NDV vaccine vector is that the consequences of administering recombinant NDV are not well understood and it is not clear whether NDV vaccines are safe for humans.
  • NDV is characterized by low packing capacity and the difficulty of obtaining vectors carrying several target antigens [Chem. Biodivers. 2010. V 7. W- 3. P. 677- 689].
  • Adenoviruses also have several disadvantages that limit their use as vectors for gene transfer.
  • adenoviral vectors The main disadvantages of adenoviral vectors the following are considered: (1) the heterogeneity of the distribution of viral receptors on the cell surface in the body, which makes many cells insensitive to adenovirus infection (2) the presence of a powerful protective population immunity to known adenoviral vectors (3) the theoretical possibility of integrating the DNA of the adenovirus genome into human chromosomes ( Stephen SL, Montini E, Sivanandam VG, Al-Dhalimy M, Kestler HA, Finegold M, Grompe M, Kochanek S. Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo. J Virol. 2010 Oct; 84 (19): 9987-94. doi: 10.1128 / JVI .00751-10. Epub 2010 Aug 4.)
  • Vectors derived from the influenza virus have several advantages over other viral vectors, because:
  • Influenza viruses do not have a DNA phase in their replication cycle and cannot integrate into the human or animal genome.
  • Influenza virus causes a systemic and mucosal B and T cell response to its antigens when infected cells of the human respiratory tract.
  • influenza virus Many different subtypes of influenza virus are available. Since antibodies against a variety of these subtypes do not have cross-reactivity, preexisting immunity to the viral vector in the host, which is often a problem in the case of other live vectors, can be circumvented. Effective booster immunizations with different subtypes of influenza viruses expressing the same antigens are also possible.
  • Influenza viruses belong to the family Ortomyxoviridae, which includes the genera Influenza A, B, C.
  • the genomes of influenza A and B viruses have a similar structure consisting of 8 genomic RNA fragments of negative polarity: PB2, PB1, RA, HA, NA, NP, M and NS (Chou YY, Vafabakhsh R, Doganay S, Gao Q, Ha T, Palese P.
  • One influenza virus particle packages eight unigue viral RNAs as shown by FISH analysis. Proc Natl Acad Sci US A. 2012 Jun 5; 109 (23) : 9101-6. Doi: 10.1073 / pnas .1206069109. Epub 2012 Apr 30).
  • the polymerase complex PB2, PB1, PA transcribes one messenger RNA (mRNA) from each genomic fragment translated into the protein of the same name.
  • messenger RNAs can alternatively be spliced to form mRNAs encoding M2 and NEP proteins, respectively. All proteins, with the exception of protein NS and PBl-f2 (not available in all strains), are structural components of viral particles.
  • An unstructured NS1 protein accumulates in the cytoplasm of infected cells and has the function of an inhibitor of the interferon system (Krug RM. Functions of the influenza A virus NS1 protein in antiviral defense. Curr Opin Virol. 2015 Jun; 12: 1-6. Doi: 10.1016 /. Coviro. 2015.01.007. Epub 2015 Jan 29. Review).
  • the fragmented nature of the genome of the influenza virus allows the formation of reassortants of the influenza virus - viruses that have fragments of the genome of mixed origin from different strains. This is one of the mechanisms of the antigenic diversity of influenza viruses in nature and the cause of pandemic influenza viruses.
  • Antigenic properties of influenza virus are determined by surface glycoproteins that form spikes on the surface of virions - hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
  • the HA molecule is responsible for the mechanisms of attachment of the virus to the sialic receptors of the cell and fusion of the viral and cell membranes for the penetration of the genome into the cytoplasm and cell nucleus.
  • HA is cleaved (activated) by cellular proteases into two subunits - HA1 and HA2, which remain connected by a disulfide bond (Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion.
  • the HA molecule consists of two parts: the globular, formed by the HA1 subunit, and the stem, which consists mainly of the HA2 subunit and partially HA1.
  • the globular portion includes a receptor-binding site and five antigenic sites and is the main target for antibody formation. Antibodies that block the binding of the virus to the receptor are neutralizing.
  • HA1 subunit is characterized by high variability.
  • the stem part of HA is located in close proximity to the viral membrane and is characterized by weak immunogenicity.
  • the HA2 subunit plays a major role in ensuring the fusion of the viral membrane with the endosomal and is highly conservative.
  • HA subtypes and 11 NA subtypes are currently known for influenza A virus.
  • the subtypes of HI, H2, H5, Hb, H8, H9, NI, H12, H13, H16, H17, H18 belong to the first group, and NZ, H4, H7, NJ, H14 and H15 belong to the second group.
  • seroptypes of HI, H2 and NS of influenza A virus and various antigenic variants of influenza B virus are capable of spreading in the human population, causing pandemics or seasonal influenza epidemics.
  • the specific immunity generated after a disease or vaccination with one seropodotype weakly protects against infection with another seropodotype of influenza A virus. Immunity to any seropodotype of influenza A virus does not protect against influenza B virus and vice versa, immunization against influenza B is not effective against influenza A. In this regard, there is an urgent need to create a universal influenza vaccine effective against all known antigenic varieties of influenza A and B.
  • the basis of the unusually fast variability of the influenza virus, and hence its escape from the action of neutralizing antibodies, is based on two mechanisms: 1) the accumulation of point mutations leading to a change in the antigenic structure of surface glycoproteins (antigenic drift) and 2) reassortment of genomic segments. They lead to the emergence of new antigenic variants of the virus. (antigenic shift) that can cause a pandemic.
  • influenza vaccines have a low risk of immunization for the elderly and young children (Jefferson T, Rivetti A, Di Pietrantonj C, Demicheli V, Ferroni E. Vaccines for preventing influenza in healthy children. Cochrane Database Syst Rev 2012; 8, CD004879 .;
  • influenza vaccines - inactivated (whole-virion, split or subunit) or live (attenuated cold-adapted) - are mainly aimed at creating immunity to the globular part of HA.
  • the stem part of HA is conservative among influenza A viruses (group I and II) and B.
  • group I and II influenza A viruses
  • B influenza B virus
  • direct neutralization is associated with the prevention of conformational changes in HA, which is necessary for the release of the fusion peptide and the subsequent integration of the endosomal and viral membranes to deliver the viral genome into the cell.
  • the second mechanism of direct neutralization is associated with the prevention of activation cleavage of HA into HA1 and HA2 subunits using antibodies that interact with the HA site in the immediate vicinity of the cleavage site.
  • Indirect neutralization mechanisms involve antibody-dependent and complement-dependent cytotoxicity (Terajima M, Cruz J, Co MD, Lee JH, Kaur K, rammert J, Wilson PC, Ennis FA. Complementary dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies. J Virol 2011; 85, 13463-7 .; Jegaskanda S, Weinfurter JT, Friedrich TC, Kent SJ. Antibody-dependent cellular cytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virus infection of macaques. J Virol 2013; 87 5512-22).
  • Antibodies to the stem region of HA during vaccination are practically not formed and are detected in small quantities only after a natural infection (Moody MA, Zhang R, Walter EB, Woods CW, Ginsburg GS, McClain MT, Denny TN, Chen X, Munshaw S, Marshall DJ, Whitesides JF, Drinker MS, Amos JD, Gurley TC, Eudailey JA, Foulger A, DeRosa KR, Parks R, Meyerhoff RR, Yu JS, Kozink DM, Barefoot BE, Ramsburg EA, Khurana S, Golding H, Vandergrift NA, Alam SM, Tomaras GD, Kepler TV, Kelsoe G, Liao HX, Haynes BF . H3N2 influenza infection elicits more cross-reactive and less clonally expanded anti-hemagglutinin antibodies than influenza vaccination. PLoS ONE 2011; 6, e25797).
  • HA2 subunits Three-fold immunization of mice with peptides representing the HA2 ectodomain (23-185 amino acid residues) or a fusion peptide (1-38 amino acid residues), in combination with KLH adjuvants (keyhole ⁇ impet hemocyanin) and Freund, induced cross-reactive immunity, which reduces the death of animals during lethal heterologous strain infections (Stanekova Z, Kiraly J, Stropkovska A, Mikuskova T, Mucha V, Kostolansky F, Vareckova E.
  • mini-HA stable constructs obtained by genetic engineering based on the amino acid sequence of the stem portion of the HA seropodotype H1N1 virus. Only the constructions with the highest affinity for antibodies with neutralizing activity of a wide spectrum were selected from the large collection.
  • mice with such constructs also protected animals from death when infected with a strain of group I, the highly pathogenic avian influenza virus H5N1 (Impagliazzo A, Milder F, Kuipers H, Wagner MV, Zhu X, Hoffman RM, van Meersbergen R, Huizingh J, Wanningen P, Verspuij J, de Man M, Ding Z, Apetri A, Kukrer B, Sneekes-Vriese E, Tomkie icz D, Laursen NS, Lee PS, Zakrzewska A, Dekking L, Tolboom J, Tettero L, van Meerten S, Yu W, Koudstaal W, Goudsmit J, Ward AB, Meijberg W, Wilson IA, Radosevic K.
  • H5N1 the highly pathogenic avian influenza virus H5N1
  • Nanoparticles were added to the animals two or three times intramuscularly with the addition of a new SAS adjuvant (Sigma Adjuvant System). Despite the lack of production of neutralizing antibodies after immunization with nanoparticles, both mice and ferrets were completely protected against death when infected with highly pathogenic avian influenza virus seropodotype H5N1.
  • One of the modern technologies for producing a live vaccine is based on the construction of vaccine vectors in which one virus expresses antigens of another virus.
  • Various DNA-containing viruses are used as vectors expressing influenza antigens, namely: adenovirus, herpes virus, baculovirus or poxvirus (Dudek T, Knipe DM. Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors.
  • adenoviral vector using an adenoviral vector, it was shown that triple immunization with a plasmid (50 ⁇ g) containing sequences of conserved NP and M2 viruses of influenza A virus, followed by intranasal infection with two adenoviral vectors expressing the same proteins, completely protected mice and ferrets from death and loss weight when infected with virulent virus A / EM / 1/47 (H1N1) or highly pathogenic strain of avian influenza virus seropodotype H5N1.
  • influenza viruses as vectors for the delivery and expression of extraneous genomic sequences in cells of the respiratory tract of animals.
  • NS genomic fragment is able to stably hold genomic inserts of more than 800 nucleotides in the reading frame of the NS1 non-structural protein, without disrupting the structure of the resulting virions (Kittel C r Sereinig S, Ferko B r Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfer A, Katinger H, Egorov A.
  • influenza A virus-based influenza vectors were obtained that encoded a short reading frame from 80 to 126 amino acid residues of the NS1 protein, which could be continued by inserting antigen sequences of various pathogens of bacterial and viral nature, e.g.
  • Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT- 6 protein induce CD4 + Thl immune response and protect animals against tuberculosis challenge.
  • NS1-124 vectors constructs bearing an NS1 protein shortened to 124 amino acid residues (hereinafter NS1-124 vectors)
  • NS1-124 vectors Ferko B r Stasakova J, Romanova J, Kittel Cr r Sereinig Katinger H, Egorov turned out to be optimal in reproduction parameters in chicken embryos and immunogenicity in animals
  • PubMed PMID 15542655 / PubMed Central PMCID: PMC524997.
  • NS1 protein designed with a large shortening of the NS1 protein had reduced ability to grow in interferon competent cells (MDCK cells, A549), including 10-day chicken embryos, and were suitable for production only in interferon-deficient Vero cells.
  • vectors with an NS1 length of 124-126 amino acid residues varied in attenuation and were not safe enough in animals.
  • reproduction rate viral vectors carrying the ESAT-6 mycobacterial protein in the indicated position in the lungs of mice could reach values close to those of pathogenic influenza viruses (10 4 or more virus particles per gram of lung tissue).
  • vectors NS1-124 at an infectious dose> 5.0 log / mouse could cause significant virus reproduction in the lung tissue of infected mice and the formation of visible pulmonary pathology (Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998 Aug; 72 (8): 6437-41.
  • influenza vectors with a shortened reading frame of the NS1 protein to 124 amino acid residues cannot be used to vaccinate people, since they do not meet the safety parameters developed for live influenza vaccines, where the temperature sensitivity of the virus is an indispensable condition (reduced ability to reproduce at a temperature of 39 ° C) and the absence of active virus reproduction in the lower respiratory tract of animals (Maassab HF, Bryant ML.
  • Vopr Virusol The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev Med Virol. 1999 Oct-Dec; 9 (4): 237-44. Re view. PubMed PMID: 10578119; Gendon IuZ. [Live cold-adapted influenza vaccine: state
  • influenza vectors NS1-124 and similar constructions did not have a phenotypic temperature sensitivity marker (ts phenotype) and had a level of reproduction in lung of mice, close to the level of wild-type virus with a full-sized NS1 protein.
  • interleukin-15 van Rikxoort M, Michaelis M, Wolschek M, Muster T, Egorov A, Seipelt J , Doerr HW, Cinatl J Jr.
  • an immunopotentiating agent for example, interleukin-15 (van Rikxoort M, Michaelis M, Wolschek M, Muster T, Egorov A, Seipelt J , Doerr HW, Cinatl J Jr.
  • interleukin-15 van Rikxoort M, Michaelis M, Wolschek M, Muster T, Egorov A, Seipelt J , Doerr HW, Cinatl J Jr.
  • influenza viruses were used that are capable of limited reproduction in some cell cultures, which do not have the necessary genetic stability of the transgene for large-scale production of substrate in chicken embryos, which is optimal for producing influenza vaccines.
  • the present invention relates to an attenuated influenza A virus that induces a cross-protective response against influenza A and B virus, comprising a chimeric NS fragment comprising a shortened reading frame of the NS1 protein and a heterologous Nep protein gene sequence derived from a subtype of influenza A virus that is different from the subtype of the indicated attenuated influenza virus A.
  • the present invention relates to an attenuated influenza A virus in which said shortened reading frame encodes an NS1 protein of 80-130 amino acid residues, more preferably, wherein said shortened reading frame encodes an NS1 protein size 124 amino acid residues.
  • One embodiment of the present invention relates to an attenuated influenza A virus, wherein said shortened reading frame of an NS1 protein is derived from an influenza virus of the H1N1 subtype, and the heterologous sequence of the Nep protein gene is derived from an influenza virus of the H2N2 subtype.
  • Another embodiment of the present invention relates to an attenuated influenza A virus comprising a chimeric NS fragment comprising a shortened reading frame of an NS1 protein and a heterologous Nep protein gene sequence, said shortened reading frame of an NS1 protein coming from an influenza virus subtype H1N1 and a heterologous protein gene sequence Nep comes from the influenza virus subtype H2N2, and where the indicated shortened reading frame encodes an NS1 protein of 124 amino acid residues.
  • the invention also relates to an attenuated influenza vector expressing a protein or fragment thereof selected from the group consisting of proteins or fragments of bacteria, viruses or protozoa, which is an attenuated influenza A virus of the invention, in which the shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by inserting the sequence at least one transgene encoding a protein or its fragment of bacteria, viruses or protozoa.
  • One embodiment of the invention relates to an attenuated influenza vector expressing a protein or fragment thereof, which are selected from the group consisting of proteins of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes virus, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C , malarial plasmodium, trichomonads, trypanosomes, Leishmania, chlamydia, the causative agent of brucellosis or combinations thereof.
  • a further embodiment of the invention is an attenuated influenza vector expressing a protein or fragment thereof of pathogenic bacteria, viruses or protozoa, wherein the size of said protein or fragment thereof is from 10 to 400 amino acids.
  • Another embodiment of the invention is an attenuated influenza vector in which the insert encodes a portion of the HA protein of the influenza virus, preferably where the portion of the HA protein is a portion of the HA2 subunit selected from the group consisting of 1-185 a. K. from influenza A virus, 1-186 a. K. from influenza B virus, 23-185 a. to. from a virus of a flu A or 65 - 222 and. K. from influenza A.
  • a further embodiment of the invention is an attenuated influenza vector in which the insert encodes a sequence of a portion of the HA2 subunit of influenza A virus or influenza B virus from 1 to 21 a. K. and the sequence of the plot of the protein NP of influenza A virus from 243 to 251 a. to.
  • Another embodiment of the invention is an attenuated influenza vector, where the insert encodes the mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6, Ag85A, Ad85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 or 10.4 or fragments thereof, in particular where the genomic sequence of the virus further comprises a self-cleavable coding sequence 2A peptide, between sequences encoding NS1-124 and ESAT6.
  • the invention also relates to an attenuated influenza vector expressing a protein or a fragment of an influenza virus, which is an attenuated influenza A virus, containing a chimeric NS fragment, including a shortened reading frame of the NS1 protein and a heterologous sequence of the Nep protein gene, said shortened reading frame of the NS1 protein comes from influenza virus subtype H1N1, and the heterologous sequence of the Nep protein gene is derived from the influenza virus subtype H2N2, and where the indicated shortened reading frame encodes an NS1 protein of 124 amino acid residues in which the shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by inserting a sequence encoding 1-21 a.
  • K. protein NP of influenza A a protein or a fragment of an influenza virus
  • Another object of the invention is an attenuated influenza vector having oncolytic activity, which is an attenuated influenza A virus according to the invention, in which a shortened reading frame of the protein gene NS1 is continued by the insertion of a sequence of at least one transgene encoding a protein or a fragment thereof of bacteria, viruses or protozoa.
  • One embodiment of the invention is an attenuated influenza vector having oncolytic activity, in which the insert encodes a protein or fragment thereof selected from the group consisting of proteins or fragments of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes virus, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C, malarial plasmodium, trichomonads, trypanosomes, Leishmania, chlamydia, or combinations thereof.
  • a protein or fragment thereof selected from the group consisting of proteins or fragments of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes virus, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C, malarial plasmodium, trichomonads, trypanosomes, Leishmania, chlamydia, or combinations thereof.
  • the next embodiment of the invention is an attenuated influenza vector having oncolytic activity, where the size of the encoded protein or its fragment is from 10 to 400 amino acids.
  • a preferred embodiment of the invention is an attenuated influenza vector having oncolytic activity, where the insert encodes the mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6, Ag85A, Ad85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 or 10.4 or fragments thereof, in particular where the shortened reading frame of the NS1 protein gene continued by the insertion of the sequence encoding the mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6, even more preferably, where the shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by the insertion of the sequence encoding the self-cleaving 2A peptide, sequence encoding the protein of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6.
  • An object of the invention is also an attenuated influenza vector inducing a cross-protective response against influenza A and B viruses, containing:
  • nucleotide sequence of the RA protein gene derived from the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1), or the nucleotide sequence having at least 95% identity with the specified sequence of the RA protein;
  • nucleotide sequence of the protein M gene derived from the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1), or the nucleotide sequence having at least 95% identity with the specified sequence of the gene protein protein M;
  • nucleotide sequence of the HA protein gene derived from the influenza virus A / California / 7/09-like HlNlpdm), or the nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence of the HA protein gene;
  • nucleotide sequence of the chimeric gene of the NS protein including
  • the reading frame of the NS1 protein derived from the virus A / PR / 8/34 (H1N1), where the specified reading frame is shortened and encodes the NS1 protein of 124 amino acid residues,
  • H2N2 a Nep protein gene sequence derived from A / Singapore / l / 57-like influenza virus
  • NP influenza A virus nucleoprotein
  • nucleotide sequence of the NS protein chimeric gene is set forth in SEQ ID NO: 21.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for treating and / or preventing an infectious disease in a subject, comprising in an effective amount an attenuated influenza A virus of the invention or an attenuated influenza vector of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an object of the invention is a pharmaceutical composition for the prevention of influenza, containing in an effective amount an attenuated influenza vector of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition according to the invention contains 6.5-10.5 1odeID 50 / ml attenuated influenza vector and a buffer solution containing 0-1.5 wt.% Monovalent salt, 0-5 wt.% Imidazole-containing compounds, 0-5 wt.% carbohydrate component, 0-2 wt.% protein component, 0-2 wt.% amino acid component and 0-10 wt.% hydroxyethylated starch.
  • a preferred embodiment of the invention is a pharmaceutical composition, wherein the buffer solution contains 0.5-1.5 wt.% Monovalent salt, 0.01-5 wt.% Imidazole-containing compounds, 1-5 wt.% Carbohydrate component, 0.1-2 wt. .% protein component, 0.01-2 mass.
  • % amino acid component and 1-10 wt.% hydroxyethylated starch preferably where the monovalent salt is sodium chloride, the carbohydrate component is sucrose, trehalose or lactose, the protein component is human albumin, casitone, lactalbumin hydrolyzate or gelatin, the amino acid component is arginine, glycine or monosodium glutamate, and the imidazole-containing compound is L-carnosine or N, ⁇ '-bis [2- (1H-imidazol-5-yl) ethyl] - propanediamide.
  • the monovalent salt is sodium chloride
  • the carbohydrate component is sucrose, trehalose or lactose
  • the protein component is human albumin, casitone, lactalbumin hydrolyzate or gelatin
  • the amino acid component is arginine, glycine or monosodium glutamate
  • the imidazole-containing compound is L-carnosine or N, ⁇ '-bis [
  • Another embodiment of the invention is a pharmaceutical composition for treating and / or preventing an infectious disease, wherein the infectious disease is caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, malarial plasmodium, trichomonads, chlamydia, trypanosomes, Leishmania or the causative agent of brucellosis.
  • the subject is a mammal or a bird, in particular, the subject is a human.
  • the invention also relates to an infectious disease vaccine comprising, in an effective amount, an attenuated influenza A virus of the invention or an attenuated influenza vector of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another object of the present invention is an influenza vaccine comprising, in an effective amount, an attenuated influenza vector of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the vaccine according to the invention contains 6.5-10.5 1odEID 50 / ml attenuated influenza vector and a buffer solution containing 0-1.5 mass. % monovalent salt, 0-5 wt. imidazole-containing compounds, 0-5 wt.% carbohydrate component, 0-2 wt.% protein component, 0-2 wt.% amino acid component and 0-10 wt.% hydroxyethylated starch.
  • Another embodiment of the invention is a vaccine in which a buffer solution contains 0.5-1.5 wt.% Monovalent salt, 0.01-5 wt.% Imidazole-containing compounds, 1-5 wt.% Carbohydrate component, 0.1-2 wt.% protein component, 0.01 to 2 wt. % amino acid component and 1-10 wt.% hydroxyethylated starch.
  • the monovalent salt is sodium chloride
  • a carbohydrate component is sucrose, trehalose or lactose
  • the protein component is human recombinant albumin, casitone, lactalbumin hydrolyzate or gelatin
  • the amino acid component is arginine, glycine or sodium glutamate
  • the imidazole-containing compound is L-carnosine or N, ⁇ '-bis [ 2- (1H-imidazol-5-yl) ethyl] - propanediamide.
  • infectious disease vaccine wherein the infectious disease is caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, immunodeficiency virus human, hepatitis C virus, malarial plasmodium, trichomonas, chlamydia, trypanosomes, Leishmania or the causative agent of brucellosis.
  • a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, immunodeficiency virus human, hepatitis C virus, malarial plasmodium, trichomonas, chlamydia, trypanosomes, Leishmania or the causative agent of brucellosis.
  • the invention also relates to the use of an attenuated influenza A virus of the invention, an attenuated influenza vector of the invention or a pharmaceutical composition of the invention for the prevention and / or treatment of infectious diseases in a subject, in particular for the treatment and / or prevention of a disease caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus and human immunodeficiency virus, virus hepatitis C, malarial plasmodium, trichomonads, chlamydia, trypanosomes, Leishmania or the causative agent of brucellosis.
  • the subject is a mammal or a bird, in particular, the subject is a human.
  • Another object of the present invention is the use of an attenuated influenza vector or pharmaceutical composition of the invention for the prevention of influenza in a subject.
  • the invention also relates to a method for treating and / or preventing an infectious disease in a subject in need thereof, comprising administering in an effective amount an attenuated influenza A virus according to the invention, an attenuated influenza vector according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention to said subject, preferably to a method for treating a disease that is caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus Types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, plasmodium malaria, Trichomonas, trypanosomes, Leishmania or the causative agent of brucellosis.
  • the subject is a mammal or a bird, in particular, the subject is a human.
  • a further object of the invention is a pharmaceutical composition for treating oncological diseases in a subject, comprising an attenuated influenza A virus of the invention or an attenuated vector of the invention in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • One of the embodiments of the invention is a pharmaceutical composition containing 8.5-10.5 log EID 50 / ml attenuated influenza A virus according to the invention or attenuated influenza vector according to the invention and a buffer solution containing 0-1.5 mass. % monovalent salt, 0-5 wt.% imidazole-containing compounds, 0-5 wt.% carbohydrate component, 0-2 wt.% protein component, 0-2% amino acid component and 0-10 wt.% hydroxyethylated starch, more preferably an embodiment of the invention, the buffer solution contains a 0.5-1.5 wt.% solution of a monovalent salt, 0.01-5 wt.% imidazole-containing compounds, 1-5 wt.% carbohydrate component, 0.1-2 wt.% protein component , 0.01-2% of the amino acid component and 1-10 wt.% Hydroxyethylated starch.
  • Another embodiment is a pharmaceutical composition in which the monovalent salt in the buffer solution is sodium chloride, the carbohydrate component is starch, the protein component is human albumin, the amino acid component is arginine, and the imidazole-containing compound is L-carnosine or N, ⁇ '-bis [2- (1H-imidazol-5-yl) ethyl] propanediamide.
  • the next object of the present invention is the use of an attenuated vector according to the invention, an attenuated influenza vector according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention for the treatment of oncological diseases in a subject, in particular diseases selected from the group consisting of colorectal cancer, cardioesophageal cancer, pancreatic cancer, cholangiocellular cancer , gliomas, glioblastomas and melanomas.
  • the subject is a human.
  • the present invention also relates to a method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering in an effective amount of an attenuated influenza A virus of the invention, an attenuated influenza vector of the invention, or a pharmaceutical composition of the invention, preferably a method of treating an cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, cardioesophageal cancer, pancreatic cancer, cholangiocellular cancer, glioma, glioblastoma and me anomie.
  • said administration is intratumoral administration, administration to a lacuna formed after surgical removal of a tumor, or intravenous administration.
  • the technical result of the present invention is the production of chimeric influenza viruses in the NS genomic fragment and the corresponding influenza vectors that are highly safe for humans and animals, in particular, vectors characterized by the absence of active reproduction of the virus in the animal body and having a temperature sensitivity phenotype, and which can be used for prevention and / or treatment of infectious diseases.
  • the technical result of the present invention is obtaining a chimeric NS-based genomic fragment of an influenza vector having the properties of a universal influenza vaccine with mucosal administration in the absence of adjuvants.
  • the technical result is a high growth potential of the obtained influenza viruses and influenza vectors in 10-day-old chicken embryos.
  • Another technical result is the production of influenza vectors that have the properties of a universal influenza vaccine.
  • the technical result is the production of influenza viruses and influenza vectors with oncolytic activity. Another technical result is the reduction in the cost of production of influenza vaccine due to the non-use of adjuvants.
  • Figure 1 shows the design principle of an influenza attenuated vector.
  • B shows the NS scheme of the genomic fragment of the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1).
  • H1N1 the genomic fragment of the influenza virus A / PR / 8/34
  • B a diagram of a genetically modified chimeric NS genomic fragment is presented, where the reading frame of the NS1 protein is shortened and can be continued by the insertion of a foreign sequence.
  • the sequence encoding the Nep protein has been replaced by a heterologous sequence from another subtype of influenza A virus.
  • Figure 2 shows the nucleotide sequences of genomic NS fragments of wild-type virus and examples of two genetic constructs of chimeric nature.
  • A the NS fragment of the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1) is shown.
  • B a chimeric NS fragment of influenza A virus is presented, where the reading frame of the NS1 protein is shortened, and the Nep sequence in bold is borrowed from virus A / Singapore / 1/57 (H2N2).
  • H2N2 shows a chimeric NS fragment of influenza A virus, where the reading frame of the NS1 protein is shortened and the Nep sequence in bold is from virus A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2).
  • Figure 3 shows the amino acid sequences of the proteins translated in the reading frame of the NS1 chimeric influenza vectors containing heterologous Nep from virus A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2).
  • Fig. 4 presents data demonstrating the pathogenicity and ts phenotype of viruses with a heterologous Nep gene.
  • A shows virus reproduction data at an optimal 34 ° C and elevated 39 ° C temperature in Vero cells.
  • In B presents data on the reproduction of viruses in the lungs of mice on the 2nd day after infection.
  • Fig. 5 is a graph showing the protective effect of a single immunization of mice with vectors expressing portions of the HA2 subunit from the reading frame of the NS1 protein during challenge with heterologous pathogenic influenza virus strains.
  • A mortality is shown during control infection with the A / Mississippi / 85/1 (H3N2) virus
  • B is mortality during control infection with the B / Lee / 40 virus.
  • Fig. 6 presents data on the oncolytic effect of recombinant influenza viruses against mouse melanoma induced by the introduction of 1x10 b B16 cells in the foot of the hind paw. Therapy was carried out by intratumoral administration of the virus on the 5th day after the implementation of the tumor.
  • A the average foot size on day 20 after the implementation of the tumor and 4-fold therapy with oncolytic vectors is presented, in B - the survival of mice after 4-fold treatment with oncolytic vectors.
  • Fig. 7 shows the structure of the influenza attenuated vector. 8 fragments of the virus genome and their features are designated.
  • fragments of the genome PB2, PB1, PA, p and M are derived from the virus A / PR / 8/34 (H1N1); genes for surface glycoproteins HA and NA are derived from A / California / 7/09-like virus (HlNlpdm);
  • the NS genomic fragment has a chimeric structure encoding two proteins: 1) an NS1 protein shortened to 124 amino acid residues, continued by inserting the sequence of the N-terminal region of the HA2 virus of influenza B and the insertion of a conserved B-cell epitope of the NP protein of influenza A virus 2) Nep protein having Sequence from a heterologous strain of influenza A virus, H2N2 seroptype A / Singapore / 1/57 -like.
  • Fig. 8 presents the nucleotide sequence of the genomic fragments of the vaccine vector: PB2, PB1, PA, NP, M - originating from the virus A / PR / 8/34 (H1N1); HA and NA derived from A / California / 7/09-like virus (HlNlpdm); chimeric NS (the insert in the reading frame of NS1 is shown in bold).
  • Fig. 9 presents the results reflecting the protective properties of the vaccine vector after intranasal immunization of mice with respect to different variants of influenza A virus and influenza B virus.
  • the graphs show% mortality in vaccinated mice after control infection with the indicated seroptypes of influenza A virus or influenza B virus in comparison with control animals.
  • the vaccine was administered once - 1x or twice - 2x.
  • Figure 10 presents data demonstrating the protective properties of the vaccine vector after intranasal immunization of ferrets.
  • Figure A shows the dynamics of the average value of temperature fluctuations after the control of infection with the A / St virus. Beach / 224/2015 (H3N2) in vaccinated and control animals.
  • Figure B shows the results of seeding the control virus from nasal swabs of ferrets on 2.4 and 6 days after infection. The titers are expressed as the average concentration of the virus in nasal swabs, expressed as the value of 50% cytopathic doses / ml after titration on MDCK cells. The vaccine was administered once - 1x or twice - 2x.
  • the present invention relates to attenuated influenza A viruses obtained by genetic engineering methods, which can be used to treat and / or prevent infectious diseases, as well as to treat cancer.
  • the present invention relates to an attenuated influenza A virus inducing a cross-protective response against influenza A and B virus, comprising a chimeric NS fragment comprising a shortened reading frame of the NS1 protein and a heterologous Nep protein gene sequence derived from a subtype of influenza A virus different from the subtype of the indicated attenuated influenza A virus.
  • the virus A subtype for the sequence encoding the shortened NS1 protein is different from the virus A subtype from which obtained the sequence encoding the protein Nep.
  • one embodiment of the present invention relates to an attenuated influenza A virus, wherein said shortened reading frame of the NS1 protein is derived from the influenza virus of the H1N1 subtype, and the heterologous sequence of the Nep protein gene is derived from the influenza virus of the H2 to H18 subtype of human or animal origin .
  • Said truncated reading frame encodes an NS1 protein of 80-130 amino acid residues, more preferably said truncated reading frame encodes an NS1 protein of 124 amino acid residues.
  • the present invention is based in particular on the fact that the authors unexpectedly found that the problem of insufficient attenuation (lack of temperature sensitivity and a high level of reproduction in the lungs of mice) of influenza vectors, in particular NS1-124, can be solved by modifying the second spliced NS protein product genomic a fragment of the influenza virus - Nep protein (NS2).
  • chimeric NS fragments of the influenza virus were constructed that encode the shortened reading frame NS1-124 from the A / PR / 8/34 (H1N1) virus in combination with the reading frame of the Nep protein taken from the seropodotype H2N2 virus.
  • Reassortant influenza viruses based on the A / PR / 8/34 virus regardless of the origin of the H1N1, H5N1 or HlNlpdm surface antigens carrying the chimeric NS genomic fragment, were unable to actively reproduce at 39 ° C and in the lungs of mice (attenuation phenotype), but at the same time, they were still reproduced to high titers in 10-day-old chicken embryos.
  • the present invention also relates to attenuated an influenza vector expressing an antigen or a fragment thereof selected from the group consisting of antigens or fragments of bacteria, viruses or protozoa, containing an attenuated influenza A virus according to the present invention, in which the shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by inserting the sequence of at least one transgene encoding an antigen or its fragment of bacteria, viruses or protozoa.
  • a transgene encoding a protein or fragment thereof from any bacteria, viruses or protozoa, both pathogenic and non-pathogenic in relation to animals and humans can be inserted into an attenuated virus according to the present invention
  • the protein can be selected from the group consisting of proteins or fragments of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, brucella abortus, herpes virus, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C, plasmodium malaria, trichomonas, trypanosomes s, Leishmania, chlamydia, the causative agent of brucellosis, or combinations thereof.
  • the insertion sequence can encode a portion of the HA protein of influenza virus, tuberculosis mycobacterium protein ESAT-b, Ad85A, Ad85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 or 10.4, or fragments thereof.
  • the genomic sequence of the attenuated vector according to the present invention may further comprise a sequence encoding a self-cleaving 2A peptide between sequences encoding NS1-124 and ESAT6.
  • the size of the antigen or its fragment encoded by the insertion sequence can be of any size, which is limited only by the ability of the genomic fragment to "receive" the nucleotide sequence encoding the antigen or its fragment.
  • the size of the antigen is from 10 to 400 amino acids.
  • the insert can encode a portion of the HA protein, which is a portion of the HA2 subunit selected from the group consisting of 1-185 amino acids from influenza A virus, 1-186 amino acids from influenza B virus, 23-185 amino acids from influenza A virus or 65- 222 amino acids from influenza A.
  • the amino acid numbering is given in accordance with the amino acid positions in the HA2 subunit of the influenza virus, from which the transgene originates.
  • an attenuated influenza vector according to the present invention is a vector in which the insert encodes a sequence of the ⁇ 2 subunit of the influenza A or influenza B virus subunit from 1 to 21 amino acids and the sequence of the NP protein region of the influenza A virus from 243 to 251 amino acids. It was unexpectedly found that these variants of vectors, despite the short duration of insertion, showed the best protective efficacy against influenza B virus and heterologous antigenic subtypes of influenza A virus, after a single immunization of mice, i.e. showed the properties of a universal flu vaccine.
  • the commonality of their genetic attenuation markers was determined by the presence of a shortened reading frame of the NS1 protein and the presence of the heterologous sequence of the Nep gene taken from another subtype of influenza A. Depending on the insert, the vectors obtained showed the properties of a universal influenza vaccine, tuberculosis vaccine, etc.
  • the present invention relates to a genetically engineered vaccine vector based on influenza A virus, which can be used to prevent influenza caused by all known strains, including influenza A and B. More specifically, the present invention relates to an attenuated influenza A virus. inducing cross a protective response against influenza A and B virus containing a chimeric NS fragment including a shortened reading frame of the NS1 protein and a heterologous sequence of the Nep protein gene derived from the subtype of influenza A virus H2N2.
  • the virus A subtype for the sequence encoding the truncated NS1 protein is different from the virus A subtype from which the sequence encoding the Nep protein is derived.
  • the shortened reading frame of the NS1 protein is derived from the H1N1 subtype influenza virus
  • the heterologous sequence of the Nep protein gene is derived from the H2N2 subtype influenza virus.
  • the present invention relates to an attenuated influenza vector inducing a cross-protective response against influenza A and B viruses, comprising:
  • nucleotide sequence of a gene encoding a protein M originating from the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1), or a nucleotide sequence having at least 95% or more (for example, 96, 97, 98 or 99%), the identity of the indicated sequence of the protein M gene;
  • nucleotide sequence of the gene encoding protein ⁇ derived from the influenza virus A / California / 7/09-like HlNlpdm
  • nucleotide sequence having at least 95% or more for example, 96, 97, 98 or 99%
  • nucleotide sequence of the chimeric gene of the NS protein including
  • the reading frame of the NS1 protein derived from the virus A / PR / 8/34 (H1N1), where the specified reading frame is shortened and encodes the NS1 protein of 124 amino acid residues,
  • H2N2 a Nep protein gene sequence derived from A / Singapore / l / 57-like influenza virus
  • nucleotide sequence having at least 95% or more (for example, 96, 97, 98 or 99%) the identity of the specified sequence of the chimeric NS gene;
  • shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by inserting a nucleotide sequence encoding a fusion peptide of the HA2 subunit from influenza B virus and a nucleotide sequence encoding a conserved B cell epitope of influenza A virus nucleoprotein (NP).
  • NP influenza A virus nucleoprotein
  • the indicated shortened reading frame encodes an NS1 protein of 124 amino acid residues, which is extended by two glycines, an insertion of the ⁇ -terminal region of the second subunit of the hemagglutinin HA2 subunit of influenza B virus (23 amino acid residues) and an insertion of the sequence of the conserved B cell epitope of influenza A virus (7 amino acid residues).
  • the surface glycoprotein genes of this vector are derived from the influenza virus A / California / 7/09 (HlNlpdm).
  • the genes for the internal proteins PB2, PB1, PA, NP and M are derived from the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1).
  • influenza vector of the invention is a complex genetic construct consisting of the genomic sequences of various strains of the influenza virus, namely: 1) genes encoding PB2, PB1, PA, NP and M are derived from virus A / PR / 8 / 34 (H1N1) (PB2 (Genbank accession number: AB671295), PB1 (Genbank accession number: CY033583), PA (Genbank accession number: AF389117), NP (Genbank accession number: AF389119), M (Genbank accession number: AF389121)) , 2) the genes encoding HA and NA are derived from the A / California / 7/09-like HlNlpdm virus) (HA (GenBank: KM408964.1) and (NA GenBank: KM408965.1), 3) the NS gene has a chimeric nature where the protein reading frame NS1 from virus A / PR / 8/34 (H1N1) was shortened to 124 amino acid
  • the present invention is based in particular on the fact that the authors unexpectedly found that a vector with the indicated structure upon intranasal immunization of mice and ferrets without the use of adjuvants protects animals from control infection not only with influenza A (H1N1) viruses, but also with influenza viruses ⁇ ( ⁇ 3 ⁇ 2) ⁇ of influenza B. Therefore, the vaccine vector has the properties of a universal influenza vaccine.
  • universal vaccine in the context of the present invention means a vaccine capable of protecting against all known and unknown variants of the influenza virus.
  • Conventional "seasonal vaccines” protect only against viruses similar to those viruses that make up their composition.
  • the term “mucosal vaccine” means that the vaccine can be administered in the cavities of the respiratory and digestive tract and applied to the mucous membranes of the mouth and nose, i.e. apply intranasally, orally, sublingually.
  • the influenza A / PR / 8/34 virus vector carrying the chimeric NS genomic fragment was unable to actively reproduce at 39 ° C and in the lungs of mice (attenuation phenotype), but it still reproduced to high titers of 10- daytime chicken embryos.
  • the present invention also relates to an attenuated influenza vector having oncolytic activity, containing the attenuated influenza A virus according to the present invention, in which the shortened reading frame of the NS1 protein gene is continued by inserting a sequence of at least one transgene encoding an antigen or fragment of pathogenic bacteria, viruses or protozoa .
  • the specified antigen can occur from any bacteria, viruses or protozoa that are pathogenic in relation to animals, in particular, the antigen can be selected from the group consisting of antigens of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes virus, respiratory syncytial virus, virus human immunodeficiency, hepatitis C, malarial plasmodium, trichomonads, trypanosomes, Leishmania, chlamydia, or combinations thereof.
  • the inserted transgene can encode the mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6, Ag85A, Ad85B, Mpt64, HspX, Mtb8.4 or 10.4 or fragments thereof, in addition, the shortened reading frame of the NS1 protein gene can be continued by inserting a sequence encoding the ESAT tuberculosis mycobacterium protein -6.
  • the size of the antigen or its fragment encoded by the insertion sequence can be of any size, which is limited only by the ability of the genomic NS fragment to "receive" the nucleotide sequence encoding the antigen or its fragment.
  • the size of the antigen is from 10 to 400 amino acids.
  • the viral vector encoding the Esat6 protein of Mycobacterium tuberculosis had higher activity compared to the known recombinant virus with a shortened NS1 protein, but without insertion.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions that contain in an effective amount an attenuated influenza A virus according to the present invention or an attenuated influenza vector according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions of the present invention are intended for the treatment and / or prevention of an infectious disease in a subject, in particular an infectious disease caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus types 1 and 2 respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, plasmodium malaria, trichomonas, chlamydia, trypanosome or leishmania.
  • a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, tuberculosis mycobacterium, herpes simplex virus types 1 and 2 respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, plasmodium malaria, trichomonas, chlamydia, trypanosome or leishmania.
  • compositions of the present invention are intended for the treatment of oncological diseases of various etiologies, in particular, the oncological disease can be selected from the group consisting of colorectal cancer, cardioesophageal cancer, pancreatic cancer, cholangiocellular cancer, glioma, glioblastoma and melanoma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated as a vaccine containing in an effective amount an attenuated influenza A virus of the present invention or an attenuated influenza vector of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • subject or “animal” as used herein means vertebrates that are susceptible to infection, caused by pathogenic bacteria, viruses or protozoa, including birds (waterfowl, chickens, etc.) and representatives of various types of mammals, such as canines, cats, wolves, ferrets, rodents (rats, mice, etc.), horses, cows, sheep, goats, pigs and primates.
  • the subject is a human.
  • an effective amount is meant an amount of virus or vector that, when administered to a subject, in a single dose or as part of a treatment cycle, is effective for treatment and / or prophylaxis with a therapeutic result. This amount may vary depending on the state of health and physical condition of the patient, age, taxonomic group of the individual being treated, formulation, assessment of the medical situation by the attending physician, and other important factors. It is believed that the amount can vary over a relatively wide range that a person skilled in the art can determine by standard methods.
  • the pharmaceutical composition may contain 6-10.5 1odEID 50 / ml, in particular 6.5-10.5 1odEID 50 / ml, in particular 6-9.5 1odEID 50 / ml, more specifically 6.5-8 , 5 1 oEID 50 / ml of the chimeric influenza A virus according to the invention or influenza vector according to the invention.
  • pharmaceutically acceptable carrier in the context of the present invention means any carrier used in this field, in particular water, saline, buffer solution and the like.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a buffer solution containing 0-1.5 mass. % monovalent salt, 0-5 wt.
  • said buffer solution contains 0.5-1 , 5 wt.% Monovalent salt, 0.01-5 wt.% Imidazole-containing compounds, 1-5 wt.% Carbohydrate component, 0.1-2 wt.% Protein component, 0.01-2 wt.
  • the monovalent salt is sodium chloride
  • the carbohydrate component is sucrose, trehalose or lactose
  • the protein component is human albumin, casitone, lactalbumin hydrolyzate or gelatin
  • the amino acid component is arginine, glycine or sodium glutamate.
  • the imidazole-containing compound is L-carnosine or N, ⁇ '-bis [2- (1H-imidazol-5-yl) ethyl] -propanediamide having the form
  • Human albumin may be recombinant albumin or donor albumin.
  • the present invention also relates to the use of an attenuated influenza A virus, an attenuated influenza vector or a pharmaceutical composition according to the present invention for the prevention and / or treatment of infectious diseases in a subject, in particular an infectious disease caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, malia plasma plasmodium, trichomonads, chlamydia, trypanosomes or Leishmania.
  • a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, malia plasma plasmodium, trichomonads, chlamydia, trypanosomes
  • the present invention also relates to the use of an attenuated influenza vector or pharmaceutical composition according to the present invention for the prevention of influenza.
  • the present invention also relates to methods of treatment in which an attenuated influenza A virus, an attenuated influenza vector or a pharmaceutical composition according to the present invention is used for administration to a subject.
  • the methods are intended for the treatment and / or prevention of infectious diseases caused by pathogenic viruses, bacteria or protozoa, in particular infectious diseases caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, malarial plasmodium, trichomonas, chlamydia, trypanosomes or Leishmania.
  • infectious diseases caused by a pathogen selected from the group consisting of influenza A virus, influenza B virus, mycobacterium tuberculosis, herpes simplex virus types 1 and 2, respiratory syncytial virus, human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, malarial plasmo
  • the methods are intended to treat oncological diseases in a subject, in particular, the oncological disease can be selected from the group consisting of colorectal cancer, cardioesophageal cancer, pancreatic cancer, cholangiocellular cancer, glioma, glioblastoma and melanoma.
  • the introduction to the subject can be carried out by any standard method, in particular, intramuscularly, intravenously, orally, sublingually, inhalation or intranasally.
  • the influenza vector or pharmaceutical composition can be administered to the subject one, two or more times, single administration is preferred.
  • the administration may be an intratumoral administration, an administration to the lacuna formed after the surgical removal of the tumor, or intravenous administration.
  • the invention is further illustrated by non-limiting embodiments.
  • the synthesized sequences were cloned into a bidirectional vector based on the plasmid pHW2000 (Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG.
  • Said plasmid vector due to the presence of Pol I and Pol II promoters, provides for the simultaneous intracellular transcription of viral and corresponding messenger RNAs during mammalian cell transfection.
  • On figa presents a diagram of the NS of the genomic fragment of the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1).
  • a full-sized genomic fragment of viral RNA (vRNA) of negative polarity has a length of 230 nucleotides (nt).
  • On figb presents a diagram of a genetically modified chimeric NS genomic fragment, where the reading frame of the protein NS1 up to 398 NT and can continue by inserting a foreign sequence ending in a triple stop codon.
  • the sequence encoding the Nep protein is replaced by a heterologous one from another subtype of the influenza A virus.
  • the chimeric genomic NS fragment has an indefinite length, depending on the length of the insertion of the foreign sequence into the NS1 reading frame.
  • the nucleotide sequence of the influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1), including the coding as well as the 5'and 3 'non-coding end regions (sequence number in the GenBank database J02150) was used as the basis for creating the chimeric construction of the NS genome segment.
  • various variants of the chimeric constructs of the NS genomic fragment were constructed, where the common features were: 1) replacing the Nep protein coding sequence of the A / PR / 8/34 (H1N1) virus with a sequence derived from influenza viruses of the H2N2 subtype (strains: A / Singapore / 1/57 and A / Leningrad / 134/4/57) (Fig.
  • Fig. 2A shows the sequence of SEQ ID NO: 1 NS of the influenza virus fragment A / PR / 8/34 (H1N1), in which a 30 nt sequence is selected and underlined to be deleted when constructing B and C.
  • the Nep gene sequence is in bold. to be replaced by a heterologous analogue from another subtype of influenza A virus.
  • Fig. 2B shows the sequence of SEQ ID NO: 2 of the recombinant NS fragment of influenza A virus, where the reading frame of the NS1 protein is shortened to 398 nt using an insert consisting of three consecutive feet - codons (underlined) , and the Nep sequence in bold is derived from virus A / Singapore / 1/57 (H2N2).
  • Figure 2B shows the sequence of SEQ ID NO: 3 of the recombinant NSA fragment of the influenza A virus, where the reading frame of the NS1 protein is shortened to 398 nt using the insert consisting of three consecutive stop codons (underlined), and the Nep sequence in bold , borrowed from the virus A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2).
  • the constructed chimeric NS genomic fragments when transcribed by the influenza polymerase complex, formed two types of messenger RNA: 1) NS1 mRNA translated in the form of NS1 protein shortened to 124 amino acid residues, limited by stop codons or continued insertion of transgenic sequences of various origins whose broadcast is limited to a cassette of stop codons; 2) Nep mRNA of heterologous origin from influenza A virus of another antigenic subtype. Translation options for the recombinant NS1 protein with inserts are presented in Fig. 3 and in Table 1 below.
  • NS124-HA2 (A) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Virus shortened 185 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE up to 124 ac
  • EKVDGVKLESMGIYQ (SEQ ID NO: 5) ac.
  • NS124-HA2 (A) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Virus with a shortened 65-222 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE up to 124 ac frame
  • LVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 6) subunits of influenza A virus, from 65 to 222 ac
  • NS124-HA2 (A) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Virus with a shortened 23-185 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE up to 124 ac frame
  • NS124-HA2 (B) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Virus with shortened 186 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE up to 124 ac
  • HA2 subunits of influenza B virus from 1 to 21 ak and a sequence of conserved B-cell epitope NP of influenza A protein A.
  • peptide 2A (originating from picornaviruses) and a sequence of Esat6 protein of Mycobacterium tuberculosis
  • HSV HSV
  • Epitope inserts are repeated
  • the recombinant viruses were assembled by transfection of VERO cells with seven plasmids encoding genomic unmodified fragments of the influenza virus, and one of the variants of the NS genome fragment of a chimeric nature, using the method of electroporation of plasmid DNA (Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza)) in accordance with the instructions for use . After transfection, cells were incubated in Optipro medium (Invitrogen) for 96 hours at 34 ° C with the addition of trypsin 1 ⁇ g / ml to ensure post-translational cleavage of the hemagglutinin precursor into HA1 and HA2 subunits.
  • Optipro medium Invitrogen
  • Vero cell viral harvest was used to infect 10-day-old chicken embryos (SPFs). Embryos were incubated for 48 hours at 34 ° C, after which allantoic fluids having a positive titer in the hemagglutination reaction were used for the second passage on chicken embryos. Allantoic fluids of the second passage were aliquoted and stored at -80 ° C. Second passage material was used to control genetic the structure of the chimeric NS fragment and the presence of the transgene by obtaining the RT-PCR product and its sequencing. In addition, the material of the second passage was used to determine phenotypic markers of recombinant viral strains and vectors and to determine the genetic stability of the transgene for 5 passages on chicken embryos.
  • the temperature sensitivity of viruses was determined by comparative titration of the infectious activity of viruses on Vero cells at optimal 34 ° C and elevated 39 ° C temperatures in 9b-well plates. Virus titers were counted by the Reed and Munch method after incubation for 96 hours, taking into account the development of the cytopathic effect in the wells of the plate (Reed, LJ; Muench, N. (1938). "A simple method of estimating fifty percent endpoints.” The American Journal of Hygiene 27: 493-497.). Ha. Fig. 4A shows virus titers at the indicated temperatures expressed in tissue 50% cytopathic doses (Log TCD50 / ml).
  • viruses carrying the heterologous Nep gene showed a reduced ability to reproduce in lung tissues (p ⁇ 0.002), compared with wild-type or virus NS124 / Nep PR8 having homologous Nep (Fig. 4B).
  • Virus titers in the lungs were evaluated 2 days after infection of the animals by titration of clarified lung homogenates in Vero cells. Pulmonary titers were expressed in log TCD50 / g lung tissue.
  • Viruses were studied with the inserts depicted in FIG. 3.
  • the ts-phenotype was studied by titrating the infectious activity of viruses at 34 and 39 ° C in 10-day-old chicken embryos by determining the hemagglutinating activity of allantoic fluids collected after 48 hours of incubation.
  • the titer was calculated by the method of Reed and Munch and was expressed in log Fetal 50% infectious doses (log EID50 / ml).
  • mice 0.05 ml of each viral sample.
  • Each group of mice contained 8 animals. Within 12 days, the lethal activity of the viruses was evaluated. It turned out that unlike the wild-type virus A / PR / 8/34 (H1N1), which caused a 50% lethal effect when using material with a titer of 3.2 log EID 50 / ml, none of the vectors showed 50% lethal activity in mice when using doses of infection> 7.5 log. Thus, all vectors with the chimeric nature of the NS genomic fragment, regardless of insertion, were highly attenuated for mice (Table 3).
  • viruses with surface antigens from the A / PR / 8/34 (H1N1) virus carrying the chimeric NS genome fragment with the Nep sequence from A / Leningrad / 134 / virus were used to immunize mice. 47/57 (H2N2).
  • the following recombinant viruses were used, encoding, in the NS1 reading frame, the HA2 hemagglutinin subunit sites: 1) vector NS124-HA2 (A) - 185 expressing the complete HA2 etodomain of influenza A virus, 185 amino acids in length (Fig.
  • NS124 / Nep-Len virus having a stop codon cassette at position 399 with nucleotide p Sequences of the NS genomic fragment restricting translation of the NS1 protein to 124 amino acid residues (FIG. 3, SEQ ID NO:).
  • the wild type A / PR / 8/34 (H1N1) virus without genetic modifications was used to form the control groups, or mice received a phosphate buffered saline that did not contain the active ingredient. Mice were immunized intranasally, under mild anesthesia, with a dose of 6.5 log / mouse virus, once.
  • mice After 28 days, the animals were subjected to control infection with heterologous strains of the influenza virus pathogenic for mice: A / Mississippi / 85/1 (H3N2) or B / Lee / 40 taken at a dose corresponding to 3-5 LD50, respectively.
  • mice immunized with viral preparations were completely protected from death caused by infection with a heterologous strain of influenza A virus (H3N2). Wild-type immunization also resulted in a statistically significant level of protection against infection by the heterologous strain.
  • immunization of mice with wild-type virus A / PR / 8/34 did not protect animals from death along with mice that received phosphate buffered saline during immunization (Fig. 5B) .
  • the assembly of the recombinant virus was carried out in several stages.
  • cDNA complementary DNA
  • the synthesized sequences were cloned into a bidirectional vector based on a plasmid pH 2000 (Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG.
  • a DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA . 2000; 97 (11): 6108-13.).
  • the specified plasmid vector due to the presence of Pol I and Pol II promoters provides simultaneous intracellular transcription of viral and corresponding messenger RNA during transfection of mammalian cells.
  • Fig. 7 presents the genetic scheme of the influenza vector.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of all 8 genomic fragments of the influenza vector.
  • genomic PB2 1 agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg
  • caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1921 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt
  • the recombinant viruses were assembled by transfection of VERO cells with eight plasmids encoding genomic unmodified fragments of the influenza virus and chimeric NS genomic fragment using the method of electroporation of plasmid DNA (Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza)) in accordance with the instructions for use. After transfection, cells were incubated in Optipro medium (Invitrogen) for 96 hours at 34 ° C with the addition of trypsin 1 ⁇ g / ml to ensure post-translational cleavage of the hemagglutinin precursor into HA1 and HA2 subunits. Vero cell viral harvest was used to infect 10-day-old chicken embryos (SPFs).
  • Embryos were incubated for 48 hours at 34 ° C, after which allantoic fluids having a positive titer in the hemagglutination reaction were used for subsequent passages on chicken embryos. Allantoic fluids of passage 7 were purified by tangential filtration and lyophilized for storage. Immunization of animals was carried out after dissolving the lyophilisate with distilled water in an equivalent volume.
  • an influenza vector of 6.81 ID EID50 / mouse was used to immunize mice, which was administered intranasally in a volume of 50 ⁇ l under mild anesthesia, once or twice with a period of 3 weeks. 21 days after the last immunization, the animals were subjected to control infection with pathogenic for mice influenza virus strains: homologous A / California / 7/09 (HlNlpdm) or heterologous A / Aichi / 2/68 (H3N2),
  • mice immunized once or twice with the viral preparation were reliably protected from death.
  • mice immunized once or twice with the viral preparation were significantly protected from death.
  • an influenza vector carrying a chimeric NS genomic fragment showed signs of a universal influenza vaccine effective against both heterologous antigenic subtypes of influenza A virus and influenza B virus
  • Ferrets are the optimal WHO recommended model for studying the effectiveness of influenza vaccines and drugs.
  • the influenza vector (9 per group) was used to immunize the ferrets, obtained in Example 5, in a dose of 7.5 log EIDio / ferret, which was administered intranasally in a volume of 500 ⁇ l under mild anesthesia , once or twice with a period of 3 weeks.
  • Beach / 224/2015 H3N2
  • the control infection of non-immune animals led to a rise in body temperature 2 days after infection, while vaccinated animals did not have a temperature reaction.
  • viruses were used to treat mouse melanoma induced by the introduction of 10 6 B16 cells in a volume of 30 ⁇ l into the subcutaneous space of the right hind foot. Used 10 animals per group. The therapy was carried out on the 5th day after the introduction of tumor cells by injection of 30 ⁇ l of the viral preparation or phosphate buffer solution directly into the tumor growth zone. Injections were performed 4 times every third day, after which the rate of increase in the volume of the affected foot and the survival of the animals over 85 days were evaluated. Animals with tumors reaching 2000 mm 3 were euthanized for ethical reasons and were considered dead.
  • a vector was used expressing the Esat6 mycobacterial antigen in a design involving 2A-mediated post-translational cleavage of the Esat-b protein from the C-terminal portion of the truncated NS1 protein of the influenza virus NS124-2A-Esat6 (FIG. 3, SEQ ID NO: 12).
  • the NS124 / Nep-Len virus was used without an insert of mycobacterial protein.
  • Fig. 6A presents the results of measuring the volume of the foot on day 19 after the introduction of tumor cells.
  • the feet of mice treated with a vector expressing Esat6 protein had the smallest average volume. This result was in correlation with the survival of mice over a long observation period of 85 days (Fig. BB). 3 out of 10 animals of the NS124-2A-Esat6 group were in remission of tumor growth, while animals in other groups died by the 60th day.
  • the data obtained indicate the advantage of the oncolytic vector encoding the bacterial antigen.
  • composition of the vaccine based on influenza vector for oncolytic purposes is a composition of the vaccine based on influenza vector for oncolytic purposes.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины и вирусологии. Представлены аттенуированные вирусы гриппа А, гриппозные векторы на их основе и содержащие их фармацевтические композиции, которые могут применяться для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний. Дополнительно, настоящее изобретение относится к аттенуированным вирусам гриппа А, гриппозным векторам на их основе и содержащим их фармацевтическим композиция, которые могут применяться для лечения онкологических заболеваний.

Description

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-301559RU/061
АТТЕНУИРОВАННЫЕ ГРИППОЗНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, А ТАКЖЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Область техники
Данное изобретение относится к области медицины и вирусологии, в частности, к аттенуированному химерному вирусу группы А, аттенуированному гриппозному вектору на основе указанного вируса и их применению для профилактики и/или лечения заболеваний инфекционной природы, а также для лечения онкологических заболеваний.
Уровень техники
На сегодняшний день важнейшей мерой защиты от вирусной инфекции и ограничения ее распространения является вакцинопрофилактика. Современные вакцины, как правило, индуцируют образование антител к поверхностным антигенам вирусов. Эффективность вакцин прямо зависит от степени соответствия антигенной структуры штаммов вируса, входящих в состав вакцины, и штаммов, циркулирующих среди популяции. Поверхностные белки большинства вирусов подвергаются постоянной антигенной вариации (антигенный дрейф) , что требует регулярного обновления штаммового состава вакцин. Разработка высокоиммуногенных и безопасных вакцин, индуцирующих иммунный ответ широкого спектра действия, является на сегодняшний день одной из основных проблем эффективной профилактики вирусных заболеваний .
Из всех респираторных вирусных заболеваний гриппозная инфекция характеризуется наиболее тяжелой патологией и причиняет наибольший ущерб здоровью населения и экономике. Периодически появляющиеся новые пандемические штаммы, к которым отсутствует популяционный иммунитет, превращают грипп в особо опасную инфекцию. Известно, что испанский грипп 1918 года стал причиной смерти от 30 до 50 млн человек. В настоящее время, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) , во время сезонных эпидемий ежегодно во всем мире заболевает гриппом до 20% населения, в том числе 5-10% взрослых и 20-30% детей (World Health Organization [Электронный ресурс] . URL: http : //www. who .int/biologicals/vaccines/influenza/en/ (дата обращения 28.03.2016)) . Тяжелые формы отмечаются в 3-5 млн. случаев, летальные исходы составляют от 250 000 до 500 000 случаев. Экономические потери, вызванные гриппом и другими острыми респира орными вирусными инфекциями (ОРВИ) , составляют около 77% от ущерба, приходящегося на долю всех инфекционных болезней. Значительные убытки связаны как с прямыми расходами на лечение и реабилитацию, так и с косвенными потерями производственного характера, вызванными снижением производительности труда и сокращением прибыли предприятий. Из общего числа случаев временной нетрудоспособности на грипп и ОРВИ приходится 12-14%.
Существующие вакцины можно разделить на два вида: аттенуированные (живые, содержащие цельные и активные вирусы, проявляющие низкую патогенность ) и инактивированные (содержащие фрагменты вирусных частиц или цельные неактивные вирусы) . Живые вирусы, способные реплицироваться в инфицированном хозяине, вызывают сильный и длительный иммунный ответ против экспрессирующихся антигенов этих вирусов. Они эффективно вызывают как гуморальный, так и клеточный иммунный ответы, а также стимулируют иммунологические реакции, опосредуемые цитокинами и хемокинами. Поэтому живые аттенуированные вирусы обладают определенными преимуществами по сравнению с композициями вакцин, основанными либо на инактивированных иммуногенах, либо на отдельных субъединицах иммуногенов, которые, как правило, стимулируют лишь гуморальную часть иммунной системы.
Для вакцинации животных и людей от различных инфекционных заболеваний вирусы различных семейств могут использоваться в качестве векторов, экспрессирующих чужеродные геномные последовательности. Применение векторов возможно в тех случаях, когда традиционные убитые или живые вакцины не могут быть получены, или их эффективность не позволяет контролировать то или иное заболевание. Среди существующих систем доставки антигенов вирусные векторы занимают особое место, поскольку обладают следующими свойствами: имеют естественный механизм взаимодействия с клеткой и проникновения в нее, переносят чужеродный генетический материал в цитоплазму или ядро клетки, способны обеспечивать длительную экспрессию антигена, вирусная оболочка защищает нуклеиновую кислоту, кодирующую введенный трансген .
Не все вирусы обладают свойствами, необходимыми для создания векторов для получения эффективных аттенуированных рекомбинантных вакцин. Для создания вакцин на основе вирусных векторов в настоящее время наиболее широко используются поксвирусы (Poxviridae) [J. Gen. Virol. 2005. V. 86. W 11. P. 2925-2936], вирус болезни Ньюкасла (NDV) [Virol. 2001. V. 75. W- 23. P. 11868-11873] и аденовирусы (Adenoviridae ) [Биотехнология. 2007. Т.5. С. 38-44] . Среди поксвирусов, используемых в качестве вирусного вектора, наиболее популярен вирус осповакцины, к преимуществам которого относятся простота и дешевизна получения, а также высокая пакующая емкость (до 25 т.п.н.) [J. Gen. Virol. 2005. V. 86. N! 11. P. 2925-2936] . Серьезный недостаток векторов на основе вируса осповакцины - предсуществующий иммунитет к этому вирусу, который присутствует в части в человеческой популяции в результате иммунизации против оспы. Поэтому целесообразно использовать векторы на основе таких поксвирусов, как вирус оспы канарейки (Сапагурох) и вирус оспы домашней птицы (Flo pox) . Однако Сапагурох и Flowpox индуцируют более слабый иммунный ответ на целевые антигены, чем вирус осповакцины, и требуют многократного введения или использования адъювантов [Vaccine. 1991. V.9. W 5. Р. 303-308.] . Существенным недостатком вакцинного вектора NDV является то, что последствия введения рекомбинантных NDV недостаточно изучены, и не ясно, безопасны ли вакцины на основе NDV для человека. Кроме того, NDV характеризуется низкой пакующей емкостью и сложностью получения векторов, несущих несколько целевых антигенов [Chem. Biodivers. 2010. V 7. W- 3. Р .677- 689 ] . Аденовирусы также имеют ряд недостатков ограничивающих их применение в качестве векторов для переноса генов. Основными недостатками аденовирусных векторов считаются: (1) неоднородность распределения вирусных рецепторов на поверхности клеток в организме, что делает множество клеток нечувствительными к аденовирусной инфекции (2) наличие мощного защитного популяционного иммунитета к известным аденовирусным векторам (3) теоретическая возможность интеграции ДН -вого генома аденовирусов в хромосомы человека (Stephen SL, Montini Е, Sivanandam VG, Al-Dhalimy M, Kestler HA, Finegold M, Grompe M, Kochanek S. Chromosomal integration of adenoviral vector DNA in vivo. J Virol. 2010 Oct ; 84 ( 19 ) : 9987-94. doi: 10.1128/JVI .00751- 10. Epub 2010 Aug 4. )
Векторы, полученные на основе вируса гриппа, имеют ряд преимуществ по сравнению с другими вирусными векторами, поскольку :
Вирусы гриппа не имеют ДНК-вой фазы в своем репликационном цикле и не могут встраиваться в геном человека или животного.
Вирус гриппа вызывает системный и мукозальный В и Т клеточный ответ к своим антигенам при заражении клеток респираторного тракта человека.
Множество различных подтипов вируса гриппа является доступным. Поскольку антитела против разновидности указанных подтипов не обладают перекрестной реактивностью, предсуществующий иммунитет к вирусному вектору у хозяина, что зачастую является проблемой в случае других живых векторов, можно обойти. Возможны также эффективные бустерные иммунизации различными подтипами вирусов гриппа, экспреесирующими одни и те же антигены.
Существует несколько типов живых гриппозных вакцин для интраназального введения (УЛЬТРАВАК® ВАКЦИНА ГРИППОЗНАЯ АЛЛАНТОИСНАЯ ЖИВАЯ (РФ) и Flumist® (USA) ) и индустриальная технология их производства с применением 10-дневных куриных эмбрионов (Guideline on Influenza Vaccines - Quality Module, European Medicines Acency, 25 April 2014 [Электронный ресурс] . URL:
http : //www. ema . europa . eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_ guideline/2014/06/WC500167817.pdf (дата обращения 01.11.2015)).
Вирусы гриппа относятся к семейству Ortomyxoviridae, которое включает роды Influenza А, В, С. Геномы вирусов гриппа А и В имеют схожую структуру, состоящую из 8 геномных фрагментов РНК негативной полярности: РВ2, РВ1, РА, НА, NA, NP, М и NS (Chou YY, Vafabakhsh R, Doganay S, Gao Q, Ha T, Palese P. One influenza virus particle packages eight unigue viral RNAs as shown by FISH analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 5; 109 (23) : 9101-6. doi : 10.1073/pnas .1206069109. Epub 2012 Apr 30) . Полимеразный комплекс PB2, PB1, PA транскрибирует одну матричную РНК (мРНК) с каждого геномного фрагмента, транслируемую в одноименный белок. У геномных фрагментов М и NS матричные РНК могут быть альтернативно сплайсированы, образуя мРНК, кодирующие белки М2 и NEP, соответственно. Все белки, за исключением белка NS и PBl-f2 (имеется не у всех штаммов) , являются структурными компонентами вирусных частиц.
Неструктурный белок NS1 накапливается в цитоплазме зараженных клеток и имеет функцию ингибитора системы интерферона (Krug RM. Functions of the influenza A virus NS1 protein in antiviral defense. Curr Opin Virol. 2015 Jun; 12:1-6. doi: 10.1016/ . coviro .2015.01.007. Epub 2015 Jan 29. Review).
Фрагментированная природа генома вируса гриппа дает возможность образования реассортантов вируса гриппа - вирусов, имеющих фрагменты генома смешанного происхождения от разных штаммов. Это является одним из механизмов антигенного разнообразия вирусов гриппа в природе и причиной возникновения пандемий вируса гриппа.
Антигенные свойства вируса гриппа определяются поверхностными гликопротеинами, образующими шипы на поверхности вирионов - гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (NA) . Молекула НА ответственна за механизмы прикрепление вируса к сиаловым рецепторам клетки и слияния вирусной и клеточной мембран для проникновения генома в цитоплазму и ядро клетки. В процессе репродукции вируса происходит расщепление (активация) НА клеточными протеазами на две субъединицы - НА1 и НА2, которые остаются соединенными дисульфидной связью (Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 1994; 371, 37-43.) . Молекула НА состоит из двух частей: глобулярной, образованной субъединицей НА1, и стволовой, которая состоит в основном из субъединицы НА2 и частично НА1. Глобулярная часть включает рецептор-связывающий сайт и пять антигенных сайтов и является основной мишенью для образования антител. Антитела, блокирующие связывание вируса с рецептором, являются нейтрализующими. Для НА1 субъединицы характерна высокая изменчивость . Стволовая часть НА расположена в непосредственной близости от вирусной мембраны и отличается слабой иммуногенностью. Субъединица НА2 играет основную роль в обеспечении слияния вирусной мембраны с эндосомальной и отличается высокой консервативностью. В соответствии с антигенной специфичностью к настоящему моменту для вируса гриппа А известно 18 подтипов НА и 11 подтипов NA. Подтипы НА HI, Н2, Н5, Нб, Н8, Н9, НИ, Н12, Н13, Н16, Н17, Н18 относят к первой группе, а НЗ, Н4, Н7, НЮ, Н14 и Н15 - ко второй группе. При этом только сероподтипы HI, Н2 и НЗ вируса гриппа А и различные антигенные варианты вируса гриппа В способны к распространению в человеческой популяции, вызывая пандемии или сезонные эпидемии гриппа.
Специфический иммунитет, вырабатываемый после перенесенного заболевания или вакцинации одним сероподтипом, слабо защищает от инфекции другим сероподтипом вируса гриппа А. Иммунитет к любому сероподтипу вируса гриппа А не защищает от вируса гриппа В и наоборот, иммунизация против гриппа В не эффективна в отношении вируса гриппа А. В связи с этим существует настоятельная необходимость создания универсальной гриппозной вакцины, эффективной по отношению ко всем известным антигенным разновидностям вируса гриппа А и В.
В основе необычайно быстрой изменчивости вируса гриппа, а значит, и его ускользания от действия нейтрализующих антител лежат два механизма: 1) накопление точечных мутаций, ведущих к изменению антигенной структуры поверхностных гликопротеинов (антигенный дрейф) и 2) реассортация геномных сегментов. Они приводят к появлению новых антигенных вариантов вируса (антигенный шифт) , которые могут вызывать пандемию.
Для всех гриппозных вакцин, применяемых в настоящее время, характерен риск низкой эффективности при иммунизации пожилых людей и маленьких детей (Jefferson Т, Rivetti A, Di Pietrantonj С, Demicheli V, Ferroni Е. Vaccines for preventing influenza in healthy children. Cochrane Database Syst Rev 2012; 8, CD004879.;
Osterholm MT, Kelley NS, Sommer A, Belongia EA. Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 2011; 12, 36-44; Pfleiderer M, Trouvin JH, Brasseur D, Granstrom M, Shiv i R, Mura M, Cavaleri M. Summary of knowledge gaps related to quality and efficacy of current influenza vaccines. Vaccine 2014; 32, 4586-91) . Кроме того, эти вакцины защищают от циркулирующих штаммов только в случае совпадения эпидемического вируса с вакцинным штаммом по антигенным свойствам. Именно высокой изменчивостью поверхностных антигенов вируса гриппа, НА и NA, обусловлена необходимость проведения ежегодной вакцинации и обновления состава вакцин. Следует отметить, что сезонные вакцины, формируемые на основании рекомендаций ВОЗ, неэффективны в случае внезапного появления нового пандемического штамма, кардинально отличающегося от всех циркулирующих вариантов, как это произошло в 2009 г. при появлении пандемического вируса A/California/7/2009 (HlNlpdm09) . Еще одним примером может служить низкая эффективность компонента H3N2 сезонной вакцины 2014 г., обусловленная появлением нового антигенного варианта этого сероподтипа в результате антигенного дрейфа (Skowronski DM, Chambers С, Sabaiduc S, De Serres G, Dickinson JA, Winter AL, Drews SJ, Fonseca K, Charest H, Gubbay JB, Petric M, Krajden M, Kwindt TL, Martineau C, Eshaghi A, Bastien N, Li Y. Interim estimates of 2014/15 vaccine effectiveness against influenza A(H3N2) from Canada's Sentinel Physician Surveillance Network, January 2015. Euro Surveill 2015; 20) . За последние 60 лет разработано множество вариантов живых и инактивированных гриппозных вакцин, имеющих определенные преимущества и недостатки, однако ни один из известных препаратов не решает проблемы контроля над заболеваемостью гриппом из-за их неспособности вызывать кросс-протективный иммунитет к постоянно эволюционирующим вирусам гриппа. В связи с этим существует настоятельная необходимость в создании универсальной гриппозной вакцины, вызывающей широкий кросс- протективный длительный иммунитет, способный противостоять всем известным известным циркулирующим сероподтипам вирусам гриппа Ά и В.
Все известные противогриппозные вакцины - инактивированные (цельновирионные, сплит или субъединичные) или живые ( аттенуированные холодоадаптированные) - в основном направлены на создание иммунитета к глобулярной части НА. В отличие от изменчивой глобулярной части, стволовая часть НА отличается консервативностью среди вирусов гриппа А (I и II группы) и В. Для антител, индуцированных к этому району НА, известно несколько механизмов как прямой, так и непрямой нейтрализации. Один из механизмов прямой нейтрализации связан с предотвращением конформационного изменения НА, которое необходимо для высвобождения пептида слияния и последующего объединения эндосомальной и вирусных мембран для доставки вирусного генома в клетку. Второй механизм прямой нейтрализации связан с предотвращением активационного расщепления НА на субъединицы НА1 и НА2 с помощью антител, взаимодействующих с участком НА в непосредственной близости от сайта расщепления. В механизмах непрямой нейтрализации задействованы антителозависимая и комплементзависимая цитотоксичность (Terajima М, Cruz J, Со MD, Lee JH, Kaur К, rammert J, Wilson PC, Ennis FA. Complement- dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies. J Virol 2011; 85, 13463-7.; Jegaskanda S, Weinfurter JT, Friedrich TC, Kent SJ. Antibody-dependent cellular cytotoxicity is associated with control of pandemic H1N1 influenza virus infection of macaques. J Virol 2013; 87, 5512-22) .
Антитела к стволовому участку НА при вакцинации практически не образуются и выявляются в небольшом количестве только после естественной инфекции (Moody MA, Zhang R, Walter ЕВ, Woods CW, Ginsburg GS, McClain MT , Denny TN, Chen X, Munshaw S, Marshall DJ, Whitesides JF, Drinker MS, Amos JD, Gurley TC, Eudailey JA, Foulger A, DeRosa KR, Parks R, Meyerhoff RR, Yu JS, Kozink DM, Barefoot BE, Ramsburg EA, Khurana S, Golding H, Vandergrift NA, Alam SM, Tomaras GD, Kepler ТВ, Kelsoe G, Liao HX, Haynes BF . H3N2 influenza infection elicits more cross-reactive and less clonally expanded anti-hemagglutinin antibodies than influenza vaccination. PLoS ONE 2011; 6, e25797) .
Большинство разрабатываемых в настоящее время подходов к получению универсальной вакцины основано на фокусировании иммунного ответа к консервативным участкам белков вируса гриппа. Антитела к консервативным внутренним белкам РВ2, РВ1, PA, NP и Ml не относятся к нейтрализующим, но могут играть важную роль в обеспечении элиминации вируса за счет антителозависимой цитотоксичности (ADCC) .
Известно несколько примеров создания универсальной вакцины на основе субъединицы НА2. Трехкратная иммунизация мышей пептидами, представляющими эктодомен НА2 (23-185 аминокислотные остатки) или пептид слияния (1-38 аминокислотные остатки), в комбинации с адъювантами KLH (keyhole ^impet hemocyanin) и Фрейнда индуцировала кросс-реактивный иммунитет, снижающий гибель животных при летальной инфекции гетерологичным штаммом (Stanekova Z, Kiraly J, Stropkovska A, Mikuskova T, Mucha V, Kostolansky F, Vareckova E. Heterosubtypic protective immunity against influenza A virus induced by fusion peptide of the hemagglutinin in comparison to ectodomain of M2 protein. Acta Virol 2011; 55, 61-7) . Более эффективная защита развивалась при вакцинации химерными конструкциями НА. Krammer с соавт. показали, что гетеросубтипичный гуморальный иммунитет у мышей индуцируется при иммунизации химерными белками, содержащими глобулярные части НА от штаммов разных сероподтипов и одинаковую стволовую часть НА (Krammer F, Palese Р, Steel J. Advances in universal influenza virus vaccine design and antibody mediated therapies based on conserved regions of the hemagglutinin. Curr Top Microbiol Immunol 2014; 386, 301-21.; Krammer F, Hai R, Yondola M, Tan GS, Leyva-Grado VH, Ryder AB, Miller MS, Rose JK, Palese P, Garcia-Sastre A, Albrecht RA. Assessment of influenza virus hemagglutinin stalk-based immunity in ferrets. J Virol 2014; 88, 3432-42) . К недостаткам этого подхода следует отнести сложную схему иммунизации, которая включает электропорацию животных с помощью ДНК и двукратную иммунизацию белковыми конструкциями внутримышечно и интраназально с адъювантом poly ( I : С) .
Другим примером служит использование стабильных конструкций (мини-НА) , полученных генно-инженерным способом на основе аминокислотной последовательности стволовой части НА вируса сероподтипа H1N1. Из большой коллекции отбирали только конструкции с самой высокой аффинностью к антителам, обладающим нейтрализующей активностью широкого спектра. Иммунизация мышей такими конструкциями также защищала животных от гибели при инфицировании штаммом I группы - высокопатогенным вирусом гриппа птиц сероподтипа H5N1 (Impagliazzo A, Milder F, Kuipers Н, Wagner MV, Zhu X, Hoffman RM, van Meersbergen R, Huizingh J, Wanningen P, Verspuij J, de Man M, Ding Z, Apetri A, Kukrer B, Sneekes-Vriese E, Tomkie icz D, Laursen NS, Lee PS, Zakrzewska A, Dekking L, Tolboom J, Tettero L, van Meerten S, Yu W, Koudstaal W, Goudsmit J, Ward AB, Meijberg W, Wilson IA, Radosevic K. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science 2015; 349, 1301-6) . Стопроцентная защита мышей от гибели достигалась в результате двукратной внутримышечной иммунизации очищенным белком мини-НА в дозе 30 мкг с адъювантом Matrix-M производства компании Novava .
Еще одно из перспективных направлений в разработке универсальной гриппозной вакцины основано на создании самособирающихся наночастиц, которые, как показано ранее, значительно повышают иммуногенные свойства НА (Kanekiyo М, Wei СJ, Yassine НМ, McTamney РМ, Boyington JC, Whittle JR, Rao SS, Kong WP, Wang L, Nabel GJ. Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies. Nature 2013; 499, 102-6) . Животным двукратно или трехкратно внутримышечно вводили наночастицы с добавлением нового адъюванта SAS (Sigma Adjuvant System) . Несмотря на отсутствие выработки нейтрализующих антител после иммунизации наночастицами, как мыши, так и хорьки оказались полностью защищены от гибели при заражении высокопатогенным вирусом гриппа птиц сероподтипа H5N1.
Одна из современных технологий получения живой вакцины основана на конструировании вакцинных векторов, в котором один вирус экспрессирует антигены другого вируса. В качестве векторов, экспрессирующих гриппозные антигены, используют различные ДНК-содержащие вирусы, а именно: аденовирус, герпесвирус, бакуловирус или поксвирус (Dudek Т, Knipe DM. Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors. Virology 2006; 344, 230-9.; He F, Madhan S, Kwang J. Baculovirus vector as a delivery vehicle for influenza vaccines. Expert Rev Vaccines 2009; 8, 455-67.; Draper SJ, Cottingham MG, Gilbert SC. Utilizing poxviral vectored vaccines for antibody induction- progress and prospects. Vaccine 2013; 31, 4223-30. Price GE, Soboleski MR, Lo CY, Misplon JA, Pappas C, Houser KV, Tumpey TM, Epstein SL. Vaccination focusing immunity on conserved antigens protects mice and ferrets against virulent H1N1 and H5N1 influenza A viruses. Vaccine 2009; 27, 6512-21) . Так, при применении аденовирусного вектора показано, что трехкратная иммунизация плазмидой (50 мкг) , содержащей последовательности консервативных белков NP и М2 вируса гриппа А, с последующим интраназальным заражением двумя аденовирусными векторами, экспрессирующими эти же белки, полностью защищала мышей и хорьков от гибели и потери веса при заражении вирулентным вирусом А/ЕМ/ 1/47 (H1N1) или высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1.
Таким образом, все перечисленные подходы фокусирования иммунного ответа в отношении консервативных антигенов вируса гриппа подтверждают принципиальную возможность создания гриппозной вакцины, которая способна защищать от заражения различными вариантами вируса гриппа А. Однако, для достижения этой цели использовались сложные схемы многократной вакцинации животных с применением иммунологических адъювантов различной природы. Кроме того, ни один из известных экспериментальных препаратов универсальной гриппозной вакцины не обеспечивал защиту от вируса гриппа В. К этому следует добавить, что перечисленные выше экспериментальные препараты требуют сложных технологических процесов производства многокомпонентных вакцин, сопряженых с неприемлемо высокой стоимостью конечного препарата.
Известно, что экспрессия антигенов в клетках носовой полости приводит к индукции системного и локального респираторного мукозального В- и Т-клеточного иммунного ответа. Были осуществлены многочисленные попытки использования вирусов гриппа в качестве векторов для доставки и экспрессии посторонних геномных последовательностей в клетках респираторного тракта животных. Среди 8 геномных фрагментов вирусов гриппа А или В только NS геномный фрагмент способен стабильно удерживать геномные вставки более 800 нуклеотидов в составе рамки считывания неструктурного белка NS1, без нарушения структуры образующихся вирионов (Kittel Cr Sereinig S, Ferko Br Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfer A, Katinger H, Egorov A. Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame. Virology. 2004 Jun 20;324 (1 ): 67-73. PubMed PMID: 15183054) . Более того, из всех белков вируса гриппа, только NS1 белок, в норме содержащий 230-237 аминокислотных остатков, может быть подвергнут 50% укорочению с карбоксильного конца без существенного нарушения репродукционной активности вируса в культуре клеток, куриных эмбрионах или в респираторном тракте животных [Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova Jr Ferko B, Katinger Dr Grassauer Л, Alexandrova G, Katinger Hr Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998 Aug;72 (8) : 6437-41. PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801) . Такое укорочение NS1 белка создает пространство для имплементации продолжительных вставок чужеродных геномных последовательностей без нарушения морфологии и основных функций вируса, что позволяет конструировать генетически стабильные векторы. В связи с этим были получены гриппозные векторы на основе вируса гриппа А, которые кодировали укороченную рамку считывания от 80 до 126 аминокислотных остатков NS1 белка, которая могла быть продолжена вставками последовательностей антигенов различных патогенов бактериальной и вирусной природы, например последовательности белков микобактерии туберкулеза, бруцеллы абортус или вируса иммунодефицита человека (Tabynov Кг Sansyzbay Ar Kydyrbayev Zr Yespembetov В, Ryskeldinova S, Zinina N, Assanzhanova N, Sultankulova K, Sandybayev N, Khairullin B, Kuznetsova Ir Ferko Br Egorov A. Influenza viral vectors expressing the Brucella OMP16 or L7/L12 proteins as vaccines against B. abortus infection. Virol J. 2014 Apr 10 11:69. doi: 10.1186/1743-422X-11-69. PubMed PMID: 24716528/ PubMed Central PMCID: PMC3997475/ Sereinig S, Stukova Mr Zabolotnyh N, Ferko Вr Kittel C, Romanova J, Vinogradova Ir Katinger Hr Kiselev O, Egorov A. Influenza virus NS vectors expressing the mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein induce CD4+ Thl immune response and protect animals against tuberculosis challenge . Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug/13 (8) : 898-904. PubMed PMID: 16893990/ PubMed Central PMCID: PMC1539114 / Ferko В, Stasakova , Sereinig S, Romanova J, Katinger D, Niebler Br Katinger H, Egorov A. Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice. J Virol. 2001 Oct/75 (19) : 8899-908. PubMed PMID: 11533153/ PubMed Central PMCID: PMC114458) . При этом оптимальными по параметрам репродукции в куриных эмбрионах и иммуногенности у животных оказались конструкции, несущие NS1 белок, укороченный до 124 аминокислотных остатков (далее векторы NS1-124) (Ferko Br Stasakova J, Romanova J, Kittel Cr Sereinig Katinger H, Egorov A. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. J Virol. 2004 Dec/ 78 (23) : 13037-45. PubMed PMID: 15542655/ PubMed Central PMCID: PMC524997) .
Конструкции с большим укорочением NS1 белка обладали сниженной способностью к росту в интерферон компетентных клетках (клетки MDCK, А549), включая 10-дневные куриные эмбрионы, и были пригодны для производства только в интерферон-дефицитных клетках Vero. С другой стороны, векторы с длиною NS1 в 124-126 аминокислотных остатков варьировали по уровню аттенуации и были недостаточно безопасны у животных. Например, уровень репродукции вирусных векторов, несущих в указанной позиции микобактериальныи белок ESAT-6, в легких мышей мог достигать значений, близких к показателям патогенных вирусов гриппа (104 и более вирусных частиц на грамм ткани легкого) . Более того, векторы NS1-124 при заражающей дозе >5.0 log/ мышь могли вызвать существенную репродукцию вируса в легочной ткани инфицированных мышей и образование видимой легочной патологии (Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998 Aug;72 (8) : 6437-41. PubMed PMID: 9658085; PubMed Central PMCID: PMC109801; Stukova MA, Sereinig S, Zabolotnyh NV, Ferko B, Kittel Cr Romanova J, Vinogradova TI, Katinger H, Kiselev 01, Egorov A. Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein. Tuberculosis (Edinb) . 2006 May-Jul ; 86 (3-4) :236-46. PubMed PMID: 16677861) . Таким образом, гриппозные векторы с укороченной рамкой считывания белка NS1 до 124 аминокислотных остатков не могут использоваться для вакцинации людей, поскольку не соответствуют параметрам безопасности, разработанным для живых гриппозных вакцин, где непременным условием является температурочувствительность вируса (сниженная способность размножаться при температуре 39°С) и отсутствие активной репродукции вируса в нижнем респираторном тракте животных (Maassab HF, Bryant ML. The development of live attenuated cold- adapted influenza virus vaccine for humans. Rev Med Virol. 1999 Oct-Dec; 9 (4) : 237-44. Review. PubMed PMID: 10578119; Gendon IuZ . [Live cold-adapted influenza vaccine: state-of-the-art]. Vopr Virusol. 2011 Jan-Feb; 56 (1) : 4-17. Review. Russian. PubMed PMID: 21427948; Aleksandrova GI, Gushchina MI, Klimov AI, Iotov W. [Genetic basis for construction of the life influenza type A vaccine using temperature-sensitive mutants] . Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1990 Mar;(3):3-8. Review. Russian. PubMed PMID: 2194119; Kendal AP . Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? Eur J Epidemiol. 1997 Jul; 13 (5) : 591-609. Review. PubMed PMID: 9258574).
В отличие от лицензированных живых гриппозных вакцин (УЛЬТРАВАК® ВАКЦИНА ГРИППОЗНАЯ АЛЛАНТОИСНАЯ ЖИВАЯ (РФ) или Flumist® (USA) ) , известные гриппозные векторы NS1-124 и близкие к ним конструкции не обладали фенотипическим маркером температурочувствительности (ts фенотип) и имели уровень репродукции в легких мышей, близкий к уровню вируса дикого типа с полноразмерным NS1 белком.
Попытки использования вирусов гриппа с онколитическими целями предпринимались еще в 50-60-е года 20-го века и основывались на наблюдениях практических врачей об отдельных случаях ремиссии раковых заболеваний после переболевания гриппом (Lindenmann J, Klein PA. Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cellantigen associated with influenza virus. J Exp Med. 1967 Jul 1 ; 126 ( 1 ) : 93-108 ) .
С момента разработки генно-инженерных методов для вируса гриппа в конце 90-х годов появилась возможность создания онколитических гриппозных векторов с модифицированным NS1 белком. Было показано, что укорочение NS1 белка может приводить к усилению онколитического эффекта при введении рекомбинантного вируса в опухоль за счет стимуляции системы врожденного иммунитета, антагонистом которого является NS1 белок (Sturlan S, Stremitzer S, Bauman S, Sachet M, Wolschek M, Ruthsatz T, Egorov A, Bergmann M. Endogenous expression of proteases in colon cancer cells facilitate influenza A viruses mediated oncolysis. Cancer Biol Ther. 2010 Sep 15 ; 10 ( 6 ) : 592- 9 ; Ogbomo H, Michaelis M, Geiler J, van Rikxoort M, Muster T, Egorov A, Doerr HW,Cinatl J Jr. Tumor cells infected with oncolytic influenza A virus prime natural killer cells for lysis of resistant tumor cells. Med Microbiol Immunol. 2010 May; 199 ( 2 ): 93-101. doi: 10.1007/s00430- 009-0139-0. Epub 2009 Dec 15. PubMed PMID: 20012989; Efferson CL, Tsuda N, Kawano K, Nistal-Villan E, Sellappan S, Yu D, Murray JL, Garcia-Sastre A, Ioannides CG. Prostate tumor cells infected with a recombinant influenza virus expressing a truncated NS1 protein activate cytolytic CD8+ cells to recognize noninfected tumor cells. J Virol. 2006 Jan; 80 ( 1 ): 383-94 ) .
Более того, возможность генно-инженерных манипуляций с длиной NS1 белка вируса гриппа позволила создать векторы, эффективность которых усиливалась наличием экспрессии иммунопотенциирующего агента, например, интерлейкина-15 (van Rikxoort М, Michaelis М, Wolschek М, Muster Т, Egorov A, Seipelt J, Doerr HW, Cinatl J Jr. Oncolytic effects of a novel influenza A virus expressing interleukin-15 from the NS reading frame. PLoS One. 2012; 7 (5) : e36506) .
К сожалению, в этих работах, использовались вирусы гриппа, способные к ограниченной репродукции в некоторых культурах клеток, не обладающие необходимой генетической стабильностью трансгена для широкомасштабного производства в куриных эмбрионах субстрате, оптимальном для наработки гриппозных вакцинных препаратов .
Таким образом, сохраняется потребность в новых эффективных вирусных векторах, в частности, аттенуированных гриппозных векторах, характеризующихся отсутствием активной репродукции вируса в организмах животных и обладающих фенотипом температурочувствительности, которые могут быть использованы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, индуцирующему кросс-протективный ответ против вируса гриппа А и В, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А.
В частности, настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков, более предпочтительно, в котором указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, причем указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2, и где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.
Изобретение относится также к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему белок или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из белков или их фрагментов бактерий, вирусов или простейших, представляющему собой аттенуированный вирус гриппа А по изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего белок или его фрагмент бактерий, вирусов или простейших.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему белок или его фрагмент, которые выбраны из группы, состоящей из белков вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий, возбудителя бруцеллеза или их комбинаций.
Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, экспрессирующий белок или его фрагмент патогенных бактерий, вирусов или простейших, где размер указанного белка или его фрагмента составляет от 10 до 400 аминокислот . Еще одним вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, в котором вставка кодирует участок белка НА вируса гриппа, предпочтительно, где участок белка НА представляет собой участок субъединицы НА2, выбранный из группы, состоящей из 1-185 а. к. из вируса гриппа А, 1-186 а. к. из вируса гриппа В, 23-185 а. к. из вируса гриппа А или 65- 222 а. к. из вируса гриппа А.
Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, в котором вставка кодирует последовательность участка субъединицы НА2 вируса гриппа А или вируса гриппа В от 1 до 21 а. к. и последовательность участка белка NP вируса гриппа А от 243 до 251 а. к.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ag85A, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты, в частности, где геномная последовательность вируса дополнительно содержит последовательность, кодирующую саморасщепляющийся 2А-пептид, между последовательностями, кодирующими NS1-124 и ESAT6.
Изобретение также относится к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему белок или его фрагмент вируса гриппа, представляющему собой аттенуированный вирус гриппа А, содержащий химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, причем указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2, и где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей 1-21 а. к. белка НА2 вируса гриппа В и 243-251 а. к. белка NP вируса гриппа А.
Другим объектом изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, обладающий онколитической активностью, представляющий собой аттенуированный вирус гриппа А по изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего белок или его фрагмент бактерий, вирусов или простейших.
Одним из вариантов осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, в котором вставка кодирует белок или его фрагмент, выбранные из группы, состоящей из белков или их фрагментов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий или их комбинаций.
Следующим вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, где размер кодируемого белка или его фрагмента составляет от 10 до 400 аминокислот.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является аттенуированный гриппозный вектор, имеющий онколитическую активность, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ag85A, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты, в частности, где укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, еще более предпочтительно, где укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей саморасщепляющийся 2А-пептид, и последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-6.
Объектом изобретения также является аттенуированный гриппозный вектор, индуцирующий кросс-протективный ответ против вирусов гриппа А и В, содержащий:
нуклеотидную последовательность гена белка РВ2, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ2;
нуклеотидную последовательность гена белка РВ1, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ1;
нуклеотидную последовательность гена белка РА, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности белка РА;
нуклеотидную последовательность гена белка NP, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности белка NP;
нуклеотидную последовательность гена белка М, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности гена белка М;
нуклеотидную последовательность гена белка НА, происходящую от вируса гриппа A/California/7/ 09-like HlNlpdm) , или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка НА;
нуклеотидную последовательности гена белка ΝΑ, происходящую от вируса гриппа A/California/7/ 09-like HlNlpdm), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка NA; и
нуклеотидную последовательность химерного гена белка NS, включающую
рамку считывания белка NS1, происходящую от вируса A/PR/8/34 (H1N1), где указанная рамка считывания является укороченной и кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатков,
и последовательность гена белка Nep, происходящую от вируса гриппа A/Singapore/l/57-like (H2N2), или
нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности химерного гена NS; где указанная укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид слияния субъединицы НА2 от вируса гриппа В, и нуклеотидной последовательности, кодирующей консервативный В- клеточный эпитоп нуклеопротеина (NP) вируса гриппа А. В частном варианте осуществления нуклеотидная последовательность химерного гена белка NS представлена в SEQ ID NO: 21.
Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, содержащая в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
Также объектом изобретения является фармацевтическая композиция для профилактики гриппа, содержащая в эффективном количестве аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
В частности, фармацевтическая композиция по изобретению содержит 6,5- 10,5 1одЭИД 50/мл аттенуированного гриппозного вектора и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс.% моновалентной соли, 0-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала.
Предпочтительным вариантом изобретения является фармацевтическая композиция, где буферный раствор содержит 0,5- 1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, предпочтительно, где моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [2- ( 1Н-имидазол-5-ил) этил] - пропандиамид .
Еще одним вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека .
Изобретение также относится к вакцине против инфекционного заболевания, содержащей в эффективном количестве аттенуировэнный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
Еще одним объектом настоящего изобретения является вакцина против гриппа, содержащая в эффективном количестве аттенуированный гриппозный вектор по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
В частности, вакцина по изобретению содержит 6,5-10,5 1одЭИД 50/мл аттенуированного гриппозного вектора и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс. % моновалентной соли, 0-5 масс. имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала .
Еще одним вариантом изобретения является вакцина, в которой буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01- 2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала. В предпочтительном варианте осуществления в указанном буферном растворе моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий рекомбинантный альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [2- ( 1Н-имидазол-5-ил) этил] - пропандиамид .
Один из вариантов осуществления изобретения относится к вакцине против инфекционного заболевания, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.
Изобретение также относится к применению аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у субъекта, в частности, для лечения и/или профилактики заболевания, вызванного патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса и вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека.
Еще одним объектом настоящего изобретения применение аттенуированного гриппозного вектора или фармацевтической композиции по изобретению для профилактики гриппа у субъекта.
Изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению указанному субъекту, предпочтительно к способу лечения заболевания, которое вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой млекопитающее или птицу, в частности, субъект представляет собой человека.
Следующим объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний у субъекта, содержащая аттенуированный вирус гриппа А по изобретению или аттенуированный вектор по изобретению в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель .
Одним из вариантов осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая 8,5-10,5 log ЭИД 50/мл аттенуированного вируса гриппа А по изобретению или аттенуированного гриппозного вектора по изобретению и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс. % моновалентной соли, 0-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, причем в предпочтительном варианте осуществления изобретения буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% раствора моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2% аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала.
Другим вариантом осуществления является фармацевтическая композиция, в которой в буферном растворе моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой крахмал, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [ 2- ( 1Н-имидазол-5- ил) этил] -пропандиамид .
Следующим объектом настоящего изобретения является применение аттенуированного вектора по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для лечения онкологических заболеваний у субъекта, в частности, заболеваний, выбранных из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой человека.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения онкологических заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по изобретению, аттенуированного гриппозного вектора по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению, предпочтительно, к способу лечения онкологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное введение представляет собой внутриопухолевое введение, введение в лакуну, образовавшуюся после хирургического удаления опухоли, или внутривенное введение .
Техническим результатом настоящего изобретения является получение химерных вирусов гриппа по NS геномному фрагменту и соответствующих гриппозных векторов, обладающих высокой безопасностью для людей и животных, в частности, векторов, характеризующихся отсутствием активной репродукции вируса в организме животного и обладающих фенотипом температурочувствительности, и которые могут быть использованы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний. Также техническим результатом настоящего изобретения является получение химерного по NS геномному фрагменту гриппозного вектора, обладающего свойствами универсальной гриппозной вакцины при мукозальном введении в отсутствии адъювантов. Кроме того, техническим результатом является высокий потенциал роста полученных вирусов гриппа и гриппозных векторов в 10-дневных куриных эмбрионах. Еще одним техническим результатом является получение гриппозных векторов, которые обладают свойствами универсальной гриппозной вакцины. Также техническим результатом является получение вирусов гриппа и гриппозных векторов, обладающих онколитической активностью. Еще одним техническим результатом является снижение стоимости производства вакцины против гриппа ввиду неиспользования адъювантов.
Краткое описание чертежей
На Фиг .1 показан принцип конструирования гриппозного аттенуированного вектора. В А представлена схема NS геномного фрагмента вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) . В Б представлена схема генетически модифицированного химерного NS геномного фрагмента, где рамка считывания белка NS1 укорочена и может продолжаться вставкой чужеродной последовательности. Последовательность, кодирующая белок Nep, заменена на гетерологичную от другого подтипа вируса гриппа А.
На Фиг .2 представлены нуклеотидные последовательности геномных NS фрагментов вируса дикого типа и примеры двух генетических конструкций химерной природы. В А представлен NS фрагмент вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) . В Б представлен химерный NS фрагмент вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена, а последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) .
В В представлен химерный NS фрагмент вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена, а последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) .
На Фиг .3 представлены аминокислотные последовательности белков, транслируемых в рамке считывания NS1 химерных гриппозных векторов, содержащих гетерологичный Nep от вируса A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) . На Фиг .4 представлены данные, демонстрирующие патогенность и ts-фенотип вирусов с гетерологичным Nep геном. В А показаны данные репродукции вирусов при оптимальной 34°С и повышенной 39°С температуре в клетках Vero. В Б представлены данные репродукции вирусов в легких мышей на 2-е сутки после заражения.
На Фиг .5 приведены графики, демонстрирующие защитный эффект однократной иммунизации мышей векторами, экспрессирующими части субъединицы НА2 с рамки считывания белка NS1, при контрольном заражении гетерологичными патогенными штаммами вируса гриппа. В А показана летальность при контрольном заражении вирусом A/Mississippi/85/1 (H3N2) , в В - летальность при контрольном заражении вирусом В/ Lee/40.
На Фиг .6 представлены данные по онколитическому действию рекомбинантных вирусов гриппа в отношении меланомы мышей, индуцированной введением 1х10б клеток В16 в стопу задней лапы. Терапия проводилась путем внутриопухолевого введения вируса на 5 день после имплементации опухоли. В А представлен средний размер стопы на 20 день после имплементации опухоли и 4х-кратной терапии онколитическими векторами, в Б - выживаемость мышей после проведенной 4х-кратной терапии онколитическими векторами.
На Фиг .7 показана структура гриппозного аттенуированного вектора. Обозначены 8 фрагментов генома вируса и их особенности.
Показано, что фрагменты генома РВ2, РВ1, PA, p и М имеют происхождение от вируса A/PR/8/34 (H1N1); гены поверхностных гликопротеинов НА и NA имеют происхождение от вируса A/California/7/09-like (HlNlpdm) ; NS геномный фрагмент имеет химерную структуру, кодирующую два белка: 1) укороченный до 124 аминокислотных остатка белок NS1, продолженный вставкой последовательности N- терминальной области НА2 вируса гриппа В и вставкой консервативного В-клеточного эпитопа NP белка вируса гриппа А 2) белок Nep, имеющий последовательность от гетерологичного штамма вируса гриппа А, сероподтипа H2N2 A/Singapore/1/57 -like.
На Фиг .8 представлены нуклеотидные последовательности геномных фрагментов вакцинного вектора: РВ2, РВ1, PA, NP, М - имеющие происхождение от вируса A/PR/8/34 (H1N1); НА и NA, имеющие происхождение от вируса A/California/7/09-like (HlNlpdm) ; химерного NS (вставка в рамке считывания NS1 выделена жирным шрифтом) .
На Фиг .9 представлены результаты, отражающие протективные свойства вакцинного вектора после интраназальной иммунизации мышей в отношении различных вариантов вируса гриппа А и вируса гриппа В. На графиках показан % летальности у вакцинированных мышей после контрольного заражения указаными сероподтипами вируса гриппа А или вирусом гриппа В по сравнению с контрольными животными. Вакцина вводилась однократно - 1х или двукратно - 2х.
На Фиг.10 представлены данные, демонстрирующие протективные свойства вакцинного вектора после интраназальной иммунизации хорьков. На графике А представлена динамика среднего значения тепературных колебаний после контрольного заражения вирусом A/St . Petersburg/224/2015 (H3N2) у вакцинированных и контрольных животных. На графике В представлены результаты высева контрольного вируса из носовых смывов хорьков на 2,4 и б день после заражения. Титры выражены в виде среднего значения концентрации вируса в носовых смывах, выраженных в виде значения 50% цитопатических доз/мл после титрования на клетках MDCK. Вакцина вводилась однократно - 1х или двукратно - 2х.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к полученным генно- инженерными методами аттенуированным вирусам гриппа А, которые могут применяться для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний.
В частности, настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, индуцирующему кросс- протективный ответ против вируса гриппа А и В, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А. Таким образом, подтип вируса А для последовательности, кодирующей укороченный белок NS1, отличается от подтипа вируса А, из которого получена последовательность, кодирующая белок Nep . В частности, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к аттенуированному вирусу гриппа А, в котором указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа от Н2 до Н18 человеческого или животного происхождения.
Указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков, более предпочтительно, указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.
Настоящее изобретение основано в частности на том, что авторы неожиданно обнаружили, что проблема недостаточной аттенуации (отсутствие температурочувствительности и высокий уровень репродукции в легких мышей) гриппозных векторов, в частности вектора NS1-124, может быть решена с помощью модификации второго сплайсированного белкового продукта NS геномного фрагмента вируса гриппа - белка Nep (NS2) . Оказалось, что замена геномной последовательности Nep вируса гриппа А, в частности, вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), на последовательности Nep, взятые от гетерологичных штаммов вируса гриппа, например, вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) или A/Leningrad/134/47/57 (H2N2), приводит к появлению у штамма гриппа А, в частности A/PR/8/34 (H1N1), фенотипа температурочувствительности и аттенуации. Используя этот феномен, были сконструированы химерные NS- фрагменты вируса гриппа, кодирующие укороченную рамку считывания NS1-124 от вируса A/PR/8/34 (H1N1) в комбинации с рамкой считывания белка Nep, взятой от вируса сероподтипа H2N2. Реассортантные вирусы гриппа на основе вируса A/PR/8/34, независимо от происхождения поверхностных антигенов H1N1, H5N1 или HlNlpdm, несущие химерный NS геномный фрагмент, оказались неспособными к активной репродукции при 39°С и в легких мышей (фенотип аттенуации) , но при этом по-прежнему репродуцировались до высоких титров в 10-дневных куриных эмбрионах.
Настоящее изобретение относится также к аттенуированному гриппозному вектору, экспрессирующему антиген или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из антигенов или их фрагментов бактерий, вирусов или простейших, содержащий аттенуированный вирус гриппа А согласно настоящему изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего антиген или его фрагмент бактерий, вирусов или простейших. В общем, в аттенуированный вирус согласно настоящему изобретению может быть вставлен трансген, кодирующий белок или его фрагмент из любых бактерий, вирусов или простейших, как патогенных, так и не патогенных в отношении животных и людей, в частности, белок может быть выбран из группы, состоящей из белков или их фрагментов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, бруцеллы абортус, вируса герпеса, респираторно- синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий, возбудителя бруцеллеза или их комбинаций. В частности, последовательность вставки может кодировать участок белка НА вируса гриппа, белок микобактерии туберкулеза ESAT-б, Ад85А, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты. При этом геномная последовательность аттенуированного вектора согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать последовательность, кодирующую саморасщепляющийся 2А-пептид, между последовательностями, кодирующими NS1-124 и ESAT6.
Размер антигена или его фрагмента, кодируемого последовательностью вставки, может иметь любой размер, который ограничен лишь способностью геномного фрагмента «принимать» нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген или его фрагмент. Предпочтительно, размер антигена составляет от 10 до 400 аминокислот. Например, вставка может кодировать участок белка НА, представляющий собой участок субъединицы НА2, выбранный из группы, состоящей из 1-185 аминокислот из вируса гриппа А, 1-186 аминокислот из вируса гриппа В, 23-185 аинокислот из вируса гриппа А или 65-222 аминокислот из вируса гриппа А. Нумерация аминокислот дана в соответствии с положениями аминокислот в участке субъединицы НА2 вируса гриппа, из которого происходит трансген.
Еще одним частным случаем аттенуированного гриппозного вектора согласно настоящему изобретению является вектор, в котором вставка кодирует последовательность участка субъединицы ΗΆ2 вируса гриппа А или вируса гриппа В от 1 до 21 аминокислот и последовательность участка белка NP вируса гриппа А от 243 до 251 аминокислот. Неожиданно было обнаружено, что эти варианты векторов, несмотря на короткую продолжительность вставки, проявили наилучшую защитную эффективность в отношении вируса гриппа В и гетерологчных антигенных подтипов вируса гриппа А, после однократной иммунизации мышей, т.е. проявляли свойства универсальной гриппозной вакцины.
Авторы обнаружили, что вставки чужеродных антигенных последовательностей в рамку считывания белка NS1, например, после аминокислотной позиции 124 не оказывали существенного влияния на фенотип аттенуации химерного вируса, полученного согласно настоящему изобретению. Таким образом, были получены разнообразные гриппозные векторы, обладающие необходимыми производственными характеристиками и выраженными фенотипическими и генотипическими маркерами аттенуации в соответствии с требованиями, предъявляемыми к живым гриппозным вакцинам. Независимо от природы вставок, вирусы показали свою безвредность для лабораторных животных и схожесть проявления фенотипического маркера аттенуации - наличие ts фенотипа. Общность их генетических маркеров аттенуации определялась наличием укороченной рамки считывания белка NS1 и наличием гетерологичной последовательности гена Nep, взятой от другого субтипа вируса гриппа А. В зависимости от вставки, полученные векторы проявляли свойства универсальной гриппозной вакцины, вакцины против туберкулеза т.д.
В частности, настоящее изобретение относится к полученному генно-инженерным методом вакцинному вектору на основе вируса гриппа А, который может применяться для профилактики гриппа, вызванного всеми известными штаммами, включая вирусы гриппа А и В. Более конкретно, настоящее изобретение относится к аттенуированному вирусу гриппа А, индуцирующему кросс- проте тивный ответ против вируса гриппа А и В, содержащему химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа A H2N2. Таким образом, подтип вируса А для последовательности, кодирующей укороченный белок NS1, отличается от подтипа вируса А, из которого получена последовательность, кодирующая белок Nep. В частности, в вакцинном векторе укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа от H2N2.
В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к аттенуированному гриппозному вектору, индуцирующему кросс-протективный ответ против вирусов гриппа А и В, содержащему :
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок РВ2, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ2;
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок РВ1, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ1;
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок РА, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной последовательности белка РА;
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок NP, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной последовательности белка NP;
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок М, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной последовательности гена белка М;
нуклеотидную последовательность гена, кодирующую белок НА, происходящую от вируса гриппа A/California/7/09-like HlNlpdm) , или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка НА;
нуклеотидную последовательности гена, кодирующую белок ΝΑ, происходящую от вируса гриппа A/California/7/09-like HlNlpdm), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка NA; и
нуклеотидную последовательность химерного гена белка NS, включающую
рамку считывания белка NS1, происходящую от вируса A/PR/8/34 (H1N1), где указанная рамка считывания является укороченной и кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатков,
и последовательность гена белка Nep, происходящую от вируса гриппа A/Singapore/l/57-like (H2N2), или
нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% или больше (например, 96, 97, 98 или 99%) идентичность указанной последовательности химерного гена NS;
где указанная укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид слияния субъединицы НА2 от вируса гриппа В, и нуклеотидной последовательности, кодирующей консервативный В- клеточный эпитоп нуклеопротеина (NP) вируса гриппа А.
Указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка, который продолжен двумя глицинами, вставкой Ν-терминальной области второй субъединицы гемагглютинина НА2 вируса гриппа В (23 аминокислотных остатка) и вставкой последовательности консервативного В клеточного эпитопа вируса гриппа А (7 аминокислотных остатков) . Гены поверхностных гликопротеинов указанного вектора происходят от вируса гриппа A/California/7/09 (HlNlpdm) . Гены внутренних белков РВ2, РВ1, PA, NP и М происходят от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) . Таким образом, гриппозный вектор по изобретению представляет собой сложную генетическую конструкцию, состоящую из геномных последовательностей различных штаммов вируса гриппа, а именно: 1) гены, кодирующие РВ2 , РВ1 , PA, NP и М, имеют происхождение от вируса A/PR/8/34 (H1N1) (РВ2 (Genbank accession number: АВ671295) , PB1 (Genbank accession number: CY033583), PA (Genbank accession number: AF389117), NP (Genbank accession number: AF389119) , M (Genbank accession number: AF389121)), 2) гены, кодирующие НА и NA, имеют происхождение от вируса A/California/7/09-like HlNlpdm) (НА (GenBank: КМ408964.1) и (NA GenBank: КМ408965.1), 3) ген NS имеет химерную природу, где рамка считывания белка NS1 от вируса A/PR/8/34 (H1N1) укорочена до 124 аминокислотных остатка и продолжена вставкой последовательности, кодирующей пептид слияния субъединицы НА2 от вируса гриппа В, и последовательности, кодирующей консервативный В-клеточный эпитоп нуклеопротеина (NP) вируса гриппа А, а рамка считывания белка NEP происходит от вируса гриппа подтипа H2N2.
Настоящее изобретение основано в частности на том, что авторы неожиданно обнаружили, что вектор с указанной структурой при интраназальной иммунизации мышей и хорьков без применения адъювантов вызывает защиту животных от контрольного заражения не только вирусами гриппа A (H1N1), но и вирусами гриппа Α(Η3Ν2)π гриппа В. Следовательно вакцинный вектор обладает свойствами универсальной гриппозной вакцины.
Термин «универсальная вакцина» в контексте настоящего изобретения означает вакцину, способную защищать от всех известных и неизвестных вариантов вируса гриппа. Обычные «сезонные вакцины» защищают только от вирусов, подобных тем вирусам, что входят в их состав.
Термин «мукозальная вакцина» означает, что вакцину можно вводить в полости респираторного и пищеварительного тракта и наносить на слизистые оболочки рта и носа, т.е. применять интраназально , перорально, подъязычно. Гриппозный вектор на основе вируса A/PR/8/34, несущий химерный NS геномный фрагмент, оказался неспособным к активной репродукции при 39°С и в легких мышей (фенотип аттенуации) , но при этом по-прежнему репродуцировался до высоких титров в 10- дневных куриных эмбрионах .
Настоящее изобретение относится также к аттенуированному гриппозному вектору, обладающему онколитической активностью, содержащему аттенуированный вирус гриппа А согласно настоящему изобретению, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего антиген или его фрагмент патогенных бактерий, вирусов или простейших. Указанный антиген может происходить из любых бактерий, вирусов или простейших, патогенных в отношении животных, в частности, антиген может быть выбран из группы, состоящей из антигенов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий или их комбинаций. В частности, вставленный трансген может кодировать белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ag85A, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты, дополнительно, укороченная рамка считывания гена белка NS1 может быть продолжена вставкой последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-6.
Размер антигена или его фрагмента, кодируемого последовательностью вставки, может иметь любой размер, который ограничен лишь способностью геномного NS фрагмента «принимать» нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген или его фрагмент. Предпочтительно, размер антигена составляет от 10 до 400 аминокислот.
Авторы неожиданно обнаружили, что аттенуированные гриппозные векторы, несущие химерный NS геномный фрагмент за счет включения гетерологичного Nep гена, обладают повышенной онколитической активностью при условии экспрессии антигена патогена, в частности, бактериального антигена с рамки считывания белка NS1. Например, вирусный вектор, кодирующий белок Esat6 микобактерии туберкулеза имел более высокую активность, по сравнению с известным рекомбинантным вирусом с укороченным NS1 белком, но без вставки. Не привязываясь к какой- либо теории, можно предположить, что наличие у млекопитающих напряженного противотуберкулезного иммунитета вносит вклад в иммунную атаку опухоли, зараженной вирусом, экспрессирующим туберкулезный белок.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А согласно настоящему изобретению или аттенуированный гриппозный вектор согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, в частности, инфекционного заболевания, вызываемого патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы или лейшмании .
Кроме того, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для лечения онкологических заболеваний различной этиологии, в частности, онкологическое заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть составлена в виде вакцины, содержащей в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А согласно настоящему изобретению или аттенуированный гриппозный вектор согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель .
Термин «субъект» или «животное» в контексте настоящего описания означает позвоночных, которые подвержены инфекции, вызываемой патогенными бактериями, вирусами или простейшими, включая птиц (водоплавающие, куры и т.д.) и представителей различных видов млекопитающих, таких как псовые, кошачьи, волки, хорьки, грызуны (крысы, мыши и т.д.), лошади, коровы, овцы, козы, свиньи и приматы. В одном из вариантов осуществления изобретения субъект представляет собой человека.
Под «эффективным количеством» подразумевается такое количество вируса или вектора, которое при введении субъекту, в однократной дозе или в качестве части цикла лечения, является эффективным для лечения и/или профилактики с получением терапевтического результата. Это количество может варьироваться в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, возраста, таксономической группы индивида, подвергаемого лечению, препаративной формы, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других важных факторов. Полагают, что количество может варьировать в относительно широком диапазоне, который специалист в данной области может определить стандартными способами. Фармацевтическая композиция может содержать 6-10,5 1одЭИД 50/мл, более конкретно, 6,5-10,5 1одЭИД 50/мл, в частности, 6-9,5 1одЭИД 50/мл, более конкретно, 6,5-8,5 1одЭИД 50/мл химерного вируса гриппа А согласно изобретению или гриппозного вектора согласно изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в контексте настоящего изобретения означает любой носитель, используемый в данной области, в частности, воду, физиологический раствор, буферный раствор и т.п. В одном из вариантов осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс. % моновалентной соли, 0-5 масс. имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, предпочтительно, указанный буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала, в наиболее предпочтительном варианте, моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия.
Имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [ 2- ( 1Н-имидазол-5-ил) этил] -пропандиамид, имеющий орму
Figure imgf000040_0001
Человеческий альбумин может представлять собой рекомбинантный альбумин или донорский альбумин.
Настоящее изобретение относится также к применению аттенуированного вируса гриппа А, аттенуированного гриппозного вектора или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у субъекта, в частности, инфекционного заболевания, вызываемого патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы или лейшмании .
Настоящее изобретение относится также к применению аттенуированного гриппозного вектора или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для профилактики гриппа .
Дополнительно, настоящее изобретение также относится к способам лечения, в которых для введения субъекту используют аттенуированный вирус гриппа А, аттенуированный гриппозный вектор или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Способы предназначены для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными вирусами, бактериями или простейшими, в частности, инфекционных заболеваний, вызываемых патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно- синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы или лейшмании. Кроме того, способы предназначены для лечения онкологических заболеваний у субъекта, в частности, онкологическое заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.
Введение субъекту может осуществляться любыми стандартными методами, в частности, внутримышечно, внутривенно, перорально, сублингвально , ингаляционно или интраназально . Гриппозный вектор или фармацевтическую композицию можно вводить субъекту один, два или более раз, предпочтительным является однократное введение.
Дополнительно, в случае лечения онкологических заболеваний введение может представлять собой внутриопухолевое введение, введение в лакуну, образовавшуюся после хирургического удаления опухоли, или внутривенное введение.
Далее изобретение проиллюстрировано примерами осуществления, не ограничивающими объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение гриппозных векторов с модифицированным MS геномным фрагментом
Сборка рекомбинантных вирусов осуществлялась в несколько этапов. На первом этапе синтетическим путем были получены комплементарные ДНК (кДНК) копии всех восьми геномных фрагментов вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), используя данные генетического банка (pHW-PR8-HA (Genbank accession number: EF467821.1), pHW- PR8-NA (Genbank accession number: AF389120.1), pH -PR8-PB2 (Genbank accession number: AB671295) , pHW-PR8-PBl (Genbank accession number: CY033583) , pHW-PR8-PA (Genbank accession number: AF389117), pHW-PR8-NP (Genbank accession number: AF389119) , pHW-PR8-M (Genbank accession number: AF389121), pHW- PR8-NS (Genbank accession number: J02150.1)) . На втором этапе синтезированные последовательности были клонированы в двунаправленный вектор на основе плазмиды pHW2000 (Hoffmann Е, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 ( 11 ): 6108-13.) . Указанный плазмидный вектор благодаря наличию Pol I и Pol II промоторов обеспечивает одновременную внутриклеточную транскрипцию вирусных и соответствующих матричных РНК при трансфекции клеток млекопитающи .
Было получено 7 плазмидных клонов, кодирующих РВ1, РВ2, РА, НА, NA, NP, М без модификаций, и набор вариантов NS геномного фрагмента с модификациями, принцип которых представлен на Фиг .1.
На Фиг .1А представлена схема NS геномного фрагмента вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) . Полноразмерный геномный фрагмент вирусной РНК (вРНК) негативной полярности имеет длину 230 нуклеотидов (нт) . Транскрипция NS фрагмента, полимеразным комплексом вируса гриппа, приводит к образованию 2 типов матричных РНК: 1. Прямого транскрипта - мРНК белка NS1, кодирующую белок NS1 длиной в 230 аминокислотных остатков (ак) и сплайсированную мРНК белка Nep, кодирующую белок длиной в 121 ак. На Фиг .1Б представлена схема генетически модифицированного химерного NS геномного фрагмента, где рамка считывания белка NS1 до 398 нт и может продолжаться вставкой чужеродной последовательности, заканчивающаяся тройным стоп кодоном. Последовательность, кодирующая белок Nep заменена на гетерологичную от другого подтипа вируса гриппа А. В результате модификации, химерный геномный NS фрагмент имеет неопределенную длину, в зависимости от длины вставки чужеродной последовательности в рамку считывания NS1.
В качестве основы для создания химерной конструкции геномного сегмента NS была использована нуклеотидная последовательность вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), включая кодирующую, а также 5'и 3' некодирующие концевые участки (номер последовательности в базе GenBank J02150) . В зависимости от цели, были сконструированы различные варианты химерных конструкций NS геномного фрагмента, где общими признаками являлись: 1) замена кодирующей белок Nep последовательности вируса A/PR/8/34 (H1N1) на последовательность, имеющую происхождение от вирусов гриппа подтипа H2N2 (штаммы: A/Singapore/1/57 и A/Leningrad/ 134/ 4 /57 ) (Фиг. 2Б и 2В) ; 2) делеция последовательности из 30 нуклеотидов (позиции 499-428 нт) в участке, кодирующем NS1, до сайта сплайсирования Nep; 3) ограничение рамки считывания белка NS1 до 124 аминокислотных остатков путем внедрения кассеты из трех последовательных стоп- кодонов (TGATAATAA) после нуклеотидной позиции 399 (Фиг.2А и Фиг.2Б); 4) наличие или отсутствие последовательности чужеродной генетической последовательности, введенной в рамку считывания NS1 после нуклеотидной позиции 398, непосредственно перед кассетой стоп-кодонов .
На Фиг .2А приведена последовательность SEQ ID NO : 1 NS фрагмента вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), в которой выделена и подчеркнута последовательность из 30 нт, подлежащая делеции при конструировании Б и В. Жирным шрифтом выделена последовательность Nep гена, подлежащая замене на гетерологичный аналог от другого подтипа вируса гриппа А. На Фиг .2Б приведена последовательность SEQ ID NO : 2 рекомбинантного NS фрагмента вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена до 398 нт, с помощью вставки, состоящей из трех последовательных стоп- кодонов (подчеркнуто ) , и последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) . На Фиг.2В приведена последовательность SEQ ID NO: 3 рекомбинантного NS фрагмента вируса гриппа А, где рамка считывания белка NS1 укорочена до 398 нт, с помощью вставки, состоящей из трех последовательных стоп-кодонов (подчеркнуто) , и последовательность Nep, выделенная жирным шрифтом, заимствована от вируса A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) .
AGСAAAAGСAGGGТGACAAAGACATAATGGATССAAACACTGTGTСAAGСTTTСAGGTA GATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCC TTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACAT СGAGACAGССACACGTGСTGGAAAGСAGATAGTGGAGСGGATTСTGAAAGAAGAATССGATGAG GCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGG AAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAG AATGGACСAGGСGATСATGGATAAAAACATCATACTGAAAGCGAACTTCAGTGTGATTTTTGAC CGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTT CACCATTGCСTTСTСTTСCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAAAAATGCAGTTGGAGTCCTCAT CGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTGAAACTCTACAGAGATTCGCTTGG AGAAGCAGTAATGAGAATGGGAGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGAGAAATGGCGGGAA CAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAGATGGTTGATTGAAGAAGTGAGACACAAACTGAAGG TAACAGAGAATAGTTTTGAGCAAATAACATTTATGCAAGCСTTACATCTATTGCTTGAAGTGGA GCAAGAGATAAGAACTTTCTCATTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCT CT
(SEQ ID NO: 1)
AGСAAAAGСAGGGTGACAAAGACATAATGGATССAAACACTGTGTСAAGСTTTСAGGTA GATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCC TTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACAT СGAGACAGССACACGTGСTGGAAAGСAGATAGTGGAGСGGATTСTGAAAGAAGAATССGATGAG GCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGG AAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAG AATGGACCAGGCGATCATGTGATAATAAAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTG CTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAG GACATACTAATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGA TAACACAGTTCGAGTCTCTAAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGTGAAACAGTAATGAGAATGGG AGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTAGGTCAAAAGTTCGAA GAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGC AAATAACATTTATGCAAGCCTTACAGCTACTATTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTC GTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (SEQ ID NO : 2 )
AGСAAAAGСAGGGTGACAAAGACATAATGGATССAAACACTGTGTСAAGСTTTСAGGTA GATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCC TTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACAT СGAGAC GСС C CGTGСTGGAAAGС GAT GTGGAGСGGATTСTGAAAGAAGAATССGATGAG GCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGG AAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAG AATGGACCAGGCGATCATGTGATAATAAAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTG CTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAG GACATACTAATGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGA TAACACAGTTCGAGTCTCTAAAACTCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGG AGACCTCCACTCACTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGCGAGAACAATTAGGTCAAAAGTTCGAA GAAATAAGATGGCTGATTGAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGC AAATAACATTTATACAAGCCTTACAGCTACTATTTGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTC
GTTTCAGCTTATTTAATAATAAAAAACACCC TGT TCTACT (SEQ ID NO : 3 )
Таким образом, сконструированные химерные NS геномные фрагменты, при их транскрипции полимеразным комплексом вируса гриппа, формировали два типа матричной РНК: 1) NS1 мРНК, транслируемая в форме укороченного до 124 аминокислотных остатков NS1 белка, ограниченного стоп-кодонами или продолжающегося вставкой последовательностей трансгенов различного происхождения, трансляция которых ограничивается кассетой из стоп-кодонов; 2) Nep мРНК гетерологичного происхождения от вируса гриппа А другого антигенного подтипа. Варианты трансляции рекомбинантного NS1 белка со вставками представлены на Фиг .3 и в Таблице 1 ниже.
Таблица 1
Аминокислотные последовательности белков, транслируемых в рамке считывания NS1, рекомбинантных вирусов, имеющих гетерологичный
Nep от вируса A/Leningrad/134/47/57 (H2N2)
Обозначение Аминокислотная последовательность Описание
NS124/Nep-Len MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLI РК считывания NS1 белка QKVAGPLCIRMDQAIM ( SEQ ID NO : 4 ) без вставки чужеродной
последовательности
NS124-HA2 (А) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной 185 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLI РК считывания NS1 белка,
QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHH транслируемой
QNEQGSGYAADQKSTQNAINGITN VNTVIEKM IQ последовательностью
FTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDI TYNAEL ( выделено жирным
LVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIG шрифтом) НА2 вируса
NGCFEFYHKCD ECMESVRNGTYDYPKYSEESKL R гриппа А, с 1 по 185
EKVDGVKLESMGIYQ (SEQ ID NO : 5 ) ак .
NS124-HA2 (А) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной 65-222 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLI PK считывания NS1 белка, QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
AVGKEFNKLEKRMENLNK VDDGFLDI транслируемой
WTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLK последовательностью
NNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNG YDYPKYS ( выделено жирным
EESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVL шрифтом) НА2
LVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 6) субъединицы вируса гриппа А, с 65 по 222 ак
NS124-HA2 (A) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной 23-185 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка,
QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
GYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGI транслируемой
TNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKV последовательностью
DDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYE ( выделено жирным
KVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGT шрифтом) НА2 вируса
YDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQ (SEQ гриппа А, с 23 по 185
ID NO: 7) ак
NS124-HA2 (В) - MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной 186 RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка, QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
GFFGAIAGFLEGG EGMIAG HGYT транслируемой
SHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVK последова ельностью NLQRLSGAMNGLHDEILELDEKVDDLRAD ISSQIE ( выделено жирным LAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEI шрифтом) НА2 GNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFD субъединицы вируса (SEQ ID NO: 8) гриппа В, с 1 по 186 ак
NS124-FUS (A) -NP MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка, QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
GLFGAIAGFIEGG TGMIDGW-GG-RESRNPGNA транслируемой
(SEQ ID NO: 9) последовательностью
( выделено жирным шрифтом) НА2 субъединицы вируса гриппа А, с 1 по 21 ак, и
последовательностью консервативного В- клеточного эпитопа NP белка вируса гриппа A. GG- глициновые вставки, разделяющие компоненты
конструкции .
NS124-Fus (В) -NP MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка, QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGW -GG-RESKNPGNA транслируемой
(SEQ ID NO: 10) последовательностью
( выделено жирным шрифтом) НА2 субъединицы вируса гриппа В, с 1 по 21 ак и последова ельностью консервативного В- клеточного эпитопа NP белка вируса гриппа A. GG- глициновые вставки, разделяющие компоненты
конструкции .
NS124-Esat6 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка, QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSL транслируемой
TKLAAA GGSGSEAYQGVQQKWDATATEL NALQNL последова ельностью ARTISEAGQAMASTEG VTGMFA (SEQ ID ( выделено жирным NO: 11) шрифтом) белка Esat6 микобактерии туберкулеза
NS124-2A-Esat6 MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка,
QKVAGPLCIRMDQAIM-GG- продолжающейся
NFDLLKLAGDVESNPGP- транслируемой
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSL последова ельностью TKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATEL NALQNL ( выделено жирным ARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA ( SEQ ID шрифтом) само-
NO: 12) pасцепляющегося
пептида 2A (происхождения из пикорнавирусов) и последова ельностью белка Esat6 микобактерии туберкулеза
NS124-HSV-2ASY MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRL Вирус с укороченной
RRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE до 124 ак рамкой
SDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPK считывания NS1 белка,
QKVAGPLCIRMDQAIM-AAA-NLLTTPKFT-AAA- продолжающейся
RMLGDVMAV-AAA-NLLTTPKFT-AAA- транслируемыми
RMLGDVMAV (SEQ ID NO: 13) последова ельностями
(выделено жирным шрифтом) Т-клеточных эпитопов вируса простого герпеса
(HSV) 1 и 2 типов. Вставки эпитопов сделаны с повтором
Сборка рекомбинантных вирусов осуществлялась путем трансфекции клеток VERO семью плазмидами, кодирующими геномные немодифицированные фрагменты вируса гриппа, и одним из вариантов NS геномного фрагмента химерной природы, используя метод электропорации плазмидной ДНК (Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza) ) в соответствии с инструкцией к применению. После трансфекции клетки инкубировались в среде Optipro (Invitrogen) в течение 96 часов при 34°С с добавлением трипсина 1 мкг/мл для обеспечения пост-трансляционного расщепления предшественника гемагглютинина на субъединицы НА1 и НА2. Вирусный урожай с клеток Vero использовался для заражения 10-дневных куриных эмбрионов (SPF) . Эмбрионы инкубировались в течение 48 часов при 34°С, после чего аллантоисные жидкости, имеющие положительный титр в реакции гемагглютинации, использовались для проведения второго пассажа на куриных эмбрионах. Аллантоисные жидкости второго пассажа аликвотировались и хранились при -80°С. Материал второго пассажа использовался для контроля генетической структуры химерного NS фрагмента и присутствия трансгена путем получения РТ-ПЦР продукта и его секвенирования . Кроме того, материал второго пассажа использовался для определения фенотипических маркеров рекомбинантных вирусных штаммов и векторов и определения генетической стабильности трансгена в течение 5 пассажей на куриных эмбрионах.
Пример 2
Определение фенотипа температурочувствительности и аттенуации рекомбинантных вирусов, несущих гетерологичный Nep
Температурочувствительность вирусов определяли путем сравнительного титрования инфекционной активности вирусов на клетках Vero при оптимальной 34°С и повышенной 39°С температурах, в 9б-луночных планшетах. Титры вирусов подсчитывали методом Рида и Мюнча после инкубации в течение 96 часов с учетом развития цитопатического эффекта в лунках планшета (Reed, L.J.; Muench, Н. (1938) . "A simple method of estimating fifty percent endpoints". The American Journal of Hygiene 27: 493-497.) . Ha Фиг .4A представлены титры вирусов, при указанных температурах, выраженные в тканевых 50% цитопатических дозах (Log ТЦД50/мл) . Неожиданно оказалось, что у обоих вирусов, несущих гетерологичный Nep, от штаммов A/Singapore/1/57 (H2N2) или A/Leningrad/134/47/57 (H2N2), наблюдается существенное > 41од снижение инфекционных титров при температуре 39°С, по сравнению оптимальной температурой 34°С. Контрольные штаммы - вирус дикого типа A/PR/8/34 (H1N1) и рекомбинантный вирус NS124/Nep PR8 с укороченным NS1 белком и гомологичным Nep не имели признака температурочувствительности, эффективно размножаясь при высокой температуре. Таким образом, замена Nep приводила к появлению у вирусов ts фенотипа.
Более того, при интраназальном заражении мышей под легкой анестезией указанными вирусами, взятыми в дозе б log/мышь, у вирусов - носителей гетерологичного гена Nep, наблюдалась сниженная способность репродукции в тканях легкого (р<0,002), по сравнению с вирусом дикого типа или вирусом NS124/Nep PR8, имеющим гомологичный Nep (Фиг.4Б) . Титры вирусов в легких оценивались через 2-е суток после заражения животных путем титрования в клетках Vero осветленных гомогенатов легкого. Легочные титры выражали в log ТЦД50/г ткани легкого. Таким образом, интродукция химерного NS геномного фрагмента в штамм вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) приводила к аттенуации вируса, выражающейся в снижении его способности к размножению в нижнем респираторном тракте животных.
Пример 3
Определение ts фенотипа и аттенуации векторов, несущих химерный NS геномный фрагмент и различные вставки в рамке считывания белка NS1
Для определения влияния вставок чужеродных последовательностей в рамку считывания белка NS1 на ts фенотип вирусов, химерных по гену Nep, был получен широкий набор векторов, кодирующих вставки различной природы. Были изучены вирусы со вставками, отображенными на Фиг .3. ts-Фенотип изучался путем титрования инфекционной активности вирусов при температурах 34 и 39°С в 10-дневных куриных эмбрионах, путем определения гемагглютинирующей активности аллантоисных жидкостей, собранных через 48 часов инкубации. Титр подсчитывался методом Рида и Мюнча и выражался в log Эмбриональных 50% инфекционных доз (log ЭИД50/мл) . Как видно из данных, представленных в Таблице 2, все векторы, в отличие от вируса дикого типа A/PR/8/34 (H1N1), отличались существенно сниженной способностью к репродукции при высокой температуре и соответствовали по фенотипическому маркеру ts прототипным химерным штаммам, не имеющим вставки, но несущим гетерологичный Nep . Таблица 2
Figure imgf000051_0001
Обозначения: *Длина (в аминокислотных остатках) натуральной последовательности белка NS1 до вставки; * *Происхождение гена Nep от штамма: A/PR/8/34 (H1N1) или A/Singapore/ 1/57 ( H2N2 ) или A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) ; **^Б-фенотип считается положительным, если разница в росте вируса при 34 и 39°С превышает 2 log
Для определения влияния вставок на аттенуацию (att) векторных штаммов для животных мышей заражали интраназально , под легкой анестезией, вируссодержащими аллантоисными жидкостями куриных эмбрионов, зараженных вирусами или векторами представленными на Фиг .3. Аллантоисные жидкости были предварительно охарактеризованы по содержанию в них инфекционных титров вирусов. Титры выражали в log ЭИД50/ мл. Мышам вводили по
0,05 мл каждой вирусной пробы. Каждая группа мышей содержала 8 животных. В течение 12 дней оценивалась летальная активность вирусов. Оказалось, что в отличие от вируса дикого типа A/PR/8/34 (H1N1), который вызывал 50% летальный эффект при использовании материала с титром 3,2 log ЭИД50/ мл, ни один из векторов не демонстрировал 50% летальной активности у мышей при использовании доз заражения >7,5 log. Таким образом, все векторы, с химерной природой NS геномного фрагмента, независимо от вставки, были высоко аттенуированными для мышей (Таблица 3) .
Таблица
Значение летальной дозы для мышей вирусов
Figure imgf000052_0001
*фенотип аттенуации определяется отсутствием летальной активности при заражающей дозе превышающей значение 7,0 log ЭИД50/мышь.
Пример 4
Протективный ответ в отношении гетерологичных штаммов вируса гриппа А и В при контрольном заражении мышей
С целью определения протективной активности в отношении гетерологичных антигенных вариантов вируса гриппа для иммунизации мышей были использованы вирусы с поверхностными антигенами от вируса A/PR/8/34 (H1N1), несущие химерный NS геномный фрагмент с последовательностью Nep от вируса A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) . Были использованы следующие рекомбинантные вирусы, кодирующие, в рамке считывания NS1, участки субъединицы гемагглютинина НА2 : 1) вектор NS124-HA2 (А) - 185 экспрессирующий полный э тодомен НА2 вируса гриппа А, длиною в 185 аминокислотных остатков (Фиг.З, SEQ ID NO:5), 2) вектор NS124-HA2 (А) -185 экспрессирующий полный эктодомен НА2 вируса гриппа В, длиною в 186 аминокислотных остатков (Фиг.З, SEQ ID NO: 8) 3) вектор NS124-Fus (A) -NP, экспрессирующий последовательность, состоящую из N - терминальных 21 аминокислотных остатков НА2 (фью н-домен) в комбинации с последовательностью консервативного В-клеточного эпитопа NP белка вируса гриппа А (Фиг.З, SEQ ID NO: 9), и 4) вирус NS124/Nep-Len, имеющий кассету из стоп-кодонов в позиции 399 нуклеотидой последовательности NS геномного фрагмента, ограничивающую трансляцию NS1 белка 124 аминокислотными остатками (Фиг.З, SEQ ID NO: ) . Для формирования контрольных групп использовался вирус дикого типа A/PR/8/34 (H1N1), не имеющий генетических модификаций, или мыши получали фосфатный буферный раствор, не содержащий активный ингредиент. Мыши были иммунизированы интраназально, под легкой анестезией, дозой вирусов 6,5 log/мышь, однократно. Через 28 дней животные были подвергнуты контрольному заражению патогенными для мышей гетерологичными штаммами вируса гриппа: A/Mississippi/85/1 (H3N2 ) или B/Lee/40, взятыми в дозе соответствующей 3-5 ЛД50, соответственно .
Как видно из Фиг .5А, контрольное заражение не иммунных мышей вирусом (H3N2) приводило к их гибели в 80% случаев. В тоже время, мыши, иммунизированные вирусными препаратами, были полностью защищены от гибели, вызываемой инфекцией гетерологичным штаммом вируса гриппа A (H3N2) . Иммунизация вирусом дикого типа также приводила к статистически достоверному уровню защиты от инфекции гетерологичным штаммом. При использовании для контрольного заражения вируса гриппа B/Lee/40, иммунизация мышей вирусом дикого типа A/PR/8/34 (H1N1) не приводила к защите животных от гибели наряду с мышами, получившими при иммунизации фосфатный буферный раствор (Фиг.5Б) . Неожиданно, рекомбинантные вирусы, несущие вставки в рамке считывания белка NS1, оказались протективными по отношению к вирусу гриппа В. При этом наилучшим показателем протективности отличался вектор NS124-Fus (A) -NP. Таким образом, векторные штаммы, несущие химерный NS геномный фрагмент, при однократной интраназальной иммунизации мышей, проявили признаки универсальной гриппозной вакцины, эффективной в отношении как гетерологичных антигенных подтипов вируса гриппа А, так и в отношении вируса гриппа В.
Пример 5
Получение гриппозного вектора с модифицированным NS геномным фрагментом кодирующим последовательность НА2 вируса гриппа В и поверхностные гликопротеины вируса HlNlpdm
Сборка рекомбинантного вируса осуществлялась в несколько этапов. На первом этапе синтетическим путем были получены комплиментарные ДНК (кДНК) копии 5 геномных фрагментов ( РВ2 , РВ1, PA, NP, М) вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) (РВ2 (Genbank accession number: АВ671295) , FBI (Genbank accession number: CY033583), PA (Genbank accession number: AF389117), NP (Genbank accession number: AF389119) , M (Genbank accession number: AF389121)) и 2 геномных фрагмента (HA, NA) вируса A/California/7/09-like (НА (GenBank: КМ408964.1) и (NA GenBank: KM408965.1 ) ) , а также синтезирован химерный геномный фрагмент NS, составленный из последовательностей, относящихся к вирусу H1N1 (ген NS1), вирусу H2N2 (ген Nep) и последовательностей двух пептидов от НА2 вируса гриппа В и NP вируса гриппа А.
На втором этапе синтезированные последовательности были клонированы в двунаправленный вектор на основе плазмиды pH 2000 (Hoffmann Е, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 ( 11 ): 6108-13.) . Указанный плазмидный вектор благодаря наличию Pol I и Pol II промоторов обеспечивает одновременную внутриклеточную транскрипцию вирусных и соответствующих матричных РНК при трансфекции клеток млекопитающих. На Фиг .7 представлена генетическая схема гриппозного вектора. На Фиг. 8 представлены нуклеотидные последовательности всех 8 геномных фрагментов гриппозного вектора.
Нуклеотидная последовательность геномного РВ2 1 agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg
61 tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc
121 aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg
181 gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat
241 gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta
301 tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat
361 ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc
421 cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat
481 gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa
541 gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa
601 gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg
661 gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg
721 ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg
781 aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca
841 gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga
901 attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc
961 aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag
1021 agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca 1081 ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca
1141 gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa
1201 cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata
1261 aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg
1321 catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt
1381 gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc
1441 gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg
1501 gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta
1561 ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac
1621 tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa
1681 tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta
1741 tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa
1801 tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat
1861 accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg
1921 cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc
1981 aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat
2041 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg
2101 aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2161 gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg
2221 gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc
2281 aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac
2341 t (SEQ ID NO: 14)
Нуклеотидная последовательность геномного PB1
1 atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca
61 actttccctt atactggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg
121 gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa
181 actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt
241 ggttatgccc aaacagattg tgtattggag gcgatggctt tccttgagga atcccatcct
301 ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac
361 aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactctaa atagaaacca acctgctgca
421 acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtct
481 ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaacaaaga agaaatgggg
541 atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata
601 acacagagaa caatgggtaa aaagaagcag agattgaaca aaaggagtta tctaattaga
661 gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca
721 attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg
781 agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 841 aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc
901 accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc
961 atgatcacat atatgaccag aaatcagccc gaatggttca gaaatgttct aagtattgct
1021 ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag
1081 agtatgaaac ttagaactca aatacctgca gaaatgctag caagcatcga tttgaaatat
1141 ttcaatgatt caacaagaaa gaagattgaa aaaatccgac cgctcttaat agaggggact
1201 gcatcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaata tgttaagcac tgtattaggc
1261 gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt
1321 cttcaatcct ctgacgattt tgctctgatt gtgaatgcac ccaatcatga agggattcaa
1381 gccggagtcg acaggtttta tcgaacctgt aagctacttg gaatcaatat gagcaagaaa
1441 aagtcttaca taaacagaac aggtacattt gaattcacaa gttttttcta tcgttatggg
1501 tttgttgcca atttcagcat ggagcttccc agttttgggg tgtctgggat caacgagtca
1561 gcggacatga gtattggagt tactgtcatc aaaaacaata tgataaacaa tgatcttggt
1621 ccagcaacag ctcaaatggc ccttcagttg ttcatcaaag attacaggta cacgtaccga
1681 tgccatagag gtgacacaca aatacaaacc cgaagatcat ttgaaataaa gaaactgtgg
1741 gagcaaaccc gttccaaagc tggactgctg gtctccgacg gaggcccaaa tttatacaac
1801 attagaaatc tccacattcc tgaagtctgc ctaaaatggg aattgatgga tgaggattac
1861 caggggcgtt tatgcaaccc actgaaccca tttgtcagcc ataaagaaat tgaatcaatg 1921 aacaatgcag tgatgatgcc agcacatggt ccagccaaaa acatggagta tgatgctgtt
1981 gcaacaacac actcctggat ccccaaaaga aatcgatcca tcttgaatac aagtcaaaga
2041 ggagtacttg aggatgaaca aatgtaccaa aggtgctgca atttatttga aaaattcttc
2101 cccagcagtt catacagaag accagtcggg atatccagta tggtggaggc tatggtttcc
2161 agagcccgaa ttgatgcacg gattgatttc gaatctggaa ggataaagaa agaagagttc
2221 actgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atagtgaatt
2281 tagcttgt (SEQ ID NO:15)
Нуклеотидная последовательность геномного PA
1 agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg
61 attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca
121 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac
181 ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg
241 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac
301 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac
361 aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg
421 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg
481 gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa
541 accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt
601 cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc 661 aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat
721 gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa
781 gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat
841 gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt
901 gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga
961 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca
1021 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag
1081 aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag
1141 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa
1201 tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg ctagcaagtt ggattcagaa tgagtttaac
1261 aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgtg
1321 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac
1381 tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca
1441 tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag
1501 gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg
1561 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt
1621 gaaccacata aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tataagaagt
1681 gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa 1741 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt
1801 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt
1861 gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc
1921 attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct
1981 ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt
2041 agggacaacc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag
2101 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca
2161 catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta
2221 ccttgtttct act (SEQ ID NO: 16)
Нуклеотидная последовательность геномного P
1 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact
61 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt
121 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct
181 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg
241 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa
301 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc
361 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata
421 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga
481 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 541 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat
601 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat
661 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga
721 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa
781 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc
841 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc
901 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg
961 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt
1021 ttctact (SEQ ID NO:17)
Нуклеотидная последовательность геномного M
1 agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact
61 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt
121 tgcagggaag aacactgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct
181 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg
241 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa
301 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc
361 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata
421 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga
481 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 541 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat
601 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat
661 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga
721 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa
781 gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc
841 ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc
901 cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg
961 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt
1021 ttctact (SEQ ID NO:18)
Нуклеотидная последовательность геномного НА
1 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta
61 tgtataggtt atcatgcaaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat
121 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa
181 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga
241 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agttcatggt cctacattgt ggaaacatct
301 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatca attatgagga gctaagagag
361 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaaaac aagttcatgg
421 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcacgctgg agcaaaaagc
481 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagccaa 541 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctgt ggggcattca ccatccatct
601 actactgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg catatgtttt tgtggggaca
661 tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcaa
721 gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa
781 gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcacaa tggaaagaaa tgctggatct
841 ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca gacacccgag
901 ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt
961 ccaaagtatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct
1021 attcaatcta gaggcctatt cggggccatt gccggcttca ttgaaggggg gtggacaggg
1081 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc
1141 gacctgaaga gcacacaaaa tgccattgac aagattacta acaaagtaaa ctctgttatt
1201 gaaaagatga atacacagtt cacagcagtg ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga
1261 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc
1321 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accatgattc aaatgtgaag
1381 aacttgtatg aaaaggtaag aaaccagtta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc
1441 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact
1501 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaaaaaat agatggggta
1561 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1621 ttggtgctgg tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgctctaa tgggtctcta
1681 cagtgtagaa tatgtattta a (SEQ ID NO: 19)
Нуклеотидная последовательность геномного NA
1 atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct
61 aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaagtt
121 gggaatcaaa gtcagatcga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact
181 tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg gcagccagtg
241 gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac
301 agtaaagaca acagtgtaag agtcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca
361 ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta
421 aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cttaatgagc
481 tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca
541 gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacagt
601 ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacggc ataataacag acactatcaa gagttggaga
661 aacgatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttacc
721 ataatgaccg atggaccaag tgatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag
781 ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc
841 tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat
901 cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgcagtggg 961 attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct
1021 aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg
1081 agaactaaaa gcattagttc aagaaaaggt tttgagatga tttgggatcc aaatggatgg
1141 actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca
1201 ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct
1261 tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagtggg
1321 agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt
1381 gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa (SEQ ID NO: 20)
Ну леотидная последовательность гена химерного NS фрагмента (вставка выделена жирным шрифтом)
AGСAAAAGСAG GGТGACAAAGACA AATGGATССАААСАСТ GТ GТСAAGСТТТСAGGТА GATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCC TTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACAT СGAGACAGССACAC GТ GСТGGAAAGСAGATAGТGGAGС GGATТСТGAAAGAAGAATССGATGAG GCACTTAAAATGACCATGGCCTCTGTACCTGCGTCGCGTTACCTAACCGACATGACTCTTGAGG AAATGTCAAGGGAATGGTCCATGCTCATACCCAAGCAGAAAGTGGCAGGCCCTCTTTGTATCAG AATGGACCAGGCGATCATGGGAGGAGG T C TCGGAGC A TGC GGT TC T GGAAGGAGGA TGGGAAGGAATGAT TGCAGG T TGGGGAGGAAGAGAGAGC СGGAAC СCAGGGAATGC T TGATAAT AAGCGGCCGCAGTGTGATTTTTGACCGGCTGGAGACTCTAATATTGCTAAGGGCTTTCACCGAA GAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTAATGAGGATG TCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAATGATAACACAGTTCGAGTCTC TAAAACTСTACAGAGATTСGСTTGGAGAAGСAGTAATGAGAATG GGAGACСTССACTСACTССA АААСAGAAAC GGAAAATG GСGAGAACAATTAG GTСAAAAGTTСGAAGAAATAAGAT GGСTGATT GAAGAAGTGAGACACAAATTGAAGATAACAGAGAATAGTTTTGAGСAAATAACATTTATACAAG ССTTACAGСТАСТАТТТGAAGTGGAACAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTСAGCTTATTTAATA ATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT (SEQ ID NO: 21)
Сборка рекомбинантных вирусов осуществлялась путем трансфекции клеток VERO восемью плазмидами, кодирующими геномные немодифицированные фрагменты вируса гриппа, и химерный NS геномный фрагмент, используя метод электропорации плазмидной ДНК (Cell Line Nucleofector® Kit V (Lonza) ) в соответствии с инструкцией к применению. После трансфекции клетки инкубировались в среде Optipro (Invitrogen) в течение 96 часов при 34°С с добавлением трипсина 1 мкг/мл для обеспечения пост- трансляционного расщепления предшественника гемагглютинина на субъединицы НА1 и НА2. Вирусный урожай с клеток Vero использовался для заражения 10-дневных куриных эмбрионов (SPF) . Эмбрионы инкубировались в течение 48 часов при 34°С, после чего аллантоисные жидкости, имеющие положительный титр в реакции гемагглютинации, использовались для проведения последующих пассажей на куриных эмбрионах. Аллантоисные жидкости 7 пассажа очищались с помощью тангенциальной фильтрации и лиофилизировались для хранения. Иммунизация животных проводилась после растворения лиофилизата дистилированной водой в эквивалентном объеме.
Пример 6
Протективный ответ в отношении гетерологичных штаммов вируса гриппа А и В при контрольном заражении мышей
С целью определения протективной активности в отношении гетерологичных антигенных вариантов вируса гриппа для иммунизации мышей был использован гриппозный вектор в дозе 6,81од ЭИД50 /мышь, который вводился интраназально в объеме 50 мкл под легкой анастезией, однократно или двукратно с периодом в 3 недели. Через 21 день после последней иммунизации животные были подвергнуты контрольному заражению патогенными для мышей штаммами вируса гриппа: гомологичным A/California/7/09 (HlNlpdm) или гетерологичными A/Aichi/2/68 (H3N2),
A/Mississippi/85/1 (H3N2) или вирусом гриппа B/Lee/40, взятыми в дозе соответствующей 3-5 ЛД50, соответственно.
Как видно из Фиг .9А, контрольное заражение не иммунных мышей вирусом HlNlpdm приводило к их гибели в 90% случаев. В тоже время, мыши, иммунизированные вирусным препаратом однократно или двукратно, были достоверно защищены от гибели.
Как видно из Фиг.-3-В9В, контрольное заражение не иммунных мышей вирусом A/Aichi/2/68 (H3N2) приводило к их гибели в 100% случаев. В тоже время, мыши, иммунизированные вирусным препаратом однократно или двукратно, были в достоверно защищены от гибели.
Как видно из Фиг.9С, контрольное заражение не иммунных мышей вирусом A/Mississippi/85/1 (H3N2 ) приводило к их гибели в 100% случаев. В тоже время, мыши, иммунизированные вирусным препаратом двукратно имели 100% защиту.
Как видно из Фиг.ЭБ, контрольное заражение не иммунных мышей вирусом гриппа B/Lee/40 приводило к гибели животных в 100% случаев. В тоже время, мыши, иммунизированные вирусным препаратом двукратно имели достоверно отличающуюся от контроля 60% защиту.
Таким образом, гриппозный вектор, несущий химерный NS геномный фрагмент, проявлял признаки универсальной гриппозной вакцины, эффективной в отношении как гетерологичных антигенных подтипов вируса гриппа А, так и в отношении вируса гриппа В
Пример 7
Протективный ответ в отношении гетерологичного штамма вируса гриппа A (H3N2) при контрольном заражении хорьков
Хорьки являются оптимальной, рекомендованной ВОЗ моделью для изучения эффективности противогриппозных вакцин и препаратов. С целью определения протективной активности в отношении гетерологичного антигенного варианта вируса гриппа для иммунизации хорьков (9 на группу) был использован гриппозный вектор, полученный в Примере 5, в дозе 7,5 log ЭИДьо/хорька, который вводился интраназально в объеме 500 мкл под легкой анастезией, однократно или двукратно с периодом в 3 недели. Через 21 день после последней иммунизации животные были подвергнуты контрольному заражению патогенным для хорьков вирусом гриппа A/St . Petersburg/224/2015 (H3N2) . Как видно из Фиг.10А, контрольное заражение не иммунных животных приводило к подъему температуры тела на 2 сутки после заражения, в то время как вакцинированные животные не имели температурной реакции.
С целью изучения эффекта вакцинации на репродукцию контрольного вируса в респираторном тракте хорьков у животных были взяты носовые смывы на 2,4 и б день с целью определения в них концентрации инфекционного вируса путем титрования 50% цитопатической дозы в культуре клеток MDCK. Как видно из Фиг.10В, контрольное заражение не иммунных хорьков приводило к активной репродукции вируса без существенного снижения титров к 6 дню. При однократной иммунизации хорьков достоверное снижение вирусного титра наблюдалось на 4 и б день после контрольного заражения. После двукратной иммунизации достоверное, более чем 100-кратное, снижение вирусного титра регистрировалось уже на 2 день после заражения животных.
Таким образом, даже однократная вакцинация хорьков гриппозным вектором приводила к защите животных от клинических проявлений в виде температурной реакции и способствовала ускоренной элиминации контрольного гетерологичного штамма из респираторного тракта. Повторная иммунизация способствовала ускорению процесса вирусной элиминации.
Пример 8
Онколитический эффект гриппозного вектора, кодирующего микобактериальный белок Esat6
С целью определения онколитического потенциала аттенуированных гриппозных векторов, несущих химерный NS геномный фрагмент с гетерологичным геном Nep, вирусы были использованы для терапии меланомы мышей, индуцированной путем введением 106 клеток В16 в объеме 30 мкл в подкожное пространство правой задней стопы. Использовалось 10 животных на группу. Терапия проводилась на 5 день после введения опухолевых клеток путем инъекции 30 мкл вирусного препарата или фосфатного буферного раствора непосредственно в зону опухолевого роста. Инъекции проводились 4 раза каждый третий день, после чего оценивались скорость увеличения объема пораженной стопы и выживаемость животных на протяжении 85 дней. Животные с опухолями, достигшими 2000 мм3, усыплялись по этическим соображениям и считались погибшими.
Для лечения меланомы был использован вектор, экспрессирующий микобактериальный антиген Esat6 в дизайне, предусматривающим, 2А опосредованное посттрансляционное отщепление белка Esat-б от С- терминальной части укороченного NS1 белка вируса гриппа NS124-2A-Esat6 (Фиг.З, SEQ ID NO:12) . В качестве контрольного терапевтического агента использовался вирус NS124/Nep-Len, не имеющий вставки микобактериального белка .
На Фиг .6А представлены результаты измерения объема стопы на 19 день после введения опухолевых клеток. Неожиданно оказалось, что наименьшим средним объемом обладали стопы мышей, получавших терапию вектором, экспрессирующим белок Esat6. Этот результат оказался в корреляции с выживаемостью мышей на протяжении длительного срока наблюдения 85 дней (Фиг.бБ) . 3 из 10 животных группы NS124-2A-Esat6 оказались в стадии ремиссии опухолевого роста, в то время как животные в других группах погибли к 60 дню. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о преимуществе онколитического вектора, кодирующего бактериальный антиген .
Пример 10
Состав вакцины на основе гриппозного вектора для интраназальной иммунизации
Вакцина, содержащая гриппозный вектор, полученный в Примере 1 или Примере 5, в количестве от 6,5 до 8,5 log эмбриональных 50% инфекционных доз (ЭИД50)/мл, и буферный стабилизирующий раствор, содержащий 0,9 масс.% раствора хлорида натрия, 0,5 масс. % L-карнозина, 2,5 масс.% сахарозы, 1 масс.% рекомбинантного альбумина, 1 масс.% L-аргинина и 3 масс.% гидроксиэтилированного крахмала 130/0,4 (молекулярная масса 130 кДа, степень молярного замещения 0,4) .
Пример 11
Состав вакцины на основе гриппозного вектора для интраназальной иммунизации
Вакцина, содержащая гриппозный вектор, полученный в Примере 1 или Примере 5, в количестве от 6,5 до 8,5 log эмбриональных 50% инфекционных доз (ЭИД50)/мл, и буферный стабилизирующий раствор, содержащий 0,9 масс.% раствора хлорида натрия, 0,1 масс.% L-карнозина, 2,5 масс.% сахарозы, 1 масс.% рекомбинантного альбумина, 1 масс.% L-аргинина и 3 масс.% гидроксиэтилированного крахмала 130/0,4 (молекулярная масса 130 кДа, степень молярного замещения 0,4) .
Пример 12
Состав вакцины на основе гриппозного вектора для онколитических целей
Вакцина, содержащая гриппозный вектор, полученный в Примере 1, в количестве от 6,5 до 10,5 log эмбриональных 50% инфекционных доз (ЭИД50)/мл, и буферный стабилизирующий раствор, содержащий 1,35 масс.% раствора хлорида натрия, 0,5 масс.% L- карнозина, 1 масс.% рекомбинантного альбумина, 1 масс. % L- аргинина и 3 масс.% гидроксиэтилированного крахмала 130/0,4 (молекулярная масса - 130 кДа, степень молярного замещения 0,4) .

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕ ЕНИЯ
1. А тенуированный вирус гриппа А, индуцирующий кросс- протективный ответ против вируса гриппа А и В, содержащий химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А.
2. Аттенуированный вирус гриппа по п. 1, где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков.
3. Аттенуированный вирус гриппа по п. 1 или 2, где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатков.
4. Аттенуированный вирус гриппа по п . 1 или 2, в котором указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2.
5. Аттенуированный вирус гриппа А, индуцирующий кросс- протективный ответ против вируса гриппа А и В, содержащий химерный NS фрагмент, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка Nep, причем указанная укороченная рамка считывания белка NS1 происходит от вируса гриппа подтипа H1N1, а гетерологичная последовательность гена белка Nep происходит от вируса гриппа подтипа H2N2, и где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатка.
6. Аттенуированный гриппозный вектор, экспрессирующий белок или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из белков или их фрагментов бактерий, вирусов или простейших, представляющий собой аттенуированный вирус гриппа А по любому из пп. 1-5, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего белок или его фрагмент бактерий, вирусов или простейших .
7. Аттенуированный гриппозный вектор по п. б, где белок или его фрагмент выбран из группы, состоящей из белков вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий, возбудителя бруцеллеза или их комбинаций .
8. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 6 или 7, где размер белка или его фрагмента составляет от 10 до 400 а. к.
9. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 6 или 7, где вставка кодирует участок белка НА вируса гриппа.
10. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 9, где участок белка НА представляет собой участок субъединицы НА2, выбранный из группы, состоящей из 1-185 а. к. из вируса гриппа А, 1-186 а. к. из вируса гриппа В, 23-185 а. к. из вируса гриппа А или 65- 222 а. к. из вируса гриппа А.
11. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 6 или 7, где вставка кодирует последовательность участка субъединицы НА2 вируса гриппа А или вируса гриппа В от 1 до 21 а. к. и последовательность участка белка NP вируса гриппа А от 243 до 251 а . к .
12. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 6 или 7, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-6, Ад85А, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты.
13. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 12, где геномная последовательность вируса дополнительно содержит последовательность, кодирующую саморасщепляющийся 2А-пептид, между последовательностями, кодирующими NS1-124 и ESAT6.
14. Аттенуированный гриппозный вектор, экспрессирующий белок или его фрагмент вируса гриппа, представляющий собой аттенуированный вирус гриппа по п. 5, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей 1-21 а. . белка НА2 вируса гриппа В и 243-251 а. к. белка NP вируса гриппа А.
15. Аттенуированный гриппозный вектор, обладающий онколитической активностью, представляющий собой аттенуированный вирус гриппа А по любому из пп. 1-5, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего белок или его фрагмент бактерий, вирусов или простейших.
16. Ат енуированный гриппозный вектор по п. 15, где белок или его фрагмент выбран из группы, состоящей из белков или их фрагментов вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса герпеса, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании, хламидий или их комбинаций .
17. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 15 или 16, где размер белка или его фрагмента составляет от 10 до 400 а. к.
18. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 15 или 16, где вставка кодирует белок микобактерии туберкулеза ESAT-б, Ад85А, Ад85В, Mpt64, HspX, Mtb8.4 или 10.4 или их фрагменты.
19. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 18, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-б.
20. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 18, в котором укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой последовательности, кодирующей саморасщепляющийся 2А-пептид, и последовательности, кодирующей белок микобактерии туберкулеза ESAT-б.
21. Аттенуированный гриппозный вектор, индуцирующий кросс- протективный ответ против вирусов гриппа А и В, содержащий:
нуклеотидную последовательность гена белка РВ2, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ2;
нуклеотидную последовательность гена белка РВ1, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка РВ1;
нуклеотидную последовательность гена белка РА, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности белка РА;
нуклеотидную последовательность гена белка NP, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности белка NP;
нуклеотидную последовательность гена белка М, происходящую от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности гена белка М;
нуклеотидную последовательность гена белка НА, происходящую от вируса гриппа A/California/7/ 09-like HlNlpdm) , или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка НА;
нуклеотидную последовательности гена белка ΝΑ, происходящую от вируса гриппа A/California/7/ 09-like HlNlpdm), или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной нуклеотидной последовательности гена белка NA; и
нуклеотидную последовательность химерного гена белка NS, включающую
рамку считывания белка NS1, происходящую от вируса A/PR/8/34 (H1N1), где указанная рамка считывания является укороченной и кодирует белок NS1 размером 124 аминокислотных остатков,
и последовательность гена белка Nep, происходящую от вируса гриппа A/Singapore/l/57-like (H2N2), или
нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность указанной последовательности химерного гена NS; где указанная укороченная рамка считывания гена белка NS1 продолжена вставкой нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид слияния субъединицы НА2 от вируса гриппа В, и нуклеотидной последовательности, кодирующей консервативный В- клеточный эпитоп нуклеопротеина (NP) вируса гриппа А.
22. Аттенуированный гриппозный вектор по п. 21, где нуклеотидная последовательность химерного гена белка NS представлена в SEQ ID NO: 21.
23. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, содержащая в эффективном количестве аттенуированный вирус гриппа А по любому из пп. 1-5 или аттенуированный гриппозный вектор по любому из пп. 6-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
24. Фармацевтическая композиция для профилактики гриппа, содержащая в эффективном количестве аттенуированный гриппозный вектор по п . 21 или п. 22 и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Фармацевтическая композиция по п. 23 или 24, содержащая 6,5-10,5 1одЭИД 50/мл аттенуированного гриппозного вектора и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс.% моновалентной соли, 0- 5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала .
26. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 23-25, где буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01- 2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала.
27. Фармацевтическая композиция по п. 26, где моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [2- ( 1Н-имидазол-5-ил) этил] -пропандиамид .
28. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 23, 25-27, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.
29. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 23-27, где субъект представляет собой млекопитающее или птицу.
30. Фармацевтическая композиция по п. 29, где субъект представляет собой человека.
31. Вакцина против инфекционного заболевания, содержащая в эффективном количестве ат енуированный вирус гриппа А по любому из пп. 1-5 или аттенуированный гриппозный вектор по любому из пп. 6-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
32. Вакцина против гриппа, содержащая в эффективном количестве аттенуированный гриппозный вектор по п. 21 или 22 и фармацевтически приемлемый носитель .
33. Вакцина по п. 31 или 32, содержащая 6,5-10,5 1одЭИД 50/мл аттенуированного гриппозного вектора и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс.% моновалентной соли, 0-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2 масс.% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала .
34. Вакцина по любому из пп. 31-33, где буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2 масс. % аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала .
35. Вакцина по п. 34, где моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой сахарозу, трегалозу или лактозу, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, казитон, гидролизат лактальбумина или желатин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, глицин или глутамат натрия, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или Ν,Ν'-бис [2- (1Н- имидазол-5-ил) этил] -пропандиамид .
36. Вакцина по любому из пп. 31, 33-35, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.
37. Применение аттенуированного вируса гриппа А по любому из пп. 1-5, аттенуированного гриппозного вектора по любому из пп. 6-14 или фармацевтической композиции по п. 23 или 24 для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний у субъекта.
38. Применение по п. 37, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синтициального вируса и вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита С, малярийного плазмодия, трихомонады, хламидии, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.
39. Применение аттенуированного гриппозного вектора по п. 21 или п. 22 или фармацевтической композиции по любому из пп. 24-27 для профилактики гриппа у субъекта.
40. Применение по любому из пп. 37-39, где субъект представляет собой млекопитающее или птицу.
41. Применение по п. 40, где субъект представляет собой человека .
42. Способ лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по любому из пп. 1-5, аттенуированного гриппозного вектора по любому из пп . 6-14 или фармацевтической композиции по п. 23 или 24 указанному субъекту.
43. Способ по п. 42, где инфекционное заболевание вызывается патогеном, выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа А, вируса гриппа В, микобактерии туберкулеза, вируса простого герпеса 1 и 2 типов, респираторно-синтициального вируса, вируса иммунодефицита человека, малярийного плазмодия, трихомонады, трипаносомы, лейшмании или возбудителя бруцеллеза.
44. Способ по п. 43, где субъект представляет собой млекопитающее или птицу.
45. Способ по п. 44, где субъект представляет собой человека .
46. Фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний у субъекта, содержащая аттенуированный вирус гриппа А по любому из пп. 1-5 или аттенуированный вектор по любому из пп. 15-20 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель .
47. Фармацевтическая композиция по п. 46, содержащая 8,5- 10,5 log ЭИД 50/мл аттенуированного вируса гриппа А по любому из пп. 1-5 или аттенуированного гриппозного вектора по любому из пп. 6-14 и буферный раствор, содержащий 0-1,5 масс. % моновалентной соли, 0-5 масс.% имидазолсодержащего соединения, 0-5 масс.% углеводного компонента, 0-2 масс.% белкового компонента, 0-2% аминокислотного компонента и 0-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала.
48. Фармацевтическая композиция по п. 47, где буферный раствор содержит 0,5-1,5 масс.% раствора моновалентной соли, 0,01-5 масс.% имидазолсодержащего, 1-5 масс.% углеводного компонента, 0,1-2 масс.% белкового компонента, 0,01-2% аминокислотного компонента и 1-10 масс.% гидроксиэтилированного крахмала .
49. Фармацевтическая композиция по п. 48, где моновалентная соль представляет собой хлорид натрия, углеводный компонент представляет собой крахмал, белковый компонент представляет собой человеческий альбумин, аминокислотный компонент представляет собой аргинин, и имидазолсодержащее соединение представляет собой L-карнозин или N, Ν'-бис [ 2- ( 1Н-имидазол-5- ил) этил] -пропандиамид .
50. Применение аттенуированного вируса гриппа А по любому из пп. 1-5, аттенуированного гриппозного вектора по любому из пп. 15-20 или фармацевтической композиции по любому из п. п. 46- 49 для лечения онкологических заболеваний у субъекта.
51. Применение по п. 50, где онкологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.
52. Способ лечения онкологических заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение в эффективном количестве аттенуированного вируса гриппа А по любому из пп. 1- 5, аттенуированного гриппозного вектора по п. 15-20 или фармацевтической композиции по любому из п. п. 46-49 указанному субъекту .
53. Способ лечения по п. 52, где введение представляет собой внутриопухолевое введение, введение в лакуну, образовавшуюся после хирургического удаления опухоли, или внутривенное введение.
54. Способ по п. 52 или 53, где онкологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из колоректального рака, кардиоэзофагеального рака, панкреатического рака, холангиоцеллюлярного рака, глиомы, глиобластомы и меланомы.
По доверенности
PCT/RU2016/050066 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний WO2017078577A2 (ru)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11201709122VA SG11201709122VA (en) 2015-11-06 2016-11-03 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
CU2018000035A CU24580B1 (es) 2015-11-06 2016-11-03 Vectores atenuados de influenza para la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas y para el tratamiento de enfermedades oncológicas
CN201680033797.2A CN108026515B (zh) 2015-11-06 2016-11-03 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体
KR1020177036573A KR102604877B1 (ko) 2015-11-06 2016-11-03 감염성 질환의 예방 및/또는 치료와 종양학적 질환의 치료를 위한 약독화된 인플루엔자 벡터
CA2991023A CA2991023A1 (en) 2015-11-06 2016-11-03 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
EP16862552.3A EP3382010A4 (en) 2015-11-06 2016-11-03 ATTENUATED FLU TYPE VECTORS FOR THE PROPHYLAXIS AND / OR TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES AND FOR THE TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES
MX2017015462A MX2017015462A (es) 2015-11-06 2016-11-03 Vectores atenuados de influenza para la prevencion y/o tratamiento de enfermedades infecciosas y para el tratamiento de enfermedades oncologicas.
EA201792083A EA037571B1 (ru) 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
JP2017560329A JP6692835B2 (ja) 2015-11-06 2016-11-03 感染性疾患の予防及び／又は処置並びに腫瘍性疾患の処置のための弱毒化インフルエンザベクター
UAA201709223A UA125333C2 (ru) 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
AU2016350939A AU2016350939B9 (en) 2015-11-06 2016-11-03 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
US15/566,202 US10392604B2 (en) 2015-11-06 2016-11-03 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
BR112017025435A BR112017025435A8 (pt) 2015-11-06 2016-11-03 vetores de influenza atenuada para a prevenção e/ou o tratamento de doenças infecciosas e para o tratamento de doenças oncológicas
IL255259A IL255259B (en) 2015-11-06 2017-10-25 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
ZA201803649A ZA201803649B (en) 2015-11-06 2018-05-31 Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147703A RU2628690C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2015147703 2015-11-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2017078577A2 true WO2017078577A2 (ru) 2017-05-11
WO2017078577A3 WO2017078577A3 (ru) 2017-06-29

Family

ID=58662984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/050066 WO2017078577A2 (ru) 2015-11-06 2016-11-03 Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10392604B2 (ru)
EP (1) EP3382010A4 (ru)
JP (1) JP6692835B2 (ru)
KR (1) KR102604877B1 (ru)
CN (1) CN108026515B (ru)
AU (1) AU2016350939B9 (ru)
BR (1) BR112017025435A8 (ru)
CA (1) CA2991023A1 (ru)
CU (1) CU24580B1 (ru)
HK (1) HK1251616A1 (ru)
IL (1) IL255259B (ru)
MA (1) MA43314A (ru)
MX (1) MX2017015462A (ru)
RU (1) RU2628690C2 (ru)
SG (1) SG11201709122VA (ru)
UA (1) UA125333C2 (ru)
WO (1) WO2017078577A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022513558A (ja) * 2018-09-11 2022-02-09 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL267077B (en) * 2017-05-26 2022-07-01 Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiyu Pharmenterprises New glutaminyl cyclase inhibitors and their use in the treatment of various diseases
MX2020006530A (es) * 2017-12-22 2020-10-15 Codagenix Inc Virus recombinante con region desoptimizada de par de codones y usos del mismo para el tratamiento de cancer.
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
RU2726106C1 (ru) * 2019-07-18 2020-07-09 федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России) Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8-NS124-TB10.4-2A-HspX и способ специфической профилактики туберкулеза легких с использованием вакцины мукозального применения на его основе
EP4210727A1 (en) * 2020-09-11 2023-07-19 University of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for prevention and treatment of influenza infections
CN117098553A (zh) * 2020-11-11 2023-11-21 加州理工学院 多价载体和相关疫苗组合物
CN113430178B (zh) * 2021-06-21 2022-10-11 武汉大学 一种表达ii型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU771110B2 (en) * 1998-06-12 2004-03-11 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
DE69937999T2 (de) * 1998-06-12 2009-01-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Interferon induzierende genetisch veränderte attenuierte viren
US6800288B2 (en) * 2000-03-02 2004-10-05 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza A viruses
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
US7709190B2 (en) * 2005-12-02 2010-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Influenza A virus vaccines and inhibitors
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
WO2011014504A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
CA2805505C (en) * 2009-07-30 2021-08-03 Mount Sinai School Of Medecine Chimeric influenza viruses having reduced ability to reassort with other influenza viruses and uses thereof
WO2011130652A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 George Baer Compositions and methods for vaccinating humans and animals against enveloped viruses
US20130209406A1 (en) * 2010-06-06 2013-08-15 Benjamin R. tenOever Recombinant rna viruses and uses thereof
WO2012072088A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Bionor Immuno As Peptide scaffold design
EP2708552A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-19 Medizinische Universität Wien Influenza virus

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022513558A (ja) * 2018-09-11 2022-02-09 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用
JP7320601B2 (ja) 2018-09-11 2023-08-03 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
CU24580B1 (es) 2022-02-04
BR112017025435A2 (pt) 2018-09-11
RU2015147703A (ru) 2017-05-16
BR112017025435A8 (pt) 2019-08-20
KR102604877B1 (ko) 2023-11-23
IL255259A (en) 2018-04-30
CN108026515A (zh) 2018-05-11
WO2017078577A3 (ru) 2017-06-29
RU2628690C2 (ru) 2017-08-21
MX2017015462A (es) 2018-03-07
HK1251616A1 (zh) 2019-02-01
JP6692835B2 (ja) 2020-05-13
AU2016350939B2 (en) 2021-07-08
CA2991023A1 (en) 2017-05-11
CU20180035A7 (es) 2018-07-05
US10392604B2 (en) 2019-08-27
EP3382010A2 (en) 2018-10-03
UA125333C2 (ru) 2022-02-23
AU2016350939A2 (en) 2018-02-08
AU2016350939A1 (en) 2017-11-23
US20180245052A1 (en) 2018-08-30
KR20180067464A (ko) 2018-06-20
MA43314A (fr) 2018-10-03
EP3382010A4 (en) 2019-03-27
AU2016350939B9 (en) 2021-07-22
CN108026515B (zh) 2022-03-11
IL255259B (en) 2020-03-31
JP2018531578A (ja) 2018-11-01
SG11201709122VA (en) 2017-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016350939B9 (en) Attenuated influenza vectors for the prevention and/or treatment of infectious diseases and for the treatment of oncological diseases
JP6870017B2 (ja) インフルエンザウイルス変異体およびその使用
Chen et al. Advances in development and application of influenza vaccines
Rajão et al. Universal vaccines and vaccine platforms to protect against influenza viruses in humans and agriculture
ES2813347T3 (es) Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero
US8597661B2 (en) Neuraminidase-deficient live influenza vaccines
US11739303B2 (en) Recombinant influenza viruses with stabilized NA
JP2023166432A (ja) インフルエンザに対する免疫原性組成物
RU2556833C2 (ru) Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/рr/8/59/m2 (h1n1), предназначенный для получения вакцинных штаммов вируса гриппа в качестве донора аттенуации, вакцинные штаммы вируса гриппа а/59/м2/калифорния/66/2211 (н2n2) и а/59/м2/токио/67/22111 (н2n2)
DK2019685T3 (en) Defective interfering virus
RU2660562C2 (ru) Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
US20220401549A1 (en) Novel prime-boost influenza vaccine
CN110769849A (zh) 替代性改良乙型流感病毒活疫苗的研制
US20230295582A1 (en) Influenza virus backbone
El-Kady et al. Avian influenza
Parker Effect of a Codon Optimized DNA Prime on Induction of Anti-Influenza Protective Antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16862552

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2016862552

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15566202

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201792083

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 255259

Country of ref document: IL

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11201709122V

Country of ref document: SG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017560329

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016350939

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20161103

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2017/015462

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177036573

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2991023

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017025435

Country of ref document: BR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201709223

Country of ref document: UA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017025435

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20171127