CN102165062A

CN102165062A - 新的流感病毒免疫表位

Info

Publication number: CN102165062A
Application number: CN2009801363762A
Authority: CN
Inventors: 马农·科图雷; 路易斯-菲利普·韦齐纳; 纳萨莉·兰德里
Original assignee: Medicago Inc
Current assignee: Medicago Inc
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2029-07-15
Also published as: IL210451A0; CA2730668A1; JP5813505B2; ES2593277T3; MX370690B; US20110191915A1; IL210451A; MX2011000657A; EP2318530A4; HK1156969A1; CA2730668C; SG192503A1; JP2011528223A; NZ590351A; PT2318530T; CN102165062B; MY161965A; EP2318530A1; DK2318530T3; US9546375B2

Abstract

提供了在植物或其部分中合成流感病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法包括在植物中表达新流感HA蛋白及其纯化。本发明还涉及包含流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码经改进之流感HA的核酸以及载体。该VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于丰富现有疫苗。

Description

新的流感病毒免疫表位

技术领域

本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及包含流感抗原(更特别地，与其他流感毒株具有广泛交叉反应性的经修饰流感抗原)之病毒样颗粒的生产。

背景技术

流感是由呼吸系统病毒引起的人类死亡首要原因。常见的症状包括发热、咽喉疼痛、气短和肌肉酸痛等。在流感季节，流感病毒感染全世界10～20％的人口，每年导致250～500,000人死亡。

流感病毒是从受感染之哺乳动物细胞的质膜出芽的包膜病毒。根据所存在的核蛋白和基质蛋白抗原，流感病毒分为A型、B型或C型。根据所存在的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的组合，A型流感病毒可进一步分成若干亚型。HA控制病毒与宿主细胞结合以及穿入宿主细胞的能力。NA从宿主细胞和病毒表面蛋白上的聚糖链除去末端唾液酸残基，这防止病毒凝集并有利于病毒运动。目前，已鉴定出16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型。每种A型流感病毒具有一种HA糖蛋白类型和一种NA糖蛋白类型。一般而言，每种亚型均表现出物种特异性；例如，已知所有HA和NA亚型均感染鸟类，而只有H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和N7显示感染人类(Horimoto 2006；Suzuki 2005)。含有H5、H7和H9的流感病毒被认为是致病性最强的A型流感病毒形式，并且最有可能引起将来的大流行。

流感大流行通常由高传播性且高致病性的流感病毒引起，并可导致全球性疾病和死亡升级。在20世纪，新的A型流感亚型的出现导致四次主要的大流行。1918～1919年由H1N1病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年间导致世界范围内超过五千万人死亡。当前，新亚型出现的风险或者动物中特有的亚型向人传播的风险总是存在。特别受到关注的是高致病性形式的禽流感(也称作“鸟流感”)，据报道其已经在全世界若干国家爆发。在许多情形下，该禽流感可在48小时内导致接近100％的死亡率。据推测，1997年在香港首次鉴定的禽流感病毒(H5N1)向其它亚洲国家和欧洲的传播与野生鸟类的迁徙模式有关。

目前对抗人中流感的方法是每年接种疫苗。疫苗通常是预测为即将到来之“流感季节”强势毒株(dominant strain)的几种毒株的组合。所述预测由世界卫生组织来协调完成。一般而言，每年生产的疫苗剂量数不足以接种全世界的人群。例如，加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂量，而欧盟仅有17％的人口可接种疫苗。很显然，在世界范围的流感大流行到来时，目前全世界的流感疫苗生产不能满足需求。即使所需的年产量在给定年份中可以某种方式实现，然而强势毒株每年都在变化，因此在一年的低需求时间大量储备是不切实际的。经济地、大规模地生产有效流感疫苗是政府和私营企业等非常关心的。

目前，用于疫苗中的最重要来源病毒储液是在受精的蛋中生产的。收获病毒颗粒，为了得到灭活病毒疫苗，通过去污剂破坏使其灭活。减毒活疫苗由适于在低温下生长的流感病毒制备，这意味着在正常体温下所述疫苗的毒力减弱。这样的疫苗在美国被批准用于5～49岁的个体。全病毒灭活疫苗是通过化学试剂灭活而变为无害的，并且其已在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产。所有这些类型的疫苗都显示出一些特定的优点和缺点。全病毒来源之疫苗的一个优点是这种疫苗所引起的免疫类型。通常，裂解型疫苗诱导强的抗体应答，而由全病毒制得的疫苗诱导抗体(体液)应答和细胞应答。尽管功能性抗体应答是与疫苗诱导之保护作用相关的获批标准，然而越来越多的证据表明T细胞应答对流感免疫也很重要，其还可为老年人提供更好的保护。

为了诱导细胞免疫应答，开发了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5N1)的高致病性，因此在BL3+设备中生产这些疫苗。对于高致病性流感毒株(例如H5N1)来说，为了降低流感毒株的致病性、使其无毒且更容易在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产，一些制造商对血凝素的基因序列进行了修饰。另一些人还使用重排列(reassortant)流感毒株，其中血凝素和神经氨酸酶蛋白的基因序列被克隆进高产量、低致病性的流感供体株(A/PR/8/34；Quan F-S等，2007)中。尽管这些方法可生产有用的疫苗，但是它们仍不能提供以满足正常年份全球需求的所需规模来大量、低成本及快速生产疫苗的解决方法，并且当大流行到来时几乎必然地不能满足需求。

利用该反向遗传技术，还可能需要对HA蛋白的基因序列进行突变以使其无毒。就高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生产需要防护(confinement)程序或者所得疫苗不与流行中病毒的基因序列完全匹配。在减毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可与来自宿主的流感病毒重组而产生新流感病毒的风险。

尽管该方法保持了抗原表位和翻译后修饰，但是存在许多缺点，包括由于使用全病毒而引起的污染风险以及取决于病毒株的不确定的产量。亚最佳水平的保护可由以下原因导致：由于将病毒引入蛋中而引起的病毒遗传异质性。其它缺点包括为了获得蛋而进行大量计划，由于在纯化中使用的化学品引起的污染风险以及生产时间长。此外，对蛋中蛋白质过敏的人可能不适于接种所述疫苗。

在大流行的情形中，需要使毒株适于在蛋中生长以及所得产量不确定减缓了裂解型疫苗的生产。尽管此技术用于生产季节性疫苗已使用了多年，但是因为世界范围的生产能力有限，因此它很难在合理的时间范围内响应于大流行。

流感病毒A型H1N1最近在墨西哥的爆发也显示出对开发新出现毒株之疫苗的快速生产方法的迫切需要。

为了避免使用蛋，已经在哺乳动物细胞培养物中(例如在MDCK或PERC.6细胞等中)生产流感病毒。另一种方法是反向遗传方法，其中通过用病毒基因转化细胞来生产病毒。然而，这些方法也需要使用全病毒以及复杂的方法和特定的培养环境。

已开发了几种作为候选重组流感疫苗的重组产物。这些方法关注A型流感病毒HA和NA蛋白的表达、制备以及纯化，包括利用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999；Johansson，1999)、病毒载体和DNA疫苗构建体(Olsen等，1997)来表达这些蛋白质。

流感病毒感染的特异性是公知的。简言之，感染周期是从病毒体表面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体(糖蛋白和糖脂)结合开始的。NA蛋白介导对唾液酸受体的处理，病毒穿入细胞则取决于HA依赖性受体介导的内吞作用。在含有流感病毒体的内化内涵体的酸性界限内，HA蛋白发生构象变化，这导致病毒与细胞膜融合，病毒脱壳以及M2介导的从核衣壳相关核糖核蛋白(RNP)释放M1蛋白，M1蛋白迁移到细胞核内用于病毒RNA合成。抗HA蛋白的抗体通过中和病毒感染性来预防病毒感染，而抗NA蛋白的抗体介导其对病毒复制早期步骤的作用。

Crawford等(1999)公开了流感病毒HA在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达。所表达的蛋白质被描述为能够预防由禽类H5和H7流感亚型引起的致命性流感疾病。Johansson等(1999)教导了杆状病毒表达的流感病毒HA和NA蛋白在动物中诱导了优于常规疫苗所诱导之应答的免疫应答。杆状病毒表达的马流感病毒血凝素的免疫原性和效力可与同源DNA候选疫苗相比较(Olsen等，1997)。总之，这些数据表明，使用多种实验方法以及在不同动物模型中，可利用重组HA或NA蛋白诱导针对流感病毒攻击的高度保护。

由于先前的研究已显示流感病毒表面糖蛋白HA和NA是用于诱导针对流感病毒之保护性免疫的主要靶标，并且M1提供了用于流感病毒之细胞免疫的保守性靶标，所以新的候选疫苗可作为蛋白质大分子颗粒(例如病毒样颗粒(VLP))包含这些病毒抗原。作为疫苗产品，VLP提供了如下优点：比亚基或重组抗原具有更强的免疫原性，能刺激体液和细胞免疫应答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有这些流感抗原的颗粒可展示出构象表位，其诱导针对多种流感病毒株的中和抗体。

生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免发生意外感染的一种方法。作为替代，已研究出用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒(VLP)。VLP模拟病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或提供二次感染的机会。

一些研究表明，使用哺乳动物表达质粒或杆状病毒载体，重组流感病毒蛋白在细胞培养物中自组装成VLP(Gomez-Puertas等，1999；Neumann等，2000；Latham和Galarza，2001)。Gomez-Puertas等(1999)公开了流感病毒VLP的有效形成取决于几种病毒蛋白质的表达水平。Neumann等(2000)建立了基于哺乳动物表达质粒的系统，其用于完全从克隆cDNA产生感染性流感病毒样颗粒。Latham和Galarza(2001)报道了在用共表达HA、NA、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中形成流感病毒VLP。这些研究表明，流感病毒体蛋白质可在真核细胞中共表达后进行自组装。

Gomez-Puertas等(2000)教导，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基质蛋白(M1)对于VLP从昆虫细胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007)教导了M1可能不是VLP形成所需的，并观察到M1和VLP的有效释放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割产生VLP之细胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并将VLP释放到介质中。

Quan等(2007)教导了在杆状病毒表达系统(昆虫细胞)中产生的VLP疫苗诱导针对某些流感病毒株(A/PR8/34(H1N1))的保护性免疫。经观察，Quan所研究的VLP从质膜出芽，并被认为具有合适的大小和形态，与在哺乳动物系统(MDCK细胞)中得到的相似。

包膜病毒可在从感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜获得膜，或者从内部细胞器的质膜获得膜。流感病毒颗粒和VLP从宿主细胞的质膜出芽。例如，在哺乳动物或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽(Quan等，2007)。

已知仅有少数包膜病毒感染植物(例如，番茄斑萎病毒属(Topovirus)和弹状病毒属(Rhabdovirus)的成员)。在已知的植物包膜病毒中，它们的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中产生了少数的重组VLP，但是它们均非源自质膜。目前的流感病毒VLP生产技术依赖于多种病毒蛋白质的共表达，这种依赖性体现出这些技术的缺点，这是因为在全世界大流行和每年流行的情形中，响应时间对于疫苗接种来说是至关重要的。依赖于只表达一种病毒蛋白的更为简单的VLP生产系统对加快疫苗的开发来说是期望的。

在基于植物的系统中生产流感病毒HA VLP已描述于WO2009/009876中，其主要显示了在植物宿主细胞中流感病毒HA能够自组装并从质膜出芽为病毒样颗粒。

为了保护全世界人口免于患流感并且击退将来的大流行，疫苗生产商需要开发有效的、快速的生产疫苗制剂的方法。目前使用受精的蛋生产疫苗不能满足需求，并且生产过程长。所用的HA蛋白是每种病毒株特异性的且不与其他病毒株交叉反应以提供更广谱的疫苗，因此一旦鉴定到新的病毒株就必需持续生产或迅速反应。

可对生产VLP所用的HA天然蛋白进行某些修饰和/或突变，这些修饰得到更广谱诱导抗体的血凝素蛋白(甚至是在仅仅单次施用后)，所述抗体中和多于一种或数种流感病毒株。

发明概述

本发明的一个方面提供了改进的流感疫苗。

本发明的另一个方面提供了新流感病毒样颗粒。

本发明的另一个方面提供了经修饰以提供更广谱之抗体反应的血凝素蛋白质。

本发明设想了这样的多肽，其具有基本上等同于病毒包膜N连接糖蛋白但是部分或完全不含N连接糖(即与原始天然HA序列相比，其一个或多个糖基化位点被消除)的氨基酸残基序列，以及生产或应用所述多肽的方法。

本发明的另一个方面提供了这样的HA蛋白质，其中来自HA1结构域的一个或多个N连接糖基化位点已被修饰/缺失/突变/移除/消除，以产生用于制备广谱流感疫苗的流感病毒VLP。

特别地，HA1结构域包含按照株A/越南/1194/04(SEQ ID NO：34)所编号的位于1至331位的氨基酸。更特别地，HA1结构域包含该蛋白质的球形头部分和F′2结构域(对应于按照株A/越南/1194/04；SEQ ID NO：34)所编号的蛋白质39至331位之间的氨基酸)。特别地，被消除的糖基化位点最初位于该蛋白质的球形头部分，特别对应于SEQ ID NO：34的39至273位之间的氨基酸。更特别地，被消除的糖基化位点最初位于该蛋白质的F′2结构域，特别对应于SEQ ID NO：34的274-331位之间的氨基酸。

本发明提供了可改变HA之抗原性和免疫原性的A型流感病毒血凝素(NA)分子中的氨基酸替换。这些替换可通过改变受体特异性和/或抗体-抗原结合来改变抗原位点。在多个实施方案中，通过所述替换得到的提高的抗原性可用于生产对流感病毒具有广泛交叉反应性的疫苗。特别地，氨基酸替换产生具有以下氨基酸替换之免疫原性特征的分子，所述替换为在HA蛋白中对应于受体结合位点的位置(特别地对应于154位和/或165位和/或286位(其中根据株A/越南/1194/04(SEQ ID NO：34)编号)为非天冬酰胺残基。在一些具体实施方案中，所述氨基酸替换使糖基化位点移除/缺失/消除。

抗原性增加的流感病毒HA分子可在对应于H5HA中154和/或165和/或286位包括一个或多个非糖基化氨基酸，其中移除这些糖基化位点中任一个导致与抗血清的反应性提高，所述抗血清来自暴露于具有野生型HA分子之流感病毒的动物。

为了破坏糖基化位点，可通过蛋白质改造对三联信号N-X-S/T(其中N是Asn，X可以是除Pro之外的任何氨基酸，S/T可以是Ser或Thr)进行修饰。所用的第一种方法可以将Asn替换为另一种氨基酸。第二种方法是用任何其他氨基酸残基替换n+2位(相对于进行糖基化的天冬酰胺来说)的S/T氨基酸。用于替换天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸的合适氨基酸是丙氨酸，但也可使用其他氨基酸。例如，可用Leu、Ile、Val、Thr、Ser或Ala替换Asn。另外可用Ala、Val、Ile或Leu替换Ser或Thr。

特别地，抗原性增加的流感病毒HA分子可在H5HA中154位和/或165位和/或286位包含非天冬酰胺氨基酸。

抗原性增加的流感病毒HA分子可包括这样的HA蛋白质，其中头部分缺少N-连接糖基化位点，即所有三个糖基化位点均被消除。

抗原性增加的流感病毒HA分子可包含一个或多个被移除的糖基化位点，所述位点选自：N-154、N-165和N-286(其中根据株A/越南/1194/04编号)。

本发明提供了来自不同流感病毒株的经修饰血凝素(HA)。

本发明还提供了在非唾液酸化宿主生物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)引入编码如上定义之流感病毒血凝素(HA)抗原的核酸，其与在非唾液酸化宿主生物或其部分中有活性的调节区域有效连接，以及

b)将所述宿主或其部分在允许所述核酸表达的条件下孵育，从而生产VLP。

本发明包括上述方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述核酸可以在宿主中瞬时表达，或者在宿主中稳定表达。此外，所述VLP可以使用例如体积排阻色谱进行纯化。

另外，本发明涉及非唾液酸化宿主生物，其用于生产包含流感病毒HA蛋白的病毒样颗粒(VLP)。特别地，能够生产VLP的合适宿主为：例如植物或其部分、植物细胞、昆虫或其部分或者昆虫细胞、或酵母或其部分或者酵母细胞。

根据本发明，提供了包含如下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码与在非唾液酸化宿主生物中有活性的调节区域有效连接的、如上定义的经修饰流感病毒HA。所述抗原可以是缺少来自分子头部分的一个或多个N-连接糖基化位点(通常存在于天然序列中的抗原位点)的流感病毒血凝素(HA)。

本发明还提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含本文定义的流感病毒HA蛋白以及一种或多种宿主脂质。如果宿主是昆虫，则病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一种或多种昆虫脂质；或者如果宿主是酵母，则病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一种或多种酵母脂质；如果宿主是植物，则病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白以及一种或多种植物脂质。

本发明还提供了在植物中生产的VLP，其因而含有一种或多种植物来源的脂质(一般称为“植物脂质”)。

本发明还提供了在昆虫细胞中生产的VLP，其包含来自昆虫细胞质膜的脂质(一般称为“昆虫脂质”)。

本发明还提供了在酵母中生产的VLP，其包含来自酵母细胞质膜的脂质(一般称为“酵母脂质”)。

本发明还包括组合物，其包含与可药用载体混合的有效剂量VLP(其包含流感病毒HA蛋白)以及来自非唾液酸化宿主生产细胞的一种或多种脂质。所述可药用载体可适于经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

本发明中还包括疫苗组合物，其包含与可药用载体混合的本文定义之免疫有效剂量VLP，其中有或没有佐剂存在。所述疫苗可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。特别地，所述疫苗在不使用佐剂的情况下施用。

本发明还提供了在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，所述方法包括向对象施用包含流感病毒HA蛋白、一种或多种宿主脂质的病毒样颗粒以及可药用载体。所述病毒样颗粒可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。

本发明涉及在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括向对象施用包含本文定义之一种或多种VLP的有效剂量的疫苗。

通过如上所述方法治疗的对象可选自包含以下的组：人、灵长类、马、猪、鸟类(禽类)、水禽、候鸟类、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、灵猫、貂、石貂、雪貂、家养宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。特别地，所述对象可以是人患者或一般意义上的鸟类(包括水禽、候鸟类、家禽例如鹌鹑、鸭、鹅、火鸡、鸡)，特别是候鸟类或用于人消费的家禽(鹌鹑、鸭、鹅、火鸡、鸡)。

本发明还提供了容器例如注射器以及包含这些容器的药盒，所有这些均包含本文定义的疫苗组合物。

本发明概述不必然描述本发明的所有方面。

发明详述

附图说明

从引用了附图的下列说明中，本发明的上述以及其它特征将更加明显，其中：

图1A示意流感病毒HA H5 A/印度尼西亚/5/05上糖基化位点的位置。标出了与A/越南/1194/04；SEQ ID NO.34(PDB文件：2IBX)结构进行比较的氨基酸同一性、位置和定位。通过破坏位于球状头部上的N154、N165和N286糖基化位点产生三突变体。Bright等人(2003)的研究已用于定位潜在的抗原位点。根据有关HA之H1、H3和H7的文献中所述的来确定糖基化类型(Abe Y.等人(2004)；Vigerust DJ等人(2007)以及Kuroda 等人(1990)；

图1B示意HA单体的亚结构域：F′1(根据A/越南/1194/04；SEQ ID NO.34编号的1-38位)、F′2(274-331位)以及F亚结构域。共同形成球状头部的受体结合位点和脂酶亚结构域(39-273位)。白色框表示融合肽。在任何HA结构中TmD和细胞质尾均不可见，因为仅有HA的可溶性菠萝蛋白酶产物被结晶并阐明结构；

图2示意来自不同A亚型的HA单体的结构。还显示了具有亲脂部分以及极性头的脂双层。结构获取自Ha等人(Ha Y，Stevens DJ，Skehel JJ，Wiley DC(2002)H5禽类)；

图3显示基于苜蓿质体蓝素的表达盒序列，其用于根据本发明的一个实施方案表达H1(SEQ ID NO：8)。蛋白质二硫键异构酶(PDI)信号肽以下划线显示。用于克隆的BglII(AGATCT)和SacI(GAGCTC)限制性位点以粗体显示；

图4示意组装用于表达来自A/印度尼西亚/5/05之野生型HA亚型H5的质粒660；

图5示意组装用于表达来自A/印度尼西亚/5/05之非糖基化突变HA亚型H5的质粒680；

图6显示第一次和第二次给药后针对灭活全病毒(whole inactivated virus，WIV)的抗体效价。在第一次免疫后(第14天)或第二次免疫后(第35天)，评估来自由野生型VLP或三突变体VLP(非糖基化)免疫的大鼠之血清的反应性。评估针对几种H5N1病毒的免疫反应性。

图7显示第一次和第二次给药之后血细胞凝集抑制(HI)抗体效价。在第一次免疫后(第14天)或第二次免疫后(第35天)14天，评估来自由野生型或三突变体VLP(非糖基化)免疫的大鼠的HI效价。评估针对几种H5N1病毒和一种H1N1病毒的免疫反应性。

图8显示流感病毒HA0的序列；

图9显示流感病毒HA蛋白亚型H2的序列；

图10显示流感病毒HA蛋白亚型H3的序列；

图11显示流感病毒HA蛋白亚型H4的序列；

图12显示流感病毒HA蛋白亚型H5的序列；

图13显示流感病毒HA蛋白亚型H6的序列；

图14显示流感病毒HA蛋白亚型H7的序列；

图15显示流感病毒HA蛋白亚型H8的序列；

图16显示流感病毒HA蛋白亚型H9的序列；

图17显示流感病毒HA蛋白亚型H10的序列；

图18显示流感病毒HA蛋白亚型H11的序列；

图19显示流感病毒HA蛋白亚型H12的序列；

图20显示流感病毒HA蛋白亚型H13的序列；

图21显示流感病毒HA蛋白亚型H14的序列；

图22显示流感病毒HA蛋白亚型H15的序列；

图23显示流感病毒HA蛋白亚型H16的序列；

图24显示了660pCAMBIA表达载体的序列，其含有完整野生型H5序列；

图25A-J显示了PCR扩增所用引物的序列；

图26显示了所产生片段的序列，其含有完整H5编码区域(包含天然信号肽)，其侧翼是紧邻起始ATG上游的HindIII位点和紧邻终止(TAA)密码子下游的SacI位点；

图27显示了所产生片段的序列，其含有经修饰除去了全部三个糖基化位点的完整H5编码区域(包含天然信号肽)，其侧翼是紧邻起始ATG上游的HindIII位点和紧邻终止(TAA)密码子下游的SacI位点；

图28A-D显示了PCR扩增的引物序列。

图29显示了来自株A/越南/1194/04的成熟H5的氨基酸序列；和

图30A-B分别显示了来自株B/佛罗里达/4/2006的成熟HA的核酸和氨基酸序列。

具体实施方案

本发明涉及病毒样颗粒(VLP)的生产。更特别地，本发明涉及包含流感抗原之病毒样颗粒的生产。

以下描述为特定实施方案。

1.HA蛋白

本文使用的“蛋白质”通常指由肽键相连的氨基酸串，其可折叠为二级、三级或四级结构以实现特定形态。或者，术语多肽、肽或肽片段可用于类似语境。

术语“血凝素结构域”是指包含HA0前体多肽或HA1或HA2结构域的肽。所述血凝素结构域不包含天然蛋白质中存在的信号肽、跨膜结构域或细胞质尾部。

对于流感病毒，本文使用的术语“血凝素”或“HA”是指发现于流感病毒颗粒外部的糖蛋白。HA是同三聚化I型膜糖蛋白，一般包含信号肽、HA1结构域和在C端包含跨膜锚定位点的HA2结构域以及小细胞质尾(图1B)。编码HA的核苷酸序列是公知的，可见于，例如生物防御公共卫生数据库(BioDefense Public Health base)(流感病毒；参见URL：biohealthbase.org)或者国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov)，其两者通过引用并入本文。

流感病毒HA的结构信息

HA单体可分为2个单独的功能结构域：球状头部结构域和茎结构域。一级序列和HA结构之间这些结构域的对应在图1B和2中显示。茎结构域通过可在酸性pH下进行的特别构象变化参与病毒的感染和致病性。其还描述为4个亚结构域，融合肽(在低pH构象状态下负责与宿主膜融合的26个氨基酸疏水片段)；茎结构域自身(可容纳2种极其不同的构象)，跨膜结构域(TmD)(决定HA对脂筏的亲和性)、细胞质尾(Ctail)(参与HA的分泌)。球状头部分为2个亚结构域，受体结合(receptor binding，RB)结构域和残留酯酶结构域(E)。酯酶亚结构域相对埋在蛋白质表面之下，因此针对HA产生的大多数抗体结合受体结合结构域(在图2中由头的最上部表示)。

术语“同三聚体”或“同三聚化”表示由三个HA蛋白质分子形成的低聚物。HA蛋白质合成为75kDa单体前体蛋白质(HA0)，其在表面上组装为延长的三聚化蛋白质。对于高致病性禽类株，在细胞内三聚化发生之前，前体蛋白在保守活化切割位点(也称为融合肽)被切割为二硫键相连的2条多肽链--HA1(328个氨基酸)和HA2(221个氨基酸；包括跨膜区域)。尽管该步骤对病毒感染力来说是非常重要，但是对于蛋白质的三聚化来说不是必要的。对于哺乳动物和不致病禽类流感病毒株，前体HA0在细胞外被宿主呼吸道细胞或者共感染的细菌或支原体分泌的蛋白酶所切割。HA插入到宿主细胞的内质网(ER)膜中，信号肽切割以及蛋白质糖基化是共翻译事件。HA的正确重折叠需要蛋白的糖基化以及6个链内二硫键的形成。HA三聚体在顺面和反面高尔基复合体中组装，跨膜结构域在三聚化过程中起作用。在流感病毒株中，菠萝蛋白酶处理的缺少跨膜结构域的HA蛋白质的晶体结构显示高度保守的结构。也已发现，HA在感染过程中经历重大构象变化，其需要前体HA0被切割为2个多肽链HA1和HA2。HA蛋白可以是加工的(即包含HA1和HA2结构域)或者未加工的(即包含HA0结构域)。

本发明涉及使用包含跨膜结构域的HA蛋白质，包括HA1和HA2结构域，例如HA蛋白质可以是HA0，或者经加工的包含HA1和HA2的HA。

本发明的HA可获得自任何亚型。例如，HA可以是亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。

本发明包括包含具有经修饰N-聚糖之HA的VLP。本发明的重组HA还可包含基于本领域中已知的任何血凝素序列的氨基酸序列，参见例如生物防御公共卫生数据库(流感病毒；参见URL：biohealthbase.org)或者国立生物技术信息中心(参见URL：ncbi.nlm.nih.gov)，其中天然N-连接糖基化位点已移除/突变/缺失/修饰从而除去了掩盖肽抗原位点的糖残基。

此外，HA可基于分离自一种或多种出现的或新鉴定出的流感病毒的血凝素序列。

此外，可产生包含HA亚型组合的VLP。例如，VLP可包含来自下列亚型的一种或多种HA：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或其组合。可由从VLP制备的疫苗的预定用途来确定HA组合的选择。例如，用于接种禽类的疫苗可包含HA亚型的任何组合，而用于接种人的VLP可包含来自下列一种或多种亚型的亚型：H1、H2、H3或H5。但是，根据VLP的用途可制备其他HA亚型组合。为产生包含HA亚型组合的VLP，所需HA亚型可在相同细胞中共表达，例如植物细胞中。

特别地，根据本文生产的VLP不包含神经氨酸酶(NA)。但是，如果需要包含HA和NA的VLP，NA可与HA共表达。

2.流感亚型

本发明包括所有类型的人流感病毒，包括例如但不限于非常流行的A亚型，以及较不常见的B型，和C型，以及从其他流感亚型获得的HA。

本发明还包括包含获得自一种或多种流感亚型之HA的VLP。例如，VLP可包含来自下列亚型的一种或多种HA：H1(由SEQ ID NO：1编码)、H2(由SEQ ID NO：2编码)、H3(由SEQ ID NO：3编码)、H4(由SEQ ID NO：4编码)、H5(由SEQ ID NO：5编码)、H6(由SEQ ID NO：6编码)、H7(由SEQ ID NO：7编码)、H8(由SEQ ID NO：8编码)、H9(由SEQ ID NO：9编码)、H10(由SEQ ID NO：10编码)、H11(由SEQ ID NO：11编码)、H12(由SEQ ID NO：12编码)、H13(由SEQ ID NO：13编码)、H14(由SEQ ID NO：14编码)、H15(由SEQ ID NO：15编码)、H16(由SEQ ID NO：16编码)或其组合。来自一种或多种流感亚型的一种或多种HA可在植物或昆虫细胞中共表达，以确保一种或多种HA的合成导致形成包含获得自一种或多种流感亚型之HA组合的VLP。可由从VLP制备的疫苗的预定用途来确定HA组合的选择。例如，用于接种人的疫苗可包含HA亚型的任何组合，特别是H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和N7中的一种或多种亚型。特别是H1、H2、H3、H5。

但是，可根据接种物的用途制备其他HA亚型组合。

3-生产方法

此外，本发明提供了在宿主中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。因此，本发明提供了来自单个包膜蛋白质表达的VLP，以及在宿主表达系统中生产病毒VLP的方法。所述方法包括引入与在宿主或其部分中有活性的调节区域有效连接的编码抗原的核酸，以及将所述宿主或其部分在允许所述核酸表达的条件下孵育，从而生产VLP。

本发明的调节元件还可与适于转化或瞬时表达的一系列宿主生物(例如特别是植物、昆虫或酵母)中表达的目的编码区域结合。

特别地，这些生物是植物，单子叶植物和双子叶植物，例如但不限于玉米、谷物、小麦、大麦、燕麦、烟草属物种(Nicotiana spp.)、芸苔属物种(Brassica spp.)、大豆、菜豆、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、人参和拟南芥(Arabidopsis)。

稳定转化以及这些生物再生的方法是本领域中已建立的，并且为本领域技术人员所知。获得转化和再生植物的方法也是本领域中公知的。

“转化”表示基因型上、表型上或两者上显现的遗传信息(核苷酸序列)的稳定种间转移。来自嵌合构建物的遗传信息向宿主的种间转移可以是可遗传的，该遗传信息的转移认为是稳定的，或者该转移可以是瞬时的并且遗传信息的转移是不可遗传的。

可使用瞬时表达方法表达本发明构建物(参见Liu和Lomonossorf，2002，Journal of Virological Methods，105：343-348，其通过引用并入本文)。或者，可使用基于真空的瞬时表达方法，如Kapila等人1997所述(通过引用并入本文)。这些方法可包括，例如但不限于，农杆菌接种或农杆菌渗入方法，但是，如上文所述也可使用其他瞬时方法。使用农杆菌接种或农杆菌渗入，包含所需核酸的农杆菌混合物进入组织的细胞间隙，例如叶、植物气生部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整株植物。在穿过表皮之后，农杆菌将t-DNA拷贝感染并转移进细胞。t-DNA以附加体形式转录，mRNA被翻译，导致在受感染细胞中产生目的蛋白质，但是t-DNA进入细胞核内是瞬时的。

4.宿主生物

本发明的VLP可在特征为缺乏唾液酸化蛋白质能力(例如缺乏唾液酸酶)的宿主细胞中产生，所述细胞例如植物细胞、昆虫细胞、真菌和其他生物，包括海绵、腔肠动物、环节动物、节肢动物、软体动物、线形动物、担轮动物、扁形动物、毛颚动物、具触手动物、衣原体、螺旋体、革兰氏阳性细菌、蓝细菌、古细菌，如glycoforum中所鉴定地(参见例如，URL：glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-A03E.html)。

根据本文所述生产的VLP通常不包含神经氨酸酶(NA)。但是，如果需要包含HA和NA的VLP，NA可与HA共表达。

特别地，本发明的VLP可在植物细胞、整株植物或其部分(例如叶、种子或任何其他植物物质)中生产。

术语“植物物质”表示来源于植物的任何物质。植物物质可包括整株植物、组织、细胞或其任何部分。另外，植物物质可包括细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物、或者其组合。另外，植物物质可包括来自植物叶、茎、花、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、液体提取物或其组合。植物物质可包括未接受任何处理步骤的植物或其部分。但是，也考虑植物物质可接受最少的如下文定义的处理步骤，或者更严格的处理，包括部分的或很大程度的蛋白质纯化，其使用本领域通常已知的技术(包括但不限于色谱、电泳等)。

术语“最少的处理”表示包含目的蛋白质的植物物质(例如，植物或其部分)经部分纯化而产生植物提取物、匀浆物、植物匀浆级分等(即最少处理)。部分纯化可包括但不限于破坏植物细胞结构，从而产生包含可溶性植物组分和不可溶植物组分的组合物，所述组分可通过例如但不限于离心、过滤或其组合来分离。就这点而言，可使用真空或离心提取容易地获得叶或其他组织的细胞间隙内分泌的蛋白质，或者可在压力下通过碾或粉碎等提取组织从而从细胞间隙中榨出或释放游离蛋白质。最少处理也可包括制备可溶性蛋白质的粗提物，因为这些制备物具有可忽略的来自次要植物产物的污染。另外，最少处理可包括用水溶液从叶提取可溶性蛋白质，然后用任何合适的盐进行沉淀。其他方法可包括大规模离析和汁液提取，从而允许直接使用提取物。

植物材料或组织形式的植物物质可以经口递送给对象。植物物质可以作为食物补充剂的一部分与其他食物一起施用或者封装。根据需要，植物物质或组织也可浓缩以改善或增加可口性，或者与其他材料、成分或药物赋形剂一起提供。

本发明的一部分还考虑了含有本发明嵌合基因构建物的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生整个植物的方法也是本领域中已知的。一般说来，将转化的植物细胞在合适培养基中培养，所述培养基可含有选择剂例如抗生素，其中使用选择标记来利于鉴定转化的植物细胞。一旦愈伤组织形成，可根据已知方法通过使用合适的植物激素促使幼苗形成，将幼苗转移到生根培养基用以再生植物。然后，所述植物可用于建立重复代，从种子产生或者使用营养繁殖方法产生。转基因植物也可在不使用组织培养的情况下产生。

本发明的一部分还考虑了根据本发明用于VLP生产的含有嵌合基因构建物的转基因植物、树、酵母、细菌、真菌、昆虫和动物细胞，所述基因构建物包含编码重组HA0的核酸。

考虑了可根据需要和情况用多种方法将包含目的蛋白或者表达包含目的蛋白之VLP的植物施用给对象或靶生物。例如，可在以粗制、部分纯化或纯化形式使用之前提取获得自植物的目的蛋白。如果蛋白质是待纯化的，则其可产生自食用或非食用植物。此外，如果蛋白质经口施用，则可收获植物组织并直接喂给对象，或者可在喂食之前将收获的组织干燥，或者可允许动物在不事先收获的情况下取食所述植物。本发明的范围内还考虑将收获的植物组织以动物饲料内食品添加剂的形式提供。如果植物组织在很少或没有进一步处理的情况下喂食给动物，则优选所施用的植物组织是可食用的。

转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)可涉及植物中转基因的有限表达，来自马铃薯病毒Y(HcPro)的沉默抑制子的共表达可用于抵消转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等人，1998)。替代性的沉默抑制子是本领域公知的，可如本文所述使用(Chiba等人，2006，Virology 346：7-14；其通过引用并入本文)，例如但不限于TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀刻病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄黑环病毒的p19(TBSV p 19)、番茄皱纹病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯病毒X的p25(PVX-p25)、马铃薯病毒M的p11(PVM-p11)、马铃薯病毒S的p11(PVS-p11)、蓝莓枯黄病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶相关病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄病毒B的p14(GVB-p14)、白芷潜伏病毒的p10(HLV-p10)或者大蒜普通潜伏病毒的p16(GCLV-p16)。因此，沉默抑制子(例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10)可与编码目的蛋白的核酸序列共表达，从而进一步确保植物内产生高水平蛋白质。

包膜病毒的VLP通常从它们出芽所通过的膜获得其包膜。植物质膜具有植物固醇补体，其可具有免疫激活作用。为了研究此可能性，将植物制备的H5VLP在存在佐剂的情况下施用给动物，测定HAI(血细胞凝集抑制抗体应答)(图7)。

在植物中生产VLP相比在昆虫细胞培养物中生产这些颗粒具有几种优点。植物脂质可激活特异性免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)形成，还含有鞘糖脂(其是植物和一些细菌和原生动物所特有的)。

鞘脂类是不常见的，因为它们不是类似PC或PE的甘油酯，而是由长链氨基醇组成，所述氨基醇与含有超过18个碳的脂肪酸链形成酰胺键。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)如树突细胞和巨噬细胞以及其他细胞(包括胸腺和肝脏中的B和T淋巴细胞))表达的CD1分子(Tsuji M，2006)。此外，除了存在植物脂质的潜在佐剂作用之外，植物N-聚糖利于抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力(Saint-Jore-Dupas，2007)可以是在植物中生产VLP的优点。

不希望受理论的限制，预计由植物制备的VLP会诱导出比其他生产/制造体系生产之VLP更强的免疫应答，并且这些植物制备的VLP诱导的免疫反应会比由活的或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应更强。

与全病毒制备的疫苗不同的是，VLP提供了以下优点，因为它们是非感染性的，因此限制性生物防范不像操作感染性全病毒时那样重要并且不是生产所必需的。植物制备的VLP提供了另外的优点，即允许表达体系在温室或田地(field)中生长，因此明显更经济且适于扩大规模。

另外，植物不包含参与合成和添加唾液酸残基到蛋白质上的酶。可在没有神经氨酸酶(NA)的情况下生产VLP，且不需要共表达NA，也不需要用唾液酸酶(神经氨酸酶)处理所产生的细胞或提取，以确保植物中的VLP生产。

特别地，根据本发明生产的VLP不包含已知结合RNA的M1蛋白质。RNA是VLP制备物中的杂质，其在获得VLP产品用作人疫苗的监管批准时是不想要的。

5.核酸

本发明提供了包含编码流感病毒血凝素(HA)抗原之核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与在非唾液酸化宿主生物中具有活性的调节区域有效连接。

本发明描述了但不限于将编码HA(例如但不限于人A型流感病毒HA)之核酸的克隆进宿主表达载体，以及从宿主生产适于疫苗生产的流感VLP。所述VLP也可用于生产含重组流感病毒结构蛋白的试剂，所述结构蛋白在转化的宿主细胞(例如植物细胞或昆虫细胞)中自组装成有功能的免疫原性同型大分子蛋白质结构(包括亚病毒流感颗粒和流感VLP)。

本发明还包括核苷酸序列H1(由SEQ ID NO：1编码)、H2(由SEQ ID NO：2编码)、H3(由SEQ ID NO：3编码)、H4(由SEQ ID NO：4编码)、H5(由SEQ ID NO：5编码)、H6(由SEQ ID NO：6编码)、H7(由SEQ ID NO：7编码)、H8(由SEQ ID NO：8编码)、H9(由SEQ ID NO：9编码)、H10(由SEQ ID NO：10编码)、H11(由SEQ ID NO：11编码)、H12(由SEQ ID NO：12编码)、H13(由SEQ ID NO：13编码)、H14(由SEQ ID NO：14编码)、H15(由SEQ ID NO：15编码)和H16(由SEQ ID NO：16编码)。

特别地，本发明包括核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7，其分别编码来自H1、H5或H7的HA；核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7，其在严格杂交条件下分别与编码来自H1、H5或H7的HA的核酸杂交；或核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7，其在严格杂交条件下分别与编码来自H1、H5或H7的HA的核酸的互补序列杂交；其中编码血凝素蛋白的核苷酸序列在表达时形成VLP，以及所述VLP诱导抗体产生。例如，该核苷酸序列在宿主细胞内的表达形成VLP，所述VLP可用于产生能够结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。在施用给对象时，VLP诱导免疫应答。

在严格杂交条件下的杂交是本领域已知的(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，1995及其增刊；Maniatis等人，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1982；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，2001；其各自通过引用并入本文)。一种此类严格杂交条件的实例可以是：在65℃下在4×SSC中杂交约16-20小时，然后在65℃下在0.1×SSC中清洗1小时或者在65℃下在0.1×SSC中清洗两次(每次20或30分钟)。或者，一种此类严格杂交条件的实例可以是：在42℃下在50％甲酰胺、4×SSC中过夜(16-20小时)，然后在65℃下在0.1×SSC中清洗1小时或者在65℃下在0.1×SSC中清洗两次(每次20或30分钟)，或者过夜(16-20小时)，或者在65℃下在Church磷酸盐缓冲水溶液(7％SDS；0.5M NaPO4缓冲液pH 7.2；10mM EDTA)中杂交，在50℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中清洗两次(每次20或30分钟)，或者在65℃下在2×SSC、0.1％SDS中清洗两次(每次20或30分钟)。

此外，本发明包括具有如下特征的核苷酸序列，所述序列与编码来自H1(SEQ ID NO：1)、H5(SEQ ID NO：5)或H7(SEQ ID NO：7)的HA的核苷酸序列具有约70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或其间任意值的序列同一性或序列相似性，其中所述核苷酸序列编码血凝素蛋白(其在表达时形成VLP)，并且所述VLP诱导抗体产生。例如，核苷酸序列在植物细胞内的表达形成VLP，所述VLP可用于产生能够结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。当施用给对象时，VLP诱导免疫应答。

可使用核苷酸序列比较程序确定序列同一性或序列相似性，例如DNASIS(例如但不限于使用以下参数：GAP罚分5，#of top diagonals 5，固定GAP罚分10，k-tuple 2，浮动空位10和窗口大小5)所提供的。但是，其他用于比较的序列比对方法是本领域公知的，例如Smith&Waterman(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson&Lipman(1988，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444)的算法，以及利用这些算法的计算机实施(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)，或者通过手动比对和肉眼观察。

因此，本发明还包括合适的载体，其包含适用于稳定或瞬时表达系统的嵌合构建物。可在一个或多个构建物中提供遗传信息。例如，可在一个构建物中引入编码目的蛋白的核苷酸序列，可使用另外的构建物引入编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列。然后，可在宿主中共表达这些核苷酸序列。但是，也可使用同时包含编码目的蛋白和修饰目的蛋白糖基化特征之蛋白的核苷酸序列的构建物。在这种情况下，核苷酸序列包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含与启动子或调节区域有效连接的编码目的蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含编码修饰目的蛋白糖基化特征之蛋白质的第二核酸序列，所述第二序列与启动子或调节区域有效连接。

“共表达”表示两种或更多核苷酸序列大约同时在宿主中表达，并且在宿主相同组织中。但是，所述核苷酸序列不必需刚好同时表达。而是，所述两种或更多核苷酸序列以使得所编码产物有机会相互作用的方式表达。例如，修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋白表达之前或期间表达，使得发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共表达所述两种或更多核苷酸序列，其中在允许两种序列表达的条件下将所述两种或更多序列在大约同时引入宿主中。或者，可将包含所述核苷酸序列之一(例如编码修饰目的蛋白糖基化特征之蛋白质的序列)的平台宿主以瞬时或以稳定形式用编码目的蛋白的其他序列转化。在这种情况下，编码修饰目的蛋白糖基化特征之蛋白质的序列可在期望发育阶段的期望组织中表达，或者可使用诱导型启动子诱导其表达，所述编码目的蛋白的另外序列可在类似条件下在相同组织中表达，以确保核苷酸序列共表达。

可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等将本发明的构建物引入植物细胞。这些技术的综述参见，例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academy Press，New York VIII，421-463页(1988)；Geierson和Corey，Plant Molecular Biology，第2版(1988)以及Miki和Iyer，Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism，第二版，DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebvre，DB Layzell(编)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London，561-579页(1997)。其他方法包括直接DNA摄取、使用脂质体、电穿孔，例如使用原生质体、显微注射、显微发射或须(whisker)，以及真空渗入。参见例如Bilang等人(Gene 100：247-250(1991)，Scheid等人(Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)，Guerche等人(Plant Science 52：111-116，1987)，Neuhause等人(Theor.Appl Genet.75：30-36，1987)，Klein等人，Nature 327：70-73(1987)；Howell等人(Science 208：1265，1980)，Horsch等人(Science 227：1229-1231，1985)，DeBlock等人(Plant Physiology 91：694-701，1989)，Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach和Weissbach编，Academic Press Inc.，1988)，Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编，Academic Press Inc.，1989)，Liu和Lomonossoff(J.Virol Meth，105：343-348，2002，)，美国专利No.4,945,050；5,036,006；和5,100,792，1995年5月10日提交的美国专利申请序列号No.08/438,666以及1992年9月25日提交的07/951,715(其全部通过引用并入本文)。

“调节区域”“调节元件”或“启动子”表示核酸的一部分，其通常但不总是在基因蛋白质编码区域的上游，可由DNA或RNA或者由DNA和RNA二者构成。当调节区域是活性的并与目的基因有效结合或有效连接时，可导致目的基因表达。调节元件能够介导器官特异性或者控制发育或时序基因活化。“调节区域”包括启动子元件、表现启动子基本活性的核心启动子元件、响应于外部刺激而诱导的元件、介导启动子活性的元件(例如负调节元件或转录增强子)。本文使用的“调节区域”还包括在转录后具有活性的元件，例如调节基因表达的调节元件例如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子、上游活化序列以及mRNA不稳定性决定簇。后面所述元件中的一些可位于编码区域附近。

在本公开内容中，术语“调节元件”或“调节区域”通常表示这样的DNA序列，其通常但不总是位于结构基因编码序列的上游(5′)，其通过提供与RNA聚合酶和/或转录从特定位点起始所需之其他因子的识别来控制编码区域的表达。但是，应理解，位于内含子中或序列3′的其他核苷酸序列也可有助于目的编码区域表达的调节。提供与RNA聚合酶或确保在特定位点起始之其他转录因子的识别的调节元件的实例有启动子元件。大多数(但不是全部)真核启动子元件含有TATA盒(由腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸碱基对构成的保守核酸序列)，其通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基本启动子元件，以及调节基因表达的其他调节元件(如上文所列)。

有几种类型的调节区域，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的调节区域。某些器官或器官组织中受发育调节或者在其控制下控制基因差异表达的调节区域在器官或组织发育过程中特定的时间被活化。但是，受发育调节的一些调节区域可优选在特定发育阶段的某些器官或组织中具有活性，在植物的其他器官或组织中它们也可以受发育调节的形式而具有活性或者维持在基本水平。组织特异性调节区域的实例(例如参见特异性调节区域)包括napin启动子和cruciferin启动子(Rask等人，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等人1994，Plant Cell 14：125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(图3；US 7,125,978，其通过引用并入本文)。

诱导型调节区域是能够响应于诱导物而直接或间接活化一个或多个DNA序列或基因转录的区域。在诱导物不存在时，DNA序列或基因不转录。通常，特异性结合活化转录之诱导型调节区域的蛋白质因子可以无活性形式存在，其随后被诱导物直接或间接转化为活性形式。但是，也可以不存在蛋白质因子。诱导物可以是化学物质，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物或者由热、冷、盐或毒性元素直接施加或者通过病原体或致病物质(例如病毒)的作用间接施加的生理应激。可通过外部施加诱导物到细胞或植物(例如通过喷雾、浇水、加热或类似方法)将含有诱导型调节区域的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调节元件可来自于植物或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358；其通过引用并入本文)。潜在的诱导型启动子的实例包括但不限于：四环素诱导型启动子(Gatz，C，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108；其通过引用并入本文)、类固醇诱导型启动子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404；其通过引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G.，等人，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick，M.X.，等人，1998，Nature Biotech.16，177-180，其通过引用并入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和Kieber，J.J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274，982-985；其通过引用并入本文)和植物生长素诱导型元件DR5(Ulmasov，T.，等人，1997，Plant Cell 9，1963-1971；其通过引用并入本文)。

组成型调节区域在植物的多个部分中以及在植物整个发育过程中持续指导基因的表达。已知的组成型调节元件实例包括与下列相关联的启动子：CaMV 35S转录物(Odell等人，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等人，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等人，1996，Plant J.，10：107-121)或tms 2(U.S.5,428,147，其通过引用并入本文)以及磷酸丙糖异构酶1(Xu等人，1994，Plant Physiol.106：459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejo等人，1993，Plant Mol.Biol.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等人，1995，Plant Mol.Biol.29：637-646)和烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等人，1995Plant Mol.Biol.29：995-1004)。本文使用的术语“组成型”不必然表示在组成型调节区域控制下的基因在所有细胞类型中都以相同水平表达，而是指该基因在众多细胞类型中表达，即使常常观察到丰度的差异。

“有效连接”表示特定序列(例如调节元件和目的编码区域)直接或间接相互作用使得行使预定功能，例如介导或调节基因表达。有效连接序列的相互作用可例如由与有效连接序列相互作用的蛋白质介导。

本发明的一种或多种核苷酸序列可在转化了本发明核苷酸序列或构建物或载体的任何合适植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于：农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔属物种、玉米、烟草属物种、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。

本发明的一种或多种嵌合遗传构建物还可包含3′非翻译区。3′非翻译区是指包含含有多腺苷酸化信号和任何其他能够影响mRNA加工或基因表达之调节信号的DNA区段的基因部分。多腺苷酸化信号通常的特征为引起一系列多聚腺苷酸加至mRNA前体的3′端。多腺苷酸化信号通常识记为存在典型形式5′AATAAA-3′的同源形式，但也常见变型形式。根据可能需要地，本发明的一种或多种嵌合遗传构建物还可包含其他增强子(翻译或转录增强子)。这些增强子区域是本领域技术人员公知的，其可包括ATG起始密码子和相邻序列。起始密码子必须与编码序列的读码框同框，以确保完整序列的翻译。

合适3′区域的非限制性实例有3′转录非翻译区，其含有农杆菌瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合酶(Nos基因))和植物基因(例如大豆贮藏蛋白基因、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO；US4,962,028；其通过引用并入本文)基因)的多聚腺苷酸化信号、调节质体蓝素表达所用的启动子(Pwee和Gray 1993；其通过引用并入本文)。质体蓝素启动子的实例描述于US 7,125,978(其通过引用并入本文)。

如本文所述，已发现包含具有已证明在叶表达中有效力之增强子序列的启动子在瞬时表达中是有效的。不希望受理论的限制，光合基因上游调节元件与核基质的结合可介导强表达。例如，从豌豆质体蓝素基因翻译起始位点起算的-784位可用于介导强的报告基因表达。

根据本发明可使用来自光合基因的调节区域，例如但不限于质体蓝素调节区(US 7,125,978；通过引用并入本文)或获得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO；US 4,962,028；其通过引用并入本文)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler等人；1986；其通过引用并入本文)、ST-LS1(其与光系统II的放氧复合体相关，Stockhaus等人，1989；其通过引用并入本文)的调节区。

为帮助鉴定转化的植物细胞，可进一步操纵本发明的构建物使其包含植物选择标记。可用的选择标记包括提供对化学品例如抗生素(如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素)或除草剂(例如草胺膦、草甘膦、氯磺隆等)具有抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色变化鉴定之化合物的酶(例如GUS(β-葡糖醛酸酶))，或使用产生可通过发光来鉴定之化合物的酶(例如萤光素酶)或GFP。

所得的这些基因的cDNA拷贝可根据宿主表达系统的需要克隆到合适表达载体中。可选择地，植物的合适表达载体实例如下所述，可使用杆状病毒表达载体(例如pFastBac1(InVitrogen))，利用已知方法以及制造商说明提供的信息得到基于pFastBac1的质粒。

本发明还涉及上述包含编码HA之核酸的基因构建物，其中所述核酸与在植物中可操作的调节元件有效连接。植物细胞中可操作的并且可用于本发明的调节元件实例包括但不限于：质体蓝素调节区(US 7,125,978；其通过引用并入本文)，或者获得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO；US 4,962,028；其通过引用并入本文)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler等人；1986；其通过引用并入本文)、ST-LS1(其与光系统II的放氧复合体相关，Stockhaus等人1989；其通过引用并入本文)的调节区。如果所述构建物在昆虫细胞中表达，则昆虫细胞中可操作的调节元件实例包括但不限于多面体启动子、gp64启动子等。

本发明还提供了将编码HA(例如但不限于人流感A/印度尼西亚/5/05病毒HA(H5N1))之核酸克隆进植物、酵母或昆虫表达载体(例如杆状病毒表达载体)以及在经转化植物细胞或经转化昆虫细胞中生产含重组流感结构蛋白的候选流感疫苗或试剂，所述结构蛋白自组装成有功能的免疫原性同型大分子蛋白质结构(包括亚病毒流感颗粒和流感VLP)。

可使用例如杆状病毒表达系统在合适细胞系中表达编码HA(例如但不限于人流感A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒HA，或者人流感A/印度尼西亚/5/05病毒HA基因)的核酸，所述细胞系例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf-9细胞系；ATCC PTA-4047)。也可使用其他昆虫细胞系。

或者，可在植物细胞或植物中表达编码HA的核酸。可使用HA RNA通过逆转录和聚合酶链式反应(PCR)合成编码HA的核酸。例如，可从人流感A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒或人流感A/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒或者从感染流感病毒的细胞分离RNA。对于逆转录和PCR，特异性针对HA RNA的寡核苷酸引物可使用例如但不限于人流感A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒HA基因或人流感A/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒HA0基因。另外，可使用本领域技术人员已知的方法化学合成编码HA的核酸。

6-蛋白质

本发明还包括由以下核苷酸序列编码的一种或多种HA蛋白：核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7(分别编码来自H1、H5或H7的HA)，在严格杂交条件下分别与编码来自H1、H5或H7之HA的核酸杂交的核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7，或者在严格杂交条件下分别与编码来自H1、H5或H7之HA的核酸的互补序列杂交的核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7，其中所述核苷酸序列编码血凝素蛋白，其在表达时形成VLP，并且VLP诱导抗体产生。

类似地，本发明包括与下列亚型相关的HA：H1(由SEQ ID NO：1编码)、H2(由SEQ ID NO：2编码)、H3(由SEQ ID NO：3编码)、H4(由SEQ ID NO：4编码)、H5(由SEQ ID NO：5编码)、H6(由SEQ ID NO：6编码)、H7(由SEQ ID NO：7编码)、H8(由SEQ ID NO：8编码)、H9(由SEQ ID NO：9编码)、H10(由SEQ ID NO：10编码)、H11(由SEQ ID NO：11编码)、H12(由SEQ ID NO：12编码)、H13(由SEQ ID NO：13编码)、H14(由SEQ ID NO：14编码)、H15(由SEQ ID NO：15编码)、H16(由SEQ ID NO：16编码)；以及具有以下特征的核苷酸序列：与H1(SEQ ID NO：1)、H2(SEQ ID NO：2)、H3(SEQ ID NO：3)、H4(SEQ ID NO：4)、H5(SEQ ID NO：5)、H6(SEQ ID NO：6)、H7(SEQ ID NO：7)、H8(SEQ ID NO：8)、H9(SEQ ID NO：9)、H10(SEQ ID NO：10)、H11(SEQ ID NO：11)、H12(SEQ ID NO：12)、H13(SEQ ID NO：13)、H14(SEQ ID NO：14)、H15(SEQ ID NO：15)、H16(SEQ ID NO：16)具有约60至100％或其间任何值的序列同一性，特别地具有约70至100％或其间任何值的同源性，约80至100％或其间任何值、约90至100％或其间任何值、约95至100％或其间任何值的序列同一性，其中所述核苷酸序列编码血凝素蛋白，其在表达时形成VLP，并且VLP诱导抗体产生。例如，核苷酸序列在植物细胞内的表达形成VLP，所述VLP可用于产生能够结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

7-VLP

因此，本发明涉及包含一种或多种HA类型或亚型的VLP。

术语“病毒样颗粒”(VLP)或“VLP”是指自组装且包含结构蛋白(如流感病毒HA蛋白)的结构。VLP通常在形态上和抗原性上类似于感染中产生的病毒颗粒，但是缺乏足以用于复制的遗传信息，因此是非感染性的。在某些实例中，VLP可包含单一蛋白质种类，或者多种蛋白质种类。对于包含多种蛋白质种类的VLP来说，蛋白质种类可以来自同一病毒物种，或者可包含来自不同病毒物种、属、亚科或科(根据ICTV命名法所命名)的蛋白质。在另一些实例中，VLP所包含的一种或多种蛋白质种类可来自对天然序列的修饰。VLP可在合适宿主细胞(包括植物和昆虫宿主细胞)中生产。从宿主细胞中提取之后，经过分离以及在合适条件下进一步纯化，可将VLP纯化为完整结构。

本发明还包括但不限于这样的源自流感病毒之VLP，其获得来自表达该VLP蛋白之细胞的质膜的脂质包膜。例如，如果VLP在基于植物的系统中表达，则VLP可获得来自细胞质膜的脂质包膜。

通常，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性)天然分子。更具体地说，该术语也用于表示脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，以及磷脂)以及其他含脂溶性固醇的代谢物或固醇。磷脂以及糖脂、固醇和蛋白质是所有生物膜的主要组分。磷脂的实例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。固醇的实例包括动物固醇(例如胆固醇)和植物固醇。已经在多种植物物种中鉴定出超过200种植物固醇，最常见的是菜油固醇、豆固醇、麦角固醇、菜子固醇、δ-7-豆固醇、δ-7-燕麦固醇、胡萝卜苷(daunosterol)、谷固醇、24-甲基胆固醇、胆固醇或β-谷固醇。如本领域技术人员所了解地，细胞质膜的脂质组成可随着细胞或从中获得细胞之生物的培养或生长条件而变化。

细胞膜通常包含脂双层以及用于多种功能的蛋白质。可在脂双层中发现局部富集的特定脂质，称为“脂筏”。不希望受理论的限制，脂筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染原的进入或释出、细胞间信号转导、与细胞或生物其他结构组分(例如胞内和胞外基质)的相互作用中具有重要作用。

根据本发明，由流感病毒来源之蛋白质产生的VLP不包含M1蛋白。已知M1蛋白结合对于VLP制备物来说属于杂质的RNA(Wakefield和Brownlee，1989)。在获得VLP产品的监管批准时，不期望存在RNA，因此不含RNA的VLP制备物是有优势的。

根据本发明的一些方面，在植物中生产的VLP可与植物来源的脂质相复合。VLP可包含HA0、HA1或HA2肽或其组合。植物来源的脂质可以是脂双层的形式，还可包含围绕VLP的包膜。植物来源的脂质可包含生产VLP之植物的质膜的脂质组分，其包括一种或多种植物来源脂质(例如但不限于磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、鞘糖脂、植物固醇或其组合)。或者，植物来源的脂质可称为“植物脂质”。

在植物中，流感VLP从质膜出芽，因此VLP的脂质组分反映其来源。根据本发明生产的VLP包含与植物来源脂质相复合的HA。植物脂质可激活特异性免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)构成，还含有鞘糖脂、皂苷和植物固醇。另外，植物质膜中也发现了脂筏，这些微区域富含鞘脂类和固醇类。在植物中，已知存在多种植物固醇，包括豆固醇、谷固醇、24-甲基胆固醇和胆固醇(Mongrand等人，2004)。

PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞例如抗原呈递细胞(APC)(如树突状细胞和巨噬细胞)以及其他细胞(包括胸腺和肝脏中的B和T淋巴细胞)表达的CD1分子(Tsuji M，2006)。CD1分子在结构上类似于I类主要组织相容性复合体(MHC)分子，其作用是将糖脂抗原呈递给NKT细胞(自然杀伤T细胞)。一经活化，NKT细胞激活固有免疫细胞(例如NK细胞和树突状细胞)，并激活获得性免疫细胞(如产生抗体的B细胞和T细胞)。

质膜中可发现多种植物固醇，其具体组分可根据物种、生长条件、营养资源或病原体状态等因素而不同。一般来说，β-谷固醇是丰度最高的植物固醇。

流感VLP中存在的与脂双层相复合的植物固醇(例如质膜来源的包膜)可提供有利的疫苗组合物。不希望受理论的限制，与脂双层(例如质膜来源的包膜)相复合的植物制备之VLP可诱导比其他表达系统中所制备之VLP更强的免疫反应，并且其可类似于活病毒或减毒全病毒疫苗诱导的免疫反应。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了与植物来源之脂双层相复合的VLP。在一些实施方案中，植物来源的脂双层可包含VLP的包膜。

8-组合物

因此，本发明提供了包含有效剂量VLP和可药用载体的组合物，所述VLP包含流感病毒HA蛋白、一种或多种植物脂质。所述流感病毒HA蛋白可以是H5(印度尼西亚)。还提供了在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法。所述方法包括施用包含流感病毒HA蛋白、一种或多种植物脂质的病毒样颗粒和可药用载体。所述病毒样颗粒可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

9-治疗方法

本发明提供了在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力或“激发免疫应答”的方法，所述方法包括施用本文定义的组合物。

“免疫应答”一般是指获得性免疫系统的应答。获得性免疫系统通常包括体液应答和细胞介导的应答。体液应答是由分泌抗体(其在B淋巴细胞谱系的细胞(B细胞)中产生)所介导的免疫力方面。分泌的抗体与侵入微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原结合，所述抗原对它们进行了标记以供破坏。体液免疫通常用于表示抗体产生和伴随其的过程，以及抗体的效应物功能(包括Th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞产生、调理素促进的噬菌作用、病原体清除等)。

细胞介导的应答是不涉及抗体而涉及应答于抗原之巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的活化以及多种细胞因子释放的免疫应答。细胞介导的免疫力通常用于表示某些Th细胞活化、Tc细胞活化和T细胞介导应答。细胞介导的免疫力对于病毒感染的应答来说特别重要。

本发明的重组HA VLP可与现有流感疫苗联用，以补充所述疫苗，使得它们更加有效，并减少所需的施用剂量。如本领域技术人员已知地，所述疫苗可针对一种或多种流感病毒。合适疫苗的实例包括但不限于可购自Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、Sinovac、Chiron、Roche、MedImmune、GlaxoSmithKline、Novartis、Sanofi-Aventis、Serono、Shire Pharmaceuticals等的那些。

如果需要，本发明的VLP可与本领域技术人员已知的合适佐剂混合。此外，所述VLP可用于疫苗组合物中，所述疫苗组合物包含如上定义用于治疗靶标生物的效剂量的VLP。此外，根据本发明生产的VLP可与使用不同流感病毒蛋白质(例如神经氨酸酶(NA))获得的VLP相组合。

因此，本发明提供了在动物或靶标生物中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用包含一种或多种VLP的有效剂量的疫苗。所述疫苗可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

如图6和7所示，体外测定显示针对突变的A/印度尼西亚/5/05H5VLP和其他流感毒株(例如A/越南/1203/04；A/安徽/1/05和A/土耳其/582/06(均为H5N1株))产生之抗体的交叉反应性，而其对于唯一测试的H1N1显示较低的血细胞凝集反应性(图7)。

显著地，与针对野生型H5产生的抗体相比，在突变H5N1(非糖基化H5蛋白)单次给药后产生的抗体在14天后诱导出针对所测试的全部H5株的更高应答，这表明该非糖基化免疫原可提供比野生型更快速的应答。

因此，这些数据证明，植物制得的包含缺少N连接糖之突变H5血凝素病毒蛋白的流感VLP诱导特异性针对致病流感株的免疫应答，并且该应答是交叉反应性，且可以在单次给药后快速产生。

10-对象

可向其施用本发明VLP的对象或靶标生物的实例包括但不限于：人、灵长类、禽类、水禽、候鸟类、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、火鸡、鸡、猪、绵羊、马科动物、马、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、灵猫、貂、石貂、雪貂、家养宠物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其他啮齿动物、海豹、鲸等。这些靶标生物是示例性的，不视为限制本发明的应用和用途。

本发明还涉及感染其他哺乳动物或宿主动物(例如：人、灵长类、马、猪、鸟类、水禽、候鸟类、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、火鸡、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、灵猫、貂、石貂、雪貂、家养宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等)的流感病毒。

特别地，通过如上定义之方法治疗的对象可选自包含以下的组：人、灵长类、马、猪、禽类(鸟类)、水禽、候鸟类、鹌鹑、鸭、鹅、鸡、狗、猫、雪貂、家畜等。特别地，所述对象通常可以是人患者或一般意义的鸟类(包括水禽、候鸟类、家禽，例如鹌鹑、鸭、鹅、火鸡、鸡)，特别是候鸟类或用于人类消费的家禽(鹌鹑、鸭、鹅、火鸡、鸡)。更特别地，所述对象是人。

11-容器、注射器和药盒等

本发明还提供了包含本文所定义组合物的容器。特别地，所述容器包含含有防腐剂的单个单位剂量或多剂量形式。更特别地，所述容器是“即用型”注射器，其预先装入本文定义的组合物或疫苗。

更特别地，本发明还提供了包含含有本文定义之疫苗或组合物的容器以及如何使用/施用所述组合物/疫苗的说明的药盒。

下面仅通过参考如下非限制性实施例的方式详细描述本发明。

实施例1

材料和方法

1.对来自A/印度尼西亚/5/05的野生型H5(SEO ID NO.17)进行突变以获得突变的非糖基化H5。

通过去除位于野生型HA球状头部的糖基化位点N154、N165和N286产生三突变体，更具体地，通过用Ala残基替换糖基化序列模式N-X-T/S中的Thr或Ser来实现。因此，三突变体含有下列三处氨基酸替换：T156A、T167A和S288A(根据起始SEQ ID NO.17编码)。通过Darveau等人(1995)给出的基于PCR的连接方法，使用野生型HA表达载体(660构建体，图4)作为模板进行三处氨基酸替换。

简言之，使用3对不同引物，对作为模板的660pCAMBIA表达载体平行进行三个PCR扩增，所述引物对为：

1)Plato-443c(SEQ ID NO：18)和HA5-T156A.r(SEQ ID NO：19)；

2)HA5-T167A.C(SEQ ID NO：20)和HA5-S288A.r(SEQ ID NO：21)；和

3)HA5-S288A.c(SEQ ID NO.22)和HA(Ind)-SacI.r(SEQ ID NO：23)。

将从三个反应获得的扩增产物混合在一起，并利用该混合物作为模板进行第四个反应(组装反应)，其使用Plato-443c(SEQ ID NO：18)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：23)作为引物。用BamHI(位于质体蓝素启动子中)和SacI(在片段的3′端)消化所得片段，将其克隆进预先用相同酶消化的pCAMBIAPlasto中。所得质粒(称为680)示于图5中(SEQ ID NO：29)。

2.表达盒的组装

所有操作均使用Sambrook和Russell(2001；其通过引用并入本文)的一般分子生物学方案来进行。第一个克隆步骤包括：组装含有苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调节元件的受体质粒。使用寡核苷酸引物XmaI-pPlas.c(SEQ ID NO：24)和SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO：25)从苜蓿基因组DNA扩增质体蓝素启动子和5′UTR序列。用XmaI和SacI消化所得扩增产物，并连接进预先用相同酶消化的pCAMBIA2300(Cambia，Canberra，Australia)中，得到pCAMBIApromo Plasto。类似地，使用引物SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO：26)和EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO：27)从苜蓿基因组DNA扩增质体蓝素基因的3′UTR序列和终止子，用SacI和EcoRI消化产物，然后插入到pCAMBIApromoPlasto的相同位点中，得到pCAMBIAPlasto。

3.H5表达盒的组装

由Epoch Biolabs(Sugar Land，TX，USA)合成编码来自流感毒株A/印度尼西亚/5/05(H5N1；登记号LANL ISDN 125873)之血凝素的片段。SEQ ID NO：28(以及对于突变H5来说的SEQ ID NO：29)示出所产生的含有完整H5编码区(SEQ ID NO.17)的片段，其包含天然信号肽(其侧翼是紧邻起始ATG上游的HindIII位点以及紧邻终止密码子(TAA)下游的SacI位点。通过Darveau等人(1995)给出的基于PCR的连接方法将H5编码区克隆进基于质体蓝素的表达盒中。简言之，使用引物Plato-443c(SEQ ID NO：30)和SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO：31)以及使用pCAMBIA promoPlasto作为模板获得第一PCR扩增产物。平行地，使用引物Plasto-SpHA(Ind).c(SEQ ID NO：6)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：32)以及使用H5编码片段作为模板进行第二扩增。将从两个反应获得的扩增产物混合在一起，并利用该混合物作为第三反应(组装反应)的模板，其使用Plato-443c(SEQ ID NO：4)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：33)作为引物。用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在片段3’端)消化所得片段，并将其克隆进预先用相同酶消化的pCAMBIAPlasto中。所得质粒(称为660)示于图5中，而得自“突变”H5蛋白的质粒称为680。

如Hamilton等人(2002)所述制备HcPro构建物(35HcPro)。对所有克隆进行测序，以确认构建物的完整性。所述质粒用于通过电穿孔(Mattanovich等人，1989)转化根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(AGL1；ATCC，Manassas，VA 20108，USA)。通过限制性酶切确认所有根瘤农杆菌菌株的完整性。

4.植物生物质、接种体的制备，农杆菌渗入以及收获

在装有市售泥炭藓基质的平面中从种子开始培养烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)植株。使植株在温室中在16/8光周期以及白天25℃/夜晚20℃的温度条件下生长。播种三周后，挑出单株的幼苗，移植到盆中，使之在同样环境条件下在温室中再培养3周。转化前，在下文所示的多个时间点，通过从植物掐去芽或者通过对植物进行化学处理去除顶芽和腋芽。

在添加了10mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄西林的YEB培养基(pH 5.6)中培养用质粒660或680转染的农杆菌，直至它们的OD600达到0.6至1.6。使用前对农杆菌悬液进行离心，用渗入介质(10mM MgCl2和10mM MESpH 5.6)重悬。如Liu和Lomonossoff(2002，Journal of Virological Methods，105：343-348)所述进行注射器渗入。对于真空渗入而言，对根瘤农杆菌悬液进行离心，用渗入介质进行重悬，并在4摄氏度下保存过夜。在渗入当天，用2.5倍培养体积对培养物批次进行稀释，并在使用前使之变温暖。在20-40Torr真空下的气密不锈钢罐中，将烟草本塞姆氏的整个植株倒置于细菌悬液中2分钟。注射器渗入或真空渗入之后，将植物放回温室，孵育4-5天直至收获。

5.叶取样和总蛋白质提取

孵育后，收获植株的气生部分，在零下80摄氏度下冷冻，切成小块。通过在3倍体积的冷50mM Tris(pH7.4)、0.15M NaCl和1mM苯甲基磺酰氟中对冷冻-切碎植物材料的每个样品进行匀浆(Polytron)来提取总可溶性蛋白。匀浆之后，在4摄氏度下以20,000g将浆液离心20分钟，将澄清的粗提物(上清)留作分析。通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)使用牛血清白蛋白作为参照标准品测定澄清粗提物的总蛋白质含量。

6.蛋白质分析和免疫印迹

通过BCA蛋白质测定(Pierce Biochemicals，Rockport IL)测定蛋白质浓度。通过在还原条件下进行SDS-PAGE以及用考马斯蓝进行染色来分离蛋白质。扫描经染色的凝胶，用ImageJ软件(NIH)进行光密度测定分析。

使用丙酮沉淀来自SEC洗脱级分的蛋白质(Bollag等人，1996)，用1/5体积的平衡/洗脱缓冲液进行重悬，在还原条件下通过SDS-PAGE进行分离，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)用以免疫检测。免疫印迹之前，在4摄氏度下用Tris缓冲盐溶液中5％脱脂乳和0.1％吐温20(TBS-T)将膜封闭16-18h。

通过与下述抗体一起孵育进行免疫印迹：为检测H1，小鼠抗A型流感病毒单克隆抗体(Fitzgerald Industries International，Concord，MA，USA，货号10-I50)(在含有2％脱脂乳的TBS-吐温20(0.1％)中为2μg/ml)；为检测H5，兔抗H5(越南)抗体(Immune Technology，Woodside，NY，USA，货号IT-003-005V)(用含有2％脱脂乳的TBS-吐温20(0.1％)以1/4000进行稀释)。过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA，USA，货号115-035-146)(用含有2％脱脂乳的TBS-吐温20(0.1％)以1/12000稀释)用作第二抗体。通过化学发光法使用鲁米诺作为底物(Roche Diagnostics Corporation)检测免疫反应复合物。通过使用EZ-Link

活化过氧化物酶缀合试剂盒(Pierce，Rockford，IL)将人IgG抗体与辣根过氧化物酶进行缀合。

H5的血液凝集测定基于Nayak.和Reichl(2004)所述的方法。简言之，在含有100μL PBS的V形底96孔微量滴定板中制备测试样品的连续二倍稀释物(100μL)，每孔留下100μL的稀释样品。将一百微升0.25％马红细胞悬液(Bio Link Inc.，Syracuse，NY)加至每个孔，将平板在室温下孵育2小时。显示完全血液凝集的最高稀释度的倒数记为HA活性。平行地，用PBS稀释重组HA标准品(A/越南/1203/2004H5N1)(Protein Science Corporation，Meriden，CT)，在每个平板上用作对照。

7.H5VLP纯化

使用市售搅拌器在1.5倍体积的50mM Tris(pH8)、NaCl 50mM和0.04％焦亚硫酸钠中对冷冻的经660-或680-渗入的烟草本塞姆氏叶进行匀浆。向所得提取物添加1mM PMSF，用1M乙酸调节到pH6，然后在42摄氏度下加热5分钟。向经热处理的提取物添加硅藻土(DE)，以吸收由pH变化和热处理而沉淀下来的杂质，通过Whatman滤纸过滤浆液。在室温下将所得澄清提取物以10,000×g离心10分钟，除去残余DE，通过0.8/0.2μm Acropack 20滤器，并加样至胎球蛋白-琼脂糖亲和柱(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO，USA)。使用400mM NaCl、25mM Tris(pH 6)的清洗步骤之后，用1.5M NaCl、50mM MES(pH6)洗脱所结合的蛋白。向洗脱的VLP添加吐温-80至终浓度0.0005％(体积/体积)。利用100kDa MWCO Amicon膜浓缩VLP，在4摄氏度下以10000×g离心30分钟，并用含有0.01％吐温-80和0.01％硫柳汞的PBS(pH7.4)进行重悬。在使用前，将悬浮的VLP进行过滤除菌。

8.动物研究

使用6-8周龄雌性Wistar大鼠(Charles River Laboratories)进行针对流感VLP施用之免疫应答的研究。将13只大鼠随机分到3组中，其中对照组3只，植物制备VLP H5野生型疫苗(660)和突变体(680)疫苗组各5只。8组用于肌内免疫，6组用于测试鼻内施用途径。所有组均使用两剂方案进行免疫，加强免疫在初次免疫后14天进行。

对于在后腿内的肌内施用，用植物制备的VLP H5疫苗(15μg)、植物制备的VLP H5突变体形式疫苗或PBS免疫未麻醉大鼠。

在免疫前，以1∶1的体积比将所有抗原制剂与Alhydrogel(明矾；Accurate Chemical and Scientific Corporation，Wesbury，NY，US)混合至终浓度1％。

血液收集和脾脏收集

在初次免疫后14天和二次免疫后14天对麻醉动物进行颈静脉血收集。通过8000g离心10分钟收集血清。

二次免疫后三周，用CO2气体麻醉动物，停止后立刻使用心脏穿刺收集血液。

对大鼠进行脾脏收集。将收集的脾脏置于添加庆大霉素的RPMI中，在50ml圆锥试管中用10ml注射器的推杆将其捣碎。将捣碎的脾脏清洗两遍，以2000rpm离心5分钟，重悬于ACK裂解缓冲液中室温保持5分钟。将脾细胞在PBS-庆大霉素中清洗，重悬于5％RPMI中并计数。将脾细胞用于增殖测定。

抗体效价：

A/越南/1203/2004(H5N1)；A/安徽/1/05(H5N1)；A/土鸡/土耳其/1/05(H5N1)；A/新喀里多尼亚/20/99(H1N2)

在第一次免疫后14天和第二次免疫后21天(处死时)测定血清的抗流感病毒抗体效价。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)使用灭活病毒A/印度尼西亚/5/05作为包被抗原测定效价。终点效价表示为：达到比阴性对照样品的OD值高出至少0.1的OD值时最高稀释度的倒数值。

对于抗体分类测定(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM)，通过如上所述的ELISA评估最终放血的效价。

血液凝集抑制(HI)效价

在第二次免疫后14和35天测定血清的血液凝集抑制(HI)效价，如前所述(WHO 2002；Kendal 1982)。使用来自毒株A/印度尼西亚/5/05、A/安徽/1/05(H5N1)、A/火鸡/土耳其/1/05(H5N1)或A/越南/1203/2004的灭活病毒制剂测试大鼠血清样品的HI活性。用从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)制备的受体破坏酶II(receptor-destroying enzyme II，RDE II)(Denka Seiken Co.，Tokyo，Japan)对血清进行预处理(Kendal 1982)。用0.5％马红细胞进行HI测定。HI抗体效价定义为：造成完全凝集抑制的最高稀释度的倒数。

结果

在第一次免疫后14天(第14天)或第二次免疫后14天(第35天)评估来自用野生型VLP或突变VLP免疫的大鼠的血清反应性。用与明矾一起配制的15μg抗原免疫所有大鼠。评估针对下列H5N1病毒的免疫反应性：进化枝1(A/越南/1203/04)、进化枝2.1(A/印度尼西亚/5/05)、进化枝2.2(A/火鸡/土耳其/1/05)和进化枝2.3(A/安徽/1/05)。第一次给药后，对于所有检测的H5N1株，突变的VLP诱导比野生型更高的抗体反应(图6)。在第一次给药后，针对禽类毒株A/火鸡/土耳其/1/05的免疫反应性具有统计学显著性(p＜0.05)。还评估了针对H1N1病毒(A/新喀里多尼亚/20/99)的免疫反应性，其显示在加强注射后的免疫反应性。GMT：效价几何平均值。值为每组五只大鼠倒数终点效价的GMT(In)。短棒表示平均偏差。^＊相比于野生型VLP，p＜0.05。

在第一次免疫后14天(第14天)或第二次免疫后14天(第35天)评估用野生型或突变VLP免疫的大鼠的HI效价。使用灭活全H5N1病毒测定HI抗体应答。第一次免疫后，针对所测的全部H5N1病毒，突变VLP诱导出比野生型VLP更高的HI抗体应答(图7)。对于A/印度尼西亚/5/05和A/火鸡/土耳其/1/05流感毒株，达到了统计学显著性。GMT：效价几何平均值。值为每组五只大鼠倒数终点效价的GMT(In)。短棒表示平均偏差。^＊相比于野生型VLP，p＜0.05。

这些数据强烈表明，对于生产作为广谱快速作用流感疫苗的VLP而言，“突变的”非糖基化H5蛋白是天然H5蛋白的非常具有吸引力的替代物。

所有引文通过参考并入本文。

本发明通过一个或多个具体实施方案进行描述。但是，本领域技术人员会了解，在不脱离权利要求所限定的发明范围的前提下，可进行多种变化和修改。

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Claims

1.具有HA1结构域的流感病毒血凝素(HA)分子，其中所述HA1结构域完全或部分不含N-连接糖基化。

2.根据权利要求1的流感病毒血凝素(HA)分子，其中HA1结构域中一个或多个N-连接糖基化位点被消除，所消除的糖基化位点最初存在于该蛋白质的免疫原性球状头部分上。

3.根据权利要求2的流感病毒血凝素(HA)分子，其中所述被消除的糖基化位点在所述免疫原性球状头部的受体结合亚结构域内或附近或者在所述HA1结构域的F′2亚结构域内或附近。

4.根据权利要求3的HA分子，其中所述糖基化位点由糖基化识别三联体N-X-S/T组成，其中N是天冬酰胺，X是除脯氨酸外的任意氨基酸，S是丝氨酸以及T是苏氨酸。

5.根据权利要求4的HA分子，其中糖基化识别三联体N-X-S/T中所包含的一个或多个天冬酰胺残基被非天冬酰胺氨基酸所替换。

6.根据权利要求5的HA分子，其中所述天冬酰胺残基由选自下列的氨基酸所替换：Leu、Ile、Val、Thr、Ser和Ala。

7.根据权利要求6的HA分子，其中所述天冬酰胺残基被丙氨酸所替换。

8.根据权利要求4或5的HA分子，其中糖基化识别三联体N-X-S/T中所包含的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基被非丝氨酸和非苏氨酸氨基酸所替换。

9.根据权利要求8的HA分子，其中糖基化识别三联体N-X-S/T中所包含的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基被选自下列的氨基酸所替换：Ala、Val、Ile和Leu。

10.根据权利要求9的HA分子，其中所述丝氨酸或苏氨酸残基被丙氨酸所替换。

11.根据权利要求1至10中任一项的HA分子，其中所述糖基化位点在与位于39至331位氨基酸之间任何三联体对应的位置，其中根据毒株A/越南/1194/04进行编码，其中所述被消除的N-糖基化位点使得HA分子对于特异性针对天然HA分子的抗体更具有抗原性。

12.根据权利要求11中任一项的HA分子，其中所述糖基化位点在选自154、165和286的位置。

13.根据权利要求12的HA分子，其具有一个被消除的糖基化位点。

14.根据权利要求12的HA分子，其具有两个被消除的糖基化位点。

15.根据权利要求12的HA分子，其具有三个被消除的糖基化位点。

16.根据权利要求1至15中任一项的流感血凝素(HA)，其中所述流感是A型和B型。

17.根据权利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述流感是B型。

18.根据权利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述HA来自选自下列的一种或多种A亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

19.根据权利要求18的流感血凝素(HA)，其中所述HA亚型是选自下列的一种或多种亚型：H1、H2、H3、H5、H7、H9和H10。

20.根据权利要求19的流感血凝素(HA)，其中所述HA亚型是选自下列的一种或多种亚型：H1、H3、H5和H7。

21.根据权利要求16的流感血凝素(HA)，其中所述流感血凝素是B型或A型H3亚型。

22.包含编码权利要求1至21中任一项之流感HA分子的核苷酸序列的核酸。

23.根据SEQ ID NO.17定义的核酸，其中编码选自154、165和286位的氨基酸的一个或多个残基编码非天冬酰胺。

24.根据权利要求23的核酸，其中编码选自154、165和286位的氨基酸的所述一个或多个残基编码丙氨酸。

25.根据SEQ ID NO.17定义的核酸，其中编码选自154+2、165+2和286+2位的氨基酸的一个或多个残基编码非丝氨酸和非苏氨酸。

26.根据权利要求25的核酸，其中编码选自154+2、165+2和286+2位的氨基酸的所述一个或多个残基编码丙氨酸。

27.与权利要求23、24、25或26的核酸具有90％同一性的核酸。

28.根据SEQ ID NO：29定义的核酸。

29.与SEQ ID NO：29具有90％同一性的核酸。

30.包含权利要求22至29中任一项的核酸的表达盒，所述核酸与在非唾液酸化宿主生物中有活性的调节区域有效连接。

31.根据权利要求30的表达盒，其中所述调节区域选自：质体蓝素调节区；napin启动子、cruciferin启动子，或获得自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶(RuBisCO)、叶绿素a/b结合蛋白、ST-LS的调节区，多面体启动子和gp64启动子。

32.根据权利要求31的表达盒，其中所述质体蓝素调节区来自苜蓿(Medicago sativa)。

33.在非唾液酸化宿主生物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括：

a)引入权利要求22至29中任一项的核酸，所述核酸与在非唾液酸化宿主生物或其部分中有活性的调节区有效连接，以及

b)在允许所述核酸表达的条件下孵育该宿主或其部分，从而生产所述VLP。

34.根据权利要求33的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述核酸可以在所述宿主中瞬时表达或者在所述宿主中稳定表达。

35.根据权利要求33或34的方法，其中所述非唾液酸化宿主生物选自：植物、昆虫和酵母。

36.根据权利要求35的方法，其中所述植物选自：植物细胞、整株植物或其部分。

37.根据权利要求36的核酸，其中所述植物细胞来自烟草本塞姆氏(N.benthiamina)。

38.根据权利要求33的方法，其还包括步骤c)：收获所述宿主并纯化所述VLP。

39.包含具有HA1结构域之流感血凝素分子的病毒样颗粒(VLP)，其中所述HA1亚结构域中的一个或多个N-连接糖基化位点已被消除。

40.根据权利要求39的VLP，其中所述VLP是免疫原性的。

41.由权利要求22至29中任一项的核酸编码的病毒样颗粒(VLP)。

42.病毒样颗粒(VLP)，其包含权利要求1至21中任一项的流感病毒HA蛋白质以及一种或多种宿主脂质。

43.根据权利要求41或42的病毒样颗粒，其中所述宿主脂质是植物脂质。

44.根据权利要求41、42或43的病毒样颗粒(VLP)，其包含带有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖的流感病毒HA。

45.根据权利要求44的病毒样颗粒(VLP)，其中所述流感HA蛋白质是H5印度尼西亚。

46.权利要求39至45中任一项的VLP在制备用于预防或治疗对象中病毒感染之疫苗中的用途。

47.根据权利要求46的用途，其中所述对象选自：人或鸟类。

48.权利要求39至45中任一项的VLP用于预防或治疗对象中流感病毒感染的用途。

49.根据权利要求48的用途，其中所述对象选自：人或鸟类。

50.包含有效剂量的权利要求39至45中任一项之VLP的组合物，其与可药用载体相混合。

51.根据权利要求50的组合物，其中所述可药用载体适于经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

52.用于对具有患流感病毒病之风险的个体进行免疫的组合物，所述组合物包含：与可药用载体混合的权利要求39至45中任一项的VLP。

53.根据权利要求52的组合物，其中所述组合物采用液体、混悬液、固体或粉末形式。

54.根据权利要求53的组合物，其中所述组合物适于经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

55.包含免疫有效剂量的权利要求39至45中任一项的VLP的疫苗组合物，其与含有或不含佐剂的可药用载体相混合。

56.根据权利要求55的疫苗，其中所述可药用载体适于经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

57.根据权利要求56的疫苗，其不含所述佐剂。

58.病毒疫苗，其包含：与生理可接受之赋形剂或佐剂相混合的权利要求39至45中任一项的VLP。

59.根据权利要求58的疫苗，其为人或禽类疫苗。

60.根据权利要求59的疫苗，其适于在症状出现之前用于预防；或者适于在症状出现之后治疗感染。

61.在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，所述方法包括施用病毒样颗粒以及可药用载体，所述病毒样颗粒包含权利要求1至21中任一项的流感病毒HA蛋白或者由权利要求22至29中任一项的核酸所编码的流感病毒HA蛋白、一种或多种宿主脂质。

62.根据权利要求61的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。

63.在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用有效剂量的权利要求50的组合物或权利要求55的疫苗。

64.在对象中诱导针对流感病毒感染之免疫力的方法，其包括施用权利要求39至45中任一项的病毒样颗粒。

65.根据权利要求64的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。

66.根据权利要求61至65中任一项的方法，其中所述对象选自包含以下的组：人、灵长类、马、猪、鸟类(禽类)、水禽、候鸟类、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、灵猫、貂、石貂、雪貂、家养宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。

67.根据权利要求66的方法，其中所述对象选自：人和鸟类。

68.根据权利要求67的方法，其中所述对象是人。

69.包含权利要求55之疫苗的容器。

70.根据权利要求69的容器，所述容器含有单次单位剂量。

71.根据权利要求69的容器，所述容器采用多剂量形式。

72.根据权利要求69、70或71的容器，所述容器是注射器。

73.预装有权利要求55之疫苗的注射器。

74.包含权利要求69至73中任一项之容器以及如何使用/施用所述疫苗之说明的药盒。

75.用权利要求22至29中任一项之核酸转化的植物细胞。

76.根据权利要求75的植物细胞，其是被瞬时或稳定转化的。

77.用权利要求22至29中任一项之核酸转化的植物部分。

78.根据权利要求77的植物部分，其是被瞬时或稳定转化的。

79.用权利要求22至29中任一项之核酸转化的植物。

80.根据权利要求79的植物，其是被瞬时或稳定转化的。

81.用权利要求30、31或32的表达盒转染的农杆菌属(Agrobacterium)细胞。