KR20240019109A - 암의 치료에 이용하기 위한 특정 braf 억제제(패러독스 브레이크) 및 pd-1 축 결합 길항제의 조합물 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 BRAF 억제제 N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-l-술폰아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화합물 및 PD-1 축 결합 길항제의 조합물, 그리고 특히 암의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제로서 상기 조합의 용도에 관계한다.

Description

암의 치료에 이용하기 위한 특정 BRAF 억제제(패러독스 브레이크) 및 PD-1 축 결합 길항제의 조합물
본원 발명은 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물뿐만 아니라 이의 용도 및 약학 조성물에 관한 것이다.
본원 발명은 특히 암의 치료에 이용하기 위한 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제를 제공하는데, 여기서 BRAF 억제제는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화합물이다:
(I).
돌연변이체 BRAF는 표적화가능 발암인자이며, 현재까지 3가지 BRAF 억제제 (BRAFi) (베무라페닙, 다브라페닙 엔코라페닙)가 시장에 출시되어 BRAFV600E 양성 흑색종에 효능을 보여주었다. 그러나, 약제 내성의 급속한 획득이 거의 보편적으로 관찰되며, 표적 요법에 대한 치료적 유익성의 지속 기간이 여전히 제한적이다.
게다가, 개발된 1세대 BRAF 억제제는 BRAF 야생형 (WT) 모형에서는 MAPK 자극 활성을 나타내는 반면, BRAFV600E 유발 종양에서는 MAPK 신호전달을 억제하는 예상치 못한 "패러독스" 능력을 드러냈다 (N Engl J Med 2012; 366:271-273; 및 British Journal of Cancer volume 111, pages640-645(2014)).
이후, RAF 패러독스에 대한 기계론적 연구에서, WT BRAF 및 RAF1 활성화는 활성화된 RAS (KRAS, NRAS, HRAS)에 의해 증진된 세포막 전위 및 동종 및/또는 이종이량체화를 포함한 사건의 복잡한 단계를 필요로 하는 반면, 종양원성 BRAFV600E는 단량체성 세포질 형태의 MEK 1/2를 인산화한다는 것이 명확하게 밝혀졌다 (Nature Reviews Cancer volume 14, pages455-467(2014)).
WT BRAF 또는 RAF1 프로토머에 베무라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙과 같은 1세대 BRAF 억제제의 결합은 RAF 동종 및/또는 이종이량체화 및 새로 형성된 RAF 이량체의 막 연결을 신속하게 유도한다. 이량체성 입체형태에서, 하나의 RAF 프로토머는 두 번째의 입체형태적 변화를 알로스테릭하게 유도하여, 억제제의 결합에 불리한 키나아제 활성 상태 및 중요하게는, 입체형태를 야기한다. 약물 처리에 의해 유도된 이량체는 결과적으로, 경로가 과활성화된 결합되지 않은 프로토머에 의해 작동된 촉매작용에 의한 MEK 인산화를 증진한다.
종양은 BRAFi 치료에서 거의 피할 수 없으며, 대부분의 경우 기전에는 RAF 이량체화를 유발하는 획득된 능력이 포함된다. 이러한 효과는 MEK 억제제 (MEKi) 병용 치료에 의해 상쇄될 수 있다. 그러나, 이들 작용제는 인간에서 MEKi 달성가능 용량을 제한하는 매우 불량한 치료 지수를 나타낸다. 결과적으로, 1세대 BRAFi 및 MEKi의 병용 요법에 대한 내성이 RAF 패러독스 활성화에 의해 여전히 매개된다. 따라서 이들 병용 요법의 임상적 유익성은 여전히 제한적이다.
최근에, T 세포 기능장애 또는 아네르기가 억제 수용체, 예정된 사멸 1 폴리펩티드 (PD-1)의 유도되고 지속된 발현과 동시에 일어난다는 것이 밝혀졌다. 이의 리간드 중에서 하나인 PD-L1은 많은 암에서 과발현되고 불량한 예후와 종종 연관된다 (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). 흥미롭게도, 대다수의 종양 침윤 T 림프구는 정상 조직에서 T 림프구 및 말초혈 T 림프구와는 대조적으로, PD-1을 지배적으로 발현하는데, 이는 종양 반응성 T 세포에서 PD-1의 상향조절이 손상된 항종양 면역 반응에 기여할 수 있다는 것을 시사한다 (Blood 2009 1 14(8): 1537).
본원 발명은 암, 특히 흑색종, 비소세포 폐암 및 연수막 암의 치료에 이용하기 위한, 화학식 (I)의 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제의 새로운 조합에 관계한다. 화학식 (I)의 화합물은 시판 중인 1세대 BRAF 억제제: 엔코라페닙, 다브라페닙 및 베무라페닙 (패러독스 유도인자)과 비교할 때, MAPK 신호전달 경로의 무시할 만한 패러독스 활성화를 보여주는 BRAF 억제제 (패러독스 브레이크)이다. 이러한 특성 이외에, 화학식 (I)의 화합물은 또한 매우 강력한 뇌 침투 특성을 가지므로, 연수막 암 또는 뇌에 전이된 암의 치료를 위한 시급히 요구되는 대안 요법을 제공한다. 본원 발명은 1세대 BRAF 억제제로 치료를 받은 환자에서 빈번하게 관찰되는 빠르게 획득된 치료 내성을 극복할 잠재력이 있는, BRAF 연관된 종양에 대한 강한 조합 활성을 나타내는 암 요법에 이용하기 위한 새로운 조합을 개시한다. 암의 치료에 이용하기 위한 본원 발명에 개시된 바와 같은 조합은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 단일요법의 부가 효과를 뛰어넘는 예상치 못한 조합 활성을 제공한다.
도 1은 1세대 BRAFi A375 BRAFV600E/NRASQ61K에 대해 내성인 세포 모형에서 P-ERK 수준에 대한, 단독으로 또는 MEKi 코비메티닙과 조합으로 화합물 Ia 또는 패러독스 유도인자 엔코라페닙 중 어느 한 가지의 활성을 보고한다.
도 2는 도 3 및 4에 보고된 연구 설계의 개략적 표시를 나타낸다.
도 3은 동계 모형 YUMM1.7로부터 유래된 동종이식 종양에 대한 화합물 Ia 5 mg/kg, 항생쥐 PD1 12.5 mg/kg, 그리고 이들의 조합 중 어느 한 가지의 생체내 항종양 활성을 보고한다. 생쥐가 31일차 때까지 치료를 받았고, 그 후에 약물 치료가 중단되고 생쥐가 종양 재성장의 증거에 대해 모니터링되었다. 위쪽 그래프는 상이한 코호트에 대한 평균 종양 성장 [mm3]을 나타낸다. 중간 그래프는 상이한 코호트의 개별 생쥐의 종양 성장을 나타낸다. 아래쪽 표는 개별 코호트에서 58일차에 종양이 검출 가능한 생쥐를 요약한다.
도 4는 동계 모형 YUMM1.7로부터 유래된 동종이식 종양에 대한 화합물 Ia 1 mg/kg, 항생쥐 PD1 12.5 mg/kg, 그리고 이들의 조합 중 어느 한 가지의 생체내 항종양 활성을 보고한다. 생쥐가 45일차 때까지 치료를 받았고, 그 후에 약물 치료가 중단되고 생쥐가 종양 재성장의 증거에 대해 모니터링되었다. 위쪽 그래프는 상이한 코호트에 대한 평균 종양 성장 [mm3]을 나타낸다. 중간 그래프는 상이한 코호트의 개별 생쥐의 종양 성장을 나타낸다. 아래쪽 표는 개별 코호트에서 58일차에 종양이 검출 가능한 생쥐를 요약한다.
도 5는 도 6 및 7에 보고된 면역표현형분석 실험에 대한 생쥐 치료의 계통도를 보여준다.
도 6은 유세포 분석법을 통해 정량화될 때, 종양 내에 총 면역 세포 (위쪽) 및 T 세포 (아래쪽) 침윤물을 보고한다. 총 면역 세포 침윤물은 3일차 및 6일차에 생존 세포에 대해 mCD45 양성의 백분율로서 표현되었고, T 세포 침윤물은 mm2당 mCD3 양성 세포로 표현되었다.
도 7은 운반제, 화합물 Ia 5 mg/kg (매일), mPD1 12.5 mg/kg (단회 치료), 또는 이들의 조합 중 어느 한 가지로 3일 동안 치료된 종양의 생쥐 면역 세포 마커 CD45의 면역조직화학 분석을 보고한다.
용어 "IC50"은 특정한 측정된 활성의 50%를 억제하는 데 필요한 특정 화합물의 농도를 지칭한다.
용어 "억제제"는 특정 수용체에 대한 특정 리간드의 결합과 경쟁하거나, 이를 감소시키거나 예방하는 화합물, 또는 특정 단백질의 기능을 감소시키거나 예방하는 화합물을 표시한다. 특히, 본원에서 이용된 바와 같은 억제제는 개별 표적의 활성을 표적으로 하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물을 지칭하며, 특정 억제제는 1 μM 미만, 500 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 또는 1 nM 미만의 IC50 값을 갖는다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 생물학적으로 바람직하지 않거나 달리 바람직하지 않은 경우가 아닌, 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 유용성과 특성을 유지하는 화학식 (I)의 화합물의 염을 지칭한다. 이들 염은 예를 들면, 무기 산 예컨대 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 특히 염화수소산, 그리고 유기 산 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산, N-아세틸시스테인 등으로 형성될 수 있다. 이에 더하여, 이들 염은 유리 산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염에는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 유기 염기로부터 유래된 염에는 일차, 이차 및 삼차 아민, 자연 발생된 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 시클릭 아민, 그리고 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리이민 수지 등의 염이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 화학식 (I)의 화합물의 특정한 약학적으로 허용되는 염은 염산염, 메탄술폰산 염 및 구연산 염이다.
용어 "용매화합물"은 용매와 용질의 비공유 화학양론적 또는 비화학양론적 조합을 지칭한다. 용어 "수화물"은 물과 용질의 비공유 화학양론적 또는 비화학양론적 조합을 지칭한다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 염은 용매화되지 않은 형태뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 용매 예컨대 아니솔, 디클로로메탄, 톨루엔, 1,4-디옥산, 물 등으로 용매화된 형태로 존재할 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 하나의 비대칭 중심을 포함하고, 광학적으로 순수한 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물 예컨대 예를 들면, 라셈체의 형태로 존재할 수 있다.
Cahn-Ingold-Prelog 규약에 따라서 비대칭적 탄소 원자는 "R" 또는 "S" 입체형상일 수 있다.
본원에서 목적으로 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 아미노산 변화의 개수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양상에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에 설명된 것들을 포함한, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 방법은 하기에 설명된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변형을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 지칭하는데, 이런 변형은 항원에 대한 항체의 친화성에서 개선을 유발한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 및 scFab); 단일 도메인 항체 (dAb); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "링커"는 펩티드 링커를 지칭하고, 바람직하게는 적어도 5개 아미노산의 길이, 바람직하게는 5개 내지 100개, 더 바람직하게는 10개 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 한 실시형태에서 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G = 글리신, S = 세린, 그리고 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5, 그리고 m= 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n= 2 또는 3, 더 바람직하게는 x = 4, n= 2이다. 한 실시형태에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다.
용어 "면역글로불린 분자"는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH), 그 이후에 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL), 그 이후에 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 또는 μ (IgM)으로 불리는 5가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예를 들면 γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) 및 α2 (IgA2)로 더 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 구성된다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 그리고 반대로, 참조 항체는 경쟁 분석에서 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 분석이 본원에 제공된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는, 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우에, 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수도 있는데, 상기 부분은 에피토프로 명명된다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인 (항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 세분화될 수 있다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG1 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 Fc-영역 이펙터 기능을 감소시키기 위한 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1 아이소타입이다. 다른 양상에서, 항체는 IgG2 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG4 항체의 안정성을 개선하기 위한, 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 아이소타입이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
본 출원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역" 또는 "인간 불변 영역"은 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 표시한다. 이런 불변 영역은 당해 분야에 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 설명된다 (예를 들면 Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788을 또한 참조한다). 본원에서 달리 명시되지 않으면, 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242에 설명된 바와 같이, Kabat의 EU 색인으로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "세포독성 작용제"는 세포 기능을 억제하거나 예방하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성 작용제에는 방사성동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 중격제); 성장 억제제; 효소 및 이들의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소뿐만 아니라 이들의 단편 및/또는 변이체; 그리고 아래에 개시된 다양한 항종양 또는 항암 작용제가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작한다, 조작된, 조작하는"은 펩티드 백본의 임의의 조작, 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 고려된다. 조작에는 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근방식의 조합이 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 것으로 의미된다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들면, Fc 수용체에 감소된 결합, 또는 다른 펩티드와의 증가된 연관을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 서열 결실과 삽입은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복시 말단 결실과 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어, Fc 영역의 결합 특징을 변경하는 목적으로, 비보존성 아미노산 치환, 다시 말하면, 한 가지 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환에는 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체 (예를 들면 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록실리신)에 의한 대체가 포함된다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에 널리 알려진 유전학적 또는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 유전학적 방법에는 특정 부위 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등이 포함될 수 있다. 유전공학 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법 또한 유용할 수 있는 것으로 예기된다. 다양한 지정이 동일한 아미노산 돌연변이를 지시하기 위해 본원에서 이용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
작용제, 예를 들면, 약학 조성물의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 이용된다. 상기 용어에는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역이 포함된다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, EU 넘버링 시스템)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 Fc 영역을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 달리 표시되지 않으면, C 말단 글리신-리신 디펩티드 없이 표시된다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, EU 넘버링 시스템)를 포함한다. 한 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 설명된 바와 같이, EU 색인으로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위의 연결을 증진하는 변형"은 동종이량체를 형성하는, Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 연관을 감소시키거나 예방하는 펩티드 백본의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 연결을 증진하는 변형은 특히, 연결하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각 (다시 말하면, Fc 도메인의 첫 번째와 두 번째 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 여기서 이들 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 연결을 증진하기 위해 서로 상보적이다. 예를 들어, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 연결을 각각, 입체적으로 또는 정전으로 우호적으로 만들기 위해, 이들 중에서 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, 각 아단위 (예를 들면 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수도 있는, 첫 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 두 번째 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이량체화가 일어난다. 일부 실시형태에서 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (CDR) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 아래의 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 포함할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 예컨대 NS0 또는 CHO 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자가 유전자도입된 동물 (예를 들면 생쥐)로부터 단리된 항체 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이런 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 가변과 불변 영역을 갖는다. 본원 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 초돌연변이가 진행되었다. 따라서 이들 재조합 항체의 VH와 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH와 VL 서열로부터 유래되고 이들 서열에 관련되지만 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 한 양상에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 양상에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 양상에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDR의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 각 영역, 예를 들면 "상보성 결정 영역" ("CDR")을 지칭한다.
일반적으로, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에서 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 그리고 VL에서 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 그리고
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
달리 표시되지 않으면, CDR은 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 Chothia, 위와 같음, McCallum, 위와 같음, 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법 시스템에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물에는 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 양상에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 양상에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 포함한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 두 가지 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 백본 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 생성될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 향상시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler ert al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).
"단리된" 핵산은 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에 설명된다.
"나신 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 약학 조성물 내에 존재할 수 있다.
"선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 선천적 IgG 항체는 디설피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로도 불리는 가변 도메인 (VH), 그 이후에 3개의 불변 중쇄 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로도 불리는 가변 도메인 (VL), 그 이후에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실제적으로 또는 완전하게 억제한다. 예를 들어, 본원 발명의 항-PD-Ll 항체는 항원 자극에 대한 T 세포에 의한 기능 반응 (예를 들면, 증식, 사이토킨 생성, 표적 세포 사멸)을 기능장애 상태로부터 복구하기 위해 PD- 1을 통한 신호전달을 차단한다.
"효현제" 또는 활성화 항체는 자신이 결합하는 항원에 의한 신호전달을 향상시키거나 개시하는 것이다. 일부 실시형태에서, 효현제 항체는 자연 리간드의 존재 없이 신호전달을 유발하거나 활성화한다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이런 치료 제품의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 포함한다.
"실제적인 교차반응성이 없음"은 분자 (예를 들면, 항체)가 특히 실제 표적 항원과 비교하여, 분자의 표적 항원과 상이한 항원 (예를 들면 표적 항원과 밀접하게 관련된 항원)을 인식하지 않거나 이것에 특이적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합할 수 있거나, 또는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만, 바람직하게는 실제 표적 항원과 상이한 항원에 약 2%, 1%, 또는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 구성되는 양으로 결합할 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 정렬의 목적으로 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 대안으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 미국 Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 미국 Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록되고 WO 2001/007611에 설명된다.
달리 표시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, 그리고 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 이용하여, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근 가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 이용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다.
용어 "약학 조성물" 또는 "약학 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 약학 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 약학 조성물 또는 제제에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 운반체에는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "PD-1 축 결합 길항제"는 PD-1 신호전달 축에서 신호전달로부터 발생하는 T 세포 기능장애를 제거하기 위해 - 결과적으로 T 세포 기능 (예를 들면, 증식, 사이토킨 생성, 표적 세포 사멸)을 복원하거나 향상시키기 위해, PD-1 축 결합 파트너 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상의 상호작용을 억제하는 분자를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-L1 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제를 포함한다.
용어 "PD-1 결합 길항제"는 PD-1 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 PD-L1, PD-L2의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 분자이다. 일부 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PD-1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 양상에서, PD-1 결합 길항제는 PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 억제한다. 예를 들어, PD-1 결합 길항제에는 PD-1의 PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 항-PD-1 항체, 이들의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자가 포함된다. 한 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 기능장애성 T 세포를 더 적게 기능장애성이 되도록 만들기 위해 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과 반응을 향상시키기 위해), PD-1을 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이것을 통해 매개되는 음성 동시자극성 신호를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정한 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 설명된 MDX-1106이다. 다른 특정한 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 설명된 Merck 3745이다. 용어 "PD-L1 결합 길항제"는 PD-L1 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 PD-1, B7-1의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 분자이다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PD-L1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 양상에서, PD-L1 결합 길항제는 PD-1 및/또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제한다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제에는 PD-L1 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 PD-1, B7-1의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 항-PD-L1 항체, 이들의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자가 포함된다. 한 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 기능장애성 T 세포를 더 적게 기능장애성이 되도록 만들기 위해 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과 반응을 향상시키기 위해), PD-L1을 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이것을 통해 매개되는 음성 동시자극성 신호를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 양태에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정 양상에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 설명된 MDX-1105이다. 또 다른 특정한 양상에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 설명된 MPDL3280A이다.
용어 "PD-L2 결합 길항제"는 PD-L2 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 PD-1의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 분자이다. 일부 실시형태에서, PD-L2 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PD-L2의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 양상에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-1에 대한 PD-L2의 결합을 억제한다. 일부 실시형태에서, PD-L2 길항제에는 PD-L2 및 이의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 PD-1의 상호작용으로부터 발생하는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 간섭하는 항-PD-L2 항체, 이들의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자가 포함된다. 한 실시형태에서, PD-L2 결합 길항제는 기능장애성 T 세포를 더 적게 기능장애성이 되도록 만들기 위해 (예를 들면, 항원 인식에 대한 효과 반응을 향상시키기 위해), PD-L2를 통한 T 림프구 매개된 신호전달에서 발현된 세포 표면 단백질에 의해 또는 이것을 통해 매개되는 음성 동시자극성 신호를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PD-L2 결합 길항제는 면역부착소이다.
"PD-1 올리고펩티드", "PD-L1 올리고펩티드" 또는 "PD-L2 올리고펩티드"는 각각, 본원에 설명된 바와 같은 수용체, 리간드 또는 신호전달 성분을 각각 포함하는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 음성 동시자극성 폴리펩티드에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. 이런 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법론을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 이용하여 제조되고 정제될 수 있다. 이런 올리고펩티드는 통상적으로 길이에서 적어도 약 5개의 아미노산, 대안으로 길이에서 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아미노산 또는 그 초과이다. 이런 올리고펩티드는 널리 알려진 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 이점에 관하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대한 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술은 당해 분야에 널리 알려져 있다는 점에 유의한다 (참조: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Metk, 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:61 1 -616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30: 10832 ( 1991 ); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991), 및 Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol, 2:668 (1991).
용어 "아네르기"는 T 세포 수용체를 통해 전달된 불완전한 또는 불충분한 신호 (예를 들면, ras-활성화의 부재에서 세포내 Ca+2의 증가)로부터 발생하는, 항원 자극에 대한 불응의 상태를 지칭한다. T 세포 아네르기는 또한, 동시자극의 부재에서 항원으로 자극 시에 발생하여, 세포가 심지어 동시자극의 맥락에서도 항원에 의한 후속 활성화에 불응성이 되도록 야기할 수 있다. 반응이 없는 상태는 종종, 인터류킨-2의 존재에 의해 무효화될 수 있다. 무력성 T 세포는 클론 확장을 겪지 않고 및/또는 이펙터 기능을 획득하지 않는다.
용어 "탈진"은 많은 만성 감염 및 암 동안 발생하는 지속된 TCR 신호전달로부터 발생하는 T 세포 기능장애의 상태로서 T 세포 탈진을 지칭한다. 이것은 불완전한 또는 결함성 신호전달을 통해서가 아닌 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 아네르기와 구별된다. 이것은 불량한 이펙터 기능, 억제 수용체의 지속된 발현, 그리고 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포의 것과 상이한 전사 상태에 의해 정의된다. 탈진은 감염 및 종양의 최적 제어를 방해한다. 탈진은 외인성 음성 조절 경로 (예를 들면, 면역조절성 사이토킨)뿐만 아니라 세포 내재성 음성 조절 (동시자극성) 경로 (PD-1, B7-H3, B7-H4 등) 둘 모두로부터 발생할 수 있다.
"T 세포 기능을 향상시키는"은 T 세포가 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도하거나, 유발하거나 자극하는 것을 의미하거나, 또는 탈진된 또는 비활성 T 세포를 재생하거나 재활성화하는 것을 의미한다. T 세포 기능을 향상시키는 것의 예에는 개입 전 수준에 비하여, CD8+ T 세포로부터 γ-인터페론의 증가된 분비, 증가된 증식, 증가된 항원 반응성 (예를 들면, 바이러스, 병원체, 또는 종양 제거)이 포함된다. 한 실시형태에서, 향상의 수준은 최소 50%, 대안으로 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 1 20%, 150%, 200%이다. 이러한 향상을 측정하는 방식은 당업자에게 공지된다.
"종양 면역성"은 종양이 면역 인식과 제거를 회피하는 과정을 지칭한다. 따라서, 치료적 개념으로서, 종양 면역성은 이런 회피가 약화되고, 그리고 종양이 면역계에 의해 인식되고 공격될 때 "치료"된다. 종양 인식의 예에는 종양 결합, 종양 위축 및 종양 제거가 포함된다.
"면역원성"은 면역 반응을 유발하는 특정 물질의 능력을 지칭한다. 종양은 면역원성이고, 그리고 종양 면역원성을 향상시키는 것은 면역 반응에 의한 종양 세포의 제거를 보조한다. 종양 면역원성을 향상시키는 것의 예에는 항-PDL 항체 및 ME 억제제로 치료하는 것이 포함된다.
"지속된 반응"은 치료의 중단 후 종양 성장을 감소시키는 것에 대한 지속된 효과를 지칭한다. 예를 들어, 종양 크기가 투여 시기의 시작 시점에서 크기와 비교하여, 동일하거나 더 작게 남아있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 지속된 반응은 치료 지속 기간과 적어도 동일하거나, 치료 지속 기간의 적어도 1.5x, 2.0x, 2.5x, 또는 3.0x 길이의 지속 기간을 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료를 받는 개체에서 질병의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질병 진행의 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 개선된 예후가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 질병의 발달을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추는 데 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "암"은 증식성 질환을 지칭한다, 예컨대 암은 결장직장암, 육종, 두경부암, 편평상피 세포 암종, 유방암, 췌장암, 위암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐암 및 중피종뿐만 아니라 상기 암 중 임의의 것의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 지칭한다. 한 실시형태에서, 암은 결장직장암이고, 그리고 임의적으로 화학요법제는 이리노테칸이다. 암이 육종인 실시형태에서, 임의적으로 육종은 연골육종, 평활근육종, 위장관 간질 종양, 섬유육종, 골육종. 지방육종 또는 악성 섬유조직구종이다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이들의 유도체, 예를 들면 단편이다.
본원에서 이용될 때, 용어 "항체의 항원 결합 부위"는 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 이런 이유로, 항체의 경쇄와 중쇄 가변 도메인은 N 말단으로부터 C 말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 많이 기여하고 항체의 특성을 정의하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프"로부터 유래된 잔기에 따라서 결정된다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 자연 항체는 예를 들면, 단일특이적이다. 본원 발명에 따른 "이중특이적 항체"는 두 가지 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본원 발명의 항체는 2개의 상이한 항원, 다시 말하면 첫 번째 항원으로서 DR5 및 두 번째 항원으로서 FAP에 대해 특이적이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일특이적" 항체는 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 이들 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 표시한다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 적어도 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 일정한 실시형태에서 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 구별되는 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)를 참조한다), 그리고 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168을 참조한다)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작하고 (WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)을 참조한다); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)을 참조한다); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)을 참조한다); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체를 이용하고 (예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)을 참조한다); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
"문어 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 역시 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편에는 또한, FAP 또는 DR5뿐만 아니라 다른 상이한 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"가 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820).
본 출원 내에서 이용된 바와 같이, 용어 "가 (valent)"는 항체 분자 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 "이가", "사가" 및 "육가"는 항체 분자 내에 각각, 2개 결합 부위, 4개 결합 부위 및 6개 결합 부위의 존재를 표시한다. 본원 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "이가"이고, "삼가" 또는 "다가" (예를 들면 "사가" 또는 "육가")일 수 있다.
본원 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이적이다. 다시 말하면, 항체는 심지어 2개 초과의 결합 부위가 있는 (즉, 항체가 삼가 또는 다가인) 경우에도 이중특이적일 수 있다. 본원 발명의 이중특이적 항체에는 예를 들면, 다가 단일 사슬 항체, 디아바디 및 트리아바디뿐만 아니라 추가 항원 결합 부위 (예를 들면, 단일 사슬 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2)가 하나 이상의 펩티드-링커를 통해 연결되는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체가 포함된다. 항체는 단일 종으로부터의 전장이거나, 또는 키메라화 또는 인간화될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본 출원 내에서 이용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 알라닌 (3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루타민산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V)을 포함하는 자연 발생 카르복시 α-아미노산의 군을 표시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 이와 같은 모든 지정은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"에는 일차 개체 세포 및 전달의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 배양물이 포함된다. 모든 자손은 축중성 또는 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 또한 이해된다. 최초 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에 설명된 것들을 포함한, 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 실시형태는 하기에 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합" 또는 "특이적으로 결합"은 시험관내 분석, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분석 (SPR, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 연관에 대한 속도 상수), kD (해리 상수), 그리고 KD (kD/ka)에 의해 정의된다. 결합 또는 특이적으로 결합은 10-8 mol/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/l의 결합 친화성 (KD)을 의미한다.
사멸 수용체에 대한 항체의 결합은 BIAcore 분석 (GE-Healthcare Uppsala, Sweden)에 의해 조사될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 연관에 대한 속도 상수), kD (해리 상수), 그리고 KD (kD/ka)에 의해 정의된다.
"감소된 결합", 예를 들면 Fc 수용체에 감소된 결합은 예를 들면 SPR에 의해 측정될 때, 개별 상호작용에 대한 친화성 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로 (또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화성에서 증가를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 이펙터 분자 방출, 세포독성 활성, 그리고 활성화 마커의 발현에서 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 한 가지 이상의 세포 반응을 지칭한다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 분석법은 당해 분야에 공지되고 본원에 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면 종양에서 세포 예컨대 암 세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에 제시된 항원 결정인자를 지칭한다. 특히 "표적 세포 항원"은 엽산염 수용체 1을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 항원 결합 모이어티 등에 대하여 용어 "첫 번째" 및 "두 번째"는 하나 초과의 각 유형의 모이어티가 있을 때 편의상 식별을 위해 이용된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 일정한 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 분자의 화학적으로 활성 표면 군화 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐을 포함하고, 그리고 일정한 실시형태에서, 특이적인 3차원 구조적 특징 및 또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 그리고 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체가 형성되는, 폴리펩티드 거대분자 상에 부위 (예를 들면 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성되는 입체형태적 형상)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들면 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질 (ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 지칭되는 단백질, 예를 들면, PD-1 및 PD-L1은 달리 표시되지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면 인간) 및 설치류 (예를 들면 생쥐 및 쥐)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 단백질의 임의의 선천적 형태일 수 있다. 특정한 실시형태에서 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정한 단백질이 언급되는 경우에, 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 단백질뿐만 아니라 세포 내에서 처리로부터 발생하는 상기 단백질의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 특히 접두사 "글리코-"가 붙은 용어 "조작하다, 조작된, 조작"뿐만 아니라 용어 "글리코실화 조작"에는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 이의 단편의 글리코실화 패턴의 임의의 조작이 포함되는 것으로 고려된다. 글리코실화 조작에는 세포에서 발현되는 당단백질의 변경된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고당류 합성 경로의 유전자 조작을 포함한, 세포의 글리코실화 기계의 대사 조작이 포함된다. 게다가, 글리코실화 조작은 글리코실화에 대한 돌연변이 및 세포 환경의 효과를 포함한다. 한 실시형태에서, 글리코실화 조작은 글리코실전달효소 활성의 변경이다. 특정한 실시형태에서, 조작은 변경된 글루코사미닐전달효소 활성 및/또는 푸코실전달효소 활성을 야기한다.
본원 발명에 따른 병용 요법은 상승 효과를 갖는다. 두 가지 화합물의 "상승 효과"는 두 가지 작용제의 조합의 효과가 그들의 개별 효과의 합계보다 크고, 대조 및 단일 약물과 통계학적으로 상이한 것이다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 병용 요법은 부가 효과를 갖는다. 두 가지 화합물의 "부가 효과"는 두 가지 작용제의 조합의 효과가 그들의 개별 효과의 합계이고, 대조 및/또는 단일 약물과 통계학적으로 상이한 것이다.
한 가지 양상에서, 본원 발명은 암의 치료에 이용하기 위한 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제를 제공하는데, 여기서 BRAF 억제제는 화학식 (I)의 화합물 (I)
또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화합물이다.
본원 발명의 일부 실시형태에서 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ia)에 따른 화합물이다:
(Ia).
본원 발명의 일부 실시형태에서 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ib)에 따른 화합물이다:
(Ib).
본원 발명에 따른 이용을 위한 PD-1 축 결합 길항제의 무제한적 예에는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®), RN888 (PF-06801591), 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)이 포함된다.
본원 발명의 일부 실시형태에서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®) 및 RN888 (PF-06801591)에서 선택되는 PD-1 결합 길항제이다. 본원 발명의 일부 실시형태에서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택되는 PD-L1 결합 길항제이다.
검사 절차
재료
L-글루타민으로 보충된 DMEM 무페놀 레드 배지가 (Thermo Fisher Scientific)로부터 구입되었다. 소 태아 혈청 (FBS)이 VWR로부터 구입되었다. 고급 ERK 포스포-T202 /Y204 키트 - 10,000 테스트가 Cisbio cat# 64AERPEH로부터 구입되었다. A375가 ATCC로부터 최초 획득되었고 Roche 저장소에 보관되었다. 384-웰 마이크로평판이 Greiner Bio-One, 384-웰 (With Lid, HiBase, 낮은 용적 cat 784-080)로부터 구입되었다.
A375 세포 또는 HCT116 세포에서 P-ERK 결정을 위한 HTRF 분석
A375는 V600E 돌연변이된 BRAF를 발현하는 세포 암 모형이고, HCT116은 WT BRAF를 발현하는 세포 암 모형이다. 1세대 BRAF 억제제 예컨대 예를 들면 다브라페닙은 그들이 WT BRAF 세포 (예컨대 예를 들면 HCT 116)의 성장을 활성화하지만 V600E 돌연변이된 BRAF 세포 (예컨대 예를 들면 A375)의 성장을 억제한다는 점에서, 종양 세포에 대한 패러독스 효과를 유도한다. ERK 1,2 인산화 (MAPK 경로의 인산화 캐스케이드의 말단 구성원)가 차후에, MAPK 경로의 활성화 상태에 대한 주된 판독값으로서 보고된다. 분석에 앞서, A375 및 HCT116 세포주는 10% 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 DMEM 무페놀 레드 배지에 유지된다. 화합물 처리 이후에, Thr202/Tyr204에서 인산화될 때 ERK 단백질 상에서 앞서 언급된 키트 (Cisbio cat# 64AERPEH)에 제공된 2가지 항체의 선택적 결합에 의해 유도된 FRET 형광 신호를 측정함으로써, P-ERK 수준이 결정된다. 간단히 말하면, 12 μl 배지/웰에서 8000개 세포/웰이 384-웰 평판에 도말되고 인큐베이터 (5% CO2-가습된 분위기 하에 37 ℃에서)에 하룻밤 동안 방치되며, 그 다음 날 평판이 아래의 최종 약물 농도: 10μM-3μM-1μM-0.3μM-0.1μM-0.03μM-0,01μM-0.003μM-0.001μM로 검사 화합물, 다브라페닙 및 PLX8394 (후자 2개는 대조)로 이중으로 처리되고, 모든 웰에 DMSO 정규화가 진행되며, 약물 인큐베이션이 1 시간 동안 발생한다. 이후, 키트와 함께 공급된 4μl의 4X 용해 완충액이 웰에 첨가되고, 평판이 이후 30 초 (300 rcf) 동안 원심분리되고 실온에서 1 시간 동안 평판 셰이커에서 인큐베이션된다.
인큐베이션의 종료 시점에 4μL/웰의 고급 P-ERK 항체 용액 (제조업체의 지침에 따라서 제조됨), 그 이후에 4μL/웰의 크립테이트 P-ERK 항체 용액 (제조업체의 지침에 따라서 제조됨) (Cisbio cat# 64AERPEH)이 검사 웰에 첨가된다.
적절한 데이터 정규화를 가능하게 하기 위해, 약물 처리가 보고된 바 없는 대조 웰이 항상 각 평판 내에 포함된다 (제조업체의 지침에 따라서):
대조 및 실험의 p-ERK HTRF 웰 함량 (μl):
이후, 평판이 30 초 동안 300 rcf로 원심분리되고, 증발을 예방하기 위해 밀봉되며, 어둠하에 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션된다.
그 다음, 평판이 분석되고, 형광 방출 값이 665 및 620 nM에서 Pherastast FSX (BMG Labtech) 기구를 통해 수집된다.
획득된 형광 값이 공식 비율=신호(620nm)/신호(625nm)*10000에 따라서 처리된 후, 블랭크에서 비율의 평균이 모든 값에서 차감된다.
데이터는 A375 세포 (BRAF 억제)의 경우에, DMSO로만 처리된 세포에 의해 파생된 비율 (블랭크 차감됨)의 평균을 100%로 간주하고, 10μM 다브라페닙 처리된 세포에 의해 파생된 비율 (블랭크 차감됨)의 평균을 0%로 간주함으로써 정규화된다. 정규화된 포인트의 평균이 S자 모양 곡선에 적합되고, IC50이 결정된다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
데이터는 HCT116 세포 (BRAF 활성화)의 경우에, DMSO로만 처리된 세포에 의해 파생된 비율 (블랭크 차감됨)의 평균을 0%로 간주하고, 가장 높은 신호를 제공하는 농도에서 다브라페닙 처리된 세포에 의해 파생된 비율 (블랭크 차감됨)의 평균을 100%로 간주함으로써 정규화된다. 개별 포인트가 S자 모양 또는 벨 모양 곡선 중 어느 하나에 적합되고, 최대 다브라페닙 매개 활성화와 비교하여 활성화의 백분율이 결정된다. EC50은 다브라페닙에 의해 달성된 최댓값의 50%에 필적하는 활성화가 획득되는 농도이다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
활성화가 다브라페닙에 의해 달성된 최댓값의 50%에 도달하지 못하는 경우에는 EC50 계산이 적용되지 않는다.
다브라페닙으로부터 최대 패러독스 유도 효과의 백분율은 검사 화합물이 최대 P-ERK 신호를 유도하는 백분율을, 검사된 용량 범위 내에 다브라페닙에 의해 생성된 가장 높은 신호의 백분율로서 평가함으로써 결정된다.
WO2012/118492에서는 실시예 25로서 참조 화합물 AR-25, 실시예 30으로서 AR-30, 그리고 실시예 31로서 AR-31을 개시한다.
표 1: 실시예 1((3 R )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드)은 AR-30 및 AR-31과 비교할 때, C 말단 Src 키나아제 (CSK) 및 림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 (LCK)에 비해 RAF 키나아제에 대한 높은 친화성 및 높은 선택성을 가짐
표 2: 실시예 1((3 R )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드)은 WT BRAF를 발현하는 HCT-116 암 세포에서 패러독스 RAF 활성화를 파괴하며; 다브라페닙 또는 AR-25와 비교할 때, 최대 패러독스 유도 효과가 50% 미만으로 감소함
본원 발명의 화학식 (I)의 화합물의 제조는 순차적 또는 수렴적 합성 루트에서 실행될 수 있다. 본원 발명의 합성은 아래의 일반적인 반응식에 도시된다. 결과 생성물의 반응 및 정제를 실행하는 데 필요한 기술은 당업자에게 공지된다.
더 상세하게, 화학식 (I)의 화합물은 아래에 제공된 방법에 의해, 실시예에 제공된 방법에 의해, 또는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 개별 반응 단계에 대한 적합한 반응 조건은 당업자에게 알려져 있다. 반응 순서는 반응식 1에 나타내진 것에 한정되지 않으며, 시작 물질 및 이들의 개별 반응성에 따라서, 반응 단계의 순서가 자유롭게 변경될 수 있다. 시작 물질은 상업적으로 가용하거나, 또는 아래에 제공된 방법과 유사한 방법에 의해, 상세한 설명 또는 아래의 실험 절차에 인용된 참고문헌에 설명된 방법에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
반응식 1
본원 발명에서 화학식 (I)의 화합물은, 생체내에서 부모 화합물로 다시 전환될 수 있는 유도체를 제공하기 위해 기능기에서 유도체화될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
실험 절차
(3 R )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 (화학식 (Ia)의 화합물) 및 (3 S )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 (화학식 (Ib)의 화합물)
6-히드록시-3-메틸-퀴나졸린-4-온
2-아미노-5-히드록시벤조산 (10 g, 65.3 mmol, 당량: 1.0) 및 N-메틸포름아미드 (30 g, 29.9 mL, 503 mmol, 당량: 7.7)가 145 ℃에서 21 시간 45 분 동안 가열되고, 이후 실온으로 냉각되었다. 반응 혼합물이 50 mL H2O로 희석되고 실온에서 20 분 동안 교반되었다. 그 결과로 생성된 침전물이 여과에 의해 수집되었다. 담갈색 고체가 3 × 20 mL 물로 세척되었다. 고체가 톨루엔에 흡수되고 증발 건조 (3 ×)되었다. 고체가 높은 진공 하에 40 ℃에서 하룻밤 동안 진공 건조되어, 표제 화합물이 담갈색 고체 (10.3 g, 89% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 177.1 [M+H]+.
3,6-디플루오로-2-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-벤조니트릴
탄산세슘 (3.22 g, 9.79 mmol, 당량: 1.15)이 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (35 mL) 중 6-히드록시-3-메틸퀴나졸린-4-온 (1500 mg, 8.51 mmol, 당량: 1.0)의 용액에 첨가되었다. 혼합물이 실온에서 30 분 동안 교반된 후, 2,3,6-트리플루오로벤조니트릴 (1.47 g, 1.08 ml, 9.37 mmol, 당량: 1.1)이 첨가되었다. 1 시간 후, 반응물이 얼음 위에서 냉각되고 물 (120 mL)로 희석되었다. 그 결과로 생성된 고체가 여과에 의해 수집되고, 얼음물 (100 mL) 및 헵탄 (100 mL)으로 세척되며, 흡인-건조되었다. 고체가 톨루엔에 흡수되고 증발 건조 (3 ×)된 후, 진공 하에 하룻밤 동안 건조되어 표제 화합물이 담갈색 고체 (2.58 g, 97% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 314.1 [M+H]+.
(3 R )-3-플루오로피롤리딘-1-술폰아미드
(R)-3-플루오로피롤리딘 염산염 (1.8 g, 14.3 mmol, 당량: 1.2)이 디옥산 (10 mL) 중 황산 디아미드 (1.148 g, 11.9 mmol, 당량: 1.0) 및 트리에틸아민 (2.42 g, 3.33 mL, 23.9 mmol, 당량: 2)의 용액에 첨가되었다. 반응물이 밀봉된 튜브에서 115 ℃에서 15.5 시간 동안 교반된 후, 실온으로 냉각되고 진공 하에 농축되었다. 잔류물이 DCM으로 희석되고, 실리카 겔에서 증발 건조되며, 칼럼으로 이전되었다. 플래시 크로마토그래피 (40 g 실리카, 80% EtOAc)에 의한 정제에 의해, 표제 화합물이 흰색 결정성 고체 (1.82 g, 91% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 169.1 [M+H]+.
(3 S )-3-플루오로피롤리딘-1-술폰아미드
트리에틸아민 (304 mg, 419 μl, 3.01 mmol, 당량: 2.0)이 디옥산 (1.3 ml) 중 황산 디아미드 (146 mg, 1.5 mmol, 당량: 1.0) 및 (S)-3-플루오로피롤리딘 염산염 (234 mg, 1.8 mmol, 당량: 1.2)의 현탁액에 첨가되었다. 반응물이 밀봉된 튜브에서 115 ℃에서 16 시간 35 분 동안 교반된 후, 진공 하에 농축되었다. 잔류물이 MeOH로 희석되고, 실리카 겔에서 증발 건조되며, 칼럼으로 이전되었다. 플래시 크로마토그래피 (40 g 실리카, 0-8% MeOH/DCM)에 의한 정제에 의해, 표제 화합물이 담황색 고체 (193 mg, 75% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 169.1 [M+H]+.
(3 R )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 (화학식 (Ia)의 화합물)
(R)-3-플루오로피롤리딘-1-술폰아미드 (1.26 g, 7.51 mmol, 당량: 2.1) 및 탄산세슘 (2.56 g, 7.87 mmol, 당량: 2.2)이 아르곤 분위기하에 건성 DMF (10.2 ml)에 현탁되었다. 반응물이 50 ℃에서 30 분 동안 교반되었다. 반응 혼합물이 실온으로 냉각되었고, DMF (25.5 ml) 중 3,6-디플루오로-2-((3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로퀴나졸린-6-일)옥시)벤조니트릴 (1.12 g, 3.58 mmol, 당량: 1.0)의 용액이 첨가되었다. 반응 혼합물이 100 ℃에서 15 시간 동안 교반된 후, 진공 하에 농축되었다. 잔류물이 포화된 수성 NH4Cl (100 mL) 및 EtOAc (100 mL)에 흡수되었다. 상이 분리되었고, 수성 층이 2 x 100 mL EtOAc로 추가로 추출되었다. 통합된 유기 층이 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척되고, 건조되고 (Na2SO4), 여과되고, 진공 하에 농축되었다. 물 층이 EtOAc (3 x 100 mL)로 역추출되었다. 통합된 유기 추출물이 염수 (200 mL)로 세척되고, 건조되고 (Na2SO4), 여과되고, 진공 하에 농축되었다. 잔류물이 DCM 및 MeOH로 희석되고, 실리카 상에 농축되었다. 플래시 크로마토그래피 (120 g, 0.5-2% MeOH/DCM)에 의한 정제에 의해 회백색 고체가 제공되었고, 이는 초음파처리와 함께 1:1 헵탄/DCM (20 mL)으로 마쇄된 후, 진공 하에 건조되어 표제 화합물이 무색 고체 (1.087 g, 66% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 426.2 [M+H]+. 키랄 SFC: RT = 4.594 분 [Chiralpak IC 칼럼, 4.6 x 250 mm, 5μm 입자 크기 (Daicel); 8 분에 걸쳐 0.2% NHEt2를 함유하는 20 - 40% MeOH의 구배; 유속: 2.5 mL/분; 140 바 배압].
(3 S )- N -[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 (화학식 (Ib)의 화합물)
(S)-3-플루오로피롤리딘-1-술폰아미드 (181 mg, 1.08 mmol, 당량: 2.1)가 DMF (1.6 ml)에 용해되었다. 실온에서 탄산세슘 (368 mg, 1.13 mmol, 당량: 2.2)이 첨가되었고, 반응 혼합물이 50 ℃에서 30 분 동안 교반되었다. 반응 혼합물이 실온으로 냉각되었고, DMF (4 ml) 중 3,6-디플루오로-2-((3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로퀴나졸린-6-일)옥시)벤조니트릴 (160.8 mg, 513 μmol, 당량: 1.0)의 용액이 첨가되었다. 반응 혼합물이 105 ℃에서 2 시간 50 분 동안 교반된 후, 진공 하에 농축되었다. 잔류물이 DCM에 흡수되고, 포화된 수성 NH4Cl로 세척되었다. 수성 층이 DCM으로 2회 역추출되었다. 통합된 유기 층이 Na2SO4 위에서 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 잔류물 (갈색 오일)이 DCM으로 희석되고 칼럼으로 이전되었다. 플래시 크로마토그래피 (80 g, DCM 중 0-100% EtOAc)에 의한 정제에 의해 고체가 제공되었고, 이는 SFC에 의해 더욱 정제되어 표제 화합물이 담황색 고체 (119 mg, 50% 수율)로서 제공되었다. MS (ESI) m/z: 426.2 [M+H]+. 키랄 SFC: RT = 4.411 분 [Chiralpak IC 칼럼, 4.6 x 250 mm, 5μm 입자 크기 (Daicel); 8 분에 걸쳐 0.2% NHEt2를 함유하는 20 - 40% MeOH의 구배; 유속: 2.5 mL/분; 140 바 배압].
본원 발명은 특히 다음에 관한 것이다:
BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 BRAF 억제제는 화학식 (I)의 화합물
(I)
또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화합물이다;
본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 화학식 (I)의 화합물은 (3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드이다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-Ll 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군에서 선택된다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®), RN888 (PF-06801591), 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택된다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®) 및 RN888 (PF-06801591)에서 선택되는 PD-1 결합 길항제이다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택되는 PD-L1 억제제이다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®)이다;
약제로서 이용하기 위한, 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 용도;
암, 특히 흑색종, 비소세포 폐암 또는 연수막 암의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 상기 방법은 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물, 그리고 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물;
본원 발명에 따른 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제는 경구 투여되고, 그리고 PD-1 축 결합 길항제는 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다;
본원 발명에 따른 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제는 PD-1 축 결합 길항제와 동시에 투여된다;
본원 발명에 따른 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제는 공동제제화된다;
본원 발명에 따른 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제는 PD-1 축 결합 길항제와 순차적으로 투여된다;
본원 발명에 따른 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제는 매일 경구 투여되고, 그리고 PD-1 축 결합 길항제는 주당 1회 정맥내 또는 피하 주사를 통해 투여된다;
본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암이다;
본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 BRAFV600X 돌연변이와 연관된다;
본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 BRAFV600X 돌연변이-양성 절제불가능 또는 전이성 암이다;
본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 BRAFV600X 돌연변이는 (a) 환자의 종양 조직 및/또는 체액의 샘플로부터 추출된 핵산 (예를 들면, DNA)에 대해 PCR 또는 염기서열분석을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 BRAFV600의 발현을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 결정된다;
하나 이상의 추가 항암제, 특히 MEK 억제제, MEK 분해제, EGFR 억제제, EGFR 분해제, HER2 및/또는 HER3의 억제제, HER2 및/또는 HER3의 분해제, SHP2 억제제, SHP2 분해제, Axl 억제제, Axl 분해제, ALK 억제제, ALK 분해제, PI3K 억제제, PI3K 분해제, SOS1 억제제, SOS1 분해제, 신호 전달 경로 억제제, 관문 억제제, 아폽토시스 경로의 조절인자, 세포독성 화학요법제, 혈관형성 표적화 요법, 면역 표적화 작용제, 및 항체-약물 접합체에서 선택되는 하나 이상의 항암제를 포함하는, 본원 발명에 따른 또는 본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
MEK 억제제를 추가로 포함하는, 본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
코비메티닙, 비니메티닙 및 트라메티닙에서 선택되는 MEK 억제제를 추가로 포함하는, 본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
코비메티닙을 추가로 포함하는, 본원 발명에 따른 이용을 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물;
암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 용도로서, 여기서 BRAF 억제제는 (3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다;
본원 발명에 따른 약제의 제조를 위한 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 용도로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®), RN888 (PF-06801591), 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택된다;
본원 발명에 따른 약제의 제조를 위한 본원 발명에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 용도로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®)이다;
암의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 상기 방법은 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 BRAF 억제제는 (3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다;
본원 발명에 따른 암의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 여기서 암은 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 및 비소세포 폐암에서 선택된다;
본원 발명에 따른 암의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®), RN888 (PF-06801591), 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택된다;
본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®) 및 RN888 (PF-06801591)에서 선택되는 PD-1 결합 길항제이다;
본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택되는 PD-L1 결합 길항제이다;
본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®)이다;
본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 화학식 (I)의 화합물은 (3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드이다;
본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 화학식 (I)의 화합물은 (3S)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드이다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제는 경구 투여된다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 첫 번째 조성물은 두 번째 조성물과 동시에 투여된다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 첫 번째와 두 번째 조성물은 공동제제화된다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 첫 번째 조성물은 두 번째 조성물과 순차적으로 투여된다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물;
암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 암은 BRAF 돌연변이에 연관된다;
암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 암은 BRAFV600X 돌연변이-양성 절제불가능 또는 전이성 암, 특히 BRAFV600E 또는 BRAFV600K 돌연변이-양성 절제불가능 또는 전이성 암이다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물로서, 여기서 BRAFV600X 돌연변이는 (a) 환자의 종양 조직 및/또는 체액의 샘플로부터 추출된 핵산 (예를 들면, DNA)에 대해 PCR 또는 염기서열분석을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 BRAFV600의 발현을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 결정된다;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에서, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물의 용도;
암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물의 용도.
본원 발명의 추가의 실시형태는 다음과 같다:
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방을 위한 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물의 효과량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 뇌 전이의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 뇌 전이의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 일차 종양은 흑색종 또는 비소세포 폐암이다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 없고, 그리고 여기서 환자는 관문 억제제 치료 경험이 있다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 있고, 그리고 여기서 환자는 관문 억제제 치료 경험이 있다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 암은 수술에 의해 이전에 치료되었다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 BRAF 억제제 치료와 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 BRAF 억제제 치료 내성 종양의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종, 비소세포 폐암 또는 연수막 암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 MEK 억제제 치료와 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계하는데, 여기서 환자는 PD-1 축 결합 길항제 치료와 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 MEK 억제제 치료 내성 종양의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다; 그리고
본원 발명의 일정한 실시형태는 PD-1 축 결합 길항제 치료 내성 종양의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다.
본원 발명의 일정한 실시형태는 엔코라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙에서 선택되는 BRAF 억제제, 그리고 비니메티닙, 트라메티닙 및 코비메티닙에서 선택되는 MEK 억제제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 엔코라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙에서 선택되는 BRAF 억제제, 그리고 PD-1 축 결합 길항제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 엔코라페닙 및 비니메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 다브라페닙 및 트라메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 베무라페닙 및 코비메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 관문 억제제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 PD-1 축 결합 길항제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 약학 조성물에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 없고, 그리고 여기서 환자는 관문 억제제 치료 경험이 있다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계하는데, 여기서 환자는 표적 요법과 관련된 치료 경험이 있고, 그리고 여기서 환자는 관문 억제제 치료 경험이 있다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계하는데, 여기서 환자는 BRAF 억제제 치료와 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 BRAF 억제제 치료 내성 종양의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제에 관계하는데, 여기서 환자는 PD-1 축 결합 길항제 치료와 관련된 치료 경험이 없다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 PD-1 축 결합 길항제 치료 내성 종양의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다.
본원 발명의 일정한 실시형태는 엔코라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙에서 선택되는 BRAF 억제제, 및/또는 코비메티닙, 비니메티닙 및 트라메티닙에서 선택되는 MEK 축 결합 길항제 치료제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 엔코라페닙 및 비니메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 다브라페닙 및 트라메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 베무라페닙 및 코비메티닙으로 이전에 치료를 받았던 개체의 치료적 및/또는 예방적 처치에서 약제로서 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다;
본원 발명의 일정한 실시형태는 관문 억제제로 이전에 치료를 받았던 개체에서 암, 특히 흑색종 또는 비소세포 폐암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제에 관계한다;
한 실시형태에서, 본원 발명은 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제, "리플렛"으로도 알려진 처방 정보, 블리스터 패키지 또는 병 (HDPE 또는 유리) 및 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 처방 정보는 바람직하게는, 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제의 조합의 투여에 관해 환자에 대한 조언을 포함한다;
한 실시형태에서, 치료를 받은 개체는 본원에 설명된 바와 같은 상기 선행 치료에 불응성이 되었다; 그리고
한 실시형태에서, 치료를 받은 개체는 본원에 설명된 바와 같은 상기 선행 치료 동안 뇌 전이가 발달하였다.
본원 발명의 일정한 실시형태는 적어도 하나의 치환체가 적어도 하나의 방사성동위원소를 포함하는 본원 발명에 따른 조합, 또는 본원에 설명된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물에 관계한다. 방사성동위원소의 특정 예는 2H, 3H, 13C, 14C 및 18F이다.
게다가, 본원 발명은 적용 가능하면 어디든지, 화학식 (I)의 화합물의 모든 광학적 이성질체, 다시 말하면, 부분입체이성질체, 부분입체이성질성 혼합물, 라세미 혼합물, 모든 이들의 상응하는 거울상이성질체 및/또는 호변체뿐만 아니라 이들의 용매화합물을 포함한다.
원하는 경우에, 본원 발명의 화합물의 라세미 혼합물은 개별 거울상이성질체가 단리되도록 분리될 수 있다. 분리는 당해 분야에 널리 알려진 방법, 예컨대 부분입체이성질성 혼합물을 형성하기 위한 화합물의 라세미 혼합물의 거울상이성질성으로 순수한 화합물로의 연계, 그 이후에 표준 방법, 예컨대 분별 결정화 또는 크로마토그래피에 의한 개별 부분입체이성질체의 분리에 의해 실행될 수 있다.
광학적으로 순수한 거울상이성질체가 제공되는 실시형태에서, 광학적으로 순수한 거울상이성질체는 화합물이 중량으로 > 90 %의 원하는 이성질체, 특정하게는 중량으로 > 95 %의 원하는 이성질체, 또는 더 특정하게는 중량으로 > 99 %의 원하는 이성질체를 함유한다는 것을 의미하고, 상기 중량 퍼센트는 상기 화합물의 이성질체의 총 중량에 기초된다. 키랄적으로 순수한 또는 키랄적으로 농축된 화합물은 키랄적으로 선택적 합성에 의해 또는 거울상이성질체의 분리에 의해 제조될 수 있다. 거울상이성질체의 분리는 최종 생성물에서 또는 대안으로 적합한 중간체에서 실행될 수 있다.
한 실시형태에서, 하나 이상의 추가 항암제는 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제 및 MEK 억제제와 병용되는데, 여기서 추가 항암제는 MEK 억제제, MEK 분해제, EGFR 억제제, EGFR 분해제, HER2 및/또는 HER3의 억제제, HER2 및/또는 HER3의 분해제, SHP2 억제제, SHP2 분해제, Axl 억제제, Axl 분해제, ALK 억제제, ALK 분해제, PI3K 억제제, PI3K 분해제, SOS1 억제제, SOS1 분해제, 신호 전달 경로 억제제, 관문 억제제, 아폽토시스 경로의 조절인자, 세포독성 화학요법제, 혈관형성 표적화 요법, 면역 표적화 작용제, 및 항체-약물 접합체에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 MEK 억제제이다. MEK 억제제의 무제한적 예에는 코비메티닙 (Cotellic®), 비니메티닙 (Mektovi®) 및 트라메티닙 (Mekinist®)이 포함된다. MEK 억제제의 추가 예는 당해 분야에 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 EGFR 억제제이다. EGFR 억제제의 무제한적 예에는 세툭시맙 (Erbitux®), 파니투무맙 (Vectibix®), 오시메르티닙 (메렐레티닙, Tagrisso®), 에를로티닙 (Tarceva®), 제피티닙 (lressa®), 네시투무맙 (PortrazzaTM), 네라티닙 (Nerlynx®), 라파티닙 (Tykerb®), 반데타닙 (Caprelsa®) 및 브리가티닙 (Alunbrig®)이 포함된다. EGFR 억제제의 추가 예는 당해 분야에 알려져 있다. 일부 실시형태에서 EGFR 억제제는 알로스테릭 EGFR 억제제이다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 HER2 및/또는 HER3의 억제제이다. HER2 및/또는 HER3 억제제의 무제한적 예에는 라파티닙, 카넬티니브, (E)-2-메톡시-N-(3-(4-(3-메틸-4-(6-메틸피리딘-3-일옥시)페닐아미노)퀴나졸린-6-일)알릴)아세트아미드 (GP-724714), 사피티닙, 7-[[4-[(3-에티닐페닐)아미노]-7-메톡시-6-퀴나졸리닐]옥시]-N-히드록시-헵탄아미드 (CUDC-101), 무브리티닙, 6-[4-[(4-에틸피페라진-1-일)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (AEE788), 이르비니티닙 (투카티닙), 포지오티닙, N-[4-[1-[4-(4-아세틸-1-피페라지닐)시클로헥실]-4-아미노-3-피라졸로[3,4-d]피리미디닐]-2-메톡시페닐]-1-메틸-2-인돌카르복스아미드 (KIN001-111), 7-시클로펜틸-5-(4-페녹시페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일아민 (KIN001-051), 6,7-디메톡시-N-(4-페녹시페닐)퀴나졸린-4-아민 (KIN001-30), 다사티닙, 및 보수티닙이 포함된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 SHP2의 억제제이다. SHP2 억제제의 무제한적 예에는 6-(4-아미노-4-메틸피페리딘-1-일)-3-(2,3-디클로로페닐)피라진-2-아민 (SHP099), [3-[(3S,4S)-4-아미노-3-메틸-2-옥사-8-아자스피로[4.5]데칸-8-일]-6-(2,3-디클로로페닐)-5-메틸피라진-2-일]메탄올 (RMC-4550) RMC-4630, TNO155, 그리고 WO 2015/107493, WO 2015/107494, WO 2015/107495, WO 2019/075265, PCT/U82019/056786 및 PCT/l82020/053019에 개시된 화합물이 포함된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 PI3K 억제제이다. 무제한적 예에는 부파리십 (BKM120), 알페리십 (BYL719), 사모톨리십 (LY3023414), 8-[(1R)-1-[(3,5-디플루오로페닐)아미노]에틸]-N,N-디메틸-2-(모르폴린-4-일)-4-옥소-4H-크로멘-6-카르복스아미드 (AZD8186), 테날리십 (RP6530), 복스탈리십 염산염 (SAR-245409), 게다톨리십 (PF-05212384), 파눌리십 (P-7170), 타셀리십 (GDC-0032), 트랜스-2-아미노-8-[4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시피리딘-3-일)-4-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF-04691502), 두벨리십 (ABBV-954), N2-[4-옥소-4-[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴린-4-이움-4-일메톡시]부티릴]-L-아르기닐-글리실-L-아스파르틸-L-세린 아세트산염 (SF-1126), 픽틸리십 (GDC-0941), 2-메틸-1-[2-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤질]-6-(모르폴린-4-일)-1H-벤즈이미다졸-4-카르복실산 (GSK2636771), 이델라리십 (GS-1101), 움브랄리십 토실레이트 (TGR-1202), 픽틸리십 (GDC-0941), 코파닐십 염산염 (BAY 84-1236), 닥토리십 (BEZ-235), 1-(4-[5-[5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일]-1-에틸-1-H-1,2,4-트리아졸-3-일]피페리딘-1-일)-3-히드록시프로판-1-온 (AZD-8835), 5-[6,6-디메틸-4-(모르폴린-4-일)-8,9-디히드로-6H-[1,4]옥사지노[4,3-e]퓨린-2-일]피리미딘-2-아민 (GDC-0084) 에베로리무스, 라파마이신, 페리포신, 시로리무스 및 템시로리무스가 포함된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 ALK 억제제이다. 무제한적 예에는 크리조티닙 (PF-02341066), 세리티닙 (LDK378), 알렉티닙 (알레센자), 브리가티닙 (AP26113), 로라티닙 (PF-6463922), 엔사르티닙 (X-396), 엔트렉티닙 (RXDX-101), 레포트렉티닙 (TPX-0005), 벨리자티닙 (TSR-011), 알코티닙 (ZG-0418), 포리티닙 (SAF-189), CEP-37440, TQ-B3139, PLB1003 및 TPX-0131이 포함된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 관문 억제제이다. 일부 실시형태에서, 관문 억제제는 CTLA-4 억제제, PD-1 결합 길항제 또는 PD-L1 결합 길항제이다. 일부 실시형태에서, CTLA-4 억제제는 이필리무맙 (Yervoy®) 또는 트레멜리무맙 (GP-675,206)이다. 일부 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 니볼루맙 (Opdivo®) 및 RN888 (PF-06801591)에서 선택된다. 일부 실시형태에서, PD-L1 결합 길항제는 아테졸리주맙 (Tecentriq®), 아벨루맙 (Bavencio®) 및 더발루맙 (ImfinziTM)에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 항체-약물 접합체이다. 항체-약물 접합체의 무제한적 예에는 겜투주맙 오조가마이신 (MylotargTM), 이노투주맙 오조가마이신 (Besponsa®), 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris®), 아도-트라스투주맙 엠탄신 (TDM-f; Kadcyla®), 미르베툭시맙 소라브탄신 (IMGN853) 및 아네투맙 라브탄신이 포함된다.
일부 실시형태에서, 추가 항암제 중에서 하나는 베바시주맙 (MvastiTM, Avastin®), 트라스투주맙 (Herceptin®), 아벨루맙 (Bavencio®), 리툭시맙 (MabTheraTM, Rituxan®), 에드레콜로맙 (파노렉스), 다라투무맙 (Darzalex®), 올라라투맙 (LartruvoTM), 오파투무맙 (Arzerra®), 알렘투주맙 (Campath®), 세툭시맙 (Erbitux®), 오레고보맙, 세미플리맙 (Libtayo®), 펨브롤리주맙 (Keytruda®), 디누톡시맙 (Unituxin®), 오비누투주맙 (Gazyva®), 트레멜리무맙 (GP-675,206), 라무시루맙 (Cyramza®), 우블리툭시맙 (TG-1101), 파니투무맙 (Vectibix®), 엘로투주맙 (EmplicitiT'V'), 네시투무맙 (PortrazzaT'V'), 시름투주맙 (UC-961), 이브리투모맙 (Zevalin®), 이사툭시맙 (SAR650984), 니모투주맙, 프레솔리무맙 (GC1008), 리리루맙 (INN), 모가물리주맙 (Poteligeo®), 피클라투주맙 (AV-299), 데노수맙 (Xgeva®), 가니투맙, 우렐루맙, 피딜리주맙, 아마툭시맙, 블리나투모맙 (AMG103; Blincyto®) 또는 미도스타우린 (리답트)와 같은 항체이다.
일부 실시형태에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 글리코실화된다.
항체의 글리코실화는 전형적으로, N-연결되거나 O-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 삼중펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 삼중펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 창출한다. O-연결된 글리코실화는 비록 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 이용될 수 있긴 하지만, 히드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로오스 중에서 한 가지의 부착을 지칭한다. 항체로부터 글리코실화 부위의 제거는 전술된 트리펩티드 서열 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 중에서 한 가지가 제거되도록, 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성된다. 변경은 글리코실화 부위 내에 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환 (예를 들면, 글리신, 알라닌 또는 보존성 치환)에 의해 만들어질 수 있다.
본원에서 임의의 실시형태에서, 단리된 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1, 예를 들면, UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 Q9NZQ7.1에 나타나 있는 바와 같은 인간 PD-L1, 또는 이의 변이체에 결합할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본원 발명은 본원에 제시된 바와 같은 항-PD-L1, 항-PD-1 또는 항-PD-L2 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개체에게 투여되는 항-PD-L1, 항-PD-1 또는 항-PD-L2 항체 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 조성물이다.
본원에 설명되거나 당해 분야에 알려진 임의의 약학적으로 허용되는 운반체가 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 설명된 항-PD-L1 항체는 약 60 mg/mL의 양에서 상기 항체, 약 20 mM의 농도에서 히스티딘 아세트산염, 약 120 mM의 농도에서 수크로오스, 0.04% (w/v)의 농도에서 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제제 내에 있고, 그리고 상기 제제는 약 5.8의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본원에 설명된 항-PD-L1 항체는 약 125 mg/mL의 양에서 상기 항체, 약 20 mM의 농도에서 히스티딘 아세트산염, 약 240 mM의 농도에서 수크로오스, 0.02% (w/v)의 농도에서 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 제제 내에 있고, 그리고 상기 제제는 약 5.5의 pH를 갖는다.
항체 제조
전술된 바와 같이, 일부 실시형태에서, PD-1 결합 길항제는 항체 (예를 들면, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L2 항체)이다. 본원에 설명된 항체는 항체를 생성하기 위한 당해 분야에서 가용한 기술을 이용하여 제조될 수 있는데, 이들의 예시적인 방법은 아래의 섹션에 더 상세하게 설명된다. 항체는 관심되는 항원에 대해 지향된다. 예를 들어, 항체는 PD-1 (예컨대 인간 PD-1), PD-L1 (예컨대 인간 PD-L1), PD-L2 (예컨대 인간 PD-L2)에 대해 지향될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 그리고 장애를 겪는 포유동물에게 항체의 투여는 상기 포유동물에서 치료적 유익성을 유발할 수 있다.
일정한 실시형태에서, 본원에 설명된 항체는 1μM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 또는 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시형태에서, Kd는 아래의 분석에 의해 설명된 바와 같이, 관심되는 항체의 Fab 이형 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지화된 항원 결합 측정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화성은 표지화되지 않은 항원의 적정 연속의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I) 표지화 항원과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체 코팅된 평판으로 포획함으로써 측정된다 (참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). 분석을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중웰 평판 (Thermo Scientific)이 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 그리고 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비흡착성 평판 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원이 관심되는 Fab의 연속 희석액과 혼합된다. 관심되는 Fab는 이후, 하룻밤 동안 인큐베이션된다; 하지만, 인큐베이션은 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더 긴 기간 (예를 들면, 약 65 시간) 동안 지속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물이 실온에서 인큐베이션을 위해 포획 평판으로 이전된다 (예를 들면, 1 시간 동안). 용액은 이후, 제거되고, 그리고 평판이 PBS에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척된다. 평판이 건조될 때, 150 μl/웰의 신틸란트 (MICROSCINT-20 TM; Packard)가 첨가되고, 그리고 이들 평판은 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard)에서 10 분 동안 계수된다. 최대 결합의 20%보다 적거나 같은 결합을 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁적 결합 측정에 이용하기 위해 선택된다.
다른 실시형태에 따라서, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라스몬 공명 분석을 이용하여 측정된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)이 공급업체의 지침에 따라서 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 대략 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 항원이 5 μl/분의 유속으로 주입 전 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 대략 25 μl/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제를 포함하는 PBS (PBST)에 주입된다. 연관 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)는 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). 온 레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1 s-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정될 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2에서, 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
항체 단편
일정한 실시형태에서, 본원에 설명된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 그리고 아래에 설명된 다른 단편이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조한다. ScFv 단편의 검토를 위해, 예를 들면 Pluckth
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n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참조: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 설명된다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면, 미국 특허 번호 6,248,516 B1). 항체 단편은 본원에 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해성 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
일정한 실시형태에서, 본원에 설명된 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 설명된다. 한 가지 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 "부류 전환된" 항체인데, 여기서 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 일정한 실시형태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들면 CDR (또는 이들의 부분)이 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FR (또는 이들의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선하기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근방식을 설명)에 추가로 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역에는 다음이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 그리고 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
인간 항체
일정한 실시형태에서, 본원에 설명된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 포함한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 관한 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 설명하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 미국 특허 번호 7,041,870, 그리고 VELOCIMOUSE® 기술을 설명하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 생산된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마 기반 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B 세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 설명된다. 추가 방법에는 예를 들면, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에 설명된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간 유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 아래에 설명된다.
라이브러리 유래 항체
항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 전시 라이브러리를 생성하고, 그리고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지된다. 이런 방법은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되고, 그리고 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 추가로 설명된다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 작제해야 하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다 (예를 들면, 인간으로부터). 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 매우 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보에는 예를 들면, US 특허 번호 5,750,373, 그리고 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360이 포함된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
다중특이적 항체
일정한 실시형태에서, 본원에 설명된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, PD-1 축 성분 길항제는 다중특이적이다. 결합 특이성 중에서 하나는 PD-1 축 성분 (예를 들면, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2)에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 결합 특이성 중에서 하나는 IL-17 또는 IL-17R에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일정한 실시형태에서, 이중특이적 항체는 PD-1 축 성분 (예를 들면, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2), IL-17, 또는 IL-17R의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 특이성 중에서 하나는 PD-1 축 성분 (예를 들면, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2)에 대한 것이고, 다른 것은 IL-17 또는 IL-17R에 대한 것이다. 다중특이적 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 암의 진행을 지연시키기 위한 방법이 본원에 제공되는데, 여기서 다중특이적 항체는 PD-1 축 성분 (예를 들면, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2)에 대한 첫 번째 결합 특이성 및 IL-17 또는 IL-17R에 대한 두 번째 결합 특이성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체는 여기에서 및 아래에서 설명된 임의의 기술에 의해 만들어질 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)를 참조한다), 그리고 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168을 참조한다)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작하고 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (참조: 예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체를 이용하고 (참조: 예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
"문어 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 역시 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편에는 또한, PD-1 축 성분 (예를 들면, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2), IL-17, 또는 IL-17R뿐만 아니라 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"가 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820).
핵산 서열, 벡터 및 생산 방법
PD1 축 결합 길항제, 예를 들면, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 설명된 PD1 축 결합 길항제의 생산에 이용될 수 있다. 본원 발명에 따라서 이용되는 PD1 축 결합 길항제는 전체 이중특이적 항원 결합 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 공동발현되는 복수 (예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합 또는 기타 수단을 통해 연결되어 기능적 PD1 축 결합 길항제 항체를 형성할 수 있다. 예를 들어, Fab 단편의 경쇄 부분은 Fab 단편의 중쇄 부분, Fc 도메인 아단위 및 임의적으로 다른 Fab 단편 (이의 일부)을 포함하는 이중특이적 항체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 연결되어 Fab 단편을 형성할 것이다. 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 단편 (이의 일부)을 포함하는, 본원에 제공된 PD-1 축 결합 길항제 항원 결합 부분의 부분은 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 다른 것 및 임의적으로 Fab 단편 (이의 일부)을 포함하는, 본원에 제공된 이중특이적 항체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있었다. 공동발현될 때, Fc 도메인 아단위가 연결되어 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일정한 실시형태에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시형태에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 전령 RNA (mRNA)의 형태에서 RNA이다. 본원 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
항체 변이체
일정한 실시형태에서, 전술된 것들 이외에, PD-1 축 결합 길항제 항체의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형에는 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환이 포함된다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예컨대 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
치환, 삽입 및 결실 변이체
일정한 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존성 치환은 "보존성 치환"의 표제하에 표 B에 도시된다. 더 실제적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제하에 표 B에 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 추가로 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 생성물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 B
아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향성에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교체하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다 (예를 들면, 인간화 또는 인간 항체). 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 특성에서 변경 (예를 들면, 개선) (예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시 기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 설명된 것들을 이용하여 편의하게 생성될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체가 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 변형 (예를 들면, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변형은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (참조: 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 SDR (a-CDR)에서 만들어질 수 있고, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 검사된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)에 설명되었다. 친화성 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류 가능성 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR 중심 접근방식을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들면, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일정한 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변형이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변형 (예를 들면, 본원에 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVR에서 만들어질 수 있다. 이런 변형은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VH와 VL 서열의 일정한 실시형태에서, 각 HVR은 변형되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 및 항원 사이의 접촉 포인트를 확인하기 위한 항원 항체 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 포함하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
글리코실화 변이체
일정한 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소하도록 변형된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변형함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
본원 발명에 이용된 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 탄수화물은 변형될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원 발명의 이중특이적 항체 또는 DR5에 결합하는 항체에서 올리고당류의 변형은 일정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.
한 실시형태에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 이중특이적 항체 변이체, 또는 항체의 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이런 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들면, WO 2008/077546에 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭한다; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. 이런 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결함성" 항체 변이체에 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화에서 결함성인 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107)가 포함된다.
항체 변이체는 양분된 올리고당류가 추가로 제공되는데, 예를 들면, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 예는 예를 들면, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 설명된다. 올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 항체 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 설명된다.
시스테인 조작된 항체 변이체
일정한 실시형태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들면 THIOMABS를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 실시형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근가능 부위에 위치되고, 그리고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 면역접합체를 창출하는 데 이용될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 아래의 잔기 중에서 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 번호 7,521,541에 설명된 바와 같이 생성될 수 있다.
재조합 방법과 조성물
본원 발명의 항체는 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성 (예를 들면 Merrifield 고체상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 획득될 수 있다. 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체 (또는 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 전통적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 알려진 방법이 적합한 전사/번역 제어 신호와 함께 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들면, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)에 설명된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 항체 (단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (다시 말하면, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 연결되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 부분이다. "종결 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 만약 존재하면 코딩 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있으며, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5'와 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 두 개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 게다가, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 또는 두 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면 본원 발명의 벡터는 단백질분해 개열을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 번역과 동시에 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 이러한 항체, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동 가능한 연결은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 그와 같은 방식으로, 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 하나 이상의 조절 서열과 연결될 때이다. 2개의 DNA 단편 (예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그것과 연결된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 야기하고, 그리고 만약 이들 2개의 DNA 단편 사이의 연쇄의 성격이 유전자 산물의 발현을 주동하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 이러한 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결될 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실제적인 전사를 주동하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다.
프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 그리고 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 주동하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 알려져 있다. 이들에는 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 거대세포바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절 (예를 들면 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40 (예를 들면 초기 프로모터), 그리고 레트로바이러스 (예컨대 예를 들면 라우스 육종 바이러스)가 제한 없이 포함된다. 다른 전사 제어 영역에는 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 -글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가의 적합한 전사 제어 영역에는 조직 특이적 프로모터와 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터 (예를 들면 프로모터 유도성 테트라사이클린)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 알려져 있다. 이들에는 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 그리고 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소 (특히 내부 리보솜 진입 부위 또는 IRES, CITE 서열로도 지칭됨)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 반전 말단 반복 (ITR)을 포함할 수 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 주동하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 연결될 수 있다. 예를 들어, 만약 항체의 분비가 요망되면, 신호 서열을 인코딩하는 DNA가 본원 발명의 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산의 상류에 배치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 조면소포체의 전역에서 성장 단백질 사슬의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로, 이러한 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 인식하는데, 신호 펩티드는 번역되는 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태가 생성된다. 일정한 실시형태에서, 선천적 신호 펩티드, 예를 들면 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이와 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드의 분비를 주동하는 능력을 유지하는 해당 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나 (예를 들면 히스티딘 태그) 또는 항체의 표지화를 보조하는 데 이용될 수 있었던 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA가 항체 (단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본원 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일정한 실시형태에서, 본원 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드와 벡터는 각각, 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 설명된 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다. 이와 같은 한 가지 실시형태에서 숙주 세포는 본원 발명의 항체 또는 이의 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들면 이것으로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원 발명의 항체, 예를 들면, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-L2 항체, 또는 이들의 단편을 생산하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 본원 발명의 항체를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 이런 세포는 타당하면, 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입될 수 있고, 그리고 대량의 벡터 함유 세포는 대규모 발효기에 파종되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 항체를 획득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포에는 원핵 미생물, 예컨대 대장균 (E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것들이 포함된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 야기하는 균류 및 효모 균주를 포함한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드 인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물과 곤충 세포가 포함된다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양물 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명). 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK), 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포 (예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 dhfr- CHO 세포를 포함한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0이 포함된다. 단백질 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포에는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포가 포함되지만, 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포 또한 포함된다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에 공지된다. 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 생성물이 중쇄와 경쇄 둘 모두를 갖는 항체이도록, 이들 항체 사슬 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본원 발명에 따라서 이용된 항체에 이용될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 무제한적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 만약 항체가 인간용으로 의도되면, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유래되는, 항체의 키메라 형태가 이용될 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태 역시 당해 분야에 널리 알려진 방법에 따라서 제조될 수 있다 (참조: 예를 들면 미국 특허 번호 5,565,332, Winter). 인간화는 (a) 비인간 (예를 들면, 공여자 항체) CDR을, 결정적인 프레임워크 잔기 (예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는 데 중요한 것들)가 유지되거나 유지되지 않는 인간 (예를 들면 수용자 항체) 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, (b) 비인간 특이성 결정 영역 (SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만 표면 잔기의 대체에 의해 이들을 인간 유사 섹션으로 "은폐하는" 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 합체를 설명); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근방식을 설명)에 추가로 설명된다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)에 전반적으로 설명된다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 만들어진 인간 단일클론 항체의 일부를 형성하고 이들로부터 유래될 수 있다 (참조: 예를 들면 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (참조: 예를 들면 Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 인간 유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다 (참조: 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다.
일정한 실시형태에서, 본원 발명에서 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132066에 개시된 방법에 따라서 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작되고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본원 발명의 항체의 능력은 효소 결합 면역흡착측정법 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 기술 (BIACORE T100 시스템에서 분석됨) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 측정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다. 특정 항원에 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인을 확인하는 데 경쟁 분석이 이용될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 이런 경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 항원 (예를 들면 PD-1)이 상기 항원에 결합하는 첫 번째 표지화된 항체 (예를 들면, US 6,054,297에 설명된 V9 항체) 및 상기 항원에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁하는 능력에 대해 검사되는 두 번째 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 두 번째 항체가 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 항원이, 첫 번째 표지화된 항체는 포함하지만 두 번째 표지화되지 않은 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. 항원에 첫 번째 항체의 결합을 허용하는 조건하에 인큐베이션 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 그리고 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 측정된다. 만약 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 검사 샘플에서 실제적으로 감소되면, 이것은 두 번째 항체가 항원에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
일정한 실시형태에서, 본원 발명에서 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132066에 개시된 방법에 따라서 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작되고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본원 발명의 항체의 능력은 효소 결합 면역흡착측정법 (ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 기술 (BIACORE T100 시스템에서 분석됨) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 측정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다. 특정 항원에 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인을 확인하는 데 경쟁 분석이 이용될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 이런 경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 항원이 상기 항원에 결합하는 첫 번째 표지화된 항체 및 상기 항원에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁하는 능력에 대해 검사되는 두 번째 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 두 번째 항체가 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 항원이, 첫 번째 표지화된 항체는 포함하지만 두 번째 표지화되지 않은 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. 항원에 첫 번째 항체의 결합을 허용하는 조건하에 인큐베이션 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 그리고 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 측정된다. 만약 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 검사 샘플에서 실제적으로 감소되면, 이것은 두 번째 항체가 항원에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
본원에 설명된 바와 같이 제조된 항체는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 이용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 이중특이적 항체 또는 DR5에 결합하는 항체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원 발명의 이중특이적 항체의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 이용될 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 본질적으로 실시예에 설명된 바와 같이 이중특이적 항체를 단리하는 데 이용될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 널리 알려진 분석법에 의해 결정될 수 있다.
분석
본원에 제공된 항체, 예를 들면, 항-PD-1 축 결합 길항제 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나 특징화될 수 있다.
친화성 분석
개별 항원, 예를 들면, PD-1, PD-L1에 대한 본원에 제공된 항체, 예를 들면, 항-PD-1 축 결합 길항제 항체의 친화성은 실시예에 진술된 방법에 따라서, 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기 (GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정될 수 있고, 그리고 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 대안으로, 개별 항원에 대한 본원에 제공된 항체의 결합은 예를 들면 유세포 분석법 (FACS)에 의해, 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 이용하여 평가될 수 있다.
KD는 25 ℃에서 BIACORE® T100 기계 (GE Healthcare)를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다. Fc 부분 및 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태깅된 재조합 Fc-수용체가 CM5 칩 상에 고정된 항-Penta His 항체 (Qiagen) ("Penta His")에 의해 포획되고, 이중특이적 작제물이 피분석물로서 이용된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE Healthcare)이 공급업체의 지침에 따라서 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 대략 6500 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 항 Penta-His 항체 ("Penta His")가 5 μl/분의 유속으로 주입 전 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 40 μg/ml까지 희석된다. 리간드의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 차후에 Fc-수용체가 4 또는 10 nM에서 60 s 동안 포획된다. 동역학적 측정을 위해, 이중특이적 작제물의 4배 연속 희석액 (500 nM 및 4000 nM 사이의 범위)이 25 ℃에서 30 μl/분의 유속으로 120 s 동안 HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % 계면활성제 P20, pH 7.4)에 주입된다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 이중특이적 작제물이 항 Penta-His 항체 ("Penta His")에 대해 설명된 바와 같이, 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정되는 항인간 Fab 특이적 항체 (GE Healthcare)에 의해 포획된다. 연계된 단백질의 최종량은 대략 12000 RU이다. 이중특이적 작제물은 300 nM에서 90 s 동안 포획된다. 표적 항원은 250 내지 1000 nM 범위의 농도에서 30 μl/분의 유속으로 180 s 동안 흐름 셀에 통과된다. 해리가 180 s 동안 모니터링된다.
참조 흐름 셀에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정된다. 항정 상태 반응이 랭뮤어 결합 등온선의 비선형 곡선 적합에 의해 해리 상수 KD를 도출하는 데 이용되었다. 연관 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)는 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE® T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
결합 분석 및 기타 분석
한 양상에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, 항-PD-1 축 결합 길항제 항체는 예를 들면, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
다른 양상에서, 경쟁 분석이 개별 항원에 결합에 대해 특정한 참조 항체와 경쟁하는 항체 또는 단편을 확인하는 데 이용될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 이런 경쟁 항체는 특정한 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 추가 방법은 실시예 섹션에 설명된다.
활성 분석
한 가지 양상에서, 본원에 제공된 항체, 예를 들면, 항-PD-1 축 결합 길항제 항체가 생물학적 활성을 갖는지를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생물학적 활성에는 예를 들면, DNA 단편화 유도, 아폽토시스 유도 및 표적화된 세포의 용해가 포함될 수 있다. 생체내에서 및/또는 시험관내에서 이런 생물학적 활성을 갖는 항체 역시 제공된다.
일정한 실시형태에서, 본원 발명의 항체는 이런 생물학적 활성에 대해 검사된다. 세포 용해 (예를 들면 LDH 방출의 측정에 의해) 또는 아폽토시스 (예를 들면 TUNEL 분석을 이용하여)을 검출하기 위한 분석법은 당해 분야에 널리 알려져 있다. ADCC 또는 CDC를 측정하기 위한 분석법은 또한 WO 2004/065540 (그 안에 실시예 1 참조)에 설명되는데, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
약학 제제
본원에 설명된 바와 같은 항체, 예를 들면, 항-PD-1 축 결합 길항제 항체의 약학 제제는 동결 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 운반체와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 운반체에는 틈새 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성 활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 추가로 포함된다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 설명된다. 한 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결 건조된 항체 제제는 US 특허 번호 6,267,958에 설명된다. 수성 항체 제제에는 US 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 설명된 것들이 포함되는데, 후자 제제는 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다.
본원에서 제제는 또한, 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시된다.
지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스가 포함되는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
항체는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 임의의 적합한 루트에 의할 수 있다, 예를 들면, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
본원 발명의 다른 실시형태는 하나 이상의 조성물을 함유하는 약학 조성물 (여기서 각 조성물은 본원 발명에 따른 이용을 위한 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 치료적으로 비활성 운반체, 희석제 또는 부형제를 함유한다)뿐만 아니라 이런 약학 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 한 가지 예에서, 화학식 (I)의 화합물은 주위 온도에서 적절한 pH에서 및 원하는 정도의 순도에서, 생리학적으로 허용되는 운반체, 다시 말하면, 생약 투여 형태로 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인 운반체와 혼합함으로써 제제화될 수 있다. 제제의 pH는 화합물의 특정 용도 및 농도에 주로 의존하지만, 바람직하게는 약 3에서부터 약 8까지 어딘가의 범위에서 변할 수 있다. 한 가지 예에서, 화학식 (I)의 화합물은 pH 5에서 아세트산염 완충액에서 제제화된다. 다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 무균이다. 화합물은 예를 들면, 고체 또는 무정형 조성물로서, 동결 건조된 제제로서 또는 수성 용액으로서 보관될 수 있다.
조성물은 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여된다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자에는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 의료 종사자에게 공지된 기타 인자가 포함된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 운반체" 또는 "약학적으로 허용되는 부형제"에는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제와 항진균제, 등장성과 흡수 지연 작용제, 그리고 약학적 투여와 호환되는 기타 물질과 화합물을 포함하여, 약학적 투여와 호환되는 임의의 모든 물질이 포함되는 것으로 의도된다. 임의의 전통적인 매체 또는 작용제가 활성 화합물과 호환되지 않는 경우가 아닌 한에 있어서, 본원 발명의 조성물에서 이들의 이용이 예기된다. 보충 활성 화합물이 또한, 조성물 내로 통합될 수 있다.
약학 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 BRAF 억제제를 약학적으로 허용되는, 무기 또는 유기 운반체 또는 부형제로 처리함으로써 획득될 수 있다. 락토오스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이의 염 등이 예를 들면, 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경성 젤라틴 캡슐에 대한 운반체로서 이용될 수 있다. 연성 젤라틴 캡슐에 적합한 운반체는 예를 들면, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체와 액체 폴리올 등이다. 하지만, 활성 물질의 성격에 따라서, 연성 젤라틴 캡슐의 경우에는 통상적으로 운반체가 필요하지 않다. 용액 및 시럽의 생산을 위한 적합한 운반체는 예를 들면, 물, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등이다. 좌약에 적합한 운반체는 예를 들면, 자연 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 반액체 또는 액체 폴리올 등이다.
약학 조성물은 게다가, 보존제, 가용화제, 안정제, 습윤제, 유화제, 감미료, 착색제, 풍미제, 삼투압을 변화시키기 위한 염, 완충액, 차폐제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한, 다른 치료적으로 귀중한 물질을 함유할 수 있다.
단독으로 또는 병용으로 BRAF 억제제의 약학 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 임의적 약학적으로 허용되는 운반체, 부형제 또는 안정제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))와 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다. 허용되는 운반체, 부형제 또는 안정제는 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
BRAF 억제제의 약학 조성물에는 경구, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 조성물은 단위 약형에서 편의하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 널리 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 약형을 생성하기 위해 운반체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 호스트뿐만 아니라 특정 투여 방식에 따라서 변할 것이다. 단일 약형을 생성하기 위해 운반체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 발생시키는 BRAF 억제제 또는 PD-1 축 결합 길항제 치료제의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트 중에서, 약 1 퍼센트 내지 약 90 퍼센트, 바람직하게는 약 5 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 10 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 활성 성분의 범위 안에 있을 것이다. 이들 조성물을 제조하는 방법은 BRAF 억제제를 운반체 및 임의적으로, 하나 이상의 부성분과 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 약학 조성물은 BRAF 억제제를 액체 운반체, 또는 미세하게 갈라진 고체 운반체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시킨 후 필요하면, 생성물을 성형함으로써 제조된다. 경구 투여에 적합한 약학 조성물은 미리 결정된 양의 BRAF 억제제를 활성 성분으로서 각각 함유하는 캡슐, 교갑, 향주머니, 알약, 정제, 로젠지 (풍미 가미된 기부, 통상적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스를 이용), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 유제, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 사탕형 알약 (비활성 기부, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아를 이용) 및/또는 구강청결제 등의 형태일 수 있다. BRAF 억제제는 또한, 일시 주사, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
본원 발명의 실시형태에서, BRAF 억제제 및 PD-1 축 결합 길항제 치료제는 2개의 별개의 약학 조성물로 제제화된다.
활성 성분은 또한, 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)에 개시된다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 무균이어야 한다. 이것은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
용량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있고, 그리고 각 특정 사례에서 개별 요건에 맞게 당연히 조정되어야 할 것이다. 경구 투여의 경우에 성인에 대한 용량은 일반식 (I)의 화합물의 하루에 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg, 또는 이의 약학적으로 허용되는 용매화합물의 상응하는 양의 범위에서 변할 수 있다. 일일량은 단회 용량으로 또는 분할 용량으로 투여될 수 있고, 그리고 이에 더하여, 상한선은 또한, 이의 초과가 지시되는 것으로 밝혀질 때, 초과될 수 있다.
아래의 실시예는 제한 없이 본원 발명을 예시하며, 본원 발명을 단지 대표하는 역할을 할 뿐이다. 약학 조성물은 약 1-500 mg, 특히 1-100 mg의 화학식 (I)의 화합물을 편의하게 함유한다.
본원 발명에 따른 조성물의 예는 다음과 같다:
실시예 A
아래와 같은 조성의 정제가 상용의 방식으로 제조된다:
표 3 : 가능한 정제 조성물
제조 절차
1. 성분 1, 2, 3 및 4를 혼합하고 정제수로 과립화한다.
2. 과립을 50 ℃에서 건조시킨다.
3. 과립을 적합한 제분 설비에 통과시킨다.
4. 성분 5를 첨가하고 3 분 동안 혼합한다; 적합한 프레스에서 압축한다.
실시예 B-1
아래와 같은 조성의 캡슐이 제조된다:
표 4 : 가능한 캡슐 성분 조성물
제조 절차
1. 성분 1, 2 및 3을 적합한 혼합기에서 30 분 동안 혼합한다.
2. 성분 4 및 5를 첨가하고 3 분 동안 혼합한다.
3. 적합한 캡슐 내로 채운다.
화학식 (I)의 화합물, 락토오스 및 옥수수 전분은 먼저 혼합기에서 혼합되고, 이후 분쇄 기계에서 혼합된다. 혼합물은 혼합기로 복귀되고; 거기에 활석이 첨가되고 철저하게 혼합된다. 혼합물은 기계에 의해, 적합한 캡슐, 예를 들면, 경성 젤라틴 캡슐 내로 채워진다.
실시예 B-2
아래와 같은 조성의 연성 젤라틴 캡슐이 제조된다:
표 5 : 가능한 연성 젤라틴 캡슐 성분 조성물
표 6 : 가능한 연성 젤라틴 캡슐 조성물
제조 절차
화학식 (I)의 화합물은 다른 성분의 따뜻한 용융물에 용해되고, 그리고 혼합물은 적합한 크기의 연성 젤라틴 캡슐 내로 채워진다. 채워진 연성 젤라틴 캡슐은 상용의 절차에 따라서 처리된다.
실시예 C
아래와 같은 조성의 좌약이 제조된다:
표 7 : 가능한 좌약 조성물
제조 절차
좌제괴는 유리 또는 강철 용기에서 용융되고, 철저하게 혼합되고, 45℃로 냉각된다. 곧바로, 미세하게 분말화된 화학식 (I)의 화합물이 거기에 첨가되고, 이것이 완전히 분산될 때까지 교반된다. 혼합물은 적합한 크기의 좌제형 내로 부어지고, 식을 때까지 방치되고; 좌약은 이후, 좌제형으로부터 제거되고 왁스 페이퍼 또는 금속 호일에 개별적으로 패킹된다.
실시예 D
아래와 같은 조성의 주사 용액이 제조된다:
표 8 : 가능한 주사 용액 조성물
제조 절차
화학식 (I)의 화합물은 폴리에틸렌 글리콜 400 및 주사용수 (일부)의 혼합물에 용해된다. pH는 아세트산에 의해 5.0으로 조정된다. 용적은 물의 잔류량의 첨가에 의해 1.0 ml로 조정된다. 용액은 여과되고, 적절한 과잉 공급을 이용하여 바이알 내로 채워지고, 살균된다.
실시예 E
아래와 같은 조성의 향주머니가 제조된다:
표 9 : 가능한 향주머니 조성물
제조 절차
화학식 (I)의 화합물은 락토오스, 미정질 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스와 혼합되고, 물에서 폴리비닐피롤리돈의 혼합물로 과립화된다. 과립은 스테아르산마그네슘 및 풍미 첨가제와 혼합되고 향주머니 내로 채워진다.
실시예
약어
CAS = 화학 초록 서비스; DCM = 디클로로메탄; DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민; DMF = 디메틸포름아미드; DMSO = 디메틸술폭시드; DNA = 데옥시리보핵산; EDC·HCl = 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염; ESI = 전기분무 이온화; EtOAc = 에틸 아세트산염; HOOBt = 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진; LC-MS/MS = 액체 크로마토그래피-MS/MS; MeOH = 메탄올; MS = 질량 분광분석; NMP = N-메틸-2-피롤리돈; PCR = 중합효소 연쇄 반응; rt = 실온; SFC = 초임계 유체 크로마토그래피; THF = 테트라히드로푸란.
아래의 실시예 및 도면은 본원 발명을 예시하기 위해 제공되며 제한의 성격을 갖지 않는다.
검사 작용제
(3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드 (본원에서 화합물 Ia로서 지칭됨)가 Roche, Basel, Switzerland로부터 분말로서 제공되었고 이용에 앞서 재현탁되었다. 항생쥐 PD-1 (CD279; 본원에서 항-mPD-1로서 지칭됨)이 BioXCell (클론 RMP1-14, 카탈로그 #: BP0146)로부터 구입되었다.
세포주 및 배양 조건
세포주가 ATCC로부터 획득되고, 표준 조건 하에 5% CO2에서 가습된 인큐베이터서 유지되며, 주 2회 계대되었다. 배양 조건은 아래의 표에 보고된다:
YUMM1.7 세포주는 대립유전자: Tyrosinase:CreERT2 (티로시나아제 유전자를 발현하는 세포에 국한된 CRE 재조합효소 발현을 활성화하기 위한; 발현이 멜라닌세포 구획에 한정된 유전자), BRAF V600E/WT (BRAFV600E는 CRE 재조합효소를 발현하는 세포에서만 조건부로 활성화된다), PTEN -/-, CDKN2A -/- (PTEN 및 CDKN2A는 CRE 재조합효소를 발현하는 세포에서만 조건부로 비활성화된다)를 갖는 흑색종의 유전적으로 조작된 생쥐 모형으로부터 최초 파생되었다. 이들 종양으로부터 파생된 뮤린 세포가 면역 구획과의 상호작용 연구를 허용하는 면역적격 CBL/6 생쥐에게 이식된다. 상기 모형은 Meeth K, et al에 최초 설명된다. YUMM 라인: 정의된 유전적 변형을 갖는 일련의 유사유전자형 생쥐 흑색종 세포주. Pigment Cell Melanoma Res 29(5): 590-597, 2016. PubMed: 27287723.
동물:
생체내 연구에서, 7-9 주령 암컷 생쥐 (실험 개시 시점에)가 Charles River Laboratories로부터 구입되었다. 실험에 활용된 계통은 C57BL/6이었다.
이종이식 확립을 위해, 세포가 50% 매트리겔 및 50% Hank의 균형 염 용액으로 구성되는 배지에 현탁되고 오른쪽 옆구리에 피하 주입되었다. 종양 용적이 대략 100 mm3에 도달하면, 생쥐는 선행 치료에 무작위 배정되었다.
생체내 연구에서, 면역적격 계통 C57BL/6의 7-9 주령 암컷 생쥐 (실험 개시 시점에)가 활용되었다. 실험은 생쥐를 공급하고 종양 확립, 약물 치료 및 종양 모니터링을 수행한 Contract Research Organization (CRO) Covance에서 수행되었다.
이종이식 확립을 위해, YUMM1.7 세포가 50% 매트리겔 및 50% Hank의 균형 염 용액으로 구성되는 배지에 현탁되고 오른쪽 옆구리에 피하 주입되었다. 종양 용적이 대략 100 mm3에 도달하면, 생쥐는 선행 치료에 무작위 배정되었다. 생쥐는 도 2에 보고된 계획에 따라서 치료를 받았다.
면역조직화학 분석을 위해, 암컷 C57/BL6 생쥐에 YUMM1.7 세포가 subQ 주입되었다. 종양이 대략 250 mm3에 도달할 때 (14일차), 생쥐는 화합물 Ia 1 또는 5 mg/kg 매일 (경구 투여), 항생쥐 PD1 12.5 mg/kg 1회 (단일 정맥내 투여), 또는 화합물 Ia 및 항-mPD1의 조합 중 어느 한 가지로 치료를 받았다. 생쥐는 도 5에 보고된 계획에 따라서 치료를 받았다. 생쥐는 치료 시작 후 3 또는 5 일째에 희생되고 종양이 수집되었으며, 종양은 소화되고 고정 및 파라핀 포매의 세포형광분석에 활용되었다. 세포 현탁액이 생존 세포 및 사멸 세포의 식별을 위해 Zombie Aqua™ 염료 (Biologend)와 함께 인큐베이션되었으며 (1:1000), 세포형광분석이 PE 표지화 항생쥐 CD45 또는 항생쥐 CD3 (클론 SP-7 Abcam)으로 세포를 염색함으로써 수행되었다. 파라핀 포매 종양의 경우, 샘플이 표준 절차 (Cancer Res. 2015 Mar 15;75(6):1091-101)에 따라 항생쥐 CD45 (클론 30-F11 biolegend USA)로 염색되었다.
실시예
화합물 Ia는 돌연변이 BRAF V600E 및 NRAS Q61K를 보유하는 세포주 A375를 이용하여 도 1에 도시된 신규한 패러독스 브레이크 BRAFi이다; 이 세포주는 1세대 BRAFi 및 BRAF/MEKi 조합에 대한 내성 모형으로서 역할을 한다.
결과는 화합물 Ia가 이 세포주 모형에서, 단일 작용제로서 엔코라페닙에 의해 달성된 것보다 우수한 강력한 P-ERK 억제를 유발한다는 증거를 제시한다. 게다가, 10 nM 고정 용량의 MEKi 코비메티닙과의 조합은 엔코라페닙/비니메티닙에 의해 달성된 활성과 비교하여 우수한 P-ERK 감소를 유발하였다.
실시예 1
생쥐에게 BRAF V600E 돌연변이를 보유하는 세포주 YUMM1.7이 이식되었다. 종양 확립 (100mm3) 시에, 생쥐는 무작위 배정되고, 경구 (PO) 하루 1 회 (QD) 화합물 Ia (1 mg/kg 또는 5 mg/kg), IV 주사를 통해 주 1회 생쥐 항 PD-1 항체, 또는 PD-1 및 화합물 Ia 1 또는 5 mg/kg의 개별 조합을 제공받았다. 치료는 화합물 Ia 5mg/kg 및 조합 PD-1/화합물 Ia 5 mg/kg의 군의 경우 11일차 (무작위배정 시에 치료 시작)부터 31일차 때까지, 또는 화합물 Ia 1mg/kg 및 조합 PD-1/화합물 Ia 1 mg/kg의 군의 경우 11일차부터 45일차까지 수행되었다. 치료 종료 시에 생쥐는 58일차 때까지 종양 재발의 징후에 대해 모니터링되었다.
도 3 및 4에 보고된 결과는 화합물 Ia 및 PD-1의 조합이 질병 재발을 나타내는 생쥐의 수에 강한 영향을 미친다는 증거를 제시하였다.
실시예 2
도 6 및 7에 보고된 결과는 화합물 Ia 및 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 효능을 명백히 뒷받침한다. 이들 실험에서 화합물 Ia를 이용한 치료는 견실한 항종양 반응을 유도하여, 유세포 분석 및 IHC 데이터에서 관찰된 바와 같이 염증성 침윤물의 모집을 촉발한다. 화합물 Ia에 의한 면역계의 활성화는 화합물 Ia를 PD-1 축 결합 길항제와 조합할 때의 강한 효과를 뒷받침한다. 이에 더하여, 종양 항원의 방출 증가는 PD-1 축 차단의 추가 효능을 증진할 수 있다.
제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하는, 예방하는 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내에 적어도 하나의 활성제는 이중특이적 항체이고, 추가 활성제는 본원에 설명된 바와 같은 추가 화학요법제이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 함유된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 이중특이적 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 함유된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 실시형태에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 추가로 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
예시적인 실시형태의 아미노산 서열
예시적인 항-PD-1 및 항-PD-L1 길항제 서열
비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실시예로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실시예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 포함된다.

Claims (21)

  1. BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 BRAF 억제제는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화합물인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물:
    (I).
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물은 (3R)-N-[2-시아노-4-플루오로-3-(3-메틸-4-옥소-퀴나졸린-6-일)옥시-페닐]-3-플루오로-피롤리딘-1-술폰아미드인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제, PD-Ll 결합 길항제 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군에서 선택되는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 축 결합 길항제는 세미플리맙(Libtayo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 니볼루맙(Opdivo®), RN888(PF-06801591), 아테졸리주맙(Tecentriq®), 아벨루맙(Bavencio®) 및 더발루맙(Imfinzi™)에서 선택되는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 축 결합 길항제는 아테졸리주맙(Tecentriq®)인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 이용하기 위한, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료적 및/또는 예방적 처치에 이용하기 위한, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  9. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물의 용도.
  10. 암, 특히 흑색종, 비소세포 폐암 또는 연수막 암의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은, 효과량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, BRAF 억제제는 경구 투여되고, PD-1 축 결합 길항제는 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여되는, 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, BRAF 억제제는 PD-1 축 결합 길항제와 동시에 투여되는, 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물.
  14. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, BRAF 억제제는 PD-1 축 결합 길항제와 순차적으로 투여되는, 조합물, 용도, 방법 또는 약학 조성물.
  15. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 뇌암, 연수막 암 또는 비소세포 폐암인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  16. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 BRAFV600X 돌연변이와 연관되는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  17. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 암은 BRAFV600X 돌연변이-양성 절제불가능 또는 전이성 암인, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  18. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, 여기서 BRAFV600X 돌연변이는, (a) 환자의 종양 조직 및/또는 체액의 샘플로부터 추출된 핵산(예를 들면, DNA)에 대해 PCR 또는 염기서열분석을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 BRAFV600의 발현을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 결정되는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  19. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, MEK 억제제, MEK 분해제, EGFR 억제제, EGFR 분해제, HER2 및/또는 HER3의 억제제, HER2 및/또는 HER3의 분해제, SHP2 억제제, SHP2 분해제, Axl 억제제, Axl 분해제, ALK 억제제, ALK 분해제, PI3K 억제제, PI3K 분해제, SOS1 억제제, SOS1 분해제, 신호 전달 경로 억제제, 관문(checkpoint) 억제제, 아폽토시스(apoptosis) 경로의 조절인자, 세포독성 화학요법제, 혈관형성 표적화(angiogenesis-targeted) 요법, 면역 표적화 작용제, 및 항체-약물 접합체에서 선택되는 하나 이상의 추가 항암제를 포함하는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  20. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물로서, MEK 억제제를 또한 포함하는, BRAF 억제제와 PD-1 축 결합 길항제의 조합물.
  21. 전술된 바와 같은 발명.
KR1020237041756A 2021-06-09 2022-06-07 암의 치료에 이용하기 위한 특정 braf 억제제(패러독스 브레이크) 및 pd-1 축 결합 길항제의 조합물 KR20240019109A (ko)

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