KR101855006B1

KR101855006B1 - 생산능이 향상된 재조합 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR101855006B1
Application number: KR1020160157184A
Authority: KR
Inventors: 박만성
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2018-05-04

Abstract

본 발명은 생산능이 향상된 재조합 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 조류인플루엔자 바이러스는 증식 속도가 빠르므로 단시간에 다량의 백신을 생산할 수 있고, HA와 NA의 종류에 관계없이 다양한 조류인플루엔자 바이러스의 백신 생산에 활용할 수 있다.

Description

생산능이 향상된 재조합 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물{HIGHLY PRODUCTIVE RECOMBINANT AVIAN INFLUENZA VIRUS AND VACCINE COMPOSITION COMPRISITNG THE SAME}

본 발명은 생산능이 향상된 재조합 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

오르소믹소바이러스과(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 감염 질환(독감)은, 인수공통 전염병으로 인간뿐만 아니라, 돼지, 말, 조류 등에서 공중보건학적·경제적으로 중요하게 여겨지는 호흡기 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 변이성이 높으며 한 종에서 다른 종으로 직접 전파될 가능성이 있어, 신종인플루엔자 바이러스나 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, AIV)의 대유행에 대비하는 일이 큰 이슈로 떠오르고 있다. A형 인플루엔자의 아형(subtype)은 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 항원성 차이에 따라 구분되며, 각각 H 아형과 N 아형으로 표시한다. A형 인플루엔자 바이러스의 H 아형은 H1부터 H16까지 16가지, N 아형은 N1부터 N9까지 9가지 종류가 있어, 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 아형은 144가지이다. 이와 더불어 최근 박쥐에서 분리된 인플루엔자-유사 바이러스(influenza-like virus)인 H17N10과 H18N11의 존재가 새로이 규명되었다.

인플루엔자　바이러스 유전자는 8개의 음성(negative-polarity) 단일가닥 RNA 절편(PB2, PB1,　PA, HA, NP, NA, M, NS)으로 구성되며, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 중합효소복합체의 구성체인 PB2, PB1 및 PA 단백질(polymerase subunit B2, B1, A; 각각 PB1, PB2, PA)과 헤마글루티닌 단백질(hemagglutinin; HA), 뉴클레오캡시드 단백질(nucleoprotein; NP), 뉴라미니다아제 단백질(neuraminidase, NA), 매트릭스 단백질 1 및 2(matrix protein 1, 2; 각각 M1, M2), 및 비구조성 단백질 1 및 2(nonstructural protein 1, 2; 각각 NS1, NS2)가 생성된다.

인플루엔자 백신은 역유전학 기술(reverse genetics system)을 사용하여 제조할 수 있으며, 특히 조류인플루엔자 백신은 HA 단백질에 존재하는 절단 부위(cleavage site)를 제거해야 하기 때문에 역유전학 기술로만 제조할 수 있다. 가령, 한 방향으로는　바이러스 유전자의 mRNA가 생성되고, 다른 방향에서는 viral RNA가 생성되는 8개의 플라스미드를 세포에 도입(transfection)하여 재조합　바이러스를 제조(rescue)할 수 있다. 통상적으로, HA와 NA 유전자는 최근 유행하는　바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 벡터에 클로닝하고, 나머지 유전자 6개는 유정란에서 효율적으로 증식하는 PR8 바이러스 유래의 것을 사용하여 세포에 도입하면 백신주 바이러스를 제조(rescue)할 수 있다. 그리고 이러한　바이러스를 불활성화 하거나 약독화하여 사독백신 또는 약독화 생백신으로 제조할 수 있다. 그러나, 유행주의 HA와 NA를 도입하였을 때, 백신주의 생산성이 현저히 낮아지는 현상이 보고되고 있다. 따라서, 바이러스의 내부 유전자를 치환하거나 백신　바이러스의 HA 및 NA의 아미노산에 돌연변이를 유발하여 백신주의 증식성을 개선한　바이러스 제작 기술 개발이 이루어지고 있다. 인플루엔자　바이러스의 증식성은 다수의 유전자와 관련된 특성으로 HA, NA,　PA, PB1, PB2, NP, NS에서 다양한 아미노산 돌연변이가 보고되어 있다. 일례로, 숙주세포의 선천성 면역 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NS1 단백질은 B형 인플루엔자 바이러스의 증식성에 중요한 영향을 미치는 인자임이 밝혀졌다(Journal of Virology 2004, 78(4): 1865-1872).

AIV 인체감염 사례는 대유행의 잠재성을 제기한다. 최초의 AIV 인체감염 사례가 발생한 1997년(홍콩, H5N1) 이후, 몇몇 AIV 아형에 의한 인체감염 사례가 지속적으로 보고되었으며, 인체감염 시 높은 치사율(H5N1 및 H7N9이 각각 약 50% 및 약 25% )을 초래하였다. 현재까지 인간에서 인간으로의 전염에 의한 AIV 감염 사례는 없는 것으로 확인되고 있으나, 페럿(ferret) 간 H5N1 AIV 전파를 기술하는 최근 보고서에서는 AIV 대유행의 가능성을 제시하였다.

인플루엔자 대유행에 대비하는 가장 효과적인 방법은 백신 접종으로 여겨지므로, 제한된 시간 내에 다수에게 접종할 수 있는 충분한 양의 백신 준비가 매우 중요하다. 현재 가장 널리 이용되는 인플루엔자 백신 생산 방법은 유정란에서 백신주를 증식시키는 방법이나, 이는 AIV의 대유행 시 문제될 수 있다. 먼저, AIV가 가금류에서도 동시에 발생하면 가금류가 폐사하고, 결국 백신 생산을 위하여 사용되는 유정란 부족을 초래할 수 있다. 또한, 유정란 내에서 증식된 AIV 백신의 낮은 헤마글루티닌(HA) 함량과 낮은 바이러스 수율로 인해 초래되는 낮은 백신 생산성도 문제될 수 있다. 이에 따라, 효율적인 백신 생산을 위해 적절한 면역반응을 유발할 수 있는 높은 항원 투여 또는 프라이밍-부스팅(priming-boosting) 전략이 요구된다. AIV 내 빈번한 항원성 변이는 또 다른 문제점을 야기할 수 있다. 1996년 이래, H5 HA 단백질은 9개의 clade 그룹의 계통으로 더 진화되어 왔다. 그러므로, 다양한 AIV 주에 대한 고효율의 백신 후보주 바이러스(candidate vaccine virus, CVV)를 개발하는 가장 효과적인 방법은 고수율 백신 백본(backbone)을 개발하는 것이다.

유정란을 사용하지 않고 대량의 백신을 제조하기 위한 효율적인 방법으로 세포배양 기반의 생산 방법이 대두되고 있다. 이는 종래의 유정란 기반 백신 생산 기술보다 생산속도를 향상시킬 수 있고, 박테리아 오염, 유정란 유래 단백질 함입의 회피, 및 백신주의 유정란-순응적 변이로부터 비교적 자유롭다. 세계보건기구(WHO)에 의하여 승인된 인플루엔자 백신 생산을 위한 세포주 중, Vero 세포는 이미 다른 바이러스의 백신 생산에 안정적, 성공적으로 사용되어 왔다. 최근에는, clade 1 계통 H5N1 바이러스에 대한 Vero 세포 기반 백신주가 최초로 승인되었다. 인간 인플루엔자 바이러스와 비교하여, H5N1을 포함하는 대부분의 AIV는 Vero 세포에서 효율적으로 증식한다. 이러한 증식효율 촉진에 관한 원인들 중 하나는, Vero 세포의 endosomal pH가 다른 세포들보다 높아 AIV의 HA 단백질 융합에 더 적합하다는 것이다. 그러나, 일반적으로 MDCK 세포 또는 유정란에 비해 Vero 세포에서의 AIV 성장이 더 느리기 때문에, Vero 세포에서 AIV 백신 바이러스의 성장을 개선하는 것은 현재 백신 개발 분야의 해결과제로 남아 있다.

본 발명의 목적은, 생산능이 향상된 재조합 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자(PA)를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스가 제공된다.

일측에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 중합효소 단백질 2를 코딩하는 유전자(PB2), 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 중합효소 단백질 1을 코딩하는 유전자(PB1), 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자(M), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(NP), 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 비구조성 단백질을 코딩하는 유전자(NS)를 포함할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스는, 서열번호 7 내지 서열번호 11 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 유전자(HA), 및 서열번호 12 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자(NA)를 포함할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 유전자(HA)는 H1N1, H5N1, H7N9 또는 H9N2 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스는 A/Korea/01/2009 또는 A/Brisbane/59/2007일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 H5N1, N7N9 및 H9N2 아형 인플루엔자 바이러스는 각각 A/chicken/Korea/IS/2006, A/Anhui/1/2013 및 A/Chicken/Korea/01310/2001일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자(NA)는 H1N1, H5N1, H7N9 또는 H9N2 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스는, 야생형(wild-type) 조류인플루엔자 바이러스에 비하여, Vero 세포에서 바이러스 수율이 10 배 내지 60배 증가할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스는, 야생형 조류인플루엔자 바이러스에 비하여, 유정란에서 바이러스 수율이 2배 내지 5배 증가할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스는, 야생형 조류인플루엔자 바이러스에 비하여, MDCK 세포에서 바이러스 수율이 1.5배 내지 50배 증가할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자(PA)는, H1N1 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스, 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물이 제공된다.

일측에 따르면, 상기 백신 조성물의 적용 대상인 상기 조류인플루엔자 바이러스는, H5N1, H7N9 또는 H9N2 아형 조류인플루엔자 바이러스일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 백신은 약독화된 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 합성 백신 및 유전공학 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 백신 조성물은 용매, 면역증강제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

일측에 따르면, 상기 용매는 생리식염수 또는 증류수일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 면역증강제는 프로인트(Freund's) 불완전체 어쥬번트, 프로인트 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 식물성 오일 및 광물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

일측에 따르면, 상기 부형제는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조류인플루엔자 바이러스, 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 재조합 조류인플루엔자 바이러스는 증식 속도가 빠르므로 단시간에 다량의 백신을 생산할 수 있다. 또한 HA와 NA의 종류에 관계없이 다양한 조합의 조류인플루엔자 바이러스에 적용할 수 있으므로 향후 어떠한 종류의 조류 인플루엔자 바이러스가 유행하더라도 신속하고 효과적으로 백신을 생산할 수 있다.

도 1a는 HA 절단부위의 유전적 변형을 나타낸 것이다.
도 1b는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 플라크 표현형을 나타낸 것이다.
도 1c는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다.
도 1d는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 HA 역가를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 유전적 변이를 갖는 재조합 바이러스의 역가를 나타낸 것이다.
도 3a은, 베로 세포 내에서 PA E31K 의 중합효소 활성도를 나타낸 것이다.
도 3b는, 시간에 따른 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 3c는, 상대적인 PA:31E 및 PA:31K의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4a 는, rVN1203/PA:E31 와 rVN1203/PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 4b 는, rVN1203/PA:E31 와 rVN1203/PA:K31의 HA 역가를 나타내는 그래프이다.
도 5a는, H7N9 CVV의 PA:E31 및 PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 5b는, H9N2 CVV의 PA:E31 및 PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 유정란에서 농도에 따른 rIETR/PA:E31과 rIETR/PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7은, MDCK 세포에서 CVV 종류에 따른 PA:E31과 PA:K31의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 생산능이 향상된 재조합 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은, 조류인플루엔자 H5N1 백신 후보주 바이러스(candidate vaccine virus, CVV)의 항원 안정성을 유정란에서의 여러 차례 계대배양을 통하여 평가하는 동안, 계대 rIETR₁₅ 가 마스터 시드 rIETR에 비하여 더 큰 플라크(plaque)를 형성한 것을 관찰하였다. 플라크의 크기 증가는 유정란, MDCK 세포 및 Vero 세포의 HA 양 및 바이러스 수율의 증가와 관련성이 있다.

상기 계대 rIETR₁₅ 바이러스의 염기서열을 분석한 결과, 4가지 유전적 변이를 확인하였다. 각각의 변이를 도입한 재조합 바이러스를 제조하였고, 4가지 변이 바이러스(PB2:R136K, PA:E31K, HA:A172T, 및 M2:R80Q) 중에서 PA:E31K 변이 바이러스가 바이러스 중합효소 복합체의 활성을 증가시키고, rIETR₁₅의 성장에 기여하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

다른 바이러스 단백질 내 몇 가지 변이의 조합을 통해 인플루엔자 CVVs의 성장 향상을 달성할 수 있다. 다만, 본 발명의 일실시예는 단일 PA 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 관한 것으로서, 단일 PA 변이만으로도 충분히 바이러스 수율과 HA 양을 증가시킬 수 있다는 점에서 종래의 기술과의 차별점이 있으며, 이러한 바이러스의 수율 향상은 백신의 생산성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따른 단일 PA 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스는, 항원(HA 및 NA)을 달리하는 다양한 조류인플루엔자 CVVs에 적용 가능하므로, 안전하고 신속한 세포배양-기반 백신 생산에 기여할 수 있다(실시예 3 및 6 참조).

PA:E31K 변이 바이러스를 Vero 세포, MDCK 세포 및 유정란에서 테스트한 결과, 바이러스 중합효소 복합체의 활성 향상을 통한 PA:E31K 변이 바이러스의 성장 촉진 효과는 숙주 세포에 독립적으로 작용하는 것으로 확인되었다(실시예 4, 7 및 8 참조).

또한, 다양한 조류인플루엔자 바이러스, 예를 들면, H5N1, H7N9 및 H9N2 CVVs 에서 PA 유전자에 E31K 변이를 갖도록 재조합 바이러스를 제조하여 테스트한 결과, 모든 경우에서 바이러스 수율 증가를 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).

이와 같은 본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는, 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자(PA)를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스가 제공된다.

일측에 따르면, 상기 백신 조성물의 적용 대상인 상기 조류인플루엔자 바이러스는, H5N1, H7N9 또는 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

본 발명에서 "항원"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원성분으로, 바람직하게는 바이러스가 발현하는 단백질일 수 있다.

상기 백신은 약독화된 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있다..

용어 "약독화된 생백신"은 살아있는 바이러스 활성 성분을 포함하는 백신을 의미한다. 용어 "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약화시킨 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양을 통해 바이러스의 약독화를 달성할 수 있다. 또한, 명확한 유전적 변화를 일으킴으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입을 통해 약독화를 달성할 수도 있다.

용어 "사독 백신"은 불활성화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득함으로써 제조할 수 있다.

용어 "서브유닛 백신"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 바이러스 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. 예를 들면, 조류인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 및/또는 NA 단백질을 추출하여 사용할 수 있다.

용어 "합성 백신"은 바이러스의 항원 또는 항원결정기만을 화학적으로 합성하거나 또는 재조합 DNA 기술로 생산한 펩타이드를 포함한 백신으로, 예를 들면, 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 및/또는 NA 단백질을 합성하여 사용할 수 있다.

용어 "유전공학 백신"은 바이러스의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 조류인플루엔자 백신은 불활성화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 조류인플루엔자를 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다. 용어 "혼합 백신"이란 서로 다른 바이러스 백신을 함께 사용한 백신을 말하며, 용어 "복합 백신"이란 바이러스 백신과 세균 백신을 함께 사용한 백신을 말한다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트(alum)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 조류인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 조류인플루엔자 바이러스 감염에 따른 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제에 순차로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

실시예 1: 바이러스 및 세포 준비

백신 후보 바이러스 rIETR을 생성하기 위하여, A/Chicken/Korea/IS/2006(H5N1, HPAI) 바이러스(IS06)의 cDNA를 사용하여 HA 및 NA 유전자 단편을 포함하는 플라스미드를 수립하였다. 모든 H5N1-연관된 실험은 BSL3 적합성(한국질병관리본부)에 맞게 수행되었다. 백신주 제작에 있어 6개의 내부 유전자(PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS)는 세계보건기구에서 인플루엔자 바이러스 백신주 제작에 사용하도록 지정되어 있는 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 바이러스로부터 확보하였다. A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 바이러스로의 HA를 코딩하는 플라스미드는 Dr. Peter Palese(Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY)로부터 제공받았다.

또한, MDCK 세포, 293T 세포 및 Vero 세포는 ATCC(Manassas, VA)에서 구매하였다. MDCK 세포는 이글최소필수배지(Eagle's minimum essential medium: Lonza, Basel, Switzerland)에서 유지하였으며, 293T 세포 및 Vero 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건의 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 돌베코수정이글배지(Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM): Gibco, Waltham, MA) 에서 유지하였다.

이하 실시예에서 사용된 조류인플루엔자 CVV 및 변이 바이러스들은 역유전학을 통해 제작한 것이다. 간단하게는, 각각의 바이러스 RNA 및 단백질을 코딩하는 8개의 플라스미드를 293T-MDCK 혼합세포에 도입(transfection)하고 TPCK-처리된 트립신 1ug/ml 를 보충하였다. 48 내지 72 시간 후, 세포 상청액을 회수하고 재조합 바이러스를 증식시키기 위하여 10일령의 유정란(chicken embryonated egg)에 접종하였다. 요수(allantoic fluids)는 바이러스 감염 48시간 후(hours-post infection, hpi)에 수득하고, 바이러스의 존재는 혈구응집시험(hemagglutination assay)으로 확인하였으며, 재조합 바이러스는 플라크-정제(plaque purification)하고 사용 전에 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

이하에서는, 본 발명의 실시예에서 사용된 혈구응집시험, 플라크형성시험, 바이러스 중합효소 활성 분석 방법을 간단히 기술한다.

혈구응집시험( hemagglutination assay)

HA 역가(titers)는 tRBCs(turkey red blood cells)를 사용하여 측정한다. 간단하게는, 요수 50ul을 PBS로 연속적으로 희석하고, 0.5%(v/v) RBC 용액 50ul를 각각의 요수에 첨가한다. 4℃에서 30 내지 45분간 배양한 후, 완전한 HA 활성을 갖는 가장 높은 희석배수의 역수로 HA 역가를 계산한다.

플라크형성시험(plaque assay)

배양된 세포에서 실제 감염 바이러스 역가를 측정하기 위해 통상의 플라크형성시험을 수행한다. 바이러스 요수 또는 세포배양 상층액을 단일층의 MDCK 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양한다. PBS를 이용한 3회의 세척을 통해 바이러스 접종원을 제거한 후, 2% 아가(agar) 및 1ug/ml 트립신을 포함하는 배지를 적층하여 37 ℃, 5% CO₂에서 배양한다. 72 hpi에 세포들을 crystal violet로 염색하고, 형성된 플라크의 개수를 세어 바이러스 역가를 계산한다.

바이러스 중합효소 활성 분석

바이러스 중합효소 활성은 Vero 세포에서 가우시아 루시퍼라제 미니-게놈 시험법(Gaussia luciferase mini-genome assay)을 이용하여 분석할 수 있다. 가우시아 루시퍼라제 유전자는 PR8 NA 유전자의 논-코딩 유전자 사이의 pPolI-Gluc 플라스미드에 리포터로 삽입한다. TransIT-2020(Mirus Bio LLC, Madison, WI)를 사용하여, 바이러스 중합효소 복합체(PB2, PB1, PA, 및 NP)의 구성 단백질을 발현시키는 4개의 플라스미드와 함께 70% 내지 80% 정도로 준비된 Vero 세포에 도입(transfection)한다. 감염된 세포에서 중합효소 활성을 측정하기 위하여, rIETR/PA:E31 및 rIETR/PA:K31 바이러스를 0.01 MOI(multiplicity of infection)로 Vero 세포에 접종한다. 정해진 시점에 세포 RNA를 분리하고, Oligo(dT) 프라이머 및 1㎍ RNA를 사용하여 cDNA를 합성한다. NP-특이적 프라이머 세트를 사용하는 실시간 PCR로 NP mRNA의 발현을 분석한다. 발현 수준은 GAPDH mRNA로 정규화하고, 감염된 세포의 rIETR/PA:E31 및 rIETR/:31에서의 상대적 발현 수준을 △△Ct 방법으로 계산한다.

웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

SDS-PAGE 분석을 위하여, 세포 용해물(lysate)을 RIPA 버퍼(Life Technologies, Carlsbad, CA)로 처리하여 준비한다. 세포 용해물 내 NP는 1차적으로 마우스 항-IS06 다중클론 항체로 감지되고, 2차적으로는 항-마우스 IgG-HRP 항체(KPL, Washington, DC)로 감지된다. β-actin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 대조군으로 사용한다.

실시예 2: H5N1 조류인플루엔자 계대배양을 통한 변이 유도

A/chicken/Korea/IS/2006(IS06; 한국에서 분리된 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 바이러스, 계통(clade) 2.2)의 HA 및 NA 유전자를 사용하여, rIETR(IS06 바이러스의 변형된 HA 절단 부위에서 발견된 유전적 정보에 기초한)으로 언급되는 H5N1 후보 백신 바이러스(CVV)를 수립하였다. HA 플라스미드는 절단 부위(cleavage site)로부터 폴리베이직 아미노산을 제거하기 위하여 변형하였다. 도 1a는 HA 절단 부위의 유전적 변형을 나타낸 것이다.

조류인플루엔자 CVV는 역유전학법으로 제작하였다. 간단하게는, 각각의 바이러스 RNA 및 단백질을 코딩하는 8개의 플라스미드를 293T-MDCK 혼합세포에 도입(transfection)하고 TPCK-처리된 트립신 1ug/ml 를 보충하였다. 48 내지 72 시간 후에, 세포 상청액을 회수하고 바이러스를 번식시키기 위하여 10일령의 유정란에 접종하였다.

10일령 유정란에서 수 차례의 계대배양을 수행하였으며, 매 계대배양에서, 10³ PFU의 바이러스를 유정란에 접종하였다. 요수는 48hpi에 수득하였고, MDCK 세포에서 플라크형성시험을 통해 역가를 확인하였다.

상기 rIETR을 유정란에서 15번 연속적으로 계대배양 한 경우, 마스터 시드인 rIETR과 15번 계대배양한 rIETR₁₅는 항원성 측면에서는 차이점이 발견되지 않았다. 하지만, 마스터 시드와 rIETR₁₅ CVVs는 플라크 표현형에서 현저한 차이점이 나타났다. 도 1b는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 플라크 표현형을 나타낸 것이다. 도 1b를 참고하면, rIETR₁₅는 마스터 시드보다 월등히 큰 플라크를 형성하였다.

유정란뿐만 아니라, Vero 세포와 MDCK 세포에서도 rIETR₁₅를 테스트 하였으며, 모든 경우에서 마스터 시드보다 더 큰 플라크를 형성하였다. 도 1c는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 바이러스 역가를 나타낸 그래프이다. 도 1c를 참고하면, rIETR₁₅는 마스터 시드 rIETR에 비하여, 유정란에서 약 10^1. ⁵배, MDCK 세포에서 약 10^0.8 배, Vero 세포에서 약 10^2. ⁷ 배 높은 바이러스 역가를 나타내었다.

또한, rIETR₁₅는 마스터 시드보다 훨씬 더 높은 HA 역가를 보였으며, Vero 세포에서 HA 역가의 증가가 가장 컸다. 도 1d는, rIETR CVV와 rIETR₁₅ CVV의 HA 역가를 나타낸 그래프이다.

실시예 3: 유전적 변이 확인

실시예 1에서 수득된 rIETR₁₅의 유전자 서열 분석을 통하여, 4가지의 유전적 변이를 확인하였다. 특히, rIETR 및 rIETR₁₅ CVV 사이의 유전적 변이를 비교하기 위해, CVV의 8개 유전자 단편을 클로닝하고 RT-PCR을 실시하였다. 각각의 유전자 단편에 대하여, 최소 3개의 rIETR 및 rIETR₁₅ CVV를 비교하였다.

상기 변이 바이러스들은 각각 PB2 단백질의 136 위치 아미노산이 R에서 K로 변이된 rIETR/PB2:K136, PA 단백질의 31 위치 아미노산이 E에서 K로 변이된 rIETR/PA:K31, HA 단백질의 172 위치 아미노산이 A에서 T로 변이된 rIETR/HA:T172, 및 M1 단백질의 80 위치 아미노산이 R에서 Q로 변이된 rIETR/M2:Q80 이었다.

분류	바이러스	단백질 및 아미노산 위치
		PB2	PA	HA	M2
		136	31	172	80
야생형	rIETR	R	E	A	R
계대주	rIETR₁₅	R/K	K	T	Q
변이주	rIETR/PB2:K136	K	-	-	-
	rIETR/PA:K31	-	K	-	-
	rIETR/HA:T172	-	-	T	-
	rIETR/M2:Q80	-	-	-	Q

상기 표 1은 rIETR₁₅ 변이 바이러스와 유전자 변이를 나타낸 것이다.

상기 표 1의 유전자 변이들 중에서 rIETR15의 성장 촉진에 중요한 인자를 밝히기 위하여, 4 가지의 유전자 변이를 각각 포함하는 4 종류의 바이러스를 생산하고 이들의 성장특성을 평가하였다.

대조군 rIETR, 상기 4종류의 rIETR/PB2:K136, rIETR/PA:K31, rIETR/HA:T172, 및 rIETR/M2:Q80 바이러스를 0.01 MOI로 Vero 세포에 접종하였다. 바이러스 역가는 48 hpi에 MDCK 세포에서 플라크형성시험으로 측정하였다.

도 2는, 유전자 변이를 갖는 재조합 바이러스의 역가를 나타낸 것이다.

도 2를 참고하면, 유전자 변이를 갖는 4 종류의 바이러스들 중, rIETR/M2:Q80 바이러스는 rIETR 바이러스에 비해 약간 높은 바이러스 역가를 나타내었다. rIETR/PB2:K136 및 rIETR/HA:T172 바이러스는 rIETR/M2:Q80 보다는 우수한 바이러스 수율을 보였으나, PA 단백질의 아미노산이 변이된 rIETR/PA:K31 바이러스가 가장 높은 바이러스 역가를 나타내었다. rIETR/PA:K31 바이러스는 마스터 시드인 rIETR 보다 대략 10 배 높은 역가로 생산되었다. 즉, 계대배양된 rIETR₁₅ 에서 확인된 유전자 변이들 중, PA 단백질의 31번째 위치한 아미노산이 K로 변이된 바이러스는 대폭 향상된 바이러스 수율 및 HA 함량을 나타내었다.

실시예 4: 바이러스 중합효소 복합체 활성에 대한 PA단백질의 E31K 변이

PA 단백질은 인플루엔자 바이러스 중합효소 복합체의 4가지 단백질 구성요소 중 하나이다. 대부분의 인플루엔자 PA 단백질은 31 잔기에 글루타믹산(E)을 보유한다. 실시예 3에서 확인하였듯이 PA E31K 변이는 바이러스 역가를 증가시킨다. 이에 따라, 미니-레플리콘(mini-replicon) 시스템을 사용하여 바이러스 중합효소 복합체 활성에서의 PA E31K 효과를 평가하였다.

가우시아 루시퍼라제 미니-게놈 시험법(Gaussia luciferase mini-genome assay)을 이용하여 Vero 세포에서 PA E31K 변이에 의한 중합효소의 활성도를 측정하였다. 각각의 pDZ-PB2, PB1, PA 와 NP 플라스미드, 및 pPolⅠ-Gluc 플라스미드를 Vero 세포에 도입(transfection) 하였으며, Gluc 활성도는 도입 후 12 시간에 측정하였다.

도 3a는, Vero 세포에서 PA E31K의 중합효소 활성도를 나타낸 것이다. 루시퍼라제 유닛은 5번의 독립적인 실험으로부터 상대적으로 계산하였으며, 에러바는 표준편차(SD)를 나타낸다. 도 3a을 참고하면, 도입된 Vero 세포에서 PA E31K 변이는 사용량 의존적으로(dose-dependent manner) 루시퍼라제 발현 향상을 나타내었다.

이어서, 또 다른 방법으로 PA E31K 변이가 단백질 발현의 향상을 초래할 수 있는지 여부를 재확인 하였다. PA 단백질의 31번 위치가 E인 바이러스 PA:E31와, PA 단백질의 31번 위치가 K인 바이러스 PA:K31를 각각 Vero 세포에 0.01 MOI로 접종하였다. 각각에 대하여 2, 4 및 8 hpi에 RNA를 분리하고, 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. NP mRNA의 발현 수준은 NP-특이적 프라이머 세트를 사용하여 qRT-PCR로 측정하였다. GAPDH mRNA level에 의해 발현 수준을 표준화 하였고, △△Ct 방법으로 감염된 세포에서 상대적인 rPA:31E 및 rPA:31K의 발현 수준을 계산하였다.

도 3b는, 시간에 따른 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.

도 3c는, 상대적인 PA:31E 및 PA:31K의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.

NP 단백질 발현을 웨스턴 블로팅법을 사용하여 관찰한 결과, PA E31K 변이는 더 높은 단백질 발현을 유도하였다. 이러한 결과는, PA E31K 변이가 바이러스의 중합효소 활성을 증가시킴으로써 바이러스 생산 수율을 향상시킨 것으로 판단된다.

실시예 5: 다른 H5N1 조류인플루엔자 바이러스의 CVVs에 대한 PA E31K의 적용

실시예 4를 통하여, rIETR₁₅ CVV의 HA 함량과 바이러스 수율의 증가는, PA E31K 변이에 의해 유발되는 바이러스 중합효소 복합체 활성의 증가에 의한 것이라는 점을 확인하였다. 이어서, 이러한 PA 변이가 다른 조류인플루엔자 CVV에도 적용되는지 확인하기 위하여, A/Viet Nam/1203/2004(VN1203, clade 1)의 HA 및 NA를 사용하여, PA 단백질의 31번 위치가 E 또는 K인 2개의 clade H5N1 CVVs를 제작하였다. 이러한 2가지 바이러스를 각각 0.01 MOI로 Vero 세포에 접종하였으며, 48 hpi에 MDCK 세포에서 플라크형성시험 또는 혈구응집시험으로 바이러스 역가를 측정하였다.

도 4a 및 도 4b는 각각, rVN1203/PA:E31 와 rVN1203/PA:K31의 바이러스 역가와 HA 역가를 나타내는 그래프이다. 바이러스 역가의 기하 평균은 3번의 독립적인 실험으로부터 계산되었으며, 에러바는 SD를 나타낸다. 바이러스 역가 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였다. (**p<0.01)

도 4a를 참고하면, PA:E31(rVN1203/PA:E31) CVV의 역가가 10^6.6 PFU/ml 인 반면, PA:K31(rVN1203/PA:K31) 변이를 갖는 CVV의 역가는 10^7.8PFU/ml에 도달하였다. 또한, 도 4b를 참고하면, rVN1203/PA:E31 CVV의 경우 HA 역가가 미미하게 관찰된 반면, rVN1203/PA:K31는 평균 2^4.6의 HA 역가를 나타내었다. 이를 통하여, 조류인플루엔자 백신주에서 PA E31K 변이는 바이러스의 HA 함량을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: H7N9 및 H9N2 조류인플루엔자 바이러스의 CVVs에 대한 PA E31K의 적용

2종의 조류인플루엔자 A/Anhui/1/2013(H7N9) 및 A/Chicken/Korea/01310/2001(H9N2)로부터 유래된 HA과 NA 유전자를 이용하여, H7N9 CVV와 H9N2 CVV를 제조하였다. 이 때, 각각의 CVV가 PA:E31 또는 PA:K31를 갖도록 제조하였다. 상기 4종의 바이러스를 각각 0.01 MOI로 Vero 세포에 접종하였으며, 48 hpi에 MDCK 세포에서 플라크형성시험으로 바이러스 역가를 측정하였다.

도 5a는, H7N9 CVV의 PA:E31 및 PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이며, 도 5b는, H9N2 CVV의 PA:E31 및 PA:K31의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다. 각 바이러스의 역가 기하 평균은 3번의 독립적인 실험으로부터 계산하였으며, 에러바는 SD를 나타낸다. 바이러스 역가의 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였다. (*P<0.05, **P<0.01)

도 5a 및 도 5b를 참고하면, H7N9 CVV 및 H9N2 CVV는 Vero 세포에서 H5N1 CVV 보다 바이러스의 성장이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 하지만, H7N9 CVV 및 H9N2 CVV 모두 PA:K31의 유전자 변이를 갖는 바이러스 수율은 각각 10배 및 10^1.7배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 조류인플루엔자의 HA 아형이 다른 경우에도, PA E31K 변이는 조류인플루엔자 CVV의 성장에 매우 중요한 결정적 요소임을 확인하였다.

실시예 7: 유정란에서 조류인플루엔자 바이러스의 CVV에 대한 PA E31K의 적용

실시예 3 내지 6을 통해, PA E31K 변이는 Vero 세포에서 바이러스의 역가를 증가시킴을 확인하였다. 이러한 바이러스 성장 촉진 효과가 현재 백신 생산에 이용되는 유정란에서도 독립적으로 적용되는지 확인하였다. Vero 세포에서 PA E31K 변이에 의해 바이러스 수율이 증가한 H5N1 CVV인 rIETR 바이러스를 적용하여 실험을 수행하였다. rIETR/PA:E31 및 rIETR/PA:K31 바이러스를 유정란에 1000 PFU, 100 PFU, 및 10 PFU로 접종하였으며, 48 hpi에 요수를 수득하여 MDCK 세포 상에서 플라크형성시험을 통해 바이러스 역가를 측정하였다.

도 6은 유정란에서 H5N1 CVV인 rIETR 바이러스의 역가를 나타내는 그래프이다. 바이러스 역가 기하 평균은 3번의 독립적인 실험으로부터 계산하였으며, 에러바는 표준편차를 나타낸다. 바이러스의 역가는 student's t-test를 이용하여 분석하였다. (**P<0.01, ***P<0.001)

도 6을 참고하면, H5N1 CVV 모두 유정란에서 PA:E31보다 PA:K31의 바이러스 수율이 증가한 것을 확인할 수 있다. 특히, 바이러스의 접종 역가가 감소하더라도 PA:K31의 수율 증가 효과는 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 바이러스 수율은 1000 PFU로 접종한 경우 10^0.64배로 증가하였으며, 100 PFU 및 10 PFU로 접종한 경우 각각 10^0.36배 및 10^0.60배 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 종합해보면, 유정란에서도 PA E31K 변이의 조류인플루엔자 CVV의 성장 촉진 효과는 독립적으로 적용되는 것을 알 수 있다.

실시예 8: MDCK 세포에서 조류인플루엔자 바이러스의 CVVs에 대한 PA E31K의 적용

실시예 3 내지 7을 통해, PA E31K 변이는 Vero 세포 및 유정란에서 바이러스 역가를 증가시킴을 확인하였다. 이러한 바이러스 성장 촉진 효과가 다른 세포주(백신 생산에 이용되는 MDCK 세포)에서도 독립적으로 적용되는지 여부를 확인하였다. 2종의 H1N1 아형의 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(2009년 신종인플루엔자 바이러스 대유행을 일으킨 H1N1 아형의 인플루엔자 바이러스, 이하 pdmH1N1 CVV) 및 A/Brisbane/59/2007(2009년 이전에 유행한 계절성 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스, 이하 seaH1N1 CVV)로부터 유래된 HA와 NA 유전자를 이용하여, pdmH1N1 CVV 및 seaH1N1 CVV를 제조하였다. 이 때, 각각의 CVV가 PA:E31 또는 PA:K31를 갖도록 제조하였다. 상기 바이러스를 각각 0.01 MOI로 MDCK 세포에 처리하였으며, 48 hpi에 MDCK 세포 상에서 플라크형성시험을 통해 바이러스 역가를 측정하였다.

도 7은 MDCK 세포에서 CVV 종류에 따른 PA:E31과 PA:K31의 바이러스 역가를 각각 나타낸 그래프이다. 바이러스 역가 기하 평균은 3번의 독립적인 실험으로부터 계산하였으며, 에러바는 표준편차를 나타낸다. 바이러스의 역가는 student's t-test를 통해 분석하였다. (*P<0.05, ***P<0.001)

도 7을 참고하면, H5N1 CVV, pdmH1N1 CVV, seaH1N1 CVV 모두 PA:E31에 비해 PA:K31의 바이러스 수율이 증가한 것을 확인할 수 있다. 바이러스 수율은 H5N1 CVV의 경우 10^0.26배 증가하였으며, pdmH1N1 CVV 및 seaH1N1 CVV의 수율이 각각 10^1.66배 및10⁰ ^.77배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 백신 생산 기질(substrate)이 변화하더라도 PA E31K 변이의 CVV 성장 촉진 효과는 독립적으로 적용된다는 사실을 확인하였다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

<110> Korea University <120> HIGHLY PRODUCTIVE RECOMBINANT AVIAN INFLUENZA VIRUS AND VACCINE COMPOSITION COMPRISITNG THE SAME <130> APC-2016-0221 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2151 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 1 atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc ggaaaaaaca 60 atgaaagagt atggggagga cctgaaaatc aaaacaaaca aatttgcagc aatatgcact 120 cacttggaag tatgcttcat gtattcagat tttcacttca tcaatgagca aggcgagtca 180 ataatcgtag aacttggtga tccaaatgca cttttgaagc acagatttga aataatcgag 240 ggaagagatc gcacaatggc ctggacagta gtaaacagta tttgcaacac tacaggggct 300 gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaagg agaatagatt catcgaaatt 360 ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa aattaaatct 420 gagaaaacac acatccacat tttctcgttc actggggaag aaatggccac aaaggcagac 480 tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca gactattcac cataagacaa 540 gaaatggcca gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg agaagagaca 600 attgaagaaa ggtttgaaat cacaggaaca atgcgtaagc ttgccgacca 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aacagaagtg tggtcataca atgctgaact cttggtagca 1320 atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380 gtgaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca ctggttgctt tgaaatattt 1440 cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaaa 1500 tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560 tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620 gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680 taa 1683 <210> 9 <211> 1683 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 9 atggaaataa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacaagcga tgctgataaa 60 atttgcattg gctaccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaaac 120 aatgtccctg tgacacatac caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgttatgt 180 gcaacaaact tgggacaccc tcttatccta gacacctgca ccattgaagg gttggtgtac 240 ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga gggaaagagt ggtcttacat tgtcgaaaga 300 tcatcagctg ttaatgggat gtgctaccct ggaagggtag agaatctgga agaactcagg 360 tcttttttca gttctgctcg ctcctacaaa 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gactcaatat gatcaacaat 1260 aagattgatg accaaataca ggacatctgg gcgtacaatg cagaattact agtactgctt 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtga acaatctgta taataaggtg 1380 aagagagcat tgggttcaaa tgcaatagag gatgggaagg gatgcttcga gttgtatcac 1440 aaatgtgatg atcaatgcat ggaaacaatt agaaacggga cttatgacag gctaaagtat 1500 aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560 acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620 cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 10 <211> 1701 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 10 atgaaggcaa tactagtagt tctgccatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60 tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacatct 300 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 360 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 420 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 480 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 540 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 600 actagtgctg accaacaaag tctctatcag aatgaagatg catatgtttt tgtggggtca 660 tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggatcga 720 gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa 780 gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcgcaa tggaaagaaa tgctggatct 840 ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca gacacccaag 900 ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt 960 ccaaaatatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct 1020 attcaatcta gaggcctatt tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg 1080 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1140 gacctgaaga gcacacagaa tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt 1200 gaaaagatga atacacagtt cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1260 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc 1320 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag 1380 aacttatatg aaaaggtaag aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1440 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1500 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta 1560 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620 ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680 cagtgtagaa tatgtattta a 1701 <210> 11 <211> 1698 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 11 atgaaagtaa aactactggt cctgttatgc acatttacag ctacatatgc agacacaata 60 tgtataggct accatgctaa caactcgacc gacactgttg acacagtact tgaaaagaat 120 gtgacagtga cacactctgt caacctgctt gagaacagtc acaatggaaa actatgtcta 180 ttaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg ttgccgggtg gatcttagga 240 aacccagaat gcgaattact gatttccaag gagtcatggt cctacattgt agaaaaacca 300 aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg catttcgctg actatgagga actgagggag 360 caattgagtt cagtatcttc atttgagagg ttcgaaatat tccccaaaga aagctcatgg 420 cccaaccaca ccgtaaccgg agtgtcagca tcatgctccc ataatgggga aagcagtttt 480 tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt acccaaacct gagcaagtcc 540 tatgcaaaca acaaagaaaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccgccaaac 600 ataggtatcc aaaaggccct ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 660 cattatagca gaaaattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaagtaag agatcaagaa 720 ggaagaatca attactactg gactctgctt gaacccgggg atacaataat atttgaggca 780 aatggaaatc taatagcgcc aagatatgct ttcgcactga gtagaggctt tggatcagga 840 atcatcaact caaatgcacc aatggataaa tgtgatgcga agtgccaaac acctcaggga 900 gctataaaca gcagtcttcc tttccagaac gtacacccag tcacaatagg agagtgtcca 960 aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacat cccatccatt 1020 caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggggggtg gactggaatg 1080 gtagatggtt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag gatctggcta tgctgcagat 1140 caaaaaagca cacaaaatgc cattaatggg attacaaaca aggtgaattc tgtaattgag 1200 aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagaattca acaaattgga aagaaggatg 1260 gaaaacttga ataaaaaagt tgatgatggg tttatagaca tttggacata taatgcagaa 1320 ctgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa tgtgaagaat 1380 ctgtatgaga aagtaaaaag ccagttaaag aataatgcta aagaaatagg aaatgggtgt 1440 tttgaattct atcacaagtg taacgatgaa tgcatggaga gtgtaaagaa tggaacttat 1500 gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 1560 ttggaatcaa tgggagtcta tcagattctg gcgatctact caacagtcgc cagttctctg 1620 gttcttttgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttacag 1680 tgtagaatat gcatctaa 1698 <210> 12 <211> 1350 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 12 atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatgataat tggaatagtt 60 agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcagaca 120 gggaatcaac gccaagctga atcaatcagc aatactaaat ttcttactga gaaagctgtg 180 gcttcagtaa cattagcggg caattcatct ctttgcccca ttagcggatg ggctgtatac 240 agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aggggggatg tgtttgttat aagagagccg 300 ttcatctcat gctcccactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg 360 aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac actaatgagt 420 tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 480 gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacaattg gaatttctgg tccagacaat 540 ggggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acaccatcaa gagttggaag 600 aacaacatac tgagaaccca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact 660 gtaatgactg atggaccaag taatgggcag gcatcatata agatcttcaa aatggaaaaa 720 gggaaggtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggagtgctcc 780 tgttatcctg atgccggcga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggctcaaat 840 aggccgtggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900 gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggtcc ggtgtccctt 960 aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ttggattggg 1020 agaaccaaaa gcaccaattc caggagcggc tttgaaatga tctgggatcc aaatgggtgg 1080 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tactagttgc 540 catgatggca aatccaggat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600 gtagtatggt acaacagaag gcctgttgca gaaattaaca catgggcccg aaacatacta 660 agaacacagg aatctgaatg tgtatgccac aacggcgtat gcccagtagt gttcaccgat 720 gggtctgcca ctggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780 aaatgggagt ctctgactgg aactgctaag catattgaag aatgctcatg ttacggggaa 840 cgaacaggaa ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900 cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgttcttaca 960 gacaatcccc gaccgaatga cccaaatata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020 aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatgggg ctaacacttg gctagggagg 1080 acaataagca cagcctcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca 1140 gatgatagat caaagcccat tcaaggtcag acaattgtat taaacgctga ctggagtggt 1200 tacagtggat ctttcatgga ctattgggct gaaggggact gctatcgagc gtgtttttat 1260 gtggagttga tacgtggaag acccaaggaa gataaagtgt ggtggaccag caatagtata 1320 gtatcgatgt gttccagtac agaattcctg ggacaatgga actggcctga tggggctaaa 1380 atagagtact tcctctaa 1398 <210> 14 <211> 1410 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 14 atgaatccaa atcagaaaat aataacaatt ggctctgtct ctctaaccat tgcaacagta 60 tgtttcctca tgcaaattgc cattctagca acgactgtaa cactgcactt caagcaaaat 120 gaatgcagca taccctcgaa caaccaagca gttccatgtg aaccaatcat aatagaaagg 180 aacataacag aaatagtgta tttgaataat actaccatag agaaagaact ttgtcctaaa 240 gtggtagaat acaggagttg gtcgaaaccg cagtgtcaga ttacagggtt tgctcctttc 300 tccaaggaca actcaatccg gctttctgct ggtgggagca tttgggtaac aagagaacct 360 tatgtatcat gcagctccaa taaatgttat caatttgcac ttgggcaggg aaccacgcta 420 gataacaaac actcaaatgg gacaatacat gatagaatct ctcatcgaac ccttttaatg 480 aacgagttgg gtgttccatt tcatttggga accaaacagg tgtgtatagc atggtccagc 540 tcaagctgtc atgatgggag agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600 gcaactgcta gtttcattta tgatggagtg cttgttgaca gtattggctc atggtctcaa 660 aatattctca gaactcagga gtcagaatgc gtttgcatca atggaacttg tacagtagta 720 atgactgatg gaagtgcatc aggaagagct gacactagaa tactattcat taaagagggg 780 aaaattgtac atattagcca attatcagga agtgctcagc atatagagga atgttcttgt 840 tatcccagat atccagacgt cagatgtgtt tgcagagaca attggaaagg atctaatagg 900 cccattatag atataaatat ggcggattat agcattgatt ccagttatgt gtgctcggga 960 cttgttggcg acacaccaag gaatgatgat agctctagca acagcaactg caaagatcct 1020 aataatgaga gagggaaccc gggagtaaaa gggtgggcct ttgactatgg aaatgatgtt 1080 tggatgggga gaacaatcag caaggattca cgctcaggtt atgaaacttt cagagtcatt 1140 ggtggttgga ccacagctaa ctccaaatca caggtgaata gacaagtcat agttgacaat 1200 aacaactggt ctggttattc tggcattttc tctgttgaag gcaaaagctg catcaatagg 1260 tgtttttatg tggagttgat aagaggaagg ccacaagaga ctagagtatg gtggacctca 1320 aacagcattg tcgtgttttg tggcacttca ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380 ggggcgaata tcaattttat gcctatataa 1410 <210> 15 <211> 1410 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 15 atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct 60 aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaactt 120 gggaatcaaa atcagattga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact 180 tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg acagtcagtg 240 gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac 300 agtaaagaca acagtataag aatcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca 360 ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta 420 aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cctaatgagc 480 tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca 540 gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacaat 600 ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacgga ataataacag acactatcaa gagttggaga 660 aacaatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttact 720 gtaatgaccg atggaccaag taatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag 780 ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc 840 tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat 900 cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgcagtggg 960 attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct 1020 aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg 1080 agaactaaaa gcattagttc aagaaacggt tttgagatga tttgggatcc gaacggatgg 1140 actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca 1200 ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct 1260 tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagcggg 1320 agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1380 gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa 1410 <210> 16 <211> 1413 <212> DNA <213> influenza A virus <400> 16 atgaacccaa atcaaaagat aataaccatt ggatcaatca gtatagcaat cggaataatt 60 agtctaatgt tgcaaatagg aaatattatt tcaatatggg ctagtcactc aatccaaact 120 ggaagtcaaa acaacactgg aatatgcaac caaagaatca tcacatatga aaacagcacc 180 tgggtgaatc acacatatgt taatattaac aacactaatg ttgttgctgg agaggacaaa 240 acttcagtga cattggctgg caattcatct ctttgttcta tcagtggatg ggctatatac 300 acaaaagaca acagcataag aattggctcc aaaggagatg tttttgtcat aagagaacct 360 ttcatatcat gttctcactt ggaatgcaga accttttttc tgacccaagg cgctctatta 420 aatgacaaac attcaaatgg gaccgtaaag gacagaagtc cttatagggc cttaatgagc 480 tgtcctctag gtgaagctcc gtccccatac aattcaaagt tcgaatcagt tgcatggtca 540 gcaagcgcat gccatgatgg catgggctgg ttaacaatcg gaatttctgg tccagacaat 600 ggagctgtgg ctgtactaaa atacaacgga ataataactg gaaccataaa aagttggaaa 660 aagcaaatat taagaacaca agagtctgaa tgtgtctgta tgaacgggtc atgtttcacc 720 ataatgaccg atggcccgag taataaggcc gcctcgtaca aaattttcaa gatcgaaaag 780 gggaaggtta ctaaatcaat agagttgaat gcacccaatt ttcattatga ggaatgttcc 840 tgttacccag acactggcat agtgatgtgt gtatgcaggg acaactggca tggttcaaat 900 cgaccttggg tgtcttttaa tcaaaacttg gattatcaaa taggatacat ctgcagtgga 960 gtgttcggtg acaatccgcg tcccgaagat ggagagggca gctgcaatcc agtgactgtt 1020 gatggagcaa acggagtaaa agggttttca tacaaatatg ataatggtgt ttggatagga 1080 aggaccaaaa gtaacagact tagaaagggg tttgagatga tttgggatcc taatggatgg 1140 acaaataccg acagtgattt ctcagtgaaa caggatgttg tagcaataac tgattggtca 1200 gggtacagcg gaagtttcgt ccaacatcct gagttaacag gattggactg tataagacct 1260 tgcttctggg ttgagttagt cagagggctg cctagagaaa atacaacaat ctggactagt 1320 gggagcagca tttctttttg tggcgttaat agtgatactg caaactggtc ttggccagac 1380 ggtgctgagt tgccgttcac cattgacaag tag 1413

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자(PA);
서열번호 10의 염기서열로 표시되는 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 유전자(HA); 및
서열번호 15의 염기서열로 표시되는 뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자(NA);를 포함하는, 인플루엔자 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 중합효소 단백질 2를 코딩하는 유전자(PB2), 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 중합효소 단백질 1을 코딩하는 유전자(PB1), 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자(M), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(NP), 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 비구조성 단백질을 코딩하는 유전자(NS)를 포함하는, 인플루엔자 바이러스.
삭제
제1항에 있어서,
상기 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 유전자(HA)는 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래한, 인플루엔자 바이러스.
제4항에 있어서,
상기 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스는 A/Korea/01/2009인, 인플루엔자 바이러스.
삭제
제1항에 있어서,
상기 뉴라미니다아제 단백질을 코딩하는 유전자(NA)는 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래한, 인플루엔자 바이러스.
제7항에 있어서,
상기 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스는 A/Korea/01/2009인, 인플루엔자 바이러스.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스는, 야생형 인플루엔자 바이러스에 비하여, MDCK 세포에서 바이러스 수율이 1.5배 내지 50배 증가한, 인플루엔자 바이러스.
제1항에 있어서,
상기 중합효소 단백질을 코딩하는 유전자(PA)는, H1N1 아형 인플루엔자 바이러스로부터 유래한, 인플루엔자 바이러스.
제13항에 있어서,
상기 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34인, 인플루엔자 바이러스.
제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제7항, 제8항 및 제12항 중 어느 한 항의 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
삭제
제15항에 있어서,
상기 백신은 약독화된 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 합성 백신 및 유전공학 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
제15항에 있어서,
상기 백신 조성물은 용매, 면역증강제 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 용매는 생리식염수 또는 증류수인, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 면역증강제는 프로인트(Freund's) 불완전체 어쥬번트, 프로인트 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 식물성 오일 및 광물성 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 부형제는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트인, 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
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