CN116390748A - 用于预防和治疗流感感染的组合物及其使用方法 - Google Patents

用于预防和治疗流感感染的组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于诱导或增加针对病毒的免疫应答的重组构建体、包括所述重组构建体的流感病毒基因组、包括所述构建体的流感病毒以及由其形成的疫苗制剂。所述组合物通常包括具有编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的核酸序列的核酸，所述核酸可以正向调节与血凝素或神经氨酸酶的表达可操作地连接的IgA表达。当核酸在感染细胞中由重组流感病毒表达时，其优选增强针对流感病毒的IgA产生。还提供了表达IGIP的减毒活病毒及其用于治疗和预防流感感染的方法。

Description

用于预防和治疗流感感染的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的美国临时申请号63/077,454的权益和优先权，该申请的全部内容通过引用纳入本文。
关于联邦资助的声明
研究或开发
本发明是在美国国家卫生研究院授予的HHSN272201400008C和AI146448以及美国农业部授予的58-5030-5-047的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
对序列表的引用
根据37 C.F.R§1.52(e)(5)，创建于2021年9月13日，大小为11,269字节的命名为“UGA_2019_094_02_PCT_ST25.txt”的文本文件提交的序列表通过引用纳入本文。
技术领域
本发明大体在重组流感病毒及其在疫苗制剂和方案中的应用的领域。
背景技术
流行性感冒，常称为流感，是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。流感病毒感染继续构成与季节性流行病和散发性流行病相关的全球主要公共卫生威胁。大多数人在一周内从发烧和其他症状中康复，无需医疗护理。然而，流感会导致高风险人群的严重疾病或死亡。例如，甲型流感(IAV)每年在全球造成300万至500万例重症病例，以及30万至60万人死亡(Girard，et al.，Vaccine，23，5708-5724(2005)，Iuliano，et al.，Lancet，391，1285-1300(2018))。对美国而言，由于预防、治疗和住院费用，以及缺课或工作日请假，流感病毒感染导致的平均经济影响为870亿美元(Molinari，et al.，Vaccine，25，5086-5096(2007)，Glezen，et al.，Am.J.Public Health，103，e43-e51(2013)，Gasparini，et al.，Hum.Vaccines Immunother，8，21-28(2012))。
疫苗接种被认为是对抗流感的第一道防线(Erbelding，J Infect Dis，218(3)：347-354(2018))，尽管不是100％有效，但仍然是预防感染的最佳方式。目前，季节性流感疫苗只针对几个(通常是三或四个)预计在下一个季节最常见的毒株，然而，这些病毒不断变化的性质使得疫苗在一个季节后或针对大流行毒株无效。FDA批准了三种类型的流感病毒疫苗供人类使用：裂解病毒体(split virion)或亚单位灭活流感病毒(IIV)、重组流感蛋白(RIV)和减毒流感病毒(LAIV)活疫苗。IIV和RIV疫苗可以引发针对HA上的表位的抗体的产生，但产生有限的或没有细胞免疫。相比之下，LAIV可以通过模拟天然感染引发体液和细胞应答的组合(Lopez，et al.，Vaccines，8，434(2020)，Yamayoshi&Kawaoka，Nat.Med.，25，212-220(2019))。尽管LAIV具有固有的提供针对多种病毒靶标的免疫力的能力，由于在免疫受损个体中的安全性问题，它们并不适合所有人(Yamayoshi&Kawaoka，Nat.Med.，25，212-220(2019)，Grohskopf，et al.，MMWR Recomm Rep.，69，1-24(2020))。因此，希望提高LAIV的安全性同时保持功效以扩大此类疫苗在人群中的用途。
接种疫苗后，机体产生针对疫苗中存在的病毒的特异性抗体。IgG和IgA是机体产生以预防流感感染的两种主要抗体同种型。IgG是血液循环中发现的主要同种型，IgA是粘膜组织(包括气道)中发现的占主导地位的同种型。IgA应答被认为对预防和/或控制多种生殖器、肠道和呼吸道感染(包括流感)具有重要意义(Corthesy，Front.Immunol.，4，185(2013))。当流感病毒通过粘膜表面进入宿主时，在气道粘膜上检测到IgA和IgG应答，具有抗流感的中和活性，然而，大量的IgA对于提供第一道保护至关重要。IgA，特别是其多重多聚体形式的分泌型IgA，通常比IgG更广泛地中和(Suzuki，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，112，7809-7814(2015))。IgA中和病原体而不引起炎症，因为它不能固定和激活补体级联(Cerutti，Nat.Rev.Immunol.，8，421-434(2008))。
此外，IgA抗体显示出显著高于IgG抗体的交叉结合活性，这意味着IgA抗体甚至可以靶向疫苗中未包含的更广谱的病毒。IgA，特别是其多重多聚体形式的分泌型IgA(sIgA)，通常比IgG6更广泛地中和。IgA中和病原体而不引起炎症，因为它不能固定和激活补体级联(Cerutti，et al.，Nat Rev Immunol，8(6)：421-34(2008))。相比之下，结合但不中和病毒(非保护性抗体)的IgG应答与2009感染大流行H1N1病毒或1957年感染大流行H2N2病毒后病情严重的中年人的免疫复合物介导的疾病有关(Monsalvo，et al.，Nature medicine，17(2)：195-9(2011))。
目前流感疫苗的有效性仍然很低，从10％到60％不等。鼻内流感疫苗被认为甚至不如注射流感疫苗有效。迄今为止可用的流感疫苗尚未被设计为特异性上调IgA应答和/或使IgA/IgG平衡向更占主导的IgA应答倾斜，特别是在气道狭窄区域(confinements)内(Boyaka，et al.，J Immunol，199(1)：9-16(2017))。目前批准或试验的减毒流感病毒活疫苗被认为能刺激粘膜和全身IgA和IgG以及T细胞介导的免疫，因为它们更类似于天然病毒感染，但它们对促进IgA应答的相对影响尚不清楚。
因此，仍然需要改进的疫苗策略来预防和治疗流感。
因此，本发明的目的是提供用于保护和治疗流感病毒感染的改进的组合物及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供用于改善针对流感的粘膜IgA应答的组合物及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供组合物及其使用方法，所述组合物及其使用方法增强和/或拓宽针对抗原漂移变体或分化体的保护，同时最小化与次优抗体-抗原匹配、疾病增强和免疫病理学相关的风险。
发明内容
提供了用于诱导或增加针对病毒的免疫应答的重组构建体、包括所述重组构建体的病毒基因组、包括所述构建体的病毒以及由其形成的疫苗制剂。所述组合物通常包括具有编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的核酸序列的核酸，所述核酸任选地可以正向调节IgA表达。当核酸在感染细胞中由重组病毒表达时，其优选增强针对病毒的IgA产生。在优选实施方案中，重组病毒是流感病毒和免疫应答针对流感。
例如，提供了包括编码可诱导或增加IgA表达的IGIP多肽的核酸序列和编码血凝素(本文可互换地缩写为H和HA)或神经氨酸酶(本文可互换地缩写为N和NA)的核酸序列的核酸，其可操作地连接到一个或多个表达控制序列。
IGIP可以是天然存在的IGIP蛋白的成熟形式，例如来自牛、人、小鼠或另外的动物。在一些实施方案中，IGIP多肽包括SEQ ID NO：1-12中任何一项的IGIP的成熟形式、或其功能片段、或与SEQ ID NO：1-12中任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多序列同一性的其变体。核酸可以包括可操作地连接到编码IGIP的序列的编码自体IGIP信号肽序列或异源信号肽序列的序列。
在一些实施方案中，H是来自甲型流感病毒的H的成熟形式，例如H1至H18亚型中的任一种。在一些实施方案中，H是来自乙型流感病毒的H的成熟形式。编码H的核酸序列还可以包括可操作地连接到编码H的序列的编码自体H信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
在一些实施方案中，N是来自甲型流感病毒的N的成熟形式，例如N1至N11亚型中的任一种。在一些实施方案中，N是来自乙型流感病毒的N的成熟形式。编码N的核酸序列还可以包括可操作地连接到编码N的序列的编码自体N信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
核酸还可以包括或编码另外的元件。例如，编码IGIP多肽的序列和编码H或N的序列可以通过编码蛋白酶切割位点的核酸序列隔开，任选地，其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。另外地或替代地，编码IGIP多肽的序列和编码H或N的序列可以通过编码自切割肽的核酸序列隔开，任选地，其中所述自切割肽是2A自切割肽。编码IGIP多肽的序列和编码H或N的序列也可以通过编码肽接头的核酸序列隔开，任选地，其中所述肽接头包括一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸。
在一些实施方案中，核酸是流感病毒的单链负义RNA基因组片段。因此，在一些实施方案中，核酸序列的取向是：5’编码IGIP多肽的核酸序列-编码H或N的核酸序列3’。在其他实施方案中，核酸序列的取向为：5’编码H或N的核酸序列-编码IGIP多肽的核酸序列3’。还提供了与单链负义RNA基因组片段相对应的反向取向、反向互补和双链的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸还包括5’非翻译区(UTR)、3’非翻译区(UTR)，或其组合。5’UTR、3’UTR或其组合可以来自流感病毒。在一些实施方案中，核酸编码H，并在核酸的5′和3′端分别包括流感病毒基因组片段4的5′UTR和3′UTR。在一些实施方案中，核酸编码N，并在核酸的5’和3’端分别包括流感病毒基因组片段6的5’UTR和3’UTR。
核酸可以由例如DNA或RNA形成，可以是单链或双链，并且可以是线性的或环形的。还明确公开了核酸的反向互补序列。还提供了包括核酸和/或其反向互补序列的载体和病毒基因组片段。
还提供了具有编码所公开的核酸的基因组的重组病毒。在一些实施方案中，所公开的核酸形成重组流感病毒基因组片段的一部分，并且剩余的病毒基因组片段来自流感病毒。因此，重组病毒可以是并且最典型的是重组流感病毒。流感病毒可以是甲型或乙型流感病毒。例如，在一些实施方案中，重组甲型流感病毒的基因组结构是：编码PB2的片段1；编码PB1和任选PB1-F2的片段2；编码PA和任选的PA-X的片段3；编码H的片段4；编码NP的片段5；编码N的片段6；编码M1和M2的片段7；以及编码NS1和NEP的片段8；其中片段4包括与编码H的核酸序列可操作地连接的编码IGIP多肽的核酸序列，或片段6包括与编码N的核酸序列可操作地链接的编码IGIP肽的核酸序列。
在一些实施方案中，重组乙型流感病毒的基因组结构是：编码PB1的片段1；编码PB2的片段2；编码PA的片段3；编码H的片段4；编码NP的片段5；编码N和NB的片段6；编码M1和BM2的片段7；以及编码NS1和NEP的片段8；其中片段4包括与编码H的核酸序列可操作地连接的编码IGIP多肽的核酸序列，或片段6包括与编码N的核酸序列可操作地链接的编码IGIP肽的核酸序列。
最典型的是，流感病毒由减毒的流感病毒骨架形成。减毒病毒可包括再分配的基因组，温度敏感突变，NS1截短，弹性蛋白酶依赖性，重排的基因组或其组合。示例性的减毒病毒包括OH/04 att、冷适应列宁格勒(ca/LEN)或B/Bris att。在一些实施方案中，编码IGIP多肽的序列的引入增加或增强了重组病毒相对于其亲本、没有IGIP编码序列的骨架病毒的减毒。
还提供了使用其他病毒表达IGIP并增强针对病毒的免疫应答的组合物和方法。例如，在一些实施方案中，所述病毒是具有编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的基因组的重组牛痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒或轮状病毒，所述多肽在感染病毒的细胞中表达时可增加IgA表达。
还提供了药物组合物，其包括在药学上可接受的载体中的活的和/或灭活的重组病毒，用于施用至受试者。在一些实施方案中，所述组合物包括一种或多种另外的流感病毒，例如一种或多种另外的减毒活流感病毒。因此，药物组合物可以是多价疫苗制剂。一种或多种病毒可表达IGIP多肽。用于疫苗制剂的优选流感病毒包括但不限于减毒活H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和/或H6N1甲型流感亚型，以及一种或多种减毒活乙型流感病毒。任何药物组合物都可以进一步包括佐剂。药物组合物可配制用于例如皮内或肌内注射或鼻内递送。在优选实施方案中，所述组合物包括有效量的重组病毒，优选流感病毒，以在受试者中诱导针对病毒(优选流感病毒)的免疫应答。免疫应答可以是，例如，针对流感病毒的IgA抗体的产生增加，优选在气道粘膜中。
因此，还提供了诱导或增加针对重组病毒(包括重组流感病毒)的免疫应答的方法。所述方法通常包括向有需要的受试者施用有效量的包括活重组病毒的药物组合物，以诱导或增强受试者对流感病毒的免疫应答。免疫应答可提供针对流感病毒感染的预防或治疗效果。药物组合物可以通过例如注射或鼻内递送来施用。受试者可以是例如人、鸟、猪、马、雪貂、鲸鱼、海豹、狗、猫和啮齿类动物，或能够携带流感病毒或其感染的其他动物。还提供了疫苗接种方案，并且可以包括单次施用，或者间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天、周或月重复施用一次或多次。
在一些实施方案中，相对于替代的流感疫苗接种组合物和方法，所公开的组合物和其使用方法增强和/或拓宽对抗原漂移变体或分化体的保护，降低与次优抗体-抗原匹配相关的风险，降低疾病增强，降低免疫病理学，或其组合。
附图说明
图1A是不同哺乳动物物种中预测的IGIP的比对(牛(SEQ ID NO：7)、雪貂(SEQ IDNO：12)、猪(SEQ ID NO：2)、人(SEQ ID NO：8)和小鼠(SEQ ID NO：10))。显示了本研究中使用的成熟猪IGIP序列(SEQ ID NO：4)(“流感”)。图1B和1C是说明生产甲型和乙型IGIP-LAIV疫苗的策略的示意图。在另外的序列的背景下，甲型和乙型毒株的片段4(HA)(1A)和片段6(NA)(1B)被修饰以编码IGIP肽，以产生其从主要蛋白质产物(基因间区域)的释放。图1B显示了由反向遗传质粒编码的多蛋白序列(5′-3′)：HA信号肽-成熟IGIP-G4S接头-弗林蛋白酶切割位点-TvV 2a自切割肽-Gluc信号肽-HA(SEQ ID NO：28)。图IC显示了由反向遗传质粒编码的多蛋白序列(5′-3′)：NA-弗林蛋白酶切割位点-TvV 2a自切割肽-Gluc信号肽-成熟IGIP(SEQ ID NO：29)。图1D是显示MDCK和MDCK STAT1 KO细胞中IGIP-H1att和H1att的生长动力学曲线的线图。实验分别进行两次，每次三个重复。通过RT-qPCR测定滴定度，并表示为log10 TCID50当量。灰色区域表示低于测定检测水平的区域。图1E-1H是显示36℃(1C)、37℃(1D)、38℃(1E)和41℃(1F)下Ty/04 WT、Ty/04 att和IGIP-HA Ty/04 att随时间变化的Log10 TCID50/ml的线图(感染后小时数(hpi))。缩写：FP，融合肽；TM，跨膜结构域；CT，c末端区；G4S，聚甘氨酸蛋白接头；弗林蛋白酶CS，弗林蛋白酶切割位点；Tav2A、Thoseaassigna病毒2A蛋白序列；GlucS，Gaussia荧光素酶的信号肽。
图2A是使用初免加强疫苗接种方案的DBA/2J小鼠中的安全性/有效性疫苗研究的示意图。图2B是DBA/2J模型中不同病毒评估的更详细的示意图。
图3A和3B是显示体重变化(％)的线图，图3C和3D是显示在甲型流感H1N1 LAIV毒株初免(prime)接种后，雄性(3A，3C)和雌性(3B，3D)DBA/2J存活率％随时间变化的存活率曲线。小鼠(n＝16，1/2雌性)鼻内接种1x105TCID50/小鼠，每天监测临床症状。图3E和3F分别是体重变化(％)和存活率曲线的线图，存活率曲线显示了存活率％随时间的变化。将小鼠(n＝16)模拟(mock)接种(PBS；白色圆圈)或接种1×105TCID50/小鼠的IGIP-H1att(蓝色圆圈)、H1att(黑色圆圈)或H1caLen(灰色圆圈)。在病毒接种后14天监测体重变化(低于75％标记的灰色区域，即小鼠达到人道终点的点)(3E)和存活率(3F)。
图4A和4B是显示高剂量H1N1后体重变化(％)的线图，图4C和4D是显示高剂量H1N1后随时间变化的存活率％的存活率曲线，分别为雄性(4A，4C)和雌性(4B，4D)DBA/2J。小鼠鼻内接种1x106TCID50/小鼠的小鼠适应的A/California/04/09(10,000MLD50)，每天监测临床症状；达到人道终点的小鼠被人道地安乐死。图4E-4H图还显示了DBA/2J小鼠中，IGIP-H1att针对H1N1致死攻击的功效数据。对之前模拟接种的小鼠(n＝12/组)进行模拟攻击(白色圆圈)或用1×106TCID50/小鼠的Ca/04(H1N1)进行攻击(黑色圆圈)。先前用IGIP-H1att(蓝色圆圈)或H1caLen(灰色圆圈)接种的小鼠受到类似的攻击。监测(4E)体重变化(灰色区域表示小鼠达到人道终点)和(4F)生存率持续12天。在5dpc，对小鼠(n＝4/组)进行人道安乐死，并在(4G)肺和鼻甲骨(4H)的组织样本中评估病毒载量。
图5A和5B是显示宏观肺部病变(％，5A)和微观肺部病变(5B)的条形图，图5C和5D是显示攻击后猪支气管肺泡灌洗液(5C)或鼻拭子(5D)中病毒滴度的条形图。将猪鼻内和气管内接种3x106TCID50/猪的H1N1 A/猪/Iowa/A01778877/2016或H3N2 A/猪/Ohio/A01354299/2017。
对于雄性(6A，6C)和雌性(6B，6D)DBA/2J，图6A和图6B是显示乙型LAIV毒株初次接种后体重变化(％)的线图，图6C和图6D是显示乙型LAIV毒株初次接种后随时间变化的存活率％的生存率曲线。小鼠鼻内接种1x106TCID50/小鼠，每天监测临床症状。
对于高剂量IBV后的雄性(7A，7C)和雌性(7B，7D)DBA/2J，图7A和7B是显示体重变化(％)的线图，图7C和7D是显示随时间变化的存活率％的存活率曲线。小鼠鼻内接种1x107TCID50/小鼠B/Brisbane/60/2008 PB2 F406Y病毒(＞10MLD50)，每天监测临床症状；达到人道终点的小鼠被人道地安乐死。
图8A-8D是显示20dpb时，IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中IgG血清应答的图。小鼠(n＝4/组)在20dpb时放血，并使用血清评估HAI、VN和针对微阵列上打印的一组流感抗原的抗体反应性。来自IGIP-H1att-和H1caLen疫苗接种小鼠的样品分别用蓝点/条和灰点/条表示。PBS对照样品显示为白点/条。(8A)HAI和VN滴度。使用携带PB1-Nluc的重组Ca/04病毒建立VN滴度，并使用经典HA测定和Nluc活性在48hpi时通过两种独立的方法进行评估。针对(8B)H1、(8C)H5和(8D)H9的IgG抗体水平。每个血清样品对每个抗原的反应性用点/抗原表示，结果用每个值±SD的荧光强度平均值(MFI)表示。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号表示。图8E-8Q是显示流感抗原微阵列数据组合的图。绘制了包括不同抗原的组合数据。20dpb时，针对H1的血清(8E)IgG和(8F)IgA。14dpc时，针对H1的血清(8G)IgG和(8H)IgA。14dpc时，针对H1的(8I)NW和(8J)BALF中的(8I-8J)IgG。14dpc时，针对H1的(8K)NW和(8L)BALF中的(8K-8L)IgA。针对NA的(8M)血清IgG。针对内部蛋白质的(8N-8O)血清(8N)IgA和(8O)IgG。针对内部IAV蛋白的(8P-8Q)粘膜(8P)IgG和(8Q)IgA。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号标记。图8R-8X是显示针对第1组HA(H2、H6、H8和H11)和第2组HA(H3、H4、H7和H10)的流感抗原微阵列数据的图。20dpb时，针对(8R)第1组和(8S)第2组HA的(8R-8S)IgG。20dpb时，针对(8T)第1组和(8U)第2组HA的(8T-8U)IgA。14dpc时，针对第1组的(8V)血清IgG应答。针对(8W)第1组和(8X)第2组HA的(8W-8X)血清IgA应答。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用红色星号表示。
图9A-9C是显示20dpb时，IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中IgA血清应答的图。图8A-8D中的同一组样本，使用流感抗原阵列探测针对(9A)H1、(9B)H5和(9C)H9的IgA抗体。血清样品的反应性如图8A-8D所示表示，结果显示为MFI±SD。IGIP-H1att样品为蓝点/条。H1caLen样品为灰点/条。PBS对照样品为白点/条。未观察到显著性差异。
图10A-10E是显示14dpc时，IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中IgG血清应答的图。如图8A-8D所示，在14dpc时给小鼠(n＝8/组)放血，收集血清并用于评估抗体滴度。IGIP-H1att样品为蓝点/条。H1caLen样品为灰点/条。PBS对照样品为白点/条。(10A)HAI、VN和VNNluc滴度。针对(10B)H1、(10C)H5、(10D)H9和(10E)第2组HA的IgG抗体水平。主要图表和插图中血清样品的反应性如图8A-8D所示，结果显示为MFI±SD。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号标记。
图11A-11C是显示14dpc时，IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中的IgA血清应答的图。来自10A-10E的同一组样品探测针对(11A)H1、(11B)H5和(11C)H9的IgA抗体。血清样品的反应性如图8A-8D所示，结果显示为MFI±SD。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号表示。
图12A-12D是显示14dpc时，IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中粘膜IgG和IgA应答的图。小鼠(n＝4/组)在第14dpc时进行人道主义安乐死，收集鼻腔冲洗液(12A，12C)和BALF(12B，12D)，以评估蛋白质微阵列上针对H1 HA的IgG(12A、12B)和IgA(12C、12D)抗体的水平。主要图表和插图中样品的反应性如图8A-8D所示表示，结果显示为MFI±SD。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号表示。
图13A-13C是显示针对NA和IAV内部蛋白的血清抗体应答的图。图8A-8D(20dpb)和图10A-10E(14dpc)中所述的同一组样品在蛋白质微阵列面板上探测针对抗原的抗NA(13A，13C)和抗IAV内部蛋白(13B)抗体应答，如图所示。(13C)a由于高背景，N1 NA A/Egypt/2321NAMRU3/2007(H5N1)抗原的数据未用于分析。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号标记。
图14A-14D针对NA和IAV内部蛋白的粘膜抗体应答。对来自图12A-12D的同一组样品探测抗NA(14A)IgG和(14B)IgA抗体以及抗IAV内部蛋白(14C)IgG和(14D)IgA抗体。NW，鼻腔冲洗。插图对应于组合的BALF和NW数据，其中每个点对应于阵列中每个样品针对抗IAV内部蛋白的平均反应性。(14B，14C)a由于高背景，N1 NA A/Egypt/2321NAMRU3/2007(H5N1)抗原的数据未用于分析。IGIP-H1att和caLen之间的统计学显著性差异用星号表示。
发明详述
I.定义
如本文所用，“减毒”是指削弱疾病的试剂(病原体)的程序。减毒病毒是一种弱化的、活力较弱的病毒。针对病毒性疾病的疫苗可以由病毒的减毒的、弱毒毒株，能够刺激免疫应答并产生免疫力但不会导致疾病或导致较轻疾病的病毒制成。减毒可以通过使用本领域技术人员已知的方法对病原体进行化学处理、通过辐射或通过基因修饰来实现。减毒可能导致增殖减少、与宿主细胞的附着减少或毒素的产生或强度降低。
如本文所用，术语“核酸”指任何含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语包含包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假脲嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基z氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。根据标准命名法，核酸序列由三个字母或单字母代码命名，如下所示：腺嘌呤(Ade，a)、胸腺嘧啶(Thy，T)、鸟嘌呤(Gua，G)、胞嘧啶(Cyt，C)、尿嘧啶(Ura，U)。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸链，而不考虑修饰(例如甲基化)。
如本文所用，术语“基因”是指包含产生多肽、RNA(例如，包括但不限于mRNA、tRNA和rRNA)或前体所需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。多肽、RNA或前体可由全长编码序列或其任一部分编码。该术语还包括结构基因的编码区和位于5’和3’端的编码区附近的序列，任一端的距离约为1kb，使得该基因对应于全长mRNA的长度。术语“基因”包括cDNA和基因组形式的基因两者，其可能由DNA或RNA组成。基因的基因组形式或克隆可包含被称为“内含子”或“中间区域”或“中间序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可包含调节元件，如增强子。内含子从核转录物或原始转录物中去除或“剪接”出来；因此，内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。mRNA在翻译过程中起作用，以指定初生多肽中氨基酸的序列或顺序。
如本文所用，术语“核酸分子编码”是指沿着核苷酸链的核苷酸的顺序或序列。这些核苷酸的顺序可以决定多肽(蛋白质)链上氨基酸的顺序。因此，核苷酸序列可以编码氨基酸序列。
如本文所用，“异源”是指源生自不同物种。
如本文所用，“同源”是指源自同一物种。例如，同源性状是从共同祖先衍生的生物体的任何特征。同源序列可以是直系同源(orthologous、)的或旁系同源(paralogous)的。如果同源序列被物种形成事件分离，则它们是直系同源的：当一个物种分化为两个单独的物种时，产生的物种中单个基因的不同拷贝被称为直系同源的。直系同源物，或直系同源基因，是不同物种中彼此相似的基因，因为它们起源于共同的祖先。如果同源序列被基因复制事件分开，则它们是旁系同源的：如果生物体中的基因被复制为占据同一基因组中的两个不同位置，则这两个拷贝是旁系同源的。
如本文所用，“自体”是指源自自身。
如本文所用，“内源的”是指源自生物体、组织或细胞内的物质。
如本文所用，“外源的”是指源自生物体、组织或细胞外的物质。
如本文所用，“重组蛋白”是源自重组DNA的蛋白质。
如本文所用，“重组DNA”指从不同来源提取并化学连接在一起的DNA分子；例如包括来自一个来源的基因的DNA可以与来自另一来源的DNA重组。重组DNA可以是所有异源DNA或同源和异源DNA的组合。重组DNA可以整合到细胞的染色体中并从中表达，或者可以表达为额外的染色体阵列，如质粒。
如本文所用，“核酸序列改变”可以是例如一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入。“氨基酸序列改变”可以是例如，一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。
如本文所用，“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。本文所述的载体可以是表达载体。
如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而不考虑修饰(例如磷酸化或糖基化)。根据标准命名法，氨基酸残基序列由三个字母或单个字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
如本文所用，“变体”、“突变体”或“突变的”多核苷酸包含相比于相应野生型或亲本多核苷酸的多核苷酸序列的至少一个多核苷酸序列改变。突变可以是天然的、故意的或偶然的。突变包括取代、缺失和插入。
如本文所用，本领域已知的“同一性”是两个或多个多核苷酸或多肽序列之间的关系，如通过比较序列来确定的。在本领域中，“同一性”还意味着多核苷酸或多肽之间的序列相关性程度，如由这些序列链之间的匹配确定的。“同一性”也可以指与参考多核苷酸或多肽的全长相比，多核苷酸或多肽的序列相关性程度。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于在(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M，Ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，Ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M，和Griffin，H.G.，Eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonn Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M和Devereux，J.，Eds.，M StocktonPress，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J Applied Math.，48：1073(1988)中描述的那些。
确定同一性的优选方法旨在提供测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。两个序列之间的百分比同一性可以通过使用包含Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443-453，1970)算法(例如NBLAST和XBLAST)的分析软件(即，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，Madison Wis.)来确定。默认参数用于确定本公开的多核苷酸或多肽的同一性。
举例来说，多核苷酸或多肽序列可与参考序列相同，即100％相同，或与参考序列相比，其可包括多达特定整数的核苷酸或氨基酸改变，使得％同一性小于100％。这种改变选自：至少一个缺失、取代，包括保守和非保守取代，或插入，其中所述改变可发生在多核苷酸的5′或3′端，或参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或这些末端位置之间的任一位置，其单独散布在参考序列中的核酸或氨基酸之间，或散布在参考序列内的一个或多个相邻基团中。通过将参考多核苷酸或多肽中的核酸或氨基酸的总数乘以各自百分比同一性的数值百分比(除以100)，然后从参考多核苷酸或多肽中的所述核酸或氨基酸总数减去该得数，确定给定％同一性的核苷酸或氨基酸改变的数量。
如本文所用，“可操作地连接”是指组件被配置为执行其通常功能的并置。例如，可操作地连接到编码序列的控制序列或启动子能够影响编码序列的表达，并且可操作地链接到蛋白质的细胞器定位序列将帮助连接的蛋白质定位在特定的细胞器。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”是指作为使用所公开的组合物的治疗靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人。受试者可能有症状或无症状。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者，无论是雄性还是雌性，都将被涵盖。受试者可以包括对照受试者或测试受试者。
如本文所用，“治疗”是指预防、降低、减少或改善年龄相关的疾病、紊乱或病症的一种或多种症状、特征或合并症；逆转年龄相关紊乱的一种或多种症状、特征或合并症的进展；阻止年龄相关的紊乱的一种或多种症状、特征或合并症的进展；预防年龄相关紊乱的一种或多种症状、特征或合并症的发生；抑制一种或多种症状、特征或合并症的发展速度，或其组合。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或缓解正在治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其他方式提供所需的药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量将根据受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康状况等)、疾病和正在进行的治疗等多种因素而变化。
如本文所用，“佐剂”是一种提高抗原刺激免疫系统的能力的物质。
如本文所用，术语“载体”或“赋形剂”是指与一种或多种活性成分组合的制剂中的有机或无机成分、天然或合成非活性成分。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质，其适用于施用至人或其他脊椎动物。
除非本文中另有说明，否则本文中的值范围的引用仅旨在作为单独引用落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在约+/-10％范围内高于或低于规定值的值；在其他形式中，这些值的范围可以在约+/-5％的范围内高于或低于规定值；在其他形式中，这些值的范围可以在约+/-2％的范围内高于或低于规定值；在其他形式中，该值的范围可以在约+/-1％的范围内高于或低于规定值。上述范围旨在通过上下文明确，不暗示进一步的限制。
本发明公开了可用于、可与之结合使用、可用于制备所公开的方法的产物和组合物的材料、组合物和成分，或其产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集体组合和排列的具体引用，但本文中具体设想和描述了每一种。例如，如果公开并讨论了配体，并且讨论了可以对包括配体在内的多个分子进行的多个修饰，则除非特别相反地指出，否则可以特别考虑配体的每个组合和排列以及可能的修饰。因此，如果公开了分子A、B和C类别以及分子D、E和F类别以及组合分子A-D的实例，则即使没有单独列举每一种，也可以单独和集体地设想每一种。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一种都是具体设想的，并且应该被认为是公开自A、B和C；D、E和F；以及示例组合A-D的公开内容。同样，这些的任何子集或组合也被具体地设想和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组是具体设想的，并且应该被认为是公开自A、B和C；D、E和F；以及示例组合A-D的公开内容。此外，如上所述设想和公开的材料、组合物、成分等中的每一种也可以具体地和独立地包括或排除在此类材料的任何组、亚组、列表、集合等中。
这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种额外步骤，应当理解，这些额外步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都是具体设想的并且应当被认为是公开的。
II.组合物
提供了重组构建体、包括所述重组构建体的病毒基因组、包括所述构建体的重组病毒以及由其形成的疫苗制剂。
A.IGIP表达构建体
提供了编码IGIP的表达构建体。所公开的重组病毒通常具有编码IGIP多肽的核酸序列，通常是基因组核酸序列，所述序列可操作地连接到表达控制序列，导致IGIP多肽由感染病毒的细胞转录和翻译。还提供了中间构建体，例如扩增子和包括构建体的正向和反向遗传载体，其可用于改造病毒。
编码IGIP多肽的核酸序列最典型地连接到编码血凝素或神经氨酸酶的序列，例如HA或NA，如下面更详细讨论的。编码IGIP的核酸可操作地连接到相同或不同的表达控制序列，导致血凝素或神经氨酸酶的转录和翻译。例如，在一些实施方案中，编码IGIP和血凝素或神经氨酸酶的构建体是多顺反子的。信使RNA可在转录后被切割成单独的信使，其中IGIP和血凝素或神经氨酸酶分别被翻译成蛋白质，或单个多肽链(即，多蛋白)，所述单个多肽链可被翻译，随后被切割以产生单独的蛋白质。
核酸序列可进一步编码各种另外的元件，包括但不限于信号肽、多肽接头、自切割肽、蛋白酶切割位点序列(例如，病毒、宿主细胞或以其他方式提供的)、报告基因等。
1.IGIP序列
所公开的构建体通常包括编码IgA诱导蛋白(IGIP)或其生物功能片段或变体的核酸序列。IGIP最初在牛胃肠道相关淋巴组织(GALT)中被表征，并已被证明正向调节IgA表达。参见例如美国专利号6,930,167和7,638,284。所公开的重组病毒编码并表达IGIP多肽。优选地，IGIP多肽由感染的宿主细胞分泌。
各种物种的IGIP多肽序列是本领域已知的。内源性蛋白质通常在N末端包括单个肽序列。如下文更详细讨论的，在一些实施方案中，所公开的构建体包括编码包括天然存在的信号肽序列的整个全长IGIP蛋白的核酸序列。在其他实施方案中，所公开的构建体包括编码全长IGIP蛋白的生物学功能片段或变体的核酸序列。部分IGIP包括成熟IGIP的连续残基，例如4、7、10、15、20或更多残基，但少于全长成熟IGIP。此外，全长IGIP或成熟IGIP或其部分可与异源肽或多肽连接，例如融合，例如以提供IGIP融合多肽。例如，成熟的IGIP可以与增强对融合多肽的免疫应答的肽或非肽分子连接。
在一些实施方案中，所公开的构建体包括编码成熟IGIP或其生物功能片段的核酸序列，所述成熟IGIP或其生物功能片段任选地但优选地与异源信号肽序列(例如，替代信号肽，其不是天然与IGIP相关联的信号肽)融合。在一些实施方案中，异源信号肽序列增强了感染所公开的重组减毒病毒的宿主细胞的IGIP多肽的分泌。
示例性的非限制性IGIP肽序列包括
牛IGIP，例如：
MKKRSVSGCNITILAVVFSHLSAGNSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：7，UniProtKB-P0C7I2(IGIP_牛))，
以及其成熟形式，例如
GNSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：4)，和
NSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：1)；
人IGIP，例如：
MCSYYHMKKRSVSGCNITIFAVMFSHLSAGKSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS
(SEQ ID NO：8，UniProtKB-A6NJ69(IGIP_人))，和
MKKRSVSGCNITIFAVMFSHLSAGKSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：9)，和
其成熟形式，例如
GKSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：5)，和
KSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：2)；和
小鼠IGIP，例如：
MCSYYHMKKRSVLGCNITIFAVMFSHLSAGNSPCGNQATVLCISRLEFVQYQS
(SEQ ID NO：10，UniProtKB-A0A1B0GR74(A0A1B0GR74_小鼠))，和
MKKRSVLGCNITIFAVMFSHLSAGNSPCGNQATVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：11)，以及其成熟形式，例如
GNSPCGNQATVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：6)，和
NSPCGNQATVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：3)；和
雪貂IGIP和猪IGIP，例如
MCSYYHMKKRSVSGCNITILAVVFSHLSAGNSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：12)，
以及其成熟形式，例如
GNSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：4)，和
NSPCGNQANVLCISRLEFVQYQS(SEQ ID NO：1)。
例如，参见图1A。
因此，在一些实施方案中，所述核酸构建体编码多肽或其融合多肽，所述多肽或其融合多肽具有SEQ ID NO：1-12中任一项的氨基酸序列，或其功能片段或其变体，所述功能片段或变体与SEQ ID NO：1-12中的任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
所公开的组合物通常编码并且感染所公开的重组病毒的细胞通常分泌IGIP、其生物活性部分、类似物或衍生物。IGIP的生物活性部分、类似物或衍生物可以具有例如一种或多种与具有SEQ ID NO：1-12中任一项的IGIP多肽基本相似的活性。IGIP活性包括，例如，诱导用CD40L或CD40L-DAP3细胞和IL-2、CD40L和抗IgM抗体或CD40L刺激的外周B细胞分泌IgA，和/或增强动物体内(例如，豚鼠、小鼠或牛-小鼠嵌合体)的Ig产生。
在特定实施方案中，IGIP多肽是SEQ ID NO：4，其是利用下述实验的IGIP多肽。例如，参见图1B和1C。
在一些实施方案中，IGIP是另一物种的全长IGIP，或成熟IGIP或其部分。这样的IGIP序列在本领域中是已知的，并且可以在下面的表1中提供的UniPro登录号下获得，其各自以引用的方式全部并入本文。因此，在一些实施方案中，核酸构建体编码具有表1中提供的UniPro登录号中的任一项的氨基酸序列的多肽或其融合多肽，或其功能片段或其变体，所述功能片段或变体与表1中所提供的UniPro登录号中的任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
表1：IGIP登录号(按生物体)
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2.血凝素和神经氨酸酶
所公开的构建体通常包括编码血凝素或神经氨酸酶的核酸序列。
a.血凝素
流感血凝素(在本文中也称为H和HA)是一种在流感病毒表面发现的同源三聚体糖蛋白，是其传染性所必不可少的。它是一种I类融合蛋白，具有作为附着因子和膜融合蛋白两者的多功能活性。HA负责使流感病毒与靶细胞(如上呼吸道细胞或红细胞)表面的唾液酸结合，从而导致病毒内化。一旦暴露于低pH(5.0-5.5)，HA也负责病毒包膜与晚期内体膜的融合。
甲型流感中的血凝素具有至少18种不同的亚型，H1至H18。还参见Russell，etal.，Tredns in Microbiol.26(10)：P841-853doi：https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.03.005(2018)，其全部内容通过引用具体纳入本文。
尽管缺乏亚型，但乙型流感病毒通过不同谱系的共循环毒株之间的基因再分配和累积突变产生的抗原漂移而经历抗原变异。通过对天然存在的变体和抗体选择的逃逸变体的序列分析，研究了乙型流感病毒HA的抗原结构。参见例如Wang，et al.，Journal ofVirology，82(6)：3011-3020；DOI：10.1128/JVI.02477-07(2008)。
所公开的构建体可以编码任何不同的HA亚型，例如H1至H18中的任一种，或任何乙型流感HA。在一些实施方案中，所述构建体包括编码H1至H18中任一种或乙型流感HA的流感病毒核酸序列。在其他实施方案中，所述构建体包括替代序列，例如编码H1至H18中任一种或乙型流感HA的密码子优化的核酸序列。
通常在人类中发现的H1、H2和H3以及乙型流感HA，因此特别用于改善人类健康的疫苗应用，构建体可编码H1、H2、H3或乙型流感HA。编码H1、H3或乙型流感HA和IGIP的构建体在以下工作实施例中描述的实验中进行了测试。
如下文更详细讨论的，甲型流感病毒的片段6仅编码NA蛋白，而乙型流感病毒的片段6编码NA蛋白和在-1交替阅读框中的NB基质蛋白，NB基质蛋白是与甲型流感病毒M2蛋白相对应的整合膜蛋白(Bouvier和Palese，Vaccine，26(Suppl 4)：D49-D53(2008)。因此，在利用乙型流感NA的实施方案中，构建体可进一步编码NB蛋白。
b.神经氨酸酶
流感神经氨酸酶(在本文中也称为N和NA)存在于流感病毒的表面，并使病毒能够从宿主细胞释放。神经氨酸酶是糖苷水解酶家族34CAZY GH_34酶，其从糖蛋白中切割唾液酸基团，是流感病毒复制所必需的。神经氨酸酶通过从病毒包膜中去除碳水化合物来防止自身聚集，从而促进病毒进出感染部位。至少有11种不同的神经氨酸酶亚型，N1至N11。另参见McAuley，et al.，Front Microbiol.10：39，doi：10.3389/fmicb.2019.00039(2019)，其全部内容通过引用具体纳入本文。
尽管缺乏亚型，但在乙型流感毒株中也鉴定了许多NA序列，参见，例如，Correia，et al.，Virology，522：122-130，doi：10.1016/j.virol.2018.07.002(2018)；Gillian，etal.，Virology，177(2)：578-587，doi：10.1016/0042-6822(90)90523-T(1990))。
所公开的构建体可以编码任一不同的NA亚型，例如N1至N11中的任一种，或乙型流感NA。在一些实施方案中，所述构建体包括编码N1至N11中任一种或乙型流感NA的流感病毒核酸序列。在其他实施方案中，所述构建体包括替代序列，例如编码N1至N11中任一种或乙型流感NA的密码子优化的核酸序列。
N1、N2和乙型流感NA通常存在于人类中，因此特别用于改善人类健康的疫苗应用，构建体可以编码N1、N2或乙型流感NA。编码N1、N2或乙型流感NA和IGIP的构建体在以下工作实施例中描述的实验中进行了测试。
3.信号肽
在优选实施方案中，感染重组病毒的宿主细胞分泌IGIP。因此，编码IGIP的构建体通常包括编码与其可操作地连接的信号肽(也称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)的核酸序列。血凝素或神经氨酸酶蛋白通常还包括信号肽，因此，编码血凝素和神经氨酸酶的核酸序列也通常包括编码与其可操作地连接的信号肽的核酸序列。
信号肽是短肽序列(通常16-30个氨基酸长)，通常存在于蛋白质的N末端。信号肽的核心通常包含具有形成单个α螺旋趋势的一段疏水性氨基酸(约5-16个残基长)。此外，许多信号肽以带正电荷的氨基酸段开始，这可能有助于在易位过程中加强多肽的正确拓扑结构。在信号肽的末端，可以有一段氨基酸，其在易位过程中或易位完成后被信号肽酶识别和切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。
IGIP的信号序列可以是IGIP的信号序列，或者天然存在的IGIP信号序列可以由备选的信号序列代替。最典型的是，单个序列是促进受感染宿主细胞的IGIP分泌的序列。因此，在一些实施方案中，IGIP信号肽序列被进一步改善其从宿主细胞分泌的信号肽序列取代。类似地，血凝素或神经氨酸酶蛋白质的信号肽序列可以是血凝素或者神经氨酸酶蛋白的信号序列，或者天然存在的血凝素或神经氨酸酶蛋白信号肽序列可用备选的信号肽序列替换。
示例性策略包括但不限于在血凝素或神经氨酸酶信号序列与其成熟多肽序列之间插入成熟的IGIP序列，以及插入与成熟血凝素和神经氨酸酶蛋白序列融合的新的异源信号序列(参见例如图1B)，或将天然存在的或异源的信号序列与成熟的IGIP序列融合(参见例如图1C)。
示例性异源信号序列是Gaussia荧光素酶(Gluc)的信号肽(MGVKVLFALICIAVAEA(SEQ ID NO：26))，其被用于下述实验的示例性构建体。
IGIP、HA和NA与其各自的信号肽序列之间的融合可进一步包括或更多个另外的氨基酸残基。例如，生物信息学分析可用于预测不同信号肽序列的改进切割，并且可包括例如在IGIP、HA和/或NA序列开始之前在信号肽序列C末端添加/插入的一个、两个、三个、四个、五个或更多个另外的氨基酸的掺入。类似地，在一些实施方案中，在IGIP、HA和/或NA序列开始之前，在信号肽序列的C末端缺失/去除一个、两个、三个、四个、五个或更多个另外的氨基酸。
4.蛋白酶切割位点
核酸构建体可编码一个或多个蛋白质切割位点。示例性蛋白酶切割位点包括但不限于弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶切割位点具有RX(K/R)R(SEQ ID NO：13)共有基序。如本文所用，氨基酸序列中的“X”或“x”通常指任何氨基酸。还参见Zimmer，et al.，JVirol.，76(18)：9218-9224 doi：10.1128/JVI.76.18.9218-9224.2002(2002)，其全部内容通过引用具体纳入本文。
在下述实验中示例的构建体利用包括序列KRKRKKR(SEQ ID NO：14)的弗林蛋白酶切割位点。
另一个示例性蛋白酶切割位点是胱天蛋白酶-1切割位点，其可以具有X-Glu-X-Asp(X-E-X-D)(SEQ ID NO：30)的共有基序。参见例如，Shen，et al.，Atherosclerosis，210(2)：422-429(2010).doi：10.1016/j.atherosclerosis.2009.12.017。
5.自切割肽
核酸构建体可编码一个或多个自切割肽。示例性自切割肽包括但不限于2A自切割肽。2A自切割肽具有共有基序DxExNPGP(SEQ ID NO：15)。在下面描述的实验中示例的构建体利用包括序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)的Thosea asigna病毒2A肽序列。其他2A肽序列包括P2A(ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17))，E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：18))和F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：19))。切割是由2A肽C端脯氨酸(P)和甘氨酸(G)之间的肽键断裂激发的，导致位于2A肽上游的肽在其C端具有额外的氨基酸，而位于2A肽下游的肽在其N端具有额外的脯氨酸。在2A肽的N端上添加任选的接头，例如Gly-Ser-Gly有助于提高效率。
6.肽接头
核酸构建体可以编码一个或多个肽接头，例如以隔开由构建体编码的各种元件。
示例性柔性接头包括但不限于Gly-Ser，Gly-Ser-Gly，Ala-Ser，Gly-Leu-Phe，Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO：20)，Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：21)，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：22)，(Gly4-Ser)2(SEQ ID NO：23)，(Gly4-Ser)4(SEQ ID NO：24)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO：25)。下面举例说明的构建体利用Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：22)和Gly-Leu-Phe接头。
7.报告基因
在一些实施方案中，构建体进一步编码报告基因。报告基因通常是宿主细胞中不存在或表达的基因。报告基因通常编码一种蛋白质，该蛋白质提供一些表型改变或酶特性。这样的基因的实例在K.Weising et al.Ann.Rev.Genetics，22，421(1988)中提供，包括但不限于癌胚抗原、分泌的碱性磷酸酶和绒毛膜促性腺激素的β亚基、葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶(例如Gaussia荧光素酶(GLuc)、Nano萤光素酶(NLuc))和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)，增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、turbo红色荧光蛋白(TurboRFP)等。
报告基因可以作为体内病毒活性的测量或监测。例如，这些报告基因由感染的细胞释放到血液中，可以通过外周测量来确定病毒活性(Phuong，et al.，Cancer Res.，63：2462-2469(2003)；Peng，et al.，Nat.Med.，8：527-531(2002)；Shashkova，et al.，CancerGene Ther.，15：61-72(2008)；Hiramatsu，et al.，Cancer Science，100，1389-1396(2005))。
还将认识到，在一些实施方案中，报告基因由病毒基因组编码，但不是IGIP编码构建体的一部分。例如，在一些实施方案中，IGIP编码序列与HA共定位，并且报告的编码序列与不同病毒基因组片段上编码NA的序列共定位；或者IGIP编码序列与NA共定位，并且报告的编码序列与不同病毒基因组片段上编码HA的序列共定位。
另外地或备选地，报告基因编码序列可以位于不同的病毒基因组片段上，因此不与IGIP、NA或HA共定位。例如，在一些实施方案中，编码报告基因的序列位于另一流感基因例如PB1基因(片段2)或NS1基因(片段8)的上游或下游。例如，参见美国公开申请号2014/0161771。
8.额外的元件和示例性病毒基因组片段
下面将更详细地讨论合适的病毒骨架。最典型的是，重组病毒包括流感病毒的基因组片段，其被工程化以编码、表达并且优选地分泌成熟的IGIP多肽。因此，所公开的核酸构建体，包括但不限于重组流感基因组片段，可以包括对于重组病毒感染的宿主细胞中的IGIP表达(1)所必需和足够的表达控制特征，和(2)以适合的方向排列的核酸序列。构建体还可以包括构建体复制和将其包装成病毒体所必需和足够的特征。
最典型地，IGIP表达构建体被设计用于与血凝素一起表达，例如在基因组片段4上，或与神经氨酸酶一起表达，例如流感基因组片段6上。这些片段被设计成使得重组病毒也表达血凝素或神经氨酸酶。
流感病毒是负义单链RNA(-ssRNA)病毒。他们具有由单链的而不是双链的RNA构成的基因组。它们的基因组是负义的，这意味着信使RNA(mRNA)是由病毒酶RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)(也称为RNA复制酶)从基因组合成的，其由所有负(-)ssRNA病毒编码。因此，如本文所用，单链核酸“编码”所描述的特征(例如，IGIP、H、N、接头、切割位点等)，其中链是正义的(例如，编码链)或负义的(例如模板链)。
为了便于描述，在流感基因组片段以及核酸中，以下示例性片段以5’至3’方向呈现，以反映编码的蛋白质序列的正义性质，因为它们也被掺入双链扩增子、克隆，然而应当理解，还提供了反向取向以及互补链，并且当指定时，核酸也可以在3′-5′方向上描述。
核酸构建体和病毒基因组片段的示例性取向包括，例如
‘5编码IGIP多肽的核酸序列-编码H或N的核酸序列3’；和
‘5编码H或N的核酸序列-编码IGIP多肽的核酸序列3’；
在一些实施方案中，核酸的5′和3′端分别包括例如来自流感病毒的5′非翻译区(UTR)、3′非翻译区(UTPR)或其组合。
在特定实施方案中，核酸编码H，并在核酸的5′和3′端分别包含流感病毒片段4的5′UTR和3UTR。
在其它实施方案中，核酸编码N，并在核酸的5′和3′端分别包含流感病毒片段6的5′UTR和3′UTR。
用于在受感染的宿主细胞中产生能够表达IGIP和血凝素或神经氨酸酶的重组基因组片段以5’-3’方向呈现的示例性质粒构建体在以下工作实例中举例说明，并以以下方向的序列为特征：
片段4的5′-UTR、HA的信号肽、IGIP成熟肽序列、接头序列(例如G4S)、切割位点(例如弗林蛋白酶识别CS)、自切割肽序列(例如Thosea assigna病毒2A蛋白序列)、信号肽序列(例如Gaussia荧光素酶(Gluc)的单肽)、HA开放阅读框、克隆间隔区和片段4的3′-UTR(图1B)，以及
片段6的5′-UTR，随后是5′-UTR下游的克隆间隔区，NA开放阅读框(和任选的NB，其中NA是乙型流感NA)，接头序列(例如G4S)，切割位点(例如，弗林蛋白酶识别CS)，自切割肽序列(例如，Thosea assigna病毒2A蛋白序列)，信号肽序列(如Gaussia萤光素酶(Gluc)的单肽)，IGIP成熟肽序列和片段6的3′-UTR(图1C)。
不认为该取向是重要的，因此也提供了备选取向。然而，图中所描述的取向可能最适合所公开的疫苗组合物和方法。
在特定实施方案中，加工的IGIP蛋白包含另外的12个氨基酸的C-末端尾(G4S(K/R)7)，产生序列GNSPCGNQANVLCISRLEFVQYQSGGGGSKRKRKKR(SEQ ID NO：31)。
B.分离的核酸、载体和扩增子
所公开的IGIP构建体可以是分离的核酸、载体、扩增子、病毒基因组等，并且许多在所公开的重组病毒的制造和使用期间以多种形式存在。例如，构建体可以是由RNA或DNA形成的正义或反义序列方向(例如，正链或负链)的线性或环形单链或双链核酸分子。
如本文所用，“分离的核酸”是指与基因组中存在的其他核酸分子分离的核酸，包括通常位于基因组中核酸的一侧或两侧的核酸。例如，分离的核酸可以是DNA分子，前提是天然存在的基因组中通常直接位于该DNA分子侧翼的核酸序列之一被去除或缺失。因此，分离的核酸包括但不限于作为独立于其他序列的单独分子存在的DNA分子(例如，化学合成的核酸，或通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及掺入到载体、自主复制的质粒、病毒、或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可以包括工程化核酸，例如作为杂交或融合核酸的一部分的重组DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库或含有基因组DNA限制性消化片段的凝胶切片内的数百至数百万个其他核酸中的核酸不应被视为分离的核酸。
核酸可以是有义或反义取向，或其组合。因此，核酸可以是编码序列、与其互补的序列或其组合。核酸序列可以相对于编码IGIP多肽或其变体的参考序列进行讨论，任选地还包括另外的元件，包括但不限于5’和/或3’UTR，编码信号肽、蛋白酶切割位点、自切割肽、肽接头、报告基因等的那些，如本文所讨论的。参考序列包括例如IGIP的核苷酸序列，并且构建体的其他元件包括本领域已知的和上文讨论的那些。
核酸可以是DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸盐骨架上修饰。这种修饰可以提高例如核酸的稳定性、杂交性或溶解度。
可以将核酸插入载体中以在细胞中表达。如本文所用，“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。载体可以是表达载体。“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体，并且“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
载体中的核酸可以与一个或多个表达控制序列可操纵地连接。如本文所用，“可操作地连接”是指掺入到基因构建体中，使得表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子区域构成的表达控制序列，通常位于转录开始点上游100个核苷酸内(通常靠近RNA聚合酶II的起始位点)。为了将编码序列置于启动子的控制之下，必须将多肽翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游1至约50个核苷酸之间。增强子在时间、位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同，增强子可以在距转录位点各种距离时发挥作用。增强子也可以位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录为mRNA时，编码序列在细胞中与表达控制序列“可操作地连接”并“受其控制”，然后mRNA可以翻译成编码序列编码的蛋白质。
合适的表达载体包括但不限于源自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒的质粒和病毒载体。许多载体和表达系统可从诸如公司Novagen(Madison，WI)、Clontech(Palo Alto，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)和Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)商购。
表达载体可以包括标签序列。标签序列通常表达为与编码多肽融合。这种标签可以插入多肽内的任何地方，包括羧基或氨基末端的任一个。有用标签的实例包括但不限于HA、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素、FlagTM标签(Kodak，New Haven，CT)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A。
可以将含有待表达核酸的载体转移到宿主细胞中。术语“宿主细胞”旨在包括其中可以引入重组表达载体的原核生物和真核生物细胞。如本文所用，“转化的”和“转染的”包括通过多种技术之一将核酸分子(例如，载体)引入细胞中。尽管不限于特定技术，但这些技术中的一些在本领域内是公知的。原核生物细胞可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化。可以通过包括例如磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔或显微注射的技术将核酸转染到哺乳动物细胞中。
C.重组病毒
所公开的能够在感染的宿主细胞中表达IGIP的重组病毒通常由流感病毒骨架形成，然而，应当理解，IGIP可以由用于疫苗的其他活重组载体产生，例如牛痘、腺病毒、疱疹、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹等。因此，尽管如下关于流感的描述特别详细，但相同或类似的策略可用于替代的重组病毒骨架，例如牛痘、腺病毒、疱疹、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹、黄热病、腮腺炎、风疹、轮状病毒等，还提供了用于表达IGIP的合适的表达构建体和其活重组病毒，以及它们在疫苗中的用途。例如，参见Nascimento and Liete，Braz J Med BiolRes.，45(12)：1102-1111(2012)，Choi and Chang，et al.，Clin Exp Vaccine Res.2(2)：97-105(2013)，Souza，et al.，Braz JMed Biol Res 38(4)：509-022(2005)，各自都通过引用全文具体纳入本文。
所公开的重组病毒通常作为活病毒进行讨论，然而，也提供了灭活病毒及其病毒组分。
任何天然存在的或工程化的流感病毒，优选甲型或乙型病毒，都可以作为所公开的重组病毒的骨架。最典型的病毒是减毒病毒。在一些实施方案中，病毒骨架是天然存在的或其他野生型病毒，并且添加IGIP表达构建体导致对病毒的关注(attention)。在优选实施方案中，骨架病毒是已经被减毒的病毒。将表达IGIP的构建体添加到这样的减毒活病毒(LAIV)基因组中可能会进一步使病毒减毒，或者添加表达IGIP构建体可能不会进一步使病毒减毒。因此，在一些实施方案中，重组的表达IGIP的病毒的减毒水平与具有表达IGIP的病毒的病毒骨架相同，而在一些实施方案中，减毒增加。
1.重组病毒的结构
流感病毒有四种类型：甲型、乙型、丙型和丁型。在美国，人甲型和乙型流感病毒几乎每年冬天都会引起季节性疾病流行(称为流感季节)(CDC网站，“流感病毒的类型”)。甲型流感病毒是已知的导致流感大流行的唯一流感病毒，即流感疾病的全球流行。当一种新的、非常不同的甲型流感病毒出现时，就会发生大流行，这种病毒既感染人，又有能力在人与人之间有效传播。丙型流感感染通常会导致轻微疾病，认为不会导致人流感流行，而丁型流感病毒主要影响牛，已知不会感染或导致人患病。
所公开的病毒通常是重组甲型流感或乙型流感病毒。甲型流感病毒根据病毒表面的两种蛋白质分为亚型：血凝素(H或HA)和神经氨酸酶(N或NA)。乙型流感病毒不分为亚型，而是进一步分为两个谱系：乙型/山形县(B/Yamagata)和乙型/维多利亚(B/Victoria)。与甲型流感病毒相似，乙型流感病毒可进一步分为特定分化枝和亚分化枝。乙型流感病毒的遗传和抗原特性通常比甲型流感病毒变化更慢，尤其是甲型流感(H3N2)病毒。近年来的流感监测数据显示，在美国和世界各地，两个谱系的乙型流感病毒共同传播。然而，每个谱系乙型流感病毒的传播比例可能因地理位置而异。
甲型和乙型流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，其基因组包括8段负极性单链RNA(Webby R J，et al.(2007)Curr.Top.Microbiol.Immunol.315：67-83；Yamanaka K，et al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：5369-5373；Lopez-Turiso J A，etal.(1990)Virus Res 16：325-337)。这些病毒具有带有宿主来源的脂质双层的包膜，并覆盖有约500个具有血凝和神经氨酸酶活性的突起的糖蛋白刺突。这些活性对应于两种主要的表面病毒糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)(或NA+NB)，分别以同源三聚体和同源四聚体的形式存在。片段4和6分别编码HA和NA(或NA+NB)基因。
在包膜内，基质蛋白(M1)和核壳体(NP)蛋白保护病毒RNA。类型名称(甲型、乙型或丙型)是基于M1和NP蛋白的抗原性特征。总基因组的大约一半编码三种病毒聚合酶蛋白(片段1、2和3)。片段5编码NP蛋白。三种聚合酶亚基(PB1、PB2和PA)、NP和vRNA以病毒核糖核蛋白颗粒(vRNP)的形式在病毒体和感染细胞中缔合。
两个最小的片段(7和8)编码两个基因，每个基因都有重叠的阅读框，这些阅读框是通过共线mRNA分子的剪接产生的。除M1外，片段7编码质子泵跨膜蛋白(M2)，其具有离子通道活性并嵌入病毒包膜中。片段8编码NS1(一种阻断宿主抗病毒应答的非结构蛋白)和核输出蛋白(NS2或NEP)(病毒颗粒的结构成分)。NEP/NS2与细胞输出机制相互作用，并参与病毒颗粒的组装。最近，还表明了NEP/NS2在流感病毒转录和复制的调节中发挥作用。
因此，八个RNA片段通常编码10-12种病毒蛋白，包括两种表面糖蛋白，HA和NA，M2，M1，NS2/NEP，NS1，以及在一些流感病毒中(从片段1中的替代翻译起始位点)PB1-F2(一种凋亡调节蛋白)(Arias C F，et al.(2009)Arch Med Res 40：643-654；Zell R，(2006)EmergInfect Dis 12：1607-1608；author reply 1608-1609；Chen W，et al.(2001)Nat Med 7：1306-1312)。其他的病毒蛋白产物包括PB1-N40，其来源于PB1 ORF内的替代起始位点，导致缺乏PB1的前39个氨基酸的蛋白产物，以及PA-X，其来源自PAmRNA，并由由+1移码引起的融合到61aa的PA的N端191aa组成(Jagger B W，et al.(2012)Science 337：199-204；YewdellJ W，Ince W L(2012)Science 337：164-165)。
因此，在一些实施方案中，重组病毒具有甲型背景，并编码HA、NA、M2、M1、NS2/NEP、NS1、NP、PB1、PB2、PA和IGIP蛋白中的一种或多种，优选全部。
在一些实施方案中，基因组包括以下的一个或多个，优选全部：
编码PB2的片段1；
编码PB1和任选的PB1-F2的片段2；
编码PA和任选的PA-X的片段3；
编码HA的片段4；
编码NP的片段5；
编码NA的片段6；
编码M1和M2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8；
其中片段4或片段6中的任一个被进一步工程化以表达IGIP。
在一些实施方案中，重组病毒具有乙型背景，并编码HA、NA、NB、BM2、M1、NS2/NEP、NS1、NP、PB1、PB2、PA和IGIP蛋白中的一种或多种，优选全部。
在一些实施方案中，基因组包括以下的一个或多个，优选全部：
编码PB1的片段1；
编码PB2的片段2；
编码PA的片段3；
编码HA的片段4；
编码NP的片段5；
编码NA和NB的片段6；
编码M1和BM2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8；
其中片段4或片段6中的任一个被进一步工程化以表达IGIP。
a.减毒病毒骨架
所公开的重组病毒通常是适于用于疫苗接种方案的减毒活病毒(LAIV)。在优选实施方案中，重组病毒的骨架是相对于野生型病毒已经减毒的骨架。
用于人类的LAIV最初由美国和俄罗斯于20世纪60年代在卵中连续传代后独立获得，在卵中连续传代后产生了具有冷适应、温度敏感突变的病毒，这些突变阻止了它们在高于35℃的温度下生长，从而限制了病毒向鼻腔的复制，随后使用各种技术的方法获得。所公开的病毒通常是减毒的。因此，病毒被削弱，并且可以表现出例如宿主中的复制减少。
减毒(att)病毒背景可以是例如可用的减毒病毒，或者是掺入一种或多种不同减毒病毒的一个或多个减毒特征的嵌合减毒病毒。可用的LAIV及其减毒特征包括例如再分配(reassortant)病毒，例如携带主供体病毒A/Ann Arbor/6/60(对于IAV)和B/Ann Arbor/1/66(对于IBV)的冷适应、温度敏感(ts)突变，NS1截短，弹性蛋白酶依赖性病毒和重排的基因组。参见，例如，Finch，et al.，Curr Top Microbiol Immunol.386：205-35.doi：10.1007/82_2014_404(2015)和Rajao和Perez，Front Microbiol.，9：123doi：10.3389/fmicb.2018.00123(2018)，其中讨论的参考文献包括但不限于Maassab et al.，Adv.Biotechnol.Process.14，203-242(1990)；Carter和Curran，Drugs 71，1591-1622(2011)；Song et al.，J.Virol.81，9238-9248(2007)；Pena et al.，J.Virol.85，456-469(2011)；Loving et al.，J.Virol.87，9895-9903(2013)；Alam et al.，J.Virol.88，314-324(2014)；Gauger et al.，Virology 471-473，93-104(2014)；Santos et al.，J.Virol.91，e00056-00017(2017)；Santos et al.，Vaccine 35，5637-5643(2017)；Solorzano et al.，J.Virol.79，7535-7543(2005)；Hai et al.，J.Virol.82，10580-10590(2008)；Richt和Garcia-Sastre，Curr.Top.Microbiol.Immunol.333，177-195(2009)；Kappes et al.，Vaccine 30，280-288(2012)；Pica et al.，J.Virol.86，10293-10301(2012)；Shi et al.，Vaccine 34，350-357(2016)；Masic et al.，Vaccine 28，7098-7108(2010)；Pena et al.，J.Virol.87，5118-5127(2013)；Nogales et al.，J.Virol.，90，6291-6302(2016)；Harding et al.，MBio 8：e00669-17(2017)，以及美国公开申请号2020/0023054，2016/0030547、2016/0022807、2014/0302158、2014/0161771和2011/0150912，以及美国专利号10,434,166、10,080,794和8,475,807，其全部内容各自通过引用具体纳入本文。
MedImmune(FluMist)生产的鼻内冷适应LAIV于2003年首次在美国获得许可，而FluMist的四价版本于2012年获得批准，尽管近年来有一些证据表明其有效性降低，这可能与H1N1pdm09毒株的稳定性和/或传染性降低有关(O′Donnell et al.，J.Virol.88，12374-12384(2014))或来自疫苗中其他成分的干扰。自1987年以来，在俄罗斯，为3岁以上儿童、成人和老年人提供的“列宁格勒”LAIV与灭活疫苗相比，在儿童中继续显示出优异的有效保护(Ghendon et al.，Infect.Immun.44，730-733(1984)；Rudenko et al.，Vaccine 34，5436-5441(2016)，其各自的全部内容通过引用具体纳入本文)。
针对马流感病毒(EIV)的改良活疫苗是一种经批准用于动物的减毒活疫苗。该疫苗具有源自野生型A/eq/肯塔基州/1/91(H3N8)EIV毒株的冷适应和温度敏感病毒，在美国，已被证明在马中使用是安全和有效的(在Paillot，Vacc.(Basel)2，797-831(2014)中进行了综述，其全部内容通过引用纳入本文)。
在禽源或猪源IAV的背景下，MDV-A株(这些病毒中的大多数天然携带NP D34G突变)的单个PB2突变(N265S)和三个PB1突变(K391E、D581G和A661T)的掺入导致体外具有ts表型的病毒，并且在将C末端表位标签掺入PB1后，体内获得了足够的att表型，在ts突变的背景下，所述C末端表位标签由源自H3 HA基因片段的9个氨基酸序列组成(HA标签)。进一步的研究表明，如上所述修饰的IAV att病毒(ts突变加HA标签)在小鼠、鸡和猪中作为LAIV是安全有效的；并且适于鼻内施用。在鸡中，IAV att疫苗也适用于卵内免疫。因此，在一些实施方案中，att病毒背景包括PB2突变(例如N265突变，例如N265S)和/或PB1突变(例如K391突变，例如K391E；E581突变，例如E581G，和/或A661突变，例如A661T)中的一个或多个。还参见美国公开申请号2011/0150912。
在一些实施方案中，att病毒背景包括突变的流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶。重组流感病毒可以包括例如突变的PA聚合酶亚基。在一些方面，突变的PA亚基可以在第59位具有突变。例如，第59位的突变可以是E到V的突变。本文所述的任何突变都可以存在于PA亚基中。
在一些实施方案中，att病毒背景包括重排的基因组，例如，具有一个或多个重排的流感基因组片段。重排的基因组片段可以包括流感基因组片段1、2、3、4、5、6、7或8中的任意一个或多个的重排。
示例性重排的流感基因组包括例如具有NS2核酸序列的基因组，但其中NS2核酸序列从基因组的RNA片段8中去除。在一些实施方案中，NS2核酸序列可以与在其正常/野生型基因组片段上发现的PB1基因可操作地连接。在一些方面，重排的基因组包括与流感基因序列例如NS1序列可操作地连接的外源序列。NS1序列可以是截短的序列。外源序列可以位于截短的NS1序列的下游。外源序列可以包括任何核酸序列。例如，外源序列可以是来自不同流感毒株的核酸序列。在一些实施方案中，外源序列可以是H5N1血凝素(HA)序列或神经氨酸酶序列。在一些实施方案中，外源序列是来自流感以外的病毒的核酸序列。
在一些实施方案中，含有重排基因组的重组att流感病毒具有PB1-NS2重排和NS1外源序列重排两者。
重排的基因组可以包括存在于一个或多个重排的基因组片段内的切割位点。例如，切割位点可以存在于包含PB1和NS2的重排基因组片段上，其中切割位点位于PB1和NS2核酸序列之间。重排的基因组片段可以包括外源序列和NS1核酸序列之间的切割位点。在一些方面，切割位点可以是CHYSEL(SEQ ID NO：27)位点。CHYSEL(SEQ ID NO：27)位点包括但不限于口蹄疫病毒2A自我蛋白酶解(FMDV 2A)位点。
具有重排基因组的重组流感病毒可以是减毒病毒。流感病毒的减毒可以通过切割位点的融合、通过在PB2(例如N265S)和PB1(例如K391E、E581G和A661T)基因中引入温度敏感(ts)突变、通过在PB1中引入干扰PB1-PA相互作用的突变(例如T6D)或通过在NS1中截短来实现。还参见美国公开申请号2014/0161771。
与IAV att备选活病毒疫苗中发现的突变相似的突变也被引入到原型(prototypic)B/Vic谱系株B/Brisbane/60/2008(B/Bris)中。具体而言，将突变设计在PB2中(K267S)和PB1中(K391E、E580G和S660A)，此外，在存在或不存在温度敏感突变的情况下，用C端HA标签修饰PB1片段。研究表明，突变E580G、S660A和C-末端HA标签在SPF卵中稳定保持了15代，在组织培养细胞中稳定保持20代，在体内稳定、减毒且具有免疫原性。因此在一些实施方案中，att乙型流感背景是病毒聚合酶的PB1片段的第580位残基谷氨酸和/或第660位残基丝氨酸被非极性氨基酸取代的乙型流感病毒(包括但不限于本文公开的任何维多利亚(Victoria)谱系(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和/或山形(Yamagata)谱系(例如乙型流感/佛罗里达、乙型流感/普吉、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞或乙型流感/威斯康星州)病毒)。例如，取代可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在特定实施方案中，病毒聚合酶的PB1片段的取代包括E580G和/或S660A取代。还参见美国公开申请号2020/0023054。
在特定实施方案中，病毒骨架是OH/04 att骨架(Pena，et al.，J Virol，85(1)：456-69(2011)，Loving，et al.，Vaccine，30(40)：5830-8(2012)，Gauger，Virology，471-473：93-104(2014))，冷适应的列宁格勒骨架(ca/LEN)(Ghendon，Infect Immun，44(3)：730-3(1984)，Isakova-Sivak，et al.，Vaccines(Basel)，7(3)(2019))，或B/Bris att的骨架(Wan，et al.，J Virol，92(21)(2018)，Santos，J Virol，91(12)(2017))，其用于下述实验。
b.血凝素(H)和神经氨酸酶(N)亚型
有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型(分别为H1至H18和N1至N11)。虽然可能有198种不同的甲型流感亚型组合，但在自然界中只检测到131种亚型。目前在人群中经常传播的甲型流感病毒亚型包括：A(H1N1)和A(H3N2)。目前流行的甲型(H1N1)流感病毒与2009年春季出现并导致流感大流行的2009H1N1流感病毒有关(CDC 2009H1N1流感网站)。这种病毒，科学上称为“甲型(H1N1)pdm09病毒”，更一般地称为“2009H1N1”，自那时以来一直季节性地传播。随着时间的推移，这些H1N1病毒经历了相对较小的基因变化和抗原特性的变化(即影响免疫的病毒特性)。
所公开的减毒活病毒可以编码H和N蛋白或乙型流感的H和N蛋白的131种亚型组合中的任一种。因此，即使是已知的减毒活病毒也可以进一步修饰以交换血凝素亚型和序列，神经氨酸酶亚型和序列，或其组合，优选同时保持削弱宿主中病毒的减毒特征。例如，在一些实施方案中，重组病毒的基因组由已知减毒病毒的片段1-3、5、7-8形成，并且片段4和6中的一个或两个被编码不同血凝素亚型和/或序列、不同神经氨酸酶亚型和或序列或其组合的不同片段4和/或片段6替换，其中片段4和/或片段6也被修饰以编码和表达IGIP。
H1、H2和H3以及N1和N2通常存在于人类中，因此特别用于改善人类健康的疫苗应用，重组减毒活病毒可以以H1、H2或H3与N1或N2的组合为特征。在人类中确认的亚型包括1918年导致西班牙流感和2009年的猪流感的H1N1；1957年导致亚洲流感的H2N2；1968年导致香港流感的H3N2；2004年导致禽流感的H5N1；H7N7；在人类、猪和鸟中流行的H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；H10N7；H7N9，其在2018年被评为甲型亚型中具有最大的大流行潜力；和H6N1。
因此，在一些实施方案中，重组病毒是在活病毒背景中优选减毒活病毒背景的H1N1、H2N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7或H7N9亚型，并被改造以表达IGIP，优选来自病毒基因组的片段4或片段6。
在一些实施方案中，重组病毒是在活病毒背景(优选减毒活病毒背景)中具有乙型流感HA和乙型流感NA的乙型流感病毒，并被改造以表达IGIP，优选来自病毒基因组的片段4或片段6。
2.重组病毒的制备方法
制备重组流感病毒的方法是本领域已知的，并且可以用于制备所公开的重组减毒流感病毒。例如，参见基于质粒的反向遗传学方法，包括但不限于将源自流感病毒的病毒RNA片段的cDNA拷贝克隆到反向遗传学质粒载体和扩增子中，以及成功产生重组流感病毒的实验程序描述于，例如Perez，et al.，“Plasmid-Based Reverse Genetics ofInfluenza A Virus，”Methods of in Molecular Biology，Reverse Generics of RNA Viruses，Spring Protocols，doi：10.1007/978-1-4939-6964-7_16(2017)；和Perez，etal.，“Plasmid-Based Reverse Genetics of Influenza A Virus，”Methods of inMolecular Biology，Animal Influenza Virus，Spring Protocols，doi：10.1007/978-1-0716-0346-8_4(2020)，美国公开申请号2014/0161771，美国公开申请号2016/0022807中。
众所周知，流感病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等病毒可以使用多个质粒制备，每个质粒都含有制备病毒所需的不同病毒基因。因此，例如，当一种新的流感毒株进化时，该新毒株的特定基因，例如HA或NA基因，可以被克隆到适当的质粒骨架中，从而可以产生含有该新毒株的流感病毒疫苗。在一些实施方案中，扩增子用于产生重组病毒的一个或多个方面。
使用扩增子生产重组病毒的方法可以包括在用于病毒繁殖的体外系统中提供编码至少一种病毒基因的一个或多个扩增子。用于这种系统的扩增子可以包括RNA聚合酶信号、终止信号和一种病毒基因或调节序列的至少一部分。该方法可以包括使用编码病毒基因的扩增子和质粒的组合。该方法可包括仅使用扩增子或仅使用质粒来携带病毒基因。
用于产生病毒的方法可以包括a)将一个或多个扩增子和/或质粒提供给体外细胞系统，所述一个或多个扩增子和/或质粒各自包括病毒基因或病毒基因的一部分，所述体外细胞系统包括能够转录扩增子和或质粒病毒基因的聚合酶，以及b)在允许病毒产生的环境下培养所述细胞。该方法还可以包括从细胞或从细胞培养基中收获病毒。
扩增子可以通过例如以下来产生：a)扩增第一片段，其中所述第一片段包括病毒和/或异源核酸序列的片段和终止序列；b)扩增第二片段，其中所述第二片段包括病毒和/或异源核酸序列的片段；c)扩增第三片段，其中所述第三片段包括启动子序列；和d)组合三个片段以形成具有终止序列、病毒和/或异源核酸序列和启动子序列的扩增子。终止序列可以是t1信号序列。
例如，包括例如一个或多个IGIP序列、信号肽序列、接头、切割序列、自切割肽序列、报告基因等的初始中间构建体可以通过例如Genscript(Piscataway，NJ)在克隆载体如pUC57中合成，并且将中间片段亚克隆到合适的反向遗传载体如pDP2002中(Perez，et al.，Methods Mol Biol，1602：251-273(2017))。随后，可以从合适的来源扩增编码整个HA或NA开放阅读的PCR片段，并将其亚克隆到相应的中间载体中，以形成编码重组基因片段的相应IGIP-HA或IGIP-NA载体。
可以进行转染，以从所选流感病毒、优选减毒流感病毒骨架中的HA或NA片段的任一个中拯救表达IGIP的甲型或乙型LAIV菌株。
例如，10-11天龄的无特异性病原体(SPF)卵中可产生病毒库。可采集、离心、等分和在例如-80℃下储存尿囊液体。可以使用任何合适的方法滴定病毒库。例如，组织培养感染剂量(TCID)或卵感染剂量(EID)。使用已知方法计算病毒滴度，例如Reed和Muench方法(Reed，et al.，Am.J.Hyg.，27：493-497(1938))。
III.疫苗制剂
提供了药物组合物、疫苗制剂和剂量单位，包括1、2、3、4、5或更多种编码和表达IGIP多肽的所公开的重组病毒。所述组合物可任选地进一步包括其他疫苗组分，包括但不限于1、2、3、4、5或更多种不表达IGIP的其他病毒(例如减毒的骨架病毒)和/或灭活病毒、病毒蛋白、佐剂等及其组合。任何组合物都可以在载体中配制，并且可以包括一种或多种赋形剂和/或防腐剂。
A.药物载体
含有病毒的药物组合物可用于全身或局部施用。可以配制通过胃肠外(肌内(IM)、腹膜内(IP)、静脉内(IV)、皮内或皮下注射(SC))或经粘膜(鼻、阴道、肺或直肠)施用途径施用的剂型。
在一些体内方法中，本文公开的组合物以治疗有效量施用至受试者。
对于本文公开的组合物和编码所述组合物的核酸，本领域技术人员可以考虑治疗背景、年龄和接受者的一般健康状况来确定用于治疗各种患者的各种病症的适当剂量水平。所选择的剂量取决于所需的治疗效果、施用途径和所需的治疗持续时间。活性病毒也可以用空斑形成单位(PFU)或焦点形成单位(FFU，也称为荧光焦点单位)来衡量。空斑形成单位可以定义为单层细胞培养物中的细胞裂解(CPE)区域，在重叠条件下，由单个病毒颗粒感染引发。FFU是PFU的变体，但FFU不是依赖细胞裂解来检测空斑形成，而是使用免疫染色技术来检测感染的宿主细胞和感染性病毒颗粒。
通常，病毒的剂量水平可以在102至1012FFU之间。根据施用途径，病毒通常以100μl至5ml，优选0.2ml至2ml的液体悬浮液形式施用。该剂量可以施用一次或多次。局部递送的病毒可以以比全身施用的病毒更低的剂量施用。
例如，用于鼻内递送的
Figure BDA0004122240900000421
QUADRIVALENT喷雾器含有单个0.2mL剂量。每0.2mL剂量含有106.5-7.5FFU(荧光焦点单位)的四种毒株中每一种的活减毒流感病毒再分配体：A/Switzerland/3330/2017(H1N1)(A/Brisbane/02/2018(H1N1)pdm09样病毒)、A/Kansas/14/2017(H3N2)、B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata/16/88谱系)和B/Colorado/06/2017(B/Victoria/2/87谱系)。
FFU或PFU用于许多人类疫苗中。剂量也可以用TCID或EID表示。大多数流感疫苗临床前试验的出版物显示的剂量为50％组织培养感染剂量(TCID50)或胚胎感染剂量(EID50)。通常，根据动物种类，动物接种的剂量为10^3-10^8 TCID50或EID50，体积范围为50μl-2ml。因此，对于所公开的组合物也可以考虑这样的剂量。
药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括有助于将活性化合物加工成可药用制剂的赋形剂和助剂。所述组合物可与一种或多种生理学或药学上可接受的载体、增稠剂、共溶剂、粘合剂、抗氧化剂、缓冲剂、粘度和吸收增强剂以及能够调节制剂渗透压的试剂组合施用。正确的制剂取决于所选择的施用途径。如果需要，所述组合物还可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂或防腐剂。
病毒的药物剂量单位通常以低体积的液体悬浮液形式施用。
示例性添加剂在下文中进行了更详细的讨论，并且应当在理解所公开的att病毒通常作为活病毒施用的情况下进行选择，并且通常不希望向药物组合物中添加可杀死或灭活病毒的试剂或其量。例如，制剂中不应包含有效量的膜破坏剂以杀死或灭活病毒。
1.局部或肠胃外施用制剂
在优选的实施方案中，包括本文公开的病毒的组合物通过肠外注射在水溶液中施用。注射包括但不限于局部注射、静脉注射、腹膜注射、肌内注射或皮下注射。制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供的药物组合物包括有效量的病毒，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物包括稀释剂、无菌水、各种缓冲液含量、pH和离子强度的缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)；以及任选地，添加剂如抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂和膨松剂(例如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或运载体的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油和玉米油，明胶和可注射有机酯如油酸乙酯。优选的溶液是磷酸盐缓冲盐水或无菌盐水。
2.粘膜施用制剂
在一些实施方案中，所述组合物被配制用于粘膜施用，例如通过鼻、肺或口腔递送。
粘膜制剂可包括一种或多种用于增强通过鼻粘膜的递送的药剂。用于增强粘膜递送的药剂是本领域已知的，参见例如Eddington的美国专利申请号20090252672和Touitou的美国专利申请号20090047234。可接受的试剂包括但不限于钙螯合剂(EDTA)、鼻酶抑制剂(硼亮氨酸、抑肽酶)、粘膜纤毛清除抑制剂(防腐剂)、鼻膜增溶剂(环糊精、脂肪酸、表面活性剂)和胶束的形成(表面活性剂如胆汁酸、Laureth9号和牛磺脱氢夫西地酸(taurodehydrofusidate)(STDHF))。组合物可包括一种或多种吸收促进剂，包括表面活性剂、脂肪酸和壳聚糖衍生物，其可通过调节紧密连接(TJ)来增强递送(B.J.Aungst，et al.，J.Pharm.Sci.89(4)：429-442(2000))。一般而言，最佳吸收促进剂应具有以下特性：其作用应是可逆的，应对粘膜的细胞膜提供快速渗透增强作用，在有效浓度水平下应是非细胞毒性的，对细胞膜、病毒膜或TJ的细胞骨架没有有害和/或不可逆的影响。
在一些实施方案中，病毒通过鼻内施用。
载体制剂、施用方法或其组合可与其他鼻内流感疫苗(如
Figure BDA0004122240900000441
QUADRIVALENT)相似，因此可为例如0.2mL剂量的悬浮液，该悬浮液是在单剂量预先填充的鼻内喷雾器中提供的。每0.2mL剂量含有106.5-7.5FFU(荧光焦点单位)的四种毒株的每一种的活减毒流感病毒再分配体。每0.2mL剂量还含有0.188mg/剂量的谷氨酸一钠、2.00mg/剂量的水解猪明胶、2.42mg/剂量的精氨酸、13.68mg/剂量的蔗糖、2.26mg/剂量的磷酸氢二钾和0.96mg/剂量的磷酸二氢钾。每个剂量都含有残余量的卵清蛋白(＜0.024mcg/剂量)，也可能含有残余量的硫酸庆大霉素(＜0.015mcg/mL)和乙二胺四乙酸(EDTA)(＜0.37mcg/剂量)。FluMist Quadrivalent不含防腐剂。为了施用制剂，在适合于鼻内施用的注射喷雾器中提供所述制剂。喷雾器的喷头配有喷嘴，所述喷嘴产生细雾，所述细雾主要沉积在鼻子和鼻咽中。FluMist Quadrivalent是一种无色至淡黄色的悬浮液，清澈至略微浑浊。参见例如，/>
Figure BDA0004122240900000442
QUADRIVALENT包装说明书。
B.佐剂
佐剂在本领域中也是已知的，并且可以作为相同或单独的药物组合物的一部分用于所公开的组合物和方法中。
Montanide IMS 1313 VG N专为与活疫苗剂一起配制而设计，并推荐用于粘膜或肠胃外施用。
佐剂可以是TLR配体。通过TLR3起作用的佐剂包括但不限于双链RNA。通过TLR4起作用的佐剂包括但不限于脂多糖衍生物，如单磷酸脂A(MPLA；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)和胞壁酰二肽(MDP；Ribi)以及苏氨酰胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(一种与脂质A有关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)。通过TLR5起作用的佐剂包括但不限于鞭毛蛋白。通过TLR7和/或TLR8起作用的佐剂包括单链RNA、寡核苷酸(ORN)、合成的低分子量化合物如咪唑并喹啉胺(例如，咪喹莫特(R-837)、雷西莫特(R-848))。通过TLR9起作用的佐剂包括病毒或细菌来源的DNA，或合成寡核苷酸(ODN)，如CpG ODN。另一类佐剂是含有硫代磷酸酯的分子，例如硫代磷酸酯核苷酸类似物和含有硫代磷酸酯主链连接的核酸。
佐剂也可以是油乳剂(例如，弗氏佐剂)；皂甙制剂；病毒颗粒和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物；免疫刺激寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和解毒衍生物；明矾；BCG；含矿物组合物(例如，矿物盐，如铝盐和钙盐，氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等)；生物粘附和/或粘膜粘着剂；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈；胞壁肽；咪唑并喹诺酮化合物；和表面活性物质(例如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，油乳液，钥孔戚血蓝素和二硝基酚)。
佐剂还可包括免疫调节剂，例如细胞因子，白介素(例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12等)，干扰素(例如，干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
通常，佐剂是不会杀死或灭活病毒的佐剂。然而，在一些实施方案中，使用可杀死或灭活活病毒的佐剂。在一些实施方案中，佐剂的使用量为对杀死和/或灭活病毒无效的量。在其他实施方案中，佐剂的使用量为有效地杀死和/或灭活病毒的量，并因此将疫苗从活病毒疫苗转化为非活病毒疫苗。此类佐剂可包括但不限于明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)；从皂树(Q.saponaria)树皮中纯化的皂甙，例如QS21(一种通过HPLC分馏在第21峰洗脱的糖脂；Antigenics，Inc.，Worcester，Mass.)；聚[二(羧基苯氧基)磷腈](PCPP聚合物；VirusResearch Institute，USA)，Flt3配体，利什曼原虫延长因子(一种纯化的利什曼虫蛋白；Corixa Corporation，Seattle，Wash.)，ISCOMS(免疫刺激复合物，其含有混合的皂甙、脂质并形成病毒大小的颗粒，具有可容纳抗原的孔；CSL，Melbourne，Australia)，Pam3Cys，SB-AS4(SmithKline Beecham佐剂系统#4，其含有明矾和MPL；SBB，Belgium)、形成胶束的非离子嵌段共聚物，如CRL 1005(这些聚合物包含疏水性聚氧丙烯的线性链，两侧是聚氧乙烯链，Vaxcel，Inc.，Norcross，Ga.)和Montanide IMS(例如，IMS 1312，水基纳米粒子与可溶性免疫刺激剂相结合，Seppic)。
任何佐剂也可从组合物中特别地排除。
C.试剂盒
剂量单位包括用于运输、储存和/或施用的药学上可接受的载体中的病毒。活病毒应使用与存活力一致的方法运输和储存，例如在含有干冰的冷却器中，以使细胞保持在4℃以下，优选低于-20℃。VSV病毒不应冻干。试剂盒的组分可以单独包装并且可以是无菌的。在一个实施方案中，包含有效量的病毒的药学上可接受的载体被运输并储存在无菌小瓶中。无菌小瓶可包含足够用于一个或多个剂量的病毒。病毒可以以适合施用的体积运输和储存，或者可以以在施用前稀释的浓缩滴度提供。在另一个实施方案中，含有有效量的病毒的药学上可接受的载体可以在注射器中运输并储存。
无菌盐水、磷酸盐缓冲盐水或其他适合病毒的介质中病毒颗粒的典型浓度。通常，活病毒的剂量单位不应含有膜破坏剂，也不应将病毒溶液冷冻和干燥(即冻干)，这可能会杀死病毒。
提供了包含各种容量的注射器或带有可变形侧面的容器(例如塑料容器或塑料侧容器)的试剂盒，这些容器可以被挤压以迫使液体组合物从孔中流出。注射器的尺寸和设计取决于施用途径。通常，将使用更大的注射器、泵或导管来全身地施用病毒。
试剂盒任选地包括以下一种或多种：生物活性剂、介质、赋形剂和以下的一种或多种：注射器、绷带、消毒剂、局部麻醉剂、镇痛剂、手术线、剪刀、无菌液体和无菌容器。用于鼻内施用的试剂盒可任选地包含用于促进鼻内递送的递送装置，例如鼻喷雾器。试剂盒通常在容器中提供，例如，适合商业销售的塑料、纸板或金属容器。任何试剂盒都可以包括使用说明。
IV.使用方法
提供了抑制和/或预防流感病毒感染的方法。本文公开的可表达IGIP的减毒活病毒和包括这些病毒的疫苗可用于免疫受试者，使其免于暴露和感染流感病毒，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒或其组合。例如，一种或多种公开的减毒重组活病毒，例如，以疫苗或包括一种或多种减毒重组活病毒的其他组合物的形式，可以施用至需要其的受试者，以治疗、抑制或预防流感感染。所述组合物可预防性地施用至有暴露于流感病毒风险的患者或受试者，所述流感病毒最典型的是甲型或乙型流感病毒，或其组合。所述组合物也可以施用至新暴露于流感病毒，或有暴露于流感病毒的风险的患者或受试者，所述流感病毒最典型的是甲型或乙型流感病毒，或其组合。
受试者可以是任何能够感染流感病毒的动物。例如，包括但不限于鸭、鸡、火鸡和鹌鹑的鸟类，猪、马、雪貂、鲸鱼、海豹、狗、猫和啮齿动物，都可以感染各种流感病毒株，并且可以施用所公开的组合物。鸟类中的流感通常称为禽流感，猪中的流感称为猪流感，马中的流感称为马流感等。人类中的流感通常被称为季节性流感。水禽是许多亚型流感的重要储主。
因此，在一些实施方案中，将所述组合物施用至人类受试者。在一些实施方案中，任选地但优选地，将所述组合物施用于非人动物，其中将所述组合物施用于非人的动物降低了所述动物维持或传播一种或多种可感染人类的病毒株的能力。在一些实施方案中，受试者是雪貂、猫、狗、马、猪、牛或鸟。鸟可以是水鸟，如鸭子，也可以是家养或农业鸟，如鸡。
在一些实施方案中，表达IGIP多肽的重组病毒相对于野生型或不含IGIP多肽的减毒的骨架病毒是被减毒的。在一些实施方案中，相对于不含IGIP多肽的减毒骨架病毒，IGIP的表达有效地增加针对病毒的免疫应答。在一些实施方案中，减毒增加了病毒的安全性，优选同时保持其有效用作疫苗的能力。
所公开的组合物被设计成在减毒流感活疫苗的基础上促进IgA应答的上调。通常，IgA抗体比IgG抗体更广泛地中和，IgA也主要存在于粘膜表面，以提供针对流感病毒的一线保护。因此，所述方法可以包括使用所公开的组合物作为鼻内流感疫苗，优选具有针对多种亚型流感的更高效力。
因此，在一些实施方案中，相对于不含IGIP多肽的减毒骨架病毒，增加的免疫应答是或包括增加的抗体滴度，特别是IgA和/或IgG抗体滴度。在一些实施方案中，在受试者的粘膜组织(例如气道)中发现较高的IgA和/或IgG抗体滴度。在一些实施方案中，免疫应答是或包括鼻相关淋巴组织(NALT)的数量和/或活性的增加。先前的研究表明，NALT是局部长期特异性抗体产生的位点(Liang，et al.，J Virol，75(11)：5416-20(2001)，Asanuma，etal.，dImmunol Methods，202(2)：123-31(1997))。
在一些实施方案中，所述组合物和方法有效地刺激粘膜表面的IgA和/IgG，并减少或防止病毒到达靶细胞。在最优选的实施方案中，疫苗是包含有效量的病毒或编码IGIP的病毒的组合的疫苗，IGIP可以从重组病毒感染的细胞分泌并稳定地维持在重组流感病毒中，并且病毒在卵子中保持生长特性和体内免疫原性。
减毒病毒的功效可以以本领域技术人员熟知的各种方式进行评估。例如，通过观察组合物减少病毒载量，可以确定组合物，例如本文公开的减毒活重组病毒，在治疗或抑制受试者中的流感感染方面有效。
在一些实施方案中，免疫应答针对流感蛋白，例如H、N、PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1和NEP中的一种或多种。
在一些实施方案中，期望免疫应答所针对的流感病毒是一种或多种甲型流感病毒、一种或多种乙型流感病毒或其组合。
示例性甲型流感病毒包括但不限于在人类中确认的亚型，如导致1918年西班牙流感和2009年猪流感的H1N1；1957年导致亚洲流感的H2N2；1968年导致香港流感的H3N2；2004年导致禽流感的H5N1；H7N7；在人类、猪和鸟中流行的H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；H10N7；H7N9，其在2018年被评为甲型亚型中具有最大的大流行潜力；和H6N1。
示例性的乙型流感病毒包括Victoria谱系(例如，乙型流感/布里斯班、乙型流感/马来西亚)和Yamagata谱系(例如乙型流感/佛罗里达州、乙型流感/普吉岛、乙型流感/上海、乙型流感/马萨诸塞州或乙型流感/威斯康星州)的病毒。
在一些实施方案中，减毒病毒的骨架源自期望对其进行免疫应答用于预防或治疗的一种或多种流感病毒。
在一些实施方案中，将一种或多种表达IGIP的减毒重组活病毒作为涉及抑制甲型流感和/或乙型流感病毒的多价疫苗(例如二价、三价或四价疫苗)中的组分施用至受试者。所公开的组合物和方法的多价疫苗可包括例如1、2、3、4或5种或更多种不同的疫苗组分，其中所述组分选自活病毒、灭活病毒、病毒蛋白等及其组合，其中所述病毒中的至少一种和任选的2、3、4或全部5种是编码和表达IGIP多肽的减毒重组病毒。在一些实施方案中，制剂的1、2、3、4或5种活病毒表达IGIP。因此，在一些实施方案中，表达IGIP的病毒与一种或多种非表达IGIP的病毒在多价疫苗制剂中组合。
每个季节的流感疫苗包括一种甲型流感(H1N1)、一种甲型流感(H3N2)和一种或两种乙型流感病毒(取决于疫苗)。接种流感疫苗可以预防流感病毒，所述流感病毒与用来制造疫苗的病毒一样。因此，在一些实施方案中，所公开的疫苗包括用于针对一种甲型流感H1N1、一种甲型流感H3N2和一种或两种乙型流感病毒接种的组分，其中所述病毒的至少一种、任选地2种、3种或全部4种是编码和表达IGIP多肽的减毒重组病毒。剩余的疫苗接种组分可以是灭活病毒、病毒蛋白等及其组合。
所公开的组合物和另外的疫苗组分和佐剂可以在相同的混合物中一起配制，或者可以在两种或多种单独的药物组合物中配制。可以同时施用两种以上不同的组合物，例如共同施用，或分开施用，例如相隔数小时、数天或数周。
任何组合物都可以作为疫苗方案的一部分施用，包括间隔1、2、3、4、5、6或7天、周或月施用所公开的组合物1次、2次、3次、4次、5次或更多次。
在更具体的实施方案中，该方案是间隔3周的初免-加强方案。初免-加强可以是活疫苗-活疫苗或活疫苗-灭活疫苗方案。
最详细地讨论了关于流感的这些方法，然而，应当理解，根据所选择的重组病毒背景和/或病毒表达的任何抗原蛋白，本文所讨论的编码IGIP的备选重组病毒可用于诱导免疫应答的方法以及治疗和预防疾病的方法。因此，在一些实施方案中，所述方法用于诱导针对例如牛痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒或轮状病毒或由病毒编码/表达的异源抗原的免疫应答，和/或保护免受由此引起的疾病。
可以通过以下编号的段落进一步理解所公开的组合物和方法。
1.核酸，其包含编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的核酸序列和编码血凝素(H)或神经氨酸酶(N)的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接到一个或多个表达控制序列，所述IgA诱导蛋白多肽任选地增加IgA的表达。
2.段落1所述的核酸，其进一步包含可操作地连接至所述编码IGIP多肽的序列的编码自体IGIP信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
3.段落1或2所述的核酸，其中所述IGIP多肽包含SEQ ID NO：1-12中任一项的IGIP的成熟形式，或其功能片段或其变体，其与SEQ ID NO：1至12中任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
4.段落1-3中任一项所述的核酸，其包含编码H的核酸序列，并且还包含可操作地连接到所述编码H的序列的编码自体H信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
5.段落4所述的核酸，其中所述H是来自甲型流感病毒的H的成熟形式。
6.段落5所述的核酸，其中所述H是H1至H18中任一项的成熟形式。
7.段落4所述的核酸，其中所述H是来自乙型流感病毒的H的成熟形式。
8.段落1-3中任一项所述的核酸，其包含编码N的核酸序列，并且还包含可操作地连接到所述编码N的序列的编码自体N信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
9.段落8所述的核酸，其中所述N是来自甲型流感病毒的N的成熟形式。
10.段落9所述的核酸，其中所述N是N1至N11中任一项的成熟形式。
11.段落8所述的核酸，其中所述N是来自乙型流感病毒的N的成熟形式。
12.段落1-11中任一项所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码蛋白酶切割位点的核酸序列隔开，任选地其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
13.段落1-12中任一项所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码自切割肽的核酸序列隔开，任选地，其中所述自切割肽是2A自切割肽，任选地其中所述2A自切割多肽选自EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)、ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：18)和VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：19)。
14.段落1-13中任一项所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码肽接头的核酸序列隔开，任选地，其中所述肽接头包含一个或多个甘氨酸和一个或多个丝氨酸。
15.段落1-14中任一项所述的核酸，其中所述核酸是具有以下取向的流感基因组RNA片段：‘5编码IGIP多肽的核酸序列-编码H或N的核酸序列3’。
16.段落1-14中任一项所述的核酸，其中所述核酸是具有以下取向的流感基因组NRA片段：‘5编码H或N的核酸序列-编码IGIP多肽的核酸序列3’。
17.段落1-16中任一项所述的核酸，其进一步包含5’非翻译区(UTR)、3’非翻译区域(UTR)，或其组合。
18.段落17所述的核酸，其中所述5′UTR、3′UTR或其组合来自流感病毒。
19.段落18所述的核酸，其中所述核酸编码H，并在核酸的5’和3’端分别包含流感病毒片段4的5’UTR和3’UTR。
20.段落18所述的核酸，其中所述核酸编码N，并且在核酸的5’和3’端分别包含流感病毒片段6的5’UTR和3’UTR。
21.核酸，其包含段落1-20中任一项所述的核酸的反向互补序列。
22.段落1-21中任一项所述的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
23.段落1-22中任一项所述的核酸，其中所述核酸是单链的或双链的。
24.段落1-23中任一项所述的核酸，其中所述核酸是环形的或线性的。
25.载体，其包含段落1-14中任一项所述的核酸。
26.病毒基因组片段，其包含段落1-21中任一项所述的核酸。
27.病毒，其包含段落26所述的病毒基因组片段。
28.段落27所述的病毒，其中剩余的病毒基因组片段来自流感病毒。
29.段落28所述的病毒，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
30.段落29所述的病毒，其包含如下基因组结构：
编码PB2的片段1；
编码PB1和任选的PB1-F2的片段2；
编码PA和任选的PA-X的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N的片段6；
编码M1和M2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8；
其中所述片段4包含编码H的段落1-23中任一项所述的核酸序列，或片段6包含编码N的段落1-23中任一项所述的核酸序列。
31.段落28所述的病毒，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
32.段落31所述的病毒，其包含如下基因组结构：
编码PB1的片段1；
编码PB2的片段2；
编码PA的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N和NB的片段6；
编码M1和BM2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8；
其中所述片段4包含编码H的段落1-23中任一项所述的核酸序列，或片段6包含编码N的段落1-23中任一项所述的核酸序列。
33.段落28-32中任一项所述的病毒，其中所述流感病毒是减毒的流感病毒。
34.段落33所述的病毒，其中所述减毒的病毒包含再分配基因组、温度敏感突变，NS1截短，弹性蛋白酶依赖性，重排的基因组，或其组合。
35.段落33或34所述的病毒，其中所述减毒的流感病毒是OH/04 att、冷适应列宁格勒(ca/LEN)或B/Bris att。
36.药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的段落27-35中任一项所述的活病毒，其用于施用至受试者。
37.段落36所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种另外的流感病毒。
38.段落37所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的流感病毒是减毒的病毒。
39.段落36-38中任一项所述的药物组合物，其包含一种或多种H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和/或H6N1甲型流感亚型。
40.段落36-39中任一项所述的药物组合物，其包含一种或多种乙型流感病毒。
41.段落36-40中任一项所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
42.段落36-41中任一项所述的药物组合物，其被配制用于皮内或肌内注射。
43.段落36-41中任一项所述的药物组合物，其被配制用于鼻内递送。
44.段落36-43中任一项所述的药物组合物，其包含有效量的流感病毒，所述有效量在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答。
45.段落44所述的药物组合物，其中所述免疫应答包括针对流感病毒的IgA和/或IgG抗体的产生增加。
46.诱导或增加针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的段落36-45中任一项所述的药物组合物，以诱导或增加受试者中针对流感病毒的免疫应答。
47.段落46所述的方法，其中所述免疫应答提供针对流感病毒感染的预防或治疗效果。
48.段落46或47所述的方法，其中所述药物组合物通过注射或鼻内递送施用。
49.段落46-48所述的方法，其中所述受试者选自人类、鸟类、猪、马、雪貂、鲸鱼、海豹、狗、猫和啮齿动物。
50.段落46-49中任一项所述的方法，其包括间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天、周或月重复施用一次或多次。
51.重组病毒，其包含编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的基因组，当在病毒感染的细胞中表达时，所述IgA诱导蛋白多肽能够增加IgA和/或IgG的表达。
52.段落51所述的重组病毒，其中所述病毒是重组流感病毒、牛痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒或轮状病毒。
53.药物组合物，其包含有效量的段落51或52所述的重组病毒，以在需要其的受试者中诱导针对病毒的免疫应答，优选地，其中针对病毒的免疫应答大于用不存在IGIP表达的病毒诱导的免疫应答。
54.段落53所述的药物组合物，其中所述重组病毒是活病毒。
55.在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向受试者施用段落53或54所述的药物组合物。
实施例
Cáceres，et al.，“Development of a Novel Live Attenuated Influenza AVirus Vaccine Encoding the IgA-Inducing Protein，”Vaccines，9(703)，21 pages(2021).doi.org/10.3390/vaccines9070703，包括所有补充材料关联(mdpi.com/article/10.3390/vaccines9070703/s1)，其全部内容通过引用具体纳入本文。
实施例1：IGIP-LAIV的设计和生产。
材料和方法
细胞
Madin-Darby犬肾(MDCK)和人胚肾293T细胞(HEK293T)是来自Robert Webster(StJude Children’s Research Hospital，Memphis，TN，USA)的礼物。MDCK STAT1 KO细胞(CCL-34-VHG)购自ATCC。将细胞保持在Dulbecco改良伊格尔培养基(DMEM，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中，该培养基含有10％胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)、1％抗生素/抗真菌剂(AB，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)和1％L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)。细胞在37℃、5％CO2下培养。
产生编码IGIP的质粒，IGIP侧翼为片段4(HA)序列。
IGIP蛋白在哺乳动物中高度保守，并由肠道中的抗原呈递树突细胞(DC)表达为47-54个氨基酸的蛋白。IGIP被认为在肠道IgA表达的调节中起作用。IGIP中的C端24aa对应于成熟的活性肽，而N端～30aa对应于信号肽区域(图1C)。
质粒构建体被设计为以5′-3′的顺序携带片段4的5′-UTR、H1 HA(A/Califomia/04/09(Ca/04)(H1N1))的信号肽、IGIP成熟肽序列、G4S接头、弗林蛋白酶识别切割位点、Thosea assigna病毒2A蛋白序列、Gaussia荧光素酶(Gluc)的信号肽、克隆间隔区和片段4的3′-UTR。针对1)H1和2)H3和3)乙型流感(IBV)HA序列生产了三种这样的构建体。这些初始中间构建体由Genscript(Piscataway，NJ)在pUC57克隆载体中合成。
将中间片段亚克隆到反向遗传载体pDP2002中(Perez，et al.，MethodsMol Biol，1602：251-273(2017)，Pena，et al.，J.Virol.，85，456-469(2011)，Wan，et al.，J.Virol.，92(2018))，产生中间质粒pDP2002 IGIP。随后，编码来自毒株A/Califomia/04/2009(H1N1)(Ca/04)、A/turkey/Ohio/313053/2004(H3N2)(OH/04)和B/Brisbane/60/2008(B/Bris)(Wan，et al.，J Virol，92(21)(2018)，Ye，et al.，PLoS Pathog，6(10)：e1001145(2010)，Santos，J Virol，91(12)(2017)的整个HA开放阅读框的PCR片段被亚克隆到相应的IGIP-HA嵌合基因片段的相应中间载体中，产生质粒pDP2002-IGIP-H1。The pDP2002-IGIP-H1序列通过Sanger测序(Psomagen，Rockville，MD，USA)确认。
参见例如图1B。
产生编码IGIP的质粒，其中所述IGIP侧翼为片段6(NA)序列。
pUC57骨架中的三个质粒载体(N1、N2和NB)是通过Genscript产生的，其编码片段6的5′-UTR，随后是5’-UTR下游的克隆间隔区、G4S接头、弗林蛋白酶识别切割位点、Thoseaassigna病毒2A蛋白序列、Gluc信号肽、IGIP成熟肽序列和片段6的3′-UTR。将表达盒克隆到pDP2002中，并将N1，N2，或乙型流感病毒NA中的任一个的整个开放阅读框扩增并克隆到相应的间隔区。
参见例如图1C。
生成表达IGIP的LAIV候选株。
进行转染，以从OH/04 att骨架(Pena，et al.，J Virol，85(1)：456-69(2011)，Loving，et al.，Vaccine，30(40)：5830-8(2012)，Gauger，Virology，471-473：93-104(2014))或冷适应列宁格勒骨架(ca/LEN)(Ghendon，Infect Immun，44(3)：730-3(1984)，Isakova-Sivak，et al.，Vaccines(Basel)，7(3)(2019))中的任一个的HA或NA片段中的任一个拯救表达IGIP的甲型流感LAIV毒株。同样，进行转染以获得B/Bris att骨架中具有或不具有IGIP的乙型LAIV毒株(Wan，et al.，J Virol，92(21)(2018)，Santos，J Virol，91(12)(2017))。
例如，用6个质粒转染pDP2002-IGIP-H1或pDPHA-H1(Ca/04)野生型质粒，所述6个质粒对应于先前描述的OH/04减毒温度敏感([ts+HA标签＝att])骨架(Wan，et al.，J.Virol.，92(2018))或冷适应的列宁格勒骨架(caLen)(Isakova-Sivak，Virology，412，297-305(2011))。在这两种情况下，均使用表达Ca/04的神经氨酸酶(NA)的质粒。将9×105HEK293T和1.5×105MDCK细胞的共培养物接种在6孔板的每孔中。第二天，将1μg的每种质粒与18μL的TransIT-LT1转染试剂(Mirus Bio LLC，Madison，WI，USA)混合。将混合物孵育45分钟，然后用于覆盖293T/MDCK细胞过夜。第二天，用含有1％AB的新鲜Opti-MEM培养基(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)替换转染混合物，转染后24小时，向培养基补充1μg/mL的甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(WorthingtonBiochemicals，Lakewood，NJ，USA)。病毒库是在10天龄的无特异性病原体(SPF)卵中产生的。在感染后48小时(hpi)采集尿囊液，离心、等分并储存在-80℃。通过组织培养感染剂量50(TCID50)滴定病毒，并通过Reed和Muench方法建立病毒滴度(Reed&Muench，Am.J.Epidemiol.，27，493-497(1938))。如前所述，通过下一代测序和sanger测序确认了病毒序列(Ferreri，et al.，Ecol.Evol.，9，6534-6546(2019))。
病毒库制备、保持和分析
在10-11天龄的无特异性病原体(SPF)卵中产生病毒库。在接种后48小时(hpi)收集尿囊液体，离心、等分并储存在-80℃。甲型LAIV用组织培养感染剂量50(TCID50)滴定，而乙型LAIV则用卵感染剂量50滴定(EID50)。通过Reed和Muench方法计算病毒滴度(Reed，etal.，Am.J.Hyg.，27：493-497(1938))。
体外生长动力学
以每种病毒0.01的感染倍数(MOI)接种MDCK或MDCK STAT1 KO细胞的汇合单层。将平板在4℃下孵育15分钟，然后在35℃下孵育45分钟。随后，去除病毒接种物，用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次。然后将含有TPCK胰蛋白酶(Worthington Biochemicals，Lakewood，NJ，USA)和抗生素-抗真菌溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的Opti-MEMI(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)添加到细胞中(Opti-MEM-AB+TPCK)。在指定的时间点，收集接种细胞的组织培养上清液用于病毒滴度定量。使用MagMAX-96AI/ND病毒RNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)从组织培养上清液中分离病毒RNA。使用基于甲型流感基质基因的实时逆转录酶PCR(RT-qPCR)测定确定病毒滴度。使用qScriptTM XLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0004122240900000571
QuantaBio(ThermoFisher)在QuantSmdio 3(Applied Biosystem，Foster City，CA，USA)中进行RT-qPCR。如前所述，使用已知滴度的病毒库的10倍连续稀释液生成标准曲线，以将定量PCR(qPCR)交叉点(Cp)值与病毒滴度相关联(Santos，et al.，J.Virol.，93(2019))。病毒滴度表示为log10 TCID50/mL当量。
图表/统计分析
所有数据分析和图表均使用GraphPad Prism软件版本9(GraphPad SoftwareInc.，San Diego，CA，USA)进行。进行了单因素方差分析。P值低于0.05被认为是显著的。
结果
实验旨在创建表达IgA-诱导蛋白(IGIP)的减毒活流感病毒(LAIV)疫苗(本文也称为IGIP-LAIV)，并测试IGIP从IGIP-LAIV感染细胞分泌、在重组流感病毒中稳定保持，并在卵子中保持生长特性和体内免疫原性的能力。
先前开发了一种稳定有效的对于IAV的备选LAIV策略，其在PB2ORF中携带ts突变，在PB1 ORF中带有ts突变和C末端表位标签[ts+HA标签＝att]。att策略与MDV-A caA/AnnArbor(Chan，et al，Virology，380，304-311(2008))有一些共同的ts突变，其安全性、免疫原性和有效性已在Balb/c小鼠和猪中得到证实(Pena，et al.，J.Virol.，85，456-469(2011)，Chan，et al.，Virology，380，304-311(2008)，Gauger，et al.，Virology，471-473，93-104(2014)，Loving，et al.，J.Virol.，87，9895-9903(2013))。设计了新的病毒来提高att候选者的安全性，并测试IGIP是否能更好地刺激针对IAV的保护性抗体应答。为了进一步开展这些研究，IGIP也在caLen骨架中进行了测试，该骨架目前已批准用于人类。IGIP中的C端24aa对应于成熟的活性肽，而N端～30aa对应于信号肽区域(图1C)。猪IGIP成熟肽序列被克隆为片段4中HA ORF的N端标签。具体而言，在A/California/04/2009(H1N1)(Ca/04)病毒的H1 HA的信号肽区下游克隆IGIP，随后是G4S接头肽、人工弗林蛋白酶切割位点、Thosea assigna病毒2A蛋白酶序列、Gaussia荧光素酶的信号肽区域和成熟的HA ORF(图1B)。携带修饰的IGIP-H1 HA片段的反向遗传学(RG)质粒与编码Ca/04的N1 NA的RG质粒和编码OH/04att或caLen骨架的6个RG质粒组合。作为对照，制备了携带Ca04的野生型H1 HA的同基因病毒。
对于OH/04 att骨架中的IGIP-H1、IGIP-H3、N1-IGIP和N2-IGIP片段，获得了成功的病毒挽救。只有IGIP-H1片段在ca/LEN骨架中被挽救。对于乙型LAIV，只有IGIP-HA嵌合构建体被拯救。至少进行了2次独立尝试，以拯救ca/LEN骨架中的IGIP-H3、N1-IGIP和N2-IGIP以及B/Bris-att骨架中的IGIP-NA，但均未成功。所有其他无IGIP修饰的同基因对照均被拯救。见表2和表3。
表2：产生和尝试的IGIP病毒的类型/亚型。甲型病毒候选疫苗的滴度以TCID50/ml显示，而乙型病毒候选疫苗的滴度以EID50/ml显示。
病毒 骨架 滴度
att(H1N1) OH/04 att 1x108
att(H3N2) OH/04 att 1x108
IGIP-H1-att(H1N1) OH/04 att 5x106
IGIP-H3-att(H3N2) OH/04 att 2x107
N1-IGIP-att(H1N1) OH/04 att 2x106
N2-IGIP-att(H3N2) OH/04 att 2x106
ca/Len(H1N1) ca/Len 2x107
ca/Len(H3N2) ca/Len 2x107
IGIP-H1-ca/LEN(H1N1) ca/Len 1x104
IGIP-H3-ca/LEN(H3N2) ca/Len 未拯救
N1-IGIP-ca/LEN(H1N1) ca/Len 未拯救
N2-IGIP-ca/LEN（H3N2) ca/Len 未拯救
IBV-att B/Bris-att 2.3x108
IGIP-HA-IBV-att B/Bris-att 4.2x107
NA-IGIP-IBV-att B/Bris-att 未拯救
Figure BDA0004122240900000601
使用Illumina MiSeq通过下一代测序对SPF卵中第1代病毒(E1)进行测序。a用NGS对E1病毒进行测序，b用合适的引物通过全长HA、PB2和PB1 RT-PCR片段的Sanger测序对E5病毒进行测序(可根据要求提供列表)。c基于SignalP v.5.0预测工具，L9P突变将“…ANA-GN…”切割位点的预测信号肽可切割性从＞0.9降低至0.8765(Armenteros，et al.，Nat.Biotechnol.，37，420-423(2019))。d N/A，不适用。
通过片段特异性PCR(甲型LAIV)或多片段PCR(乙型LAIV)的分析揭示了片段大小的差异，这取决于是否存在IGIP修饰。
病毒库的Sanger和NGS(MiSeq Illumina，(Ferreri，et al.，Ecol Evol，9(11)：p.6534-6546(2019)))测序显示，HA或NA片段的任一个中存在预期的IGIP片段。
病毒滴度结果显示，与非IGIP同基因对照相比，OH/04 att骨架中HA的IGIP修饰导致1-1.5log10的下降；但与非IGIP ca/LEN对照获得的滴度相似。与同基因对照相比，OH/04att骨架中的NA-IGIP修饰降低了病毒滴度约2log10。
尽管IGIP-HA(H1N1)病毒在两种减毒背景下都得到了拯救(表3)，但与不含IGIP的等基因H1caLen相比，IGIP-H1caLen病毒在MDCK细胞和卵两者中生长不良，因此，其未纳入后续分析。相比之下，IGIP-H1att生长到如等基因H1att病毒的滴度(表3)，并且在35℃下，在MDCK细胞和MDCK STAT1 KO细胞中都显示出相似的生长动力学(图1D)。在允许的温度(35℃)下，携带IGIP的具有修饰的H3 HA基因片段的IGIP-HA-LAIV获得与未修饰LAIV相似的病毒滴度。IGIP-HA片段的掺入显示在37℃下生长延迟，在39℃和41℃的非允许温度下生长限制增强。见图1E-1H。重要的是，IGIP-H1att病毒的连续传代表明，修饰的HA片段在SPF卵和MDCK细胞中保持了至少五代(表3)。
具有延伸的3′UTR的NA-IGIP嵌合构建体可以改善片段6包装成病毒，这可以提高病毒产量。
在备选的构建体中，H3 IGIP-HA嵌合体中的信号肽被修饰为在切割位点包含两个另外的氨基酸，因为生物信息学分析表明，在IGIP序列开始之前，在信号肽序列的C端掺入两个另外的氨基酸将导致改善的切割。实验表明，这种病毒可以拯救并生长。
如上所述，IGIP-H1能够在ca/LEN骨架中进行拯救；然而，该病毒表现出较差的产率(104TCID50/ml)。IGIP-H1 ca/LEN病毒的不良生长和其他3种嵌合构建体的拯救的缺乏可能是由于ca/LEN似乎不能耐受另外的修饰的过度减毒。与同基因B/Bris-att对照相比，B/Bris-att骨架中的IGIP-HA修饰导致滴度小幅下降(＜1log10)。
实施例2：IGIP-LAIV在体内抗流感安全有效
材料和方法
安全性和有效性
一项安全性/有效性研究利用了以下候选疫苗IGIP-H1 att(H1N1)和N1-IGIP att(H1)，并将它们与非IGIP-att(H1N1)病毒和非IGIP-ca/LEN(H1N1)病毒进行了比较。其他对照组包括未接种/攻击和未接种/未攻击(仅显示最相关的组)。使用雄性和雌性DBA/2J小鼠(5-6周龄，n＝16/组，1/2雌性)。
对于初免和加强，小鼠鼻内接受1x105TCID50/小鼠(50μl剂量)的相应疫苗，间隔21天。在初免后和加强后两周内监测与流感感染一致的疾病临床症状。参见图2A和2B。
对于乙型流感研究，按照上述初免-加强设计，对DBA/2J小鼠(n＝12/组，1/2雌性)鼻内接种106EID50/小鼠(50μl剂量)的IGIP-HA IBV att病毒或非-IGIP IBV att对照病毒。
在加强后三周，对来自每组的小鼠子集进行抽血以评估血清转化，其余小鼠用107EID50/小鼠(约10MLD50)的B/Brisbane/60/2008PB2 F406Y病毒(Santos，J Virol，91(12)(2017)或1×106TCID50/小鼠(大约10000小鼠致死剂量50)的A/California/04/2009(H1N1)(Ca/04)小鼠适应株进行鼻内攻击，如前所述(Ye，et al.，PLoS Pathog.，6，e1001145(2010))。每天监测临床症状、体重变化和死亡率。对减轻初始体重≥25％的小鼠(3分制疾病严重程度中评分为3分或更高)进行人道安乐死。为了在安乐死前获得血清样本，如前所述，从下颌下静脉对小鼠进行放血(Golde，et al.，LabAnim.，34，39-43(2005))。攻击两周后，对所有幸存者进行放血、安乐死，并采集组织样本。
病毒滴定
使用Tissue Lyzer II(Qiagen，Hilden，Germany)制备5dpc时从小鼠收集的鼻甲和肺匀浆。简言之，将1mL PBS-AB与3mm碳化钨珠(Qiagen)一起添加到每个组织中。样品均化15分钟，然后在15,000g离心10分钟。收集上清液，等分并在-80℃下储存，直到进一步分析。通过TCID50滴定样品，并通过Reed和Muench方法建立病毒滴度(Reed&Muench，Am.J.Epidemiol.，27，493-497(1938))。
组织病理学检查
5dpc时，从每组代表性数量的小鼠(n＝4)中采集肺，进行组织病理学检查。将组织置于10％中性缓冲福尔马林(NBF)中，固定至少72小时，石蜡包埋并用苏木精和伊红染色(HE)进行常规组织病理学处理。由对研究不知情的病理学家基于病变严重程度和炎症程度对损伤进行主观评分：无(0)，轻度；≤10％(1)，轻度至中度；11-25％(2)，中度；26-40％(3)，中度至重度；41-60％(4)和≥60％(5)严重。评分考虑的特征如下：支气管炎/细支气管炎、肺泡炎、胸膜炎和血管炎、炎性浸润类型、坏死的存在与程度、出血、水肿(间质和/或肺泡)、纤维蛋白/透明膜、2型肺细胞肥大和增生以及胸膜间皮增生。对于针对IAV的免疫组化(IHC)，使用多克隆抗体抗IAV H1N1(Meridian Life Science；稀释度1/1500)。染色用于估计病毒抗原的强度。染色强度和分布由对研究不知情的病理学家进行主观评分，评分范围从无(0)到大/最高阳性(5)。
结果
实验旨在证明IGIP-LAIV疫苗在体内对流感是安全有效的，并显示与对照相比增强的IgA水平的刺激。
为了评估IGIP候选疫苗，如前所述，在DBA/2J小鼠中针对高剂量流感攻击测试了其安全性、免疫原性和保护功效(Wan，et al.，J Virol，92(21)(2018))。选择DBA/2J株是因为与Balb/c小鼠株相比，其对流感的敏感性更高(Pica，et al.，J.Virol.，85，12825-12829(2011)，Srivastava，et al.，PLoS One，4(3)：p.e4857(2009))，以更彻底地评估IGIP-和非IGIP-LAIV候选疫苗的安全性。使用了间隔21天的初免-加强疫苗接种策略。
DBA/2J小鼠在接种非IGIP att(H1N1)病毒后体重显著减轻，并死于流感感染(8/8只雌性，7/8只雄性)。该观察结果与之前在雌性Balb/c小鼠中进行的类似研究形成了对比(Pena，et al.，J Virol，85(1)：456-69(2011)中的图2)，在该研究中，这种病毒被完全减毒，在接种的动物中没有引起疾病症状，也没有体重减轻。
尽管未预料到，但接种了非IGIP att(H1N1)病毒的DBA/2J小鼠的结果与其对流感病毒易感性更高的看法一致(Pica，et al.，J Virol，85(23)：12825-9(2011))。
在HA中掺入IGIP修饰导致了显著的减毒，而在NA中的这种修饰导致了初免后雌性和雄性小鼠中的部分减毒(尽管在雌性小鼠中仍然存在显著的发病率)。IGIP-H1 att(H1N1)的减毒水平与初免后的ca/LEN(H1N1)对照相似。加强免疫没有引起明显的疾病症状。总之，在HA(片段4)中IGIP修饰的掺入显著改善了OH/04 att的安全性，类似于雌性和雄性DBA/2J小鼠中的对照ca/列宁格勒(ca/Len)骨架毒株。在NA(片段6)中IGIP修饰的掺入，导致部分减毒，但在雌性DBA/2J小鼠产生了显著的体重减轻。参见图3A-3D。
还参见图3E-3F。H1att组的DBA/2J小鼠从4dpi开始体重下降，临床症状迅速恶化，死亡发生在8-10dpi之间(16只中有1只存活，图3E，3F)。相比之下，在接种IGIP-H1att或H1caLen组的小鼠中，未观察到任何临床症状、不可忽略的体重变化和死亡率(图3E，3F)。
为了测试IGIP-H1att疫苗的功效，使用了相隔3周的初免-加强策略的接种(图2B)。在加强后第21天(接种后42天)，对每组小鼠的子集进行放血以评估血清转化，而其余的小鼠用1x106TCID50/小鼠(约10,000小鼠致死剂量50；MDL50)的Ca/04(H1N1)小鼠适应毒株进行鼻内攻击(Ye，et al.，PLoSPathog，6(10)：e1001145(2010))。结果显示，与ca/Len对照病毒疫苗相比，接受IGIP-H1 att(H1N1)疫苗或N1-IGIP att(H1N1)疫苗中的任一种的小鼠中，实现了对临床症状的完全保护和100％存活。参见图4A-4F。
与这些观察结果一致，在5dpc时，从来自接种/攻击组两者的小鼠子集采集的肺和鼻甲(NT)样本中观察到了低于检测限的病毒脱落，但在模拟接种/攻击小组中没有观察到(图4G，4H)。与其他组相比，模拟接种/攻击组的小鼠肺部组织病理学检查显示出更严重的损伤(表4)。其特征在于，中度至重度随机坏死区域，其特征为不连续的肺泡间隔被明亮的嗜酸性纤维物质(纤维蛋白)取代，并伴有出血、肺泡水肿、核碎裂细胞碎片、活的和退化的嗜中性粒细胞和泡沫状巨噬细胞。支气管上皮偶尔受到衰减、脱落(deciliation)和单细胞坏死的影响。相比之下，接种疫苗/攻击组表现出类似的损伤模式，具有轻度或轻度-中度淋巴细胞、浆细胞数量和少量嗜中性粒细胞和巨噬细胞扩张细支气管周和血管周间质。脱落(deciliation)和单细胞脱落对支气管上皮的影响最小。仅在模拟接种/攻击组的肺部中检测到针对IAV抗原的免疫组织化学染色(表4)。这存在于支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、肺细胞的细胞核和细胞质内以及坏死的细胞碎片内。在任何接种组和阴性对照中均未观察到IAV抗原的存在。这些观察表明，IGIP-H1att在保护小鼠免受同源IAV侵略性攻击方面至少与H1caLen病毒一样有效。
表4.在5dpc时，肺中的组织病理学检查(HE)和免疫组织化学针对IAV的评分。
Figure BDA0004122240900000651
虚线(-)隔开了每只个体小鼠的评分(n＝4/组，1/2雌性)。
总之，无论接种何种疫苗，接种疫苗的小鼠都没有出现疾病迹象，完全免受高剂量病毒攻击。
在一项单独的研究中，在猪中评估了甲型IGIP-LAIV候选疫苗对高剂量流感异源攻击的安全性和有效性，并研究在例如二价流感疫苗背景下IGIP策略是否有益。使用了间隔14天的初免-加强接种策略，IGIP疫苗同时含有IGIP-H1-att和IGIP-H3-att。在HA中IGIP修饰的掺入不会改变猪IAV att骨架的减毒特性，该疫苗具有与非IGIP att对照疫苗相似的安全性。
加强接种后三周(接种后35天)，用3x106TCID50/猪的地方性流行的H1N1或地方性流行的H3N2(两者在抗原方面与疫苗抗原不同)对猪进行鼻内和气管内攻击。结果显示对肺部病变的有效保护，几乎完全防止病毒复制和脱落，只有少数接种疫苗的动物在肺部和鼻腔样本中显示出可检测到的病毒滴度。相比之下，未接种疫苗的攻击对照组(非Vacc/H1N1和非Vacc/H3N2)的所有动物都在肺部和鼻腔样本中显示出高滴度，并且受损害的肺部比例明显较高。参见图5A-5D。
总体而言，这些结果表明，与小鼠中的甲型IGIP-LAIV候选疫苗相似，甲型IGIP-LAIV候选疫苗是安全的，能够保护猪免受异源攻击，并且仍然是可行的候选疫苗。
这些研究还扩展到了乙型流感病毒，以研究IGIP策略在例如四价流感疫苗的背景下是否有益。如先前在雌性DBA/2J小鼠中观察到的，IBV att疫苗也在雄性DBA/2J小鼠中减毒。例如B/Bris毒株的HA中的IGIP修饰，不会改变IBV att骨架的减毒特性。图6A-6D。
增强后三周，对每组小鼠子集进行放血以评估血清转化，其余小鼠用107EID50/小鼠(约10MLD50)的B/Brisbane/60/2008 PB2 F406Y病毒(Santos，J Virol，91(12)(2017))进行鼻内攻击。这项研究表明，IGIP-HA IBV att候选疫苗对乙型流感病毒攻击是安全有效的。相比之下，在未接种疫苗/攻击对照组中，在攻击后第7天和第8天之间，分别有4/4名雄性和3/4名雌性死亡。图7A-7D。总之，结果显示，接受IGIP-HA-att IBV疫苗的小鼠完全免于临床症状，100％存活，所述疫苗性能与无IGIP的对照att IBV疫苗相当。
通过血凝抑制滴度测定的初始血清转化表明IBV att接种的小鼠相比于IGIP-HA-IBV att接种小鼠具有略高的抗体滴度。一般来说，这些结果表明，与甲型IGIP-LAIV候选疫苗相似，乙型IGIP-LAIV候选疫苗是安全的，并提供针对致命攻击的保护，仍然是可行的候选疫苗。
总之，上述实验说明了产生编码表达IGIP的嵌合HA和NA基因的重组片段4和片段6的策略，以及成功地产生在HA或NA片段中的任一个中携带IGIP的H1N1或H3N2亚型的病毒。四个嵌合片段(IGIP-H1、N1-IGIP、IGIP-H3和N2-IGIP)病毒在OH/04 att骨架中被拯救。然而，只有H1-IGIP病毒可用于ca/LEN骨架中的拯救。与同基因非IGIP病毒相比，OH/04 att骨架中甲型IGIP重组体的病毒滴度降低了约1-2log10。OH/04 att骨架中的IGIP重组体达到与ca/LEN骨架中的非IGIP对照相似的滴度。与非IGIP-ca/LEN对照相比，ca/LEN骨架中的IGIP-H1嵌合体实现了显著较低的滴度。还设计了一种乙型流感IGIP-LAIV(IGIP-HA-IBV-att)，其产量与同基因非IGIP病毒对照的产量相似。病毒库的Sanger和NGS测序显示，存在最初为所有甲型和乙型病毒设计的IGIP修饰。
甲型IGIP-LAIV(H1N1)病毒在小鼠模型中是安全的，特别是IGIP-H1 att(H1N1)病毒。尽管N1-IGIP att(H1N1)病毒在雌性小鼠中显示出一些毒性，但与在DBA/2J小鼠中在施用剂量下没有减毒的att(H1N1)病毒相比，IGIP修饰导致了显著的减毒。att(H1N1)病毒缺乏减毒与之前在Balb/c和猪中进行的研究相反。甲型IGIP-LAIV(H1N1)病毒保护小鼠免受侵略性H1N1攻击。在接种疫苗的小鼠中观察到100％的存活率，而未接种疫苗/攻击小鼠在攻击后第4天和第6天之间死亡。
IGIP-HA-IBV-att病毒对侵略性IBV攻击是安全有效的，因为在接种疫苗的小鼠中观察到100％的存活率。相反，未接种疫苗/攻击的所有雄性和3/4的雌性小鼠分别在攻击后第5天和第8天之间死于感染。数据显示，接种IGIP-HA-IBV att病毒的小鼠在加强后的血清转化和中和抗体滴度，很可能是病毒复制活跃的结果。
实施例3：与H1caLen病毒相比，IGIP-H1att病毒在DBA/2J小鼠中产生了定性不同的体液应答
材料和方法
血凝抑制测定
在20dpb和攻击后14天(dpc)采集血清样品，以通过血凝抑制(HAI)测定筛选中和抗体的存在，如前所述(Wan，et al.，J.Virol.，92(2018))。简而言之，用受体破坏酶(DenkaSeiken，VWR，PA，USA)处理血清，在37℃下孵育过夜，然后在56℃下灭活30分钟。灭活后，用PBS将血清稀释1∶10，连续稀释2倍，并在96孔板中与4个血凝单位(HAU)的病毒混合。病毒/血清混合物在室温下孵育15分钟，并在与0.5％的火鸡红细胞(RBC)孵育45分钟后测定HI活性。低于≤10的HI滴度任意赋值为10。
病毒中和测定
PB1下游携带Nano荧光素酶(NLuc)基因的重组Ca/04(H1N1)病毒在96孔板中以每孔100TCID50使用，并与如上所述收集和处理的1/10系列稀释的血清样品孵育。在前一天将血清/病毒混合物在37℃下孵育1小时，然后在4℃下覆盖在接种在96孔板中的MDCK细胞上15分钟，然后在37℃覆盖45分钟。随后去除血清/病毒混合物，加入200μL Opti-MEM-AB+TPCK-胰蛋白酶，并将细胞在37℃、5％CO2下孵育48小时。通过经典HA测定和NLuc测定观察病毒中和(VN)滴度。对于NLuc荧光素酶测定，通过使用Victor X3多标记平板读取器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)，使用Nano-Glo荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI，USA)。
流感抗原微阵列
流感抗原微阵列如前所述进行(Nakajima，et al.，mSphere，3(2018))。血清、BALF和NW样品在蛋白质阵列封闭缓冲液(GVS，Sanford，ME，USA)中稀释1∶100，补充大肠杆菌裂解液(GenScript，Piscataway，NJ，USA)至最终浓度为10mg/mL，并在室温(RT)下预孵育30分钟。同时，阵列在封闭缓冲液中再水合30分钟(不含裂解液)。去除封闭缓冲液，并且使用密封室用预孵育的血清样品探测阵列，以防止垫之间样品的交叉污染。将阵列在4℃温和搅拌下孵育过夜。然后在室温下用含有0.05％吐温20 (T-TBS)的Tris缓冲盐水(TBS)洗涤三次，将生物素缀合的山羊抗鼠IgA和生物素缀合的抗小鼠IgG(Jackson Immuno ResearchLaboratories，Inc.，West Grove，PA，USA)在封闭缓冲液中以1∶400稀释，并在室温轻轻搅拌应用于单独的阵列1小时。用T-TBS洗涤阵列三次，然后与在封闭缓冲液中稀释1∶200的链霉亲和素缀合的Qdot655(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)室温孵育1小时。阵列用T-TBS洗涤三次，用水洗涤一次。阵列通过在500g离心5分钟进行空气干燥。使用Grace Bio-Labs的ArrayCAM成像系统(Bend，OR，USA)采集图像。使用带注释的grid(.gal)文件测量空斑和背景强度。通过同种型分组的抗原的平均荧光用于随后的分析。不同的抗原从Sino biological(Wayne，PA，USA)获得。
结果
通过血凝抑制(HAI)和病毒中和(VN)滴度，使用在加强后20天(20dpb)从四只小鼠/组的子集(1/2雌性)中获得的血清样品分析IGIP-H1att和H1caLen接种小鼠中产生的体液应答(图8A-8D)。为了建立VN滴度，使用了携带带有C-末端Nano荧光素酶(Nluc)的嵌合PB1的重组Ca04(H1N1)病毒。因此，VN滴度与48hpi时测得的Nluc活性水平成反比。此外，使用由153个HA蛋白组成的蛋白质微阵列分析IgG和IgA应答，所述153个HA蛋白代表第1组(H1、H2、H5、H6、H8、H9和H11)和第2组(H3、H4、H7、H10)亚型。该蛋白质阵列还包含与N1、N2和N9亚型相对应的12种NA蛋白质、3种M1蛋白质、4种NP蛋白质以及1种NS1和1种NS2蛋白质。此外，该阵列还包含源自对应于两个主要谱系(Victoria和Yamagata)的乙型流感病毒(IBV)的22种HA蛋白和两种NA蛋白，以及来自阴性对照的原型IBV的单个NP蛋白。大约一半的HA蛋白显示为全长，而其余的对应于HA1区。表5中提供了来源菌株、蛋白质来源以及表位标签的存在与不存在的详细信息。
HI(平均220vs.170HI滴度)和VN(平均702vs.660VN滴度)滴度显示，与H1caLen疫苗接种小鼠相比，在从IGIP-H1att疫苗接种的小鼠获得的样品中，中和应答改善的趋势(图8A)。这一趋势与蛋白质微阵列中抗H1 HA应答的类似趋势一致，其中IGIP-H1att样品平均高于H1caLen样品(图8B和8E)。对于两种疫苗，针对完整HA的平均IgG应答高于HA1部分，这可能是由于前者的更好的折叠和/或存在茎抗体(stalk antibodies)。然而，必须注意的是，与源自H1caLen的样品相比，来自IGIP-H1att的样品针对大流行前HA蛋白一致地较高(A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的HA在统计学上显著不同，p＝0.045)。
与抗H1应答相比，针对第1组和第2组HA的IgG交叉反应性应答显著较低(图8C、8D)。对H5 HA的IgG应答，特别是对阵列中的全蛋白的IgG应答显示出混合模式，一些与H1caLen组的样品反应更好，一些与IGIP-H1att组的样品反应更好(图8C)。对H9的应答接近背景，但对A/Hong Kong/35820/2009HA抗原的应答除外，其中来自IGIP-H1att和H1caLen组的样品反应类似(图8D)。对其他第1组HA的应答较低，但远高于背景，观察到有利于IGIP-H1att组样品的趋势(图8R)。
对第2组HA的交叉反应应答通常可以忽略不计，除了两个疫苗组的血清样品可以类似地识别的少数完整H3抗原，以及H1caLen组的样品更具反应性的对HA1和完整H7抗原的应答(图8S)。两个疫苗组对H1 HA表现出相似的血清IgA应答概括(9A、8F)。除了对源自A/duck/Hunan/795/2002(H5N1)的HA1的反应性外(其在两个疫苗组之间类似并显著高于背景)，观察到了针对其他第1组HA的背景血清IgA水平(图9B、9C和9T)。两个疫苗组对第2组的血清IgA应答均接近背景(图9U)。有趣的是，来自IGIP-H1att组而非H1caLen组的一些IgA血清样品与H7 HA抗原反应，这与针对第2组HA的IgG概况相反(图9U，与图9S相比)。
为了确定上述定性差异是否会转化为攻击后的不同回忆应答，分析了14dpc时采集的血清样品。HI和VN应答的分析表明，与H1caLen组相比，IGIP-H1att组样品的应答提高了约2倍(图10A)。攻击后IgG和IgA应答的分析显示与加强后的概况一致。平均而言，在IGIP-H1att血清样品中观察到的针对H1 HA的IgG应答高于在14dpc采集的H1caLen血清样品，其大多数2009年后抗原之间存在统计学显著性差异，但2009年前抗原没有显著性差异(图10B)。
此外，当组合所有H1抗原时，观察到疫苗之间的显著性差异(图8G)。第1组应答显示出混合概况，来自两个疫苗组的血清样品相比于H9 HA抗原更好地识别完整的H5(图10C，10D)。两个疫苗组在针对其他第1组HA抗原的回忆IgG应答方面都不是特别有效(H2、H6、H8和H11，图8V)。有趣的是，IGIP-H1att疫苗对第2组HA产生了更高的平均IgG应答，尤其是对H3和H4，而对H7的应答高于对H3的应答，两个疫苗组的表现相似(图10E和8H)。平均而言，与IGIP-H1att组相比，在14dpc时，H1caLen组的样品观察到了更高的血清IgA应答，其在2009年后H1抗原中具有统计学显著性差异(图11A-11C和补充图8W-8X)。这些分析表明，在接种不同LAIV的小鼠中对流感病毒的定性应答可能受到疫苗背景的影响。
实施例4：与H1caLen组相比，在14dpc时，IGIP-H1att组的平均抗-H1 HA粘膜IgG和IgA应答更高
使用在14dpc从两个疫苗组收集的鼻腔冲洗液(NW；图12A、12C)和BALF(图12B、12D)样品建立回忆粘膜应答分析。这些分析显示，当IGIP-H1att组的样品与H1caLen组进行比较时，BALF中IgG和IgA以及NW反应中的IgA统计学显著增加(图12A-12D，8I-8L)。对完整H1 HA抗原的IgG和IgA应答高于其HA1区。此外，回忆应答高度集中于针对2009H1抗原，而对大流行前H1 HA(图12A-12D)或其他第1组和第2组HA反应性很少或几乎反应性。
实施例5：针对NA和内部蛋白的体液和粘膜应答与IGIP-H1att和H1caLen组的抗HA应答模式一致
针对NA、NP、M1和NS1的血清和粘膜IgG和IgA概况遵循针对HA应答观察到的模式(图13A-13C和图14A-14D)。平均而言，抗NA应答在20dpb时明显高于背景，但仅在IGIP-H1att组的血清样品中，且主要针对N1亚型(图13A)，而H1caLen的血清样品具有背景应答。在第14dpc时，抗NA应答(特别是针对N1的应答)在IGIP-H1att血清样品中增加，但在H1caLen组中没有增加，并且具有统计学显著性(图8M)。
两个疫苗组都刺激了针对NP的血清抗体应答，主要是IGIP-H1att样品中的IgG，但H1caLen样品中是IgA(图13B)。有趣的是，只有IGIP-H1att疫苗导致对其他内部蛋白的体液IgG应答，特别是针对M1和NS1，而不是NS2(图13A-13C)。在IGIP-H1att组中，M1和NS1应答在攻击后略有增加。结合攻击前和攻击后血清应答的分析表明，针对内部蛋白的抗体在IGIP-H1att组中主要由抗NPIgG主导，在H1caLen组中由抗NP IgA主导(图8N，8O)。
值得注意的是，在攻击前和攻击后两个疫苗组中，抗NA IgA血清应答都可以忽略不计(图13C)。同样，两个疫苗组的抗NA粘膜IgG和IgA应答均处于背景水平(图14A、14B)。在两个疫苗组中检测到针对NP的粘膜IgG和IgA抗体，但没有针对其他内部蛋白(图14C、14D)。值得注意的是，H1caLen组获得的NW样品中的抗NP IgG应答平均高于IGIP-H1att组，但仅针对评估的四种NP抗原中的两种观察到统计学显著性差异。如抗NP血清反应所观察到的，在IGIP-H1att组中，它们以IgG为主(图8P)，但在H1caLen组中明显以IgA为主(图8Q)。
尽管疫苗接种被认为是对抗流感的第一道防线，但近年来当前IAV疫苗的有效性并不理想，总体低于50％(Chung，et al.，Clin.Infect.Dis.，71，e368-e376(2020)，Dawood，et al.，MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep.，69，177-182(2020))，Rolfes，et al.，Clin.Infect.Dis.，69，1845-1853(2019))。尽管LAIV具有提供增加的多维和普遍的细胞和体液应答的潜力，它们也与较差的功效相关。此外，由于担心关于人类流感病毒再分配的安全性，从市场上撤回了一种用于农业的抗猪流感LAIV。本文所公开的策略经过测试，旨在提高LAIV的安全性和有效性概况。具体而言，该策略旨在降低HA片段的适应性，即降低其再分配潜力，同时提高对流感的粘膜免疫力。为此，对一株原型2009H1N1大流行毒株(Ca04)的HA片段进行了修饰，以携带IGIP成熟肽，其两侧带有另外的修饰，并与成熟的HA ORF同框。
IGIP在哺乳动物中高度保守，预测分子量在约5.1至约5.9KDa之间。在牛、猪和雪貂中，IGIP成熟的24个氨基酸的肽序列是相同的。与猪IGIP相比，在人IGIP成熟肽中观察到一个单一氨基酸差异(32位的赖氨酸而不是天冬酰胺)。与猪同源物相比，预测的小鼠IGIP在一个氨基酸上不同(40位的苏氨酸代替天冬酰胺)。这些不同多态性的作用尚不清楚。
在上述实验中，测试了猪IGIP成熟序列在LAIV骨架背景下对免疫应答的调节。B细胞中的IgA类别转换(switch)通过T细胞依赖性和不依赖T细胞的途径发生，并且抗体靶向致病微生物和共生微生物(Estes，Vet.Immunol.Immunopathol.，138，312-317(2010))。显示IGIP上调IgA表达(Austin，et al.，J.Immunol.，171，1336-1342(2003)，Estes，Vet.Immunol.Immunopathol.，138，312-317(2010))。肠道中的DC是IGIP的主要来源(Estes，Vet.Immunol.Immunopathol.，138，312-317(2010))。DC在B细胞类别转换过程中的意义已被充分确立(Estes，Vet.Immunol.Immunopathol.，138，312-317(2010))。用CD40L-和血管活性肠肽(VIP)刺激人单核细胞来源的DC导致IGIP mRNA合成的显著上调(约为背景的35倍)。与转化生长因子β(TGF-β)不同(一种良好表征的B细胞类别转换效应器)，IGIP不以潜在形式保持，并且不需要额外的活化处理(Estes，Vet.Immunol.Immunopathol.，138，312-317(2010))。IGIP需要CD40配体(CD40L)的存在，而不是B细胞受体(BCR)的交联，以特异性地刺激牛B细胞上的IgA类别转换(Austin，et al.，J.Immunol.，171，1336-1342(2003))。相比之下，TGF-β需要CD40L和BCR两者来对牛B细胞发挥其类别转换活性(Austin，et al.，J.Immunol.，171，1336-1342(2003))。人类幼稚IgD+B细胞可被诱导为IgA类别转换，并可在与CD40L、IL-2、IL-10、跨膜激活剂和钙调节剂以及亲环蛋白配体相互作用物(TACI)-Fc以及IGIP或TGF-β一起孵育后被刺激产生IgA(Endsley，et al.，J.Immunol.，182，1854-1859(2009))。据信，没有证据表明IGIP的过度表达与炎症或自身免疫性疾病相关；然而，APRIL、BAFF或TGF-β的过度表达与自身免疫性疾病和癌症相关(Mackay，et al.，Annu.Rev.Immunol.，21，231-264(2003)，Mackay&Ambrose，Cytokine Growth FactorRev.，14，311-324(2003))。
在IGIP肽和HA ORF(G4S接头、弗林蛋白酶切割位点和Tav 2A蛋白酶)之间引入了额外的修饰，以帮助从成熟HA释放IGIP并到达细胞外隔室。该策略产生了携带12个氨基酸的C末端尾部(G4S(K/R)7)的嵌合IGIP肽。
重组病毒IGIP-H1att在MDCK细胞中有效生长，比不含IGIP的同基因H1att病毒低约1log10。此外，IGIP-H1att病毒在卵中稳定至少五代。相对于E1储备病毒，在E5代IGIP-H1att病毒的HA片段中仅鉴定出两个突变：第一个突变L9P(t58cnon-syn)落在IGIP基因上游H1HA的信号肽内。L9P突变被认为(Armenteros，et al.，Nat.Biotechnol.，37，420-423(2019))将信号肽可切割性从野生型H1 HA序列中的＞0.9(L9)降低到突变序列中的0.8765(P9)。尽管如此，P9突变仍将允许大量的IGIP肽在没有N端信号肽序列的情况下存在。第二个突变t86cSyn对应于IGIP ORF中的沉默突变，因此对于其潜在活性而言，它似乎无关紧要。IGIP-HA片段严重损害了重组caLen疫苗病毒的生长，可能是因为与OH/04 att骨架相比，后者含有更多的减毒突变(Isakova-Sivak，Virology，412，297-305(2011))。
对IGIP-H1att、H1att和H1caLen病毒之间在体外病毒生长动力学以及DBA/2J小鼠中的安全性和功效评估方面进行了并排比较。先前的研究表明，与C57 BL/6和Balb/c小鼠株相比，DBA/2J小鼠对IAV的敏感性高10-1000倍(Mackay&Ambrose，Cytokine GrowthFactor Rev.，14，311-324(2003)，Solorzano&Perez，J.Virol.，84，4587-4596(2010))。必须注意的是，DBA/2J小鼠不是免疫缺陷的，并对甲型和乙型流感病毒以及其他病原体产生保护性体液应答(Wan，et al.，J.Virol.，92(2018)，Hollingsworth，et al.，Immunogenetics，59，713-724(2007)，Santos，et al.，J.Viroi.，91(2017))。尽管先前对Balb/c和猪的研究(Pena，et al.，J.Virol.，85，456-469(2011)，Solorzano&Perez，J.Virol.，84，4587-4596(2010)，Abente，et al.，J.Virol.，92(2018))显示了携带att(ts+HA标签)修饰的不同IAV的减毒，但这种策略不足以对DBA/2J小鼠中的H1att病毒进行减毒。更重要的是，IGIP-H1att病毒在DBA/2J小鼠中的减毒程度与对照H1caLen病毒相同。这一观察结果还表明，IGIP修饰导致HA片段的降低的适用性，因此不太可能再分配，尽管此类评估超出了本报告的范围。
IGIP-H1att病毒与H1caLen一样有效地保护小鼠免受同源原型2009H1N1毒株的侵略性攻击。两个疫苗组中，攻击性病毒脱落均低于检测极限，且无临床症状。通过不同方法(HI、VN和蛋白质微阵列)对体液应答的分析清楚地表明，与接种H1caLen病毒的小鼠相比，接种IGIP-H1att病毒的小鼠中的更高的IgG应答趋势，其不仅针对H1 HA，而且针对其他第1组HA。加强后的血清IgA应答较低，主要集中于H1 HA，疫苗组之间的水平相似。在之前的一项研究中，用野生型H7N9 IAV感染小鼠导致诱导针对第1组和第2组HA的抗体，其不存在可辨别的HAI滴度(Liu，et al.，J.Infect.Dis.，215，518-528(2017))。在这项研究中，还检测到针对第2组H7 HA的加强后血清IgG应答，特别是在H1caLen组的样品中。相比之下，使用来自IGIP-H1att组的样品，相同的H7 HA组显示增加的血清IgA反应性。
在14dpc，与H1caLen组的样品相比，来自IGIP-H1att的样品的回忆血清IgG抗体继续对H1 HA更强烈反应，其具有统计学显著性差异。与H1概况相比，对其他第1组HA的血清IgG应答显示出相对较弱信号的混合模式。值得注意的是，在IGIP-H1att组样品中，攻击后导致第2组HA应答加强，特别是针对H7组，但也针对H3和H4抗原。相比之下，在H1caLen组的样品中，攻击后血清IgA应答平均统计学上更高。在14dpc时在NW和BALF中检测到的粘膜抗体应答在IGIP-H1att组的样品中IgG和IgA的平均信号总体较高，并且针对BALF中的IgG和NW和BALB中的IgA在疫苗间的差异具有统计学意义。
针对其他病毒蛋白(尤其是N1和NP)的IgG和IgA应答模式与针对HA观察到的模式一致。仅在来自IGIP-H1att组的样品中检测到血清IgG抗N1 NA应答以及抗M1和抗NS1应答高于背景，而在来自H1caLen组的那些样品中未检测到。在这方面，需要注意的是，更普遍的流感疫苗的各种方法考虑了更保守的靶点，例如NA、M2、M1和NP上的表位(Krammer，et al.，mBio，9(2018)，Fiers，et al.，Vaccine，27，6280-6283(2009)，McMahon，et al.，Front.Immunol.，10，2005(2019))。此外，NP调节激活CD4+和CD8+淋巴细胞的细胞免疫应答，提供针对人畜共患的IAV毒株的交叉反应性(van de Sandt，et al.，J.Virol.，88，1684-1693(2014)，Lee，et al.，J.Clin.Investig.，118，3478-3490(2008))。
在LAIV的背景下，还表明，在缺乏中和抗体的情况下，不同的NP不同地调节免疫应答，从而提供针对异源攻击的保护(Isakova-Sivak，et al.，Vaccines，7，61(2019))。FLU-v(其在人类II期中显示出了有希望的结果)表明了解NP抗体的作用以及如何调节NP应答可以为产生更通用的疫苗铺平道路(Pleguezuelos，et al.，NPJ Vaccines，5，22(2020))。所公开的结果表明，在血清和粘膜样品中容易检测到抗NP应答。血清和BALF IgG在IGIP-H1att组和在H1caLen组的NW中主导对NP的应答。H1caLen组样品的平均粘膜抗NP IgA应答较高。人们普遍认为，IgA应答在中和HA等主要病毒靶点方面更好，而不是其他病毒蛋白如NP或其他内部蛋白(甚至可能是NA)。相比之下，由于感染细胞中表达的病毒蛋白，IgG应答在靶向ADCC、补体固定和抗体介导的吞噬作用的非主要靶点方面会更好。因此，与H1caLen组的样品相比，IGIP-H1att组样品中的IgA/IgG应答模式可能显示出优越的保护优势。总之，这些研究强烈表明，响应不同的LAIV骨架和随后的修饰可以诱导定性不同的免疫应答。尚不确定上述应答模式是否是由于IGIP发挥任何生物功能所致。然而，重要的是，IGIP修饰不仅提高了att骨架的安全性，而且在不牺牲针对HA的免疫力的情况下做到了这一点。尽管已接受IGIP在调节IgA应答中很重要，但这种活性被认为仅限于肠道边界。对于IGIP在呼吸道中的功能以及它是否能帮助刺激IgA和IgG应答两者知之甚少。数据的综合分析表明，与H1caLen疫苗相比，IGIP-H1att疫苗的I.N.施用刺激了更高的全身IgG应答以及更高的IgG和IgA粘膜回忆应答，不仅针对HA，还针对其他病毒抗原。因此，IGIP可作为呼吸道中的普遍佐剂，产生增强的IgG和IgA应答。
表5：流感抗原微阵列中所用抗原的来源和目录号
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所有抗原均来自Sino Biological(Wayne，PA)。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用的材料通过引用具体纳入。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在包含在以下权利要求中。
序列表
<110> 佐治亚大学研究基金会股份有限公司
美国农业部
丹尼尔·R·佩雷斯
达尼埃拉·拉焦
马库斯·E·克赫利
艾米·L·文森特
<120> 用于预防和治疗流感感染的组合物及其使用方法
<130> UGA 2019-094-02 PCT
<150> . 63/077,454
<151> 2020-09-11
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 1
Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu
1 5 10 15
Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 2
Lys Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu
1 5 10 15
Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 3
Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Thr Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu
1 5 10 15
Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
20
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 4
Gly Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg
1 5 10 15
Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
20
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 5
Gly Lys Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg
1 5 10 15
Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
20
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 6
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1 5 10 15
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20
<210> 7
<211> 47
<212> PRT
<213> 家牛（Bos taurus）
<400> 7
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1 5 10 15
Val Phe Ser His Leu Ser Ala Gly Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala
20 25 30
Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
35 40 45
<210> 8
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Val Gln Tyr Gln Ser
50
<210> 9
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 9
Met Lys Lys Arg Ser Val Ser Gly Cys Asn Ile Thr Ile Phe Ala Val
1 5 10 15
Met Phe Ser His Leu Ser Ala Gly Lys Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala
20 25 30
Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
35 40 45
<210> 10
<211> 53
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 10
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1 5 10 15
Ile Thr Ile Phe Ala Val Met Phe Ser His Leu Ser Ala Gly Asn Ser
20 25 30
Pro Cys Gly Asn Gln Ala Thr Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe
35 40 45
Val Gln Tyr Gln Ser
50
<210> 11
<211> 47
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 11
Met Lys Lys Arg Ser Val Leu Gly Cys Asn Ile Thr Ile Phe Ala Val
1 5 10 15
Met Phe Ser His Leu Ser Ala Gly Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala
20 25 30
Thr Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser
35 40 45
<210> 12
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 12
Met Cys Ser Tyr Tyr His Met Lys Lys Arg Ser Val Ser Gly Cys Asn
1 5 10 15
Ile Thr Ile Leu Ala Val Met Phe Ser His Leu Ser Ala Gly Asn Ser
20 25 30
Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe
35 40 45
Val Gln Tyr Gln Ser
50
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X =任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = 赖氨酸(K)或精氨酸(R)
<400> 13
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 14
Lys Arg Lys Arg Lys Lys Arg
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X =任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X =任何氨基酸
<400> 15
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> Thosea asigna病毒
<400> 16
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 猪捷申病毒-1（porcine teschovirus-1）
<400> 17
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 鼻炎病毒
<400> 18
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 19
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 20
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 21
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 26
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 27
Cys His Tyr Ser Glu Leu
1 5
<210> 28
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 28
Gly Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg
1 5 10 15
Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Lys
20 25 30
Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
35 40 45
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Lys Val Leu Phe
50 55 60
Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu Ala
65 70
<210> 29
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 29
Lys Arg Lys Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Glu Gly Arg Gly Ser Leu
1 5 10 15
Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Lys
20 25 30
Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu Ala Gly Asn Ser
35 40 45
Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg Leu Glu Phe
50 55 60
Val Gln Tyr Gln Ser
65
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X =任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X =任何氨基酸
<400> 30
Xaa Glu Xaa Asp
1
<210> 31
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 31
Gly Asn Ser Pro Cys Gly Asn Gln Ala Asn Val Leu Cys Ile Ser Arg
1 5 10 15
Leu Glu Phe Val Gln Tyr Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Lys
20 25 30
Arg Lys Lys Arg
35

Claims (76)

1.核酸，其包含编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的核酸序列和编码血凝素(H)或神经氨酸酶(N)的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接到一个或多个表达控制序列。
2.权利要求1所述的核酸，其进一步包含可操作地连接至所述编码IGIP多肽的序列的编码自体IGIP信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
3.权利要求2所述的核酸，其中所述IGIP多肽包含SEQ ID NO：1-12中任一项的IGIP的成熟形式或其功能片段或其变体，所述变体与SEQ ID NO：1至12中任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性，任选地其中所述IGIP多肽能够增加IgA表达。
4.权利要求3所述的核酸，其包含编码H的核酸序列，并且还包含可操作地连接到所述编码H的序列的编码自体H信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
5.权利要求4所述的核酸，其中所述H是来自甲型流感病毒的H的成熟形式，任选地，其中所述H是H1至H18中的任一种。
6.权利要求5所述的核酸，其中所述H是H1的成熟形式。
7.权利要求4所述的核酸，其中所述H是来自乙型流感病毒的H的成熟形式。
8.权利要求3所述的核酸，其包含编码N的核酸序列，并且还包含可操作地连接到所述编码N的序列的编码自体N信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
9.权利要求8所述的核酸，其中所述N是来自甲型流感病毒的N的成熟形式。
10.权利要求9所述的核酸，其中所述N是N1至N11中任一项的成熟形式。
11.权利要求8所述的核酸，其中所述N是来自乙型流感病毒的N的成熟形式。
12.权利要求3所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码蛋白酶切割位点的核酸序列隔开，任选地其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
13.权利要求12所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码自切割肽的核酸序列隔开，任选地，其中所述自切割肽是2A自切割肽，任选地其中所述2A自切割多肽选自EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)、ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ IDNO：17)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：18)和VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：19)。
14.权利要求13所述的核酸，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H或N的序列由编码肽接头的核酸序列隔开，任选地，其中所述肽接头包含一个或多个甘氨酸和一个或多个丝氨酸。
15.权利要求3所述的核酸，其中所述核酸是具有以下取向的流感基因组RNA片段：‘5编码IGIP多肽的核酸序列-编码H或N的核酸序列3’。
16.权利要求3所述的核酸，其中所述核酸是具有以下取向的流感基因组RNA片段：‘5编码H或N的核酸序列-编码IGIP多肽的核酸序列3’。
17.权利要求15所述的核酸，其进一步包含5’非翻译区(UTR)、3’非翻译区域(UTR)，或其组合。
18.权利要求17所述的核酸，其中所述5′UTR、3′UTR或其组合来自流感病毒。
19.权利要求18所述的核酸，其中所述核酸编码H，并在核酸的5’和3’端分别包含流感病毒片段4的5’UTR和3’UTR。
20.权利要求18所述的核酸，其中所述核酸编码N，并且在核酸的5’和3’端分别包含流感病毒片段6的5’UTR和3’UTR。
21.核酸，其包含权利要求1-20中任一项所述的核酸的反向互补序列。
22.权利要求21所述的核酸，其中所述核酸是DNA或RNA。
23.权利要求21所述的核酸，其中所述核酸是单链的或双链的。
24.权利要求21所述的核酸，其中所述核酸是环形的或线性的。
25.载体，其包含权利要求1-14中任一项所述的核酸。
26.病毒基因组片段，其包含权利要求1-20中任一项所述的核酸或其反向互补序列。
27.病毒，其包含权利要求26所述的病毒基因组片段。
28.权利要求27所述的病毒，其中剩余的病毒基因组片段来自流感病毒。
29.权利要求28所述的病毒，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
30.权利要求29所述的病毒，其包含如下基因组结构：
编码PB2的片段1；
编码PB1和任选的PB1-F2的片段2；
编码PA和任选的PA-X的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N的片段6；
编码M1和M2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8。
31.权利要求28所述的病毒，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
32.权利要求31所述的病毒，其包含如下基因组结构：
编码PB1的片段1；
编码PB2的片段2；
编码PA的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N和NB的片段6；
编码M1和BM2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8。
33.权利要求27所述的病毒，其中所述流感病毒是减毒的流感病毒。
34.权利要求33所述的病毒，其中所述减毒的病毒包含再分配基因组，温度敏感突变，NS1截短，弹性蛋白酶依赖性，重排的基因组，或其组合。
35.权利要求33所述的病毒，其中所述减毒的流感病毒是OH/04att、冷适应列宁格勒(ca/LEN)或B/Bris att。
36.药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的权利要求27所述的活病毒，用于施用至受试者。
37.权利要求36所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种另外的流感病毒。
38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的流感病毒是减毒的病毒。
39.权利要求37所述的药物组合物，其包含一种或多种H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9和/或H6N1甲型流感亚型。
40.权利要求37所述的药物组合物，其包含一种或多种乙型流感病毒。
41.权利要求36所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
42.权利要求36所述的药物组合物，其被配制用于皮内或肌内注射。
43.权利要求36所述的药物组合物，其被配制用于鼻内递送。
44.权利要求36所述的药物组合物，其包含有效量的流感病毒，所述有效量在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答，任选地，其中所述免疫应答针对H、N、PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1、NEP或其组合中的一种或多种。
45.权利要求44所述的药物组合物，其中所述免疫应答包括针对流感病毒的IgA、IgG或其组合的抗体的产生增加。
46.诱导或增加针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物，以诱导或增加受试者中针对病毒的免疫应答，所述药物组合物包含有效量的活病毒，所述活病毒包含含有权利要求1-20中任一项所述的核酸序列或其反向互补序列的病毒基因组片段。
47.权利要求46所述的方法，其中所述免疫应答提供针对流感病毒感染的预防或治疗效果。
48.权利要求47所述的方法，其中所述药物组合物通过注射或鼻内递送施用。
49.权利要求48所述的方法，其中所述受试者选自人类、鸟类、猪、马、雪貂、鲸鱼、海豹、狗、猫和啮齿动物。
50.权利要求46所述的方法，其包括间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天、周或月重复施用一次或多次。
51.权利要求46所述的方法，其中所述H是来自甲型流感病毒的H的成熟形式。
52.权利要求51所述的方法，其中所述H是H1至H18的成熟形式。
53.权利要求52所述的方法，其中所述H是H1的成熟形式。
54.权利要求46所述的方法，其中所述H是来自乙型流感病毒的H的成熟形式。
55.权利要求46所述的方法，其包含编码N的核酸序列，并且还包含可操作地连接至所述编码N的序列的编码自体N信号肽序列或异源信号肽序列的核酸序列。
56.权利要求55所述的方法，其中所述N是来自甲型流感病毒的N的成熟形式。
57.权利要求56所述的方法，其中所述N是N1至N11中任一项的成熟形式。
58.权利要求55所述的方法，其中所述N是来自乙型流感病毒的N的成熟形式。
59.权利要求53所述的方法，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H的序列由编码蛋白酶切割位点的核酸序列隔开，任选地其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
60.权利要求54所述的方法，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H的序列由编码自切割肽的核酸序列隔开，任选地，其中所述自切割肽是2A自切割肽，任选地其中所述2A自切割多肽选自EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)、ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：17)、QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：18)和VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：19)。
61.权利要求60所述的方法，其中所述编码IGIP多肽的序列和所述编码H的序列由编码肽接头的核酸序列隔开，任选地，其中所述肽接头包含一个或多个甘氨酸和一个或多个丝氨酸。
62.权利要求53所述的方法，其中剩余的病毒基因组片段来自流感病毒。
63.权利要求62所述的方法，其中所述流感病毒是重组甲型流感病毒。
64.权利要求63所述的方法，其包含如下基因组结构：
编码PB2的片段1；
编码PB1和任选的PB1-F2的片段2；
编码PA和任选的PA-X的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N的片段6；
编码M1和M2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8。
65.权利要求62所述的方法，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
66.权利要求65所述的方法，其包含如下基因组结构：
编码PB1的片段1；
编码PB2的片段2；
编码PA的片段3；
编码H的片段4；
编码NP的片段5；
编码N和NB的片段6；
编码M1和BM2的片段7；和
编码NS1和NEP的片段8。
67.权利要求62所述的方法，其中所述流感病毒是减毒的流感病毒。
68.权利要求67所述的方法，其中所述减毒的病毒包含再分配基因组、温度敏感突变，NS1截短，弹性蛋白酶依赖性，重排的基因组，或其组合。
69.权利要求67所述的方法，其中所述减毒的流感病毒是OH/04att、冷适应列宁格勒(ca/LEN)或B/Bris att。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述免疫应答针对H、N、PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1、NEP或其组合。
71.重组病毒，其包含编码IgA诱导蛋白(IGIP)多肽的基因组，当在病毒感染的细胞中表达时，所述IgA诱导蛋白多肽能够增加IgA和/或IgG的表达。
72.权利要求71所述的重组病毒，其中所述病毒是重组流感病毒、牛痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、副粘病毒5、新城疫病毒、麻疹病毒、黄热病病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒或轮状病毒。
73.药物组合物，其包含有效量的权利要求51或72所述的重组病毒，以在需要其的受试者中诱导针对病毒的免疫应答，优选地，其中针对病毒的免疫应答大于用不存在IGIP表达的病毒诱导的免疫应答。
74.权利要求73所述的药物组合物，其中所述重组病毒是活病毒。
75.在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向受试者施用权利要求73所述的药物组合物。
76.多肽，其包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7638284B2 (en) * 2000-10-31 2009-12-29 The Curators Of The University Of Missouri Immunoglobulin A inducing protein and uses therefor
CN101983069B (zh) * 2006-08-09 2014-07-16 米迪缪尼有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
EP2747778B1 (en) * 2011-08-26 2017-12-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as live attenuated vaccines
WO2014089124A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Cenexys, Inc. Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells
WO2016089916A1 (en) * 2014-12-02 2016-06-09 Roger Williams Hospital Methods and compositons for treating cancer
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

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