CN114980921A

CN114980921A - 新型初免-加强流感疫苗

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Publication number: CN114980921A
Application number: CN202080094281.5A
Authority: CN
Inventors: T·穆斯特尔
Original assignee: Vivaldi Biosciences Inc
Current assignee: Vivaldi Biosciences Inc
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-08-30
Also published as: US20220401549A1; WO2021127463A1; EP4076517A1; AU2020407644A1

Abstract

本发明总体上涉及流感疫苗接种领域，具体地涉及双组分疫苗，该疫苗包括具有天然血凝素(HA)并缺乏功能性NS基因(delNS1流感)的流感病毒株，该疫苗应用于对受试者进行疫苗接种，其中初免组合物配制用于在加强组合物之前进行初免施用，初免组合物包括选自第一组A型流感病毒、第二组A型流感病毒或由B型流感病毒组成的第3组中的一种、两种或三种delNS1流感病毒株；加强组合物配制用于加强施用，加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，加强组合物的流感病毒株与初免组合物中的组相同，但其HA头部在抗原性上不同。此外，还提供了包括所述双组分的试剂盒及其用于预防流感病毒感染的应用。

Description

新型初免-加强流感疫苗

技术领域

本发明总体上涉及流感疫苗接种领域，具体地涉及双组分疫苗，该疫苗包括具有天然血凝素(hemagglutinin，HA)并缺乏功能性NS基因(delNS1流感)的流感病毒株，该疫苗应用于对受试者进行疫苗接种，其中初免组合物配制用于在加强组合物之前进行初免施用，初免组合物包括选自第一组的A型流感病毒、第二组的A型流感病毒或第3组的B型流感病毒的一种、两种或三种delNS1流感病毒株；加强组合物配制用于加强施用，加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，加强组合物的流感病毒株与初免组合物中的组相同，但其HA头部不同。此外，还提供了包括所述双组分的试剂盒及其用于预防流感病毒感染的应用。

背景技术

A型流感病毒是威胁人类和动物的最常见病原体之一，有可能引起灾难性的大流行。A型流感病毒每年在全世界造成300,000-500,000人死亡，在其大流行的年份，这一数字则增加到100万(1957-1958年)，或如1918-1919年高达5000万。最近，高致病性禽流感病毒(H5N1)引起了人们的极大关注，担心其有可能引起大流行。1997年在中国香港的一次小规模爆发中发现了人类感染H5N1病毒并导致18人感染和6人死亡，直到目前为止病例已达到383人，死亡率为61％。2009年春天，一种新型A型流感(H1N1)病毒在北美出现并在世界范围内传播，引发了自1968年以来的第一次流感大流行。在最初的4个月内，美国有500多例死亡确认与2009年大流行的A型流感(H1N1)病毒感染相关(Shieh W.J.et al.,2010,TheAmerican Journal of Pathology,177,1,166-175)。

由于病毒的抗原多样性和变异性，流感疫苗几乎每年都必须适应与循环毒株相匹配。目前使用的流感疫苗主要通过诱导中和抗体来提供仅针对特异性毒株的保护，这些中和抗体针对病毒的表面糖蛋白、血凝素(HA)以及神经氨酸酶(neuraminidase，NA)。此外，流感大流行的发生往往伴随着人畜共患传染病的表面基因溢出进入感染人类的病毒中，使现有疫苗对新出现的病毒无效。

在过去十年中，通用流感疫苗的开发取得了重大突破，这是由于发现了稀有抗体，这种抗体对流感血凝素的免疫原性较弱但对保守的茎结构域(stem region)具有特异性。为了将宿主免疫反应从HA球状头部结构域重新定向至该保守的茎结构域，开发了合理的疫苗设计，例如无头HA和嵌合HA疫苗(WO2014/099932)。基于HA茎的方法已显示比此前存在的流感疫苗具有更广泛的保护作用。然而，针对不同HA组病毒的保护效力低、必需多次接种疫苗以达到足够保护效力，以及罕见的不良反应情况(例如HA茎抗体增强病毒感染活性)引起了重大关注。此外，最近的研究已经分离出突变的流感病毒，每种病毒都表现出对特定HA茎特异性抗体的抗性(Ekiert DC,et al.,Science(2011)333:843–50；Friesen RH et al.,Proc Natl Acad Sci U S A(2014)111:445–50；Chai N.et al.,PLoS Pathog(2016)12:e1005702)。

在欧洲获得许可的灭活流感疫苗的保护效果有限，特别是在老年人群体和从未经历过自然流感的儿童中。冷适应流感活疫苗在预防和遏制儿童疾病传播方面更有效，但现在反向遗传学等新技术可以用于进一步改进活疫苗的方法。

Jang YH等(Frontiers in Immunology,2018,9,116,1-17)描述了冷适应病毒应用于开发对A型流感提供广泛保护的通用疫苗。该概念基于适应在25℃生长(冷适应)的温度敏感减毒“主毒株”的产生。冷适应的活病毒疫苗和灭活病毒疫苗对免疫系统的刺激不同，但在这两种情况下都缺乏足够的免疫原性，尤其是在老年人中，这是流感疫苗接种的最重要缺点之一。

尽管冷适应活流感病毒疫苗被认为足够安全，但减毒的确切遗传和分子机制尚不完全清楚。据称，冷适应流感疫苗的安全性本质是基于分布在内部基因片段上的大量点突变。然而，只有少数定位在聚合酶基因中的定位突变是冷适应病毒株减毒的原因，这些突变使该病毒无法在正常体温下复制(Herlocher,M.L.,et al.,1996,Virus Res.42:11-25；Herlocher,M.L.,et al.,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.90:6032-6036)。事实上，活疫苗毒株的遗传稳定性经常受到质疑，因为从接种疫苗的宿主中重新分离出的病毒显示额外的点突变，这些点突变最终可能作为“抑制”突变而发挥作用，导致复制特性增强，并可能使回复突变的病毒丧失温度敏感表型(Herlocher,M.L.,et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:6032-6036,Treanor,J.,M.et al.,1994J Virol.68:7684-7688)。

Wang P等涉及冷适应delNS1流感病毒的产生及其对同源病毒的攻击具有保护作用，显示其对异亚型和抗原性远缘相关流感病毒具有交叉保护作用(Frontiers inImmunology,2018,Vol.9)。

Van Reeth K等报告用具有不同抗原性的佐剂猪流感病毒H3N2的灭活疫苗进行异源初免-加强疫苗接种。针对保守的血凝素茎或其他血凝素亚型的抗体未被诱导(NPJVaccines,2017,Vol.2(1))。

疫苗接种对于保护民众对抗流感感染是至关重要的公共卫生措施。此前的研究表明，作为初免-加强方案施用需要两剂A型(H5N1)佐剂疫苗，以引发足够水平的抗体反应以赋予保护作用(A型(H5N1)亚病毒粒子灭活流感疫苗的安全性和免疫原性；Treanor,J.J.,et al.,Safety and immunogenicity of an inactivated sub-virion influenza A(H5N1)vaccine.N.Engl.J.Med.354,1343–1351(2006).)。在美国，国家疫苗储备的发展是为大流行疾病做好准备的一项重要措施。此外，候选的疫苗病毒被开发以匹配新出现的毒株。然而，快速演化的A型(H5Nx)病毒需要不断适应的疫苗病毒。在大流行的情况下，大流行毒株和储备疫苗毒株之间抗原不匹配的可能性相当高。即使当候选病毒可用时，现有的疫苗生产能力也可能不足以迅速提供足够数量的匹配疫苗，以保护全体人群免受大流行性病毒的侵害。因此，非常需要改进的流感疫苗接种策略，这些策略可以诱导对新出现的大流行毒株产生更广泛的交叉反应性中和抗体反应。

与同源初免-加强相比，使用不同递送载体(carrier)和/或载体(vector)的异源初免-加强疫苗接种由于减弱的抗病毒载体抗体反应，代表了一种用于诱导T细胞免疫的具有前景的策略，该反应已知会通过疫苗抗体免疫复合物清除疫苗，干扰针对靶标抗原的免疫；以及异源初免-加强疫苗接种代表了不同疫苗技术刺激不同免疫反应并且协同工作的潜力。异源初免-加强方法已经关注了各种组成的疫苗，但最近主要集中在用于临床开发的DNA/病毒载体组合或病毒载体/病毒载体组合上。随着在刺激强大和持久的T细胞免疫方面具备前景，异源初免/加强疫苗策略在急性和慢性病毒感染、癌症、过敏以及自身免疫方面特别值得关注。

尽管使用不同递送载体的异源初免-加强疫苗接种是众所周知的，并且与同源初免-加强疫苗相比，它代表了一种可选的可提供广泛流感保护的策略，但对于用于生产通用流感疫苗的减毒活流感疫苗平台的需求仍未得到满足。

发明内容

本发明的目的是提供改进的通用流感疫苗。

本发明解决了该目的。

根据本发明，提供了双组分疫苗，其包括具有天然血凝素(HA)的复制缺陷型流感病毒株，该流感病毒株缺乏功能性NS基因(delNS1流感)，该疫苗应用于对受试者进行疫苗接种，其中：

i.初免组合物配制用于在加强组合物之前进行初免施用，该初免组合物包括一种、两种或三种选自以下的delNS1流感病毒株：

-第1组A型流感病毒，

-第2组A型流感病毒，或

-第3组，其具有来自Victoria(维多利亚)和Yamagata(山形)B型流感病毒谱系的HA；

ii.加强组合物配制用于加强施用，加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，该流感病毒株与初免组合物中的组相同，但其HA不同，具体地其HA茎结构域不同。

具体地，受试者处于被流感病毒感染的风险中，该双组分疫苗应用于针对流感病毒的疫苗接种。

具体地，疫苗接种是指对有感染流感病毒或患流感病毒疾病风险的受试者进行预防、预防性治疗或治疗；具体地，其中使用复制缺陷型流感病毒株对受试者进行免疫。

具体地，第1组流感病毒由H1N1和H5N1 A型流感病毒组成，和/或第2组流感病毒由H3N1和H7N1 A型流感病毒组成。

第3组的B型流感病毒具体包括Victoria和Yamagata的B型流感谱系。

根据具体实施例，选择用于初免和加强组合物的一组相应的流感病毒株包括在抗原性上相似或相同的天然HA茎结构域，但抗原性不同的HA头部。

大多数结合血凝素茎结构域的抗体是由预先存在的记忆B细胞产生的。由抗原性不同的流感毒株诱导的广泛保护性茎偏向反应与此前的免疫配合，足以根除季节性流行的毒株。

由于在干扰素感受态细胞或生物体中缺乏复制(复制缺陷表型)，NS1蛋白的缺失导致流感病毒显著减弱。缺乏NS1蛋白的病毒不能拮抗受感染细胞的细胞因子产生，从而引起自佐剂和免疫调节作用。用delNS1病毒免疫后的免疫反应标志是Th1型免疫反应的触发，该免疫反应与主要的IgG2A抗体亚型反应相关(Ferko B.et al.,J.Virol.,2004,78(23),13037-45)。由于T细胞反应增强，DelNS1流感病毒的主干在这方面非常有利。增强的T细胞反应可积极影响HA茎结构域的交叉反应性，从而导致细胞的记忆效应增加，以及优化本文描述的初免/加强疫苗的疫苗接种效果。此外，已经证明用基于delNS1病毒的NS1进行免疫也能够诱导T细胞易于快速加强，这是有效的初免加强方法的重要先决条件。因为免疫可以相当快地产生，并且两次给药之间的时间最短，所以快速的初免-加强方案可能有利于在人体中施用有效的疫苗。这些改善的T细胞反应是由于基于delNS1的病毒缺乏NS1所导致的干扰素释放。最重要的是，使用delNS1疫苗病毒，记忆细胞的回忆反应不仅更强，而且表现得更快(Mueller et al,J Virol.2010,84:1847-55)。因此，基于delNS1的初免加强方法具有有效激活免疫系统双臂的巨大优势，并且可以快速加强免疫。特别是更快的回忆反应可能对有效的T细胞介导保护至关重要，因为流感病毒复制速度很快。

具体地，该流感病毒是复制缺陷型流感病毒。

利用本文描述的本发明双组分疫苗及其在初免/加强施用方案中的应用，通过对流感HA抗原保守茎的细胞和抗体免疫，成功地提供了广泛的保护。异源初免-加强引导免疫反应远离可变的HA头部，并加强针对保守HA茎(stem)/茎(stalk)结构域的抗体，以提供针对所有其他流感病毒的保护。

在具体实施例中，加强组合物在初免组合物之后2至4周施用，更具体地，加强组合物在初免组合物之后约3周施用。

根据本文描述的具体实施例，初免组合物的delNS1流感病毒优选包括具有H5 HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H1 HA头部的天然HA；或者其中初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H1 HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H5 HA头部的天然HA。

根据本文描述的具体实施例，初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H3 HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H7 HA头部的天然HA；或者其中初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H7 HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H3 HA头部的天然HA。

根据本文描述的具体实施例，初免组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Victoria谱系HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Yamagata谱系HA头部的天然HA；或者其中初免组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Victoria谱系HA头部的天然HA，加强组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Yamagata谱系HA头部的天然HA。

根据具体实施例，初免组合物包括第1组A型流感、第2组A型流感和第3组B型流感的delNS1流感病毒，加强组合物包括对应于初免组合物病毒类型的delNS1流感病毒，其中加强组合物的delNS1流感病毒的HA头部与初免组合物的delNS1流感病毒不同。

本文还提供了如本文描述的用于预防流感相关疾病或感染的疫苗。

具体地，受试者是人类、禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物或猪。

本文进一步提供了用于初免-加强疫苗接种的试剂盒，其包括至少两个小瓶，其中第一小瓶包括初免组合物，初免组合物包括选自第1组A型流感病毒、第2组流感病毒和/或由Victoria和Yamagata B型流感病毒组成的第3组中的一种、两种或三种delNS1流感病毒株；第二小瓶包含加强组合物，加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，加强组合物的流感病毒株与初免组合物中的组相同，但其HA头部不同。具体地，第1组流感病毒由H1N1和H5N1 A型流感病毒组成，和/或第2组流感病毒由H3N1和H7N1 A型流感病毒组成。

附图说明

图1：雪貂的体温变化(delT℃)，雪貂用delNS-H1N1和/或delNS-H5N1进行鼻内初免-加强免疫，加强在初免三周后进行，随后用A型流感(H1N1)pdm09样病毒攻击。显示了delT(℃)平均体温±SEM(N＝6/组)。每只雪貂的基线体温是根据在第一次免疫前(D-3至D-1)、第二次免疫前(D20至D21)和攻击感染前(D38至D39)收集的BT(体温)测量值计算得到的。在D40用异源H1N1pdm病毒攻击所有免疫和对照(稀释剂)动物。显示了delT(℃)平均体温±SEM(N＝6/组)。实心菱形对应第1组(初免delNS1-H1N1，加强delNS1-H1N1)，空心方块对应第2组(初免delNS1-H1N1，加强delNS1-H5N1)，实心三角形对应第3组(初免delNS1-H5N1，加强delNS1-H5N1)，星型对应第4组(初免delNS1-H5N1，加强delNS1-H1N1)以及空心圆圈对应第5组(初免稀释剂，加强稀释剂)。

图2：攻击2天后的平均最大温度升高。

图3a)HA2(茎)特异性雪貂血清IgG。该血清来自如图1描述相同的实验，并在攻击前的第一次和第二次免疫后采集。对应于保守茎的Vietnam(越南)H5N1毒株的HA2用作包被抗原。D-3是原始血清，2×delH1是用delNS-H1N1 New Caledonia(新喀里多尼亚)毒株免疫雪貂两次的血清，delNSH1-delH5是用delNS-H1N1 New Caledonia初免并用delNS-H5N1Vietnam加强，2×delH5是用delNS-H5N1免疫两次，delH5/delH1是用delNS-H5N1 Vietnam初免并用delNS-H1N1加强，稀释剂组用缓冲液模拟处理两次。

b)HA1(head-H1N1pdm09)特异性雪貂血清IgG。对应于攻击病毒的大流行H1N1pdm09的HA1亚基用作包被抗原。免疫方案和分组与图3a中描述的相同。

具体实施方式

如本文所用，术语“一个(a)”或“一种(an)”，正如在专利文件中常用的，包括一个或多个，独立于“至少一个”或“一个或多个”的任何其他实例或用法。如本文所用，术语“或”用于表示非排他性的或，因此除非另有说明，“A或B”包括“A但没有B”、“B但没有A”和“A和B”。

如本文所用，术语“约”用于指大约、接近、几乎或接近等于或等于规定量的量，例如，规定量加/减约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。

本发明的组合物、制剂和方法可以包括、基本上由或由本发明的组分和成分以及本文描述的其他成分组成。如本文所用，“基本上由…组成”是指该组合物、制剂和方法可以包括额外的步骤、组分或成分，但前提是该额外的步骤、组分或成分不会实质性地改变要求保护的组合物、制剂和方法的基本和新颖的特征。

流感病毒粒子由包含单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋核衣壳)以及内层由基质蛋白(M1)构成的外层脂蛋白囊膜组成。A型和B型流感病毒的分段基因组由八个片段组成，C型流感病毒为七个片段，片段是线性、负极性、单链的RNA，RNA编码11种(某些A型流感病毒株为10种)多肽，这些多肽包括RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1以及PA)以及形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2或B型流感的BM2)；从包含囊膜的脂质中突出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)以及核输出蛋白(NEP，又名：NS2)。B型流感病毒还编码NB，一种可能具有离子通道活性的膜蛋白，以及大多数A型流感毒株还编码被认为具有促凋亡特性的第11种蛋白(PB1-F2)。基因组的转录和复制发生在细胞核中，通过在质膜上出芽发生组装。病毒可以在混合感染期间重新排列基因。流感病毒通过HA吸附到细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖上。在病毒粒子的内吞作用之后，HA分子在细胞内体中发生构象变化，促进了膜的融合，从而触发脱壳。核衣壳迁移到细胞核，病毒mRNA在细胞核发生转录。病毒mRNA通过一种独特的机制进行转录和加工，其中病毒核酸内切酶从细胞异源mRNA上切割加帽的5'-末端，然后将其用作病毒转录酶从病毒RNA模板转录的引物。转录本终止于距模板末端15至22个碱基的位点，其中oligo(U)序列作为添加poly(A)束的信号。在由此产生的A型流感病毒的八种病毒RNA分子中，其中六种包含单顺反子信息，其直接翻译成代表HA、NA、NP以及病毒聚合酶蛋白PB2、PB1、PA的蛋白质。其他两种转录本进行剪接，每种产生两个mRNA，两个mRNA在不同的阅读框中翻译产生M1、M2、NS1以及NS2。在大多数A型流感病毒中，片段2还编码第二种蛋白质(PB1-F2)，该蛋白质从重叠的阅读框表达。换言之，8种病毒RNA片段编码11种蛋白质：9种结构蛋白和2种非结构蛋白(NS1、PB1-F2)。

如本文描述的流感病毒还可用于制备重组病毒，包括6:1:1重配体、6:2重配体和7:1重配体。根据本发明的6:1:1重配体是具有6个内部基因片段、来自不同的第二病毒分离物的NA基因片段和来自第三分离物的HA基因片段的流感病毒；6:2重配体是具有6个内部基因片段，以及来自不同(第二)病毒分离物的NA基因片段和HA基因片段的流感病毒；以及7:1重配体是具有6个内部基因片段和来自疫苗病毒的NA基因片段，以及来自与疫苗病毒不同的病毒来源的HA基因片段的流感病毒，或者是具有6个内部基因片段和来自疫苗病毒的HA基因片段以及来自与疫苗病毒不同的病毒来源的NA基因片段的流感病毒。可选地，5:1:2重配体也包括在本文中。如本文所用，术语“双组分”是指包括具有天然血凝素(HA)但缺乏功能性NS基因(delNS1流感)的流感病毒株的疫苗，其包括初免组合物和加强组合物，初免组合物配制用于在加强组合物之前进行初免施用，加强组合物包括一种、两种或三种与初免组合物中的组相同但其HA头部不同的流感病毒株。

本文描述的双组分组合物可包括初免组合物和加强组合物，初免组合物包括一种流感病毒株，加强组合物包括一种与初免组合物流感病毒株的组相同，但是其HA(特别是HA茎结构域)不同的流感病毒株。包括一种流感病毒株的双组分组合物在本文中可称为单价疫苗组合物。

本文描述的双组分组合物可选地包括初免组合物和加强组合物，初免组合物包括两种不同的流感病毒株，加强组合物包括两种不同的流感病毒株，加强组合物流感病毒株与初免组合物流感病毒株的组相同，但是其HA(特别是HA茎结构域)不同。包括两种不同流感病毒株的双组分组合物可称为二价疫苗组合物。

本文描述的双组分组合物可选地包括初免组合物和加强组合物，初免组合物包括三种不同的流感病毒株，加强组合物包括三种不同的流感病毒株，加强组合物流感病毒株与初免组合物流感病毒株的组相同，但是其HA(特别是HA茎结构域)不同。包括三种不同流感病毒株的三组分组合物可称为三价疫苗组合物。

由于缺乏功能性NS1蛋白(delNS1)，该流感病毒株为复制缺陷型。

缺乏NS1活性为deltaNS1流感病毒减毒活疫苗(LAIV)实现了非常有利的特性。具体地当在鼻内递送时，它会感染上呼吸道细胞并表达病毒抗原，但它不会形成病毒后代，以及疫苗毒株也不会被疫苗接受者排出，这使得deltaNS1 LAIV疫苗非常安全；此外，由于deltaNS1病毒株无法抵消宿主的干扰素(IFN)反应，因此deltaNS1感染会诱导高水平的干扰素，从而实现天然佐剂效应，激活B和T细胞介导的免疫反应。

此外，deltaNS1病毒激发针对漂移变体的交叉中和血清抗体(Wacheck V.et al.,J.Infect.Dis.,2010,201(3),354-62)，以及针对不同A型流感病毒亚型的交叉中和黏膜IgA(Morokutti A.et al.,Vaccine,2014,32(17),1897-1900)。临床数据还表明，大流行的deltaNS1具有增强免疫力的潜力(Nicolodi et al.Vaccine.2019,37,3722–372)。

根据本发明，术语“复制缺陷”定义为与野生型流感病毒的复制率相比，在干扰素感受态宿主细胞中的复制率至少小于5％，优选小于1％，优选小于0.1％；该复制率通过本领域熟知的血凝试验、TCID50试验或噬斑试验确定。

NS1蛋白的功能完全减弱。NS1蛋白缺乏功能性RNA结合结构域和/或流感病毒NS1蛋白的羧基末端结构域可能会失去功能。

在实施例中，NS1蛋白包括至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的NS1氨基酸缺失。该结构域可以完全地或部分地缺失，以及可以替换或插入氨基酸，可以采用本领域描述的方法(Dauber et al,J Virol.2006,Dec；80(23):11667-77)检测剩余结构域的功能。

在可选的实施例中，流感病毒包括截短的NS1蛋白，其包含NS1蛋白N末端的至多122个氨基酸，优选至多121个氨基酸，优选至多120个氨基酸，优选至多119个氨基酸，优选至多118个氨基酸，优选至多117个氨基酸，优选至多116个氨基酸，优选至多115个氨基酸，优选至多114个氨基酸，优选至多113个氨基酸，优选至多112个氨基酸，优选至多111个氨基酸，优选至多110个氨基酸，优选至多109个氨基酸，优选至多108个氨基酸，优选至多107个氨基酸，优选至多106个氨基酸，优选至多105个氨基酸，优选至多104个氨基酸，优选至多103个氨基酸，优选至多102个氨基酸，优选至多101个氨基酸，优选至多100个氨基酸，优选至多99个氨基酸，优选至多98个氨基酸，优选至多97个氨基酸，优选至多96个氨基酸氨基酸，优选至多95个氨基酸，优选至多94个氨基酸，优选至多93个氨基酸，优选至多92个氨基酸，优选至多91个氨基酸，优选至多90个氨基酸，优选至多89个氨基酸，优选至多88个氨基酸，优选至多87个氨基酸，优选至多86个氨基酸，优选至多85个氨基酸，优选至多84个氨基酸，优选至多83个氨基酸，优选至多82个氨基酸，优选至多81个氨基酸，优选至多80个氨基酸，优选至多79个氨基酸，优选至多78个氨基酸，优选至多77个氨基酸，优选至多76个氨基酸，优选至多75个氨基酸，优选至多74个氨基酸，优选至多73个氨基酸。

根据具体的实施例，NS1蛋白包括其N末端的≤73个氨基酸。

由于在干扰素感受态细胞或生物体中缺乏复制能力(复制缺陷表型)，NS1蛋白的缺失或该蛋白的功能性敲除已被证明可导致流感病毒显著减弱。缺乏NS1蛋白的病毒不能拮抗受感染细胞的细胞因子的产生，因此可引起自佐剂和免疫调节作用。用delNS1病毒免疫后的免疫反应标志是Th1型免疫反应的触发，该免疫反应与主要的IgG2A抗体亚型反应相关(B.Ferko et al.2004)。

本文描述的流感病毒可以是人类或动物的流感病毒，例如但不限于禽类、马科动物、猪。

如本文所指，术语“第1组流感病毒”是指具有第1组HA血凝素(具体地为第1组HA的HA茎和头部结构域)的A型流感病毒组。所述第1组流感病毒包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17以及H18。在一些实施例中，H1流感病毒为流感病毒A/New Caledonia(新喀里多尼亚)/20/1999(H1N1)、A/Puerto Rico(波多黎各)/8/34(H1N1)或A/Vietnam(越南)1203/04(H5N1)样病毒。

如本文所指，术语“第2组流感病毒”是指具有第2组HA血凝素表位的A型流感病毒组。所述第2组流感病毒包含H3、H4、H7、H10、H14以及H15。在一些实施例中，H3流感病毒为流感病毒A/Hong Kong(香港)/4801/2014(H3N2)、A/Brisbane(布里斯班)/10/2007(H3N2)、A/Texas(德克萨斯)/1/77(H3N2)样病毒。

在一些实施例中，H7流感病毒为流感A/Anhui(安徽)/1/2013(H7N2)样病毒。

如本文所指，术语“第3组流感病毒”是指具有第3组HA的B型流感病毒组。所述第3组流感病毒包含B/Victoria、B/Yamagata流感病毒。所述病毒具体可以为B/Victoria/2/87代表毒株，简称B/Victoria，以及B/Yamagata/16/88代表毒株，简称B/Yamagata。

根据具体实施例，流感B/Lee 1940毒株作为第3组流感病毒包含于本文中，该流感病毒株是B/Yamagata和B/Victoria的祖先毒株。

术语“血凝素”和“HA”是指任何流感病毒血凝素。在某些实施例中，血凝素为流感血凝素，例如A型流感血凝素、B型流感血凝素或C型流感血凝素。典型的血凝素包括本领域技术人员已知的结构域，该结构域包括(任选的)信号肽、茎结构域(stem domain)(也称为“茎结构域(stalk domain)”)、球状头部结构域、(任选的)腔结构域、(任选的)跨膜结构域以及(任选的)胞浆结构域。在功能上，血凝素糖蛋白由免疫显性球状头部结构域和膜近端茎结构域组成，免疫显性球状头部结构域参与病毒附着至宿主细胞，膜近端茎结构域在宿主内体中介导病毒与细胞膜融合。术语“茎(stalk)”和“茎(stem)”在本文中可以互换使用。茎结构域在A型流感病毒(第1组和第2组)和B型流感病毒中更为保守，使得靶向该区域的抗体可以中和广泛的流感病毒亚型，茎结构域确定具有中和性B细胞抗原表位。因此，HA茎结构域在A型流感病毒组中是保守的，而免疫显性的HA头部结构域发生恒定的抗原漂移或转变。HA茎结构域由三个螺旋束组成，在病毒进入和离开宿主细胞过程中，该结构在pH诱导的涉及膜融合的构象变化上是功能性必需的。与HA头部的可变性相比，茎结构域在流感毒株中显示出更高水平的保守性，其中一些中心残基在所有亚型中都是相同的(Krystal M,etal.,Proc Natl Acad Sci USA.1982；79:4800–4804)。茎结构域的演化速度明显慢于头部结构域。此外，与蛋白质的整个头部和整个茎部区域相比，茎结构域中的交叉反应性表位(广泛地被中和性单克隆抗体靶向)的进化速度甚至更慢(Kirkpatrick E.et al.,Scientific Reports,2018,8:10432,1-14)。已在A型流感病毒HA的茎部确定了三个保护性表位，该表位在第1组和第2组流感毒株之间具有不同水平的交叉反应性。表位1在HA中HA2区域的Aα螺旋中心。靶向该表位也可以提供针对B型毒株的保护，但抗体必须具有独特的特性以适应有助于掩盖表位表面的关键修饰(Dreyfus C,et al,Science.2012；337:1343–1348.)。表位2和3针对第2组A型流感亚型具有保护作用。表位2包括HA2中长α螺旋CD的上部(Wang TT,et al.,PLoS Pathog.2010；6:e1000796.)，而表位3位于HA2茎的底部，跨越融合肽和螺旋加帽环(helix-capping loop)的区域(Ekiert DC,et al.,Science.2011；333:843–850)。第四个保护性茎表位位于HA1的C末端部分，并针对两种B型毒株谱系提供广泛的保护(Yasugi M,et al.,PLoS Pathog.2013；9:e10031)。对任何这些保守的抗原表位产生强烈的抗体反应，可以通过避免依赖容易发生抗原漂移的表位，来提供更广泛、更持久的抗流感保护。

如本文所用，术语“HA头部”或“HA头部结构域”和“流感病毒血凝素头部结构域”是指流感血凝素多肽的球状头部结构域。根据H3编号，流感病毒HA的残基C52和C277之间的氨基酸序列代表典型的流感病毒HA球状头部结构域。

如本文所用，术语“在抗原性上不同”是指存在不同的抗原位点作为抗体反应的靶标。不同的抗原性可能是由于流感病毒的抗原漂移和转变导致HA头部结构域中的氨基酸取代。“经典的”抗原位点历来是使用鼠的单克隆抗体(mAb)以及分析与抗原漂移相关的氨基酸序列变化来确定的(通过测量HI活性的降低来确定，Underwood and Wiley et al.,Nature 289,373–378(1981))。头部中的大多数突变集中在与免疫逃逸相关的位点，而大多数茎中的突变似乎均匀地分散在整个结构域中(Kirkpatrick et al.,2018)。

如本文所用，术语“感染”是指病毒在细胞或受试者中的入侵、增殖和/或存在。感染可以是“活性”感染，即病毒在细胞或受试者中发生复制的感染。此类感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官传播到其他细胞、组织和/或器官。感染也可以是潜伏感染，即病毒不复制的感染。在某些实施例中，感染是指由病毒在细胞或受试者中的存在或者病毒对细胞或受试者的入侵所导致的病理状态。

如本文所用，术语“流感病毒疾病”是指由流感(例如A型或B型流感)病毒在细胞或受试者中的存在或者流感病毒对细胞或受试者的入侵所导致的病理状态。在具体实施例中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸道疾病。

如本文所用，术语“核酸”包括DNA分子(例如cDNA)和RNA分子(例如mRNA或mRNA前体)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链或者双链的。

如本文所用，在向受试者施用治疗以预防流感病毒疾病的上下文中，术语“预防(prevent，preventing和prevention)”是指由施用疗法或组合疗法而产生的一种或多种预防性/有益的效果。在具体实施例中，在向受试者施用疗法以预防流感病毒疾病的上下文中，术语“预防”是指由施用疗法或组合疗法而产生的以下一种或多种效果：(i)抑制流感病毒疾病或其症状的发展或发作；(ii)抑制流感病毒疾病或与之相关症状的复发；以及(iii)减少或抑制流感病毒感染和/或复制。

具体地，术语“预防(prophylaxis)”或“预防性(prophylactic)”是指旨在降低疾病发生或疾病复发风险的预防措施。当预防性地提供时，本文描述的双组分疫苗是在流感感染的任何症状或临床体征变得明显之前提供。制剂的预防性施用是用于预防或减轻任何随后的感染。当预防性地提供时，本发明的双组分疫苗是在疾病的任何症状或临床体征变得明显之前提供。如本文所用的预防性治疗在受试者中诱导适应性特异性免疫。制剂的预防性施用是用于预防或减轻一种或多种由病毒感染(具体为流感病毒感染)引起的疾病相关的症状或临床体征。适应性免疫系统，也称为获得性免疫，使用特定抗原战略性地发动免疫反应。与仅基于对一般威胁的识别而进行攻击的先天免疫系统不同，适应性免疫因暴露于本文描述的双组分疫苗制剂而激活，并使用免疫记忆来了解威胁并相应地增强免疫反应。与先天免疫系统不同，适应性免疫系统依赖于B细胞和T细胞。

本文中，“适应性特异性免疫”是指流感特异性的B细胞和T细胞反应。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”可互换使用以指代动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在一个具体实施例中，受试者为鸟类。在另一个实施例中，受试者为哺乳动物，包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠以及小鼠)和灵长类动物(例如猴子、黑猩猩以及人类)。在某些实施例中，受试者是非人类动物。在一些实施例中，受试者是农场动物或宠物。在另一个实施例中，受试者是人类。

如本文所用，术语“治疗(treat，treatment和treating”是指预防性治疗，即指对受试者的免疫接种或疫苗接种以及治疗性治疗。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗性治疗(therapeutic treatment和therapeutically treating)”在对受试者施用疗法的上下文中是指治疗流感病毒疾病或感染以获得疗法或组合疗法的有益或治疗性效果。在具体实施例中，此类术语是指由施用疗法或组合疗法所产生的以下一种、两种、三种、四种、五种或多种效果：降低或改善流感病毒感染或与之相关的疾病或症状的严重性；减少流感病毒感染或与之相关的疾病或症状的持续时间；流感病毒感染或与之相关的疾病或症状的消退；降低流感病毒的滴度；减少与流感病毒感染或其相关疾病有关的器官衰竭；减少受试者的住院情况；缩短住院时间；增加受试者的存活率；消除流感病毒感染或与之相关的疾病或症状；抑制流感病毒感染或与之相关的疾病或症状的进展；防止流感病毒从一个细胞、组织、器官或受试者传播到另一个细胞、组织、器官或受试者；抑制或减少流感病毒进入宿主细胞；抑制或减少流感病毒基因组的复制；抑制或减少流感病毒蛋白的合成；抑制或减少从宿主细胞释放流感病毒颗粒；和/或增强或改善另一种疗法的治疗效果。

提供的“保护”不必是绝对的，即不必完全预防或根除流感感染，只需要与哺乳动物的对照群体或组(具体为人类)相比，具有统计学上的显著改善。保护可能仅限于降低流感病毒感染症状或临床体征的严重性或发作速度。根据具体实施例，本文描述的双组分疫苗可进一步包括一种或多种佐剂。如本文所用，“佐剂”是指可增强机体对抗原的免疫反应的物质，在本公开中，佐剂增强细胞介导的免疫反应，该反应由第一组合物、第二组合物和/或第三组合物的组合进行诱导。如本文所用，佐剂结合至任意或所有初免组合物和/或加强组合物中。

“施用”是指将本公开的双组分疫苗组合物引入至受试者中；它还可以指将本公开的疫苗提供给受试者的行为(例如，通过处方)。可以使用多种已知途径和技术将该双组分疫苗组合施用于人类或动物受试者体内。例如，该双组分疫苗组合物可以作为可注射溶液、悬浮液或乳液提供，并可通过使用常规针头和注射器，或使用液体喷射系统进行肠胃外、皮下、口服、表皮、皮内、肌肉内、动脉内、腹膜内、静脉内注射施用。该双组分疫苗组合物可以局部施用至皮肤或粘膜组织，例如经鼻、气管内、肠内、舌下、直肠或阴道，或作为适用于经呼吸道或经肺施用的细微分散喷雾剂(例如雾剂)提供。在某些实施例中，该双组分疫苗组合物是肌肉内或鼻内施用的。

术语“有效量”是指所施用化合物将会产生反应的量，该反应不同于在该化合物不存在时发生的反应。对于本公开中包括本公开免疫疗法化合物的实施例，“有效量”为与没有施用该化合物时预计将会产生的反应相比，使该化合物接受者的免疫反应增加的量。

“药物组合物”是指一种或多种本文描述的疫苗毒株、其衍生物或其药学上可接受的盐与其他化学成分(例如药学上可接受的载体和赋形剂)的混合物。药物组合物的目的之一是促进化合物对生物体的施用。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激以及不会消除所施用疫苗组合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。该初免-加强方案的一般概念对于疫苗领域的技术人员来说是众所周知的。初免-加强疫苗在本文中用于预防性治疗有感染病毒(具体为流感病毒)风险的患者。因此，在一个实施例中，该双组分疫苗组合物的初免组合物是包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株的初免疫苗制剂，初免组合物流感病毒株选自具有第1组HA的第1组A型流感病毒、具有第2组HA的第2组、或具有来自Victoria和Yamagata谱系的B型流感病毒HA的第3组，初免组合物用于初步引发免疫反应；该双组分疫苗组合物的加强组合物是加强疫苗，其包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，加强组合物流感病毒株与初免组合物中的组相同，但其HA在抗原性上不同，加强组合物配制用于加强施用以用于加强免疫反应。如本文描述的，第一种初免组合物作为初免剂量施用，而第二种加强组合物作为加强剂量施用，前提是第一种和第二种组合物均被施用。在实施例中，初免剂量和加强剂量的施用为2至4周，具体为相隔至少7天、至少14天、至少21天，具体地相隔至少28天或更长。在实施例中，初免剂量和加强剂量以相隔以下天数进行施用：约7天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、56天、63天、70天、77天、84天、91天、98天、105天、112天、119天、126天、133天、140天、147天、154天、161天、168天、约175天或约183天。

在某些实施例中，初免施用和加强施用以相隔以下周数进行：约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、或约30周。在某些其他实施例中，初始剂量和加强剂量以相隔以下月数进行施用：约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、或约12个月。

作为一般的指导，使用病毒疫苗时可作为参考的免疫学有效量范围可以从每剂约1×10⁷个病毒颗粒至每剂约1×10¹²个病毒颗粒。免疫学有效量可以为每剂约6×10¹⁰、约7×10¹⁰、约8×10¹⁰、约9×10¹⁰、约1×10¹¹个病毒颗粒。

如本文描述的用于初免-加强疫苗接种的试剂盒包括至少两个单独的小瓶：

第一小瓶包含初免组合物，初免组合物包括delNS1流感病毒，初免组合物流感病毒选自由H1N1和H5N1组成的第1组A型流感病毒，由H3N1和H7N1组成的第2组，或者由Victoria和Yamagata B型流感病毒组成的第3组，具体地包含约7×10¹⁰至8×10¹⁰TCID50的有效量；以及

第二小瓶包含加强组合物，加强组合物包括与初免组合物中的组相同但其HA头部不同的delNS1流感病毒，具体地包含约7×10¹⁰至8×10¹⁰TCID50的有效量，以及任选地包括关于合适的施用顺序和剂量信息的小册子。

本文描述的实施例是对本发明的说明，而不是旨在对本发明的限制。已经根据本发明描述了本发明的不同实施例。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述和说明的技术进行多种修改和变化。因此，应当理解这些实施例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

本研究的目的是评估两种复制缺陷型delNS1毒株A/Vietnam/1203/2004H5N1(delNS-H5N1)和A/New Caledonia/20/1999H1N1(delNS-H1N1)在雪貂中对抗流感病毒A(H1N1)pdm09样病毒(A/Vie/1H/2009)攻击的安全性、保护效果以及鼻内施用的最佳顺序。delNS1-H5N1缺乏完整的NS1开放阅读框，通过质粒共转染的cDNA克隆拯救，该质粒编码流感A/Vietnam/1203/04(H5N1)的血凝素、神经氨酸酶和基质蛋白，而其余的内部5个基因片段来自流感病毒IVR-116(WHO)。IVR-116是具有来自流感A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的HA和NA基因，来自A/Texas/1/77(H3N2)的PB1基因，以及来自A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)病毒的所有其他基因的重组病毒。对种子病毒的HA切割位点进行基因改造以去除H5N1病毒的高致病性状(Nicolodi et al 2019)。通过将来自A/NC/20/99表面糖蛋白的质粒，与对来自流感病毒株IVR-116的内部基因片段的对应质粒共转染来拯救delNS1-H1N1。从IVR-116的NS基因片段中删除NS1开放阅读框(Wacheck et al 2010)。

雪貂模型的初免/加强H5-delNS1/H1-delNS1(表1)：

分配和剂量

组	动物，性别	初免(第1天)	加强(第22天)	攻击(第40天)
					1	3M+3F	delNS-H1N1	delNS-H1N1	H1N1pdm09
2	3M+3F	delNS-H1N1	delNS-H5N1	H1N1pdm09
					3	3M+3F	delNS-H5N1	delNS-H5N1	H1N1pdm09
4	3M+3F	delNS-H5N1	delNS-H1N1	H1N1pdm09
					5	3M+3F	稀释剂	稀释剂	H1N1pdm09

第1组和第2组(N＝6/组)的雪貂在研究第1天(D1)用delNS-H1N1(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。第3组和第4组的雪貂用delNS-H5N1(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。在D22，第1组和第4组的雪貂用delNS-H1N1(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内加强免疫，而第2组和第3组的雪貂鼻内接受delNS-H5N1(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)。第5组(N＝6/组)的雪貂在D1和D22用280μl稀释剂(SHNP缓冲液)进行鼻内免疫。

在D40，所有雪貂(第1-5组)都用异源野生型A型流感(H1N1)pdm样病毒A/Vie/1H/2009攻击(剂量：280μl，10^4.5fTCID₅₀)。

体温

免疫后的体温(BT)

每天测量两次BT，并计算观察期内每一天的平均BT。为了比较个体的体温升高，在第一次免疫之前(D-3至D-1收集的平均BT)、第二次免疫之前(D20和D21的平均BT)和攻击感染之前(D38和D39的平均BT)计算每只雪貂的背景平均体温作为基线温度。在观察期间，第一次和第二次免疫后，每个免疫组的日平均体温在狭窄的delT(℃)体温范围内波动(<±0.5℃)，而与delNS免疫原无关(图1)。在雪貂的未免疫对照组(第5组)和免疫组(第1-4组)之间，没有检测到其delT(℃)日平均体温存在相关显著差异。在免疫后的任何雪貂组中都没有发现超出生理BT范围的平均BT的升高。这些数据进一步证实了基于delNS疫苗的出色安全性。

攻击感染后的体温

体温升高是雪貂流感的典型症状。通过鼻内途径接受稀释剂的雪貂(第5组)在攻击感染后48小时表现出非常强烈的温度升高。具体地，所有(6/6)动物的日平均BT均上升≥1℃。平均BT比基线温度增加1.7℃，该基线温度定义为在D38+D39测量的BT平均值(图1、图2)。该组的雪貂从发热反应中恢复缓慢，表现为在第二天(D43)测得平均BT升高>1℃。此外，该组中4/6的雪貂的最高温度为≥40.0℃，被定义为严重发热。只有用异源的初免/加强免疫方案H1N1-delNS/H5N1-delNS(第2组)和H5N1-delNS/H1N1-delNS(第4组)免疫的雪貂免受BT升高≥1℃，且没有测量到严重发热(≥40.0℃)。相比之下，同源的H5N1和H1N1初免/加强组(第1组和第3组)各有2/6的动物对攻击感染产生反应，日平均BT升高≥1℃，以及在同源的H1N1-delNS初免/加强组中，1/6的动物出现严重发热(表2)。

在攻击感染后48小时(D42)，检测到稀释剂组(第5组)和所有delNS免疫组(第1-4组)的组特异性平均值之间存在高度显著差异(p>0.0001)。在D43，仅在稀释剂组与异源初免/加强组(第2组和第4组，图1)之间观察到存在统计学上的高度显著差异(p>0.0001)。

图1显示了雪貂的体温变化(delT℃)，雪貂用不同的delNS-H1N1/delNS-H5N1组合经鼻内进行初免-加强免疫，加强免疫在初免后三周进行，随后用流感A(H1N1)pdm09样病毒攻击。显示了delT(℃)平均体温±SEM(N＝6/组)。每只雪貂的基线体温是根据在第一次免疫前(D-3至D-1)、第二次免疫前(D20至D21)和攻击感染前(D38至D39)收集的BT测量值计算得到的。在D40用异源H1N1pdm病毒攻击所有免疫和对照(稀释剂)动物。显示了delT(℃)平均体温±SEM(N＝6/组)。实心菱形对应第1组(初免delNS1-H1N1，加强delNS1-H1N1)，空心方块对应第2组(初免delNS1-H1N1，加强delNS1-H5N1)，实心三角形对应第3组(初免delNS1-H5N1，加强delNS1-H5N1)，星型对应第4组(初免delNS1-H5N1，加强delNS1-H1N1)和空心圆圈对应第5组(初免稀释剂，加强稀释剂)。

表2：攻击感染后符合特定体温检测结果的雪貂数量

总之，数据显示在雪貂中使用delNS-H1N1和delNS-H5N1的鼻内初免/加强异源免疫方案，在用远缘相关的大流行流感病毒株攻击感染后，在保护动物免于发热方面具有优越性。在攻击后第2天观察到的平均最大温度升高表明，用delNS-H5N1进行初免，然后用delNS-H1N1进行加强的顺序非常有利(图2)。

实施例2：

在第一次和第二次免疫之后以及在攻击之前从如实施例1描述的免疫雪貂中采集血清。简而言之，delNS毒株以不同的组合用于初免-加强免疫(表1)，这些delNS毒株包含来自流感New Caledonia H1N1(H1)和Vietnam H5N1(H5)的HA和NA。H5/H1初免-加强组合显示出针对茎的最佳ELISA滴度，随后是H1/H5组合。

结果如图3所示。

图3a显示了HA2(茎)特异性雪貂血清IgG抗体。该血清来自与图1描述相同的实验，并在攻击前的第一次和第二次免疫后采集。对应于保守茎的Vietnam H5N1毒株的HA2用作包被抗原。D-3是原始的血清，2×delH1是用delNS-H1N1 New Caledonia毒株免疫雪貂两次的血清，delNSH1/delH5是用delNS-H1N1 New Caledonia初免并用delNS-H5N1 Vietnam加强，2×delH5是用delNS-H5N1免疫两次，delH5/delH1是用delNS-H5N1 Vietnam初免并用delNS-H1N1加强，稀释剂组用缓冲液模拟处理两次。

图3b显示了HA1(头部-H1N1pdm09)特异性雪貂血清IgG。对应于攻击病毒的大流行H1N1pdm09的HA1亚基用作包被抗原。免疫方案和分组与图3a中描述的相同。

特别是对于异源的初免/加强组合，该组合对茎的反应性非常好(图3a)，但没有诱导针对攻击毒株HA1(头部)的显著抗体(图3b)，表明该抗体成功地针对保守的HA2(茎)。此外，该结果表明诱导的茎抗体是成功应对攻击的主要因素，因为异源的初免/加强组合提供了出色的防发热保护。

实施例3

该实验的目的是评估两种复制缺陷型delNS1毒株delNS-H7N2(A/Anhui/1/2013)和delNS-H3N2(A/HK/4801/2014)在雪貂中对抗流感病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)样病毒攻击的安全性、保护效果以及鼻内施用的最佳顺序。delNS1-H7N2缺乏完整的NS1开放阅读框，通过质粒共转染的cDNA克隆拯救，该质粒编码流感H7N2的血凝素和神经氨酸酶，而其余的内部6个基因片段来自流感病毒IVR-116(WHO)。IVR-116是具有来自流感A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的HA和NA基因，来自A/Texas/1/77(H3N2)的PB1基因，以及来自A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)病毒的所有其他基因的重组病毒。类似地，通过将来自A型流感/H3N2表面糖蛋白的质粒，与对来自流感病毒株IVR-116的内部基因片段的对应质粒共转染来拯救delNS1-H3N2。从IVR-116的NS基因片段中删除NS1开放阅读框(Wacheck etal 2010)。

雪貂模型的初免/加强delNS-H7N2/delNS-H3N2：

表3：分配和剂量

组	动物，性别	初免(第1天)	加强(第22天)	攻击(第40天)
					1	3M+3F	delNS-H3N2	delNS-H3N2	H3N2 Brisbane
2	3M+3F	delNS-H3N2	delNS-H7N2	H3N2 Brisbane
					3	3M+3F	delNS-H7N2	delNS-H7N2	H3N2 Brisbane
4	3M+3F	delNS-H7N2	delNS-H3N2	H3N2 Brisbane
					5	3M+3F	稀释剂	稀释剂	H3N2 Brisbane

第1组和第2组(N＝6/组)的雪貂在研究第1天(D1)用delNS-H3N2(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。第3组和第4组的雪貂用delNS-H7N2(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。在D22，第1组和第4组的雪貂用delNS-H3N2(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内加强免疫，而第2组和第3组的雪貂鼻内接受delNS-H7N2(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)。第5组(N＝6/组)的雪貂在D1和D22用280μl稀释剂(SHNP缓冲液)进行鼻内免疫。

可选地，第一次和第二次免疫并不都是通过鼻内方式，而是通过肌肉内或皮下的方式给予第二次免疫。

作为delNS-H7N2毒株的替代选择，使用A/HK/4801/2014H3N2-delNS毒株的远缘相关delNS-H3N2毒株(例如流感A/Panama(巴拿马)/2007/99H3N2-delNS)作为第二毒株，应用于描述的初免/加强实验。

在D40，所有雪貂(第1-5组)都用异源的H3N2 A/Brisbane/10/2007野生型病毒攻击(剂量：280μl，10^4.5fTCID₅₀)。

体温(BT)

作为保护效果的测量，每天测量两次BT，并计算观察期内每一天的平均BT。为了比较个体的体温升高，在第一次免疫之前(D-3至D-1收集的平均BT)、第二次免疫之前(D20和D21的平均BT)和攻击感染之前(D38和D39的平均BT)计算每只雪貂的背景平均体温作为基线温度。

实施例4

该实验的目的是评估两种复制缺陷型delNS1毒株delNS-B/Yamagata(B/Phuket(普吉岛)/3073/2013)和delNS-B/Victoria(B/Brisbane/60/2008)在雪貂中对抗远源相关的B型流感野生型病毒(例如B/Beijing/184/93)攻击的安全性、保护效果以及施用的最佳顺序。delNS1-B/Yamagata缺乏完整的NS1开放阅读框，通过质粒共转染的cDNA克隆拯救，该质粒编码流感(B/Phuket/3073/2013)的血凝素和神经氨酸酶，而其余的内部6个基因片段来自流感病毒B/Thueringen/2/06，该流感病毒缺乏NS1基因。通过将来自流感B/Brisbane/60/2008表面糖蛋白的质粒，与对来自B型流感病毒/Thueringen/2/06的内部基因片段的对应质粒共转染来拯救delNS1-B/Victoria，B型流感病毒/Thueringen/2/06缺乏NS1基因。

雪貂模型的初免/加强：delNS1-B/Yamagata(delNS-BY)与delNS1 B/Victoria(delNS-BV)：

表4：分配和剂量

组	动物，性别	初免(第1天)	加强(第22天)	攻击(第40天)
					1	3M+3F	delNS-BY	delNS-BY	B/Beijing/184/93
2	3M+3F	delNS-BY	delNS-BV	B/Beijing/184/93
					3	3M+3F	delNS-BV	delNS-BV	B/Beijing/184/93
4	3M+3F	delNS-BV	delNS-BY	B/Beijing/184/93
					5	3M+3F	稀释剂	稀释剂	B/Beijing/184/93

第1组和第2组(N＝6/组)的雪貂在研究第1天(D1)用delNS-BY(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。第3组和第4组的雪貂用delNS-BV(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内免疫。在D22，第1组和第4组的雪貂用delNS-BY(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)进行鼻内加强免疫，而第2组和第3组的雪貂鼻内接受delNS-BV(剂量：280μl，10^8.0fTCID₅₀)。第5组(N＝6/组)的雪貂在D1和D22用280μl稀释剂(SHNP缓冲液)进行鼻内免疫。

在D40，所有雪貂(第1-5组)都用异源野生型病毒(例如B/Beijing/184/93)攻击(剂量：280μl，10^4.5fTCID₅₀)。

体温(BT)

Claims

1.双组分疫苗，其包括具有天然血凝素(HA)的复制缺陷型流感病毒株，所述流感病毒株缺乏功能性NS基因(delNS1流感)，所述疫苗应用于对处于流感病毒感染风险中的受试者进行疫苗接种，其中：

i.初免组合物配制用于在加强组合物之前进行初免施用，所述初免组合物包括一种、两种或三种选自以下的delNS1流感病毒株：具有第1组HA的第1组A型流感病毒、具有第2组HA的第2组，或具有来自Victoria和Yamagata谱系的B型流感HA的第3组；

ii.加强组合物配制用于加强施用，所述加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，所述流感病毒株与所述初免组合物中的组相同，但其HA在抗原性上不同。

2.根据权利要求1或2所述使用的疫苗，其中，第1组流感病毒由H1N1和H5N1 A型流感病毒组成，和/或第2组流感病毒由H3N1和H7N1 A型流感病毒组成。

3.根据权利要求1至3中任一项所述使用的疫苗，其中，所述HA头部在抗原性上不同。

4.根据权利要求1至4中任一项所述使用的疫苗，其中，所述加强组合物在所述初免组合物之后2至8周施用。

5.根据权利要求1至5中任一项所述使用的疫苗，其中，所述加强组合物在所述初免组合物之后约3周施用。

6.根据权利要求1至6中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H5 HA头部的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H1HA头部的天然HA。

7.根据权利要求1至6中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H1 HA头部的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H5HA头部的天然HA。

8.根据权利要求1至7中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H3 HA头部的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H7HA头部的天然HA；或者其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有H7 HA头部的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有H3 HA头部的天然HA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Victoria衍生HA的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Yamagata谱系HA的天然HA；或者其中，所述初免组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Yamagata谱系衍生HA的天然HA，所述加强组合物的delNS1流感病毒包括具有B/Victoria谱系衍生HA的天然HA。

10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物包括第1组、第2组A型流感以及第3组的delNS1流感病毒，所述加强组合物包括对应于所述初免组合物病毒类型的delNS1流感病毒，所述加强组合物的delNS1流感病毒的HA头部在抗原性上不同于所述初免组合物的delNS1流感病毒。

11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的疫苗，其中，所述初免组合物和加强组合物是三价的，其包括第1组、第2组和第3组的流感病毒株。

12.根据权利要求1至11中任一项所述使用的疫苗，其中，所述疫苗接种用于预防流感相关疾病或感染。

13.根据权利要求1至12中任一项所述使用的疫苗，其中，所述受试者为人类、禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物或猪。

14.一种用于初免-加强疫苗接种的试剂盒，其包括至少两个小瓶，其中，第一小瓶包含初免组合物，所述初免组合物包括选自第1组A型流感病毒、第2组流感病毒和/或由Victoria和Yamagata B型流感病毒组成的第3组中的一种、两种或三种delNS1流感病毒株；第二小瓶包含加强组合物，所述加强组合物包括一种、两种或三种delNS1流感病毒株，所述加强组合物的流感病毒株与初免组合物中的组相同，但具有在抗原性上不同的HA头部。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，第1组流感病毒由H1N1和H5N1 A型流感病毒组成，和/或第2组流感病毒由H3N1和H7N1 A型流感病毒组成。