MX2011000657A - Epitopo de inmunizacion de nuevo virus de la influenza. - Google Patents

Epitopo de inmunizacion de nuevo virus de la influenza.

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Abstract

Se proporciona un método para sintetizar partículas tipo virus de influenza (VLPs) dentro de una planta o una parte de una planta. El método implica la expresión de una proteína HA de influenza novedosa en plantas y su purificación. La invención también se dirige a VLP que comprenden proteína HA de influenza y lípidos de plantas. La invención también se dirige a un ácido nucleico que codifica influenza HA mejorada así como vectores. Las VLPs se pueden usar para formular vacunas de influenza, o se pueden usar para enriquecer las vacunas existentes.

Description

EPITOPO DE INMUNIZACION DÉ NUEVO VIRUS DE LA INFLUENZA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la producción de partículas tipo virus. Más específicamente, la presente invención se dirige a la producción de partículas tipo virus que comprenden antígenos de influenza, más particularmente antígenos de influenza modificados que tienen amplia reactividad cruzada con otras cepas de influenza.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La influenza es la principal- causa de muerte en humanos debido a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, falta de aliento, y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, el virus de la influenza infecta 10-20% de la población mundial, que conduce a 250-500,000 muertes anualmente.
Los virus de la influenza son virus envueltos que brotan de la membrana de plasma de células de mamífero infectado. Se clasifican en tipos A, B, o C, basado en las nucleoproteínas y antígenos de proteína de matriz presentes. Los virus de la influenza tipo A se pueden además dividir en subtipos de acuerdo con la combinación . de glicoproteinas de superficie de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentadas. HA gobierna la capacidad de el virus para enlazar a y atravesar la célula hospedera. NA remueve residuos de ácido siálico terminal de cadenas de glicano sobre célula hospedera y proteínas de superficie viral, que previene agregación viral y facilita la movilidad del virus. Actualmente, 16 subtipos HA (Hl - H16) y 9 NA (N1-N9) se reconocen. Cada virus de influenza tipo A presenta un tipo de HA y un tipo de glicoproteína NA. Generalmente, cada subtipo exhibe especificidad de especies; por ejemplo, todos los subtipos HA y NA se conoce, que infectan a las aves, mientras que solamente los subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, NI, N2, N3 y N7 han mostrado que infectan a humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Los virus de la influenza¦ que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas más altamente patogénicas de los virus de la influenza A, y son más probables de causar pandemias futuras.
Las pandemias de influenza usualmente son causadas por los virus de la influenza altamente transmisibles y virulentos, y pueden llevar a niveles elevados de enfermedad y muerte en el mundo. La aparición de nuevos subtipos de influenza A resulta en 4 pandemias importantes del siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918-1919 llevó a la muerte de más de 50 millones de personas en el mundo entre 1917 y 1920. Actualmente, el riesgo de la aparición de un nuevo subtipo, o de la transmisión a humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. De particular preocupación es una forma altamente virulenta de influenza aviar (también llamada "gripe aviar") , los brotes de los cuales se han reportado en diversos países alrededor del mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede resultar en velocidad de mortalidad que se acerca 100% dentro de 48 horas. El despliegue del virus de la influenza aviar (H5N1), primero identificado en Hong Kong en 1997, a otros países de Asia y Europa se han postulado para ligarse a los patrones migratorios de aves silvestres.
El método actual para combatir la influenza en humanos es por vacunación anual. La vacuna es usualmente una combinación de diversas cepas que se prevé que son las cepas dominantes para la próxima "temporada de gripe". La predicción se coordina por la Organización Mundial de la Salud. Generalmente, el número de dosis de vacuna producida cada año no es suficiente para vacunar a la población mundial. Por ejemplo, Canadá y los Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar alrededor de un tercio de su población, mientras que solamente el 17% de la población de la Unión Europea se pueden vacunar. Es evidente que la producción mundial actual de vacuna de influenza podría ser insuficiente en el caso de una pandemia de gripe en todo el mundo. Aún si la producción anual necesaria podría de alguna manera atenderse en un año determinado, las cepas dominantes cambian de año a año, almacenar por lo tanto en tiempo de baja necesidad en el año no es práctico. La producción a gran escala, económica de una vacuna de influenza efectiva es de interés importante para el gobierno e industria privada por igual.
Actualmente, las reservas virales de la fuente más importante para usar en vacunas se producen en huevos fertilizados. Las partículas de virus se cosechan, y para una vacuna viral desactivada, interrumpido por el detergente para desactivarlo. Las vacunas vivas atenuadas se hacen de virus de influenza que se adaptan para el crecimiento a baja temperatura lo que. significa que en temperatura del cuerpo normal, la vacuna se atenúa. Tal vacuna se autoriza en EUA para usar en individuos de 5 hasta 49 años de edad. Las vacunas de virus completo inactivadas se hacen inofensivas por inactivación con agentes químicos y se han producido en huevos embriónicos o cultivo celular de mamífero. Todos esto's tipos de vacunas muestran algunas ventajas y desventajas específicas. Una ventaja de las vacunas derivadas de virus completo es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, vacunas divididas inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras que las vacunas hechas de virus completo inducen tanto un anticuerpo (humoral) como respuesta celular. Aunque una respuesta de anticuerpo funcional es un criterio para obtener licencia que se correlaciona con protección inducida por una vacuna, cada vez hay más evidencia de que una respuesta de célula T también es importante en inmunidad de influenza - esto también .puede proporcionar mejor protección en las personas mayores.
Con objeto de inducir una respuesta inmunitaria celular, las vacunas hechas de virus completo se desarrollaron. Debido a la alta patogenicidad de la cepa de la influenza (por ejemplo, H5N1), estas vacunas se producen en medio BL3+. Para cepas de influenza altamente patogénicas tal como H5N1, algunos fabricantes han modificado la secuencia de gen de hemaglutinina con objeto de reducir la patogenicidad de la cepa de influenza y para hacerla avirulenta y más fácilmente producidas en huevos embriónicos o cultivo celular de mamífero. Otros también usan cepas de influenza recombinante en las cuales las secuencias genéticas para las proteínas de hemaglutinina y neuraminidasa se clonan en un alto rendimiento de cepa de donador de influenza de baja patogenicidad (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007). Mientras que estos métodos pueden producir vacunas útiles, no proporcionan una solución a la necesidad para alto volumen, bajo costo y rápida producción de vacunas en la escala necesaria para cumplir la necesidad mundial en un año normal, y casi con toda seguridad es insuficiente en el caso de una pandemia.
Usando esta tecnología genética inversa, pudiera también ser necesario mutar la secuencia genética de la proteína HA para hacerlo avirulenta. Para cepas de influenza altamente patogénicas, la producción de vacunas de virus completas requieren ya sea procedimientos de confinamiento o las vacunas resultantes no coinciden exactamente con la secuencia genética del virus circulante. En el caso de vacunas atenuadas vivas, todavía hay un riesgo de que la vacuna administrada pueden recombinarse con un virus de influenza del hospedero, que conduce a un nuevo virus de influenza.
Aunque este método mantiene el epítopo antigénico y modificaciones post-traduccionales , hay un número de inconvenientes que incluyen el riesgo de contaminación debido al uso de virus completo y rendimientos de variable dependiendo de la cepa del virus. Los niveles sub-óptimos de protección pueden resultar de heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en huevos. Otras desventajas incluyen amplia planificación para obtener huevos, riesgos de contaminación debido a químicos usados en la purificación, y tiempos de producción largos. También, personas hipersensibles a proteínas de huevo no pueden ser candidatos elegibles para recibir la vacuna.
En el caso de una pandemia, la producción de vacuna dividida se reduce por la necesidad de adaptar la cepa por crecimiento en huevos y los rendimientos de producción variable alcanzados. Aunque esta tecnología se ha usado por años para la producción de vacunas estacionales, difícilmente puede responder en un plazo razonable a una pandemia ya que la capacidad de fabricación en todo el mundo es limitada.
El reciente brote en México de Influenza H1N1 tipo A también pone de relieve la necesidad médica urgente para desarrollar una rápida metodología para producción de vacuna de cepas que recientemente aparecieron.
Para evitar el uso de huevos, los virus de la influenza también se han producido en cultivo celular de mamífero, por ejemplo en MDCK o células PERC.6, o similares. Otro enfoque es genética inversa, en cuyos virus se producen por transformación celular con genes virales. Estos métodos, sin embargo, también requieren el uso de virus completo así como métodos elaborados y ambientes de cultivo específicos.
Diversos productos recombinantes se han desarrollado como candidatos de vacuna de influenza recombinante . Estos enfoques se han centrado en la expresión, producción, y purificación de proteínas HA y. NA de influenza tipo A, incluyendo expresión de estas proteínas usando células de insecto infectadas con baculovirus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999), vectores virales, y constructos de vacuna de ADN (Olsen et al, 1997).
Los específicos de una infección de virus de influenza son bien conocidos. Brevemente, el ciclo infeccioso se inicia por el enlace de la proteína HA de superficie del virión a un receptor celular que contiene ácido siálico (glicoproteínas y glicolípidos ) . La proteína NA media el procesamiento del receptor de ácido siálico, y la penetración de virus en la célula depende de endocitosis mediada por el receptor dependiente de HA. En los límites ácidos de endosomas interiorizados que contienen un virión de influenza, la proteína HA experimenta cambios conformacionales que llevan a fusión de membranas virales y celulares y virus no recubierto y liberación mediada por M2 de proteínas MI de ribonucleoproteínas asociadas con nucleocápsida (RNPs) , que migra en el núcleo celular para síntesis de ARN viral. Los anticuerpos para proteínas HA previene infección de virus por infectividad de virus de neutralización, mientras que los anticuerpos para proteínas NA median su efecto en las etapas tempranas de replicación viral.
Crawford et al. (1999) describen la expresión de influenza HA en células de insecto infectadas con baculovirus. Las proteínas expresadas se describen como que son capaces de prevenir la enfermedad de influenza letal causada por subtipos de influenza H5 y H7 aviar. Johansson et al. (1999) enseña que las proteínas HA y NA de influenza expresadas por baculovirus inducen respuestas inmunitarias en animales superiores a aquellas inducidas por una vacuna convencional. La inmunogenicidad y eficacia de hemaglutinina expresada por baculovirus de virus de influenza de equino se comparó con un candidato de vacuna de ADN homólogo (Olsen et al, 1997). Colectivamente, estos datos demuestran que un alto grado de protección contra enfrentamiento de virus de influenza se puede inducir con proteínas HA o NA recombinantes , usando diversos enfoques experimentales y en diferentes modelos a animales.
Ya que la investigación previa ha mostrado que las glicoproteínas de influenza de superficie, HA y NA, son los objetivos principales para provocar inmunidad protectora contra virus de influenza y ese . MI proporciona un objetivo conservado para inmunidad celular a influenza, un nuevo candidato de vacuna puede incluir estos antígenos virales como una partícula macromolecular de proteína, tal como partículas tipo virus (VLPs) . Como productos de vacuna, las VLPs ofrecen la. ventaja de ser más inmunogénicas que la subunidad o antígenos recombinantes y son capaces de estimular tanto la respuesta inmunitaria humoral como la celular (Grgacic and Anderson, 2006) . Además, la partícula con estos antígenos de influenza pueden exhibir epitopos conforraacionales que provocan anticuerpos de neutralización para múltiples cepas de virus de influenza.
La producción de una cepa de virus de influenza no infecciosa para propósitos de vacuna es una forma para evitar infección accidental. Alternativamente, las partículas tipo virus (VLPs) como sustitutos para el virus cultivado se ha investigado. Las VLPs imitan la estructura de la cápsida viral, pero carece de un. genoma, y por lo tanto no puede replicar o proporcionar un medio para una infección secundaria.
Diversos estudios han demostrado que proteínas de influenza recombinante se auto-ensamblan en las VLP en cultivo celular usando plásmidos de expresión de mamíferos o vectores de baculovirus (Gomez-Puertas et al, 1999; Neumann et al, 2000; Latham and Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) describe que la formación eficiente de VLP de influenza depende de los niveles de expresión de diversas proteínas virales. Neumann et al. (2000) estableció un sistema basado en plásmido de expresión de mamífero para generar partículas como virus de influenza infecciosas completamente de los cADNs clonados. Latham y Galarza (2001) reportan la formación de las VLPs de influenza en células de insecto infectadas con genes que co-expresan baculovirus li ¦ recombinante HA, NA, MI, y M2. Estos estudios demuestran que las proteínas de virión de influenza pueden auto-acumularse sobre co-expresión en células eucarióticas .
Gomez-Puertas et al. (2000) enseñan que, además de la hemaglutinina (HA), la .proteína de matriz (MI) del virus de influenza es esencial para VLP en ciernes de células de insecto. Sin embargo, Chen et al. (2007) enseña que MI no podría requerirse para la formación de VLP, y observa que liberación eficiente de MI y VLPs requiere la presencia de HA y actividad de sialidasa proporcionada por NA. El NA abre los ácidos siálicos de las glicoproteínas en la superficie de las células que producen las VLPs, y que liberan las VLPs en el medio .
Quan et al (2007) enseña que una vacuna VLP producida en un sistema de expresión de baculovirus (célula de insecto) induce una inmunidad protectora contra algunas cepas de virus de influenza (A/PR8/34 (H1N1)). Las VLPs estudiadas por Quan se observaron que brotan de la membrana de plasma, y se consideraron para ser del tamaño correcto y morfología, similar a aquella obtenida en un sistema de mamífero (células MDCK) .
Los virus envueltos pueden obtener su envoltura de lípidos cuando 'germinan' fuera de la célula infectada y obtienen la membrana de la membrana de plasma, o de la de un organelo interno. Las partículas del virus de influenza y las VLPs brotan de la membrana de plasma de la célula hospedera. En sistemas celulares de mamífero o baculovirus, por ejemplo, la influenza brota de la membrana de plasma (Quan et al 2007) .
Solamente unos pocos virus envueltos se conocen que infectan plantas (por ejemplo, miembros de los virus Topoviruses y Rhabdo) . De los virus de planta envueltos conocidos, se caracterizan por germinado de membranas internas de la célula hospedera, y no de la membrana de plasma. Aunque de un pequeño número de VLPs recombinantes se han producido en hospederos de plantas, ninguno se derivó de la membrana de plasma. Las tecnologías dé producción de influenza VLP actual confían .en la co-expresión de múltiples proteínas virales, y esta dependencia representa un inconveniente de estas tecnologías ya que en caso de una pandemia y de epidemias anuales, el tiempo de respuesta es crucial para la . vacunación. Un sistema de producción VLP simple, confía en que la expresión de solamente una proteína viral es deseable para acelerar el desarrollo de la vacuna.
La producción de VLP de influenza HA en un sistema basado en plantas se ha descrito en WO 2009/009876 que esencialmente muestra que la influenza HA es capaz de auto-ensamblarse en células hospederas de planta y brotar de membranas de plasma en partículas tipo virus.
Con objeto de proteger a la población mundial de la influenza y para evitar completamente pandemias futuras, los fabricantes de vacunas necesitarán desarrollar métodos rápidos, efectivos que produzcan dosis de vacuna. El uso actual de huevos fertilizados para producir vacunas es insuficiente e implica un proceso largo. Las proteínas HA usadas son específicas para cada cepa y no tienen reacción cruzada con otras cepas para proporcionar vacunas de espectro más amplio necesitando así producción constante o corto tiempo de reacción una vez que una nueva cepa se identifica.
Ciertas modificaciones y/o mutaciones se pueden traer a la proteína nativa HA usada para producir VLP, tales modificaciones que llevan una proteína de hemaglutinina que tiene más amplio espectro para inducir anticuerpo que neutraliza a más de uno, o diversas cepas de gripe, aún después de solamente una administración sencilla.
SUMARIO DE LA INVENCION Es un aspecto de la invención proporcionar una vacuna de influenza mejorada.
Es un aspecto adicional de la invención proporcionar partículas tipo virus de influenza novedosas.
Es un aspecto adicional de la invención proporcionar una proteina de hemaglutinina que se ha modificado para proporcionar una reacción de anticuerpo de espectro más amplio .
La presente invención contempla un polipéptido que tiene una secuencia de residuo de · aminoácido sustancialmente idéntica a la de una glicoproteina ligada a N envuelta viral pero que está parcialmente o totalmente libre de carbohidratos ligados a N (esto es, tiene uno o más sitios de glicosilación que se suprime cuando se compara con una secuencia HA nativa original) , asi como métodos para producir y utilizar el polipéptido.
Es un aspecto adicional de la invención proporcionar una proteina HA en donde uno o más de los sitios de glicosilación ligados a N del dominio HA1 se ha modificado/eliminado/mutado/removido/suprimido para producir VLPs de influenza para la preparación de una vacuna de influenza de espectro amplio.
Particularmente, el dominio HA1 comprende aminoácidos ubicados en las posiciones 1 hasta 331 como se enumera de acuerdo con la cepa A./Vietnam/1194/04 ; SEQ ID NO.34). Más particularmente, el dominio HA1 comprende la porción principal globular y el dominio F'2 de la proteina, que corresponde a los aminoácidos entre las posiciones 39 hasta 331 de la proteína como se enumera de acuerdo con la cepa A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO.34). Particularmente, el sitio de glicosilación que se suprime se presenta originalmente en la porción principal globular de la proteína, particularmente que corresponde a aminoácidos ubicados entre posiciones 39 hasta 273 de la SEQ ID No.34. Más particularmente, el sitio de glicosilación suprimido se ubica originalmente en el dominio F' 2 de la proteína, particularmente que corresponde a aminoácidos ubicados entre posiciones 274-331 de la SEQ ID NO.34.
La presente invención proporciona sustituciones de aminoácido en la molécula de hemaglutinina (NA) de influenza A que puede alterar la¦ antigenicidad e inmunogenicidad de la HA. Estas sustituciones pueden alterar los sitios antigénicos al alterar la especificidad del receptor y/o enlace anticuerpo-antígeno . En una variedad de modalidades, la antigenicidad incrementada que resulta de la sustitución puede ser útil para la producción de vacunas con reactividad cruzada más amplia para influenza. Particularmente, la sustitución de aminoácido resulta en moléculas con las características de inmunogenicidad de la sustitución de aminoácido de residuo sin asparagina de la proteína HA en la ubicación que corresponde al sitio que enlaza al receptor y particularmente que corresponde a la ubicación 154 y/o 165 y/o 286 (en donde la numeración es de acuerdo con la cepa A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO.34). En modalidades particulares, la sustitución de aminoácido remueve/elimina/suprime un sitio de glicosilación .
La molécula HA de antigenicidad incrementada de virus de influenza puede incluir uno o más aminoácidos no glicosilados que corresponden a posiciones 154 y/o 165 y/o 286 en H5 HA, donde la remoción de cualquiera de estos sitios de glicosilación resulta en una reactividad incrementada con antisueros derivados de un animal expuesto a un virus de influenza con una molécula HA tipo natural.
Con objeto de destruir un sitio de glicosilación, la señal de triada N-X-S/T (donde N es un Asn, X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro, y S/T puede ser tanto Ser como Thr) se puede modificar por producción por ingeniería de proteína. El primer enfoque usado puede ser para reemplazar el Asn por otro aminoácido. El segundo enfoque es para reemplazar el aminoácido S/T en la posición n+2 relativa a la asparagina para glicosilarse, por cualquier otro residuo de aminoácido. Un aminoácido apropiado usado para reemplazar la asparagina, serina o treonina es alanina, pero otro aminoácido se puede también usar. Por ejemplo, Asn se puede reemplazar por Leu, He, Val, Thr, Ser o Ala. También, Ser o Thr se puede reemplazar por Ala, Val, He o Leu.
Particularmente, la molécula HA de antigenicidad incrementada de virus de influenza puede incluir un aminoácido sin asparagina en las posiciones 154 y/o 165 y/o 286 en H5 HA.
La molécula HA de antigenicidad incrementada de virus de influenza puede incluir proteina HA en donde la porción principal carece de sitios de glicosilación ligados a N esto es, todos los tres sitios de glicosilación se han suprimido.
La molécula HA de antigenicidad incrementada de virus de influenza puede incluir uno o más de un sitio de glicosilación que se remueve, seleccionado del grupo que consiste de: N-154, N-165 y N-286 (en donde la numeración es de acuerdo con la cepa A/Vietnam/1194/04 ) .
La presente invención proporciona una hemaglutinina modificada (HA) de diferentes cepas de influenza.
La presente invención también proporciona un método para producir virus de influenza tipo partículas (VLPs) en un organismo hospedero sin sialilación que comprende: a) introducir un ácido nucleico que codifica un antígeno de hemaglutinina (HA) de influenza como se definió arriba, operativamente ligado a una región reguladora activa en un organismo hospedero sin sialilación o una porción del mismo, b) incubar el hospedero o una porción del mismo bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, produciendo de tal modo las VLPs.
La presente invención incluye el método anterior en donde, en la etapa de introducir (etapa a), el ácido nucleico puede ser cualquiera expresado de forma transitoria en el hospedero, o establemente expresado en el hospedero. Por otra parte, las VLPs se pueden purificar usando, por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño.
Adicionalmente la presente invención se refiere a un organismo hospedero sin sialilación usado para la producción de partícula tipo virus (VLP) que comprende una proteína HA de virus de influenza. Particularmente, el hospedero adecuado capaz de producir una VLP, es por ejemplo, una planta o una porción del mismo, una célula de planta, un insecto o una porción del mismo, o una célula de insecto, o una levadura o porción del mismo o una célula de levadura.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una HA de influenza modificada como se definió arriba operativamente ligado a una región reguladora activa en un organismo hospedero sin sialilación. El antígeno puede ser una hemaglutinina (HA) de influenza que carece de uno o más los sitios de glicosilación ligados a N de la porción principal de la molécula (sitios antigénicos que normalmente se presentan en la secuencia nativa) .
La presente invención también proporciona una partícula tipo virus (VLP) que comprende un proteína HA de virus de influenza como se define en la presente y uno o más de un lípido hospedero. Si el hospedero es insecto, entonces la partícula tipo virus (VLP) puede comprender una proteína HA de virus de influenza y uno o más de un lípido de insecto, o si el hospedero es una levadura,, entonces la partícula tipo virus (VLP) puede comprender una proteína HA de virus de influenza y uno o más de un lípido de levadura, si el hospedero es una planta, entonces la partícula tipo virus (VLP) puede comprender una proteína -HA de virus de influenza y uno o más de un lípido de planta.
La invención además proporciona las VLPs que se producen en una planta conteniendo de este modo uno o más de un lípido de origen de planta (generalmente denominados como "lípidos de planta") .
La invención además proporciona las VLPs producidas en células de insecto que comprenden lípidos de la membrana de plasma de células de insecto (generalmente denominados como "lípidos de insecto") .
La invención además proporciona las VLPs producidas en levadura que comprende lípidos de la membrana de plasma de las células de levadura (generalmente denominados como "lípidos de levadura") .
También se incluye en la presente invención una composición que comprende una dosis efectiva de una VLP que comprende una proteina HA de virus de influenza, uno o más de un lipido derivado de una célula de producción de hospedero no sialilante, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser adecuado para administración oral, intradérmica , intranasal, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, o subcutánea.
Además se incluye en la presente invención, una composición de vacuna que comprende una dosis inmunológicamente efectiva de una VLP como se define en la presente en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable con o sin la presencia de un adyuvante. La vacuna se puede administrar oralmente, intradérmicamente , intranasalmente, intramuscularmente , intraperitonealmente , intravenosamente, o subcutáneamente. Particularmente, la vacuna se administra sin el uso de un adyuvante.
La presente invención también proporciona un método para inducir inmunidad a una infección de virus de influenza en un sujeto, el método que comprende administrar al sujeto las partículas tipo virus que comprenden una proteína HA de virus de influenza, uno o más de un lipido hospedero, y un portador farmacéuticamente aceptable. La partícula tipo virus se puede administrar a un sujeto oralmente, intradérmicamente, intranasalmente , intramuscularmente , intraperitonealmente , intravenosamente, o subcutáneamente.
La presente invención se asocia a un método para inducir inmunidad a infección de virus de influenza en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis efectiva de una vacuna que comprende uno o más de una VLP como se define en la presente.
El sujeto que se trata por los métodos como se definieron arriba se puede seleccionar del grupo que comprende humanos, primates, caballos, cerdos, aves (aviar), aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, ganso, aves de corral, pollos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, algalia, visón, marta de piedra, hurones, animales domésticos, ganado, ratones, ratas, foca, ballenas y similares. Particularmente, el sujeto puede ser un paciente humano o aves en general (que incluyen aves acuáticas, aves migratorias, aves de corral tales como codorniz, pato, ganso, pavos, pollos), particularmente aves migratorias o aves de corral para consumo humano (codorniz, pato, ganso, pavos, pollos ) .
La presente invención también proporciona un recipiente tal como una jeringa asi como kits que comprenden tal recipiente, todos de los cuales comprenden la composición de vacuna como se define en la presente.
Este sumario de la invención no necesariamente describe todos los aspectos de la invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Estas y otras características de la invención se harán más evidentes de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los dibujos anexos en donde: La Figura 1A representa la localización de sitios de glicosilación en el virus de influenza HA H5 A/Indonesia/5/05. La identidad de aminoácidos, posición, y ubicación se indican por analogía en la estructura de la A/Vietnam/1194/04 ; SEQ ID NO. 34 (archivo PDB: 2IBX) . El triple mutante se ha hecho por la destrucción de los sitios de glicosilación N154, N165, y N286 ubicados en la cabeza globular. El estudio de Bright et al. (2003) se ha usado para ubicar los sitios antigénicos potenciales. El tipo de glicosilación se ha determinado basado en lo gue se escribe en la literatura alrededor de HAs Hl, H3 y H7 (Abe Y. et al. (2004); Vigerust DJ et al (2007); y Kuroda et al. (1990); La Figura IB es una ilustración de los subdominios del monómero HA: Los subdominios- F'l (1-38 como se enumeran de acuerdo a A/Vietnam/1194/0 ; SEQ ID NO.34), subdominios F'2 (274-331) y F se representan. El sitio que enlaza el receptor y sub-dominios de esterasa que juntos forman la cabeza globular (39-273). El péptido de fusión se representa como una caja blanca. El TmD y la cola celular no se puede ver en cualquiera de las estructuras HA ya que solamente los productos de bromelina solubles de las HAs se han cristalizado y la estructura ha sido dilucidada; La Figura 2 representa las estructuras de un monómero de HA de diferentes subtipos A. La bicapa de lipido, con su contraparte alifática y su cabeza polar se representa asi. Las estructuras se toman de Ha et al (Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) H5 aviar; La Figura 3 muestra una secuencia de un cásete de expresión basado en plastocianina de alfalfa usada para la expresión de Hl de acuerdo con una modalidad de la presente invención (SEQ ID NO: 8). El péptido de señal de isomerasa (PDI) de bisulfuro de proteina se subraya. Los sitios de restricción BglII (AGATCT) y Sad (GAGCTC) usados para clonación se muestran en negritas; La Figura 4 muestra una representación de plásmido 660 ensamblado para la expresión de subtipo H5 tipo HA natural de A/Indonesia/5/05; La Figura 5 muestra una representación de plásmido 680 ensamblado para la expresión de subtipo H5 HA mutado no glicosilado de A/Indonesia/5/05; La Figura 6 muestra concentraciones de anticuerpo contra Virus inactivados completos ( IV) después de la primera y segunda dosis. La reactividad de sueros de ratas inmunizadas con ya sea la VLP tn o el triple mutante VLP (no glicosilado) se evaluó después de la primera (14 días) o la segunda inmunización (35 días). La inmunoreactividad se evaluó contra diversos virus H5N1; La Figura 7 representa concentraciones de anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (HI) después de la primera y segunda dosis. Los concentraciones HI de ratas inmunizadas con la VLP tn o el triple mutante (no glicosilado) se evaluaron 14 días después de la primera (Día 14) o la segunda (Día 35) inmunización. La inmunoreactividad se evaluó contra diversos virus H5N1 y un virus H1N1; La Figura 8 representa el listado de secuencias para una HAO de influenza; La Figura 9 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H2; La Figura 10 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H3; La Figura 11 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H4; La Figura 12 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H5; La Figura 13 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H6; La Figura 14 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H7 ; La Figura 15 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H8; La Figura 16 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H9; La Figura 17 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H10; La Figura 18 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo Hll; La Figura 19 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H12; La Figura 20 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H13; La Figura 21 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H14; La Figura 22 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H15; La Figura 23 representa el listado de secuencias para una proteína HA de influenza subtipo H16; La Figura 24 representa el listado de secuencias para el vector de expresión 660 pCAMBIA que contiene la secuencia H5 tipo natural completa; Las Figuras 25A-25J representan el listado de secuencias de los cebadores usados para amplificación PCR; La Figura 26 representa el listado de secuencias para el fragmento producido, que contiene la región que codifica H5 completo incluyendo el péptido de señal nativo flanqueado por un sitio HindIII inmediatamente cadena arriba del ATG inicial, y un sitio Sad inmediatamente cadena abajo del codón de detención (TAA) ; La Figura 27 representa el listado de secuencias para el fragmento producido, que contiene la región que codifica H5 completo modificado para remover todos los tres sitios de glicosilación, incluyendo el péptido de señal nativo flanqueado por un sitio HindIII inmediatamente cadena arriba del ATG inicial, y un sitio SacI inmediatamente cadena abajo del codón de detención (TAA) ; Las Figuras 28 A-28D representan los listados de secuencias por cebadores para amplificación PCR.
La Figura 29 representa la secuencia de aminoácido de H5 maduro de la cepa A/Vietnam/1194/04 ; y Las Figuras 30 A-30B representan las secuencias de ácido nucleico y aminoácido respectivamente del HA maduro de la cepa B/Florida/4/2006.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de partículas tipo virus (VLP) . Más particularmente, la présente invención se dirige a la producción de partículas tipo virus que comprenden antígenos de influenza.
La siguiente descripción es de una modalidad particular.
Proteína 1-HA Como se usa en la presente, una "proteína" se refiere generalmente a una serie de aminoácidos conectados por un enlace de péptido, que se puede plegar en estructura secundaria, terciaria o cuaternaria para lograr una morfología particular. Alternativamente, los términos polipéptido, péptido o fragmentos de péptido se pueden usar en un contexto similar.
El término "dominio de hemaglutinina" se refiere a un péptido que comprende ya sea el polipéptido precursor HAO, o los dominios HA1 y HA2. El dominio de hemaglutinina no incluye el péptido de señal, dominio de transmembrana, o la cola citoplásmica encontrada en la proteína que se presenta naturalmente.
Con referencia, al virus de influenza, el término "hemaglutinina" o "HA" como se usa en la presente se refiere a una glicoproteína encontrada en el exterior de las partículas víricas de influenza. La HA es una glicoproteína tipo I de membrana homotrimérica , generalmente comprende un péptido de señal, un dominio HA1, y un dominio HA2 que comprende un sitio de anclaje que abarca la membrana en la terminal C y una cola citoplásmica pequeña (Figura IB) . Las secuencias de nucleótido que codifican HA son bien conocidas y están disponibles - ver, por ejemplo, la base de Biodefensa de Salud Pública (Virus de influenza; ver URL: biohealthbase.org) o Centro Nacional para la Información de Biotecnología (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov), ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia.
Información estructural en las HA de influenza El monómero HA puede subdividirse en 2 dominios funcionales distintos, el dominio de cabeza globular y el dominio progenitor. La correspondencia de estos dominios entre la secuencia primaria y la estructura de HA se ilustra en las Figuras IB y 2. El dominio progenitor se involucra en infectividad y patogenicidad del virus por medio del cambio conformacional extraordinario puede realizarse en pH ácido. Se describe además como 4 subdominios, el péptido de fusión (extensión hidrofóbica de 26 aminoácidos responsables de la fusión con la membrana hospedera en el estado conformacional de pH bajo); el dominio progenitor por sí mismo (que puede acomodar 2 conformaciones extremadamente diferentes) , el dominio de transmembrana ( TmD) (determina la afinidad de HA para plataformas de lipido) la cola citoplásmica (Ccola) (se involucra en secreción de HA) . La cabeza globular se divide en 2 subdominios, el dominio de enlace del receptor (RB) y el dominio de esterasa de vestigio (E) . El subdominio dé esterasa está más bien enterrado de la superficie de la proteina y por lo tanto la mayoría de anticuerpos se elevan contra HA enlazada al dominio de enlace del receptor (representado por la parte más alta de la cabeza en la Figura 2).
El término "homotrímero" u "homotrimérico" indica que un olígomero está formado por tres moléculas de proteína HA. La proteína HA se sintetiza como una proteína precursora monomérica de 75 kDa (HAO) , que se acumula en la superficie en una proteína trimérica alargada. Para cepas aviares altamente patogénicas, la. proteína precursora se desdobla intracelularmente en un sitio de desdoblamiento de activación conservada (también denominado como péptido de fusión) en 2 cadenas de polipéptido, HA1 (328 aminoácidos) y HA2 (221 aminoácidos; que comprende la región de transmembrana),, ligada por un enlace de disulfuro antes de que ocurra la trimerización . Aunque esta etapa es central para infectividad del virus, no es esencial para la trimerización de la proteína. Para cepas del virus de influenza aviar de mamífero y patogénicas, el precursor HAO se desdobla extracelularmente por proteasas secretadas por células del tracto respiratorio del hospedero, o por micoplasma o bacterias co-infectadas . La inserción de HA dentro de la membrana de retículo endoplásmico (ER) de la célula hospedera, desdoblamiento de péptido de señal y glicosilación de proteína son eventos co-traduccionales . El repliegue correcto de HA requiere glicosilación de la proteína y formación de 6 enlaces de disulfuro de intra-cadena . El trímero HA se acumula dentro del complejo cis y trans-Golgi, el dominio de transmembrana juega un papel en el proceso de trimerización . Las estructuras de cristal de proteínas HA tratadas con bromelaina, que carecen del dominio de transmembrana, han mostrado una estructura altamente conservada entre las cepas de influenza. También se ha establecido que HA experimenta cambios conformacionales principales durante el proceso de infección, que requiere el precursor HAO para desdoblarse en las 2 cadenas de polipéptido HAl y HA2. La proteína HA puede procesarse (esto es, comprende dominios HAl y HA2 ) , o puede no procesarse (esto es comprende el dominio HAO) .
La presente invención se refiere al uso de una proteína HA que comprende el dominio de transmembrana e incluye dominios HAl y HA2, por ejemplo la proteína HA puede ser HAO, o HA procesada que comprende HAl y HA2.
La HA de la presente invención puede obtenerse de cualquier subtipo. Por ejemplo, el HA puede ser de subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7 , H8., H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, o H16.
La presente invención incluye VLPs que comprenden HA que tienen N-glicanos modificados. La HA recombiriante de la presente invención también puede comprender una secuencia de aminoácido con base en la secuencia de cualquier hemaglutinina conocida en la técnica - ver, por ejemplo, la base de BioDefensa de Salud Pública (Virus de influenza; ver URL: biohealthbase.org) o Centro Nacional para Información de Biotecnología (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov) en donde los sitios de glicosilación ligados a N nativos se han removido/mutado/eliminado/modificado para remover los residuos de azúcar que ocultan los sitios antigénicos peptídicos .
Por otra parte, la HA puede ser con base en la secuencia de una hemaglutinina que está aislada de uno o más virus de influenza emergente o nuevamente identificados.
Por otra parte, los VLP pueden producirse que comprenden una combinación de subtipos HA. Por ejemplo, los VLP pueden comprender una o más que una HA del subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, o una combinación de los mismos. La selección de la combinación de HA puede determinarse por el uso pretendido de la vacuna preparada de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para uso en pájaros inoculados puede comprender cualquier combinación de subtipos HA, mientras que las VLP útiles para inocular humanos pueden comprender subtipos de uno o más de uno de los subtipos Hl, H2, H3 o H5. Sin embargo, otras combinaciones de subtipo HA pueden prepararse dependiendo del uso de la VLP. Con objeto de producir las VLP que comprenden combinaciones de subtipos HA, el subtipo HA deseado puede co-expresarse dentro de la misma célula, por ejemplo una célula de planta.
Particularmente, las VLP producidas como se describe en la presente no comprenden neuraminidasa (NA) . Sin embargo, NA puede co-expresarse con HA deben desearse las VLP que comprenden HA y NA. 2 - Subtipos de gripa La invención incluye todos los tipos de virus de influenza humana, incluyendo por ejemplo, pero no limitados a los sub-tipos A muy prevalentes, y el tipo B menos común, y tipo C, y para HA obtenidos de otros subtipos de influenza.
La presente invención también incluye las VLP que comprenden HA obtenidas de uno o más de un subtipo de influenza. Por ejemplo, las VLP pueden comprender una o más de una HA del subtipo Hl (codificada por la SEQ ID NO: 1), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 3), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 4), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 6), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 7), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 8), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 10), Hll (codificada por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 16), o una combinación de los mismos. Una o más que una HA de uno o más de un subtipos de influenza pueden co-expresarse dentro de una planta o célula de insecto para asegurar que la síntesis de una o más que una HA resulta en la formación de VLP que comprenden una combinación de HA obtenidas de uno o más de un subtipo de influenza. La selección de la combinación de HA puede determinarse por el uso pretendido de la vacuna preparada de la VLP. Por ejemplo una vacuna para uso al inocular humanos puede comprender cualquier combinación de subtipos HA, particularmente, uno o más de uno de los subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, NI, N2, N3 y N7. Particularmente, Hl, H2, H3, H5.
Sin embargo, otras combinaciones de subtipo HA pueden prepararse dependiendo del uso del inoculo. 3 - Método de producción Por otra parte, la presente invención proporciona un método para producir partículas tipo virus (VLP) en un hospedero. Por lo tanto, la invención se proporciona para las VLP, y un método para producir VLP víricas en un sistema de expresión hospedero, de la expresión de una proteína de envoltura sencilla. El método involucra introducir un ácido nucleico que codifica un antígeno operativamente ligado a una región reguladora activa en el hospedero o una porción del mismo, e incubar el hospedero o una porción del hospedero bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, produciendo de tal modo las VLP.
Los elementos reguladores de la presente invención también pueden combinarse con la región de codificación de interés para la expresión dentro de un rango de organismos hospederos que son susceptibles a transformación, o expresión transitoria, tales como particularmente planta, insecto o levadura .
Particularmente, tales organismos son plantas, tanto monocotiledóneas y dicotiledóneas, por ejemplo pero no limitadas a maíz, plantas de cereal, trigo, cebada, avena, Nicotiana spp, Brassica spp, fríjol de soya, fríjol, chícharo, alfalfa, papa, jitomate, ginseng, y Arabidopsis .
Los métodos para la transformación estable, y regeneración de estos organismos se establecen en la técnica y se conocen por alguien de experiencia en la técnica. Los métodos para obtener plantas transformadas y regeneradas también son bien conocidos en. la técnica.
Por "transformación" significa la transferencia interespecifica estable de información genética (secuencia de nucleótido) que se manifiesta genotipicamente , fenotipicamente o ambas. La transferencia interespecifica de información genética de un constructo quimérico a un hospedero puede ser hereditaria y la transferencia de información genética considerada estable, o la transferencia puede ser transitoria y la transferencia de información genética no es heredable.
Los métodos de expresión transitoria se pueden usar para expresar los constructos de la presente invención (ver Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; que se incorpora en la presente como referencia) . Alternativamente, un método de expresión transitorio con base en vacio, como se describe por Kapila et al. 1997 (incorporado en la presente como referencia) se pueden usar. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, un método de Agro-inoculación o Agro-infiltración, sin embargo, otros métodos transitorios también pueden usarse como se anota arriba. Con ya sea Agro-inoculación o Agro-infiltración, una mezcla de Agrobacterias que comprende el ácido nucleico deseado entra en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo las hojas, porción aérea de la planta (incluyendo tallo, hojas y flores), otra porción de la planta (tallo, raíz, flores) , o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las copias de t-ADN se transfieren e infectan de Agrobacteria en las células. El t-ADN se transcribe de manera episomal y el mARN se traduce, que conduce a la producción de la proteina de interés en células infectadas, sin embargo, el paso de t-ADN dentro del núcleo es transitorio. 4 - Organismo hospedero Las VLP de la presente invención pueden producirse en una célula hospedera que se caracteriza por carecer de la capacidad de sialilar proteínas, por ejemplo carece de sialidasa, tal - como una célula, de planta, una célula de insecto, hongo, y otros organismos incluyendo esponja, coelenterara , anélidos, artrópodos, moluscos, nematelmintos , troquelmintos , platelmintos , quetognatos, tentaculados , clamidia, espiroquetas, bacterias gram positivas, cianobacterias, arqueobacterias , como se identifican en glicoforo (ver, por ejemplo, la URL: glycoforum. gr . jp/science/word/evolution/ES-AOSE . html) .
Las VLP producidas como se describen en la presente no comprenden típicamente neuraminidasa (NA) . Sin embargo, la NA puede co-expresarse con HA deben desearse las VLP que comprenden HA y NA.
Particularmente, las VLP de la presente invención pueden producirse en células de planta, una planta completa o porciones de la misma tales como hoja, semillas, o cualquier otra materia de la planta.
Por el término "materia de la planta", significa cualquier material suministrado de una planta. La materia de la planta puede comprender una planta completa, tejido, células, o cualquier fracción de la misma. Además, la materia de la planta puede comprender componentes de planta intracelular , componente de planta extracelular , extractos líquidos o sólidos de plantas, o una combinación de los mismos. Además, la materia de la planta puede comprender plantas, células de planta, tejido, un extracto líquido, o una combinación de los mismos, de hojas, tallos, flores, frutos, raíces de la planta o una . combinación de los mismos. La materia de la planta puede comprender una planta o porción del mismo que no se ha sometido a cualquiera de las etapas de procesamiento. Sin embargo, también se contempla que el material de la planta pueda someterse a las etapas de procesamiento mínimas como se definen a continuación, o procesamiento más riguroso, incluyendo purificación de proteína sustancial o parcial usando técnicas comúnmente conocidas dentro de la técnica incluyendo, pero no limitado a cromatografía, electroforesis y los similares.
Por el término "procesamiento mínimo" significa materia de la planta, por ejemplo, una planta o porción de la misma que comprende una proteína de interés que se purifica parcialmente para proporcionar un extracto de planta, homogeneizado, fracción del homogenei zado de la planta o los similares (esto es procesado de manera mínima) . La purificación parcial puede comprender, pero no se limita a interrumpir las estructuras celulares de la planta por ello crea una composición que comprende componentes de planta solubles, y componentes de planta insolubles que pueden separarse por ejemplo, pero no limitados a, por centrifugación, filtración o una combinación de los mismos. En este sentido, las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos pueden obtenerse fácilmente usando extracción de vacío o centrifuga, o los tejidos pueden extraerse bajo presión al pasar a través de rodillos o molinos o los similares para apretar o liberar la proteína libre dentro del espacio extracelular. El procesamiento mínimo puede también involucrar preparación de extractos crudos de proteínas soluble, ya que estas preparaciones deben tener contaminación insignificante de productos de planta secundarios. Además, el procesamiento mínimo puede involucrar extracción acuosa de proteína soluble de las hojas, seguido por precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir maceración a gran escala y extracción de jugo con objeto de permitir el uso directo del extracto.
La materia de la planta, en la forma de material o tejido de la planta puede suministrarse oralmente a un sujeto. La materia de la planta se puede administrar como parte de un suplemento dietético, junto con otros alimentos, o encapsulados . La materia o tejido de la planta también puede concentrarse para mejorar o incrementar palatabilidad, o proporcionarse junto con otros materiales, ingredientes, o excipientes farmacéuticos, como se requiera.
También se consideran parte de esta invención plantas transgénicas , células de planta o semillas que contienen el constructo del gen quimérico de la presente invención. Los métodos para regenerar las plantas completas de células de planta también se conocen en la técnica. En general, las células de planta transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, donde los marcadores seleccionados se usan para facilitar la identificación de células de planta transformadas. Una vez que el callo se forma, la formación del brote puede fomentarse al emplear las hormonas de la planta apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y los brotes transferidos al medio de raíz para regeneración de las plantas. Las plantas luego pueden usarse para establecer generaciones repetitivas, ya sea . de semillas o usando técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también pueden generarse sin usar cultivos de tejido.
También se consideran parte de esta invención plantas transgénicas, árboles, levadura, bacterias, hongos, células de insecto y animales que contienen el constructo del gen quimérico que comprende un ácido nucleico que codifica ??? recombinante para producción de VLP, de acuerdo con la presente invención.
Se contempla que una planta que comprende la proteina de interés, o que expresa la VLP que comprende la proteina de interés se puede administrar a un sujeto u organismo objetivo, en una variedad de formas dependiendo de la necesidad y la situación. Por ejemplo, la proteina de interés obtenida de la planta puede extraerse antes de su uso en cualquiera de una forma cruda, parcialmente purificada, o purificada. Si la proteina es para purificarse, entonces puede producirse en cualquiera de las plantas comestibles o no comestible. Por otra parte, si la proteina se administra oralmente, el tejido de la planta puede cosechar y alimentarse directamente al sujeto, o el tejido cosechado puede secarse antes de alimentarse, o un animal puede permitirse para pastar en la planta sin previa cosecha tomando su lugar. También se considera dentro del alcance de esta invención que los tejidos de planta cosechados sean proporcionados como un suplemento alimenticio dentro del alimento del animal. Si el tejido de la planta se está alimentando a un animal con poco o sin procesamiento adicional se prefiere que el tejido de la planta que se está administrando sea comestible.
El silenciamiento del gen post-transcripcional (PTGS, por sus siglas en inglés) puede involucrarse al limitar la expresión de los transgenes en plantas, y la co-expresión de un supresor de silenciamiento del virus de papa Y (HcPro) se pueden usar para contrarrestar la degradación especifica de mARN de transgen (Brigneti et al, 1998) . Los supresores alternos de silenciamiento son bien conocidos en la técnica y se pueden usar como sé describe en la presente (Chiba et al, 2006, Virology 346:7-14; que se incorpora en la presente como referencia), por ejemplo pero no limitado a, TEV-pl/HC-Pro (Virus de grabado del Tabaco-pl/HC-Pro) , BYV-p21, pl9 de virus del enanismo arbustivo del jitomate (TBSV pl9) , proteiria de cápsida del virus de oruga de Jitomate (TCV-CP) , 2b de virus de mosaico de pepino; CMV-2b) , p25 del Virus de papa X (PVX-p25), pll del virus de papa M (PVM-pll), pll del virus de papa S (PVS-pll), pl6 del virus de quemadura de arándano, (BScV-pl6) , p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de parra, (GLRaV-2 p24), plO del virus A de parra, (GVA-plO), pl4 del virus B de parra (GVB-pl4), plO del virus latente de Heracleum (HLV-plO) , o pl6 del virus latente común del ajo (GCLV-??ß) . Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo, pero no limitado a, HcPro, TEV-pl/HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-p 10, GCLV-p 16 o GVA-plO, puede co-expresarse junto con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés para asegurar además niveles altos de la producción de proteína dentro de una planta.
Las VLP de virus envueltos generalmente adquieren su envoltura de la membrana que brota a través. Las membranas de plasma de la planta tienen un complemento de fitoesterol que puede tener efectos inmunoestimuladores . Para investigar esta posibilidad, las VLP H5 hechas de la planta se administraron a animales en la presencia de un adyuvante, y la HAI (respuesta de anticuerpo de la inhibición de hemaglutinación ) se determina (Figura 7) .
La producción de VLP en plantas presenta diversas ventajas sobre la producción de estas partículas en cultivo celular de insectos. Los lípidos de planta pueden estimular células inmunitarias específicas y potenciar la respuesta inmunitaria inducida. Las membranas de planta se hacen de lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y también contienen glicoesfingolípidos que son únicos para plantas y algunas bacterias y protozoos. Los esfingolípidos son inusuales en que no son ésteres de glicerol tipo PC o PE pero al contrario consisten de un alcohol amino de cadena larga que forma una ligadura amida para una cadena de ácido graso que contiene más de 18 carbonos. El PC y PE así como glicoesfingolípidos pueden · enlazar a moléculas CD1¦ expresadas por células inmunitarias mamíferas tales como células que presentan antígeno (APCs) tipo células dentriticas y macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo e hígado (Tsuji M, . 2006). Por otra parte, además del efecto adyuvante potencial de la presencia de lípidos de planta, la capacidad de N-glicanos de la planta para facilitar la captura de antígenos de glicoproteína por células que presentan antígeno ( Saint-Jore-Dupas, 2007), puede ver ventajosa de la producción de VLP en plantas.
Sin desear apegarse por la teoría, se anticipa que las VLP hechas de planta inducirán una reacción inmunitaria más fuerte que las VLP hechas en otros sistemas de producción/fabricación y que la reacción inmunitaria inducida por estas VLP hechas de planta será más fuerte cuando se compara con la reacción inmunitaria inducida por vacunas de virus completas vivas o atenuadas.
Contrario a las vacunas hechas de virus completos, las VLP proporcionan la ventaja de que no son infecciosas, de esta manera la contención biológica restrictiva no es tan importante un tema como debe trabajarse con un virus completo, infeccioso, y no se requiere para producción. Las VLP hechas de planta proporcionan una ventaja adicional de nuevo al permitir que el sistema de expresión crezca en un invernadero o campo, de esta manera son significativamente más económicas y adecuadas para ampliación.
Adicionalmente , las plantas no comprenden las enzimas involucradas en sintetizar y agregar residuos de ácido siálico a las proteínas.. Las VLP pueden producirse en la ausencia de neuraminidasa (NA) , y no necesitan co-expresar la NA, o para tratar las células producidas o extracto con sialidasa (neuraminidasa) , para asegurar la producción de VLP en plantas .
Particularmente, las VLP producidas de acuerdo con la presente invención no comprenden la proteína MI que se conoce para enlazar el ARN. El ARN es un contaminante de la preparación VLP y es no deseada cuando se obtiene la aprobación reguladora para el producto VLP para uso como una vacuna humana. 5 - Ácidos nucleicos La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de ' nucleótido que codifica un antigeno de hemaglutinina (HA) del virus de influenza, operativamente ligado a una región reguladora activa en un organismo hospedero sin sialilación.
La presente invención describe, pero no se limita a, la clonación de un ácido nucleico que codifica HA, por ejemplo pero no limitado a, una HA del virus de influenza A humana en un vector de expresión hospedero, y la producción de VLP de influenza del hospedero, adecuada para producción de vacuna. Las VLP también pueden usarse para producir reactivos compuestos de proteínas estructurales de influenza recombinante que se auto-acumulan en estructuras de proteína macromoleculares homotípicas inmunogénicas y funcionales, incluyendo partículas de influenza subvíricas y VLP de influenza, en células hospederas transformadas, por ejemplo células de planta o células de insecto.
La presente invención también incluye secuencias de nucleótido Hl (codificada por la SEQ ID NO: 1), H2 4 ß (codificada por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificada por la SEQ : ID NO: 3), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 4), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificada por la SEQ ; ID NO: 6), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 7), H8 5 (codificada por la SEQ ID NO: 8), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 10), Hll (codificada por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificada por la SEQ 10 ID NO: 15), y H16 (codificada por la SEQ ID NO: 16).
Particularmente, la presente invención incluye secuencias de nucleótid SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7 que codifica HA de Hl, H5 o H7 respectivamente; una secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID 15 NO: 7, que se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas para un ácido nucleico que codifica la HA de Hl, H5 o H7, respectivamente; o una secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que se hibridiza bajo condiciones de hibridación severas para un complemento de un 20 ácido nucleico que codifica la HA de Hl, H5 o H7 respectivamente; en donde la secuencia de nucleótido codifica una proteina de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótido dentro de una célula hospedera forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1, o HA2. La VLP, cuando se administra a un sujeto, - induce una respuesta inmunitaria.
La hibridación bajo condiciones de hibridación severas se conocen en la técnica (ver por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds . 1995 y complementos; Maniatis et al, en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, .1982; Sambrook and Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición 2001; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . Un ejemplo de tales condiciones de hibridación severas puede ser alrededor de 16-20 horas de hibridación' en 4 X SSC a 65°C, seguido por lavado en 0.1 X SSC a 65°C durante una hora, o 2 lavados en 0.1 X SSC a 65°C cada üno durante 20 ó 30 minutos. Alternativamente, una condición de hibridación severa ejemplar puede ser durante la noche (16-20 horas) en formamida al 50%, 4 X SSC a 42°C, seguido por lavado en .0.1 X SSC a 65°C durante una hora, o 2 lavados en 0.1 X SSC a 65°C cada uno durante 20 ó 30 minutos, o durante la noche (16-20 horas), o hibridación en. solución amortiguadora de fosfato acuoso Church (SDS al 7%; solución amortiguadora NaP04 0.5M pH 7.2; EDT 10 mM) a '65°C, con 2 lavados ya sea a 50°C en 0.1 X SSC, SDS al 0.1% durante 20 ó 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65°C en 2 X SSC, SDS al durante 20 ó 30 minutos cada uno.
Adicionalmente, la presente invención incluye secuencias de nucleótido que se caracterizan como que tienen alrededor de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad entre ellas, identidad de secuencia, o similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótido que codifica HA de Hl (SEQ ID NO: 1), H5 (SEQ ID NO: 5) o H7 (SEQ ID NO: 7), en donde la secuencia de nucleótido codifica una proteina de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótido dentro de una célula de planta forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1, o HA2. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria .
La identidad de secuencia o similitud de secuencia puede determinarse usando un programa de comparación de secuencia de nucleótido, tal como que se proporciona dentro de DNASIS (por ejemplo, usando, pero no limitado a, los siguientes parámetros: penalización por espacio 5, #de diagonales superiores 5, penalización por espacio fijo 10, k-tupla 2, espacio de flotante 10, y tamaño de la ventana 5) . Sin embargo, otros métodos de alineación de secuencia para comparación son bien conocidos en la técnica por ejemplo los algoritmos de Smith y Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson y Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444), y por implementaciones computari zadas de estos algoritmos (por ejemplo GAP, BESTFIT, FASTA, y BLAST)., o por alineación manual e inspección visual.
Por lo tanto, la presente invención incluye además un vector adecuado que comprende el constructo quimérico adecuado para uso con ya sea sistemas de expresión estables o transitorios. La información genética también puede proporcionarse dentro de uno o más de un constructo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido que codifica una proteina de interés puede introducirse en un constructo, y una segunda secuencia de nucleótido que codifica una proteina que modifica la glicosilacion de la proteina de interés puede introducirse usando un constructo separado. Estas secuencias de nucleótido luego pueden co-expresarse dentro de un hospedero. Sin embargo, un constructo que comprende una secuencia de nucleótido que codifica tanto la proteina de interés como la proteina que modifica el perfil de glicosilacion de la proteina de interés también puede usarse.
En este caso la secuencia de nucleótido debe comprender una primera secuencia que comprende una primera secuencia dé ácido nucleico que codifica la proteina de interés operativamente ligada a un promotor o región reguladora, y una segunda secuencia que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina que modifica el perfil de glicosilación de la proteina de interés, la segunda secuencia operativamente ligada a un promotor o región reguladora.
Por "co-expresado" significa que dos, o más de dos, secuencias de nucleótido se expresan en alrededor del mismo tiempo dentro del hospedero, y dentro del mismo tejido del hospedero. Sin embargo, las secuencias de nucleótido no necesitan expresarse en exactamente el mismo tiempo. Al contrario, las dos o más secuencias de nucleótido se expresan en una forma de manera que los productos codificados tienen una oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la proteina que modifica la glicosilación de la proteina de interés puede expresarse ya sea antes o durante el periodo cuando la proteina de interés se expresa asi que la modificación de la glicosilación de la proteina de interés toma lugar. Las dos o más de dos secuencias de nucleótido pueden co-expresarse usando un sistema de expresión transitorio, donde las dos o más secuencias se introducen dentro del hospedero en alrededor del mismo tiempo bajo condiciones que ambas secuencias se expresan. Alternativamente, un hospedero de plataforma comprende una de las secuencias de nucleótido, por ejemplo la secuencia que codifica la proteina que modifica el perfil de glicosilación de la proteina de interés, puede transformarse, ya sea transitoriamente o en una manera estable, con una secuencia adicional que codifica la proteína de interés. En este caso, la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa deseada de desarrollo, o su expresión puede inducirse usando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la proteína de interés puede expresarse bajo condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que las secuencias de nucleótido se coexpresan .
Los constructos de la presente invención pueden introducirse en las células de la planta usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores del virus de la planta, transformación de ADN directa, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas ver por ejemplo Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geíerson and Corey, Plant Molecular Biology, 2a Ed. (1988); y Miki and Iyer, Fundamentáis of Gene Transfer in Plants; In Plant Metabolism, 2a Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, pp. 561-579 (1997). Otros métodos incluyen reabsorción de ADN directa, el uso de liposomas, electroporación, por ejemplo usando protoplastos, micro-inyección, microproyectiles o triquitas, e infiltración de vacio. Ver, por ejemplo, Bilang, et al (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al (Theor. Appl Genet . 75: 30-36, 1987), Klein et al, Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al, Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Patentes de E.U.A. Nos. 4,945,050; 5,036,006; y 5,100,792, solicitud de la patente de E.U.A. Nos. De Serie 08/438,666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951,715, presentada el 25 de septiembre de 1992, (todas de las cuales se incorporan en la presente para referencia) .
Por "región reguladora" "elemento regulador" o "promotor" significa una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, cadena arriba de la región que codifica la proteína de un gen, que puede estar comprendido de ya sea ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, u operativamente ligada, con un gen de interés, esta puede resultar en expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad de órgano, o controlar el desarrollo o activación del gen temporal. Una "región reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores del núcleo que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora tal como elementos reguladores negativos o potenciadores transcripcionales . La "región reguladora", como se usa en la presente, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión del gen tales como potenciadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, secuencias activadas cadena arriba, y determinantes de inestabilidad mAR . Diversos de estos elementos últimos pueden localizarse próximos a la región de codificación.
En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" o "región reguladora" típicamente se refiere a una secuencia de ADN, usualmente , pero no siempre, cadena arriba (5') con la secuencia de codificación de un gen estructural, que controla la expresión de la región de codificación al proporcionar el reconocimiento para la polimerasa de ARN y/u otros factores requeridos para iniciar la transcripción en un sitio particular. Sin embargo, se entiende que otras secuencias de nucleótido, localizadas dentro de intrones, o 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de expresión de una región de codificación de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que se proporciona para el reconocimiento para la polimerasa de ARN u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, pero no todos, los elementos promotores eucarióticos contienen una caja TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada que comprende de pares base de nucleótido de adenosina y timidina usualmente situados aproximadamente 25 pares base cadena arriba de un sitio de inicio transcripcional . Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable para el inicio de transcripción, así como otros elementos reguladores (como se enlista arriba) que modifican la expresión del gen.
Existen diversos tipos de regiones reguladoras, incluyendo aquellas que se regulan de manera desarrollada, inducible o constitutiva. Una región reguladora que se regula de manera desarrollada, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se. activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en tiempos específicos durante el desarrollo de tal órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan de manera desarrollada pueden preferencialmente activarse dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas de desarrollo específicas, que también pueden activarse en una manera regulada de manera desarrollada, o en un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta también. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas de ' tejido, por ejemplo ver específico una región reguladora, incluyen el promotor napina, y el promotor cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de hoja incluye el promotor plastocianina (Figura 3; EUA 7,125,978, que se. incorpora en la presente como referencia).
Una región reguladora inducible es una que es capaz de directamente o indirectamente activar la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En la ausencia de un inductor las secuencias de ADN o genes no se transcribirán. Típicamente el factor de proteína que enlaza específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede presentarse en una forma inactiva, que luego se convierte directamente o indirectamente a la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de proteína también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o una tensión fisiológica impuesta directamente por calor, frío, sal, o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente de enfermedad tal como' un virus. Una célula de planta que contiene una región reguladora inducible puede exponerse a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula o planta tal como por métodos de rocío, riego, calentamiento o similares. Los elementos reguladores inducible pueden derivarse de ya sea cualquiera de los genes de la planta o no de planta (por ejemplo Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que se incorpora en la presente) . Los ejemplos, de promotores inducibles potenciales incluyen, pero no se limitan a, promotor tetraciclina-inducible (Gatz, C, 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; que se incorpora en la presente), promotor inducible de esteroide (Aoyama, T. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397- 404; que se incorpora como referencia) y promotor etanol-inducible (Salter, M. G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que se incorporan como referencia) genes IB6 y CKI1 inducibles de citoquinina ( Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; que se incorporan como referencia) y el elemento inducible auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al, 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; que se incorpora como referencia).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diversas partes de una planta y continuamente a través del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluye promotores asociados con el transcripto CaMV 35S. (Odell et al, 1985, Nature, 313: 810-812), la actina 1 de arroz (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al, 1996, Plant J. , 10: 107-121), o tms 2 (E.U.A. 5,428,147, que se incorpora en la presente para referencia), y genes de triosefosfato isomerasa 1 (Xu et . al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol . 29: 637-646), los genes de Arabidopsis ubiquitina 1 y 6 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646)., y el gen del factor 4A de inicio de traducción del tabaco (Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). El término "constitutiva" como se usa en la presente no necesariamente indica que un gen bajo control de la región reguladora constitutiva se expresa en el mismo nivel en todos los tipos de célula, pero que el gen se expresa en un amplio intervalo de tipos de célula aunque a menudo se observa variación en la abundancia.
Por "ligado operativamente" significa que las secuencias particulares, por ejemplo un elemento regulador y una región codificadora de interés, que interactúa ya sea directamente o indirectamente para llevar a cabo una función pretendida, tal como mediación o modulación de la expresión del gen. La interacción de secuencias ligadas operativamente puede, por ejemplo, mediarse por proteínas que interactúan con las secuencias ligadas operativamente.
Una o más de una secuencia de nucleótido de la presente invención puede expresarse en cualquier hospedero de planta apropiado que se transforma por la secuencia de nucleótido, o constructos, o vectores de ' la presente invención. Los ejemplos de hospederos apropiados incluyen, pero no se limitan a, cultivos de agricultura que incluyen alfalfa, cañóla, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., alfalfa, papa, ginseng, chícharo, avena, arroz, fríjol de soya, trigo, cebada, girasol, algodón y similares.
Uno o más constructos genéticos quiméricos de la presente invención pueden comprender además una región no traducida 3' . Una región no traducida 3' se refiere a tal porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal dé poliadenilación y cualquiera de las otras señales reguladoras capaces de efectuar procesamiento de mARN o expresión del gen. La señal de poliadenilación es usualmente caracterizada al efectuar la adición de pistas de ácido poliadenilico al extremo 3' del precursor de mARN. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología a la forma canónica 5' AATAAA-3 ' aunque las variaciones no son poco frecuentes. Uno o más de los constructos genéticos quiméricos de la presente invención también pueden incluir potenciadores adicionales, potenciadores ya sea de traducción o transcripción, como se requiera. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas para las personas expertas en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio deberá estar en fase con la estructura de lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de la secuencia completa.
Los ejemplos no limitantes de regiones 3' apropiadas son las regiones no traducidas transcritas 3' que contienen una señal de poliadenilación de tumor Agrobacterium que induce genes de plásmido (Ti) , tal como la nopalina sintasa (gen Nos) y genes de planta tal como los genes de proteína de almacenamiento de fríjol de soya,, la subunidad pequeña de la ribulosa-1, gen 5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO; US 4,962,028; que se incorpora en la presente para referencia), el promotor usado para regular expresión de plastocianina (Pwee and Gray 1993; que se incorpora en la presente para referencia) . Un ejemplo de un promotor de plastocianina se describe en US 7,125,978 (que se incorpora en la presente para referencia) .
Como se describe en la presente, los promotores que comprenden secuencias potenciadoras con eficiencia demostrada en la expresión en hoja, se ha encontrado que es efectivo en la expresión transitoria. Sin desear enlazarse por la teoría, el enlace de elementos reguladores cadena arriba de un gen fotosintético por el enlace a la matriz nuclear puede mediar la expresión fuerte. Por ejemplo hasta -784 del sitio de inicio de traducción del gen de plastocianina de chícharo se pueden usar mediante expresión del gen reportero fuerte.
El uso de una región reguladora de un gen fotosintético, por ejemplo pero no limitado a una región reguladora de plastocianina (EUA 7,125,978; que se incorpora en la presente para referencia) , o una región reguladora obtenida de Ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; EUA 4,962,028; que se incorpora en la presente para referencia), proteína de enlace a clorofila a/b (CAB; Leutwiler et a; 1986; que se incorpora en la presente para referencia) , ST-LSI (asociado con el complejo que desarrolla el oxigeno del fotosistema II, Stockhaus et al.1989; que se incorpora en la presente para referencia) se pueden usar de acuerdo con la presente invención.
Para ayudar en la identificación de células de planta transformadas, los constructos de esta invención pueden manipularse además para incluir marcadores seleccionables de planta. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que se proporcionan para resistencia a químicos tales como un antibiótico por ejemplo, gentamicina, higromicina, canamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina , glifosato, clorosulfuro, y similares. De manera similar, las enzimas se proporcionan para la producción de un compuesto identificable por cambio de color tal como GUS (beta-glucuronidasa ) , o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP, se pueden usar.
Las copias de cADN resultantes de estos genes pueden clonarse en un vector de expresión adecuado como se requiera por el sistema de expresión hospedero. Los ejemplos de vectores de expresión apropiados para plantas se describen a continuación, alternativamente, vector de expresión de baculovirus, por ejemplo, pFastBacl (InVitrogen) , que resulta en plásmidos con base en pFastBacl, usando métodos conocidos, e información proporcionada por las instrucciones del fabricante pueden usarse.
La presente invención se dirige además a un constructo de gen que comprende un ácido nucleico que codifica HA, como se describe arriba, operativamente ligado a un elemento regulador que es operativo en una planta. Los ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula de planta y que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen pero no se limitan a una región reguladora de plastocianina (EUA 7,125,978; que se incorpora en la presente para referencia) , o una región reguladora obtenida de Ribulosa 1 , 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; EUA 4,962,028; que se incorpora en la presente para referencia), proteina enlazada a clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986; que se incorpora en la presente para referencia), ST-LSI (asociado con el complejo que desarrolla el oxigeno de fotosistema II, Stockhaus et al. 1989; que se incorpora en la presente para referencia) . Si le constructo se expresa en una célula de insecto, los ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula de insecto incluyen pero no se limitan al promotor de poliedro, el promotor gp64 y similares.
La presente invención además proporciona la clonación de un ácido nucleico que codifica una HA, por ejemplo pero no limitado a, virus HA de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1) en un vector de expresión de planta, levadura o insecto (por ejemplo vector de expresión de baculovirus) y producción de reactivos o candidatos de la vacuna de influenza compuestos de proteínas estructurales de influenza recombinante que se auto-acumulan en estructuras de proteína macromoleculares homotípicas inmunogénicas y funcionales, incluyendo partículas de influenza subvíricas y VLP de influenza, en células de planta transformadas o células de insecto transformadas.
El ácido nucleico que codifica la HA, por ejemplo pero no limitado a, un virus HA de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), o el gen del virus HA de influenza humana A/Indonesia/5/05 pueden expresarse, por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus en una línea celular apropiada, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (por ejemplo línea celular Sf-9; ATCC PTA-4047). Otras líneas de célula de insecto también pueden usarse.
El ácido nucleico que codifica la HA puede, alternativamente, expresarse en una célula de planta, o en una planta. El ácido nucleico que codifica HA puede sintetizarse por transcripción inversa y reacción de cadena de polimerasa (PCR) usando ARN de HA. Como un ejemplo, el ARN puede aislarse de virus de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) ¦ o virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1), o de células infectadas con un virus de influenza. Para transcripción inversa y PCR, los cebadores de oligonucleótido específicos para ARN de HA, por ejemplo pero no limitados, genes HA del virus de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) o genes HAO del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1) pueden usarse. Adicionalmente , el ácido nucleico que codifica HA puede sintetizarse químicamente usando métodos como se deben conocer para alguien de experiencia en la técnica. 6 - Proteínas La presente invención también incluye uno o más de una proteína HA codificada por las secuencias de nucleótido SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7 (que codifica HA de Hl, H5 o H7, respectivamente), una secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que se híbrida bajo condiciones de hibridación severas a un ácido nucleico que codifica la HA de Hl, H5 o H7, respectivamente, o una secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que se híbrida bajo condiciones de hibridación severas para proveer un ácido nucleico que codifica la HA de Hl, H5 o H7, respectivamente, en donde la secuencia de nucleótido codifica una proteína de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP incluye la producción de un anticuerpo .
De manera similar, la presente invención incluye HAs asociadas con los siguientes subtipos Hl (codificados por la SEQ ID NO: 1), H2 (codificados por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificados por la SEQ ID NO: 3), H4 (codificados por la SEQ ID NO: 4), H5 (codificados por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificados por la SEQ ID NO: 6) , H7 (codificados por la SEQ ID NO: 7), H8 (codificados por la SEQ ID NO: 8), H9 (codificados por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificados por la SEQ ID NO: 10), Hll (codificados por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificados por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificados por la SEQ ID NO: 13), H14 (codificados por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificados por la SEQ ID NO: 15) , H16 (codificados por la SEQ ID NO: 16) ; y secuencias de nucleótido que se caracterizan como que tienen desde alrededor de 60 hasta 100% o cualquier cantidad entre la identidad de secuencia, particularmente desde alrededor de 70 hasta 100% de homología o cualquier cantidad entre ella, 80 hasta 100% o cualquier cantidad entre ella, 90-100% o cualquier cantidad entre ella, ó 95-100% o cualquier cantidad entre ella, identidad de secuencia con Hl (SEQ ID NO: 1), H2 (SEQ ID NO: 2), H3 (SEQ ID NO: 3), H4 (SEQ ID NO: 4), H5 (SEQ ID NO: 5), H6 (SEQ ID NO: 6), H7 (SEQ ID NO: 7), H8 (SEQ ID NO: 8), H9 (SEQ ID NO: 9), H10 (SEQ ID NO: 10), Hll (SEQ ID NO: 11), H12 (SEQ ID NO: 12), H13 (SEQ ID NO: 13), H14 (SEQ ID NO: 14), H15 (SEQ ID NO: 15), H16 (SEQ ID NO: 16), en donde la secuencia dé nucleótido codifica una proteina de hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótido dentro de una célula de planta forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1, o HA2. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria. 7 - VLP Por lo tanto, la presente invención se dirige a una VLP que comprende uno o más de un tipo o subtipo HA.
El término "virus tipo partícula" (VLP) , o "partículas tipo virus" o "VLPs" se refiere a estructuras que auto-reúnen y comprenden proteínas estructurales tales como proteína HA de influenza. Las VLP generalmente son morfológicamente y antigénicamente similares a viriones producidos en una infección, pero carecen de información genética suficiente para replicarse y de esta manera no son infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP pueden comprender una especie de proteína sencilla, o. más de una especie de proteína. Para las VLP que comprenden más de una especie de proteina, la especie de proteína puede ser de .la misma especie de virus, o puede comprender una proteína de una especie, género, subfamilia o familia diferente de virus (como se designa por la nomenclatura ICTV) . En otros ejemplos, una o más de la especie de proteína que comprende una VLP se puede modificar de la secuencia que se presenta naturalmente. Las VLP pueden producirse en células hospederas adecuadas incluyendo células hospederas de planta e insecto. Después de la extracción de la célula hospedera y durante el aislamiento y purificación adicional bajo condiciones adecuadas, las VLP se pueden purificar como estructuras intactas.
La invención también incluye, pero no se limita a, VLP derivadas de influenza que obtienen una envoltura de lípido de la membrana de plasma de la célula en la cual las proteínas VLP se expresan. Por ejemplo, si la VLP se expresa en un sistema con base en planta, la VLP puede obtener una envoltura de lípido de la membrana de plasma de la célula.
Generalmente, el término "lípido" se refiere a las moléculas que se presentan naturalmente, solubles en grasa ( lipofílicas ) . El término también se usa más específicamente para referir a ácidos grasos y . sus derivados (incluyendo tri, di, y monoglicéridos y fosfolípidos ) , así como otros esteróles o metabolitos que contienen esterol soluble en grasa. Los fosfolípidos son un componente principal de todas las membranas biológicas, junto con glicolipidos , esteróles y proteínas. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidil etanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol , fosfatidilserina, y similares. Los ejemplos de esteróles incluyen zooesteroles (por ejemplo, colesterol) y fitoesteroles . Más de 200 fitoesteroles se han identificado en varias especies de planta, la más común siendo campesterol, estigmaesterol , ergoesterol, brasicaesterol , delta-7-estigmaesterol, delta-7-avenaesterol , daunoesterol , sitoesterol, 24-metilcolesterol, colesterol o beta-sitoesterol. Como alguien de experiencia en la técnica debe entender, la composición de lípido de la membrana de plasma de una célula puede variar con el cultivo o condiciones de crecimiento de la célula u organismo, de la cual la célula se obtiene.
Las membranas celulares generalmente comprenden bicapas de lípido, así como proteínas para varias funciones. Las concentraciones localizadas de lípidos particulares pueden encontrarse en la bicapa de lípido, denominada como 'plataformas de lípido'. Sin desear enlazarse por la teoría, las plataformas de lípido pueden tener papeles importantes' en endo y exocitosis, entrada o egreso de virus u otros agentes infecciosos, transducción de señal de inter-célula, interacción con otros componentes estructurales de la célula u organismo, tales como matrices intracelulares y extracelulares .
Las VLP producidas de proteínas derivadas de influenza, de acuerdo con la presente invención no comprenden la proteína Mi. La proteína Mi se conoce para enlazar ARN (Wakefield and Brownlee, 1989) que es un contaminante de la preparación de VLP. La presencia de ARN es indeseada cuando se obtiene la aprobación reguladora para el producto VLP, por lo tanto una preparación VLP que carece de ARN puede ser ventajosa.
Una VLP producida en una planta de acuerdo con algunos aspectos de la invención puede ser compleja con lípidos derivados de planta. La VLP puede comprender un péptido HAO, HA1 o HA2 o combinaciones de los mismos. Los lípidos derivados de planta pueden estar en la forma de una bicapa de lípido, y pueden comprender además una envoltura que rodea la VLP. Los lípidos derivados de planta pueden comprender componentes de lípido de la membrana de plasma de la planta donde la VLP se produce, incluyendo, y uno o más de un lípido derivado de planta, por ejemplo pero no limitado a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glicoesfingolípidos , fitoesteroles o una combinación de los mismos. Un lípido derivado de planta puede alternativamente ser denominado como un 'lípido de planta'.
En plantas, las VLP de influenza brotan de la membrana de plasma, por lo tanto la composición de lipido de las VLP refleja su origen. Las VLP producidas de acuerdo a la presente invención comprenden HA, en complejo con lipidos derivados de planta. Los lipidos de planta pueden estimular células inmunitarias especificas y potenciar la respuesta inmunitaria inducida. Las membranas de planta se hacen de lipidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y también contienen glicoesfingolipidos , saponinas, y fitoesteroles . Adicionalmente , las plataformas de lípid'o también se encuentran en membranas de plasma de planta -estos microdominios se enriquecen en esfingolipidos y esteróles. En plantas, una variedad de fitoesteroles se conocen para ocurrir, incluyendo estigmaesterol, sitoesterol, 24-metilcolesterol y colesterol (Mongrand et al, 2004).
La PC y PE asi como glicoesfingolipidos pueden enlazar a moléculas CDl expresadas por células inmunitarias de mamífero tales como células que presentan antígeno (APCs) tipo células dendríticas y macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo e hígado (Tsuji M, . 2006) . Las moléculas CDl son estructuralmente similares a las moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y su papel es presentar los antígenos de glicolípido a células NKT (células T Exterminadoras Naturales) . Durante la activación, las células NKT activan las células inmunitarias innatas tales como células NK y células dendriticas y también activan células inmunitarias adaptivas tipo las células T y células B que producen el anticuerpo.
Una variedad de fitoesteroles puede encontrarse en una membrana de plasma - el complemento especifico puede variar dependiendo de las especies, condiciones de crecimiento, recursos de nutriente o estado del patógeno, por nombrar unos pocos factores. Generalmente, la beta-sitoesterol es el fitoesterol más abundante.
Los fitoesteroles presentes en una VLP de influenza formada en complejo con una bicapa de lipido, tal como una envoltura derivada de la' membrana de plasma puede proporcionar para una composición de vacuna ventajosa. Sin desear enlazarse por la teoría, las VLP hechas de plantas en complejo con una bicapa de lipido, tal como una envoltura derivada de la membrana de plasma, puede inducir una reacción inmunitaria más fuerte que las VLP hechas en otros sistemas de expresión, y puede ser similar a la reacción inmunitaria inducida por vacunas de virus completos vivas o atenuadas.
Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención proporciona una VLP en complejo con una bicapa de lipido derivada de planta. En algunas modalidades la bicapa de lipido derivada de planta puede comprender la envoltura de la VLP. 8- Composición Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición que comprende una dosis efectiva de una VLP que comprende una proteina HA de virus de influenza, uno o más de un lipido de planta, y un portador farmacéuticamente aceptable. La proteina HA de virus de influenza puede ser H5 Indonesia. También se proporciona un método para inducir inmunidad a una infección por virus de influenza en un sujeto. El método comprende administrar el partícula tipo virus que comprende una proteína HA de virus de influenza, uno o más de un lipido de planta, y un portador farmacéuticamente aceptable. La partícula tipo virus se puede administrar a un sujeto oralmente, intradérmicamente, intranasalmente, intramuscularmente , intraperitonealmente , intravenosamente, o subcutáneamente. 9- Método de tratamiento La presente invención proporciona un método para inducir inmunidad o "provocar una respuesta inmunitaria" para una infección de virus de influenza en un sujeto, el método comprende administrar la composición como se define en la presente .
Una "respuesta inmunitaria" generalmente se refiere a una respuesta del sistema inmunitario adaptativo. El sistema inmunitario adaptativo generalmente comprende una respuesta humoral, y una respuesta mediada por célula. La respuesta humoral es el aspecto de inmunidad que está mediado por anticuerpos secretados, producidos en las células del linaje de linfocito B (célula B) . Los anticuerpos secretados enlazan a antigenos en las superficies de microbios invasores (tales como virus o bacterias), que los marcan para destrucción. La inmunidad humoral se usa generalmente para referirse a la producción de anticuerpo y. los procesos que lo acompañan, asi como las funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la activación de la célula Th2 y producción de citoquina, generación de memoria celular, promoción de opsonina de fagocitosis, eliminación de patógeno y similares.
Una respuesta mediada por célula es una respuesta inmunitaria que no involucra anticuerpos pero al contrario involucra la activación de macrófagos, células eliminadoras naturales (NK) , linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, y la liberación de varias citoquinas en respuesta a un antígeno. La inmunidad mediada por célula se usa generalmente para referirse a alguna activación de célula Th, activación de célula Te y respuestas mediadas por célula T. La inmunidad mediada por célula es de importancia particular para responder a infecciones víricas.
Las VLP HA recombinantes de la presente invención pueden usarse en conjunto con vacunas de influenza existentes, para complementar la vacunas, volviéndolas más eficientes, y para reducir las dosificaciones de administración necesarias. Como se conocería por una persona experta en la técnica, la vacuna puede dirigirse contra uno o más de un virus de influenza. Los ejemplos de vacunas apropiadas incluyen, pero no se limitan a aquellas comercialmente disponibles de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline , Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals y similares.
Si se desea, las VLP de la presente invención pueden mezclarse con un adyuvante apropiado como se conocería por alguien de experiencia en la técnica. Por otra parte, la VLP se puede usar en una composición de vacuna que comprende una dosis efectiva de la VLP para el tratamiento de un organismo objetivo, como se definió arriba. Por otra parte, la VLP producida de acuerdo a la presente invención puede combinarse con las VLP obtenidas usando diferentes proteínas de influenza, por ejemplo, neuraminidasa (NA) .
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para inducir inmunidad para infección de virus de influenza en un animal u organismo objetivo que comprende administrar una dosis efectiva de una vacuna que comprende una o más de una VLP. La vacuna se puede administrar oralmente, intradérmicamente, intranasalmente, intramuscularmente , intraperitonealmente, intravenosamente, o subcutáneamente.
Como se muestra en las Figuras 6 y 7 los ensayos in vitro muestran una reactividad cruzada de anticuerpos producidos contra las VLP A/Indonesia/5/05 H5 mutadas y otras cepas de influenza tales como A/Vietnam/1203/04 ; A/Anhui/1/05 y A/Pavo/582/06 (todas las cepas H5N1) , aunque muestra menos reactividad de hemaglutinación contra la única H1N1 probada ( Figura 7 ) .
Significativamente, los anticuerpos producidos después de una dosis sencilla de H5N1 mutado (proteina H5 no glicosilada) induce una respuesta mayor contra todas las cepas H5 probadas después de 14 días de que los anticuerpos se producen contra el H5 de tipo natural, lo que indica que este inmunógeno no glicosilado puede proporcionar una respuesta más rápida que el tipo natural.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP de influenza hechas de planta comprende la proteina viral de hemaglutinina H5 mutada desprovista de carbohidratos ligados N induce una respuesta inm.unitaria para cepas de influenza patogénicas, y que esta respuesta es reactividad cruzada y puede ser rápida después de una dosis sencilla. 10- Sujeto Los ejemplos de un sujeto u organismo objetivo a las que las VLP de la presente invención se pueden administrar incluyen, pero no se limitan a, humanos, primates, pájaros, aves acuáticas, aves migratorias,¦ codorniz, pato, ganso, aves de corral, pavos, pollos, .cerdos, ovejas, equinos, caballos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visón, marta de piedra, hurones, animales domésticos, ganado, conejos, ratones, ratas, conejillos de indias u otros roedores, foca, ballena y similares. Tales organismos objetivos son ejemplares, y no se considera que se limitan a las aplicaciones y usos de la presente invención.
La presente invención también concierne a los virus de influenza que infectan otros mamíferos o animales hospederos, por ejemplo humanos, primates, caballos, cerdos, pájaros, aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, ganso, aves de corral, pavos, pollos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visón, marta de piedra, hurones, animales domésticos, ganado, ratones, ratas, foca, ballena y similares.
Particularmente, el sujeto a tratarse por el método como se definió arriba se puede seleccionar del grupo que comprende humanos, primates, caballos, cerdos, pájaros (aves) aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, ganso, pollos, perros, gatos, hurones, ganado y similares.
Particularmente, el sujeto puede ser un paciente humano o pájaros en general (incluyendo aves acuáticas, aves migratorias, aves de corral tales como codorniz, pato, ganso, pavos, pollos), particularmente aves migratorias o aves de corral para consumo humano (codorniz, pato, ganso, pavos, pollos). Más particularmente, el sujeto es humano. 11- Recipientes, jeringas, .y kits etc.
La presente invención también proporciona un recipiente que comprende la composición como se define en la presente. Particularmente, el recipiente contiene la dosis unitaria sencilla o en forma de dosificación múltiple con un agente conservador. Más particularmente, el recipiente es una jeringa "lista para uso" previamente llenada con la composición o la vacuna como se define en la presente.
Más particularmente, la invención también proporciona un kit que comprende un recipiente · que comprende la vacuna o composición como se define en la presente, e instrucciones sobre cómo usar/administrar la composición/vacuna.
La invención ahora se describirá en detalle a manera de referencia solamente a los siguientes ejemplos no limitativos .
EJEMPLOS Ejemplo 1 Material y métodos 1. Mutación de H5 de tipo natural de A/Indonesia/5/05 (SEQ ID NO. 17) para obtener H5 no glicosilado mutado.
El mutante triple se ha hecho al remover los sitios de glicosilación N154, N165, y N286 localizados en la cabeza globular de HA de tipo natural, más específicamente al reemplazar la Thr o Ser cercana en el patrón de secuencia de glicosilación N-X-T/S por un residuo Ala. Por lo tanto, el mutante triple contiene los siguientes tres reemplazos de aminoácido: T156A, T167A y S288A (enumerados de acuerdo a la SEQ ID NO. 17 de inicio) . Los tres reemplazos de aminoácido se realizaron por método de ligación con base en PCR presentado en Darveau et al. (1995) usando el vector de expresión HA de tipo natural (constructo 660, Figura 4) como la plantilla.
Brevemente, tres amplificaciones PCR se realizaron en paralelo en el vector de expresión 660 pC AMBIA como la plantilla con 3 pares diferentes de cebadores: 1) Plato-443-c (SEQ ID NO: 18) y HA5-T156A.r ( SEQ ID NO: 19); 2) HA5-T167A.C (SEQ ID NO: 20) y HA5-S288A.r (SEQ ID NO: 21); y 3) HA5-S288A.C ( SEQ ID NO: 22) y HA ( Ind) -SacI . r (SEQ ID NO: 23) .
Los productos de amplificación obtenidos de las tres reacciones se mezclaron juntos y la mezcla sirve como plantilla para una cuarta reacción (reacción de ensamble) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 18) y HA ( Ind) -Sac . r (SEQ ID NO: 23) como cebadores. El fragmento resultante se digirió con BamHI (localizado en el promotor de plastocianina) y Sad (en el extremo 3' del fragmento) y clonó en pCAMBIAPlasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante, nombrado 680, se presenta en la Figura 5 (SEQ ID NO. 29) . 2. Ensamble de casetes de expresión Todas las manipulaciones se llevaron a cabo usando los protocolos de biología molecular generales de Sambrook y Russell (2001; que se incorpora en la presente para referencia) . La primera etapa de clonación consiste en ensamblar un plásmido receptor que contiene reguladores del elemento cadena arriba o cadena abajo del gen de alfalfa plastocianina. El promotor de plastocianina y secuencias 5 ' UTR se amplificaron del ADN genómico alfalfa usando cebadores de oligonucleótido Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 24) y SacI-ATG-pPlas. r (SEQ ID NO: 25). El producto de amplificación resultante se digirió con Xmal y Sad y ligó en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia) , previamente digerido con las mismas enzimas, para crear pCAMBIApromo Plasto. De manera similar, las secuencias 3 ' UTR y el terminador del gen de plastocianina se amplificó de ADN genómico alfalfa usando los siguientes cebadores: Sacl-PlasTer.c (SEQ ID NO: 26) y EcoRI-PlasTer . r (SEQ ID NO: 27), y el producto se digirió con Sad y EcoRI antes de insertarse en los mismos sitios de pCAMBIApromoPlasto para crear pCAMBIAPlasto . 3. Ensamble del cásete de expresión H5 Un fragmento que . codifica hemaglutinina de la cepa de influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1; No. de Acc. LANL ISDN 125873) se sintetizó por Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, EUA) . El fragmento producido, que contiene la región que codifica H5 completa (SEQ ID NO. 17) incluyendo el péptido de señal nativo flanqueado por un sitio HindIII inmediatamente cadena arriba del ATG inicial,, y un sitio Sad inmediatamente cadena abajo del codón de detención (TAA) , se presenta en la SEQ ID NO: 28 (y SEQ ID NO.29 en el caso del H5 mutante). La región que codifica H5 se clonó en un cásete de expresión con base en plastocianina por el método de ligación con base en PCR presentado en Daryeau et al. (1995). Brevemente, una primera amplificación PCR se obtuvo usando cebadores Plato-443c (SEQ ID NO: 30) y SpHA ( Ind) -Plasto . r (SEQ ID NO: 31) y pCAMBIA promoPlasto como plantilla. En paralelo, una segunda amplificación se realizó con cebadores Plasto-SpHA ( Ind) . c (SEQ ID NO: 6) y HA ( Ind) -Sac . r (SEQ ID NO: 32) con fragmentos que codifican H5 como plantilla. La amplificación obtenida de ambas reacciones se mezclaron juntas y la mezcla sirve como plantilla para una tercera reacción (reacción de ensamble) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 4) y HA ( Ind) -Sac . r (SEQ ID NO: 33) como cebadores. El fragmento resultante se digirió con BamHI (en el promotor de plastocianina ) y Sad (en el extremo 3' del fragmento) y clonó en pCAMBIAPlasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante, nombrado 660, se presenta en la Figura 5 mientras que el plásmido resultante de la proteina H5 "mutada" se nombró 680.
Un constructo HcPro (35HcPro) se preparó como se describe en Hamilton et al. (2002). Todos los clones se procesaron por secuencia para confirmar la integridad de los constructos. Las plásmidos se usaron para transformar Agrobacterium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, EUA) por electroporación (Mattanovich et al., 1989). La integridad de todas las cepas A. tumefaciens se confirmaron por mapeo de restricción. 4. Preparación de biomasa, inoculo, agroinfiltración, y cosecha de la planta Las plantas de Nicotiana benthamiana se hicieron crecer de semillas en llanos rellenados con un sustrato de musgo de chícharo comercial. Las plantas se permitieron crecer en el invernadero bajo un fotoperiodo 16/8 y un régimen de temperatura de 25°C día/20°C noche. Tres semanas después de la siembre, las plántulas individuales se seleccionaron, transplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales bajo las mismas condiciones ambientales. . Antes de la transformación, los brotes de ápice y axilares se removieron en varias veces como se indica a continuación, ya sea al apretar los brotes de la planta, o al tratar químicamente la planta.
Las Agrobacterias transfectadas con plásmidos 660 ó 680 se hicieron crecer en un medio YEB complementado con ácido 2- [N-morfolino] etansulfónico 10 mM (MES), acetosiringona 20 µ?, 50 yg/ml de canamicina y 25 pg/ml de carbenicilina pH 5.6 hasta que alcanzan un OD600 entre 0.6 y 1.6. Las suspensiones •de Agrobacteria se centrifugaron antes del uso y volvieron a suspender en medio de infiltración (MgC12 10 mM y MES. 10 mM pH 5.6). La infiltración por jeringa se realizó como se describe por Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological ethods, 105:343-348). Para infiltración por vacio, las suspensiones A. tumefaciens se centrifugaron, volvieron a suspender en el medio de infiltración y almacenaron durante la noche a 4°C. En el día de la infiltración, los lotes de cultivo se diluyeron en volúmenes de 2.5 cultivos y se permitieron entibiar antes del uso. Las plantas completas de Nicotiana benthamiana se colocaron al revés en la suspensión bacteriana en un tanque de acero inoxidable hermético bajo un vacio de 20-40 Torr durante 2-min. Después de la infiltración por vacio o jeringa, las plantas se regresaron al invernadero durante un periodo de incubación de 4-5 días hasta la cosecha. 5. Muestreo de la hoja y extracción de la proteina total Después de la incubación, la parte aérea de las plantas se cosechó, congeló a -80°C, aplastó en piezas. Las proteínas solubles totales se extrajeron al homogenizar (Polytron) cada muestra del material de planta congelado-aplastado en 3 volúmenes de Tris 50 mM frío pH 7.4, NaCl 0.15 M, y fluoruro de fenilmetansulfonilo' 1 mM. Después de la homogenización, las mezclas espesas se centrifugaron en 20,000 g durante 20 min a 4°C y estos extractos crudos clarificados (sobrenadantes) se mantienen para análisis. El contenido de proteína total de los .extractos crudos clarificados se determinó por el ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albúmina de suero de bovino como el estándar de referencia. 6. Análisis de proteina e Inmunotinción Las concentraciones de proteina se determinaron por el ensayo de proteina BCA (Pierce Biochemicals , Rockport IL) . Las proteínas se separaron por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas y tiñeron con Coomassie Blue. Los geles teñidos se exploraron y el análisis de densitometría se realiza usando Software ImageJ (NIH) .
Las proteínas de la fracción de elución de SEC se precipitaron con acetona (Bollag et al, 1996) , se volvieron a suspender en 1/5 volúmenes en solución amortiguadora de equilibrio/elución y se separaron por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas y electrotransfirieron en membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis , IN) para inmunodetección . Antes de la inmunotinción, las' membranas se bloquearon con leche descremada al 5% y Tween-20 al 0.1% en solución amortiguadora salina Tris (TBS-T) durante 16-18h a 4°C.
La inmunotinción se realizó por incubación con los siguientes anticuerpos: para la detección de Hl, un anticuerpo monoclonal de anti-influenza A de ratón (Fitzgerald Industries International, Concord, MA, EUA, No. de Cat. 10-150) (2 pg/ml en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 0.1%), y para la detección de H5, un anticuerpo anti-H5 de conejo (Vietnam) ( Iraraune Technology, Woodside, NY, EUA, No. de Cat. IT-003-005V) diluido 1/4000 en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 0.1%. Un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, EUA, No. de Cat. 115-035-146) (diluido 1/12 000 en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 0.1%) se usó como anticuerpo secundario. Los complejos inmunoreactivos se detectaron por quimioluminiscencia usando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation) . La conjugación de la enzima de peroxidasa de raíz de rábano de anticuerpo IgG humano se llevo a cabo al usar, el kit de conjugación de Peroxidasa Activada EZ-Link Plus® (Pierce, Róckford, IL) .
El ensayo de hemaglutinación para H5 fue con base en un método descrito por Nayak. and Reichl (2004) . Brevemente, las diluciones dobles en serie de las muestras de prueba (100 yL) se hicieron en placas de microtitulación de 96 pozos de fondo V que contienen 100 pL. PBS, partiendo de 100 pL de muestra diluida por pozo. Cien mililitros de una suspensión de glóbulos rojos de caballo al 0.25% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) se agregaron a. cada pozo, y las placas se incubaron durante 2h a temperatura ambiente. El reciproco de la dilución más alta que muestra hemaglutinación completa se registró como actividad HA. En paralelo, un estándar HÁ recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) se diluyó en PBS y corrió como un control en cada placa. 7. Purificación H5 VLP 660 o 680 hojas congeladas infiltradas de N. bentamiana se homogeneizaron en 1.5 volúmenes de 50 mM Tris pH 8, NaCl 50 mM y 0.04% meta-bisulfito de sodio usando una licuadora comercial. El extracto resultante se complemento con 1 mM PMSF y se ajustó a pH 6 con ácido acético 1 M antes de calentarse a 42°C durante 5 min. La Tierra diatomácea (DE) se agregó al extracto tratado por calor para adsorber los contaminantes precipitados por el cambio de pH y tratamiento de calor, y la mezcla espesa se filtró a través de un filtro de papel Whatman. El extracto ¦ clarificado resultante se centrifugó a 10,000 x g durante 10 minutos a TA para remover DE residual, pasado a través de filtros Acropack 20 0.8/0.2 pm y carga sobre una columna de afinidad de fetunina-agarosa (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA) . Después de una etapa de lavado en 400 mM NaCl, 25 mM Tris pH 6, proteínas enlazadas se eluyeron con NaCl 1.5 M, 50 mM MES pH 6. Las VLP eluidas se complementaron con Tween-80 a una concentración final de 0.0005% (v/v) . Las VLP se concentraron en una membrana M CO Amicon 100 kDa, centrifugada a 10,000 x g durante 30 minutos a 4°C y se re-suspende en pH 7.4 PBS con Tween-80 0.01% y timerosal 0.01%. Las VLPs suspendidas se esterilizan por filtración antes de usar. 8. Estudios animales Los estudios en la respuesta inmunitaria a administración de VLP de influenza se realizaron con ratas Wistar hembras de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories). Trece ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos que van desde tres para el grupo control hasta cinco animales para ambos grupos la vacuna tipo natural de VLP H5 hecha de planta. (660) y los grupos de vacuna mutante (680) . Ocho grupos se usaron para inmunización int amuscular y seis grupos se usaron para probar la vía intranasal de administración. Todos los grupos se inmunizaron en un régimen de dos dosis, la inmunización de estimulo que se hace 14 días después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, ratas no anestesiadas se inmunizaron con ya sea la vacuna de VLP H5 hecha de planta (15 µ?) , la forma mutante de VLP H5 hecha de planta de la vacuna o PBS.
Todas las preparaciones de antígeno se mezclaron con Hidrogel de aluminio a una concentración final de 1% (alumbre; Accurate Chemical and Scientific Corporation, Wesbury, NY, US) en una relación de volumen 1:1 antes de las inmuni zaciones .
Recolección de sangre y recolección de bazo La colección de bazo de vena yugular se realizó catorce días después de la primera inmunización y catorce días después de la segunda inmunización en animal anestesiado. El suero se recolectó por centrifugación en 8000 g durante 10 min .
Tres semanas después, de la segunda inmunización, las ratas se anestesiaron con gas C02 e inmediatamente sobre la terminación, punción cardiaca se usó para colectar sangre.
La colección de sangre se realizó en bazos recolectados de ratas que se colocaron en RPMI complementado con gentamicina y molieron en un tubo cónico 50 mi con émbolo de una jeringa de 10 mi. Los Bazos molidos se enjuagaron 2 veces y centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min y re-suspendieron en solución amortiguadora de lisis ACK durante 5 min a temperatura ambiente. Los esplenocitos se lavaron en gentamicina PBS, re-suspendieron en RPMI 5% y contaron. Los esplenocitos se usaron para ensayo de proliferación.
Concentraciones de anticuerpo : A/Vietnam/?203/2004 (H5N1) ; A/ñnhui/1/05 (H5N1) ; A/pavos/Pavos/1/05 (H5N1) ; A/New Caledonia/20/99 (H1N2 Las concentraciones de anticuerpo anti-influenza de sueros se midieron en 14 días después de la primera inmunización asi como 21 días después de la segunda inmunización (en el sacrificio) . Los concentraciones se determinaron por ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) usando el virus inactivado A/Indonesia/5/05 como el antigeno de recubrimiento. Los concentraciones de punto final se expresaron como el valor reciproco de la dilución mayor que alcanza un valor OD de al menos 0.1 mayor que el de muestras de control negativo.
Para la determinación de clase de anticuerpo (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM) , las concentraciones se evaluaron en sangrado final por ELISA como se describió previamente.
Concentraciones de inhibición de hemaglutinación (HI) Las concentraciones de inhibición de hemaglutinación (HI) de sueros se midieron en los días 14 y 35 después de la segunda inmunización como se describió previamente (WHO 2002; endal 1982). Las Preparaciones de virus inactivados de las cepas A/Indonesia/5/05; ' . A/Anhui/1/05 (H5N1); A/pavos/Pavos/1/05 (H5N1) ¦ o A/Vietnam/1203/2004 se usaron para probar muestras de suero de rata para la actividad HI. Los sueros se pre-trataron con enzima II que destruye el receptor (RDE II) (Denka Seiken Co . , Tokyo, Japan) preparado de Vibrio cholerae . (Kendal 1982) . Los ensayos HI se realizaron con células de glóbulos rojos de caballo al 0.5%. Los concentraciones de anticuerpo HI se definieron como el reciproco de la dilución mayor que causa la inhibición completa de la aglutinación.
Resultados La reactividad de los sueros de las ratas inmunizadas con ya sea la VLP tn o la VLP mutante se evaluó 14 días después de la primera (Dia 14) o la segunda inmunización (Día 35) . Todas las ratas se inmunizaron con 15 yg del antigeno formulado con alumbre. La inmunoreactividad se evaluó contra virus H5N1 de subtipo 1 (A/Vietnam/I 203/04), subtipo 2.1 (A/Indonesia/5/05) , subtipo 2.2 (A/pavos/Pavos/1/05 ) y subtipo 2.3 (A/Anhui/1/05) . Después de la primera dosis, la VLP mutante induce una reacción de anticuerpo mayor que el tn para todas las cepas, de H5N1 probadas (Figura 6) . La inmunoreactividad contra la cepa aviar A/pavos/Pavos/1/05 fue estadísticamente importante (p<0.05) después de la primera dosis. La inmunoreactividad también se evaluó contra virus de H1N1 (A/New Caledonia/20/99 ) que muestran inmunoreactividad después de inyección de estimulo. GMT : titulo de media geométrica. Los valores, son el GMT (ln) de concentraciones de punto final recíprocos de cinco ratas por grupo. Barras representan desviación media. * p< 0.05 comparado con la VLP tn .
Las concentraciones HI de ratas inmunizadas con la VLP tn o el mutante se evaluaron 14 días después de la primera (Día 14) o la segunda (Día 35) inmunización. Las respuestas de anticuerpo HI se midieron usando virus H5N1 completos inactivados. Después de la primera inmunización, la VLP mutante induce una respuesta de anticuerpo HI mayor que la VLP tn contra todos lo.s virus H5N1 probados (Figura 7) . La importancia estadística se alcanzó por cepas de influenza A/Indonesia/5/05 y A/pavos/Pavos/1/05. GMT: título de media geométrica. Los valores son el GMT (ln) de concentraciones de punto final recíprocos de cinco ratas por grupo. Las barras representan desviación media. * p< 0.05 y comparadas con VLP tn .
Estos datos fuertemente sugieren que la proteína H5 no glicosilada "mutada" representa una alternativa muy interesante a la proteína H5 nativa para la producción de las VLPs como espectro amplio y vacuna de gripe rápida-activa .
Todas las citas se incorporan en la presente como referencia.
La presente invención se ha descrito con respecto a una o más modalidades particulares. Sin embargo, Será evidente para personas expertas en la técnica que un número de variaciones y- modificaciones se puede hacer sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.
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Claims (80)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un cásete de expresión caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica un dominio HAl de hemaglutinina (HA) de virus de influenza, en donde el dominio HAl es totalmente o parcialmente libre de glicosilación ligada a N, ligado operativamente a una región reguladora activa en un organismo hospedero sin sialilación.
2. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región reguladora se selecciona del grupo que consiste de: región reguladora de plastocianina; promotor de napina, el promotor de cruciferina, o una región reguladora obtenida de Ribulosa 1 , 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) , proteina que enlaza clorofila a/b, ST-LS, promotor de poliedro, y el promotor gp6 .
3. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región reguladora de plastocianina es a partir de alfalfa (Medicago sativd) .
4. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque el ácido nucleico se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 17, en donde uno o más aminoácidos que codifican residuo son seleccionados del grupo que consiste de: 154, 165 y 286 es una no asparagina de codificación.
5. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque uno o más aminoácidos que codifican residuos seleccionados del grupo que consiste de: 154, 165 y 286 es alanina de codificación.
6. El cásete de expresión, caracterizado porque el ácido nucleico tiene 90% de identidad al ácido nucleico de conformidad como se define en la reivindicación 4 ó 5, por lo que el aminoácido 154, 165 o 268 es como se definió en la reivindicación 4 ó 5.
7. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el ácido nucleico se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 17, en donde uno o más aminoácidos que codifican residuos seleccionados del grupo que consiste de: 154+2, 165+2 y 286+2 es una no serina y no treonina de codificación.
8. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque uno o más aminoácidos que codifican residuo seleccionados del grupo que consiste de: 154+2, 165+2 y 286+2 es alanina de codificación.
9. El cásete de expresión, de conformidad con la reivindicación 7 ó 8, caracterizado porque el ácido nucleico tiene 90% de identidad al ácido nucleico como se define en la reivindicación 7 ó 8, por lo que el aminoácido que codifica residuo 154+2, 165+2 o 268+2 es como se definió en la reivindicación 7 ó 8.
10. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el ácido nucleico es como se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 29.
11. El cásete de expresión, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico tiene 90% de identidad a la SEQ ID NO. 29, por lo que los aminoácidos que codifican residuos 154, 165 y 268 son idénticos a aquellos de la SEQ ID No. 29.
12. Un método para producir partículas del tipo de virus de influenza (VLPs) en un organismo hospedero sin sialilación, el método caracterizado porque comprende: a) introducir un ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 11, y b) incubar el hospedero o una porción por lo tanto bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, produciendo de tal modo las VLPs.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque, en la etapa de introducir (etapa a) , el ácido nucleico puede ser ya sea expresado de forma transitoria en el hospedero, o establemente expresado en el hospedero.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque el organismo hospedero sin sialilación se selecciona del grupo que consiste de: planta, insecto y levadura.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de: una célula de planta, una planta completa y una porción del mismo.
16. El ácido . nucleico de conformidad con la rei indicación 15, caracterizado ' porque la célula de planta es de N. benthiamina.
17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende una etapa de: c) cosechar el hospedero y purificar las VLPs.
18. Una partícula tipo virus (VLP) caracterizada porque comprende una molécula de hemaglutinina de influenza que tiene un dominio HAl, en donde uno o más del sitio de glicosilacion ligado a N del subdominio HAl se ha suprimido.
19. Una partícula tipo virus (VLP) caracterizada porque comprende un dominio HAl de hemaglutinina de virus de influenza (HA) totalmente o parcialmente libre de glicosilación ligada a N, y uno o más de un lipido hospedero, en donde el hospedero es un organismo hospedero sin sialilación.
20. La partícula tipo virus de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el lipido hospedero es un lipido de planta.
21. Una partícula tipo virus (VLP) de conformidad con las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque comprende un virus de influenza HA que porta N-glicanos específicos de planta, o N-glicanos modificados.
22. La VLP de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque uno o más de los sitios de glicosilación ligados a N de dominio HA1 se suprimen, por lo que el sitio de glicosilación que se suprime se presenta originalmente en una porción de cabeza globular inmunogénica de la proteína.
23. La VLP de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el sitio de glicosilación suprimido está dentro o cerca de un subdominio que enlaza al receptor de la cabeza globular inmunogénica o dentro o cerca de un subdominio F' 2 del dominio HA1.
24. La VLP de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizada porque el sitio de glicosilación consiste de una triada de reconocimiento de glicosilación N-X-S/T en donde N es asparagina, X es cualquier aminoácido excepto prolina, S es serina y T es treonina.
25. La VLP de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque uno o más residuos de asparagina compuestos en una triada de reconocimiento de glicosilación N-X-S/T se sustituye por un aminoácido sin asparagina.
26. La VLP de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el residuo de asparagina se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: Leu, Val, Thr, Ser y Ala.
27. La VLP de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el residuo de asparagina se sustituye por una alanina.
28. La VLP de conformidad con las reivindicaciones 22 o 23, caracterizada porque uno o más residuos de serina o treonina compuestos en una triada de reconocimiento de glicosilación N-X-S/T se sustituye por un aminoácido sin serina y sin treonina.
29. La VLP de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque uno o más residuos de serina o treonina compuestos en una triada .de reconocimiento de glicosilación N-X-S/T se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: Ala, Val, lie y Leu.
30. La VLP de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el residuo de serina o treonina se sustituye por una alanina.
31. La VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 22 hasta 30, caracterizada porque el sitio de glicosilación está ' en una posición que corresponde a cualquier triada ubicada entre aminoácidos 39 hasta 331 en donde la numeración es de acuerdo con cepa A/Vietnam/1194 /0 , por lo que el sitio de glicosilación N hace la molécula HA más antigénica con respecto a anticuerpos específicos para una molécula nativa.
32. La VLP de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el sitio de glicosilación está en una posición seleccionada del. grupo que consiste de: 154,. 165 y 286.
33. La VLP de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque tiene un sitio de glicosilación suprimido.
34. La VLP de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque tiene dos sitios de glicosilación suprimidos.
35. La VLP de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque tiene tres sitios de glicosilación suprimidos.
36. La VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 22 hasta 35, caracterizada porque la influenza es de tipo A y de tipo B.
37. La VLP de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la influenza es de tipo B.
38. La VLP de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la HA es de uno o más de un subtipo Ha seleccionado del grupo que consiste de: Hl, H2, H3, H , H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 y H16.
39. La VLP de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el subtipo HA es uno o más de un subtipo seleccionado del grupo que consiste de: Hl, H2, H3, H5, H7, H9, y H10.
40. La VLP de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el subtipo HA es uno o más de un subtipo seleccionado del grupo que consiste de: Hl, H3, H5 y H7.
41. La VLP de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la hemaglutinina de influenza es de tipo B o de subtipo H3 de tipo A.
42. La partícula tipo virus (VLP) de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína HA de influenza es Indonesia H5.
43. La VLP de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la VLP es inmunogénica .
44. Una partícula tipo virus (VLP) caracterizada porque se codifica por el cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11.
45. La VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44 para usar como una vacuna para la prevención o tratamiento de una infección viral en un sujeto.
46. La VLP de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el sujeto se selecciona del grupo que consiste de: humano o aves.
47. La VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44 para la prevención o tratamiento de una infección viral de influenza en un sujeto.
48. La VLP de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el sujeto se selecciona del grupo que consiste de: humano o aves.
49. Una composición caracterizada porque comprende una dosis efectiva de una- VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
50. La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración oral, intradérmica , intranasal, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, o subcutánea .
51. Una composición para inmunizar un individuo en riesgo de contraer una enfermedad viral de influenza, la composición caracterizada porque comprende: una VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
52. La composición de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la composición está en forma de liquido, suspensión, sólido o polvo.
53. La composición de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la composición es adecuada para administración oral, intradérmica , intranasal, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa o subcutánea.
54. Una composición de vacuna caracterizada porque comprende una dosis inmunológicamente efectiva de una VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44, en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable con o sin la presencia de un adyuvante.
55. La vacuna de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable es adecuado para administrarse oralmente, intradérmicamente, intranasalmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente o subcutáneamente.
56. La vacuna de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque carece de adyuvante.
57. Una vacuna viral caracterizada porque comprende: una VLP de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44, en mezcla en un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
58. La vacuna de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque es una vacuna de humano o de ave.
59. La vacuna de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es adecuada para la profilaxis antes de aparecer los síntomas; o para el tratamiento de infección después de la aparición de los síntomas.
60. Un método para inducir inmunidad a una infección de virus de influenza en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar la partícula tipo virus codificada por el cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, y un portador farmacéuticamente aceptable.
61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la partícula tipo virus se administra a un sujeto oralmente intradérmicamente, intranasalmente , intramuscularmente , intraperitonealmente , intravenosamente o subcutáneamente.
62. Un método para inducir inmunidad a una infección de virus de influenza en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una dosis efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 49, o una vacuna de conformidad con la reivindicación 54.
63. Un método para inducir inmunidad a una infección de virus de influenza en un' sujeto, caracterizado porque comprende administrar la partícula tipo virus de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 18 hasta 44.
64. El método de. conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la partícula' tipo virus se administra a un sujeto oralmente, intradérmicamente , intranasalmente , intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente, o subcutáneamente .
65. El método de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 60 hasta 64, caracterizado porque el sujeto es seleccionado del grupo que comprende humanos,' primates, caballos, cerdos, aves (aviar), aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, patos, gansos, aves de corral, pollos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigres, leopardos, algalia, visón, marta de piedra, hurones, animales domésticos, ganado, ratones, ratas, foca, ballenas y similares.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el sujeto se selecciona del grupo que consiste de: humanos y aves.
67. El método de conformidad con la reivindicación 66,-caracterizado porque el sujeto es humano.
68. Un recipiente caracterizado porque comprende la vacuna de conformidad con la reivindicación 5 .
69. El recipiente de conformidad con la reivindicación 68, el recipiente caracterizado porque contiene una dosis unitaria sencilla.
70. El recipiente de conformidad con la reivindicación 68, el recipiente caracterizado porque está en forma de dosificación múltiple.
71. El recipiente de conformidad con la reivindicación 68, 69 o 70, el recipiente caracterizado porque es una j eringa .
72. Una jeringa pre-llenada con la vacuna de conformidad con la reivindicación 54.
73. Un kit caracterizado porque comprende un recipiente de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 68 hasta 72, e instrucciones en cómo usar/administrar la vacuna.
74. Una célula de planta transformada con un cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11.
75. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque se transforma transitoriamente o establemente.
76. Una porción de una planta transformada con un cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11.
77. La porción de una planta de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque se transforma transitoriamente o establemente.
78. Una planta transformada con un cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11.
79. La planta de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque se transforma transitoriamente o establemente.
80. Una célula de Agrobacterium transfectada con un cásete de expresión de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11.
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