ES2614802T3 - Vacunas contra la gripe optimizadas - Google Patents

Abstract

El uso de polinucleótidos que codifican proteínas del virus de la gripe procedentes de una cepa H1N1 y una cepa H3N2 para la preparación de una composición inmunogénica o un componente de vacuna contra infecciones de la gripe A en seres humanos y cerdos, en donde los polinucleótidos codifican hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) y proteína matriz (M) y la nucleoproteína (NP) en donde los polinucleótidos codifican SEQ ID NO: 11 y 13 y SEQ ID NO: 6 y 8 o 9 y en donde las secuencias de ADN o ARN contienen codones que están optimizados para la expresión en células de mamífero.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

te al virus en la población humana y, por tanto, el virus se propagará en todas las partes del mundo.

Glicosilación:

Una glicosilación ligada a N es una adición eucariótica cotraduccional y postraduccional de sacáridos en el nitrógeno de la amida de las cadenas laterales de asparagina. Una etapa de modificación en la síntesis de glicoproteínas. Estas glicosilaciones son esenciales para el plegamiento correcto y la estabilidad de la glicoproteína. Glicosilaciones en, o cerca de, los sitios de unión a antígeno pueden interferir con el reconocimiento de la proteína por la célula hospedadora. De este modo, las glicosilaciones pueden ayudar a enmascarar la proteína del sistema inmune del hospedador.

Sitios de glicosilación:

Los sitios de glicosilación se definen en esta memoria como glicosilaciones expuestas en la parte superficial de la proteína. Para proteínas unidas a la membrana, tales como HA y NA, una parte de la proteína está expuesta en el exterior del virus y la glicosilación en esta parte de la proteína es importante para la virulencia del virus y/o para la exposición de sitios inmunogénicos/antigénicos. Para H1N1 de 1918 y H1N1v de 2009, los sitios de glicosilación son 4, mientras que H1N1 estacional tiene ahora 6 sitios de glicosilación, pero puede acumular más en el futuro. Del mismo modo, para H3N2 de 1968 los sitios de glicosilación son 6 mientras que H3N2 estacional tiene 8 sitios de glicosilación. Pocos sitios de glicosilación debe ser la base para un plegamiento correcto de la proteína y deben estar presentes y se encuentran siempre, incluso en cepas pandémicas no adaptadas. Estos sitios de glicosilación están conservados. A lo largo del tiempo, la proteína del virus acumula más sitios de glicosilación expuestos en la superficie para "enmascarar" la inmunidad y, por lo tanto, volverlo más adaptado y probablemente menos virulento.

ADN mutado:

La mutagénesis dirigida al sitio en las glicoproteínas de la superficie del virus de la gripe va a alterar el patrón de glicosilación. Se pueden mutar nucleótidos en sitios de secuones para alterar los codones en el tripéptido del sitio de glicosilación. De esta manera, se pueden eliminar los secuones seleccionados.

Alternativamente, la proteína en la que se debe eliminar la glicosilación, se puede producir en un hospedador no eucariota. También tal proteína de vacuna no glicosilada se puede suministrar a partir de un hospedador de este tipo no eucariota, tal como bacterias como las bacterias Lactococcus, mediante la administración de las bacterias transfectadas directamente en las superficies mucosas, por ejemplo, en la nariz o por vía oral al intestino, en donde el organismo producirá la proteína de la vacuna in situ.

Hemaglutinina:

El nombre hemaglutinina proviene de la capacidad de los virus para aglutinar glóbulos rojos. La glicoproteína HA de la envuelta es un trímero en forma de varilla con monómeros idénticos. La proteína HA se sintetiza en la célula infectada como una única cadena polipeptídica, HA0. Esta molécula inicial tiene que ser escindida por las proteasas de la célula hospedadora en las subunidades HA1 (47 kDa) y HA2 (29 kDa) ligadas con disulfuro, para que el virus medie en la fusión de membranas y la subsiguiente infección. La subunidad HA1 es el dominio globular de la molécula de HA, que comprende el sitio de unión al receptor, responsable de la fijación del virus a los receptores de ácido siálico de la célula hospedadora. Los cinco sitios antigénicos A, B, C, D y E en la cabeza globular dirigen la respuesta de los anticuerpos del hospedador. La HA es el antígeno vírico primario y el único antígeno que induce una respuesta neutralizante del virus en el hospedador. Las principales funciones de HA son la fusión del virión con la membrana celular del hospedador y la fusión del virión endocitado con la membrana endosómica, lo que permite una liberación del genoma en el citoplasma. HA es una proteína integral de membrana de prototipo 1 que se dirige a la membrana del RE a través de una secuencia peptídica señal, N-terminal y que se escinde con la peptidasa señal. La subunidad HA2 forma el tronco de la molécula. El extremo N-terminal de HA2 (péptido de fusión) es hidrófobo y está altamente conservado en las HAs de diferentes cepas de virus de la gripe, y es esencial en la actividad de fusión de HA. La HA se modifica después de la traducción mediante la adición de carbohidratos ligados a N en residuos de asparagina

(N) en cada monómero, y ácido palmítico a residuos de cisteína (C) en la región de la cola citoplasmática. HA se une al ácido 5-N-acetil neurámico (ácido siálico) en la superficie de la célula hospedadora y las posiciones son esenciales para la determinación del tropismo celular preferido del hospedador. Las cepas infecciosas humanas se unen preferentemente al ácido siálico con un enlace α-(2,6) a galactosa, mientras que los virus de la gripe aviar (AIV) se unen preferentemente a α-(2,3)

Neuraminidasa:

La neuraminidasa (NA) es una glicoproteína de la membrana de la envuelta de clase II con actividad enzimática. Es un tetrámero con monómeros idénticos que tienen una forma de tipo hongo. La región del tallo hidrófobo está anclada a la membrana y la cabeza globular contiene el sitio activo de la enzima y los tres sitios antigénicos A, B y C de la molécula. La función principal es catalizar la escisión de enlaces glicosídicos adyacentes al ácido siálico. La actividad es esencial para que los viriones de la progenie se liberen de forma eficaz desde la superficie de la célula infectada. Al igual que HA, NA se modifica de forma posterior a la traducción con glicosilaciones ligadas a N. La molécula de NA es una diana de fármacos antivirales como zanamivir y oseltamivir. La inhibición de NA impide la liberación

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

del virus desde la célula infectada y retrasa la propagación del virus. En la actualidad se han reconocido nueve subtipos de NA.

Proteínas matriz:

Las proteínas matriz consisten en dos proteínas, la proteína del canal iónico M2 y la proteína estructural M1. La proteína M1 es una proteína matriz que recubre el lado interior de la membrana derivada de la célula hospedadora infectada, proporcionando una estructura y rigidez a la membrana. La proteína M1 contiene un dominio de unión a lípidos hidrófobo y un dominio de unión a RNP. El ensamblaje del virus de ARN de cadena negativa requiere una localización de las proteínas M1 en la membrana plasmática. Las proteínas M1 se unen a las colas citoplasmáticas de HA, NA y M2, especialmente NA estimula la unión a la membrana a través de las proteínas M1. M1 junto con NS2 es necesaria para la exportación de RNPs genómicas desde el núcleo, M1 también inhibe la síntesis de ARN. La proteína M2 es una pequeña proteína de membrana integral homotetrámera, y canal de iones, traducida a partir de un ARNm cortado y empalmado en el marco de lectura +1. El canal de iones es activado por el pH bajo del endosoma, permitiendo que los protones entren en el interior del virus, lo que conduce a cambios conformacionales en M1, alterando las interacciones entre M1-RNP. El canal iónico M2 es una diana de fármacos antivirales como amantadina y rimantadina.

Nucleoproteína:

La nucleoproteína (NP) es muy básica y se une a la cadena principal de azúcar-fosfato de ARN vírico de una manera no específica de la secuencia, aproximadamente cada 25 nucleótidos. NP interacciona tanto con PB1 como con PB2 y con una variedad de otras proteínas víricas y celulares. La interacción con M1 controla la actividad transcripcional de las RNPs y su tráfico intracelular. NP es responsable principalmente de mantener la estructura de las RNPs y de la regulación de la transcripción y la replicación del genoma, la polimerasa no puede utilizar ARN vírico desnudo como molde. La NP asociada con ARN vírico es abundante en el líquido extracelular y el tejido pulmonar durante una infección grave con el virus de la gripe A.

El virus de la gripe de 1918:

La pandemia más grave de este siglo fue la "gripe española" con H1N1 de 1918. El virus mató entre 40 y 50 millones de personas en todo el mundo durante 1918 y 1919 (10). Basándose en especímenes conservados, se han caracterizado genéticamente todos los genes y todo el virus ha sido restaurado (27). Esto proporciona una oportunidad única para dilucidar los mecanismos de inmunopatogénesis de la cepa pandémica. El origen de la pandemia de 1918 es objeto de debate. Taubenberger et al. 2005 sugieren, basándose en un análisis filogenético de los genes de la polimerasa, que el virus era enteramente de origen aviar. Sin embargo, hay grandes desacuerdos sobre el verdadero origen del virus y muchos todavía creen que esta cepa pandémica también era un reagrupamiento entre un virus de mamífero y de ave (Taubenberger et al., 2005, Antonovics et al., 2006). Los genes de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de la cepa H1N1 de 1918 no poseen indicadores genéticos conocidos para la alta virulencia, que podrían haber explicado la grave enfermedad observada en los seres humanos (Reid et al., 1999 y 2000). Sin embargo, la proteína HA (y la NA) en una estructura principal de virus humanos recientes confería una patogenicidad mejorada en ratones (Kobasa et al., 2004, Tumpey et al., 2005b). Podría haber sido la combinación de genes más que la propia HA, lo que causara el fenotipo letal (Tumpey et al., 2005). La incertidumbre sobre el origen y los mecanismos de la virulencia elevada del virus H1N1 de 1918 ha planteado la cuestión de si es posible desarrollar una inmunidad protectora frente a ese virus. Se ha publicado recientemente que una vacuna de ADN que codifica la HA de la cepa H1N1 de 1918 mostraba protección frente a una exposición letal a la cepa recombinante del virus H1N1 de 1918 en ratones (Kong W et al., 2006). Los genes de NP y M de la pandemia de 1918 son los ancestros de los genes de NP y M de los virus H1N1, H3N2 y H2N2 que circulan en la actualidad. Estos genes también están muy conservados y se modifican menos que las glicoproteínas de la superficie a lo largo del tiempo.

El virus de la gripe A H1N1v de 2009:

Durante abril del 2009, se descubrió un nuevo virus de la gripe H1N1v en California y también se reconoció que había causado brotes anteriores en México el mismo año. El virus no estaba relacionado con virus de la gripe humana anteriores, tanto genética como antigénicamente. La nueva cepa H1N1v está relacionada más estrechamente con los virus porcinos con reagrupamiento triple. La OMS anunció en junio que el virus H1N1v era un virus pandémico y en noviembre de 2009, 206 países y territorios o comunidades de ultramar describieron casos confirmados de gripe pandémica H1N1v, incluyendo más de 6770 muertes. Las vacunas de la gripe con proteína están ahora disponibles contra la nueva cepa pandémica, sin embargo, estas vacunas necesitan ser evaluadas ya que el virus se modifica. Nuestro objetivo es generar una vacuna de ADN universal que proteja incluso frente a virus H1N1v con una deriva amplia.

Virus H3N2 estacionales:

La primera introducción de los virus H3N2 en humanos se produjo mediante la pandemia de 1968. Este virus era el resultado de un reagrupamiento entre los virus H3 aviar y los virus H2N2 de la pandemia de 1957. Desde entonces, H3N2, y más tarde, H1N1, han circulado conjuntamente entre la población humana causando brotes estacionales y epidemias. Los virus H3N2 se modifican lo suficiente a lo largo del tiempo para que cambie la composición de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

vacuna de proteína.

Las cepas pandémicas de 1957 (H2N2) y 1968 (H3N2) eran ambas el resultado de un reagrupamiento genético con virus aviares (11,17). El origen de la pandemia de 1918 es objeto de debate. Taubenberger et al., (26) sugirió basándose en un análisis filogenético de los genes de la polimerasa, que el virus era enteramente de origen aviar. Sin embargo, hay grandes desacuerdos sobre el verdadero origen del virus y muchos todavía creen que esta cepa pandémica también era un reagrupamiento entre un virus de mamífero y de ave (1,26). Los genes de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de la cepa H1N1 de 1918 no poseían indicadores genéticos conocidos de una virulencia elevada, lo que podría haber explicado la gravedad observada en los seres humanos (19,20). Sin embargo, la proteína HA (y NA) en una estructura principal de virus humanos recientes, confería una patogenicidad mejorada en ratones (12,29). Podría haber sido la combinación de genes más que la propia HA lo que causara el fenotipo letal (27). La incertidumbre sobre el origen y los mecanismos de la virulencia elevada del virus H1N1 de 1918 ha planteado la cuestión de si es posible desarrollar una inmunidad protectora frente a ese virus. Se ha publicado recientemente que una vacuna de ADN que codifica la HA de la cepa H1N1 de 1918, mostraba protección frente a una exposición letal a la cepa recombinante del virus H1N1 de 1918 en ratones (Kong W, Hood C, Yang Z, Wei C, Xu L, Garcia-Sastre A, Tumpey TM, Nabel GJ. Protective immunity to lethal challenge of the 1918 pandemic influenza virus by vaccination. PNAS 103(43):15987-91, 2006)

Vacunas de ADN o ARN:

De aquí en adelante, la expresión "vacunas de ADN" se refiere a vacunas de nucleótidos que significa tanto vacunas de ADN como vacunas de ARN. La vacuna de ADN se puede administrar como ARN o ADN, ya sea como plásmido de ADN "desnudo" con o sin un compuesto a base de lípidos o células apoptóticas para facilitar la captación celular, proporcionar un efecto de depósito y/o un efecto de adyuvante, incluyendo o no una molécula de proteína adyuvante y/o plásmidos de ADN que codifican tal o tales proteínas adyuvantes, para una inducción inmune mejorada y óptima. Los genes de vacunas de ADN se pueden inyectar con o sin un apoyo tal como electroporación, o administrar por chorro de aire o recubiertos sobre partículas como con una pistola de genes, o se pueden administrar en superficies mucosas, por ejemplo, por vía intranasal y/o por vía intratraqueal. Los genes de vacunas de ADN también se pueden incorporar en un vector vírico o bacteriano para administrar, tales como adenovirus, poxvirus, virus adenoasociado, alfavirus, citomegalovirus, y/o bacterias tales como especies de Lactococcus o Lactobacillus o Shigella o Salmonella.

Los dos tipos más comunes de administración de una vacuna de ADN son una inyección salina de ADN desnudo e inoculaciones de ADN con pistola de genes (ADN recubierto en perlas de oro macizo, administradas con presión de helio). Una inyección intramuscular de solución salina de ADN genera preferentemente una respuesta Th1 de IgG2a, mientras que la administración con pistola de genes tiende más a iniciar una respuesta Th2 de IgG1. Los plásmidos inyectados intramuscularmente tienen riesgo de ser degradados por desoxirribonucleasas extracelulares, sin embargo, las respuestas inducidas son frecuentemente más prolongadas que las inducidas por el método de pistola de genes. Una vacunación mediante administración de ADN con una pistola de genes, en la epidermis, ha mostrado ser el método más eficaz de inmunización, probablemente porque la piel contiene todos los tipos de células necesarias, incluyendo células especializadas presentadoras de antígeno (APC), para provocar una respuesta inmune tanto humoral como celular citotóxica (células de Langerhans y dendríticas). Una protección completa frente a una dosis letal de virus de la gripe se ha obtenido con tan poco como 1 µg de ADN en ratones. El vector de la vacuna de ADN convencional consiste en el gen de interés clonado en un plásmido bacteriano modificado genéticamente para tener una expresión óptima en células eucariotas. Las características esenciales incluyen; un origen de replicación que permite la producción en bacterias, un gen de resistencia a antibióticos bacterianos que permite la selección del plásmido en un cultivo bacteriano, un promotor constitutivo fuerte para una expresión óptima en células de mamífero (los promotores obtenidos a partir de citomegalovirus (CMV) o virus de simio proporcionan la expresión génica más elevada), una secuencia de poliadenilación para estabilizar los transcritos de ARNm, tal como poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BHG) o poliadenilación del virus de simio, y un sitio de clonación múltiple para la inserción de un gen de antígeno. Una secuencia de intrón A mejora notablemente la expresión génica. Muchos vectores de vacunas de ADN bacterianas contienen motivos de dinucleótidos no metilados de citidinfosfato-guanosina (CpG) que pueden provocar fuertes respuestas inmunitarias, innatas en el hospedador. En los últimos años ha habido varios enfoques para mejorar y personalizar la respuesta inmune frente a estructuras artificiales de vacuna de ADN (vacunas de ADN de segunda generación). Por ejemplo, vectores dicistrónicos o plásmidos que expresan múltiples genes se han utilizado para expresar dos genes simultáneamente. Se han modificado genéticamente promotores específicos que restringen la expresión génica a ciertos tejidos, y se han construido genes de fusión de citocina/antígeno para mejorar la respuesta inmune. Además, los genes pueden tener los codones optimizados para una expresión génica óptima en el hospedador y se pueden sustituir secuencias líderes sin tratamiento previo por líderes optimizados que incrementan la eficacia de la traducción.

La administración de una vacuna de ADN puede ser mediante inyección de una solución salina o una solución salina tamponada de ADN o ARN desnudo, o una inyección de plásmido de ADN o de fragmentos de ADN lineales que expresan genes, acoplados a partículas o administrados mediante un vector vírico tal como adenovirus, virus vaccinia de Ankara modificado (MVA), virus vaccinia, virus adenoasociado (VAA), alfavirus, etc. Las vacunas de ADN se podrían administrar ya sea mediante una pistola de genes como en los ejemplos anteriores, o como una inyección con o sin electroporación.

imagen7

imagen8

Aminoácido

imagen9

imagen10

Gen sintético de NA 1918 0607869, basado en el nº de acc.: AF250356: A/Brevig mission/1/1918

Nucleótido

imagen11

Aminoácido

imagen12

Gen sintético de NP 1918 0607866, basado en el nº de acc.: AY44935: A/Brevig mission/1/1918

Nucleótido

imagen13

imagen14

Aminoácido

imagen15

Gen sintético de M 1918 0607868, basado en el nº de acc.: AY130766: A/Brevig mission/1/1918

Nucleótido

imagen16

Aminoácido

Proteína M1

imagen17

Proteína M2

imagen18

Gen sintético de HA 2009 H1N1v, basado en el nº de acc.: ACP41105: A/California/04/09

imagen19

imagen20

Secuencia de aminoácidos

imagen21

imagen22

Gen sintético de NA 2009 H1N1v, basado en el nº de acc.: ACP41107: A/California/04/09

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

Secuencia de aminoácidos

imagen27

imagen28

Gen sintético estacional de HA H3N2, basado en el nº de acc.: EU103823: A/Wisconsin/67/05

imagen29

Aminoácido

imagen30

imagen31

imagen32

Gen sintético estacional de NA H3N2, basado en el nº de acc.: ISDN136490: A/Wisconsin/67/05

imagen33

imagen34

Aminoácido

imagen35

Todos los genes naturales aplicados en las vacunas de ADN actuales están disponibles al público como secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, pero se pueden traducir en genes óptimos de ADN para vacunas mediante sínte

5 sis, utilizando codones óptimos para la expresión en mamíferos eucariotas, usando vectores de expresión convencionales (características principales: promotor de CMV, intrón A, secuencia de Kozac, gen de la vacuna incluida su secuencia de secreción, codón de parada, poliadenilación). Un gen de resistencia a kanamicina irrelevante clínicamente se incluye para el crecimiento y la selección en E. coli transfectadas para la producción de ADN plasmídico.

Las secuencias de aminoácidos de HA y NA de 1918 están disponibles al público (GenBank A/South Carolina/1/18

10 AF117241, A/Brevig Mission/1/18 AF250356) y se pueden traducir en ADN utilizando codones óptimos convencionales para la expresión en mamíferos eucariotas, utilizando vectores de expresión convencionales (características

imagen36

imagen37

imagen38

Aminoácido

imagen39

NA H3N2 nº de acc.: AB295606: A/Aichi/2/1968(H3H2)

Nucleótido

imagen40

Aminoácido

NA H3N2 nº de acc.: AB295606: A/Aichi/2/1968(H3H2)

Nucleótido

imagen41

HA H3N2 nº de acc.: CY022013: A/Albany/20/1957(H2H2)

Nucleótido

imagen42

Aminoácido

imagen43

imagen44

NA H2N2 nº de acc.: CY022015: A/Albany/20/1957(H2H2)

Nucleótido

imagen45

Aminoácido

imagen46

Para investigar adicionalmente el principio de una vacuna de ADN pandémica, hemos diseñado una vacuna de ADN basada en los genes pandémicos de HA y NA del virus H3N2 de la gripe de Hong Kong de 1968. Una vez más, la vacuna de ADN pandémica inducía protección frente a una infección con el virus H3N2 contemporáneo. Se observó un aclaramiento más rápido del virus y niveles elevados de anticuerpo contra la cepa expuesta.

Nucleótidos y proteínas incluidas en la presente invención:

Nucleótidos y proteínas

SEQ ID NO

ADN sintético de HA de H1N1 de 1918

1

Proteína de HA de H1N1 de 1918

2

ADN sintético de NA de H1N1 de 1918

3

Proteína de NA de H1N1 de 1918

4

ADN sintético de NP de H1N1 de 1918

5

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

con vacunas convencionales, mostraron anticuerpos inducidos, específicos de la gripe (Figura 10). Los animales vacunados con ADN de H/N de 1918 tenían una valoración de anticuerpos de recordatorio comparable a la de los animales vacunados con vacunas convencionales, el séptimo día después de la infección (Figura 10). No se esperaba que los anticuerpos específicos de la gripe para el grupo vacunado con ADN de NP/M de 1918 se midieran en este ensayo ELISA previo a la exposición, debido a la utilización de una vacuna contra la gripe convencional como antígeno.

Inducción de anticuerpos neutralizantes después de la vacunación con ADN

El ensayo de inhibición de la hemaglutinación (ejemplo 4b) se correlaciona con un ensayo de neutralización de virus y mide de qué modo los sueros de animales vacunados inactivan la unión de los virus de la gripe a los glóbulos rojos. Solo los hurones vacunados con la vacuna de ADN de H/N de H1N1 de 1999 tenían una valoración de HI significativa frente al virus A/New Caledonia/20/99(H1N1), después de una vacunación con ADN el día de la exposición (Fig. 9). Ni H/N de 1918 ni NP/M de 1918 se esperaba que proporcionaran valoraciones antes de la infección, debido a la larga deriva y a la acumulación de mutaciones en el sitio de unión al receptor de HA entre los virus H1N1 de 1918 y 1999. Los anticuerpos contra NP o M no son neutralizantes. La vacuna de ADN de H/N de 1999 proporcionó una mejor respuesta recordatoria de los anticuerpos neutralizantes que la vacuna de proteína trivalente convencional (Figura 9). El día cinco después de la infección, 60% de los hurones vacunados con ADN de H/N de H1N1 de 1999 se habían seroconvertido (HI>40), en comparación con el 40% de los hurones en el grupo de la vacuna convencional. También un aumento >2,5 en HI MGT se llevó a cabo después de la vacunación, medido el día de la exposición (Figura 9).

Ejemplo 14: Resultados de la vacuna de ADN de H3N2 pandémico en hurones

Para demostrar el principio de reactividad cruzada amplia, obtenida mediante el uso particular de las proteínas de la superficie pandémicas como vacunas de ADN, se evaluó la protección frente a una exposición al virus contemporáneo H3N2 después de una vacunación con HA y NA con los codones optimizados de la gripe H3N2 pandémica de 1968 de Hong Kong, como vacuna de ADN en hurones. Los hurones fueron vacunados (Ejemplo 2) con pistola de genes (PMED) tres veces, con dos semanas de diferencia, con la vacuna de ADN de HA + NA basada en el virus de 1968 o de 2007/08 (A/Wisconsin/67/05(H3N2)). Los grupos de control se vacunaron dos veces, con tres semanas de diferencia, con la vacuna de proteína trivalente convencional. El grupo de control negativo no recibió ninguna vacunación antes de la exposición. Todos los hurones fueron expuestos dos semanas después de la última vacunación.

Las fosas nasales de los hurones se lavaron después de la exposición con 1 ml de PBS y los lavados se almacenaron inmediatamente a -80°C. La valoración del virus se midió mediante RT-PCR en tiempo real (Ejemplo 3) en el gen de la proteína matriz de la gripe A y se correlacionó con una curva patrón de TCID50/ml conocida del virus H3N2 2007/08 en células MDCK. Los grupos vacunados con ADN tenían una reducción de la valoración del virus durante la incubación vírica, que no se observó en los grupos de control. Solo los hurones vacunados de forma convencional y los hurones no vacunados tenían una valoración de virus presente el día 12 después de la infección (Figura 5).

Se recogió la sangre de los hurones en diferentes puntos de tiempo después de la exposición y se analizaron los sueros en busca de anticuerpos IgG específicos del virus de la gripe H3N2 de 2007/08 mediante ELISA (Ejemplo 4). Las vacunas de ADN inducían IgG específicas del virus de la gripe de 2007/08 en el suero, después de una vacunación al igual que la vacuna convencional (Figura 6). Los hurones vacunados con ADN de 1968 generaron anticuerpos con una reacción cruzada elevada frente a la exposición al virus contemporáneo A/Wisconsin/67/05(H3N2). La respuesta dirigida contra el virus expuesto no se pudo observar antes del día 7 en el grupo no sometido previamente a experimentación. El nivel de anticuerpos específicos de la gripe en el grupo vacunado con ADN de HA+NA de 2007/08 es comparable con el nivel observado en el grupo de la vacuna convencional.

Los sueros sanguíneos recogidos en diferentes puntos de tiempo después de la exposición, se midieron en busca de anticuerpos inhibidores de la aglutinación (HI) del virus H3N2 A/Aichi/2/68 y A/Wisconsin/67/05 mediante un ensayo de HI (Ejemplo 4b). Se midieron las valoraciones ya que la última dilución de sueros proporcionaba una inhibición del 100% de 4 unidades de hemaglutinación (HAU) de virus en 25 µ (Figura 7). A) Se observaron valoraciones elevadas de HI en sueros frente al virus de 1968 después de una vacunación con ADN de HA+NA de 1968. Los anticuerpos generados después de una vacuna de ADN de HA+NA de 2007/08 o convencional, no tenían una reacción cruzada con el virus de 1968. B) Se observaron valoraciones elevadas de HI con reacción cruzada frente al virus de 2007/08 en agrupaciones después de una vacunación con ADN de 1968. Los hurones vacunados con ADN de 2007/08 tenían más anticuerpos HI contra el virus de 2007/08 después de la vacunación, que los hurones inmunizados con la vacuna trivalente convencional de proteína de 2007/08.

La vacunación con HA de H3N2 de 1968 inducía protección frente a una cepa de virus H3N2 de 1968 y una sometida a deriva más actual (2007).

Ejemplo 15: Vacuna de ADN de virus pandémico H1N1v en cerdos

Los cerdos y hurones se vacunaron con la mezcla de vacuna de ADN que contenía plásmidos que codificaban HA y NA procedentes de H1N1v, con o sin plásmidos de ADN que codificaban M y NP procedentes de H1N1 de 1918, con

o sin plásmidos de ADN que codificaban HA y NA de una cepa de H3N2 estacional (A/Wisconsin/67/05), usando los

genes sintetizados con codones humanos preferidos para una expresión elevada en seres humanos, hurones y cerdos. Se evaluaron los niveles de valoración de inhibición de hemaglutinina (HI) y/o valoración de anticuerpos neutralizantes y/o anticuerpos IgG totales y/o protección frente a una exposición con virus heterólogo u homólogo, según se midió por aclaramiento vírico más rápido en las vías respiratorias después de una o dos inmunizaciones

5 con ADN (ejemplo 3, 4 y 4b).

Para determinar la inmunidad protectora cruzada en cerdos después de la vacunación con la vacuna de ADN del virus de la gripe, basada en los genes de HA y NA del nuevo virus pandémico H1N1v de 2009, con o sin los genes de NP y M del virus pandémico H1N1 de 1918, administrados con pistola de genes o por electroporación, vacunamos dos veces cuatro cerdos con 6 semanas de edad, con tres semanas de diferencia, y los expusimos 10 semanas

10 después de la última inmunización, a 1x107 EID50 de un virus H1N1 estacional porcino (A/cerdo/Dinamarca/19126/93). Se incluyeron cuatro cerdos como animales sin una experimentación previa, que no recibieron la vacuna.

Un cerdo vacunado con pistola de genes recibió perlas tanto de HA y NA de H1N1v como de NP y M de H1N1 de 1918. El otro animal en el grupo de pistola de genes recibió una dosis doble de perlas de HA y NA de H1N1v. Un

15 cerdo vacunado mediante electroporación recibió inyecciones de ADN tanto de HA y NA de H1N1v de 2009 como de NP y M de H1N1 de 1918, mientras que el otro cerdo en el grupo de electroporación recibió inyecciones dobles de ADN de HA y NA de H1N1v de 2009.

Los cerdos se vacunaron de la siguiente manera:

Tres grupos:

Gr1

Pistola de genes

Gr2

Electroporación

Gr3

sin vacuna previa

Detalles de la vacunación del grupo 1 y 2:

imagen52

Grupo 1 de pistola de genes

Cerdo 1

Perlas de HA+NA de H1N1v Cara dorsal de cada oreja: dos disparos Cara interna de cada muslo: dos disparos NP+M de 1918 Cara dorsal de cada oreja: dos disparos Cara interna de cada muslo: dos disparos

Cerdo 2

Perlas de HA+NA de H1N1v Cara dorsal de cada oreja: cuatro disparos Cara interna de cada muslo: cuatro disparos

imagen53

Grupo 2 de electroporación

Cerdo 3

HA de H1N1v Cara dorsal de cada oreja: una inyección de 50 µl, un pulso Cara interna de cada muslo: una inyección de 50 µl, un pulso NA de H1N1v Cara dorsal de cada oreja: una inyección de 50 µl, un pulso Cara interna de cada muslo: una inyección de 50 µl, un pulso NP de 1918 Cara dorsal de cada oreja: una inyección de 50 µl, un pulso Cara interna de cada muslo: una inyección de 50 µl, un pulso M de 1918 Cara dorsal de cada oreja: una inyección de 50 µl, un pulso Cara interna de cada muslo: una inyección de 50 µl, un pulso

imagen54

imagen55

imagen56

Claims (1)

1. imagen1