PL222220B1 - Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza - Google Patents
Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarzaInfo
- Publication number
- PL222220B1 PL222220B1 PL393644A PL39364404A PL222220B1 PL 222220 B1 PL222220 B1 PL 222220B1 PL 393644 A PL393644 A PL 393644A PL 39364404 A PL39364404 A PL 39364404A PL 222220 B1 PL222220 B1 PL 222220B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- host cell
- cells
- human
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 266
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 262
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 258
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 186
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 45
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title claims description 28
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title claims description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title description 49
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 4
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 title description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 169
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 136
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 126
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 98
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 75
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 525
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 263
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 261
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 122
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 100
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 77
- 101150102398 Galt gene Proteins 0.000 claims description 55
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 53
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 53
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 230000025545 Golgi localization Effects 0.000 claims description 40
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 38
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 claims description 36
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 32
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 32
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 108010083819 mannosyl-oligosaccharide 1,3 - 1,6-alpha-mannosidase Proteins 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 14
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 14
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 102100022622 Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 claims description 11
- 101000972916 Homo sapiens Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 102000003781 Inhibitor of growth protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000191 Inhibitor of growth protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100346929 Homo sapiens MUC1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000057860 human MUC1 Human genes 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims 1
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 119
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 118
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 118
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 45
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 26
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 158
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 98
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 87
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 64
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 42
- 230000006870 function Effects 0.000 description 38
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 31
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000000463 material Substances 0.000 description 29
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 28
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 27
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 21
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 19
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 18
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 18
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 17
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 15
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 15
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 15
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 15
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 12
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 12
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 101001059701 Spodoptera frugiperda Alpha-mannosidase 2 Proteins 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 11
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 11
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 101000917821 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c Proteins 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 9
- 229940124292 CD20 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 8
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 8
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 8
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 7
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 6
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 6
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 6
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 6
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 6
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 5
- 102100029206 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-c Human genes 0.000 description 5
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 5
- 102100038551 Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase Human genes 0.000 description 5
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 5
- BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N Val-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 5
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 5
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 5
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 108040002068 peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 5-methoxysalicylic acid Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 206010050245 Autoimmune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 4
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 4
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 4
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 4
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 102100020773 Immunoglobulin kappa variable 1-12 Human genes 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 4
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 4
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 4
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 101150108347 sdhB gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 3
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 3
- 102100021761 Alpha-mannosidase 2 Human genes 0.000 description 3
- 206010002965 Aplasia pure red cell Diseases 0.000 description 3
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- OLISTMZJGQUOGS-GMOBBJLQSA-N Asn-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLISTMZJGQUOGS-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N Asp-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 3
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HQRHFUYMGCHHJS-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- FSPVILZGHUJOHS-QWRGUYRKSA-N Gly-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CNC=N1 FSPVILZGHUJOHS-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 3
- WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WECYRWOMWSCWNX-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 3
- PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PBOUVYGPDSARIS-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N 0.000 description 3
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- RWDVVSKYZBNDCO-MELADBBJSA-N Ser-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O RWDVVSKYZBNDCO-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O DAOREBHZAKCOEN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WBPFYNYTYASCQP-CYDGBPFRSA-N Val-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N WBPFYNYTYASCQP-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010012864 alpha-Mannosidase Proteins 0.000 description 3
- 102000019199 alpha-Mannosidase Human genes 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 208000017760 chronic graft versus host disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- XCSQXCKDEVRTHN-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CCC=CC1 XCSQXCKDEVRTHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 3
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 3
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 3
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 3
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 3
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 3
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AAUQLHHARJUJEH-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-5-methoxybenzoic acid Natural products COC1=CC=CC(O)=C1C(O)=O AAUQLHHARJUJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 2
- SVBXIUDNTRTKHE-CIUDSAMLSA-N Ala-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SVBXIUDNTRTKHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- DJAIOAKQIOGULM-DCAQKATOSA-N Arg-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O DJAIOAKQIOGULM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N Arg-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YBZMTKUDWXZLIX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FKQITMVNILRUCQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N Arg-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O UZSQXCMNUPKLCC-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N Arg-Tyr Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O UVTGNSWSRSCPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTAIIXQCOPUNBQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QTAIIXQCOPUNBQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N Asp-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100024775 Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- ZEXHDOQQYZKOIB-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZEXHDOQQYZKOIB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- MQQLYEHXSBJTRK-FXQIFTODSA-N Cys-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MQQLYEHXSBJTRK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 NWOUBJNMZDDGDT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N Glu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- FIQQRCFQXGLOSZ-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FIQQRCFQXGLOSZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- XVYKMNXXJXQKME-XEGUGMAKSA-N Gly-Ile-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XVYKMNXXJXQKME-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 2
- GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N Gly-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N Leu-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- PWPBLZXWFXJFHE-RHYQMDGZSA-N Leu-Pro-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PWPBLZXWFXJFHE-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N Leu-Thr-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N Lys-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N Phe-Arg-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N Phe-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 2
- JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N Phe-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(C)C)C(O)=O APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- SXJOPONICMGFCR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O SXJOPONICMGFCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000003670 Pure Red-Cell Aplasia Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N Ser-Asn-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KAAPNMOKUUPKOE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N Thr-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UDQBCBUXAQIZAK-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N Thr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- XLVRTKPAIXJYOH-HOCLYGCPSA-N Trp-His-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)NCC(=O)O)N XLVRTKPAIXJYOH-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 2
- OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N Tyr-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 2
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VNGKMNPAENRGDC-JYJNAYRXSA-N Val-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 VNGKMNPAENRGDC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N Val-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C(C)C)N)O MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010001271 arginyl-glutamyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N tyloxapol Chemical compound O=C.C1CO1.CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NTUPOKHATNSWCY-PMPSAXMXSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NTUPOKHATNSWCY-PMPSAXMXSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- ZFXQNADNEBRERM-BJDJZHNGSA-N Ala-Ala-Pro-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 ZFXQNADNEBRERM-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZIBWKCRKNFYTPT-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZIBWKCRKNFYTPT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SIGTYDNEPYEXGK-ZANVPECISA-N Ala-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 SIGTYDNEPYEXGK-ZANVPECISA-N 0.000 description 1
- NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N Ala-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C)N)O NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- IFKQPMZRDQZSHI-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IFKQPMZRDQZSHI-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- DCUCOIYYUBILPS-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DCUCOIYYUBILPS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DEWWPUNXRNGMQN-LPEHRKFASA-N Ala-Met-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DEWWPUNXRNGMQN-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N Ala-Phe-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N HYIDEIQUCBKIPL-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N Ala-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N Ala-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N Ala-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SSQHYGLFYWZWDV-UVBJJODRSA-N Ala-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O SSQHYGLFYWZWDV-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- HULHGJZIZXCPLD-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N HULHGJZIZXCPLD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N Arg-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N Arg-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- DPXDVGDLWJYZBH-GUBZILKMSA-N Arg-Asn-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DPXDVGDLWJYZBH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BVBKBQRPOJFCQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HJAICMSAKODKRF-GUBZILKMSA-N Arg-Cys-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O HJAICMSAKODKRF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BBYTXXRNSFUOOX-IHRRRGAJSA-N Arg-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BBYTXXRNSFUOOX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N Arg-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N Arg-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GOWZVQXTHUCNSQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N Arg-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UBCPNBUIQNMDNH-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N Arg-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 XKDYWGLNSCNRGW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OISWSORSLQOGFV-AVGNSLFASA-N Arg-Met-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OISWSORSLQOGFV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FIQKRDXFTANIEJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FIQKRDXFTANIEJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- IGFJVXOATGZTHD-UHFFFAOYSA-N Arg-Phe-His Natural products NC(CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccccc1)C(=O)NC(Cc2c[nH]cn2)C(=O)O IGFJVXOATGZTHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MOGMYRUNTKYZFB-UNQGMJICSA-N Arg-Thr-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MOGMYRUNTKYZFB-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XTWSWDJMIKUJDQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N Arg-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- AKEBUSZTMQLNIX-UWJYBYFXSA-N Asn-Ala-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N AKEBUSZTMQLNIX-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N Asn-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HUAOKVVEVHACHR-CIUDSAMLSA-N Asn-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N HUAOKVVEVHACHR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PTSDPWIHOYMRGR-UGYAYLCHSA-N Asn-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PTSDPWIHOYMRGR-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N Asn-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NLRJGXZWTKXRHP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WXVGISRWSYGEDK-KKUMJFAQSA-N Asn-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WXVGISRWSYGEDK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WCRQQIPFSXFIRN-LPEHRKFASA-N Asn-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WCRQQIPFSXFIRN-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N Asn-Pro-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N Asn-Thr-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N Asn-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N Asn-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O ZAESWDKAMDVHLL-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- XEDQMTWEYFBOIK-ACZMJKKPSA-N Asp-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XEDQMTWEYFBOIK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GVPSCJQLUGIKAM-GUBZILKMSA-N Asp-Arg-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O GVPSCJQLUGIKAM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HMQDRBKQMLRCCG-GMOBBJLQSA-N Asp-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HMQDRBKQMLRCCG-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N JDHOJQJMWBKHDB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QOVWVLLHMMCFFY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QOVWVLLHMMCFFY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- YRBGRUOSJROZEI-NHCYSSNCSA-N Asp-His-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O YRBGRUOSJROZEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N Asp-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- YWLDTBBUHZJQHW-KKUMJFAQSA-N Asp-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YWLDTBBUHZJQHW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QSFHZPQUAAQHAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- NWAHPBGBDIFUFD-KKUMJFAQSA-N Asp-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NWAHPBGBDIFUFD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108030001771 Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- SURTWIXUHQNUGN-GUBZILKMSA-N Cys-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N SURTWIXUHQNUGN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JTNKVWLMDHIUOG-IHRRRGAJSA-N Cys-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JTNKVWLMDHIUOG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KCPOQGRVVXYLAC-KKUMJFAQSA-N Cys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KCPOQGRVVXYLAC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- IDZDFWJNPOOOHE-KKUMJFAQSA-N Cys-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IDZDFWJNPOOOHE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NMWZMKLDGZXRKP-BZSNNMDCSA-N Cys-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NMWZMKLDGZXRKP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MBRWOKXNHTUJMB-CIUDSAMLSA-N Cys-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MBRWOKXNHTUJMB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LPBUBIHAVKXUOT-FXQIFTODSA-N Cys-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N LPBUBIHAVKXUOT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 206010051392 Diapedesis Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015218 Erythema multiforme Diseases 0.000 description 1
- 206010015226 Erythema nodosum Diseases 0.000 description 1
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 1
- 108010021470 Fc gamma receptor IIC Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- -1 GD3 ganglioside Chemical class 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N Glu-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BUZMZDDKFCSKOT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N Glu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DVLZZEPUNFEUBW-AVGNSLFASA-N Glu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N DVLZZEPUNFEUBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SYWCGQOIIARSIX-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SYWCGQOIIARSIX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asn Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ALMBZBOCGSVSAI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N Glu-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- HJTSRYLPAYGEEC-SIUGBPQLSA-N Glu-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJTSRYLPAYGEEC-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N Glu-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N Glu-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N Glu-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N Glu-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SOYWRINXUSUWEQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- YMUFWNJHVPQNQD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN YMUFWNJHVPQNQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N Gly-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN LHRXAHLCRMQBGJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OMOZPGCHVWOXHN-BQBZGAKWSA-N Gly-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)CN OMOZPGCHVWOXHN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN IRJWAYCXIYUHQE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N Gly-Thr-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YXTFLTJYLIAZQG-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)CN UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O DKJWUIYLMLUBDX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- HRGGKHFHRSFSDE-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Ser Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N HRGGKHFHRSFSDE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LBCAQRFTWMMWRR-CIUDSAMLSA-N His-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBCAQRFTWMMWRR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N His-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- MPXGJGBXCRQQJE-MXAVVETBSA-N His-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MPXGJGBXCRQQJE-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N His-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N 0.000 description 1
- ORERHHPZDDEMSC-VGDYDELISA-N His-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N ORERHHPZDDEMSC-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N His-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AIPUZFXMXAHZKY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- TVMNTHXFRSXZGR-IHRRRGAJSA-N His-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TVMNTHXFRSXZGR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JUCZDDVZBMPKRT-IXOXFDKPSA-N His-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O JUCZDDVZBMPKRT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- 101000615966 Homo sapiens Alpha-mannosidase 2x Proteins 0.000 description 1
- 101000787903 Homo sapiens Transmembrane protein 200C Proteins 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 1
- VSZALHITQINTGC-GHCJXIJMSA-N Ile-Ala-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N VSZALHITQINTGC-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- LVQDUPQUJZWKSU-PYJNHQTQSA-N Ile-Arg-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N LVQDUPQUJZWKSU-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N Ile-Asn-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- IIXDMJNYALIKGP-DJFWLOJKSA-N Ile-Asn-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N IIXDMJNYALIKGP-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- FUOYNOXRWPJPAN-QEWYBTABSA-N Ile-Glu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N FUOYNOXRWPJPAN-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- KFVUBLZRFSVDGO-BYULHYEWSA-N Ile-Gly-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O KFVUBLZRFSVDGO-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N Ile-Pro-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- CZWANIQKACCEKW-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N CZWANIQKACCEKW-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N Ile-Pro-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N Ile-Thr-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N DGTOKVBDZXJHNZ-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- QHUREMVLLMNUAX-OSUNSFLBSA-N Ile-Thr-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N QHUREMVLLMNUAX-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ZRLUISBDKUWAIZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N Leu-Asp-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XBCWOTOCBXXJDG-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XBCWOTOCBXXJDG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- WRLPVDVHNWSSCL-MELADBBJSA-N Leu-His-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N WRLPVDVHNWSSCL-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UBZGNBKMIJHOHL-BZSNNMDCSA-N Leu-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 UBZGNBKMIJHOHL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HGUUMQWGYCVPKG-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N HGUUMQWGYCVPKG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N Leu-Pro-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IZPVWNSAVUQBGP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ADJWHHZETYAAAX-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N ADJWHHZETYAAAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- KLSUAWUZBMAZCL-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KLSUAWUZBMAZCL-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- OZTZJMUZVAVJGY-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N OZTZJMUZVAVJGY-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N Leu-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O BGGTYDNTOYRTTR-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- YIRIDPUGZKHMHT-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YIRIDPUGZKHMHT-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZQCVMVCVPFYXHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HGZHSNBZDOLMLH-DCAQKATOSA-N Lys-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N HGZHSNBZDOLMLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LLSUNJYOSCOOEB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KNKJPYAZQUFLQK-IHRRRGAJSA-N Lys-His-Arg Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KNKJPYAZQUFLQK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PRCHKVGXZVTALR-KKUMJFAQSA-N Lys-His-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PRCHKVGXZVTALR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N Lys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N Lys-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VUTWYNQUSJWBHO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN YSPZCHGIWAQVKQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N Lys-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- USPJSTBDIGJPFK-PMVMPFDFSA-N Lys-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O USPJSTBDIGJPFK-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N Lys-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- VIZLHGTVGKBBKO-AVGNSLFASA-N Met-Arg-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N VIZLHGTVGKBBKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OLWAOWXIADGIJG-AVGNSLFASA-N Met-Arg-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O OLWAOWXIADGIJG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OSOLWRWQADPDIQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WGBMNLCRYKSWAR-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN WGBMNLCRYKSWAR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UROWNMBTQGGTHB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Leu-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KMSMNUFBNCHMII-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN KMSMNUFBNCHMII-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ILKCLLLOGPDNIP-RCWTZXSCSA-N Met-Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ILKCLLLOGPDNIP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- MPCKIRSXNKACRF-GUBZILKMSA-N Met-Pro-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MPCKIRSXNKACRF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028424 Myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010029491 Nodular vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229940122060 Ornithine decarboxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N Phe-Arg-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N Phe-Asn-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N HXSUFWQYLPKEHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKUGPVXSDOOANW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N Phe-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BNRFQGLWLQESBG-YESZJQIVSA-N Phe-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O BNRFQGLWLQESBG-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- RVEVENLSADZUMS-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RVEVENLSADZUMS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N Phe-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O MRWOVVNKSXXLRP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N Phe-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- LKRUQZQZMXMKEQ-SFJXLCSZSA-N Phe-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LKRUQZQZMXMKEQ-SFJXLCSZSA-N 0.000 description 1
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 102100025067 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710163352 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Proteins 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OYEUSRAZOGIDBY-JYJNAYRXSA-N Pro-Arg-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OYEUSRAZOGIDBY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UVKNEILZSJMKSR-FXQIFTODSA-N Pro-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UVKNEILZSJMKSR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N Pro-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- ILMLVTGTUJPQFP-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ILMLVTGTUJPQFP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N Pro-Gly-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- BAKAHWWRCCUDAF-IHRRRGAJSA-N Pro-His-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BAKAHWWRCCUDAF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CPRLKHJUFAXVTD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N Pro-Met-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HBBBLSVBQGZKOZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RPLMFKUKFZOTER-AVGNSLFASA-N Pro-Met-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RPLMFKUKFZOTER-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NAIPAPCKKRCMBL-JYJNAYRXSA-N Pro-Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 NAIPAPCKKRCMBL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CZCCVJUUWBMISW-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O CZCCVJUUWBMISW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N Pro-Thr-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ZYJMLBCDFPIGNL-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O ZYJMLBCDFPIGNL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RNFKSBPHLTZHLU-WHFBIAKZSA-N Ser-Cys-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N)O RNFKSBPHLTZHLU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N Ser-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N Ser-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZBKRJVCRMZAST-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJHJPZQOMKCSTP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ODRUTDLAONAVDV-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ODRUTDLAONAVDV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000027522 Sydenham chorea Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001106 Takayasu Arteritis Diseases 0.000 description 1
- NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O NJEMRSFGDNECGF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- LOHBIDZYHQQTDM-IXOXFDKPSA-N Thr-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LOHBIDZYHQQTDM-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- KBLYJPQSNGTDIU-LOKLDPHHSA-N Thr-Glu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KBLYJPQSNGTDIU-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N Thr-Glu-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N Thr-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N Thr-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N UYTYTDMCDBPDSC-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N Thr-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N Thr-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WRQLCVIALDUQEQ-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N Thr-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N Thr-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O DEGCBBCMYWNJNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N Thr-Pro-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KERCOYANYUPLHJ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYBFTPLPAXZBOY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- KPMIQCXJDVKWKO-IFFSRLJSSA-N Thr-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPMIQCXJDVKWKO-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100025939 Transmembrane protein 200C Human genes 0.000 description 1
- RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N Trp-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- NKUIXQOJUAEIET-AQZXSJQPSA-N Trp-Asp-Thr Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NKUIXQOJUAEIET-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- DTPARJBMONKGGC-IHPCNDPISA-N Trp-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N DTPARJBMONKGGC-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- BEWOXKJJMBKRQL-AAEUAGOBSA-N Trp-Gly-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BEWOXKJJMBKRQL-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- BOBZBMOTRORUPT-XIRDDKMYSA-N Trp-Ser-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BOBZBMOTRORUPT-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- LNGFWVPNKLWATF-ZVZYQTTQSA-N Trp-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LNGFWVPNKLWATF-ZVZYQTTQSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HKYTWJOWZTWBQB-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HKYTWJOWZTWBQB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GIOBXJSONRQHKQ-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GIOBXJSONRQHKQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- PJWCWGXAVIVXQC-STECZYCISA-N Tyr-Ile-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PJWCWGXAVIVXQC-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- GYKDRHDMGQUZPU-MGHWNKPDSA-N Tyr-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N GYKDRHDMGQUZPU-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- FGVFBDZSGQTYQX-UFYCRDLUSA-N Tyr-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FGVFBDZSGQTYQX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N Tyr-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O KLQPIEVIKOQRAW-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- KSGKJSFPWSMJHK-JNPHEJMOSA-N Tyr-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KSGKJSFPWSMJHK-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- HZWPGKAKGYJWCI-ULQDDVLXSA-N Tyr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(C)C)C(O)=O HZWPGKAKGYJWCI-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N Val-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- SMKXLHVZIFKQRB-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SMKXLHVZIFKQRB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N Val-Arg-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N Val-Glu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VVZDBPBZHLQPPB-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N Val-Gly-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N Val-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RFKJNTRMXGCKFE-FHWLQOOXSA-N Val-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 RFKJNTRMXGCKFE-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- IEBGHUMBJXIXHM-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N IEBGHUMBJXIXHM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FMQGYTMERWBMSI-HJWJTTGWSA-N Val-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N FMQGYTMERWBMSI-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N Val-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- VSCIANXXVZOYOC-AVGNSLFASA-N Val-Pro-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N VSCIANXXVZOYOC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DEGUERSKQBRZMZ-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEGUERSKQBRZMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HWNYVQMOLCYHEA-IHRRRGAJSA-N Val-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N HWNYVQMOLCYHEA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MIAZWUMFUURQNP-YDHLFZDLSA-N Val-Tyr-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N MIAZWUMFUURQNP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 1
- 235000010722 Vigna unguiculata Nutrition 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 125000005211 alkyl trimethyl ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010087667 beta-1,4-mannosyl-glycoprotein beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical group O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 102000023852 carbohydrate binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008400 carbohydrate binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012085 chronic inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 201000003278 cryoglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000008846 dynamic interplay Effects 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNYBQONXHNTVIJ-UHFFFAOYSA-N etodolac Chemical compound C1COC(CC)(CC(O)=O)C2=C1C(C=CC=C1CC)=C1N2 NNYBQONXHNTVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical class COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960000578 gemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960003297 gemtuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000000585 glomerular basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000055333 human MAN2A2 Human genes 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229950000518 labetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000023404 leukocyte cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 229940063718 lodine Drugs 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002818 ornithine decarboxylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 206010064257 ovarian fibroma Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000793 papillary cystadenoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229960005570 pemtumomab Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000019629 polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000005664 protein glycosylation in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940051173 recombinant immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 208000005057 thyrotoxicosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010058119 tryptophyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010029384 tryptophyl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/2488—Mannanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01038—Beta-N-acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-galactosyltransferase (2.4.1.38)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01094—Protein N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.94)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01114—2-Coumarate O-beta-glucosyltransferase (2.4.1.114)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01144—Beta-1,4-mannosyl-glycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.144)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01024—1,4-Alpha-glucan 6-alpha-glucosyltransferase (2.4.1.24)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01096—Hexosyltransferases (2.4.1) sn-Glycerol-3-phosphate 1-galactosyltransferase (2.4.1.96)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
Description
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 22.01.2004 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
377967 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
22.01.2004, PCT/IB04/000844 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
05.08.2004, WO04/065540 (51) Int.Cl.
C12N 9/10 (2006.01) C12N 9/24 (2006.01) C07K 16/00 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01)
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
(30) Pierwszeństwo: 22.01.2003, US, 60/441,307 | (73) Uprawniony z patentu: |
ROCHE GLYCART AG, Z^ich, CH | |
31.07.2003, US, 60/491,254 15.08.2003, US, 60/495,142 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
PABLO UMANA, Zurich, CH | |
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 20.02.2006 BUP 04/06 | PETER BRUENKER, Hittnau, CH CLAUDIA FERRARA, Zurich, CH TOBIAS SUTER, Baden, CH |
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska |
29.07.2016 WUP 07/16 |
PL 222 220 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza.
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny manipulacji glikozylacją białek, a bardziej konkretnie cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym, konstruktów fuzyjnych mających aktywność katalityczną i ich zastosowania w manipulacji glikozylacją w komórkach gospodarzy w celu wytworzenia polipeptydów o zwiększonych właściwościach terapeutycznych, w tym przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonej funkcji efektorowej.
Glikoproteiny pośredniczą w wielu istotnych funkcjach u ludzi, w innych organizmach eukariotycznych i niektórych prokariotycznych, włączając w to katalizę, przekazywanie sygnałów, komunikację międzykomórkową oraz rozpoznawanie i asocjację cząsteczek. Stanowią one większość niecytosolowych białek w organizmach eukariotycznych. (Lis i wsp., Eur. J Biochem. 218 : 1-27 (1993)). Wiele glikoprotein jest wykorzystywanych do celów terapeutycznych i w czasie ostatnich dwóch dziesięcioleci zrekombinowane wersje występujących naturalnie, wydzielanych glikoprotein były głównym produktem przemysłu biotechnologicznego. Przykłady obejmują erytropoetynę (EPO), terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (terapeutyczne mAb), aktywator tkankowy plazminogenu (tPA), interferon-β (IFN-β), czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF) i ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG). (Cumming i wsp., Glycobiology 1 : 115-130 (1991)).
Składnik oligosacharydowy może znacząco wpływać na właściwości związane ze skutecznością terapeutycznej glikoproteiny, w tym, stabilność fizyczną, odporność na atak proteaz, oddziaływania z układem odpornościowym, farmakokinetykę i specyficzną aktywność biologiczną. Takie właściwości mogą zależeć nie tylko od obecności albo nieobecności, ale również odspecyficznych struktur oligosacharydów. Można dokonać pewnych uogólnień pomiędzy strukturą oligosacharydu i funkcją glikoproteiny. Na przykład, pewne struktury oligosacharydowe pośredniczą w szybkim usuwaniu glikoproteiny z krwiobiegu przez oddziaływania ze specyficznymi białkami wiążącymi węglowodany, podczas gdy inne struktury mogą być wiązane przez przeciwciała i wzbudzać niepożądane reakcje odpornościowe. (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14 : 975-81 (1996)).
Komórki ssaków są korzystnymi gospodarzami do wytwarzania terapeutycznych glikoprotein dzięki ich zdolności do glikozylacji białek w postaci najbardziej odpowiedniej do zastosowań u ludzi. (Cumming i wsp., Glycobiology 1 : 115-30 (1991); Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14 : 975-81 (1996)). Bakterie bardzo rzadko glikozylują białka i podobnie jak inne typy powszechnie stosowanych gospodarzy, takie jak drożdże, grzyby nitkowate, komórki owadzie i roślinne, dają wzory glikozylacji związane z szybkim usuwaniem z krwiobiegu, niepożądanymi reakcjami odpornościowymi i w niektórych konkretnych przypadkach, zmniejszoną aktywnością biologiczną.
Wśród komórek ssaczych, w ciągu ostatnich dwóch dziesięcioleci najczęściej były używane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO). Poza dawaniem odpowiednich wzorów glikozylacji komórki te umożliwiają powtarzalne wytwarzanie stabilnych genetycznie, wysoce produktywnych klonów linii komórkowych. Można je hodować do wysokich gęstości w prostych bioreaktorach przy zastosowaniu wolnej od surowicy pożywki, co umożliwia opracowywanie bezpiecznych i powtarzalnych bioprocesów. Inne powszechnie stosowane komórki zwierzęce obejmują komórki nerki oseska chomika (BHK), komórki mysiego szpiczaka NSO i SP2/0. Ostatnio testowano również wytwarzanie transgenicznych zwierząt (Jenkins i wsp., Nature Biotechnol. 14 : 975-81 (1996)).
Wszystkie przeciwciała zawierają struktury węglowodanów z konserwowanymi pozycjami w regionach stałych łańcucha ciężkiego, przy czym każdy izotyp posiada odrębny układ N-związanych struktur węglowodanowych, które w różny sposób wpływają na składanie, sekrecję lub aktywność funkcjonalną (Wright, A., i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 : 26-32 (1997)). Te struktury N-związanych węglowodanów różnią się znacząco w zależności od stopnia obróbki i mogą obejmować bogate w mannozę, wielokrotnie rozgałęzione jak również dwuantenowe złożone oligosacharydy. (Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 : 26-32 (1997)). Typowo, ma miejsce heterogenna obróbka struktur rdzenia oligosacharydowego przyłączonego w konkretnym miejscu glikozylacji, tak, że istnieją nawet przeciwciała monoklonalne jako liczne glikoformy. Podobnie, wykazano, że główne różnice w glikozylacji przeciwciał występują pomiędzy liniami komórkowymi, a nawet mniejsze różnice są widoczne dla danej linii komórkowej hodowanej w różnych warunkach hodowli. (Lifely, M. R. i wsp., Glycobiology 5 (8) : 813-22 (1995)).
PL 222 220 B1
Nieskoniugowane przeciwciała monoklonalne (mAb) mogą być przydatnymi lekami do leczenia raka, co zostało pokazane przez zatwierdzenie przez U. S. Food and Drug Administration Rituximabu (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA oraz Genentechinc., San Francisco, CA) do leczenia chłoniaka nieziarniczego komórek B CD20-dodatnich o niskim stopniu złośliwości lub grudkowego, Trastuzumabu (Herceptin™; GenentechInc) do leczenia zaawansowanego raka sutka (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semis. Oncol. 26 : 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin.Ther. 21 : 309-18 (1999)), Gemtuzumabu (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) do leczenia nawracającej ostrej białaczki szpikowej i Alemtuzumabu (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) do leczenia przewlekłej białaczki limfocytowej z komórek B. Sukces tych produktów wynika nie tylko z ich skuteczności, ale również ich wyróżniających się profili bezpieczeństwa (Grillo-Lopez, A.-J., i wsp., Semin. Oncol. 26 : 66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Cliva. Ther. 21 : 309-18 (1999)). Pomimo sukcesu tych leków, istnieje obecnie ogromne zainteresowanie otrzymaniem wyższej aktywności swoistych przeciwciał niż osiąga się zazwyczaj poprzez terapię z nieskoniugowanymi mAb.
Jedną z dróg uzyskania znacznego zwiększenia mocy przy utrzymaniu prostego procesu wytwarzania i potencjalnym uniknięciu znacznych, niepożądanych efektów ubocznych jest wzmocnienie naturalnych funkcji efektorowych mAb, w których pośredniczą komórki przez manipulację ich składnikiem oligosacharydowym (Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17 : 176-180 (1999)). Przeciwciała typu IgG1, czyli przeciwciała najczęściej stosowane w immunoterapii raka, są glikoproteinami, które mają konserwowane N-związane miejsce glikozylacji w pozycji Asn297 w każdej domenie CH2. Dwa złożone dwuantenowe oligosacharydy przyłączone do Asn297 są zagłębione pomiędzy domenami CH2, tworząc silne miejsce styku ze szkieletem polipeptydowym i ich obecność jest niezbędna, aby przeciwciało pośredniczyło w funkcjach efektorowych, takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała (ADCC) (Lifely, M. R., i wsp., Glycobiology 5 : 813-822 (1995); Jefferis, R., i wsp., Immunol Rev. 163 : 59-16 (1998); Wright, A. i Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 : 26-32 (1997)).
Niniejsi twórcy wykazali uprzednio, że nadekspresja w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) β (1, 4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III), glikozylotransferazy katalizującej tworzenie się przeciętych oligosacharydów, znacznie zwiększa aktywność ADCC in vitro chimerowych przeciwciał monoklonalnych wobec nerwiaka niedojrzałego (chCE7) wytwarzanych przez poddane zabiegom inżynierii genetycznej komórki CHO. (Patrz Umana, P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999), międzynarodowa publikacja nr WO 99/54342). Przeciwciało chCE7 należy do dużej klasy nieskoniugowanych przeciwciał, które mają wysokie powinowactwo i swoistość wobec nowotworu, ale zbyt małą moc, aby być klinicznie przydatne, gdy są wytwarzane w standardowych przemysłowych liniach komórkowych z brakiem enzymu GnT III (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol. 17 : 176-180 (1999)). Były to pierwsze badania, które wykazały, że można uzyskać ogromne zwiększenie aktywności ADCC przez poddanie zabiegom inżynierii genetycznej komórek wytwarzających przeciwciała, tak aby wyrażały GnT III, co prowadzi również do zwiększenia proporcji związanych z regionem stałym (Fc) przeciętych oligosacharydów, w tym przeciętych niefukozylowanych oligosacharydów, powyżej poziomów znalezionych w przeciwciałach występujących naturalnie.
Wyniki wielu badań sugerują, że mechanizmy zależne od receptora Fc mają istotny udział w działaniu cytotoksycznych przeciwciał przeciw nowotworom i wskazują, że optymalne przeciwciało przeciw nowotworom będzie wiązać się preferencyjnie z aktywacyjnymi receptorami Fc, a minimalnie z partnerem inhibitorowym FcyRIIB. (Clynes, R. A., i wsp., Nature Medicine 6(4) : 443-446 (2000); Kalergis, A. M. oraz Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195(12) : 1653-1659 (czerwiec 2002). Na przykład, wyniki z co najmniej jednego badania sugerują, że zwłaszcza receptor FcyRIIB jest silnie związany ze skutecznością terapii przeciwciałem. (Cartron, G., i wsp., Blood 99(3) : 754-757 (luty 2002)). Badania te wykazały, że pacjenci homozygotyczni pod względem FcyRIIIa mieli lepszą odpowiedź na Rituximab niż pacjenci heterozygotyczni. Autorzy wyciągnęli wniosek, że lepsza odpowiedź była dzięki lepszemu wiązaniu się przeciwciała z FcyRIIIa in vivo, czego wynikiem była lepsza aktywność ADCC przeciw komórkom chłoniaka. (Cartron, G., i wsp., Blood 99(3) : 754-757 (luty 2002)).
Poza ADCC, przeciwciała monoklonalne o działaniu przeciwnowotworowym często indukują niezależne od Fc mechanizmy bezpośredniego przekazywania sygnałów, które regulują przeżywanie, proliferację lub śmierć komórek docelowych przez aktywację kaskad przekazywania sygnałów w komórkach albo blokowanie dostępu dla czynników wzrostu. (Selenko, N., i wsp., J Clin. Immunol. 22 (3) : 124-130 (2002)). Na przykład, wykazano, że traktowanie Rituximabem komórek B CD20+ indukuje lizę za pośrednictwem dopełniacza i indukowaną przez Mab indukcję apoptozy, jak również ADCC. (Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22(3) : 124-130 (2002)). Ponadto, apoptoza komórek chłoniaka
PL 222 220 B1 indukowana przez Rituximab nie tylko zabija komórki, ale również promuje pobieranie i prezentację krzyżową peptydów pochodzących z komórek chłoniaka przez prezentujące antygen komórki dendrytyczne (DC), indukuje dojrzewanie DC i umożliwia wytwarzane swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL).
Znając ogromny potencjał terapeutyczny przeciwciał o zwiększonym powinowactwie wiązania się z receptorem Fc i zwiększonej funkcji efektorowej, niniejsi twórcy opracowali sposób wytwarzania takich przeciwciał, który obejmuje manipulacje profilem glikozylacji regionu Fc przeciwciała.
Twórcy niniejszego wynalazku badali ogólnie sposoby manipulacji systemem glikozylacji komórki gospodarza w celu dokonania zmian wzoru glikozylacji jednego albo większej liczby polipeptydów wytwarzanych przez tę komórkę gospodarza. Sposób według wynalazku można zastosować do wytwarzania terapeutycznych przeciwciał o zmodyfikowanej glikozylacji w regionie Fc, w tym zmniejszonej fukozylacji, przy czym przeciwciała mają zwiększoną funkcję efektorową i/lub zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku zmodyfikowanej glikozylacji. Poddane zmianom glikozylacji przeciwciała są szczególnie przydatne w traktowaniu terapeutycznym nowotworów u pacjentów.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórki gospodarza, która zawiera (a) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową, która zawiera domenę katalityczną β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnTIII)lub β (1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego β (1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (ManII); i (b) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza, przy czym polipeptyd ten jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała oraz fuzji białkowej, przy czym ten polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza obejmuje region Fc ludzkiej IgG, a fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym domena katalityczna GnTIII ma aktywność GnTIII i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją z SEK. ID. NR: 21 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena katalityczna GalT ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 22 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, natomiast domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 23 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 24 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Korzystnie polipeptydem wytwarzanym przez tę komórkę gospodarza jest IgG lub jej fragment, korzystniej IgGl lub jej fragment.
Korzystnie fuzja polipeptydowa w komórce według wynalazku zawiera domenę katalityczną GnTIII, która korzystnie ma aktywność GnTIII i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 21 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.
Korzystnie domena katalityczna GnTIII ma aktywność GnTIII i zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 21.
Korzystnie fuzja polipeptydowa w komórce według wynalazku zawiera domenę katalityczną GalT, która ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 22 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, bardziej korzystnie domena katalityczna GalT ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 22.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego w komórce według wynalazku jest domena lokalizacji Man II, która korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 23 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi lub sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 23.
Korzystnie domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji GnTI, która korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 24 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi lub obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 24.
PL 222 220 B1
Korzystnie polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza według wynalazku wykazuje zwiększoną funkcję efektorową w wyniku przeprowadzenia modyfikacji, bardziej korzystnie zwiększoną funkcją efektorową, którą jest zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc lub zwiększone wiązanie się z komórkami NK lub zwiększone wiązanie się z makrofagami, lub zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi, lub zwiększone wiązanie się z monocytami, lub zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę, lub zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych lub zwiększone piętnowanie komórek T.
Korzystnie również polipeptyd wytworzony przez komórkę według wynalazku opisaną powyżej wykazuje w wyniku przeprowadzonej modyfikacji zwiększone powinowactwo do receptora Fc, lub korzystnie receptora aktywującego Fcy lub receptora FcyRIIIA.
Korzystnie komórka według wynalazku jest komórką CHO, komórką BHK, komórką NSO, komórką SP2/0, komórką szpiczaka YO, mysią komórką szpiczaka P3X63, komórką PER, komórką PER.C6 lub komórką hybrydoma.
Korzystnie polipeptydem wytwarzanym przez komórkę gospodarza jest przeciwciało anty-CD20, bardziej korzystnie jest IDEC-C2B8.
Korzystnie polipeptydem wytwarzanym przez komórkę gospodarza jest chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 wobec ludzkich komórek raka nerki.
Korzystnie co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez komórkę według wynalazku jest transfekowanym kwasem nukleinowym. Korzystnie ten transfekowany kwas nukleinowy koduje przeciwciało anty-CD20, chimerowe przeciwciało monoklonalne chCE7 przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 przeciw rakowi komórek nerki, chimerowe przeciwciało monoklonalne ING-1 przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i sutka, humanizowane monoklonalne przeciwciało 3622W94 anty-ludzki antygen 17-1 A, humanizowane przeciwciało A33 przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka, przeciwciało R24 przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydowi GD3, chimerowe przeciwciało monoklonalne SF-25 przeciw rakowi płasko komórkowemu człowieka, przeciwciało anty-ludzki EGFR, przeciwciało anty-ludzki EGFRyIII, przeciwciało anty-ludzki PSMA, przeciwciało anty-ludzki PSCA, przeciwciało anty-ludzki CD22, przeciwciało anty-ludzki CD30, przeciwciało anty-ludzki CD33, przeciwciało anty-ludzki CD38 człowieka, przeciwciało anty-ludzki CD40, przeciwciało anty-ludzki CD45, przeciwciało anty-ludzki CD52, przeciwciało anty-ludzki CD138, przeciwciało anty-ludzki wariant HLA-DR, przeciwciało antyludzki EpCAM, przeciwciało anty-ludzki CEA, przeciwciało anty-ludzki MUC1, przeciwciało antyludzkie białko rdzenia MUC1, przeciwciało przeciw nieprawidłowo glikozylowanemu ludzkiemu MUC1, przeciwciało przeciw wariantom ludzkiej fibronektyny zawierającym domenę ED-B lub przeciwciało anty-ludzki HER2/neu.
Korzystnie co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową jest połączony funkcjonalnie z konstytutywnym elementem promotorowym.
Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza obejmującego:
a. hodowanie komórki gospodarza według wynalazku określonej powyżej w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie tego polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym ta fuzja polipeptydową jest wyrażana w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; i
b. izolowanie polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza.
Korzystnie polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza wykazuje zwiększoną funkcję efektorową jak opisano powyżej w części dotyczącej komórki według wynalazku.
Polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza korzystnie wykazuje w wyniku modyfikacji zwiększone wiązanie się z receptorem Fc, którym korzystnie jest receptor aktywujący Fc lub receptor FcyRIIIA.
Polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza korzystnie wykazuje zwiększony udział przeciętych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu.
Polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza korzystnie wykazuje zwiększony udział oligosacharydów niefukozylowanych w regionie Fc, przy czym bardziej korzystnie niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe lub niefukozylowane oligosacharydy są złożone.
Polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza korzystnie wykazuje zwiększony udział przeciętych niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu, przy czym bar6
PL 222 220 B1 dziej korzystnie przecięte niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe lub przecięte n iefukozylowane oligosacharydy są złożone.
Korzystniej co najmniej 20% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowi przecięte niefukozylowane oligosacharydy lub co najmniej 25% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte niefukozylowane lub co najmniej 30% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte, niefukozylowane lub co najmniej 35% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte niefukozylowane oligosacharydy.
Krótki opis figur
Fig. 1. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez zmienionej glikozylacji) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach BHK. Komórki transfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, aoligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 2. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym dzikiego typu („wt”) GnT III. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1166 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 3. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgGl anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („Gl-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną dzięki domenie lokalizacji GnT I w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1425 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 4. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w BHK, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfamannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1502 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1506 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 5. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA. Komórki transfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 6. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293EBNA, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfamannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 7. Widma MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego przeciwciała ze zmienioną glikozylacją IgG1 anty-CD20, wytworzonego w HEK293EBNA, zmanipulowanych genetycznie kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową („M2-GnTIII”) o aktywności GnT III i zlokalizowaną w aparacie Golgiego dzięki domenie lokalizacji alfamannozydazy II (Man II) w aparacie Golgiego. Komórki kotransfekowano wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. (a) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (b) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH.
PL 222 220 B1
Fig. 8. (a) Schematyczny opis trawienia oligosacharydów katalizowanego przez EndoH. EndoH może ciąć hybrydy (i hybrydy przecięte, ale nie może ciąć złożonych lub złożonych przeciętych oligosacharydów. (b) Przez rozróżnianie pomiędzy oligosacharydami złożonymi i typu hybrydowego, obróbka EndoH umożliwia przypisanie cech strukturalnych pikom oligosacharydów o takich samych stosunkach m/z w widmach MALDI/TOF-MS, otrzymanych po początkowej obróbce PNGazą F.
Fig. 9. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „G1-GnTIII” w porównaniu z warunkowaną przez niezmodyfikowane, zrekombinowane chimerowe przeciwciała IgGl anty-CD20. Oba przeciwciała wytworzono w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 3, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 1. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4 godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E : T wynosił 25 : 1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 10. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) warunkowana przez przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z warunkowaną przez niezmodyfikowane, zrekombinowane anty-CD20 chimerowe przeciwciała IgG1. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E : T wynosił 25 : 1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 11. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu ze zrekombinowanym anty-CD20, chimerowym przeciwciałem IgG1 o glikozylacji zmienionej przez „wt-GnT III”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach BHK. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III przedstawiono na Fig. 4, a profil dla przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez wt-GnT III na Fig. 2. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E : T wynosił 25 : 1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 12. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1, z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-iudzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując konkurujący fragment przeciwciała specyficznego dla Fcgamma-Rllla (patrz Fig. 13).
Fig. 13. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK w obecności rosnących stężeń konkurującego fragmentu przeciwciała anty-FcgammaRIII. Oba zrekombinowane przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6,
PL 222 220 B1 a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1, przy czym oczyszczone komórki NK inkubowano razem z rekombinowanym przeciwciałem (zawsze w końcowym stężeniu 3 pg/ml) i z różnymi, rosnącymi stężeniami (patrz wykres) konkurującego fragmentu 3G8-Fab2 przeciwciała anty-Fcgammmalll. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora Fcgamma-RIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK.
Fig. 14. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych przeciwciał IgG1 „L19” rozpoznających formę izomeryczną ED-B+ fibronektyny i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem pETR1546 do ekspresji przeciwciała.(b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem pETR154 6 do ekspresji przeciwciała i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej chromatografią powinowactwa do białka A, a następnie chromatografią wykluczania według wielkości w złożu Superdex 200 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 15. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-ED-B+fibronektyna chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIb na ludzkich komórkach chłoniaka Raji. Oba przeciwciała wytworzono w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 14b, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 14a. Test wiązania wykonano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITO fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach chłoniaka Raj i pochodzącego z komórek B.
Fig. 16. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnTIII” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgG1 z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK pochodzących od różnych dawców. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293-EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Test wiązania wykonano tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawców o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Dwóch dawców genotypowano jako jako homozygoty pod względem wariantu 158V-„o wyższym powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Dwóch innych dawców genotypowano jako heterozygoty 158V/F pod względem wariantów 158V-„o wyższym powinowactwie” i 158F-„o niższym powinowactwie” receptora FcgammaRIIIa. Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano przez zastosowanie konkurencyjnego fragmentu przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 17. Analiza FACS ekspresji skróconego CD4 (tCD4) w liniach komórkowych stabilnie wytwarzających chimerowe przeciwciała anty-CD20 IgGl (a) BHK-1502-28 (dzikiego typu) i w (b) klonie BHK-1502-28-11 (o glikozylacji zmienionej przez M2-GnTIII). Ekspresja tCD4 jest funkcjonalnie sprzężona z ekspresją M2-GnT III przez element IRES na wektorze ekspresyjnym pETR1537 GnT III, w związku z tym jest stosowana jako pośredni marker dla ekspresji GnT III. Średnie i średnie geometryczne intensywności fluorescencji wynosiły odpowiednio 27,6 i 19,9 dla linii komórkowych poddanych manipulacji glikozylacją oraz 4,7 i 4,1 dla linii komórkowych typu dzikiego.
Fig. 18. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III, przeciwciała chimerowego IgG1 antyCD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK-1502-28-11.
PL 222 220 B1
Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 19. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od oligosacharydów uwolnionych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH, pochodzących ze zrekombinowanego, o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III, przeciwciała chimerowego IgG1 anty-CD20, wytworzonego w linii komórkowej BHK 1502-28-11. Linię komórkową, oczyszczanie przeciwciała i otrzymywanie oraz analizę oligosacharydów opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 20. Wiązanie przeciwciał o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu z wiązaniem niezmodyfikowanych, zrekombinowanych anty-CD20 chimerowych przeciwciał IgGl, wytworzonych w stabilnych liniach komórkowych, z receptorem FcgammaRIIIa na komórkach NK. Profil glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 18 i na Fig. 19. Test wiązania wykonano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji, mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano przez zastosowanie konkurencyjnego fragmentu przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 21. Liza za pośrednictwem dopełniacza (CML) zależna od przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do zależnej od niezmodyfikowanego, zrekombinowanego anty-CD20 chimerowego przeciwciała IgG1. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 6, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 5. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki chłoniaka SKW6.4. W teście zastosowano ludzki układ dopełniacza. Lizę mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 22. Widma MALDI/TOF-MS obojętnych mieszanin oligosacharydów pochodzących od zrekombinowanych, chimerowych przeciwciał IgG1 „C225” rozpoznających ludzki receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR) i wytworzonych w komórkach HEK293-EBNA. (a) Niezmodyfikowane przeciwciało wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciała pURSl28. (b) Przeciwciało o glikozylacji zmienionej przez M2-GnT III wytworzone w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciała pE-TRURSI28 i wektorem pETR1519 do ekspresji GnT III. Oba przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej chromatografią powinowactwa do białka A, a następnie chromatografią wykluczania według wielkości w złożu Superdex200 (Amersham) wymieniając bufor na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 23. Zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórkowa (ADCC) przeciwciała o glikozylacji zmienionej przez „M2-GnT III” w porównaniu do niezmodyfikowanego, zrekombinowanego antyEGFR chimerowego przeciwciała IgGl „C225”. Oba przeciwciała otrzymano w komórkach HEK293EBNA. Profil wytwarzania i glikozylacji przeciwciała ze zmienioną glikozylacją przedstawiono na Fig. 22b, a profil dla niezmodyfikowanego przeciwciała na Fig. 22a. Komórkami docelowymi (T) były ludzkie komórki raka płaskokomórkowego (nr ECACC 85090402). Komórkami efektorowymi (E) były świeżo wyizolowane ludzkie komórki PBMC. W trakcie 4-godzinnej inkubacji w teście ADCC stosunek E : T wynosił 25 : 1, cytotoksyczność mierzono ilością uwolnionej dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w stosunku do kontrolnych poziomów maksymalnego uwalniania (z zastosowaniem detergentu zamiast przeciwciała) i uwalniania spontanicznego (pożywka hodowlana zamiast przeciwciała). Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 24. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji polipeptydowej Mannozydaza II-GnT III.
Fig. 25. Sekwencja kwasu nukleinowego i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa fuzji polipeptydowej GnTI-GnTIII.
Fig. 26. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od niezmodyfikowanego, chimerowego przeciwciała IgGl C2B8 anty-CD20 („Cwt”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Przeciwciało
PL 222 220 B1 oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w dziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 5.
Fig. 27. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgGl ze zmienioną glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cbrt”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520 i wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej, a oligosacharydy otrzymano i analizowano, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 5. (A) Profil oligosacharydowy uwalnianych przez PNGazę F oligosacharydów, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosacharydowy oligosacharydów uwalnianych przez PNGazę F, trawionych następnie EndoH.
Fig. 28. Widmo MALDI/TOF-MS obojętnej mieszaniny oligosacharydów pochodzącej od zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 ze zmienioną glikozylacją C2B8 anty-CD20 („Cm”), wytworzonego w komórkach HEK293-EBNA kotransfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520, wektorem do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) i wektorem do ekspresji polipeptydu mannozydazy II (pCLF9). Przeciwciało oczyszczono z pożywki hodowlanej oligosacharydy otrzymano i analizowano oligosacharydy tak, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 5. (A) Profil oligosacharydowy uwalnianych PNGazą F oligosacharydów, bez dodatkowej obróbki enzymatycznej. (B) Profil oligosacharydowy uwalnianych PNGazą F oligosacharydów, trawionych następnie EndoH.
Fig. 29. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w której pośredniczą przeciwciała chimerowe anty-CD20 o glikozylacji zmienionej przez ekspresję w komórkach HEK293EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie zachodzi ekspresja samego kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt), jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem pETR1520 do ekspresji przeciwciała. Test opisano szczegółowo w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1.
Fig. 30. Wiązanie się z receptorem FcgammaRIIIa przeciwciał chimerowych anty-CD20 o zmienionej glikozylacji przez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji Man II Golgi, gdzie zachodzi ekspresja samego kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgG1 C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520. Test wiązania przeprowadzono, jak opisano w rozdziale „Materiały i Metody” w Przykładzie 1. Ludzkie komórki NK wyrażające na powierzchni receptor FcgammaRIIIa wyizolowano od dawcy o genotypie, o którym wiadomo, że nie warunkuje wytwarzania receptora FcgammaRIIc (tj. homozygotycznym pod względem wariantu genu zawierającego kodon stop w ramce odczytu sekwencji kodującej FcgammaRIIc). Średnia geometryczna intensywności fluorescencji mierzona metodą FACS z wykorzystaniem znakowanego FITC fragmentu przeciwciała anty-ludzkie IgG, wzrasta wraz z ilością zrekombinowanego przeciwciała związanego na komórkach NK. Wiązanie wykryte w tym teście jest specyficzne dla FcgammaRIIIa, co wykazano wykorzystując konkurujący fragment przeciwciała specyficznego dla FcgammaRIIIa (patrz Fig. 13).
Fig. 31. Cytotoksyczność, w której pośredniczy dopełniacz, przeciwciał chimerowych anty-CD20 o glikozylacji poddanej manipulacji przez ekspresję w komórkach HEK293-EBNA kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest zlokalizowana przez domenę lokalizacji Man II w aparacie Golgiego, gdzie zachodzi ekspresja kwasu nukleinowego kodującego Man II-GnT III (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresja razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm) w komórkach wytwarzających przeciwciała. Cwt jest to niezmodyfikowane, zrekombinowane przeciwciało chimerowe IgGl C2B8 anty-CD20 („Cwt”) wytworzone w komórkach HEK293-EBNA transfekowanych wektorem do ekspresji przeciwciał pETR1520.
Fig. 32(A-C). Wektory ekspresyjne pCLF9 (A) pETR1842 (B) i pETR1843 (C).
Fig. 33(A i B). Wektory ekspresyjne dla fuzji białkowej Man II-GalT (A) i GalT (B).
PL 222 220 B1
Fig. 34. Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności α-mannozydazy II względny procent struktur, dla których wykazano, że są związane z fragmentem Fc przeciwciała.
Fig. 35 (A i B). Profil oligosacharydowy monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT i względny procent struktur, dla których stwierdzono, że są związane z fragmentem Fc przeciwciała. Profil oligosacharydowy po trawieniu PNGazą F (A) i po trawieniu EndoH (B).
Fig. 36. Przeciwciało wytworzone w obecności α-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorem FcyRIHA z większym powinowactwem niż przeciwciała typu dzikiego.
Fig. 37. Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał, w której pośredniczy przeciwciało chimerowe anty-CD20 ze zmienioną glikozylacją.
Stosowane tu terminy są takie, jak są powszechnie stosowane w dziedzinie, chyba, że określono je inaczej w następujący sposób.
Stosowany tutaj termin „przeciwciało” ma obejmować cząsteczki całych przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, poliklonalnych i wielowartościowych (np. dwuwartościowych), a także fragmenty przeciwciał mające region Fc i fuzje białkowe zawierające region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny. Termin ten obejmuje także przeciwciała humanizowane i chimerowe.
Stosowany tutaj termin „region Fc” ma odnosić się do C-końcowego regionu łańcucha ciężkiego IgG. Ponieważ granice regionu Fc łańcucha ciężkiego IgG mogą się nieznacznie różnić, zwykle określa się, że region Fc łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG rozciąga się od reszty aminokwasowej w pozycji Cys226 do końca karboksylowego.
Stosowany tutaj termin „region odpowiadający regionowi Fc immunoglobuliny” ma obejmować naturalnie występujące alleliczne warianty regionu Fc immunoglobulin, a także warianty mające zmiany, które wytwarzają podstawienia, wstawienia lub delecje, ale które nie zmniejszają istotnie zdolności immunoglobuliny do pośredniczenia w funkcjach efektorowych (takich jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał). Na przykład, można usunąć jeden lub więcej aminokwasów z N-końca lub C-końca regionu Fc immunoglobuliny bez istotnej utraty funkcji biologicznej. Takie warianty można wybierać według ogólnych zasad znanych w dziedzinie, tak, aby miały minimalny wpływ na aktywność (patrz, np. Bowie, J. U. i wsp., Science 247 : 1306-10 (1990).
Stosowany tutaj termin fuzja polipeptydowa „mająca aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III” odnosi się do fuzji polipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dodawania reszty N-acetyloglukozaminowej (GlcNAc) w wiązaniu β-1-4 do β-związanego mannozydu rdzenia trimannozylowego N-związanych oligosacharydów. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności β (1,4)-Nacetyloglukozaminylotransferazy III, znanej także jako 4-beta-N-acetyloglukozaminylotransferaza ^-1,4-mannozyloglikoproteinowa (EC 2.4.1.144), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („No-menclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), jak zmierzona w konkretnym teście biologicznym, zależną lub niezależną od dawki. W przypadku istnienia zależności od dawki, nie musi ona być identyczna z zależnością dla β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III, ale raczej znacząco podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu z β (1,4)-N-acetyloglukozaminy-lotransferazą III (tj. polipeptyd - kandydat będzie wykazywał większą aktywność lub nie więcej niż około 25-krotnie mniejszą i korzystnie nie więcej niż około około 10-krotnie mniejszą, a najkorzystniej nie więcej niż trzykrotnie mniejsza aktywność w stosunku do β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III).
Stosowany tutaj termin fuzja polipeptydowa „mająca aktywność β (1,4)-galaktozylotransferazy” lub „mająca aktywność GalT” odnosi się do fuzji polipeptydowych, które mają zdolność do katalizowania dodawania reszty galaktozy z UDP galaktozy do nieredukującego końca GlcNAc znajdującego się w N-połączonych oligosacharydach. Termin ten obejmuje fuzje polipeptydowe wykazujące aktywność enzymatyczną podobną, ale nie koniecznie identyczną, do aktywności β (1,4)-galaktozylotransferazy, znanej także jako UDP-Gal; GlcNAc β-1,4-galaktozylotransferaza (EC 2.4.1.38), według nomenklatury Komitetu Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej („Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology”; NC-IUBMB), jak zmierzona w konkretnym teście biologicznym, zależną lub niezależną od dawki. W przypadku istnienia zależności od dawki, nie musi ona być identyczna z zależnością dla β (1,4)-galaktozylotransferazy, ale raczej znacząco podobna do zależności od dawki dla danej aktywności w porównaniu do β (1,4)12
PL 222 220 B1
-galaktozylotransferazy (tj. polipeptyd kandydat będzie wykazywał wyższą aktywność lub nie więcej niż około 25-krotnie mniejszą i korzystnie nie więcej niż około 10-krotnie mniejszą, a najkorzystniej nie więcej niż około trzykrotnie mniejszą aktywność w stosunku do β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotrans-ferazy III).
Przez kwas nukleinowy lub polinukleotyd mający sekwencję nukleotydową co najmniej, na przykład, w 95% „identyczną” z referencyjną sekwencją nukleotydową, rozumie się, że sekwencja nukleotydową polinukleotydu jest identyczna z referencyjną sekwencją z takim wyjątkiem, że sekwencja polinukleotydowa może zawierać do pięciu mutacji punktowych na każde 100 nukleotydów referencyjnej sekwencji nukleotydowej. Innymi słowy, w celu otrzymania polinukleotydu mającego sekwencję nukleotydową identyczną co najmniej w 95% z referencyjną sekwencją nukleotydową, w referencyjnej sekwencji można usunąć lub podstawić innymi nukleotydami do 5% nukleotydów, lub ilość nukleotydów stanowiąca do 5% wszystkich nukleotydów w sekwencji referencyjnej może być wstawiona do sekwencji referencyjnej. Sekwencją zapytania może być cała sekwencja przedstawiona na Fig. 24 lub Fig. 25.
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób, czy konkretna cząsteczka kwasu nukleinowego lub polipeptydu jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją nukleotydową lub sekwencją polipeptydową ujawnioną w niniejszym wynalazku, stosując znane programy komputerowe. Korzystnym sposobem wyznaczania najlepszego, ogólnego dopasowania pomiędzy sekwencją zapytania (sekwencją ujawnioną w niniejszym wynalazku) i sekwencją docelową, także określanego jako globalne przyrównanie sekwencji, może być wyznaczanie za pomocą programu komputerowego FASTDB wykorzystującego algorytm Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6 : 237-245 (1990). W dopasowywaniu sekwencji, obie sekwencje, zapytania i docelowa, są sekwencjami DNA. Sekwencję RNA można porównać zamieniając U na T. Wynik powyższego globalnego dopasowywania sekwencji jest podany w postaci procentu identyczności. Korzystnymi parametrami stosowanymi w budowaniu dopasowania sekwencji DNA w FASTDB w celu wyliczenia procentu podobieństwa są: Macierz= jednostkowa (ang. Matrix=Unitary), k-tuple=4, kara za niedopasowanie (ang. Mismatch Penalty)=1, kara za połączenie (ang. Joining Penalty=30), długość grupy randomizowanej=0, wynik odcięcia=1, kara za przerwę=5, kara za wielkość przerwy 0,05, wielkość okna=500 lub długość nukleotydowej sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja zapytania z uwagi na delecje 5' lub 3', a nie z uwagi na wewnętrzne delecje, należy wprowadzić ręczne korekty do wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych końców 5' i 3' sekwencji docelowej podczas wyliczania procentu identyczności. Dla sekwencji docelowych skróconych na końcach 5' i 3' w stosunku do sekwencji zapytania, procent identyczności jest korygowany przez wyliczenie ilości zasad sekwencji zapytania, które są końcami 5' i 3' sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane, jako procent całkowitej ilości zasad sekwencji zapytania. To czy nukleotyd jest sparowany/dopasowany, określa się w wyniku dopasowywania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tę wartość procentową od procentu identyczności, wyliczonego w powyższym programie FASTDB, wykorzystując ustalone parametry, aby osiągnąć ostateczną wartość procentu identyczności. Ta poprawiona wartość jest wykorzystywana na potrzeby obecnego wynalazku. Jedynie zasady poza zasadami 5' i 3' sekwencji docelowej, jak jest pokazywane w dopasowywaniu FASTDB, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym wyliczaniu wartości procentu identyczności.
Na przykład, aby określić procent identyczności dopasowania, sekwencję docelową złożoną z 90 zasad przyrównano z sekwencją zapytania o 100 zasadach. Delecje znajdują się na końcu 5' sekwencji docelowej i stąd dopasowanie FASTDB nie pokazuje sparowania/dopasowania pierwszych 10 zasad z końca 5'. 10 niesparowanych zasad odpowiada 10% sekwencji (ilość niesparowanych zasad na końcach 5' lub 3'/całkowita ilość zasad w sekwencji zapytania), tak więc 10% odejmuje się od wartości procentu identyczności wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 zasad było doskonale dopasowanych, końcowy procent identyczności wynosiłby 90%. W innym przykładzie porównano sekwencję docelową złożoną z 90 zasad z sekwencją zapytania o 100 zasadach. W tym przypadku delecje znajdują się wewnątrz, tak że nie ma niesparowanych/niedopasowanych zasad na końcach 5' lub 3' sekwencji docelowej w stosunku do sekwencji zapytania. W tym przypadku, procent identyczności wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawieniu. I znów, jedynie zasady z końców 5' i 3' sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są
PL 222 220 B1 korygowane ręcznie. Dla celów niniejszego wynalazku nie ma potrzeby wykonywania żadnych innych ręcznych poprawek.
Przez polipeptyd mający sekwencję aminokwasową co najmniej, na przykład, w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową zapytania, rozumie się, że sekwencja aminokwasowa docelowego polipeptydu jest identyczna z sekwencją zapytania z wyjątkiem takim, że sekwencja polipeptydu docelowego może zawierać do pięciu zmian aminokwasów na każde 100 aminokwasów sekwencji aminokwasowej zapytania. Innymi słowy, aby otrzymać polipeptyd mający sekwencję co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową zapytania, można wstawić, usunąć lub podstawić innymi aminokwasami do 5% reszt aminokwasowych w sekwencji docelowej. Te zmiany w sekwencji referencyjnej mogą wystąpić w pozycjach na końcu karboksylowym lub aminowym referencyjnej sekwencji aminokwasowej lub gdziekolwiek między tymi końcowymi pozycjami, mogą być rozrzucone albo pojedynczo między resztami sekwencji referencyjnej albo w jednej lub więcej sąsiednich grupach w sekwencji referencyjnej.
Z praktycznej strony, można określić w standardowy sposób, czy konkretny polipeptyd jest co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczny z polipeptydem referencyjnym, stosując znane programy komputerowe. Korzystnym sposobem określania najlepszego, ogólnego dopasowania między sekwencją zapytania (sekwencją ujawnioną w niniejszym wynalazku) i sekwencją docelową, określanego również jako globalne dopasowanie sekwencji, można określić za pomocą programu komputerowego FASTDB bazującego na algorytmie Brutlaga i wsp., Comp. App. Biosci. 6 : 237-245 (1990). Przy dopasowaniu obie sekwencje, sekwencja zapytania i sekwencja docelowa, są sekwencjami nukleotydowymi lub obie są sekwencjami aminokwasowymi. Wynik powyższego globalnego dopasowania sekwencji jest podany w postaci procentu identyczności. Korzystnymi parametrami stosowanymi w dopasowywaniu sekwencji aminokwasowych w FASTDB są: Macierz=PAM 0, k-tuple=2, kara za niedopasowanie=1, kara za połączenie=20, długość grupy randomizowanej=0, wynik odcięcia=1, wielkość okna=długość sekwencji, kara za przerwę=5, kara za wielkość przerwy=0.05, wielkość okna=500 lub długość sekwencji docelowej, jeżeli jest krótsza.
Jeżeli sekwencja docelowa jest krótsza niż sekwencja zapytania z powodu delecji na końcu N lub C, a nie z powodu wewnętrznych delecji, należy dokonać ręcznej korekty wyników. Jest to spowodowane tym, że program FASTDB nie liczy skróconych końców N lub C sekwencji docelowej podczas wyliczania globalnego procentu identyczności. Dla sekwencji docelowych skróconych na końcach N lub C w stosunku do sekwencji zapytania, procent identyczności jest poprawiany przez wyliczenie ilości reszt sekwencji zapytania, które są końcem N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do odpowiadającej im reszty docelowej, jako procent całkowitej ilości zasad sekwencji zapytania. To czy reszta jest sparowana/dopasowana, określa się wynikami dopasowania sekwencji w FASTDB. Następnie odejmuje się tę wartość procentową od procentu identyczności wyliczonego w powyższym programie FASTDB, z zastosowaniem ustalonych parametrów, w celu osiągnięcia ostatecznej wartości procentu identyczności. Tę końcową, poprawioną wartość procentu identyczności wykorzystuje się na potrzeby niniejszego wynalazku. Jedynie reszty końców N lub C sekwencji docelowej, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są brane pod uwagę w ręcznym wyliczaniu wartości procentu istotności, to jest, jedynie pozycje reszt zapytania poza najdalszymi resztami końców N lub C sekwencji docelowej.
Na przykład, aby określić procent identyczności przyrównano docelową sekwencję aminokwasową złożoną z 90 reszt z sekwencją zapytania o 100 resztach. Delecje występują na końcu N sekwencji docelowej i dlatego dopasowanie FASTDB nie pokazuje sparowania/dopasowania pierwszych 10 reszt z końca N. 10 niesparowanych reszt reprezentuje 10% sekwencji (ilość niesparowanych reszt na końcach N i C/całkowita ilość reszt w sekwencji zapytania), tak więc 10% odejmuje się od wartości procentu identyczności wyliczonego w programie FASTDB. Jeżeli pozostałe 90 reszt było doskonale dopasowanych, końcowy procent identyczności wynosiłby 90%. W innym przykładzie, porównano sekwencję docelową złożoną z 90 reszt z sekwencją zapytania o 100 resztach. W tym przypadku delecje są delecjami wewnętrznymi tak, że nie ma niesparowanych/niedopasowanych reszt na końcach N lub C sekwencji docelowej w stosunku do sekwencji zapytania. W tym przypadku, procent identyczności wyliczany w FASTDB nie podlega ręcznemu poprawianiu. Ponownie, jedynie pozycje reszt poza końcami N lub C sekwencji docelowej, jak przedstawiono w dopasowaniu FASTDB, które nie są sparowane/dopasowane do sekwencji zapytania, są korygowane ręcznie. Nie ma potrzeby wykonywania żadnych innych ręcznych poprawek dla celów niniejszego wynalazku.
PL 222 220 B1
Jak tu stosowano termin kwas nukleinowy, który „hybrydyzuje w ostrych warunkach” z sekwencją kwasu nukleinowego odnosi się do polinukleotydu, który hybrydyzuje podczas całonocnej inkubacji w 42°C w roztworze obejmującym 50% formamid, 5x SSC (750 m NaCl, 75 mM cytrynian sodu), 50 mM fosforanu sodu (pH 7,6), 5x odczynnik Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 pg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, z późniejszym płukaniem filtrów w 0,1x SSC w około 65°C.
Stosowany tutaj termin „domena lokalizacji w aparacie Golgiego” odnosi się do sekwencji aminokwasowej polipeptydu znajdującego się w aparacie Golgiego, która jest odpowiedzialna za jego zakotwiczenie w miejscu znajdującym się w aparacie Golgiego. Na ogół, domeny lokalizacji obejmują aminokońcowe „ogony” enzymu.
Stosowany tutaj termin „funkcja efektorowa” odnosi się do tych biologicznych aktywności, którymi cechuje się region Fc (natywna sekwencja regionu Fc lub wariant sekwencji aminokwasowej regionu Fc) przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują, ale nie wyłącznie, powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC), fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP), wydzielanie cytokin, pobieranie antygenu zależne od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, negatywną regulację powierzchniowych receptorów komórek, itd.
Stosowany tutaj termin „manipulować, poddane manipulacji, manipulowanie i manipulacja glikozylacją”, ma obejmować dowolną manipulację wzorem glikozylacji naturalnie występującego polipeptydu lub jego fragmentu. Manipulowanie glikozylacją obejmuje manipulowanie metaboliczne systemem glikozylacji komórki, w tym, manipulacje genetyczne szlakami syntezy oligosacharydów, w celu osiągnięcia zmiany glikozylacji glikoprotein wyrażanych w komórkach. Dalej, manipulowanie glikozylacją obejmuje wpływy mutacji i środowiska komórki na glikozylację.
Stosowany tutaj termin „komórka gospodarza” obejmuje dowolny rodzaj układu komórkowego, który można poddać manipulacji w celu wytwarzania postaci o zmodyfikowanej glikozylacji białek, fragmentów białek lub peptydów będących przedmiotem zainteresowania, w tym, przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji białkowych. Zwykle, komórki gospodarza zmieniono tak, aby wyrażały GnT III na optymalnym poziomie. Komórki gospodarza obejmują komórki z hodowli, np. ssacze komórki z hodowli, takie jak komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, komórki drożdży, komórki owadzie i komórki roślinne, aby wymienić tylko kilka, ale także komórki ze zwierząt transgenicznych, roślin transgenicznych lub roślin hodowlanych lub z tkanek zwierzęcych.
Stosowany tutaj termin „cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc” obejmuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy rozpuszczalna fuzja białkowa Fc zawierająca ludzki region Fc. Jest to mechanizm odporn ościowy prowadzący do lizy „komórek docelowych opłaszczonych przez przeciwciała”, powodowanej przez ludzkie, efektorowe komórki układu odpornościowego, w którym:
„Ludzkimi”, efektorowymi komórkami układu odpornościowego” są populacje leukocytów, które eksponują na swojej powierzchni receptory Fc, przez które wiążą się z regionem Fc przeciwciał lub fuzji białkowych Fc i wykazują funkcje efektorowe. Taka populacja może obejmować, ale nie wyłącznie, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i/lub komórki NK (NK).
„Komórki docelowe opłaszczone przez przeciwciała” są to komórki związane przez przeciwciała lub fuzje białkowe Fc. Przeciwciała lub fuzje białkowe Fc wiążą się do docelowych komórek przez część białkową N-końcową w stosunku do regionu Fc.
Stosowany tutaj termin „zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc” określa wzrost ilości „opłaszczonych przez przeciwciała komórek” poddanych lizie w danym czasie, przy danym stężeniu przeciwciał lub fuzji białkowej Fc, w pożywce otaczającej komórki docelowe, przez zdefiniowany powyżej mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc, i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciał lub fuzji białkowej Fc w pożywce otaczającej komórki docelowe, wymaganego do osiągnięcia lizy danej liczby „opłaszczonych przeciwciałami komórek” w danym czasie, przez mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Wzrost cytotoksyczn ości komórkowej, w której pośredniczy Fc jest zależny od cytotoksyczności komórkowej , w której pośredniczy to samo przeciwciało lub fuzji białkowej Fc, wytworzonej w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów wytwarzania, oczyszczania, formułowania i metod przechowywania, znanych specjalistom w dziedzinie, ale takich, które nie zostały wytworzone w komórkach gospodarza zmanipulowanych sposobami tutaj opisanymi tak, aby wyrażały glulozylotransferazę GnT III.
PL 222 220 B1
Przez przeciwciało mające zwiększoną cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) rozumie się przeciwciało mające zwiększoną ADCC, określoną dowolnym, odpowiednim sposobem znanym specjalistom w dziedzinie. Jeden z przyjętych in vitro testów ADCC jest opisany poniżej:
1) w teście stosuje się komórki docelowe, o których wiadomo, że wyrażają antygen docelowy, rozpoznawany przez wiążący antygen region przeciwciała;
2) w teście, jako komórki efektorowe stosuje się ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), wyizolowane z krwi od losowo wybranych, zdrowych dawców;
3) test przeprowadza się zgodnie z poniższym protokołem:
i) PBMC izoluje się stosując standardowe procedury wirowania w gradiencie gęstości i zawiesza się w pożywce RPMI do hodowli komórek w ilości 5 x 106 komórek/ml;
ii) komórki docelowe hoduje się standardowymi metodami hodowli tkankowych, zbiera się w fazie wzrostu wykładniczego przy żywotności wyższej niż 90%, przemywa się hodowlaną pożywką
RPMI, znakuje się dodając 100 MiKcurie 51Cr, przemywa dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowej 5 i zawiesza w pożywce do hodowli komórkowej przy gęstości 105 komórek/ml;
iii) 100 mikrolitrów powyższej, końcowej zawiesiny komórek docelowych przenosi się do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania;
iv) przeciwciało rozcieńcza się seryjnie od 4000 ng/ml do 0,04 ng/ml w pożywce do hodowli komórkowej i dodaje się po 50 mikrolitrów otrzymanych roztworów przeciwciała do komórek docelowych na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania, testując w trzech powtórzeniach różne stężenia przeciwciała pokrywające cały, powyższy zakres stężeń;
v) dla kontroli maksymalnego uwalniania (MR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierającej wyznakowane komórki docelowe dodaje się 50 mikrolitrów 2% (obj./obj.) wodnego roztworu niejonowego detergentu (Nonidet, Sigma, St. Louis) zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vi) dla kontroli spontanicznego uwalniania (SR), do 3 dodatkowych studzienek na płytce zawierającej wyznakowane komórki docelowe dodaje się 50 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowej RPMI zamiast roztworu przeciwciała (punkt iv powyżej);
vii) następnie 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania wiruje się przy 50 x g przez 1 minutę i inkubuje się przez 1 godzinę w 4°C;
viii) do każdej ze studzienek dodaje się po 50 mikrolitrów zawiesiny PBMC (punkt i powyżej), aby osiągnąć stosunek komórek efektorowych; docelowych 25 : 1 i płytki umieszcza się w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 w 37°C na 4 godziny;
ix) z każdej ze studzienek zbiera się nadsącz wolny od komórek, a uwolnioną eksperymentalnie radioaktywność (ER) mierzy się stosując licznik gammma;
x) procent specyficznej lizy wylicza się dla każdego stężenia przeciwciała na podstawie wzoru (ER-MR)/(MR-SR) x 100, w którym ER jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla tego stężenia przeciwciała, MR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli MR (patrz punkt v powyżej) i SR jest średnią radioaktywnością zliczoną (patrz punkt ix powyżej) dla kontroli SR (patrz punkt vi powyżej);
4) „zwiększona ADCC” jest określona jako wzrost maksymalnego procentu specyficznej lizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała i/lub zmniejszenie stężenia przeciwciała wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnego procentu specyficznej lizy obserwowanej dla danego, testowanego powyżej przedziału stężeń przeciwciała. Wzrost ADCC jest względny w stosunku do ADCC mierzonej w powyższym teście, zależnej od tego samego przeciwciała wytworzonego w tym samym rodzaju komórek gospodarza, z zastosowaniem tych samych standardów wytwarzania, oczyszczania, formułowania i metod przechowywania, znanych specjalistom w tej dziedzinie, ale takiego, które nie zostało wytworzone w komórkach gospodarza poddanych manipulacji sposobami tutaj opisanymi tak, aby uzyskać nadekspresję glukozylotransferazy GnT III.
Stosowany tutaj termin „przeciwciało anty-CD20”, oznacza przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje na powierzchni komórki nieglikozylowaną fosfoproteinę o masie 35000 Daltonów, zwykle określaną jako antygen różnicowania Bp35 specyficzny dla ludzkich limfocytów B, potocznie określaną jako CD20.
Podstawą niniejszego wynalazku jest stwierdzenie, że manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby wyrażały nową fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) lub alternatywnie mającą aktywność β (1,4)-galaktozylotransferazy („GalT”), i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, pozwala na otrzymanie przeciwciał o zwiększonym powinowac16
PL 222 220 B1 twie wiązania się z receptorem Fc i ze zwiększonymi funkcjami efektorowymi. Alternatywnie, przeciwciała ze zwiększonymi funkcjami efektorowymi i/lub zwiększonym wiązaniem się z receptorem Fc można otrzymać manipulując komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby miały zwiększoną ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający katalityczną aktywność α-mannozydazy II.
W korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β (1,4)-Nacetyloglukozaminylotransferazy III, a domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji mannozydazy II. Kwas nukleinowy kodujący taką fuzję polipeptydową ma sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 12. Polipeptyd kodowany przez taką sekwencję ma sekwencję aminokwasową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 13.
W innym, korzystnym wykonaniu, fuzja polipeptydowa zawiera domenę katalityczną β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III, a domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji β (1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnT I). Kwas nukleinowy kodujący taką fuzję ma sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 25 i SEK. NR ID: 14, a polipeptyd kodowany przez taką sekwencję ma sekwencję aminokwasową pokazaną na Fig. 25 i SEK. NR ID: 15. Kwas nukleinowy może obejmować sekwencję, która hybrydyzuje w ostrych warunkach do sondy hybrydyzacyjnej o sekwencji nukleotydowej, która składa się z sekwencji nukleotydowej pokazanej na Fig. 24 i SEK. NR ID 12 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 14. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje sekwencję identyczną co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% z sekwencją nukleotydową pokazaną na Fig. 24 i SEK. NR ID: 12 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 14. W innym wykonaniu, wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować sekwencję kodującą polipeptyd mający sekwencję aminokwasową co najmniej w 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczną z sekwencją aminokwasową z Fig. 24 i SEK. NR ID: 13 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 15. Wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować sekwencję kodującą polipeptyd mający sekwencję aminokwasową z Fig. 24 i SEK. NR ID: 13 lub Fig. 25 i SEK. NR ID: 15, z substytucjami konserwowanych aminokwasów.
Sposoby modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego w komórce gospodarza obejmują wprowadzanie do takiej komórki gospodarza kwasu nukleinowego lub wektora. Korzystnie, modyfikowanym polipeptydem jest IgG lub jej fragment zawierający region Fc. Najbardziej korzystnie, polipeptydem jest IgGl lub jej fragment zawierający region Fc. W innym, korzystnym wykonaniu, modyfikowanym polipeptydem jest fuzja białkowa zawierająca region odpowiadający regionowi Fc ludzkiej IgG.
Zwiększoną funkcją efektorową jest korzystnie zwiększenie jednego z następujących: zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, zwiększenie fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP), zwiększenie wydzielania cytokin, zwiększenie pobierania antygenu zależnego od kompleksów immunologicznych przez komórki prezentujące antygen, zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc, zwiększone wiązanie się z komórkami NK, zwiększone wiązanie się z makrofagami, zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi (PMN), zwiększone wiązanie się z monocytami, zwiększone krzyżowe sieciowanie związanych docelowo przeciwciał, zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę, zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych i zwiększone piętnowanie komórek T.
W innym korzystnym wykonaniu, polipeptydem wytwarzanym przez taką komórkę gospodarza jest chimerowe monoklonalne przeciwciało C225 anty-ludzki EGFR.
W szczególności, sposób według niniejszego wynalazku może być stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest niefukozylowanych.
Sposób według niniejszego wynalazku może być także stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co
PL 222 220 B1 najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych. Ponadto, sposób według niniejszego wynalazku może być stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35%, korzystniej co najmniej 40%, korzystniej co najmniej 45%, korzystniej co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 55%, korzystniej co najmniej 60%, korzystniej co najmniej 65%, korzystniej co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 75%, korzystniej co najmniej 80%, korzystniej co najmniej 85%, korzystniej co najmniej 90%, korzystniej co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 96%, korzystniej co najmniej 97%, korzystniej co najmniej 98%, korzystniej co najmniej 99% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych, niefukozylowanych.
Sposób według niniejszego wynalazku może być także stosowany do wytwarzania polipeptydów, w których co najmniej 15%, korzystniej co najmniej 20%, korzystniej co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, korzystniej co najmniej 35% oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu jest przeciętych, hybrydowych, niefukozylowanych.
Przeciwciała, fragmenty przeciwciał zachowujących region Fc i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny wytworzone sposobem według wynalazku mogą być stosowane jako substancje czynne w kompozycjach farmaceutycznych do stosowania w sposobach leczenia nowotworów.
Korzystnie, każda cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w komórce gospodarza według niniejszego wynalazku jest na tym samym wektorze ekspresyjnym. W innym wykonaniu, każda cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje się na innym wektorze ekspresyjnym.
Identyfikacja i wytwarzanie kwasów nukleinowych kodujących białko, którego wzór glikozylacji ma być poddany modyfikacji.
Niniejszy wynalazek dotyczy komórek gospodarza do wytwarzania glikoform przeciwciał, fragmentów przeciwciał zawierających region Fc, fuzji białkowych z regionem równoważnym regionowi Fc, mających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, korzystnie aktywującymi receptorami Fc, i/lub wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała. Ujawniono identyfikację docelowych epitopów i wytwarzanie przeciwciał mających potencjalną wartość leczniczą, dla których pożądana jest modyfikacja wzoru glikozylacji i izolacja odpowiednich kodujących je sekwencji kwasów nukleinowych.
Do wytwarzania przeciwciał wobec docelowych epitopów będących przedmiotem zainteresowania można zastosować różne procedury znane w tej dziedzinie. Takie przeciwciała obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimerowe, humanizowane, w pełni ludzkie, jednołańcuchowe, fragmenty Fab i fragmenty wytworzone dzięki bibliotece ekspresyjnej ScFv, Fab, VH, IgG. Takie przeciwciała mogą być przydatne np. jako czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Jako czynniki lecznicze, szczególnym przedmiotem zainteresowania cieszą się przeciwciała neutralizujące, tj. te, które konkurują o wiązanie z ligandem, substratem lub cząsteczką adaptorową.
W celu wytworzenia przeciwciał immunizuje się różne zwierzęta - gospodarzy przez wstrzyknięcie docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w tym, ale nie wyłącznie, króliki, myszy, szczury itd. Przeciwciała poliklonalne można wzbudzić w zwierzętach przez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie odpowiedniego antygenu i adiuwanta. Aby wzmocnić odpowiedź odpornościową można zastosować różne adiuwanty w zależności od gatunków gospodarza w tym, ale nie wyłącznie, adiuwant Freunda (pełny lub niepełny), żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole Pluronic, polianiony, peptydy, saponina, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (Bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Zwierzęta immunizuje się przeciw antygenowi, immunogennym koniugatom lub pochodnym przez kombinację np. 100 g lub 5 g białka lub koniugatu (odpowiednio dla królików lub myszy) z 3 objętościami pełnego adiuwanta Freunda i wstrzyknięcie roztworu śródskórnie w wielu miejscach. Miesiąc później, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą w ilości 1/5 do 1/10 wyjściowej ilości peptydu lub koniugatu w pełnym adiuwancie Freunda przez iniekcję śródskórną w wielu miejscach. Siedem do 14 dni później skrwawia się zwierzęta i oznacza się w surowicy miano przeciwciała. Zwierzętom podaje się dawkę przypominającą aż do osiągnięcia plateau miana. Korzystnie, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą koniugatu tego samego antygenu, ale skoniugowanego z innym białkiem i/lub przez inny reagent sieciujący. Koniugaty można wytworzyć także w hodowlach zrekombinowanych komórek jako fuzje białkowe.
PL 222 220 B1
Przeciwciała monoklonalne dla celu będącego przedmiotem zainteresowania można otrzymać z wykorzystaniem dowolnej techniki, która zapewnia wytwarzanie cząsteczek przeciwciała przez ciągłe linie komórkowe w hodowli. Obejmuje to, ale nie wyłącznie, techniki hybrydoma najpierw opisane przez Kohlera i Milsteina, Nature 256 : 495-97 (1975), techniki hybrydoma ludzkich limfocytów B (Kosbor i wsp., Immunology Today 4 : 72 (1983); Cote i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 : 2026-30 (1983) i techniki hybrydoma EBV (Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77-96 (Alan R. Liss, Inc., 1985)). Ponadto, można zastosować techniki opracowane do wytwarzania „przeciwciał chimerowych” (Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 : 6851-55 (1984); Neuberger i wsp., Nature 312 : 604-08 (1984); Takeda i wsp., Nature 314 : 452-54 (1985)) przez składanie genów z cząsteczki mysiego przeciwciała o specyficzności wobec odpowiedniego antygenu z genami z cząsteczki ludzkiego przeciwciała o odpowiedniej aktywności biologicznej. Techniki te również mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał chimerowych obejmujących cząsteczkę przeciwciała pochodzącą od innych ssaków. Alternatywnie, można zaadaptować techniki opisane dla wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (zgłoszenie patentowe USA nr 4,946,778) do otrzymywania przeciwciał jednołańcuchowych mających żądaną specyficzność. Ujawniono ponadto humanizowane przeciwciała, które poddano zmianom glikozylacji zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku. Techniki otrzymywania humanizowanych przeciwciał ujawniono, np. w zgłoszeniu patentowym USA nr 6,180,320 Queen i wsp.
Stosując znane techniki można wytworzyć fragmenty przeciwciał zawierające miejsca specyficznego wiązania się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Na przykład, takie fragmenty obejmują, ale nie wyłącznie, fragmenty F(ab')2, które można wytworzyć przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała i fragmenty Fab, które można wytworzyć przez redukcję mostków disulfidowych fragmentów F(ab')2. Alternatywnie, można skonstruować biblioteki ekspresyjne Fab (Huse i wsp., Science 246 : 1275-81 (1989)), aby umożliwić szybką i łatwą identyfikację monoklonalnych fragmentów Fab o żądanej specyficzności wobec białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Po zidentyfikowaniu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, których wzór glikozylacji ma być poddany modyfikacji, izoluje się kodującą je sekwencje kwasu nukleinowego za pomocą znanych technik.
a. Generowanie linii komórkowych do wytwarzania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji
Niniejszy wynalazek dostarcza komórek gospodarza do generowania białek ze zmienionym wzorem glikozylacji. W szczególności, niniejszy wynalazek dostarcza komórek gospodarza do generowania glikoform białek, mających poprawioną wartość terapeutyczną. Zatem, w jednym aspekcie, wynalazek dostarcza komórek gospodarza poddanych manipulacjom tak, aby wyrażały np. fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego. Szczególnie, takie komórki można poddać manipulacjom, aby zawierały rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą taką fuzję polipeptydową, połączoną funkcjonalnie z konstytutywnym lub regulowanym systemem promotorowym.
W jednym konkretnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza poddanej manipulacjom, tak, aby uzyskać ekspresję, co najmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym aspekcie, komórka gospodarza jest poddana manipulacji j cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą co najmniej jeden gen kodujący fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego.
Na ogół może być zastosowany dowolny rodzaj, hodowlanej linii komórkowej jako podstawa do skonstruowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu, w celu skonstruowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku jako wyjściową linię komórkową stosuje się komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma lub inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. (Patrz Ma, J.K.C. i wsp., Nature Genetics 4 : 794-805 (October 2003).
Wynalazek obejmuje dowolną skonstruowaną linię komórek gospodarza wyrażającą fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą
PL 222 220 B1 domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, tak jak tutaj zdefiniowano.
Jeden lub kilka kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową może być poddawanych ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora lub alternatywnie, regulowanego systemu ekspresji. Odpowiednie regulowane systemy ekspresji obejmują, ale nie wyłącznie, system ekspresji regulowany tetracykliną, system ekspresji indukowany ekdyzonem, system ekspresji uruchamiany lac, system ekspresji indukowany glukokortykoidem, system promotorowy indukowany temperaturą lub system ekspresji metalotioneiny indukowany metalem. Jeżeli układ komórek gospodarza zawiera szereg różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową część z nich można poddać ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora, podczas gdy inne są poddawane ekspresji pod kontrolą regulowanego promotora. Maksymalny poziom ekspresji jest to najwyższy, możliwy poziom stabilnej ekspresji fuzji polipeptydowej, który nie wywiera znaczącego, negatywnego wpływu na tempo wzrostu komórki, i możliwy jest do określenia standardowymi metodami eksperymentalnymi. Poziomy ekspresji określa się metodami ogólnie znanymi w tej dziedzinie, w tym analizą Western blot z zastosowaniem przeciwciał specyficznych wobec polipeptydu mającego aktywność GnT III lub przeciwciała specyficznego wobec znacznika peptydowego połączonego z polipeptydem mającym aktywność GnT III, hybrydyzacją Northern z zastosowaniem sondy w postaci kwasu nukleinowego specyficznego dla genu kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III lub sondy w postaci kwasu nukleinowego swoistej wobec kwasu nukleinowego kodującego znacznik peptydowy sfuzowany z polipeptydem mającym aktywność GnT III, lub mierząc aktywność GnT III. Alternatywnie, można zastosować lektynę, która wiąże się z produktami biosyntetycznymi GnT III, na przykład, lektynę E4-PHA. Alternatywnie, można zastosować test funkcjonalny, w którym mierzy się zwiększone wiązanie do receptora Fc lub zwiększoną funkcję efektorową przeciwciał, otrzymanych w komórkach poddanych manipulacji przy użyciu kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III. W innym alternatywnym wykonaniu, kwas nukleinowy może być połączony funkcjonalnie z genem reporterowym; poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej mającej aktywność (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającej domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego określa się mierząc sygnał związany z poziomem ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może ulegać transkrypcji razem z kwasem(ami) nukleinowym(ymi) kodującym fuzję polipeptydową jako pojedyncza cząsteczka RNA; ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Gen reporterowy może ulegać translacji razem z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, tak, że tworzy się pojedynczy łańcuch polipeptydowy. Kwasy nukleinowe kodujące fuzje polipeptydowe mogą być połączone funkcjonalnie z genem reporterowym pod kontrolą pojedynczego promotora, tak, że kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową i gen reporterowy są transkrybowane do jednej cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana na dwie oddzielne cząsteczki RNA informacyjnego (mRNA); jeden z otrzymanych mRNA podlega translacji do białka reporterowego, a inny podlega translacji do fuzji polipeptydowej.
Jeżeli ekspresji podlega kilka różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, mogą być one ułożone w taki sposób, że są transkrybowane jako jedna lub szereg cząsteczek mRNA. Jeżeli są transkrybowane jako jedna cząsteczka mRNA, ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (IRES) lub przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Mogą być transkrybowane z jednego promotora do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do szeregu oddzielnych cząsteczek RNA informacyjnego (mRNA), które, następnie są poddawane translacji do odpowiednich, kodowanych przez nie fuzji polipeptydowych.
W innych wykonaniach dostarczane są systemy ekspresji w komórkach gospodarza do wytwarzania przeciwciał terapeutycznych, mających zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc, w szczególności wiązanie z aktywacyjnymi receptorami Fc i wzmocnione funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. Ogólnie, ekspresyjne systemy komórek gospodarza poddano manipulacji tak, aby uzyskać ekspresję kwasu nukleinowego kodującego prze20
PL 222 220 B1 ciwciało, dla którego pożądane jest wytwarzanie zmienionych glikoform, razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego. W jednym wykonaniu, system komórek gospodarza transfekowano co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym taką fuzję polipeptydową. Zwykle, stransfekowane komórki są selekcjonowane w celu identyfikacji i izolacji klonów, które stabilnie wyrażają fuzję polipeptydową.
Wyjściowo może być zastosowana dowolna, hodowlana linia komórkowa do skonstruowania linii komórkowej gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu, można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Zwykle, konstruuje się takie linie komórkowe, aby zawierały ponadto, co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę całego przeciwciała, fragment przeciwciała zawierający region Fc immunoglobuliny lub fuzję białkową, która zawiera region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny. Zwykle, takie linie komórkowe wytwarzające przeciwciała pochodzą od klonów wytwarzających i wydzielających przeciwciało z wysoką specyficznością wytwarzania w zakresie od 20 do 120 pg/(komórkę dziennie). W alternatywnym wykonaniu, w celu wytworzenia skonstruowanych komórek gospodarza według wynalazku jako wyjściową linię komórkową, można zastosować linię komórek hybrydoma wyrażającą konkretne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania.
W jednym wykonaniu, kwasy nukleinowe kodujące przeciwciało, fragment przeciwciała lub fuzję polipeptydową Fc, klonuje się w wektorach do ekspresji przeciwciał, a następnie transfekuje do komórek gospodarza a klony komórek selekcjonuje się i przeszukuje pod kątem wysokiej i stabilnej produkcji specyficznych przeciwciał. Takie wyselekcjonowane klony są następnie transfekowane wektorami ekspresyjnymi dla glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny zawierającymi kwasy nukleinowe kodujące, na przykład, (a) fuzję polipeptydową o aktywności beta (1,4)-N-acetyloglukozaminylo-transferazy III (GnT III) lub (b) fuzję polipeptydową o aktywności beta 1,4-galaktozylotransferazy (GalT) lub (c) polipeptyd o aktywności alfa-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego (d) fuzję polipeptydową o aktywności GnT III lub (e) fuzję polipeptydową o aktywności GalT i kolejny polipeptyd o aktywności Man II.
Klony są następnie selekcjonowane i przeszukiwane pod kątem stabilnej ekspresji genów kodujących przeciwciała na poziomach prowadzących do wysokiej specyficzności wytwarzania przeciwciał przy stabilnej ekspresji genów glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny na poziomach ekspresji prowadzących do modyfikacji wzoru glikozylacji regionu Fc, w tym zwiększenia udziału frakcji niefukozylowanych oligosacharydów, które mogą być zarówno przecięte lub nieprzecięte, i które ponadto mogą być typu złożonego lub hybrydowego, który jest związany ze zwiększeniem wiązania z receptorem Fc, szczególnie ze zwiększeniem powinowactwa wiązania Fc-Fcy RIII i ze zwiększeniem funkcji efektorowych, w których pośredniczy Fc, w tym, ale nie wyłącznie, cytotoksyczności komórkowej zależnej od Fc. Metody selekcji i przeszukiwania opisano poniżej.
W innym wykonaniu, odwrócona jest kolejność dwóch transfekcji opisanych powyżej, a mianowicie transfekcji wektorami do ekspresji przeciwciał i transfekcji wektorami do ekspresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny, tj. komórki gospodarza są najpierw transfekowane wektorami do ekspresji glikotransferaz modyfikujących glikoproteiny a następnie wektorami do ekspresji przeciwciał. W takim podejściu, klony z pierwszej transfekcji mogą być przeszukane pod kątem odpowiednich poziomów stabilnej ekspresji genów glikotransferaz dowolną z metod opisanych dalej poniżej lub alternatywnie można poddać przejściowej transfekcji repliki takich klonów z wektorami do ekspresji przeciwciał i wtedy można zastosować metody przeszukiwania opisane dalej poniżej, w celu identyfikacji klonów o stabilnej ekspresji genów glikotransferaz na poziomach prowadzących do modyfikacji wzoru glikozylacji regionu Fc i do zwiększenia powinowactwa wiązania się z receptorami Fc, w tym receptorami Fc-FcyRIII i do zwiększenia funkcji efektorowych, w których pośredniczy Fc, w tym cytotoksyczności komórkowej zależnej od Fc.
W dalszym wykonaniu, transfekuje się jednocześnie genami kodującymi przeciwciała i genami glikotransferaz w pojedynczym etapie transfekcji albo jednym wektorem ekspresyjnym albo oddzielnymi wektorami.
Zwykle, co najmniej jeden kwas nukleinowy w systemie komórki gospodarza koduje fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) lub alternatywnie
PL 222 220 B1 β (1,4)-galaktozylotransferazy i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego lub alternatywnie koduje polipeptyd o aktywności α-mannozydazy II (Man II) z aparatu Golgiego.
Jeden lub kilka kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową może być poddawanych ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora lub alternatywnie, regulowanego sytemu ekspresji. Odpowiednie regulowane systemy ekspresji obejmują, ale nie wyłącznie, system ekspresji regulowany tetracykliną, system ekspresji indukowany ekdyzonem, system ekspresji uruchamiany lac, system ekspresji indukowany glukokortykoidem, system promotorowy indukowany temperaturą lub system ekspresji metalotioneiny indukowany metalem. Jeżeli układ komórek gospodarza zawiera szereg różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, część z nich może podlegać ekspresji pod kontrolą konstytutywnego promotora, podczas gdy inne są wyrażane pod kontrolą regulowanego promotora. Maksymalny poziom ekspresji to najwyższy, możliwy poziom stabilnej ekspresji fuzji polipeptydowej, który nie wywiera znaczącego, negatywnego wpływu na tempo wzrostu komórki i możliwy jest do określenia standardowymi metodami eksperymentalnymi. Poziomy ekspresji wyznacza się metodami ogólnie znanymi w tej dziedzinie, w tym analizą Western blot z zastosowaniem np. przeciwciała specyficznego wobec polipeptydu mającego aktywność GnT III lub przeciwciała specyficznego wobec znacznika peptydowego połączonego z polipeptydem mającym aktywność GnT III, hybrydyzacją Northern z zastosowaniem sondy kwasu nukleinowego specyficznej np. dla genu kodującego polipeptyd mający aktywność GnT III lub sondy kwasu nukleinowego specyficznej dla kwasu nukleinowego kodującego znacznik peptydowy połączony z polipeptydem mającym aktywność GnTIII, lub mierząc aktywność enzymatyczną GnT III. Alternatywnie, można zastosować lektynę, która wiąże się z produktami biosyntetycznymi GnT III, na przykład, lektynę E4-PHA. Alternatywnie, można zastosować test funkcjonalny, w którym mierzy się zwiększone wiązanie do receptora Fc lub zwiększone funkcje efektorowe, w których pośredniczą przeciwciała wytworzone w komórkach zmanipulowanych kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd o aktywności GnT III. W innym alternatywnym wykonaniu, kwas nukleinowy może być funkcjonalnie połączony z genem reporterowym; poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej określa się mierząc sygnał skorelowany z poziomem ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może ulegać transkrypcji razem z kwasem(ami) nukleinowym(ymi) kodującymi glikotransferazy modyfikujące glikoproteiny jako pojedyncza cząsteczka RNA; ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone albo przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (IRES) albo przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Gen reporterowy może ulegać translacji razem, z co najmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, tak, że powstaje pojedynczy łańcuch polipeptydowy.
Kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową może być połączony funkcjonalnie z genem reporterowym pod kontrolą pojedynczego promotora, tak, że kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową i gen reporterowy są transkrybowane do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do dwóch oddzielnych cząsteczek informacyjnego RNA (mRNA); jeden z otrzymanych mRNA ulega translacji do białka reporterowego, a inny ulega translacji do fuzji polipeptydowej.
Jeżeli ekspresji podlega kilka różnych kwasów nukleinowych kodujących fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu zlokalizowanego w aparacie Golgiego, mogą być one ułożone w taki sposób, że są transkrybowane jako jedna lub szereg cząsteczek mRNA. Jeżeli są transkrybowane jako jedna cząsteczka mRNA, ich odpowiednie sekwencje kodujące mogą być połączone zarówno przez wewnętrzne miejsce wiązania rybosomów (IRES) jak i przez wzmacniacz translacji niezależny od czapeczki (CITE). Mogą być transkrybowane z pojedynczego promotora do cząsteczki RNA, która jest alternatywnie składana do szeregu oddzielnych cząsteczek informacyjnego RNA (mRNA); które ulegają wtedy translacji do odpowiednich, kodowanych przez nie fuzji polipeptydowych.
i. Systemy ekspresji
Można zastosować metody dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie, aby skonstruować wektory ekspresyjne zawierające sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu
PL 222 220 B1 zlokalizowanego w aparacie Golgiego, razem z odpowiednimi sygnałami kontroli transkrypcji/translacji. Metody te obejmują techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i in vivo rekombinacji /rekombinacji genetycznej. Dla przykładu patrz na techniki opisane przez Maniatis i wsp., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) i przez Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Do ekspresji sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową można zastosować szereg systemów gospodarz-wektor ekspresyjny. Korzystnie, stosowane są komórki ssacze jako system komórek gospodarza transfekowany wektorami ekspresyjnymi będącymi DNA rekombinowanego plazmidu lub DNA kosmidu, zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową. Najkorzystniej, jako system komórek gospodarza można zastosować komórki CHO, komórki BHK, komórki NSO, komórki SP2/0, komórki szpiczaka YO, mysie komórki szpiczaka P3X63, komórki PER, komórki PER.C6 lub komórki hybrydoma, inne komórki ssacze, komórki drożdży, komórki owadów lub komórki roślinne. Pewne przykłady systemów ekspresji i metod selekcji są opisane w następujących odnośnikach i w odnośnikach w nich zawartych: Borth i wsp., Biotechnol. Bioen. 71(4) : 266-73 (2000-2001), w Werner i wsp., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8) : 870-80 (1998), w Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13 : 117-123 (2002), w Chadd and Chamów, Curr. Op. Biotechnol. 12 : 188-194 (2001) i w Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12 : 450-454 (2001). W alternatywnych wykonaniach można rozważać zastosowanie innych systemów eukariotycznych komórek gospodarza, w tym, komórek drożdży transformowanych zrekombinowanymi drożdżowymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową; systemów komórek owadzich infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirus) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową; systemów komórek roślinnych infekowanych zrekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirus mozaiki kalafiora, CaMV; wirus mozaiki tytoniu, TMV) lub transformowanych rekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. plazmid Ti) zawierającymi sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową lub systemy komórek zwierzęcych infekowanych rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. adenowirus, wirus ospy krowiej), w tym linie komórkowe poddane manipulacjom, aby zawierały wiele kopii DNA kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencję kodującą fuzję polipeptydową, zarówno amplifikowane stabilnie (CHO/dhfr) lub amplifikowane niestabilnie w chromosomach typu „dubleminute” (np. mysie linie komórkowe).
W sposobie według wynalazku, ogólnie, stabilna ekspresja jest korzystniejsza od przejściowej, ponieważ zwykle osiąga się bardziej powtarzalne wyniki i jest także bardziej odpowiednia dla wytwarzania na dużą skalę, tj. wytwarzania przeciwciał o zmienionej glikozylacji w liniach komórkowych w skali produkcyjnej. Zamiast wykorzystywać wektory ekspresyjne zawierające wirusowe miejsce początku, komórki gospodarza można transformować odpowiednimi, kodującymi kwasami nukleinowymi, kontrolowanymi przez odpowiednie elementy kontrolujące ekspresję (np. promotor, wzmacniacz, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itp.) i marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, umożliwia się skonstruowanym komórkom wzrost przez 1-2 dni we wzbogaconych pożywkach, a następnie przenosi się je do pożywek selekcyjnych. Marker selekcyjny na zrekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i umożliwia selekcję komórek, w których plazmidy są włączone stabilnie do ich chromosomów i na wzrost powodujący powstawanie ognisk (foci), które dzięki temu można klonować i namnażać otrzymując linie komórkowe.
Można zastosować szereg systemów selekcji, w tym, ale nie wyłącznie, geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (Wigler i wsp., Cell 11 : 223 (1977)), fosforybozylotransferazy hypoksantynagunina (Szybalska i Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 : 2026 (1962)), fosforybozylotransferazy adeninowej (Łowy i wsp., Cell 22 : 817 (1980)), które można zastosować odpowiednio w komórkach tk-, hgprf lub aprt-. Można wykorzystać również oporność na antymetabolity jako podstawę do selekcji na dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigler i wsp., Natl. Acad. Sci. USA 77 : 3567 (1989); O'Hare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 1527 (1981)); gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2072 (1981)); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Garapin i wsp., J. Mol. Biol. 150 : 1(1981)); i hygro, który nadaje oporność na hygromycynę (Santerre i wsp., Gene 30 : 147 (1984). Ostatnio opisano dodatkowe geny selekcyjne, mianowicie trpB, który umożliwia komórkom wykorzystanie indolu zamiast tryptofanu;
PL 222 220 B1 hisD, który umożliwia komórkom wykorzystanie histynolu zamiast histydyny (Hartman i Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8047 (1988)); system syntazy glutaminy i ODC (dekarboksylazy ornitynowej), który nadaje oporność na inhibitor dekarboksylazy ornitynowej, 2-(difluorometylo)-DL-ornitynę, DFMO (McConlogue, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).
ii. Identyfikacja transfektantów lub transformantów, które wyrażają białko o zmodyfikowanym wzorze glikozylacji
Komórki gospodarza, które zawierają sekwencję kodującą i które wyrażają biologicznie aktywne produkty genów, można identyfikować co najmniej czterema ogólnymi podejściami: (a) hybrydyzacją DNA-DNA lub DNA-RNA; (b) obecnością lub brakiem funkcji genu „markerowego”; (c) oceną poziomu transkrypcji jak zmierzona ekspresją odpowiednich transkryptów mRNA w komórce gospodarza; (d) wykrywania produktu genu przez pomiar testem immunologicznym lub jego aktywnością biologiczną.
W pierwszym podejściu, obecność sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową, wstawionych do wektora ekspresyjnego, można wykrywać przez hybrydyzację DNA-DNA lub DNA-RNA z zastosowaniem sond obejmujących sekwencje nukleotydowe, które są homologiczne odpowiednio do odpowiednich sekwencji kodujących, ich części lub pochodnych.
W drugim podejściu, system zrekombinowany wektor ekspresyjny/gospodarz może być zidentyfikowany i selekcjonowany na podstawie obecności lub braku funkcji konkretnego genu „markerowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, oporności na metotreksat, fenotypu po transformacji, tworzenia ciał okluzyjnych w bakulowirusach, itd.). Na przykład, jeżeli sekwencja kodująca białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencja kodującą fuzję polipeptydową została wstawiona do sekwencji genu markerowego wektora rekombinanty zawierające odpowiednie sekwencje kodujące można zidentyfikować przez brak funkcji genu markerowego. Alternatywnie, gen markerowy można umieścić tandemowo z sekwencjami kodującymi pod kontrolą tego samego lub innego promotora, wykorzystywanego do kontrolowania ekspresji sekwencji kodujących. Ekspresja markera w odpowiedzi na indukcję lub selekcję wskazuje na ekspresję sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową.
W trzecim podejściu, w testach hybrydyzacyjnych można określać aktywność transkrypcyjną regionu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową. Na przykład, można wyizolować RNA i poddać analizie Northern z wykorzystaniem sondy homologicznej do sekwencji kodującej białko będące przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową lub do ich konkretnego fragmentu. Alternatywnie, można wyizolować całkowite kwasy nukleinowe komórki gospodarza i poddać analizie hybrydyzacyjnej z takimi sondami.
W czwartym podejściu, ekspresję produktów białkowych białka będącego przedmiotem zainteresowania i sekwencji kodującej fuzję polipeptydową mającą aktywność β (1,4)-N-acetyloglukoza-aminylotransferazy III (GnT III) i zawierającą domenę lokalizacji w aparacie Golgiego dla heterologicznego polipeptydu lokalizowanego w aparacie Golgiego, można określać immunologicznie, np. przez Western blot, w testach immunologicznych takich jak radioimmunologiczne testy precypitacji, testy immunoenzymatyczne i tym podobne. Jednak, ostateczny test działania systemu ekspresyjnego, obejmuje wykrywanie aktywnych biologicznie produktów genów.
b. Wytwarzanie i stosowanie białek i fragmentów białek o zmienionych wzorach glikozylacji i. Wytwarzanie i stosowanie przeciwciał mających zwiększone funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał.
W korzystnych wykonaniach, dostarczono glikoform przeciwciał i fragmentów przeciwciał, mających zwiększone wiązanie się z receptorem Fc i/lub zwiększone funkcje efektorowe, w tym cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał.
Testy kliniczne nieskoniugowanych przeciwciał monoklonalnych (mAB) w leczeniu pewnych typów raka dostarczyły ostatnio zachęcających wyników. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12 : 223-25 (1997); Deo i wsp., Immunology Today 18 : 127 (1997). Chimerowe, nieskoniugowane IgG1 zostały dopuszczone do leczenia nieziarniczego chłoniaka z limfocytów B o niskim stopniu zróżnicowania, Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12 : 223-25 (1997), podczas, gdy inne, nieskoniugowane mAb, humanizowane IgG1 ukierunkowane na lite guzy sutków, także wykazywały obiecujące wyniki w fazie III testów klinicznych. Deo i wsp., Immunology Today 18 : 127 (1997). Antygeny dla tych dwóch mAb są wyrażane na wysokich poziomach w odpowiednich komórkach nowotworowych i przeciwciała pośredniczą w silnym niszczeniu nowotworu przez komórki efektorowe in vitro i in vivo. Prze24
PL 222 220 B1 ciwnie, wiele innych nieskoniugowanych mAb o wysokich specyficznościach wobec nowotworu nie może wzbudzić wystarczająco silnych funkcji efektorowych, aby być przydatnymi klinicznie. Frost i wsp., Cancer 80 : 317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19 : 184-91 (1996). Dla pewnych słabszych mAb, testuje się obecnie leczenie dodatkowymi cytokinami. Dodanie cytokin może stymulować cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) przez wzrost aktywności i ilości krążących limfocytów. Frost i wsp., Cancer 80 : 317-33 (1997); Surfus i wsp., J. Immunother. 19 : 184-91 (1996). ADCC, atak lityczny na komórki opłaszczone przeciwciałami, jest wzbudzany przez związanie receptorów leukocytów z regionem stałym (Fc) przeciwciał. Deo i wsp., Immunology Today 18 : 127 (1997).
Innym, ale uzupełniającym podejściem do wzmocnienia aktywności ADCC niekoniugowanych przeciwciał IgG1 jest manipulowanie regionu Fc przeciwciała. Badania z manipulowaniem białkami wykazały, że FcyR oddziałują z niższym regionem zawiasowym domeny CH2 IgG. Lund i wsp., J. Immunol. 157 : 4963-69 (1996). Jednak, wiązanie Fcy R wymaga również obecności oligosacharydów przyłączonych kowalencyjnie przy konserwatywnym Asn297 w regionie CH2 Lund i wsp., J. Immunol. 157 : 4963-69 (1996); Wright i Morrison, Trends Biotech. 15 : 26-31 (1997), co sugeruje, że oba zarówno oligosacharyd jak i polipeptyd bezpośrednio przyczyniają się do miejsca oddziaływania lub, że oligosacharyd jest wymagany do zachowania konformacji aktywnego polipeptydu CH2. Zatem, modyfikacja struktury oligosacharydu może być badana jako środek zwiększający powinowactwo oddziaływania.
Cząsteczka IgG niesie dwa N-połączone oligosacharydy w swoim regionie Fc, po jednym na każdym ciężkim łańcuchu. Jak każda glikoproteina, przeciwciało jest wytwarzane jako populacja glikoform, które mają taki sam szkielet polipetydowy ale mają różne oligosacharydy przyłączone do miejsc glikozylacji. Oligosacharydy znajdujące się zwykle w regionie Fc surowiczych IgG są typu złożonego lub dwuantenowego (Wormald i wsp., Biochemistry 36 : 130-38 (1997)), o niskim poziomie końcowych podstawników kwasu sialowego i przecinającej N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) i o różnym stopniu końcowej glikozylacji i fukozylacji rdzenia. Niektóre badania sugerują, że minimalna struktura węglowodanowa wymagana do wiązania FcyR zawarta jest w rdzeniu oligosacharydowym. Lund i wsp., J. Immunol. 157 : 4963-69 (1996).
Linie komórkowe pochodzące od myszy lub chomika używane w przemyśle lub w badaniach akademickich do wytwarzania niekoniugowanych, terapeutycznych mAb zwykle przyłączają wymagane determinanty oligosacharydowe do miejsc Fc. IgG wyrażanym w tych liniach komórkowych brak jednak przecinającej N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) znalezionej w małych ilościach w surowiczych IgG. Lifely i wsp., Glycobiology 318 : 813-22 (1995). Dla odmiany, ostatnio zaobserwowano, że pewne postacie glikoform szczurzej, wytworzonej przeciw czerniakowi, humanizowanej IgG1 (CAMPATHlH) niosą przecinającą GlcNAc. Lifely i wsp., Glycobiology 318 : 813-22 (1995). Przeciwciało pochodzące z komórki szczurzej, osiągnęło podobny, maksymalny poziom aktywności ADCC in vitro jak przeciwciała CAMPATH-IH wytworzone w standardowych liniach komórkowych, ale przy znacząco niższych stężeniach przeciwciała.
Antygen CAMPATH jest zwykle obecny na wysokim poziomie na komórkach chłoniaka i jego chimerowe mAb ma wysoką aktywność ADCC pod nieobecność przecinającej GlcNAc. Lifely i wsp., Glycohiology 318 : 813-22 (1995). W szlaku N-połączonej glikozylacji, przecinającej GlcNAc jest dodawana przez enzym β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazę III (GnT III). Schachter, Biochem. Cell Biol. 64 : 163-81 (1986).
W poprzednich badaniach stosowano linię komórkową CHO wytwarzającą pojedyncze przeciwciało, którą wcześniej skonstruowano tak, aby wyrażała w regulowany zewnętrznie sposób różne poziomy sklonowanego genu enzymu GnT III (Umana, P. i wsp., 7 : 176-180 (1999)). Podejście to, po raz pierwszy ustaliło silny związek między ekspresją GnT III i aktywnością ADCC modyfikowanego przeciwciała.
Dalsze przeciwciała mające zwiększone powinowactwo wiązania się z receptorem Fc i zwiększoną funkcję efektorową obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciało monoklonalne (chCE7) przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne (chG250) przeciw rakowi komórek nerki, humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2 (np. Trastuzumab (HERCEPTIN)) chimerowe przeciwciało monoklonalne (ING-1) przeciw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i piersi humanizowane monoklonalne przeciwciało anty-ludzki antygen 17-1A (3622W94), humanizowane monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (A33), przeciwciało przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydom GD3 (R24), chimerowe przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi płaskokomórkowemu (SF-25), monoklonalne przeciwciało przeciw drobnokomórkowemu rakowi płuc człowieka (BEC2, ImClone Systems, Merck KgaA), monoklonalne przeciwciało
PL 222 220 B1 przeciw chłoniakowi nieziarniczemu człowieka (Bexxar (tositumomab, Coulter Pharmaceuticals), Oncolym (Techniclone, Alpha Therapeutic)), przeciwciało monoklonalne przeciw rakowi płaskokomórkowemu głowy i szyi człowieka (C225, ImClone Systems), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (Panorex (edrecolomab), Centocor, Glaxo Wellcome), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników człowieka (Theragyn, Antisoma), monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczka szpikowej człowieka (SmartM195, Protein Design Labs, Kanebo), monoklonalne przeciwciało przeciw złośliwemu glejakowi człowieka (Cotara, Techniclone, Cambridge Antibody Technology), monoklonalne przeciwciało przeciw chłoniakowi człowieka wywodzącemu się z limfocytów B (IDEC-Y2B8, IDEC Pharmaceuticals), monoklonalne przeciwciało przeciw litym guzom człowieka (CEA-Cide, Immunomedics), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka (lodine 131-MN-14, Immunomedics), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi jajników, nerki, piersi i prostaty człowieka (MDX-210, Medarex, Novartis), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi okrężnicy i odbytu oraz trzustki człowieka (TTMA, Pharmacie & Upjohn), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka wyrażającemu TAG-72 (MDX-220, Medarex, Novartis), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi człowieka wyrażającemu EGFr (MDX-447), monoklonalne przeciwciało AntyVEGF (Genentech), monoklonalne przeciwciało przeciw rakowi piersi, płuc, prostaty i trzustki człowieka (BrevaRex, AltaRex), monoklonalne przeciwciało przeciw ostrej białaczce szpikowej człowieka (Monoclonal Antibody Conjugate, Immunex). Ponadto ujawniono fragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobulin.
ii. Wytwarzanie i zastosowanie fuzji białkowych zawierających region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny, który promuje cytotoksyczność, w której pośredniczy Fc.
Powyżej omówiono sposób zwiększania powinowactwa wiązania się z receptorem Fc i/lub funkcji efektorowej leczniczych przeciwciał. Zwiększenie to osiągane jest to przez zmianę wzoru glikozylacji regionu Fc takich przeciwciał, w szczególności przez manipulację komórkami wytwarzającymi przeciwciała tak, aby wytwarzały polipeptydy o aktywności np. GnT III lub o aktywności GalT lub o aktywności Man II, które modyfikują oligosacharydy przyłączone do regionu Fc takich przeciwciał. Strategię tę można zastosować do zwiększenia cytotoksyczności komórkowej za pośrednictwem Fc, przeciwko niepożądanym komórkom, w której pośredniczy dowolna cząsteczka niosąca region, który jest równoważny regionowi Fc immunogiobuliny nie tylko lecznicze przeciwciała, ponieważ zmiany wprowadzone przez manipulację glikozylacją dotyczą jedynie regionu Fc, a zatem jego oddziaływań z receptorami Fc na powierzchni komórek efektorowych biorących udział w mechanizmie ADCC. Cząsteczki zawierające Fc, do których można zastosować ujawnione niniejszym sposoby, obejmują, ale nie wyłącznie, (a) rozpuszczalne fuzje białkowe wytworzone z białkowej domeny kierującej połączonej z N-końcem regionu Fc (Chamov and Ashkenazi, Trends Biotech. 14 : 52 (1996)) i (b) fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazmatycznej wytworzonych z domeny transbłonowej typu II, która lokalizuje w błonie plazmatycznej połączonej z N-końcem regionu Fc (Stabila, P.F., Nature Biotech. 16 : 1357 (1998)).
W przypadku rozpuszczalnych fuzji białkowych (a) domena kierująca kieruje wiązaniem się fuzji białkowej z niepożądanymi komórkami, takimi jak komórki rakowe, tj. w analogiczny sposób do przeciwciał terapeutycznych. Zastosowanie obecnie opisanego sposobu zwiększania funkcji efektorowej, w tym aktywności cytotoksyczności komórkowej za pośrednictwem Fc, w której pośredniczą te cząsteczki, będzie identyczne ze sposobem stosowanym dla przeciwciał terapeutycznych.
W przypadku fuzji białkowych zakotwiczonych w błonie plazmatycznej (b) komórki w organizmie niepożądane muszą mieć ekspresję genu kodującego fuzję białkową. Można to osiągnąć przez podejścia terapii genowej, tj. transfekując komórki in vivo plazmidem lub wektorem wirusowym, który kieruje ekspresję genów kodujących fuzję białkową do niepożądanych komórek lub przez implantację w organizmie komórek poddanych manipulacjom genetycznym tak, aby wyrażały fuzję białkową na swojej powierzchni. Te ostatnie komórki będą zwykle implantowane do organizmu wewnątrz kapsułki polimerowej (terapia enkapsulowanymi komórkami), przy czym nie mogą być zniszczone przez dowolny mechanizm cytotoksyczności komórkowej, w której pośredniczy Fc. Jednak, gdy kapsułka ulegnie uszkodzeniu, komórki mogą się wydostać i staną się niepożądanymi, wtedy mogą być zniszczone przez cytotoksyczność komórkową, w której pośredniczy Fc. Stabila et al., Nature Biotech. 16 : 1357 (1998). W tym przypadku, obecnie ujawniony sposób byłby stosowany zarówno przez wprowadzenie do wektora terapii genowej dodatkowej kasety do ekspresji genu, zapewniającego odpowiednie lub maksymalne poziomy ekspresji fuzji polipeptydowej lub przez manipulację komórkami, które mają być implantowane tak, aby wyrażały fuzję polipeptydową na odpowiednich lub maksymalnych poziomach.
PL 222 220 B1
Terapeutyczne zastosowanie przeciwciał, fragmentów przeciwciał i fuzji polipetydowych wytworzonych zgodnie ze sposobami według wynalazku.
Przeciwciała (tj. przeciwciała, fragmenty przeciwciał i fuzje białkowe zawierające region równoważny regionowi Fc immunoglobuliny) można stosować samodzielnie do namierzania i zabijania komórek nowotworowych in vivo. Przeciwciała można również stosować w połączeniu z odpowiednim czynnikiem terapeutycznym do leczenia ludzkiego raka. Na przykład, przeciwciała można również stosować w połączeniu ze standardowymi lub konwencjonalnymi metodami, takimi jak chemioterapia, radioterapia lub mogą być koniugowane lub łączone z lekiem lub terapeutyczną toksyną, jak również z limfokiną lub czynnikiem hamującym wzrost guza, w celu dostarczania czynników terapeutycznych do miejsca raka.
Techniki koniugacji takich czynników terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane [patrz, np., Amon i wsp., „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i wsp., (wyd.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i wsp., „Antibodies For Drug Delivery”, w Controlled Drug Delivery (Wyd. 2), Robinson i wsp., (wyd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, w Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i wsp., (wyd.), str. 475-506 (1985); i Thorpe i wsp., „The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)].
Alternatywnie, przeciwciało ze zmienioną glikozylacją może być połączone z promieniowaniem o dużej energii, np. z radioizotopem, takim jak <131>I, który po umiejscowieniu w miejscu guza powoduje zabicie kilku średnic komórek [patrz, np. Order, „Analysis, Results, and Futurę Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i wsp., (wyd.), str. 303-16 (Academic Press 1985)]. Zgodnie z jeszcze innym wykonaniem przeciwciała tu ujawnione można koniugować z innym przeciwciałem, aby utworzyć heterokoniugat przeciwciał w celu leczenia komórek nowotworowych, jak opisano przez Segal w opisie patentowym USA nr 4,676,980.
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne dla ujawnionych tu przeciwciał obejmują koniugowanie lub łączenie, np. technikami rekombinowania DNA, z enzymem zdolnym do przemiany proleku w lek cytotoksyczny i zastosowanie takich koniugatów przeciwciało-enzym w kombinacji z prolekiem do przekształcania proleku w czynnik cytotoksyczny w miejscu raka [patrz, np., Senter i wsp., „AntiTumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4842-46 (1988); „Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates”, Cancer Research 49:5789-5792 (1989); i Senter, „Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy”, FASEB J. 4 : 188-193 (1990)].
Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne tu ujawnionych tu przeciwciał obejmują zastosowanie, albo w obecności dopełniacza albo jako część koniugatu przeciwciało-lek lub przeciwciałotoksyna, do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Według tego podejścia, autologiczny szpik kostny może być usunięty ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik kostny może być wprowadzony z powrotem pacjentowi [patrz, np. Ramsay i wsp., „Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies”, J. Clin. Immunol., 8(2) : 81-88 (1988)].
Ponadto, w leczeniu można zastosować przeciwciała chimerowe, rekombinowane immunotoksyny i inne rekombinowane konstrukty tu ujawnione zawierające specyficzność regionu wiążącego antygen żądanego przeciwciała monoklonalnego. Na przykład, do leczenia ludzkiego raka in vivo można zastosować jednołańcuchowe immunotoksyny.
Podobnie, do leczenia ludzkiego raka in vitro można zastosować fuzję polipeptydową zawierającą, co najmniej region wiązania antygenu tu ujawnionego przeciwciała połączony co najmniej z funkcjonalnie aktywną częścią innego białka mającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiny lub onkostatyny. Ponadto, znane w tej dziedzinie techniki rekombinacji można zastosować do konstrukcji przeciwciał dwuwartościowych, w których jedna ze specyficzności wiązania przeciwciała jest skierowana przeciw antygenowi związanemu z nowotworem, podczas gdy druga specyficzność wiązania przeciwciała jest skierowana przeciw cząsteczce innej niż ten antygen związany z nowotworem.
Niniejszym ujawniono sposób selektywnego zabijania komórek nowotworowych wyrażających antygen, który wiąże się specyficznie z przeciwciałem monoklonalnym ujawnionym w niniejszym wynalazku lub z funkcjonalnym ekwiwalentem. Sposób ten obejmuje reagowanie przeciwciał ze zmienioPL 222 220 B1 ną glikozylacją lub zawierających je immunokoniugatów (np. immunotoksyn) z takimi komórkami nowotworowymi. Te komórki nowotworowe mogą pochodzić z ludzkiego raka.
Ponadto ujawniono sposób leczenia raków (na przykład ludzkich raków) in vivo. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej leczniczo ilości kompozycji zawierającej co najmniej jedno ujawnione tu przeciwciało ze zmienioną glikozylacją lub zawierające je immunokoniugaty (np. immunotoksyny).
W dalszym aspekcie ujawniono ulepszony sposób leczenia choroby autoimmunologicznej wywoływanej w całości albo w części przez patogenne przeciwciała opartej na zmniejszeniu komórek B, obejmujący podawanie skutecznej leczniczo ilości immunologicznie czynnych przeciwciał potrzebującemu tego osobnikowi ludzkiemu, przy czym ulepszenie obejmuje podawanie skutecznej leczniczo ilości przeciwciał mających zwiększoną ADCC przygotowanych zgodnie z ujawnionymi tu sposobami. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest przeciwciało anty-CD20. Przykłady chorób lub zaburzeń autoimmunologicznych obejmują, ale nie wyłącznie, trombocytopenie związane z zaburzeniami układu odpornościowego, takie jak ostra idiopatyczna plamica małopłytkowa, przewlekła idiopatyczna plamica małopłytkowa, zapalenie skórno-mięśniowe, pląsawica Sydenhama, nerkową postać tocznia, gorączkę reumatyczną, zespoły wielogruczołowe, plamicę Henocha-Schonleina, zapalenie nerek po infekcji paciorkowcami, rumień guzowaty, chorobę Takayasu, chorobę Addisona, rumień wielopostaciowy, wieloguzkowe zapalenie naczyń, zesztywniające zapalenia stawów kręgosłupa, zespół Goodpasturea, zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczyń, pierwotna żółciowa marskość wątroby, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, tyrotoksykoza, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, wielomięśniowe/zapalenie skórnomięśniowe, zapalenie wielochrząstkowe, pęcherzyca zwykła, ziarniniak Wegenera, zapalenie błony filtracyjnej w kłębuszkach nerkowych, stwardnienie zanikowe boczne, wiąd rdzenia, ból wielomięśniowy, anemię złośliwą, piorunujące kłębuszkowe zapalenie nerek i zwłóknienie pęcherzyków płucnych, odpowiedzi zapalne, takie jak choroby zapalne skóry, w tym, łuszczycę i zapalenie skory (np. atopowe zapalenie skóry); twardzinę układową i stwardnienie; odpowiedzi związane z chorobami zapalnymi jelit (takie jak choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelit); zespół ostrego wyczerpan ia oddechowego (w tym zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych; ARDS); zapalenie skóry; zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych; zapalenie mózgu; zapalenie błony naczyniowej oka; zapalenie jelit; kłębuszkowe zapalenie nerek; stany alergiczne, takie jak egzema i astma i inne stany, w których dochodzi do naciekania komórkami T i przewlekłe odpowiedzi zapalne; miażdżycę tętnic; zaburzenia adhezji leukocytów; reumatoidalne zapalenie stawów; toczeń układowy (SLE); cukrzycę (np. cukrzycę typu I lub cukrzycę insulinozależną); stwardnienie rozsiane; zespół Reynauda, au toimmunologiczne zapalenie tarczycy; alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia; zespół Sjorgena; cukrzycę młodzieńczą; i odpowiedzi odpornościowe związane z ostrą i opóźnioną nadwrażliwością za pośrednictwem cytokin i limfocytów T zwykle występującą w gruźlicy, sarkoidozę, zapalenie wielomięśniowe, ziarniniakowatość i zapalenie naczyń; anemię złośliwą (chorobę Addisona); choroby z udziałem diapedezy leukocytów; zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN); zespół obrażeń wielonarządowych; anemię hemolityczną (obejmującą, ale nie wyłącznie, krioglobulinemię lub anemię immunohemolityczną z dodatnim odczynem Coombsa); miastenia rzekomoporaźna; choroby za pośrednictwem kompleksu antygen-przeciwciało; chorobę związaną z przeciwciałami przeciw błonie podstawnej kłębuszka nerkowego; zespół antyfosfolipidowy; alergiczne zapalenie nerwu; chorobę Gravesa; zespół miasteniczny Lamberta-Eatona; pemfigoid pęcherzowy; pęcherzycę; choroby endokrynologiczne na podłożu autoimmunologicznym; chorobę Reitera; zespół sztywności ogólnej; chorobę Behceta; olbrzymiokomórkowe zapalenie naczyń; zapalenie nerek wywoływane kompleksami immunologicznymi; nefropatię IgA; zapalenia wielonerwowe wywoływane IgM; plamicę małopłytkową na podłożu immunologicznym (ITP) lub małopłytkowość autoimmunologiczną, itd. W tym aspekcie ujawnione tu przeciwciała są stosowane do ograniczenia we krwi prawidłowych komórek B w dłuższym przedziale czasu.
Zgodnie z niniejszym ujawnieniem osobnikiem może być człowiek, koń, świnia, wół, mysz, pies, kot lub ptak, a także inne zwierzęta stałocieplne.
Niniejszym ujawniono również sposób leczenia osobnika chorego na raka. Osobnikiem może być człowiek, pies, kot, mysz, szczur, królik, koń, koza, owca, krowa, kura. Rak może być rozpoznany jako rak sutka, pęcherza, siatkówczak, brodawkowaty torbielakogruczolako włókniak jajnika, guz Wilma lub drobnokomórkowy rak płuc i jest ogólnie charakteryzowany jako grupa komórek mających antygeny związane z nowotworem. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi ilości przeciwciała nakierowanego na nowotwór połączonego z czynnikiem cytotoksycznym zabijającej raka. Na ogół, połączenie przeciwciała nakierowanego na nowotwór z czynnikiem cytotoksycznym wykonuje się
PL 222 220 B1 w warunkach umożliwiających tak połączonemu przeciwciału wiązanie się z jego celem na powierzchni komórki. Wiążąc się ze swoim celem, przeciwciało nakierowane na nowotwór działa bezpośrednio lub pośrednio powodując lub przyczyniając się do zabijania komórek tak związanych, tym samym lecząc osobnika.
Ujawniony jest również sposób hamowania proliferacji ssaczych komórek nowotworowych obejmujący doprowadzenie do kontaktu ssaczych komórek nowotworowych z wystarczającymi stężeniami przeciwciał ze zmienioną glikozylacją lub zawierających je immunokoniugatów tak, aby hamować proliferację ssączych komórek nowotworowych.
Ujawniono również kompozycje farmaceutyczne, kombinacje i sposoby leczenia ludzkich raków, na przykład, kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwciała wytworzonego w komórce gospodarza według niniejszego wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Kompozycje mogą zawierać przeciwciało lub fragmenty przeciwciała, albo niezmodyfikowane, skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym (np. lekiem, toksyną, enzymem lub drugim przeciwciałem) albo w postaci rekombinowanej (np. przeciwciała chimerowe, fragmenty przeciwciał chimerowych, przeciwciała dwuwartościowe). Kompozycje mogą zawierać dodatkowo przeciwciała lub koniugaty do leczenia raków (np. koktajl z przeciwciał).
Kompozycje przeciwciał, koniugatów przeciwciał lub immunotoksyn mogą być podawane z wykorzystaniem konwencjonalnych sposobów podawania w tym, między innymi, dożylnie, dootrzewnowo, doustnie, poprzez układ limfatyczny lub bezpośrednio do guza. Korzystne jest podawanie dożylne.
Kompozycje mogą być podawane w szeregu różnych postaciach dawkowania, które obejmują, między innymi, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęcherzyki, liposomy lub roztwory do iniekcji lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Kompozycje korzystnie zawierają również konwencjonalne, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i adiuwanty znane w tej dziedzinie, takie jak albumina osocza człowieka, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforujące takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbinowy, sorbinian potasu oraz sole i elektrolity, takie jak siarczan protaminy.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania kompozycji zależą od ciężkości i przebiegu choroby, stanu zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. Zatem, dawkowanie kompozycji powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta. Niemniej, skuteczna dawka kompozycji może zawierać się w przedziale od około 1 do 2000 mg/kg.
Cząsteczki tutaj opisane mogą być w szeregu różnych postaciach dawkowania, które obejmują, między innymi, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, polimeryczne mikrokapsułki lub mikropęcherzyki, liposomy lub roztwory do zastrzyków lub wlewów. Korzystna postać zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.
Najbardziej skuteczny sposób podawania i warunki dawkowania cząsteczek według niniejszego wynalazku zależą od umiejscowienia leczonego nowotworu, od ciężkości i przebiegu raka, stanu zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i oceny leczącego lekarza. Zatem, dawkowanie cząsteczek powinno być dostosowane indywidualnie do pacjenta.
Wzajemne zależności dawkowania dla zwierząt różnej wielkości i gatunków i człowieka, na podstawie mg/kg w stosunku do obszaru powierzchni opisano w Freireich, E.J. i wsp., Cancer Chemother., Rep. 50(4) : 219-244 (1966). Można dokonać zmian w warunkach dawkowania, aby zoptymalizować hamowanie wzrostu komórek nowotworowych i zabijającą odpowiedź, np. dawkę można podzielić i podawać na podstawie codziennych obserwacji lub można zmniejszyć proporcjonalnie, w zależności od sytuacji (np. można podawać kilka podzielonych dawek dziennie lub zmniejszonych proporcjonalnie w zależności od specyficznej sytuacji leczniczej).
Jest oczywiste, że dawkę kompozycji wymaganą do osiągnięcia leczenia, można dalej zmniejszać przy optymalizacji harmonogramu.
Nośnikiem farmaceutycznym może być nośnik lipidowy. Nośnikiem lipidowym może być fosfolipid. Ponadto, nośnikiem lipidowym może być kwas tłuszczowy. Także, nośnikiem lipidowym może być detergent. Detergentem jest dowolna substancja, która zmienia napięcie powierzchniowe cieczy, zwykle je obniżając.
Detergent może być detergentem niejonowym. Przykłady niejonowych detergentów obejmują, między innymi, polisorbat 80 (znany także jako Tween 80 lub monooleinian polioksyetylenosorbitanu), Brij i Triton (na przykład Triton WR-1339 i Triton A-20).
PL 222 220 B1
Alternatywnie, detergentem może być detergent jonowy. Przykład jonowego detergentu obejmuje, między innymi, bromek alkilotrimetyloamoniowy.
Nośnikiem lipidowym może być liposom. „Liposom” jest to dowolny pęcherzyk związany z błoną zawierający cząsteczki ujawnione w wynalazku lub ich kombinacje.
Przykłady poniżej wyjaśniają wynalazek bardziej szczegółowo. Poniższe sposoby otrzymywania i przykłady zostały podane, aby umożliwić specjalistom w tej dziedzinie lepsze zrozumienie i wykonywanie wynalazku. Jednak, niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem przykładowych wykonań, którymi zamierzono jedynie zilustrować pojedyncze aspekty wynalazku i funkcjonalnie równorzędne sposoby mieszczą się w zakresie wynalazku. Szereg modyfikacji wynalazku dodatkowych w stosunku do tutaj opisanych będzie oczywistych dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie poniższego opisu i towarzyszących im rysunków. Takie modyfikacje mają być objęte zakresem dołączonych zastrzeżeń.
P r z y k ł a d 1
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych dla przeciwciał
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20
Wektor ekspresyjny pETR1502 dla przeciwciała anty-CD20 C2B8 składa się z czterech niezależnych, oddzielnych kaset ekspresyjnych (jedna dla łańcucha lekkiego przeciwciała C2B8, jedna dla łańcucha ciężkiego przeciwciała C2B8, jedna dla genu oporności na neomycynę oraz jedna dla mysiego genu dhfr). Wszystkie geny znajdują się pod kontrolą promotora wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego (MPSV) i zawierają syntetyczny sygnał zgodności dla poliadenylacji pochodzący z sygnału poliadenylacj i króliczego genu β-globiny.
Cząsteczki cDNA kodujące rejony zmienne ciężkiego (VH) oraz lekkiego (VL) łańcucha przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały złożone z zestawu zachodzących na siebie jednoniciowych oligonukleotydów w jednoetapowym procesie z zastosowaniem PCR (Kobayashi, N., i wsp., Biotechniques 23 : 500-503 (1997)). Oryginalne sekwencje kodujące regiony VL i VH C2B8 uzyskano z opublikowanego międzynarodowego zgłoszenia patentowego (międzynarodowa publikacja numer: WO 94/11026). Złożone fragmenty cDNA VL i VH zostały poddane subklonowaniu do pBluescriptllKS(+) w celu uzyskania plazmidów pBlue-C2B8VH i pBlue-C2B8VL oraz sekwencjonowaniu. Zmienne łańcuchy C2B8 amplifikowano z odpowiedniego plazmidu pBlue-C2B8VH i pBlue-C2B8VL z zastosowaniem starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne Ascl na końcu 5' oraz odpowiednie miejsca restrykcyjne na połączeniu regionu zmiennego ze stałym (BsiWI dla łańcucha lekkiego i Nhel dla łańcucha ciężkiego). Regiony stałe IgGl zostały amplifikowane z biblioteki cDNA ludzkich leukocytów (Quickclone, Clontech) z zastosowaniem starterów wprowadzających dogodne miejsca restrykcyjne na końcach 5' i 3' (BsiWI i BamHI dla regionu stałego łańcucha lekkiego oraz Nhel i BamHI dla regionu stałego łańcucha ciężkiego).
Po potwierdzeniu poprawności sekwencji DNA, każdy z łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała C2B8 został połączony z promotorem MPSV i sygnałami poliadenylacji. W pierwszym etapie, skonstruowano dwa różne wektory ekspresyjne: jeden dla łańcucha lekkiego C2B8 (pETR1315), adrugi dla łańcucha ciężkiego C2B8 (pETR1316). W drugim etapie do wektora pETR1315 wprowadzono kasetę ekspresyjną oporności na neomycynę (gen oporności na neomycynę pochodzący z transpozonu Tn5 i umieszczony pod kontrolą minimalnego promotora MPSV), w wyniku, czego powstał plazmid pETR1481. Kaseta ekspresyjna genu dhfr pod kontrolą promotora MPSV została wstawiona do wektora pETR1316, w wyniku, czego powstał plazmid pETR1328. W końcowym etapie, oba moduły ekspresyjne (łańcuch lekki C2B8 + neo i łańcuch ciężki C2B8 + dhfr) zostały połączone w jeden wektor, co dało plazmid pETR1502.
Wektor ekspresyjny pETR1520 dla przeciwciała anty-CD20 pETR1520 stanowi połączenie wektora ekspresyjnego dla przeciwciała C2B8 z miejscem inicjacji replikacji z wirusa Epstein-Barra (oriP) dla replikacji i utrzymania wektora episomalnego w komórkach wytwarzających jądrowy antygen wirusa Epstein-Barra (EBNA). W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego C2B8, pETR1520, moduł ekspresyjny C2B8 z pETR1416 został wstawiony jako fragment HinDIII do wektora pETR1507 zawierającego ori-P. Wektor pETR1416 jest podobny do pETR1502 z wyjątkiem tego, że w plazmidzie tym gen oporności na neomycynę znajduje się pod kontrolą całkowitego, zamiast minimalnego, promotora MPSV.
Wektor ekspresyjny pETR1546 przeciwciała przeciw fibronektynie
PL 222 220 B1
Wektor ten jest identyczny z wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że regiony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie regiony kodujące przeciwciała L19, ludzkiego przeciwciała rozpoznającego domenę ED-B fibronektyny. Fragmenty DNA kodujące regiony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody wydłużania w reakcji PCR zachodzących na siebie regionów z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów opartych na sekwencji regionów zmiennych przeciwciała L19 (Pini, A. i wsp. J. Biol. Chem. 273 (34): 21769-76 (1998)).
Wektor ekspresyjny pURSI28 przeciwciała (C225) przeciw EGFR
Wektor ten jest identyczny z wektorem pETR1520, z wyjątkiem tego, że regiony kodujące zmienny łańcuch ciężki i lekki przeciwciała C2B8 anty-CD20 zostały zastąpione przez odpowiednie regiony kodujące przeciwciało C225, chimerowego przeciwciała rozpoznającego receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu. Fragmenty DNA kodujące regiony zmienne zostały zsyntetyzowane za pomocą metody zachodzącego wydłużania PCR (ang. overlap extension PCR) z zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów opartych na sekwencji regionów zmiennych przeciwciała C225 (sekwencje można znaleźć w opublikowanym zgłoszeniu patentowym o międzynarodowym numerze publikacji WO 96/40210, Fig. 16 i 17 tego zgłoszenia patentowego odpowiednio dla łańcuchów ciężkich i lekkich).
2. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji-GnT III pETR1166
Wektor do konstytutywnej ekspresji GnT III
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego GnT III pETR166 amplifikowano szczurzy GnT III z biblioteki cDNA nerki szczurzej (Clontech) za pomocą PCR. C-końcowy znacznik c-myc-epitop dodano powyżej kodonu stop genu (sekwencja aminokwasowa: PEQKLISEEDL) w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GnT III przez Western blot. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji GnT III, gen wstawiano pod kontrolę promotora MPSV i dodawano syntetyczny sygnał poliadenylacji króliczej beta globiny. Końcowy wektor ekspresyjny GnT III zawierał także oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem oporności na puromycynę pod kontrolą promotora MPSV i syntetycznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny. pETR1425: Zastąpienie pierwszych 76 aminokwasów GnTIII przez pierwsze 102 aminokwasy ludzkiej GnTI.
Konstruowanie tego hybrydowego genu glikozylotransferazy przeprowadzono za pomocą reakcji zachodzącego wydłużania PCR W jednej reakcji strukturalny region ludzkiej GnTI amplifikowano z zastosowaniem starterów GAB-179 i GAB-180. Podczas tej reakcji PCR na końcu 5' wstawiono także sekwencję największej zgodności Kozaka oraz miejsce restrykcyjne AscI. Uzyskany fragment PCR miał 23 pz zachodzące na początek GnT III zaczynając od pozycji 229. W drugiej reakcji PCR region GnT III od pozycji 229 do 380 był amplifikowany ze starterami GAB-177 i GAB-178 wytwarzając fragment PCR z pojedynczym miejscem dla BstXI na 3' końcu i 22 pz pokrywającymi się ze strukturalnym regionem GnT I na 5' końcu. Oba fragmenty PCR oczyszczono i zastosowano jako matryce w trzeciej reakcji PCR (startery GAB-179 i GAB-178). Uzyskany fragment oczyszczano i strawiono Ascl i zligowano z wektorem pETR1001 (ciętym Ascl i Smal) uzyskując plazmid pETR1404. Po potwierdzeniu sekwencji wstawki do pETR1404 dodawano element promotorowy MPSV jako fragment Ascl (trawienie częściowe)/Pmel uzyskując plazmid pETR1423. Fragment SphI/BstXI z pETR1166, wektora ekspresyjnego niosącego oryginalny szczurzy gen GnT III, zastąpiono następnie odpowiadającym fragmentem pETR1423 otrzymując plazmid pETR1425 zawierający fuzję GnT I-GnT III pod kontrolą promotora MPSV i kasetę oporności na puromycynę dla selekcji. Sekwencje starterów:
GAB-177: GCGTGTGCCTGTGACCCCCGCGCCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-178: GAAGGTTTCTCCAGCATCCTGGTACC
GAB-179: CTGAGGCGCGCCGCCACCATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGC
GAB-180: GGGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGCGCGGGGGTCACAGGCACACGCGGC pETR1506: Zastąpienie 76 N-końcowych aminokwasów GnT III przez pierwsze 100 aminokwasów ludzkiej mannozydazy II
Konstruowanie pETR1506 przeprowadzono analogicznie do konstruowania pETR1425. Region strukturalny ludzkiego genu mannozydazy II amplifikowano z zastosowaniem starterów GAB-252 i GAB-253 stosując jako matrycę wektor pBlue-man. Podczas tej reakcji PCR na 5' końcu wstawiano miejsce Fsel i sekwencję największej zgodności Kozaka. Uzyskany fragment PCR zachodzi na gen GnT III zaczynający się w pozycji 229 przez 23 pz. W drugiej reakcji PCR część genu GnT III (pozycja 229-460) amplifikowano ze starterami GAB-254 i GAB-255. Ta reakcja PCR wytworzyła fragment zawierający zakładkę o 43 pz z genem mannozydazy II na 5' końcu i pojedyncze miejsce Stul na 3' końcu. Oba fragmenty oczyszczono i zastosowano jako matryce w trzeciej reakcji PCR ze starterami
PL 222 220 B1
GAB-252 i GAB-255. Uzyskany fragment wstawiono do pICI9H otrzymując wektor pETR1484. Po potwierdzeniu prawidłowej sekwencji wstawki skonstruowano całkowity gen fuzyjny przez zligowanie fragmentu Fsel/Stul pETR1484 z fragmentem StuI/BamHI z pETR1166 w wektorze pETR12177 (Fsel/BamHI). Otrzymany plazmid (pETR1500) zawierał hybrydowy gen Man II-GnT III (SEK. NR ID: 14) pod kontrolą promotora MPSV. W celu selekcji plazmidu w komórkach ssaczych wstawiano kasetę oporności na puromycynę jako fragment Spel z pETR1166 uzyskując plazmid pETR1506.
Sekwencje starterów:
GAB-252: GCTAGGCCGGCCGCCACCATGAAGTTAAGCCGCCAGTTCACCGTGTTCGG
GAB-253: GGGACAGTGGCTGGAGCAGGGGTGAGCCAGCACCTTGGCTGAAATTGCTTTGTGAACTTTTCGG
GAB-254: TCCGAAAAGTTCACAAAGCAATTTCAGCCAAGGTGCTGGCTCACCCCTGCTCCAGCCACTGTCCCC
GAB-255: ATGCCGCATAGGCCTCCGAGCAGGACCCC pETR1519: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III z miejscem inicjacji replikacji oriP z wirusa Epstein'a Barr'a
Stosując startery GAB-261 i GAB-262 amplifikowano 2 kz fragment zawierający oriP z plazmidu pCEP4 (Invitrogen). Podczas tej reakcji PGR na obu końcach fragmentu wstawiono miejsca Sspl i EcoRI. W celu zsekwencjonowania fragment oriP wstawiano do wektora pIC19H. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji, oriP wstawiano jako fragment Sspl do wektora pERT1001 (trawionego a BsmBI i z lepkimi zachodzącymi 5'-końcami wypełnionymi za pomocą polimerazy Klenowa). Otrzymany plazmid oznaczono jako pETR1507. Kasetę ekspresyjną SphI/NruI Man II-GnT III z pETR1510 wstawiono do pETR1507 trawionego takimi samymi endonukleazami restrykcyjnymi otrzymując plazmid pETR1519.
Sekwencje starterów:
GAB-261: GCTAAAATATTGAATTCCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGC
GAB-262: TAGCAATATTGAATTCGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGC pETR1537: Połączenie hybrydowego genu fuzyjnego Man II-GnT III i skróconego genu markerowego powierzchni komórkowej CD4
Wektor ekspresyjny pETR1506 modyfikowano w celu dodatkowej ekspresji skróconego genu markerowego powierzchni komórkowej CD4. W skrócie, kasetę ekspresyjną fuzyjnego genu hybrydowego Man II-GnT III przekształcono z monocistronowej na bicistronową kasetę ekspresyjną przez wstawienie, poniżej kodonu stop fuzji Man II-GnT III, elementu IRES wirusa polio, za którym znajdował się cDNA kodujący skrócone ludzkie białko CD4 (obejmujący sekwencję liderową ludzkiego CD4 do wydzielania, za którą znajdują się domeny przezbłonowe i zewnątrzkomórkowe).
3. Transfekcja ssaczych komórek fuzją GnT III i wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał
Transfekowanie komórek BHK
Wykładniczo rosnące komórki (żywotność 90-95%) wysiano w odpowiedniej liczbie butelek T75 w stężeniu 0,9 x 10-6 komórek/ml 24 godziny przed elektroporacją. Jako pożywkę hodowlaną stosowano Invitrus (Cell Culture Technologies, Switzerland) uzupełnianą 10% płodową surowicą bydlęcą (FCS). Komórki zliczono przed elektroporacją. Zebrano 8 x 10-6 komórek przez odwirowanie (5 minut, 200 x g), a supernatant usunięto. Komórki zawieszono w 800 μΐ pożywki Invitrus i przeniesiono do sterylnej kuwety elektroporacyjnej (szczelina 0,4 cm) zawierającej już 8 μ DNA kolistego plazmidu i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Komórki elektroporowano stosując Gene Pulser II (BioRad) w następujących warunkach: 400 V, 960 μF dwoma pulsami w 30 sekundowym odstępie. Po elektroporacji komórki natychmiast przeniesiono do butelki T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej (Invitrus/20% (obj./obj.) FCS/1,25% (obj./obj.) DMSO) i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% zawartością CO2. W celu wytwarzania niezmodyfikowanych (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciał, komórki stransfekowano jedynie wektorami ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytworzenia przeciwciał z manipulacją glikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III (SEK. NR ID: 15), w stosunku odpowiednio 3 : 1.
PL 222 220 B1
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Wykładniczo rosnące komórki HEK293-EBNA stransfekowano metodą z fosforanem wapnia. Komórki hodowano w postaci przylegających jednowarstwowych hodowli w butelkach T stosując pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnianą 10% FCS i transfekowano, gdy osiągnęły one 50-80% konfluencji. W celu transfekcji butelki T75, 8 milionów komórek umieszczono 24 godziny przed transfekcją w 14 ml pożywki hodowlanej DMEM z FCS (w końcowym stężeniu 10%/obj.) / 250 pg/ml neomycyny i komórki umieszczono w 37°C w inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez noc. Dla każdej butelki T75 przeznaczonej do transfekcji, przygotowano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez zmieszanie 47 pg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 235 pl 1M roztworu CaCl2 i dodanie wody do końcowej objętości 469 pl. Do tego roztworu dodano 469 pl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 o pH 7,05, mieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiano do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczono 12 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodano do T75 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastąpiono 12 ml DMEM, 10% FCS. W celu wytworzenia niezmodyfikowanych (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciał, komórki transfekowano jedynie wektorami (ekspresyjnymi dla przeciwciał. W celu wytworzenia przeciwciał ze zmnienioną glikozylacją, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do ekspresji przeciwciała i drugim do ekspresji fuzji polipeptydowej GnT III, w stosunku odpowiednio 4:1. Piątego dnia po transfekcji, zbierano supernatant, odwirowywano przez 5 minut przy 1200 obr./min., a następnie ponownie odwirowywano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało anty-CD20
Komórki BHK (BHK21-13c) transfekowano przezelektroporację wektorem ekspresyjnym pETR1502 przeciwciała C2B8, który zawiera kasetę ekspresyjną genu oporności na neomycynę. Klony oporne na neomycynę najpierw selekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które miały zintegrowany chromosomalnie DNA wektora pETR1502. Następnie klony przeszukano pod kontem wytwarzania zrekombinowanego przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. W skrócie, 24 godziny po elektroporacji, żywotne komórki zliczono i określono wydajność transfekcji przez zliczanie komórek fluorescencyjnych równoległej, kontrolnej elektroporacji wykonanej z wektorem ekspresyjnym pEYFP. Komórki rozcieńczono w pożywce selekcyjnej Invitrus zawierającej 10% FCS i 1 mg/ml neomycyny. Zazwyczaj na 8 96-studzienkowych płytek nakładano różne stężenia żywotnych, stransfeko- wanych
2 2 komórek (1 x 103, 5 x 102 oraz 1 x 102 komórek na studzienkę) i inkubowano w 37°C do czasu, gdy można było zidentyfikować klony. Gdy klony wyrosły do stadium niemal całkowitej konfluencji, supernatanty przeanalizowano za pomocą ELISA pod kontem wytwarzania przeciwciała. Klony pozytywne w teście ELISA wysiano początkowo do 24-studzienkowych, a następnie 6-studzienkowych płytek, a następnie do butelek T25. Po pięciu dniach wzrostu w butelkach T25 określono końcowe miano przeciwciała stosując oznaczenie ELISA. Stosując tę elektroporację i procedurę selekcji wyizolowano klon komórek BHK wyrażających przeciwciało C2B8 anty-CD20 (BHK-1502-28), który wytwarzał 13 pg/ml przeciwciała w powyższych warunkach hodowli.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20 i fuzję GnT III.
Klon BHK-1502-28, wyrażający konstytutywnie geny monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 i gen oporności na neomycynę, stransfekowano wektorem ekspresyjnym pETR1537 za pomocą elektroporacji. pETR1537 jest wektorem do konstytutywnej ekspresji genu Man II-GnT III i skróconej postaci ludzkiego CD4 wyrażanej zależnie od IRES. Wektor ten zawiera także kasetę ekspresyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę najpierw zselekcjonowano w celu uzyskania zbioru klonów, które miały zintegrowany chromosomalnie DNA wektora pETR1537. Następnie klony przeszukano pod kontem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji bicistronowej jednostki ekspresyjnej genu Man II-GnT III+tCD4. Wytworzenie zrekombinowanego przeciwciała z wybranych klonów potwierdzono stosując oznaczenie ELISA.
W skrócie, DNA wektora pETR1537 linearyzowano z użyciem Xmnl. Równolegle przeprowadzono kontrolną transfekcję z wektorem ekspresyjnym EYFP. Wydajność transfekcji ustalono po 24 godzinach przez zliczanie komórek wyrażających EYFP w stosunku do wszystkich komórek. Spośród wszystkich komórek 58% wyrażało EYFP. Żywotność komórek wynosiła 91%. Jeden dzień po transfekcji, komórki stransfekowane pETR1537 lub pEYFP rozcieńczono seryjnie w stosunku 1 : 100,
PL 222 220 B1 : 500, 1 : 1000 i 1 : 5000 i umieszczono na 96-studzienkowych płytkach, w końcowej objętości 0,2 ml pożywki selekcyjnej (Invitrus, 10% FCS, 20 pg/ml puromycyny, 1 mg/ml neomycyny). Klony były widoczne po dwóch tygodniach. Klony wysiano i i przeszukano pod kontem ekspresji skróconego CD4 (tCD4) i ekspresji przeciwciała.
W celu przeszukiwania poziomu ekspresji tCD4, w przybliżeniu 500 000 komórek przemyto buforem FACS i inkubowano z 5 pl anty-ludzkich CD4 FITC (Becton Dickinson, Switzerland) nprzez 20 minut w lodzie. Po dwóch płukaniach komórki zawieszono w 0,5 ml buforu FACS i analizowano z FACS (Fig. 17A-B). Wyizolowano klon (BHK-1502-28-11) z dobrym poziomem ekspresji tCD4. Po pięciu dniach wzrostu w butelce T25 wytwarza on przeciwciało anty-CD20 o końcowym mianie około 17 pg/ml, jak ustalono przez ELISA.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfikowanych i z modyfikacją glikozylacji
Zbieranie pożywki hodowlanej
W przypadku komórek BHK stransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała plus wektorem ekspresyjnym dla fuzji-GnT III, supernatant hodowlany zebrano po hodowaniu stransfekowanych komórek przez 96 godzin po transfekcji. W zależności od oczekiwanej wydajności, przeprowadzono kilka elektroporacji (10-1 5) dla tego samego wektora.
W przypadku komórek HEK293-EBNA stransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała plus wektorem ekspresyjnym dla fuzji-GnT III, pożywkę hodowlaną zastąpiono świeżą pożywką hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, a następnie pożywkę zebrano po hodowaniustransfekowanych komórek przez kolejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowlę wysiano w stężeniu 500 000 komórek/ml, a supernatant zebrano po 4 dniach hodowli, gdy gęstość komórek wynosiła 1,7 x 10-6 żywotnych komórek/ml, a żywotność komórek wynosiła 69%.
Oczyszczanie przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne oczyszczono z supernatantu hodowlanego stosując dwa kolejne etapy chromatograficzne. Pierwszy etap składał się z chromatografii Białka A z zastosowaniem elucji w gradiencie pH, która wydajnie oddziela bydlęce i ludzkie IgG. Po tym następował etap chromatografii kationowo-wymiennej w celu wymiany próbki buforu na roztwór soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (PBS).
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy uwalniano enzymatycznie z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, z przeciwciałami albo unieruchomionymi na membranie PVDF albo w roztworze.
Otrzymany roztwór trawienny zawierający uwolnione oligosacharydy albo bezpośrednio gotowe do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawione za pomocą glikozydazy EndoH w celu przygotowania próbki do analizy MALDI/TOF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na membranie PVDF
Studzienki 96-studzienkowej płytki wytworzonej z membraną PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) nawilżono 100 pl metanolu, a płyn przepuszczono przez membranę PVDF z użyciem próżni stosowanej w próżniowym kolektorze Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Membrany PVDF przemyto trzykrotnie 300 pl wody. Następnie studzienki przemyto 50 pl buforu RCM (8M mocznik, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8,6). Na studzienkę zawierającą 10 pl buforu RCM naniesiono między 30-40 pg przeciwciała. Płyn w studzience przepuszczono przez membranę stosując próżnię, a następnie dwukrotnie przemyto membranę 50 pl buforu RCM. Przeprowadzono redukcję mostków didulfidowych przez dodanie 50 pl 0,1 M ditiotretiolu w RCM i inkubację w 37°C przez 1 godzinę.
Po redukcji, zastosowano próżnię w celu usunięcia ze studzienki roztworu ditiotretiolu. Studzienki przemyto trzykrotnie 300 pl wody przed przeprowadzeniem karboksymetylacji reszt cysteinowych przez dodanie 50 pl 0,1 M kwasu jodooctowego w buforze RCM i inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
Po karboksymetylacji, studzienki osuszano przy pomocy próżni, a później przemyto trzykrotnie 300 pl wody. Następnie membranę PVDF blokowano, w celu zapobieżenia adsorpcji endoglikozydazy, przez inkubowanie 100 pl 1% wodnego roztworu poliwinylu 360 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie reagent blokujący usunięto delikatną próżnią z późniejszym trzykrotnym przemyciem 300 pl wody. W celu usunięcia wszystkich potencjalnych naładowanych reszt monosachary34
PL 222 220 B1 dowych, w końcowej objętości 25 pl w 20 mM NaHCO3, pH 7,0) N-związane oligosacharydy uwolniono przez dodanie 2,5 mU peptydo-N-glikozydazy F (rekombinowana N-glikanaza, GLYKO, Novato, CA) i 0,1 mU sialidazy (GLYKO, Novato, CA). Trawienie prowadzono przez 3 godziny w 37°C.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze
Między 40 a 50 pg przeciwciała zmieszano z 2,5 mU PNGazy F (Gyko, U.S.A.) w 2 mM Tris, pH 7,0 w końcowej objętości 25 mikrolitrów i mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C.
Stosowanie trawienia oligosacharydów uwolnionych PNGaząF endoglikozydazą H w celu prz ypisania struktur hybrydowych przeciętych na oligosacharydów do pików MALDI/TOF-MS neutralnych oligosacharydów
Oligosacharydy uwolnione PNGaząF strawiono następnie endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96). W celu trawienia EndoH, do trawienia PNGaząF dodano 15 mU EndoH (Roche, Szwajcaria) (sposób dla przeciwciał w roztworze, patrz powyżej), w celu uzyskania końcowej objętości 30 mikrolitrów, mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w 37°C. EndoH tnie pomiędzy resztami N-acetyloglukozaminy rdzenia chitobiozy N-związanych oligosacharydów. Enzym może trawić jedynie oligomannozę i wiele glikanów typu hybrydowego, podczas gdy złożone typy oligosacharydów nie podlegają hydrolizie.
Przygotowanie próbki dla MALDI/TOF-MS
Trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy inkubowano przez kolejne 3 godziny w warunkach pokojowych po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM, a następnie przepuszczono przez 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, ziarna 100-200, BioRad, Szwajcaria) nałożone na kolumnę chromatograficzną mikro-biospin (BioRad, Szwajcaria) w celu usunięcia kationów i białek. Jeden mikrolitr otrzymanej próbki nałożono na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i zmieszano na płytce z 1 pl macierzy sDHB. Macierz sDHB przygotowano przez rozpuszczenie 2 mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego plus 0,1 mg kwasu 5-metoksysalicylowego w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1 : 1 (obj./obj.). Próbki wysuszono na powietrzu, nałożono 0,2 pl etanolu i umożliwiano rekrystalizację próbki w powietrzu atmosferycznym.
MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TOF stosowanym do uzyskania widm masowych był Voyager Elite (Perspective Biosystems). Przyrząd działał w układzie liniowym, z przyspieszeniem 20 kV i opóźnieniem 80 nsek. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację z zastosowaniem standardów oligoscharydowych. Widma z 200 zdjęć laserowych zsumowano w celu uzyskania końcowego widma.
6. Przygotowanie PBMC
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) i stosując zasadniczo instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobrano krew żylną od ochotników, których poproszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minutę w celu zwiększenia procentowego udziału limfocytów NK we krwi. Krew rozcieńczono 1 : 0,75-1,3 PBS niezwierającym Ca lub Mg i umieszczono warstwowo na Histopaque-1077. Gradient odwirowano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zebrano interfazę zawierającą PBMC i przemyto ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zebrano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczono PBMC i przemyto drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszono w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
7. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK wyizolowano z PBMC stosując procedurę negatywnej selekcji przy użyciu magnetycznych kulek nie wiążących komórek CD16- i CD56-dodatnich (układ MACS z Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, GER). PBMC raz przemyto schłodzonym buforem MACS (PBS zawierający 2% FCS i 2 mM EDTA), ponownie zawieszono w stężeniu 20 komórek Mio na ml mieszaniny 1:1 FCS i buforu MACS i inkubowano przez 10 minut w 4°C. Komórki następnie osadzono i ponownie zawieszono w 80 pl 1 buforu MACS zawierającego 10% FCS, na 10 milionów komórek. Następnie na 10 milionów komórek dodano 20 pl roztworu przeciwciała-Hapten. Komórki inkubowano przez 10 minut w 4°C z powtarzalnym zamieszaniem probówką. Po dwóch przemyciach buforem MACS, w co najmniej 10 x objętości buforu do znakowania, komórki ponownie zawieszono w buforze MACS zawierającym 10% FCS przy 10 milionach komórek na 80 pl i dodano 20 p mikrokulek-antyhapten na 10 milionów komórek. Probówkę inkubowano przez 15 minut w 4°C z mieszaniem. Po jednym przemyciu buforem MACS komórki ponownie zawieszono w stężeniu do 10 milionów komórek
PL 222 220 B1 w 500 pl buforu MACS i umieszczono na kolumnie LS MACS, którą umieszczono w magnesie MINIMACS i zrównoważono 3 ml buforu MACS. Kolumnę przemyto 3 x 3 ml buforu MACS. Komórki w przemytej frakcji zebrano, a następnie stosowano jako limfocyty NK. Czystość oznaczona za pomocą ekspresji CD56 wynosiła między 88-98%.
8. Oznaczenie ADCC
PBMC lub NK jako komórki efektorowe przygotowano jak to opisano powyżej. Stosunek efektora do celu wynosił 25 : 1 i 10 : 1 odpowiednio dla komórek PBMC i NK. Komórki efektorowe przygotowano w pożywce AIM-V w odpowiednim stężeniu w celu dodania 50 pl na studzienkę na 96studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Komórki docelowe dla przeciwciał C2B8 stanowiły komórki SKW6,4 lub komórki chłoniaka z limfocytów B Namalwa hodowane w DMEM zawierającym 10% FCS. Komórki docelowe przemyto PBS, zliczono i ponownie zawieszono w AIM-V w stężeniu 0,3 miliona na ml w celu dodania 30 000 komórek w 100 pl na mikrostudzienkę. Przeciwciała rozcieńczono w AIM-V, dodano w objętości 50 pl do uprzednio nałożonych komórek docelowych i umożliwiono związanie się z komórkami docelowymi przez 10 minut w RT. Następnie dodano komórki efektorowe i płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Zabijanie komórek docelowych oszacowano przez pomiar uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) ze zniszczonych komórek, stosując zestaw do wykrywania cytotoksyczności (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Szwajcaria). Po 4-godzinnej inkubacji płytki odwirowano przy 800 x g. 100 pl supernatantu z każdej studzienki przeniesiono do nowej przezroczystej 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Dodano 100 pl kolorowego buforu substratowego z zestawu na studzienkę. Ustalono wartości Vmax reakcji kolorowej w czytniku ELISA przy 490 nm przez co najmniej 10 minut, stosując oprogramowanie SOFTmaxPRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontaniczne uwalnianie LDH zmierzono w studzienkach zawierających jedynie docelowe i efektorowe komórki, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalnianie ustalano ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton X-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób:
((x-SR)/(MR-SR)*100, przy czym x jest średnią Vmax przy specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
9. Wiązanie FcyRIIIA na limfocytach NK
Świeżo wyizolowane limfocyty NK odwirowano przez 5 minut przy 200 x g i potraktowano 0,09% (wag./obj.) roztworem kwasu mlekowego (140 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 3,9) przez inkubowanie 3 X 5
105 komórek/ml w temperaturze pokojowej przez 5 minut, w celu usunięcia związanych z limfocytami NK IgG (De Haas M., J. Immunol., 156 : 2948 (1996)).
Komórki przemyto dwukrotnie PBS, 0,1% BSA, 0,01% azydkiem sodu i doprowadzano do stężenia 2 x 106 komórek/ml w PBS, 0,15% BSA, 0,01% azydku sodu. 5 x 105 komórek inkubowano z 0, 0,1, 0, 3, 1, 3, 10 pg/ml wariantów przeciwciała przez 30 minut w 4°C. Komórki następnie przemyto dwukrotnie i wiązanie przeciwciała wykryto przez inkubowanie z 1: 200 skoniugowanym z fluorescencyjnym izotjocjanianem kozim F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, 5
PA) i anty-ludzkimi CD56-PE w stężeniu 5 pl/5 x 105 komórek (BD Pharmingen, San Diego, CA) przez 30 minut w 4°C (Shields R., i wsp., J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740 (2002)).
Natężenie fluorescencji odnoszące się do związanych wariantów przeciwciał określono dla komórek CD56+ na FACSalibur (BD Bioscience, San Jose, CA).
10. Wiązanie FCgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji
Komórki limfocytów B ludzkiego chłoniaka Raji przemywano 20 minut w 37°C w PBS (stężenie 0,3 komórek Mio/ml). Komórki następnie zawieszono przy 2,22 milionów komórek/ml w PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3 i dodano 180 pl na probówkę FACS. Dziesięciokrotne rozcieńczenia przeciwciała (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 pg/ml) monoklonalnych przeciwciał niezmodyfikowanych w pozycji L19 i z modyfikacją glikozylacji w pozycji L19 dodano do komórek Raji i inkubowano w 4°C przez 30 minut (końcowe stężenie komórek 2 miliony komórek/ml). Po dwóch przemyciach, 1 : 200 skoniugowanego z fluorescencyjnym izotjocjanianem koziego F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) dodano do komórek i inkubowano w 4°C przez 30 minut. Po jednym przemyciu, komórki zawieszono w 0,5 ml PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3, a natężenie fluorescencji odnoszące się do związanych odmian przeciwciała określono na FACSalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) dla żyjących komórek.
11. Oznaczenie cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Komórki docelowe zliczono, przemyto PBS, zawieszono w AIM-V (Invitrogen) przy 1 milionie komórek na ml. W 96-studzienkowej płaskodennej płytce umieszczono po 50 pl komórek na studzien36
PL 222 220 B1 kę. Rozcieńczenia przeciwciał przygotowano w AIM-V i dodano w objętości 50 μl do komórek. Przeciwciałom umożliwiono wiązanie się do komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dopełniacz ludzkiej surowicy (Quidel) rozmrożono na świeżo, rozcieńczono 3-krotnie AIM-V i dodano w 50 μl do studzienek. Dopełniacz króliczy (Cedarlane Laboratories) przygotowano w sposób opisany przez producenta, rozcieńczono 3-krotnie w AIM-V i dodano do studzienek po 50 μ!. Jako kontrolę, przed dodaniem do oznaczenia surowicez komplementem podgrzano przez 30 minut w 56°C.
Płytki do oznaczeń inkubowano przez 2 godziny w 37°C. Zabijanie komórek określono pomiarem uwalniania LDH. W skrócie, płytki odwirowano przy 300 x g przez 3 minuty. 50 μl supernatantu na studzienkę przeniesiono na nową 96-studzienkową płytkę i dodano 50 μl reagenta do oznaczenia z zestawu Cyto-toxicity (Roche). Przez kinetyczny pomiar z użyciem czytnika ELISA określono Vmax odpowiadającą stężeniu LDH w supernatancie. Maksymalne uwalnianie określono przez inkubację komórek w obecności 1% Triton X-100.
Wyniki i dyskusja
Glikomodyfikowane wariantyy chimerowych przeciwciał IgG1 anty-CD20 (przeciwciało chimerowe C2B8, znane również jako rituximab) wytworzono przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących różne polipeptydy o aktywności GnT III. Odmiana niezmodyfikowana (bez glikomodyfikacji) tego samego przeciwciała była wytwarzana przez transfekowanie ssaczych komórek jedynie wektorem do ekspresji genu przeciwciała. Transfekowane komórki trzymano w hodowli przez co najmniej trzy dni, a wydzielone, zrekombinowane przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej za pomocą chromatografii powinowactwa Białka A. Ekspresja genów kodujących polipeptydy o aktywności GnT III nie miała znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciała, w odniesieniu do komórek niewytwarzających takich polipeptydów.
Oczyszczone przeciwciała były następnie analizowane pod kątem ich wzorów glikozylacji. Przeciwciała te niosą N-związanych oligosacharydy dołączone jedynie do reszty Asn297 regionu Fc ludzkiego IgG1. Oligosacharydy były enzymatycznie usuwane z przeciwciał przez trawienie PNGaząF, a następnie analizowane za pomocą MALDI/TOF-MS. Stosując tę technikę, możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, pierwotnej populacji oligosacharydów Fc i możliwe jest także przypisanie danych struktur do różnych pików widma (Umana, P., i wsp., Natura Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Na Fig. 1 przedstawiono neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS ze zrekombinowanego, chimerowego przeciwciała IgG1 C2B8 anty-CD20 wytworzonego w komórkach BHK. Komórki te transfekowano wektorem ekspresyjnym dla przeciwciała pETR1502. Na Fig. 2 do 4 przedstawiono odpowiednie profile dla tego samego przeciwciała wytworzonego przez komórki BHK poddane manipulacji kwasami nukleinowymi kodującymi polipeptydy o aktywności GnT III. Profil na Fig. 2 pochodzi z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego GnT III typu dzikiego podlegającego ekspresji z wektora pETR1166. Profil na Fig. 3 wynika z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N domenę lokalizacji GnT I połączoną z końcem C domeny katalitycznej GnT III. Ten gen fuzyjny podlegał ekspresji z wektora pETR1425. Profil na Fig. 4 wynika z zastosowania kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową zawierającą na końcu N domenę lokalizacji α-mannozydazy II (Man II) aparatu Golgiego połączoną z domeną katalityczną GnT III. Ta fuzja genowa była poddawana ekspresji z wektora pETR1506.
Niezmodyfikowane przeciwciało ma typowy profil oligosacharydowy (Fig. 1), z pikami o stosunkachh m/z 1485, 1648 i 1810 zgodnymi dla dwuantenowymi, złożonych oligosacharydów o fukozylowanym rdzeniu, z odpowiednio 0, 1- i 2- resztami galaktozowymi. Podobne profile stwierdzono dla oligosacharydów regionów Fc niezmodyfikowanych przeciwciał IgG1 wytwarzonych przez inne standardowe ssacze, przemysłowe linie komórkowe takie, jak CHO i komórki mysiego szpiczaka (Lifely, M.R. i wsp., Glycobiology 5 : 813-822 (1995)). Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało przez ekspresję GnT III typu dzikiego prowadzi głównie do przeciętych, z fukozylowanym rdzeniem, złożonych, dwuantenowych oligosacharydów (Fig. 2) z pikami o stosunkach m/z 1689, 1851 i 2014, stanowiącymi przecięte odpowiedniki dla pików nie-przeciętych fukozylowanych oligosacharydów charakterystycznych dla przeciwciała niezmodyfikowanego. Manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciało za pomocą ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową GnTI-GnT III, przy czym domena katalityczna GnT III zlokalizowana jest przez domenę lokalizacji GnT I Golgi, prowadzi także do powstania głównie przeciętych, złożonych oligosacharydów dwuantenowych (zauważ piki przy m/zI 1689 i 1851 na Fig. 3). Jednakże w porównaniu z GnT III typu dzikiego,
PL 222 220 B1 zastosowanie fuzji GnT I-GnT III prowadzi do zwiększenia ilości przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur (porównaj stosunki pików z m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 w odniesieniu do całkowitego, między Fig. 2 i 3). Synteza przeciętych niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur pochodzi ze współzawodnictwa, dla oligosacharydowych substratów modyfikowanych GnT I pomiędzy zrekombinowaną domeną katalityczną GnT III oraz (i) rdzeniem endogennym, a1,6-fukozylotransferazą, (ii) α-mannozydazą II aparatu Golgiego (Man II) i (iii) GnT II, ponieważ po zmodyfikowaniu oligosacharydu tnącą na dwie części GlcNAc dodana na drodze reakcji katalizowanej przez GnT III, te trzy pozostałe enzymy nie mogą więcej modyfikować przeciętych oligosacharydów. Zatem blokowanie działania Man II przez dodanie tnącej GlcNAc skutecznie blokuje także GnT II, ponieważ GnT II działa poniżej Man II w szlaku biosyntezy N-związanych oligosacharydów. Piki przy m/z 1664 i 1826 są niefukozylowane, podczas gdy piki przy m/z 1810 i 1973 są fukozylowane. Trawienie glikozydazą EndoH, dzięki któremu można rozróżnić oligosacharydy hybrydowe i złożone (Fig. 8A), zastosowano w celu potwierdzenia, że wzrost tych pików spowodowany jest wzrostem udziału przeciętych połączonych z Fc, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych oligosacharydów (patrz poniżej).
W przeciwieństwie do innych zastosowanych tutaj kwasów nukleinowych kodujących aktywność GnT III, manipulowanie komórkami wytwarzającymi przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III (SEK. NR ID: 12), gdzie domena katalityczna GnT III umieszczana jest przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur (zauważ piki przy m/z 1664, 1810, 1826 i 1973 na Fig. 4). Zatem, w porównaniu z typem dzikim GnT III i fuzją GnT I-GnT III (SEK. NR ID: 14 i 15) fuzja Man II-GnT III była wydajniejsza w syntetyzowan iu przyłączonych do Fc przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych oligosacharydów (porównaj stosunki pików z m/z 1664 i 1810 w odniesieniu do całości pmiędzy Fig. 2, 3 i 4). Proporcje przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów-Fc powstałych z ekspresji kwasów nukleinowych kodujących dziki typ GnT III, fuzji GnT I-GnT III oraz fuzji Man II-GnT
II wynosiły w przybliżeniu odpowiednio 4, 13 i 33%. Nie wykrywano przeciętych oligosacharydów w niezmodyfikowanym (niemanipulowanym) przeciwciele.
Zwiększanie ekspresji konstruktu fuzyjnego Man II-GnT
III w komórkach wytwarzających przeciwciało prowadziło do dalszego wzrostu w udziale przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów. Zostało to wykazane przez ekspresję konstruktu Man IIGnT III z wektora (pETR1519) z OriP dla episomalnej replikacji w stransfekowanych komórkach HEK293-EBNA. Ten układ ekspresyjny znany jest z prowadzenia do wysokich poziomów ekspresji i był także stosowany do ekspresji genów przeciwciała z wektora pETR1520. Profil oligosacharydowy z oczyszczonego, niezmodyfikowanego (bez manipulacji glikozylacją) przeciwciała wyrażanego na wysokich poziomach w tym układzie przedstawiono na Fig. 5, która ponownie ukazuje typowy profil oligosacharydowy z pikami nieprzeciętych, fukozylowanych oligosacharydów mających 0, 1 i 2 reszty galaktozowe (np., porównaj Fig. 1 i 5 ukazujące podobne profile oligosacharydowe niezmodyfikowanego przeciwciała wyrażanego w komórkach BHK lub na wyższych poziomach w komórkach HEK293EBNA). Manipulacja komórkami wytwarzającymi przeciwciało z kwasem nukleinowym kodującym fuzję Man II-GnT III podlegającym ekspresji na wyższych poziomach w tym układzie prowadziła do wytwarzania przeciwciał, w których większość oligosacharydów-Fc było przeciętych, niefukozylowanych (patrz Fig. 6, gdzie piki hybrydowych, niefukozylowanych, przeciętych oligosacharydów przy m/z 1664 i 1826 stanowią razem ponad 90% wszystkich oligosacharydów).
Jak wspomniano powyżej, w celu potwierdzenia przypisania przeciętych niefukozylowanych i przeciętych hybrydowych struktur z różnymi pikami oligosacharydów obserwowanymi w profilach MALDI stosowano endoglikozydazę H (EndoH). Profile oligosacharydów neutralnych MALDI/TOF-MS glikanów trawionych PNGaząF i PNGaząF+EndoH, uzyskanych z chimerowego przeciwciała IgG1 anty-CD20, wytworzonych przez komórki HEK293 z manipulacją glikozylacji przez nadekspresję GnT III(M2), przedstawiono na Fig. 7. Pik przy m/z 1664 może być przypisany dwóm różnym glikanom, mianowicie niefukozylowanemu hybrydoprzeciętemu lub niefukozylowanemu złożonemu, nieprzeciętemu. Różne struktury ukazują taki sam stosunek m/z z powodu takiej samej mieszaniny monosacharydowej (Fig. 8B). Trawienie glikanów uwolnionych PNGaząF za pomocą endoglikozydazy H wytwarza nowe struktury, z głównym pikiem przesuniętym z m/z 1664 do 1460 (Fig. 7B). Różnica odnosi się do masy reszty GlcNAc. Jak wspomniano powyżej EndoH nie może trawić oligosacharydów złożonego.
PL 222 220 B1
Zatem, główny pik przy m/z 1664 może być określony jako typ niefukozylowany hybrydowy przecięty po trawieniu endoglikozydazą H.
Inne piki, mogą być przypisane do złożonych lub hybrydowych przeciętych glikanów. Przy m/z 1810; po trawieniu EndoH pik znika, zatem struktury mogą być przypisane do fukozylowanego hybrydowego przeciętego typu. Odjęcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy (z rdzenia a-1,6 fukozylowanego, reszta GlcNAc końca redukującego) z piku m/z 1810 wytwarza strukturę o m/z 1460. Przy m/z 1502 zniknięcie tego piku przez trawienie EndoH (wyeliminowana reszta GlcNAc) i pojawienie się piku przy m/z 1298, ukazuje, że pik 1502 może być przypisany do niefukozylowanego hybrydowego przeciętego typu. Przy m/z 1547 zniknięcie piku po trawieniu EndoH ukazuje, że pik ten jest fukozylowaną hybrydową przeciętą strukturą. Usunięcie jednej reszty GlcNAc i jednej reszty fukozy wytwarza strukturę o m/z 1298. Pik przy m/z 1826, niefukozylowany hybrydowy przeciety typ był trawiony przez EndoH. Wytworzyło to strukturę z m/z 1622. Pik przy m/z 1053 po trawieniu EndoH może być przypisany do typu wielomannozowego(1257 m/z), strawionego przez EndoH. Pik przy m/z 1689 (złożony przecięty) nie był naruszony przez trawienie EndoH, jak się spodziewano. W syntezie, z danych uzyskanych w Tab. 1, stwierdzono, że 88% struktur oligosacharydowych niesie przeciętą GlcNAc, z których 60% to struktury oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych przeciętych, 22% fukozylowanych hybrydowych przecietych, a 6% fukozylowanych złożonych przeciętych.
T a b e l a 1. | Przypisanie oligosacharydów | |||||
m/z | Możliwe struktury | Względny % przed EndoH | Oczekiwany m/z po EndoH | Obserwowany m/z po EndoH | Względny % po EndoH | Przypisanie |
1256 | Wielomanno- | 9 | 1053 | 1053 | 11 | Wielomanno- |
zowa | zowa (9%) | |||||
1502 | Niefukoz. | 7 | 1298 lub | 1298 | 13 | Niefukoz. |
hybrydowa | 1502 | - | hybrydowa | |||
przecięta lub | przecięta | |||||
niefukoz. złożona | (7%) | |||||
1647 | Fukoz. | 7 | 1298 lub | 1298 | 13 | Fukoz hybry- |
hybrydowa | 1647 | - | dowa prze- | |||
przecięta lub fukoz. złożona | cięta (7%) | |||||
1664 | Niefukoz. | 49 | 1460 lub | 1460 | 60 | Niefukoz. |
hybrydowy prze- | 1664 | hybrydowa | ||||
cięta lub niefukoz. | przecięta | |||||
złożona | (49%) | |||||
1689 | Fukoz złożona | 3 | 1689 | 1689 | 5 | Fukoz. |
przecięta | złożona przecięta(3%) | |||||
1810 | Fukoz hybrydowa | 15 | 1460 lub | 1460 | 60 | Fukoz. |
przecięta lub | 1810 | 1810 | 2 | hybrydowa | ||
fukoz. złożona | przecięta (13%) i fukoz. złożona (2%) | |||||
1826 | Niefukoz. | 4 | 1622 | 1622 | 7 | Niefukoz |
hybrydowa | hybrydowa | |||||
przecięta | przecięta (4%) | |||||
1851 | Fukoz. złożona | 3 | 1851 | 1851 | 2 | Fukoz. złożo- |
przecięta | na przecięta (3%) | |||||
1972 | Fukoz hybrydowa | 3 | 1622 | 1622 | 7 | Fukoz. hy- |
przecięta | brydowa |
przecięta (3%)
PL 222 220 B1
Równowagi mas (w molach frakcji w %):
a) Piki przy m/z 1502 oraz 1647: 7 + 7% = 14% (oczekiwana). Trawienie EndoH dla obu pików daje m/z 1298 (otrzymane 13% po EndoH).
b) Piki przy m/z 1664 i 1810:49 + 13% = 62%. EndoH daje m/z 1460 (otrzymane 60%)
c) Piki przy m/z 1826 i 1972: 4 + 3% = 7%. EndoH daje m/z 1622 (7%)
Podsumowanie:
Całkowity względny procent struktur niosących przeciętą GlcNAc: 88% niefukozylowany hybrydowy przeciety: 60% fukozylowany hybrydowy dwuczęściowy: 22% fukozylowany złożony przecięty: 6%
Powyższe dane (Fig. od 1 do 6) wskazują, że zarówno poziom ekspresji GnT III jak i szczególnej domeny lokalizacji stosowanej do umieszczenia domeny katalitycznej GnT III w aparacie Golgiego, wpływają na współzawodnictwo o oligosacharydowe substraty modyfikowane GnT I między zrekombinowaną domeną katalityczną GnT III a endogenną rdzenną α 1,6-fukozylotransferazą, enzymami (Man II) i GnT II. Wyższa ekspresja GnT III daje jej przewagę w tym współzawodnictwie, prowadząc do wyższych poziomów przeciętych, hybrydowych i przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów oraz do towarzyszącej redukcji poziomów przeciętych, złożonych i przeciętych fukozylowanych oligosacharydów. Było to również stwierdzone wcześniej dla GnT III typu dzikiego (Umana, P., i wsp., Nature Biotechnol 17 : 176-180 (1999)). Jednak, pomimo, że prowadzi do powstania podobnych całkowitych poziomów przeciętych oligosacharydów, umiejscowienie domeny katalitycznej GnT III przez domeny lokalizacji GnT I lub Man II prowadziło do skuteczniejszego współzawodnictwa, w stosunku do GnT III typu dzikiego dla substratów oligosacharydów zmodyfikowanych GnT I względem endogennego rdzenia α 1,6-fukozylotransferazy, enzymów Man II i GnT II.
Wyższą wydajność fuzji GnT I-GnT III w porównaniu z GnT III typu dzikiego dla syntezy przeciętych, hybrydowych i przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów można wyjaśnić przez wcześniejszą dystrybucję w aparacie Golgiego, w kierunku od cis do trans transportu substratu glikoproteinowego GnT I w stosunku do GnT III. Dokładną dystrybucję GnT I i Man II w aparacie Golgiego ustalono wcześniej za pomocą ilościowej mikroskopii immunoelektronowej (Rabouille, C., i wsp., J. Cell Sci. 108: 1617-27 (1995)). Oba enzymy rozmieszczone są razem wzdłuż aparatu Golgiego, lokalizując się głównie w cysternach przyśrodkowych i trans stosu aparatu Golgiego, z wyższymi poziomami w cysternach przyśrodkowych w porównaniu z cysternami trans. Dokładne ilościowe przestrzenne rozmieszczenia rdzenia α 1,6-fukozylotransferazy, GnT II i GnT III typu dzikiego nie zostały jeszcze ustalone. Powyższe dane nie wyjaśniają jedna, dlaczego fuzja Man II-GnT III jest znacząco wydajniejsza niż fuzja GnT I-GnT III, w syntezie przeciętych, hybrydowych i przecietych, niefukozylowanych oligosacharydów, ponieważ zarówno GnT I jak i Man II mają identyczne przestrzenne rozkłady wzdłuż subkompartmentów aparatu Golgiego.
Wyższa wydajność fuzji Man II-GnT III wskazuje na istnienie względnie zorganizowanych funkcjonalnych subkompartmentów reakcji glikozylacji wśród fizycznych subkompartmentów cysterny przyśrodkowej i trans aparatu Golgiego. Przyjmuje się, że tak zwane „enzymy glikozylacji środkowego aparatu Golgiego”, GnT I, GnT II i Man II występują w aparacie Golgiego w postaci kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. Jednak, jeżeli domeny lokalizacji umożliwiają tym enzymom tworzenie części tych kompleksów, tak samo byłoby dla fuzji GnT I- i Man II-GnT III. Ekspresja zrekombinowanej fuzji GnT I-GnT III nie doprowadziła do zastąpienia endogennego enzymu GnT I typu dzikiego w stopniu znaczącym dla syntezy Fc-oligosacharydów, ponieważ wszystkie zastosowane tutaj konstrukty GnT III prowadziły do większości oligosacharydów modyfikowanych w reakcjach przeprowadzanych zarówno przez GnT I, jak i GnT III.
Dane nasze wskazują, że za pomocą domeny lokalizacji Man II, ma miejsce bardziej specyficzne funkcjonalne parowanie pomiędzy domenami katalitycznymi endogennego GnT I a zrekombinowaną fuzją Man II-GnT III. Wiadomo, że zorganizowane parowanie enzymów katalizujących kolejne reakcje na szlaku biosyntezy, w sposób, który promuje przenoszenie produktu pierwszej reakcji do drugiego miejsca katalitycznego w stosunku do przenikania takiego produktu od enzymów, ma miejsce w innych szlakach biosyntezy, takich, jak glikoliza i biosynteza poliketydów. Obserwowano tworzenie przez GnT I i Man II „pokrewnych oligomerów”, przynajmniej podczas przemieszczania się jednego z tych enzymów do siateczki wewnątrzplazmatycznej (Nilsson, T. i wsp., EMBO J. 13(3). 562-74 (1994)). Okazało się, że para naładowanych reszt aminokwasowych w każdym z rejonów struktural40
PL 222 220 B1 nych obu tych enzymów jest kluczowa dla rozpoznawania tego rodzaju pokrewieństwa. Reszty w GnT I były odwrotnie naładowane w stosunku do reszt w Man II. Zidentyfikowaliśmy podobne reszty w równoważnych miejscach regionów strukturalnych innych enzymów glikolizacyjnych aparatu Golgiego zaangażowanych w tę część szlaku biosyntetycznego N-związanych oligosacharydów, konkretnie w rdzeniu α 1,6-fukozylotransferazy (takie same ładunki jak w GnT I zamiast komplementarnych ładunków jak w przypadku Man II), Man I iz GnT II. Ustaliliśmy także, że te reszty są konserwowane u różnych gatunków. Chociaż sugerowano, że reszty te nie są istotne dla łączenia sięw tworzone przez enzymy kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej lub nawet dla lokalizacji w aparacie Golgiego (Opat, A.S. i wsp., J. Biol. Chem 275(16): 11836-45 (2000)), możliwe jest, że są one zaangażowane w bardziej specyficzne parowanie domen katalitycznych w trakcie biosyntezy oligosacharydów. Parowanie takie nie musi być nieodwracalne, ale może być zależne od przejściowego, dynamicznego oddziaływania pomiędzy enzymami. Mogą istnieć dodatkowe determinanty parowania w którejkolwiek części regionu strukturalnego lub katalitycznego. Jednak, jakikolwiek udział w specyficznym parowaniu GnT I-Man II ze strony katalitycznej domeny Man II wiązałby się z utratą zrekombinowanej fuzji niosącej katalityczną domenę GnT III.
Na Fig. 9 do 11 przedstawiono podwyższoną zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC), będącą wynikiem nadekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd o aktywności GnT III, umieszczony w aparacie Golgiego za pomocą różnych domen lokalizacji. Podwyższoną ADCC będącą wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego GnT I przedstawiono na Fig. 9. Oligosacharydowy profil dla przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 9, przedstawiono na Fig. 1. Oligosacharydowy profil dla glikozmodyfikowanego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 9, przedstawiono na Fig. 3. Podwyższona ADCC będąca wynikiem wyrażenia zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego glikozydazy, Man II, przedstawiono na Fig. 10. Oligosacharydowy profil przeciwciała kontrolnego zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 10, przedstawiono na Fig. 5. Oligosacharydowy profil glikomodyfikowanego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 10, przedstawiono na Fig. 6. Na Fig. 11 pokazano, że wyrażanie zrekombinowanego polipeptydu o aktywności GnT III umieszczonego w aparacie Golgiego za pomocą domeny lokalizacji w aparacie Golgiego Man II prowadzi do podwyższenia aktywności ADCC w porównaniu z zastosowaniem polipeptydu GnT III typu dzikiego z jego własną domeną lokalizacji w aparacie Golgiego GnT III. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną przez wyrażanie GnT III typu dzikiego, zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 11, przedstawiono na Fig. 2. Oligosacharydowy profil przeciwciała z manipulacją glikozylacji uzyskaną przez wyrażenie fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III, umieszczonego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II i zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 11, przedstawiono na Fig. 4. Dane te pokazują także, że przeciwciała zawierające przecięte oligosacharydy, w tym, przecięte hybrydowe i przecięte, niefukozylowane oligosacharydy, mają podwyższoną aktywność ADCC w porównaniu z przeciwciałami zawierającymi złożone, fukozylowane, nieprzecięte oligosacharydy. Należy zauważyć, że wszystkie spośród przeciętych oligosacharydów najbardziej aktywnego przeciwciała zastosowanego w teście ADCC widocznym na Fig. 10 są przeciętymi, niefukozylowanymi hybrydowymi oligosacharydami. Jak wspomniano uprzednio, stosowanie fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III i umieszczonej w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II prowadzi do wydajniejszej syntezy niefukozylowanych, przeciętych oligosacharydów, a na Fig. 11 pokazano, że przeciwciała o podwyższonych poziomach przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów są bardziej aktywne w teście ADCC w stosunku do przeciwciał o niższch poziomach tych oligosacharydów. Podwyższone aktywności ADCC są skorelowane ze zwiększeniem frakcji przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów w populacji oligosacharydów związanych z Fc, a znaczne wzrosty są widoczne, gdy frakcja ta jest większa niż 15 do 20%.
Wiadomo, że komórki naturalni zabójcy (NK) są ważnymi mediatorami ADCC. Komórki te niosą na swojej powierzchni receptor aktywujący Fc gamma IIIA, znany również jako CD16a. Wiązanie rejonu Fc przeciwciał połączonych z komórkami docelowymi, z receptorami Fc gammma RIIIA na komórkach NK jest istotne dla usieciowania tych receptorów na komórce NK i następującej po tym indukcji ADCC. Ważne jest, zatem oszacowanie wiązania przeciwciał wytworzonych opisanymi tutaj sposobami do receptorów Fc, a zwłaszcza do receptorów w naturalnej postaci, w której ludzkie immunologiczne komórki efektorowe je prezentują. Na Fig. 12 zademonstrowano, że przeciwciała z manipulacją
PL 222 220 B1 glikozylacji wytworzone w wyniku ekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciała, kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III, mają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego receptora aktywującego Fc gamma RIIIA. Jak wspomniano uprzednio dla oznaczeń ADCC, przeciwciała te mają podwyższone poziomy przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, co jest wynikiem wyrażenia w komórkach wytwarzających przeciwciało fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III. Komórki NK zastosowane w tym oznaczeniu pochodziły od dawcy o genotypie, który nie wyraża receptora Fc gamma RIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol. Methods 258(1-2) : 85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek jest to aktywujący receptor Fc gamma RIIIA. Na Fig. 13 pokazano, że analiza wiązania mierzy specyficzne powinowactwo wiązania się z tym receptorem. Zostało to wykazane przez współzawodnictwo z fragmentem specyficznego przeciwciała blokującego Fc gamma RIII (fragment 3G8 Fab2).
Silny dowód na wpływ wzmocnionych oddziaływań Fc-FcR na rezultat przeciwnowotworowej terapii przeciwciałami pochodzi z korelacji, stwierdzonej u pacjentów z chłoniakiem otrzymujących rituximab, między wydajnością a homozygotycznym genotypem receptora FcgammaRIIIA o wysokim powinowactwie (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)). Był to pojedynczy parametr związany z ogromnie zwiększonym tempem obiektywnej odpowiedzi oraz zwiększoną udziałem odpowiedzi cząsteczkowych. Zwiększona wydajność spowodowana wzmocnionymi oddziaływaniami FcgammaRIIIA-Fc może pochodzić z funkcji pełnionych przez różne rodzaje komórek odpornościowych, w tym, komórek naturalnych zabójców (NK), makrofagów, monocytów oraz komórek dendrytycznych. Usieciowanie aktywującego receptora Fcgamma-RIIIA na komórkach NK, makrofagach i monocytach może prowadzić do lizy komórki nowotworowej przez ADCC (powszechnie uważa się, że jest to pierwotny, zależny od FcR mechanizm zabijania in vivo) (Maloney, D. G., i wsp., Semin. Oncol. 29 (1 Suppl. 2) 2-9 (2002), Amigorena S., J. Exp. Med. 195(1); Fl-3 (2002)) oraz komórkowej fagocytozy zależnej od przeciwciał (Hazenbos, W. L., i wsp., J. Immunol. 161(6): 3026-32 (1998), Reff, M. E. i Heard, C. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 40(1): 25-35 (2001)) i uwolnienia cytokin w sąsiedztwie komórek nowotworowych (Carson, W. E., i wsp., Eur. J. Immunol. 31: 3016-3025 (2001)). Cytokiny te mogą z kolei prowadzić do kierowania wpływów cytotoksycznych na komórki nowotworowe do efektów przeciwangiogennych, które hamują wzrost nowotworu przez pozbawienie tlenu i związków odżywczych i do wzmocnionej prezentacji antygenów nowotworowych jako części odpowiedzi odpornościowej z udziałem aktywnych limfocytów T przeciwko komórkom nowotworowym. Komórki dendrytyczne mają kluczowe znaczenie w prezentowaniu antygenu limfocytom T, a usieciowanie FcgammaRIIIA na ich powierzchni (np., z wiązania z przeciwciałem obumierających komórek nowotworowych początkowo zaatakowanych in vivo na drodze ADCC) może prowadzić do zwiększonego dojrzewania komórki dendrytycznej, wychwytu antygenów i prezentacji limfocytom T oraz krzyżowego piętnowania cytotoksycznych limfocytów T będących potencjalnym, bardzo wydajnym mechanizmem aktywowania oporności przeciwnowotworowej (Amigorena S., J. Exp. Med. 195(1) : Fl-3 (2002), Kalergis, A. M., i Ravetch, J. V. J. Exp. Med. 195(12) : 1653-1659 (2002), Selenko, N., i wsp., J. Clin. Immunol. 22(3):124130 (2002)). Usieciowanieprzeciwciał związanych z komórką docelową przez receptory Fc na odpornościowych komórkach efektorowych może także prowadzić do zwiększonego bezpośredniego zabijania komórek docelowych, na przykład na drodze apoptozy indukowanej przez usieciowanie cząsteczek docelowych z antygenowymi za pośrednictwem przeciwciał (Reff, M. E. i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1): 25-35 (2001), Cragg, M. S., i wsp., Blood 101(3): 1045-1052 (2003)). Spośród wszystkich tych odpornościowych komórek efektorowych jedynie limfocyty NK posiadają na swojej powierzchni tylko aktywujący receptor FcgamaRIII. Na innych rodzajach komórek, aktywujący receptor FcgammaRIII jest obecny razem z hamującym receptorem Fcgamma-Rllb, a indukcja efektorowych funkcji przeciwnowotworowych wynika z dodatniej równowagi sygnałów aktywujących w stosunku do sygnałów hamujących.
Na Fig. 15 pokazano, że zwiększone wiązanie receptora Fc jest wybiórcze dla receptora aktywującego w stosunku do receptora hamującego FcgammaRIIb. Wybiórczość taka jest ważna dla funkcji efektorowych komórek odpornościowych innych niż limfocyty NK, jak to wyjaśniono powyżej. Ponadto, przyrosty w wiązaniu osiągnięte przez manipulację glikozylacją regionu Fc przeciwciała, z zastosowaniem opisanych tutaj sposobów, są dużo większe niż te obserwowane naturalnie dla pacjentów o homozygotycznym genotypie FcgammaRIIA o większym powinowactwie/ donorów otrzymujących standardowe, niezmodyfikowane przeciwciało (Fig. 16) oraz, że zostały już połączone z wyższą wydajnością przeciwciał anty-nowotworowych (Carton, G., i wsp., Blood 99(3): 754-8 (2002)).
PL 222 220 B1
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną z FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała ze zmienioną glikozylacją mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki efektorowe prezentujące FcgammaRIIIb, takie jak komórki granulocytowe (PMN), obejmując uwolnienie toksycznych produktów i fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1) : 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15; 203-34 (1997), Ravetch, J. V. i Holland S. Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90 (2001)).
Na Fig. 18 przedstawiono oligosacharydowy profil przeciwciała anty-CD20 wytworzonego przez komórki BHK rosnące w zawiesinie i zmodyfikowane dla celów konstytutywnej ekspresji na wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III. Oligosacharydowy profil przedstawia podwyższone poziomy przeciętych niefukozylowanych i przeciętych hybrydowych oligosacharydów przeciwciał pochodzących z komórek, poddanych manipulacji z fuzją GnT III (patrz również Tab. 2). Struktury te nie występują w przeciwciałach bez modyfikacji glikozylacji, wytworzonych przez komórki BHK bez modyfikacji glikozylacji (patrz Fig. 1). Komórki poddane manipulacji wyrażające fuzję GnT III wykazywały normalny wzrost w zawiesinie i dobrą wydajność wytwarzania przeciwciał.
Względne procenty oligosacharydów monoklonalnych przeciwciał ze zmienioną glikozylacją wytwarzanych przez stabilną linię komórkową BHK-1502-28-11 przedstawiono w Tab. 2.
T a b e l a 2: Względny procent pików uzyskany przez MALDI/TOF-MS.
1 | Pik (m/z) 1257 | Względny procent 2,5% |
2 | 1486 | 2,8% |
3 | 1647 | 6% |
4 | 1664 | 22,3% |
5 | 1680 | 2,5% |
6 | 1689 | 4,8% |
7 | 1705 | 3% |
8 | 1810 | 27,8% |
9 | 1826 | 10% |
10 | 1851 | 7,5% |
11 | 1972 | 9% |
12 | 2012 | 1,75% |
Całkowite przecięte: 88,6% (4+5+6+7+8+9+10+11+12)
Całkowite niefukozylowane przecięte: 37,8% (4+5+7+9)
Całkowite fukozylowane przecięte: 50,8% (6+8+10+11+12) Przecięte złożone: 17% (6+7+10+12)
Hybrydowe przecięte: 71,6% (4+5+8+9+11)
Analiza oligosacharydów wykazała, że 88,6% struktur zawiera przeciętą resztę GlcNAc, 50,8% jest fukozylowanych, a 37,8% jest niefukozylowanych. Trawienie uwolnionego przez PNGazę F oligosacharydu za pomocą endoglikozydazy H wykazało, że większość uzyskanych pików jest typu hybrydowego przeciętego (Fig. 19). Na Fig. 20 przedstawiono zwiększone powinowactwo wiązania przeciwciała z modyfikacją glikozylacji, wytworzonego przez linię komórkową BHK-1502-28-1 1, do aktywującego receptora Fc FcgamnaRIIIA na ludzkich limfocytach NK. Linie komórkowe rosnące w zawiesinie, z konstytutywną, stabilną ekspresją zarówno genów przeciwciał, jak i fuzji polipeptydowej GnT III są idealne do wytwarzania leczniczych przeciwciał na dużą skalę. Przy zastosowaniu standardowych sposobów manipulacji komórkowej można osiągnąć manipulację glikozylacją a albo przez wprowadzenie fuzji genowej GnT III do linii komórkowej zawierającej geny przeciwciał albo przez wprowadzenie genów przeciwciała do linii komórkowej zawierającej fuzję genową GnT III („produkcyjna linia koPL 222 220 B1 mórkowa przed manipulacją glikozylacji”) lub przez jednoczesne wprowadzenie genów przeciwciała i genów fuzji GnT III.
Przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową z aktywnością GnT III i umieszczaną w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, testowano również pod kątem lizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na odpornościowych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była przeciętego, hybrydowego, nie-fukozylowanego typu. Obniżoną aktywność CML obserwowano dla tego przeciwciała anty-CD20 w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanym (Fig. 21). Dla takich samych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższoną ADCC ale z obniżonym CML, na przykład w celu zmniejszenia skutków ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych po stronie nowotworu, w którym pośredniczą CML. Inne znaczące skutki uboczne, w których pośredniczą CML obserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4): 807-11 (2001)). Jednak, profile oligosacharydowe opisane powyżej pokazują także, że możliwe jest również zmodyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało, aby wyrażały fuzję polipeptydową GnT III na średnim poziomie ekspresji, który prowadzi do średnich poziomów przeciętych, hybrydowych, niefukozylowanych oligosacharydów (większych niż 15%), ale ze znaczącą frakcją oligosacharydów złożonych w populacji oligosacharydów Fc glikomodyfikowanego przeciwciała. Takie złożone oligosacharydy są związane z normalnymi, niezredukowanymi poziomami CML. Zatem, dane wskazujące, że przeciwciała o podwyższonym ADCC mogą być wytwarzane na tej drodze, która powinna utrzymywać bardzo podobne poziomy aktywności CML w porównaniu z niemodyfikowanymi przeciwciałami.
Drugie, chimerowe przeciwciało IgGl C225, znane także jako cetuximab, rozpoznaje ludzki receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) było poddane modyfikacji glikozylacji sposobami tu opisanymi. Na Fig. 22 przedstawiono profile oligosacharydowe niemodyfikowanego przeciwciała anty-EGFR C225 i wersji tego samego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji. To ostatnie było wytwarzane w komórkach z ekspresją kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnTIII i lokalizowane w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II. Na Fig. 23 przedstawiono podwyższoną ADCC dla przeciwciała anty-EGFR wynikające z modyfikacji jego glikozylacji. Przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane opisanymi tutaj sposobami i mające podwyższoną ADCC oraz podwyższone powinowactwo wiązania do aktywujących receptorów Fc, są obiecującymi cząsteczkami do terapii przeciwciałami nowotworu oraz chorób autoimmunologicznych, ponieważ powinny prowadzić do zwiększonej wydajności, w porównaniu z odpowiadającą niezmodyfikowaną (bez modyfikacji glikozylacji) wersją tych przeciwciał, dla tych terapii. Dodatkowo powinno być możliwe obniżenie dawek leczniczych przeciwciał z modyfikacją glikozylacji w porównaniu z przeciwciałami niezmodyfikowanymi, a to pozytywnie wpłynie na ekonomikę wytwarzania przeciwciał.
P r z y k ł a d 2
Leczenie immunozależnej małopłytkowości u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi
Autoimmunologiczna małopłytkowość w przewlekłej chorobie przeszczepu przeciwko gospodarzowi reprezentuje przypadek dysregulacji limfocytów B prowadzącej do choroby klinicznej.
W celu leczenia małopłytkowości immunozależnej u pacjenta z przewlekłą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi, pacjentowi podawane jest chimerowe monoklonalne przeciwciało antyCD20 wytworzone sposobami ujawnionymi w niniejszym wynalazku i mające podwyższone ADCC, jak to opisano w Ratanatharathorn, V., i wsp., Ann. Inter. Med. 133(4): 275-79 (2000), (której cała zawar2 tość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, cotygodniowa infuzja 375 mg/m2 przeciwciała jest podawana pacjentowi przez 4 tygodnie. Terapia przeciwciałami powoduje znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i spadek poziomów przeciwciała związanego z płytkami krwi.
P r z y k ł a d 3
Leczenie ciężkiej immunozależnej aplazji układu czerwonokrwinkowego i anemii hemolitycznej
Immunozależna, nabyta aplazja układu czerwonokrwinkowego (PRCA) to rzadkie schorzenie, często związane z innymi zjawiskami autoimmunologicznymi. W celu leczenia immunozależnaj , nabytej aplazji układu czerwonokrwinkowego pacjenta, chimerowe monoklonalne przeciwciało anty-CD20 wytworzone sposobami ujawnionymi w niniejszym wynalazku i mające podwyższoną ADCC podawane jest pacjentowi, jak to zostało opisane w Zecca, M., i wsp., Blood 12: 3995-97 (1997) (której cała zawartość włączona jest tu w całości jako odniesienie). Szczegółowo, pacjentowi z PRCA i autoimmu44
PL 222 220 B1 2 nologiczną anemią hemolityczną podaje się dwie dawki 375 mg/m2 przeciwciała tygodniowo. Po terapii przeciwciałami rozpoczyna się leczenie zastępcze dożylną immunoglobuliną. Leczenie to wytwarza znaczny spadek limfocytów B we krwi obwodowej i znaczny wzrost liczby retikulocytów związany ze wzrostem poziomów hemoglobiny.
P r z y k ł a d 4
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych fuzji GalT
Wektor do konstytutywnego wyrażania GalT
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla GalT, cDNA GalT jest powielane z biblioteki cDNA (Clontech) za pomocą PCR. Dodawany jest C-końcowy znacznik epitopu c-myc zaraz powyżej kodonu stop genu (sekwencja aminokwasowa; PEQKLI-SEEDL), w celu późniejszego, dogodnego wykrywania GalT za pomocą testów Western biot. Po potwierdzeniu poprawnej sekwencji GalT, gen umieszczany jest pod kontrolą promotora MPSV i dodawany jest sztuczny sygnał poliadenylacji króliczej betaglobiny. Końcowy wektor ekspresyjny GalT, zawiera również oddzielną kasetę oporności na puromycynę w celu selekcji, z genem oporności na puromycynę również znajdującym się pod kontrolą promotora MPSV oraz sztucznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiego GnTI.
Konstruowanie takiego hybrydowego genu galaktozylotransferazy przeprowadza się, na przykład, przez reakcje zachodzącego PCR, w wyniku, czego powstaje plazmid zawierający fuzję GnTIGalT pod kontrolą promotora MPSV oraz kasetę oporności na puromycynę do celów selekcji.
Zastąpienie aminokwasów tworzących domenę lokalizacji GalT aminokwasami tworzącymi domenę lokalizacji ludzkiej mannozydazy II.
Przeprowadza się konstruowanie wektora ekspresyjnego GalT. Powstały plazmid zawiera hybrydowy gen Man II-GalT będący pod kontrolą promotora MPSV.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT z miejscem inicjacji replikacji oriP pochodzącym z wirusa Epsteina Barra.
Fragment DNA zawierający oriP jest subklonowany w sposób opisany w Przykładzie 1, do op isanego powyżej hybrydowego wektora ekspresyjnego Man II-GalT.
Łączenie hybrydowego genu fuzji Man II-GalT ze skróconym genem powierzchniowego znacznika komórek CD4.
Wektor ekspresyjny jest modyfikowany do celów dodatkowej ekspresji skróconego genu powierzchniowego znacznika komórek CD4. W skrócie, kaseta ekspresji hybrydowego genu fuzji Man II-GalT przekształcana jest z jednocistronowej na dwucistronową kasetę ekspresyjnej przez wstawienie, poniżej kodonu stop fuzji Man II-GalT, elementu IRES pochodzącego z wirusa polio, za którym leży cDNA kodujące skrócone białko ludzkiego CD4 (zawierające sekwencję liderową ludzkiego CD4 do wydzielania, za którą leżą domeny transbłonowa oraz zewnątrzkomórkowa).
3. Transfekcja komórek ssaczych ekspresyjnymi wektorami dla fuzji GalT i przeciwciał
Transfekcja komórek BHK
Komórki w wykładniczej fazie wzrostu (żywotność 90-95%) są hodowane, zbierane, a następnie transfekowane w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji komórki są kotransfekowane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GalT odpowiednio w stosunku 4 : 1.
Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w wykładniczej fazie wzrostu są transfekowane w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytwarzania przeciwciał z modyfikacją glikozylacji, komórki są kotransfekowane dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała i drugim do wyrażania fuzji polipeptyd owej GAlT odpowiednio w stosunku 4 : 1. 5 dnia po transfekcji, supernatant jest zbierany, odwirowywany przez 5 minut przy 1200 obr./min., po czym ponownie odwirowywany przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymany w 4°C.
Wytwarzanie stabilnej ssaczej linii komórkowej wyrażającej zrekombinowane przeciwciało antyCD20 oraz fuzyjne GAlT.
Klon BHK-1502-28, w którym konstytutywnej ekspresji ulegają geny monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 oraz gen oporności na neomycynę, transfekowany jest wektorem ekspresyjnym przez elektroporację. Wektor umożliwia konstytutywną ekspresję genu Man II-GalT iskróconej formy ludzkiego CD4, przy czym ekspresja ostatniego zależna jest od IRES. Wektor zawiera także kasetę eksPL 222 220 B1 presyjną genu oporności na puromycynę. Klony oporne na puromycynę są najpierw poddawane selekcji w celu uzyskania zestawu klonów, mających wektor DNA zintegrowany z chromosomem. Klony są następnie przeszukiwane pod względem powierzchniowego wyrażania skróconego CD4 (tCD4), który służy jako znacznik poziomu ekspresji dwucistronowej jednostki ekspresyjnej genu Man II GalT+tCD4. Wytwarzanie zrekombinowanego przeciwciała przez wyselekcjonowane klony jest weryfikowane z zastosowaniem testu ELISA.
Transfekcja, po której następuje przeszukiwanie pod względem poziomu ekspresji tCD4 przeprowadzana jest w sposób opisany w Przykładzie 1.
4. Wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał niezmodyfikowanych i z modyfikacją glikozylacji
W przypadku komórek BHK transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjnego GalT, supernatant z hodowli zbierany jest po hodowli transfekowanych komórek przez 96 godzin po przeprowadzeniu transfekcji.
W zależności od oczekiwanej wydajności, dokonywanych jest kilka elektroporacji (10-15) dla tego samego wektora.
W przypadku komórek HEK293-EBNA transfekowanych wektorem ekspresyjnym przeciwciała lub kotransfekowanych wektorem ekspresyjnym wraz z wektorem ekspresyjnym fuzyjnego GAlT, pożywka hodowlana zastępowana jest świeżą pożywką hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, po czym ta ostatnia jest zbierana po hodowli transfekowanych komórek przez kolejne 120 godzin.
Dla stabilnej linii komórkowej BHK-1502-28-11, hodowla jest wysiewana w liczbie 500 000 komórek/ml, a supernatant zbierany po 4 dniach hodowli.
Oczyszczanie przeciwciał
Monoklonalne przeciwciało oczyszczane jest z hodowlanego supernatantu przy zastosowaniu dwóch kolejnych etapów chromatografii, chromatografii białka A oraz chromatografii kationowymiennej w sposób opisany w Przykładzie 1.
5. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy są w sposób enzymatyczny uwalniane z przeciwciał przez trawienie PNGazą F, przy czym przeciwciała są unieruchomione na błonie PVDF lub znajdują się w roztworze.
Uzyskany roztwór trawienny zawierający uwolnione oligosacharydy jest albo przygotowywany bezpośrednio do analizy MALDI/TOF-MS albo dalej trawiony glikozydazą EndoH przed przygotowywaniem próbek do analizy MALDI/TOF-MS.
Sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał unieruchomionych na błonie PVDF oraz sposób uwalniania oligosacharydów dla przeciwciał w roztworze są przeprowadzane tak, jak opisano w Przykładzie 1.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGazą F do przypisania struktur hybrydowych galaktozylowanych oligosacharydów do pików neutralnych oligosacharydów MALDI/TOF-S
Oligosacharydy uwolnione za pomocą PNGazy są następnie trawione endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96) w sposób opisany w Przykładzie 1.
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające enzymatyczne trawienia zawierające uwolnione oligosacharydy są przyg otowywane, a następnie analizowane w spektrometrze masowym MALD/TOF w sposób opisany w Przykładzie 1.
6. Przygotowywanie i izolacja komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywane są z zastosowaniem Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy oraz protokołem opisanym w Przykładzie 1.
Ludzkie limfocyty NK są izolowane z PBMC z zastosowaniem procedury negatywnej selekcji jak opisano w Przykładzie 1.
8. Test ADCC
PBMC lub NK jako komórki efektorowe są przygotowywane w sposób opisany powyżej i oznaczone po względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w sposób opisany w Przykładzie 1.
9. Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji.
PL 222 220 B1
Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb na komórkach chłoniaka Raji ustalane jest w sposób opisany w Przykładzie 1.
10. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza są przeprowadzane z zastosowaniem roztworów przeciwciał zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 1.
Wyniki i Dyskusja
Przeprowadzane są testy w celu ukazania wpływu ekspresji genów kodujących polipeptydy o aktywności GalT na żywotność komórek, wzrost komórkowy lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu z komórkami nie wytwarzającymi takich polipeptydów. Oczyszczone przeciwciała są analizowane pod względem wzorów ich glikozylacji za pomocą MALDI/TOF-MS w sposób opisany w Przykładzie 1. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oligosacharydów-Fc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym pikom w widmach (Umana P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)).
Ustalany jest profil oligosacharydowy przeciwciała niezmodyfikowanego. Szczegółowo, ustalone jest czy modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję GalT typu dzikiego prowadzi głównie do oligosacharydów galaktozylowanych, złożonych dwuantenowych o fukozylowanym rdzeniu. Ustalane jest także czy w porównaniu z GalT typu dzikiego modyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciała przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową GnT1-GAlT, w którym katalityczna domena GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji GnT I aparatu Golgiego, prowadzi głównie do powstania galaktozylowanych złożonych dwuantenowych oligosacharydów. Jeśli zsyntetyzowane zostaną galaktozylowane, niefukozylowane i galaktozylowane struktury hybrydowe, może to wynikać ze współzawodnictwa między GalT a innymi glikozylotransferazami lub glikozydazami. Oczekuje się, że jak tylko oligosacharyd jest zmodyfikowany galaktozą dodaną na drodze reakcji katalizowanej przez GalT, rdzeń a 1,6-fukozylotransferazy, α-mannodydaza II aparatu Golgiego (Man II) oraz GnT II nie mogą dłużej modyfikować galaktozylowanych oligosacharydów.
Trawienie galaktozydazą EndoH, które może rozróżnić oligosacharydy hybrydowe i złożone, stosuje się do oceny udziału galaktozylowanych oligosacharydów niefukozylowanych połączonych z Fc oraz oligosacharydów galaktozylowanych, hybrydowych.
Przeprowadzane są testy w celu ustalenia czy modyfikacja komórek wytwarzających przeciwciało przez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GalT, gdzie domena katalityczna GalT jest lokalizowana przez domenę lokalizacji Man II aparatu Golgiego, prowadzi głównie do galaktozylowanych, niefukozylowanych i galaktozylowanych hybrydowych oligosacharydów. W szczególności ustalane jest czy w stosunku do dzikiego typu GalT i do fuzji GnT I-GaIT, fuzja Man II-GalT jest wydajniejsza w syntezie oligosacharydów galaktozylowanych, niefukozylowanych, połączonych z Fc oraz galaktozylowanych, hybrydowych.
Jak wspominano powyżej, endoglikozydaza H (EndoH) stosowana jest do potwierdzenia przypisania galaktozylowanych niefukozylowanych i galaktozylowanych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych obserwowanych w profilach MALDI. Spośród reszt galaktozydowych oligosacharydów, które niosą resztę galaktozową, ustalane są procentowe udziały tych struktur, które są strukturami oligosacharydów niefukozylowanych hybrydowych, fukozylowanych hybrydowych oraz fukozylowanych złożonych.
Określany jest wpływ poziomu ekspresji GalT i konkretnej domeny lokalizacji, która jest stosowana do nakierowania domeny katalitycznej GalT do aparatu Golgiego, na współzawodnictwo dla substratów oligosacharydowych modyfikowanych GnT I między rekombinowaną domeną katalityczną GalT i endogennym rdzeniem a 1,6-fukozylotransferazy, enzymów Man II i GnT II. Określany jest poziom komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) wynikający z nadekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało, kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd o aktywności GalT, który umieszczany jest w aparacie Golgiego przez różne domeny lokalizacji.
Określane jest także, czy przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzane przez ekspresję w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GalT, mają zwiększone powinowactwo wiązania do ludzkiego aktywującego receptora Fc FcgammaRIIIA, czy też do hamującego receptora FcgammaRIIb.
Konstrukty GalT będą przewyższać aktywność enogennego rdzenia a 1,6-fukozylotransferazy, modyfikując glikozylację rejonu Fc przeciwciała i w konsekwencji zwiększając ADCC.
PL 222 220 B1
Określany jest profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytwarzanego w komórkach BHK wzrastających w zawiesinie i modyfikowanego w celu konstytutywnej, ekspresji na wysokim poziomie zarówno przeciwciała rekombinowanego, jak i fuzji polipeptydowej o aktywności GalT. Określane są także względne udziały procentowe oligosacharydów monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji wytwarzanego w stabilnej linii komórkowej BHK1502-28-11.
P r z y k ł a d 5
Materiały i Metody
1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych Man II i GnT II
W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego Man II, cDNA ludzkiej mannozydazy II (SEK. NR ID: 17) subklonowano do plazmidowego wektora ekspresyjnego poniżej promotora MPSV i po wyżej sztucznego sygnału poliadenylacji króliczej beta-globiny. W celu ekspresji GnT II, stosowany jest plazmidowywektor ekspresyjnego z cDNA ludzkiego GnT II suklonowanego poniżej promotora//wzmacniacza ludzkiego CMV i powyżej sygnału poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Połączenie wektorów ekspresyjnych z miejscem inicjacji replikacji oriP z wirusa Epsteina Barra
Fragment DNA z oriP subklonowano w sposób opisany w Przykładzie 1, do opisanego powyżej wektora ekspresyjnego Man II, w celu otrzymania wektora ekspresyjnego Man II pCLF9. Fragment DNA z oriP jest subklonowany w sposób opisany w Przykładzie 1, do opisanego powyżej wektora ekspresyjnego GnT II w celu otrzymania wektora ekspresyjnego GanTII pGnT II.
2. Transfekcja komórek HEK293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA w fazie wykładniczego wzrostu transfekowano w sposób opisany w Przykładzie 1. W celu wytworzenia niezmodyfikowanego przeciwciała „Cwt”, komórki transfekowano wektorem ekspresyjnym przeciwciała (pETR1520). W celu wytworzenia przeciwciała „Cbrt” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520) i drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) w stosunku odpowiednio 4 : 1. W celu wytworzenia przeciwciała „Cm” z modyfikacją glikozylacji, komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) i trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) w stosunku odpowiednio 3:1:1. W celu wytworzenia przeciwciała „Cmg” z modyfikacja glikozylacji, komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jednym do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugim do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519), trzecim do wyrażania mannozydazy II (pCLF9) i czwartym do wyrażania GnT II (pGnT II) w stosunku odpowiednio 4 : 0,33 : 0,33 : 0,33.
3. Wytwarzanie i oczyszczanie niezmodyfikowanych przeciwciał i przeciwciał z modyfikacją glikozylacji
Pożywkę hodowlaną powyższych stransfekowanych komórek wymieniano na świeżą pożywkę hodowlaną w przybliżeniu 16 godzin po transfekcji, a tę ostatnią pożywkę zbierano po hodowli stransfekowanych komórek przez dalszych 120 godzin. Zebrane supernatanty odwirowwano przez 5 minut przy 1200 obr./min., a następnie ponownie odwirowano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
Oczyszczanie przeciwciał
Przeciwciała monoklonalne oczyszczono z supernatantów hodowlanych stosując dwa następ ujące po sobie etapy chromatograficzne, chromatografię białka A i chromatografię katjono-wymienną, w sposób opisany w Przykładzie 1. Dla przeciwciał cwt7, cbrt5 i cm1, po etapie kationo-wymiennym dodano dodatkowy etap chromatografii wykluczania według wielkości stosując kolumnę Superdex 200 (Amersham Pharmacia) oraz roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem i zebrano monomeryczny pik przeciwciał.
4. Analiza oligosacharydów
Oligosacharydy uwolniono enzymatycznie z przeciwciał znajdujących się w roztworze przez trawienie PNGazą, w sposób opisany w Przykładzie 1.
Zastosowanie trawienia endoglikozydazą H oligosacharydów uwolnionych PNGazą w celu przypisania struktur oligosacharydów hybrydowych przeciętych do neutralnych pików oligosacharydowych. MALDI/TOF-MS
Oligosacharydy uwolnione PNGazą trawiono następnie endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96), w sposób opisany na Przykładzie 1.
PL 222 220 B1
MALDI/TOF-MS
Próbki zawierające trawienia enzymatyczne zawierające uwolnione oligosacharydy przygot owano do i następnie poddano analizie na spektrometrze masowym MALDI/TOF, jak to opisano w Przykładzie 1.
5. Przygotowanie i izolowanie komórek
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostic Inc., St. Louis, M063178 USA) w sposób zasadniczo zgodny z instrukcjami wytwórcy i protokołem opisanym w Przykładzie 1.
6. Izolacja limfocytów NK
Ludzkie limfocyty NK wyizolowano z PBMC stosując procedurę selekcji negatywnej, w sposób opisany w Przykładzie 1.
7. Test ADCC
PBMC jako komórki efektorowe przygotowano jak to opisano powyżej i przetestowano pod względem ich zdolności do pośredniczenia w cytotoksyczności w teście cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), jak to opisano w Przykładzie 1.
8. Wiązanie FcgammaRIIIA na limfocytach NK
Wiązanie FcgammaRIIIA na świeżo wyizolowanych limfocytach NK oraz wiązanie FcgammaRIIb określono jak opisano w Przykładzie 1.
9. Test cytotoksyczności zależnej od dopełniacza
Testy cytotoksyczności zależnej od dopełniacza przeprowadzono stosując rozcieńczenia przeciwciała zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 1, z następującymi modyfikacjami w celu przygotowania źródła ludzkiego dopełniacza. W skrócie, normalną surowicę ludzką (NHS) przygotowywano z krwi zdrowych ochotników. Krew pozostawiono do skrzepnięcia przez jedną godzinę, a następnie była odwirowywano przy 1200 g przez 20 minut. Wolny od komórek supernatant surowicy podzielono na jednakowe objętości i przechowywano w -80°C. Stosowano 20% końcowej objętości oznaczenia NHS.
Wyniki i Dyskusja
Wersje chimerowego przeciwciała IgG1 anty-CD20 z modyfikacją glikozylacji (przeciwciało chimerowe C2B8, znane także jako rituximab) wytwarzono przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy o aktywności GnT III i mannozydazy II. Dodatkowa wersja przeciwciała z modyfikacją glikozylacji jest także wytwarzana przez kotransfekowanie hodowli ssaczych komórek wektorami do ekspresji genów przeciwciała oraz wektorami do ekspresji genów kodujących polipeptydy aktywności GnT III, aktywności mannozydazy II i aktywności GnT II. Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cbrt” komórki kotransfekowano dwoma plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519). Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cm” komórki kotransfekowano trzema plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji polipeptydowej GnT III (pETR1519) , trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9). Dla przeciwciała z modyfikacją glikozylacji „Cmg” komórki kotransfekowano czterema plazmidami, jeden był do wyrażania przeciwciała (pETR1520), drugi do wyrażania fuzji po- lipeptydowej GnT III (pETR1519), trzeci do wyrażania mannozydazy II (pCLF9), a czwarty do wyrażania GnT II (pGnT II). Nie zmodyfikowaną (bez modyfikacji glikozylacji) wersję tego samego przeciwciała „Cwt” wytworzono transfekując ssacze komórki jedynie wektorem do ekspresji genów przeciwciała. Transfekowane komórki hodowano przez 5 dni, a wydzielone, rekombinowane przeciwciała oczyszczono z pożywki hodowlanej. Ekspresja genów kodujących polipeptydy aktywności GnT III lub Man II nie miała żadnego znaczącego wpływu na żywotność komórek, wzrost komórek lub wytwarzanie przeciwciał, w porównaniu z komórkami nieprodukującymi takich glikotransferaz lub peptydów glikozydaz.
Oczyszczone przeciwciała następnie analizowano pod kątem wzorów ich glikozylacji. Przeciwciała te niosą N-związanych przez oligosacharydy jedynie do reszty Asn297 regionu Fc ludzkiego IgG1. Oligosacharydy usunięto enzymatycznie z przeciwciał trawiąc PNGazą F, anastępnie analizowano za pomocą MALDI/TOF-MS. Przy zastosowaniu tej techniki możliwe jest określenie frakcji różnych rodzajów oligosacharydów w całkowitej, oryginalnej populacji oligosacharydów-Fc, a także możliwe jest przypisanie struktur różnym pikom w widmach (Umana P. i wsp., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Na Fig. 26 przedstawiono neutralne profile oligosacharydowe MALDI/TOF-MS z niemodyfikowanego, rekombinowanego, chimerowego IgG1 C2B8 anty-CD20 przeciwciała Cwt. Jak dla niemodyfikowanego przeciwciała poprzednio opisanego w Przykładzie 1, Fig. 5, Cwt wykazuje
PL 222 220 B1 typowy profil oligosacharydowy z pikami o wartościach m/z 1485, 1648 i 1810 odpowiadającymi dwuantenowym, z fukozylowanym rdzeniem, złożonym oligosacharydom mającym odpowiednio 0, 1 i 2 reszty galaktozowe. Manipulacja komórkami wytwarzającymi przeciwciało poprzez ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, w której domena katalityczna GnT III jest lokalizowana poprzez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cbrt), w których większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi hybrydami (patrz Fig 27). Jak opisano w Przykładzie 1, endoglikozydaza H (EndoH) została zastosowana do potwierdzenia przypisania przeciętych, niefukozylowanych i przeciętych, hybrydowych struktur do różnych pików oligosacharydowych widocznych w profilach MALDI.
Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało przez jednoczesną ekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II i kwasu nukleinowego kodującego Man II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cm), gdzie większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi, złożonymi (patrz Fig 28). Manipulacja komórek wytwarzających przeciwciało przez koekspresję kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, kwasu nukleinowego kodującego Man II i kwasu nukleinowego kodującego GnT II, prowadziła do wytwarzania przeciwciała (Cmg), gdzie większość oligosacharydów-Fc było przeciętymi, niefukozylowanymi, złożonymi z jeszcze większym udziałem przeciętych, niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów przyłączonych do Fc niż dla przeciwciała Cm.
Na Fig. 29 pokazano dane wskazujące na zwiększenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC) spowodowanej ekspresją w komórkach wytwarzających przeciwciało kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową Man II-GnT III, gdzie domena katalityczna GnT III jest lokalizowana przez domenę lokalizacji w aparacie Golgiego Man II, gdzie kwas nukleinowy kodujący Man II-GnT III jest poddawany ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i poddawany koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm). Zatem, zwiększanie poziomu przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją glikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC.
Wiadomo, że ważnymi pośrednikami w ADCC są komórki NK (NK). Komórki te niosą na swojej powierzchni podlegający aktywacji receptor Fcgamma IIIA, znany także jako CD16a. Wiązanie się regionu Fc przeciwciał opłaszczających komórkę docelową z receptorami FcgammaRIIIA na komórkach NK jest konieczne do wiązania krzyżowego tych receptorów na komórkach NK i następującej po tym indukcji ADCC. Tak więc, jest ważne, aby oceniać wiązanie się przeciwciał wytworzonych sposobami tutaj przedstawionymi z receptorami Fc, w szczególności do receptorami w natywnej postaci, w której są prezentowane przez ludzkie komórki efektorowe. Na Fig. 30 pokazano, że przeciwciała z modyfikacją glikozylacji otrzymane przez uzyskanie ekspresji, w komórkach wytwarzających przeciwciało, kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III, poddanego ekspresji zarówno samodzielnie (przeciwciało Cbrt) jak i koekspresji w komórkach wytwarzających przeciwciało razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (Cm), mającym zwiększone powinowactwo wiązania się z aktywującym ludzkim receptorem FcgammaRIIIA. Jak wspomniano powyżej dla testów ADCC, przeciwciała te mają zwiększone poziomy przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, co jest wynikiem wyrażania fuzji polipeptydowej o aktywności GnT III w komórkach wytwarzających przeciwciało.
A zatem, zwiększanie poziomu przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, zarówno typu hybrydowego jak i złożonego, w regionie Fc przeciwciał z modyfikacją glikozylacji prowadzi do wzrostu aktywności ADCC. Komórki NK zastosowane w tym teście pochodzą od dawcy o genotypie, który nie warunkuje wyrażania receptora FcgammaRIIc na swoich komórkach NK (Metes, D., i wsp., J. Immunol. Methods 258(1-2) : 85-95 (2001)). Zatem, jedyny receptor Fc znajdujący się na powierzchni tych komórek, to aktywujący receptor Fc gamma RIIIA.
Domena wiążąca aktywującego receptora FcgammaRIIIB jest prawie identyczna z taką domeną FcgammaRIIIA. Zatem, powyższe dane wskazują także, że opisane tutaj przeciwciała z manipulacją glikozylacji mogą prowadzić do wzrostu funkcji efektorowych, w których pośredniczą komórki efektorowe prezentujące FcgammaRIIIB, takie jak komórki granulocytów (PMN), obejmując uwolnienie toksycznych produktów oraz fagocytozę ((Reff, M. E., i Heard, C., Crit Rev Oncol Hematol. 40(1) : 25-35 (2001), Daeron, FM. Annu. Rev. Immunol. 15: 203-34 (1997), Ravetch, J. V. i Holland S. Annu. Rev.
PL 222 220 B1
Immunol. 19 : 275-90 (2001)). Cbrt, czyli przeciwciało anty-CD20 wytwarzane w komórkach zmodyfikowanych w celu uzyskania ekspresji kwasu nukleinowego kodującego fuzję polipeptydową o aktywności GnT III i umieszczanego w aparacie Golgiego przez domenę lokalizacji Man II, przetestowano również pod kątem lizy z udziałem dopełniacza (CML), innej funkcji efektorowej, która nie jest zależna od receptorów Fc na odpornościowych komórkach efektorowych. Znaczna większość oligosacharydów tego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji była rodzaju przeciętego, hybrydowego, niefukozylowanego. Obniżoną aktywność CML zaobserwowano dla przeciwciała Cbrt w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanym Cwt (Fig. 31). Dla pewnych zastosowań mogą być pożądane przeciwciała z podwyższonym ADCC, ale z obniżonym CML, na przykład, w celu zmniejszenia skutków ubocznych, takich jak zapalenie naczyń krwionośnych w miejscu nowotworu, w którym pośredniczy CML. Inne znaczące skutki uboczne, w których pośredniczą CML, zaobserwowano dla terapii z przeciwciałem anty-CD20 (van der Kolk L. E., i wsp., Br J Haematol. 115(4) : 807-11 (2001)). Jednakże, możliwe jest otrzymanie przeciwciał z modyfikacją glikozylacji o zwiększonej aktywności ADCC i wiązaniu FcgammaRIII, ale bez znaczącego obniżenia aktywności CML w stosunku do niemodyfikowanego przeciwciała, jak w przypadku przeciwciała Cm (Fig. 31). Takie przeciwciała są pożądane w zastosowaniach, w których maksymalna liczba eliminowanych komórek docelowych wymaga zarówno wysokiej ADCC, jak i wysokiej aktywacji dopełniacza i aktywności CML. Profile oligosacharydowe opisane powyżej pokazują, że możliwe jest zmodyfikowanie komórek wytwarzających przeciwciało w celu wytwarzania przeciwciał, w których większość oligosacharydów przyłączonych do Fc jest przeciętymi, niefukozylowanymi, typu złożonego zamiast typu hybrydowego przez koekspresję fuzji polipeptydowej GnT III razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II (przeciwciało Cm) lub razem z kwasem nukleinowym kodującym Man II i z kwasem nukleinowym kodującym GnT II (przeciwciało Cmg). Przeciwciała z modyfikacją glikozylacji mają zwiększoną aktywność ADCC i zwiększone powinowactwo wiązania FcgammmaRIII, które odpowiada ich zwiększonym poziomom przeciętych, niefukozylowanych oligosacharydów, przy zwiększonej aktywności CML związanej ze wzrostem udziału oligosacharydów złożonych w stosunku do udziału oligosacharydów hybrydowych.
Ten i wcześniejsze Przykłady opisały wyrażanie fuzji polipeptydowej kodowanej przez kwasy nukleinowe, przy czym fuzja polipeptydowa zlokalizowana jest w aparacie Golgiego i ma domenę katalityczną, która konkuruje z endogennymi fukozylotransferazami o akceptory oligosacharydów, wcześniej zmodyfikowane dzięki reakcjom katalizowanym przez GnT I. Rekombinowane glikoproteiny wytworzone w tak zmodyfikowanych komórkach gospodarza mają podwyższone poziomy niefukozylowanych oligosacharydów. Przykład ten pokazuje, że koekspresja w takich komórkach gospodarza kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II razem z powyższymi kwasami nukleinowymi kodującymi fuzję polipeptydową, prowadzi do przesunięcia w przebiegu biosyntezy w stronę złożonych zamiast hybrydowych oligosacharydów, a zatem do syntezy glikoprotein o zwiększonych poziomach niefukozylowanych, złożonych oligosacharydów w stosunku do glikoprotein wytwarzanych w komórkach bez jednoczesnej ekspresji kwasów nukleinowych kodujących Man II i/lub GnT II.
P r z y k ł a d 6
Nadekspresja α-mannozydazy
Klonowanie molekularne
Ludzka α-mannozydaza II
Gen kodujący ludzką α-mannozydazę („hMan II”) (E.C. 3.2.1.114) (SEK. NR ID: 17), pod kontrolą promotora MPSV wklonowano do wektora ekspresyjnego zawierającego element OriP. Otrzymany wektor ekspresyjny pCLF9 przedstawiono na Fig. 32A. Wektorami ekspresyjnymi kodującymi lekki i ciężki łańcuch monoklonalnego przeciwciała anty-CD20 były, odpowiednio, pETR1842 i pETR1843 (Fig. 32B i 32C).
Fuzja białkowa Man II-GalT
Fuzję białkową (SEK. NR ID: 20), składającą się z hMan
II CTS i domeny katalitycznej β 1,4-galaktozylotransferazy człowieka (M22921, aminokwasy 126-397) skonstruowano jak opisano poniżej. Region hMan II CTS amplifikowano w PCR na matrycy pETR1448 (CF33, GAB252). Domenę katalityczną GalT (aminokwasy 126-397) amplifikowano z wykorzystaniem CF31 i CF35 na matrycy pBlueGalT. Połączono hMan II CTS z domeną katalityczną GalT, aby otrzymać fuzję białkową kontrolowaną promotorem MPSV (pCLF24). Cały gen GalT otrzymano z pBlueGAlT. Gen kodujący GalT zsekwencjonowano (SEK. NR ID: 16):
PL 222 220 B1
MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSR
LPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDS
SPWDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDL
ELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAI1IPFRNRQEHLKYWLYYLH P VLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDV DLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLT
INGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAWGRCRMIRHSRDKK
NEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS
Koniec 5' GalT amplifikowano z CF32/CF38 i dodano na początku genu miejsce restrykcyjne Fsel. Przez sekwencjonowanie stwierdzono, że sekwencja jest poprawna i podmieniono ją w pCLF24 przez trawienie Fsel/Dralll (pCLF26). Dodano OriP do pCLF24 i pCLF26, aby otrzymać odpowiednio pCLF25 i pCLF27 (Fig. 33A i 33B).
Wyrażanie α-mannozydazy i Man II-GalT w komórkach HEK 293-EBNA
Komórki HEK293-EBNA transfekowano metodą z fosforanem wapnia. W skrócie, w celu transfekcji w butelce T150, 15 milionów komórek umieszczono 24 godziny przed transfekcją w 28 ml DMEM, 10% FCS, 250 ąg/ml neomycyny i inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc.
Dla każdej butelki T150 przeznaczonej do transfekcji, przygotowano roztwór DNA, CaCl2 i wody przez zmieszanie 94 ąg DNA całkowitego wektora plazmidowego, 469 ąI 1M roztworu CaCl2 i dodanie wody do końcowej objętości 938 ąl. Do tego roztworu dodano 938 ąl roztworu 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 o pH 7,05, zmieszano natychmiast przez 10 sekund i zostawiono do odstania w temperaturze pokojowej przez 20 sekund. Zawiesinę rozcieńczono 24 ml DMEM uzupełnioną 2% FCS i dodano do T150 w miejsce istniejącej pożywki. Komórki inkubowano w 37°C, z 5% CO2 przez około 17 do 20 godzin, następnie pożywkę zastąpiono 30 ml DMEM, 10% FCS. W celu testowania wpływu α-mannozydazy II na współzawodnictwo z fukozylotransferazą rdzenia, komórki transfekowano pETR1842, pETR1843 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2 : 2 : 1. Dla fuzji białkowej Man IIGAlT komórki stransfekowano pETR1842, pETR1843 i pCLF9 w stosunku odpowiednio 2 : 2 : 1. Piątego dnia po transfekcji, zebrano supernatant, odwirowano przez 5 minut przy 1200 obr./min., a następnie ponownie odwirowano przez 10 minut przy 4000 obr./min. i trzymano w 4°C.
Oczyszczanie przeciwciała monoklonalnego anty-CD20
Przeciwciało monoklonalne oczyszczono z 30 ml supernatantu stosując dwa kolejne etapy chromatograficzne, obejmujące pierwszy etap składający się z chromatografii białka A, aby oddzielić przeciwciało monoklonalne od przeciwciała krowiego obecnego w surowicy, po tym następował etap chromatografii kationo-wymiennej w celu wymiany buforu na PBS.
Analiza oligosacharydów
Trawienie PNGaząF
Próbkę przeciwciała monoklonalnego (50 ąg) inkubowano z N-glikozydazą F (rekombinowana, Roche, Szwajcaria) w stężeniu 0,1 mU/ąl. Trawienie przeprowadzono w buforze 2mM Tris, pH 7,0 przez 3 godziny w 37°C. Uwolnione neutralne oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM. Następnie próbki odsolono na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, 100-200 mesh, BioRad, Hercules, CA) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Hercules, CA)
Trawienie EndoH
Przed traktowaniem kwasem octowym, uwolnione PNGaząF oligosacharydy strawiono endoglikozydazą H (EC 3.2.1.96, ROCHE, Szwajcaria), enzymem tnącym między resztami N-acetyloglukozaminowymi rdzenia chitobiozy N-przyłaczonych oligosacharydów. Enzym przetnie oligomannozę i większość typów glikanów hybrydowych, podczas gdy oligosacharydy typu złożonego nie są hydrolizowane.
Oligosacharydy strawiono 0,2 mU/ąl endoglikozydazą H w buforze 2mM Tris, pH 7,0. Trawienie prowadza się przez 3 godziny w 37°C. Oligosacharydy inkubowano przez 3 godziny w temperaturze
PL 222 220 B1 pokojowej po dodaniu kwasu octowego w końcowym stężeniu 150 mM, a następnie odsolono na 0,6 ml żywicy kationo-wymiennej (żywica AG50W-X8, postać wodorowa, 100-200 mesh, BioRad, Szwajcaria) nałożonej na kolumnę chromatograficzną mikro-bio-spin (BioRad, Szwajcaria).
Przygotowanie próbki i macierzy
Macierz kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego (sDHB) przygotowano przez rozpuszczenie 2 mg kwasu 2,5-dihydrobenzoesowego + 0,1 mg kwasu 5-metoksysalicylowego w 1 ml etanolu/10 mM wodnego chlorku sodu 1 : 1 (obj./obj.). 1 pl próbki nałożono na płytkę docelową ze stali nierdzewnej i zmieszano na płytce z 1 pl podłoża sDHB. Próbki wysuszono na powietrzu, nałożono 0,2 pl etanolu.
Analiza MALDI/TOF-MS
Spektrometrem masowym MALDI-TOF stosowanym do uzyskania widma masowego był Yoyager Elite (Perspective Biosystems) z możliwością opóźnionej ekstrakcji. Przyrząd działał w układzie z reflektorem. Pozytywne jony przyspieszano do 20 kV po 75 nsek opóźnieniu. Pięć widm po 40 zdjęć (200 zdjęć) połączono w celu uzyskania końcowego widma. Do oznaczania masy jonów stosowano zewnętrzną kalibrację przy zastosowaniu standardów oligoscharydowych.
Profile oligosacharydowe
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności Man II przedstawiono na Fig. 34. Stwierdzono, że oligosacharydy związane z częścią Fc przeciwciała mają strukturę złożoną, 48% z nich nie brak fukozy rdzenia, a-mannozydaza II współzawodniczy z fukozylotransferazą rdzenia, wytwarzając 48% struktur oligosacharydów w postaci nie fukozylowanej. Przy braku a-mannozydazy II, oligosacharydy części Fc przeciwciała składają się tylko ze struktur fukozylowanych (przeciwciało dzikiego typu).
Profil oligosacharydowy przeciwciała anty-CD20 wytworzonego w obecności fuzji białkowej Man II-GalT przedstawiono na Fig. 35A-B. Jak dla a-mannozydazy II, także w przypadku fuzji białkowej Man II-GalT, wzrasta ilość oligosacharydów o strukturze niefukozylowanej. Duży udział procentowy struktur niefukozylowanych jest zgodny z dużą ilością struktur z mannozą (m/z 1256, 1419 i 1581). Przy 67% tych niefukozylowanych cukrów, dodatkowo stwierdzono 30% struktur hybrydowych, niefukozylowanych (m/z 1622). Zatem, próbka otrzymana w obecności fuzji białkowej Man II-GalT wykazuje prawie 100% niefukozylowanych struktur.
Aktywność biologiczna przeciwciał otrzymanych w obecności a-mannozydazy II i fuzji białkowej Man II-GalT
Aby określić wpływ działania enzymów a-mannozydazy II i Man II-GalT we współzawodnictwie z fukozylotransferazą rdzenia, wykonano odpowiednie testy biologiczne. Próbki testowano in vitro na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i na wiązanie się z receptorem CD16 wyrażanym na powierzchni modyfikowanej linii komórkowej CHO (CHO-17 08-37).
Wiązanie IgG na CHO-1708-37
Linia komórkowa CHO-1708-37 wyraża na swojej powierzchni receptor FcyRIIIA (CD16) i łańcuch γ receptora FcyRI. Wyrażanie receptora FcyRIIIA (CD16) oznaczono w analizie FACS z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego 3G8-FITC (Fig, 36). Komórki CHO-1708-37 inkubowano w stężeniu 1 milion/ml w PBS, 0,1% BSA z różnymi wariantami przeciwciał, w różnych stężeniach (10, 3, 1, 0,3, 0,1 pg/ml) i w trzech powtórzeniach.
Komórki inkubowano przez 30 min. w 4°C, a następnie przepłukano PBS, 0,1% BSA. Wiązanie przeciwciał wykryto inkubując przez 30 min. w 4°C ze skoniugowanym z izotiocjanianem fluoresceiny 1 : 200 kozim przeciwciałem F(ab')2 anty-ludzka IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA). Intensywność fluorescencji odwołująca się dowariantów związanego przeciwciała określono na żywych, bramkujących komórkach FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA).
Doświadczeniami z testami wiązania objęto następujące przeciwciała:
Cwt8 (typu dzikiego I)
Man II (a-mannozydaza II)
Przeciwciało wytworzone w obecności a-mannozydazy II (Man II) wiąże się z receptorami FcγRIIIA z wyższym powinowactwem niż przeciwciała typu dzikiego.
Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) in vitro.
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) przygotowywano stosując Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. i Louis, M063178 USA) i zasadniczo stosując instrukcje producentów. W skrócie, heparynowanymi strzykawkami pobierano krew żylną od ochotników, których poproszono o bieganie z maksymalną szybkością przez 1 minutę w celu zwiększenia procentowego udziału komórek NK (NK) we krwi. Krew rozcieńczono 1:0,75-1,3 PBS niezwierającym Ca lub Mg i umieszczono na
PL 222 220 B1
Histopaque-1077. Gradient odwirowano przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw. Zebrano interfazę zawierającą PBMC i przemyto ją PBS (50 ml na komórki z dwóch gradientów) i zebrano przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut, RT. Po ponownym zawieszeniu osadu w PBS, zliczano PBMC i przemyciu drugi raz przez odwirowanie przy 200 x g przez 10 minut w RT. Komórki następnie ponownie zawieszono w odpowiedniej pożywce do kolejnych procedur.
Docelowe komórki Raji przemyto w PBS, zliczono i ponownie zawieszono w DMEM, 10% FCS, 1% Glutamax w stężeniu 1 milion/ml. Dodano do nich kalceinę i komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C. Komórki następnie przemyto w PBS, zliczono i ponownie zawieszono w AIM-V w stężeniu 0,3 miliona/ml. Z tej zawiesiny komórek, dodano po 100 pl na studzienkę na okrągłodennej, 96-studzienkowej płytce. Przeciwciała rozcieńczono w AIM-V, dodano po 50 pl do wysianych komórek docelowych i umożliwiono wiązanie się z komórkami docelowymi przez 10 min. w temp. pokojowej. Jako komórki efektorowe PBMC przygotowano tak jak opisano powyżej. Stosunek komórek efektorowych do docelowych wynosił 25 : 1. Komórki efektorowe przygotowano w stężeniu 15 milionów na ml w pożywce AIM-V i dodano po 50 pl na studzienkę. Płytkę inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki przepłukano dwukrotnie PBS i dodano po 200 pl roztworu boranu. Zabijanie komórek mierzono na podstawie uwalniania kalceiny do pożywki po lizie roztworem boranowym (Fig. 37).
Spontaniczne uwalnianie mierzono w studzienkach zawierających jedynie komórki docelowe i efektorowe, ale nie przeciwciała. Maksymalne uwalniane określono ze studzienek zawierających jedynie komórki docelowe i 1% Triton X-100. Procent specyficznego zabijania z udziałem przeciwciał obliczano w następujący sposób: ((x-SR)/(MR-SR)*100, gdzie x jest średnią Vmax w specyficznym stężeniu przeciwciała, SR jest średnią Vmax spontanicznego uwalniania, a MR jest średnią Vmax maksymalnego uwalniania.
P r z y k ł a d 7
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji anty-EGFR w leczeniu łuszczycy
Pacjenci będący ludźmi z łuszczycą mogą być leczeni monoklonalnym przeciwciałem z modyfikacją glikozylacji anty-EGFR wytworzonym sposobem tu ujawnionym. Konkretnie, pacjenci otrzymują 2 cotygodniowe infuzje przeciwciała z modyfikacją glikozylacji w dawce początkowej 400 mg/m2. Utrzy2 mujące dawki po 250 mg/m2 podaje się na podstawie cotygodniowych obserwacji aż do osiągnięcia pełnej odpowiedzi.
P r z y k ł a d 8
Stosowanie monoklonalnego przeciwciała z modyfikacją glikozylacji Anty-ErbB2 w leczeniu przerzutującego raka prostaty, przerzutującego raka sutka, przerzutującego raka okrężnicy i odbytu, stadium Illb lub IV niedrobnokomórkowego raka płuc
RhuMAb2C4 jest pełnej długości, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym (wytworzonym w komórkach CHO) skierowanym przeciw ErbB2. RhuMab 2C4 blokuje oddziaływania ErbB2 z innymi członkami rodziny ErbB, przez co hamuje przekazywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych szlaku ErbB. RhuMab 2C4 nie tylko hamuje wzrost nowotworów z nadekspresją ErbB2, ale także blokuje wzrost nowotworów, które wymagają przekazywania sygnałów zależnego od ligandów ErbB.
Postać RhuMab 2C4 z modyfikacją glikozylacji, wytworzona ujawnionymi tu sposobami może być zastosowana jako pojedynczy czynnik w leczeniu pacjentów z hormononiezależnym niewrażliwym na androgeny) przerzutującyrn rakiem prostaty, przerzutującym rakiem sutka, przerzutującyre rakiem okrężnicy i odbytu, stadium IIIb lub IV niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Szczegółowo, przeciwciało RhuMab 2C4 z modyfikacją glikozylacji podaje się dożylnie (IV), co tydzień lub, co trzy tygodnie w ilości odpowiednio 2 lub 4 mg/kg, aż do ustania postępów choroby. Przeciwciało jest dostarczane w postaci cieczy dla wielu dawek (20 ml przy stężeniu 20 mg/ml lub wyższym).
Jest oczywistym, że wynalazek można stosować w inny sposób niż opisano szczegółowo w powyższych opisach i przykładach. Jest możliwy szereg modyfikacji i zmian obecnego wynalazku w świetle powyższych technik, a zatem są one objęte dołączonymi zastrzeżeniami.
Cała zawartość wszystkich publikacji (w tym. publikacji patentowych, zgłoszeń patentowych, artykułów w pismach, podręczników laboratoryjnych, książek lub innych dokumentów) tutaj cytowanych włączona jest tu jako odniesienie.
PL 222 220 B1
P30045PL00
POPRAWIONA LISTA SEKWENC3I
<110> | GlycArt Biotechnology AG Umana, Pablo Bruenker, Peter Ferrara, Claudia Suter, lobias |
<120> | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
<130> | 1975.018PC03 |
<140> <141> | To Be Assigned Herewith |
<150> <151> | US 60/441,307 2003-01-22 |
<150> <151> | US 60/491,254 2003-07-31 |
<150> <151> | US 60/495,142 2003-08-15 |
<160> | 24 |
<170> | Patentln version 3.5 |
<210> <211> <212> <213> | 1 11 PRT Nieznane |
<220> <223> | Znacznik epitopowy c-myc |
<400> | 1 |
Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 | 5 10 |
<210> <211> <212> <213> | 2 45 DNA Sekwencja sztuczna |
<220> <223> | Starter PCR GAB-177 |
<400> | 2 |
PL 222 220 B1
gcgtgtgcct gtgacccccg cgcccctgct | ccagccactg | tcccc | 45 | |
<210> | 3 | |||
<211> | 26 | |||
<212> | DNA | |||
<213> | Sekwencja sztuczna | |||
<220> | ||||
<223> | Starter PCR GAB-178 | |||
<400> | 3 | |||
gaaggtttct ccagcatcct ggtacc | 26 | |||
<210> | 4 | |||
<211> | 43 | |||
<212> | DNA | |||
<213> | Sekwencja sztuczna | |||
<220> | ||||
<223> | Starter PCR GAB-179 | |||
<400> | 4 | |||
ctgaggcgcg ccgccaccat gctgaagaag | cagtctgcag | ggc | 43 | |
<210> | 5 | |||
<211> | 48 | |||
<212> | DNA | |||
<213> | Sekwencja sztuczna | |||
<220> | ||||
<223> | Starter PCR GAB-180 | |||
<400> | 5 | |||
ggggacagtg gctggagcag gggcgcgggg | gtcacaggca | cacgcggc | 48 | |
<210> | 6 | |||
<211> | 50 | |||
<212> | DNA | |||
<213> | Sekwencja sztuczna | |||
<220> | ||||
<223> | Starter PCR GAB-252 | |||
<400> | 6 | |||
gctaggccgg ccgccaccat gaagttaagc | cgccagttca | ccgtgttcgg | 50 |
<210> 7 <211> 65
PL 222 220 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-253 <400> 7 ggggacagtg gctggagcag gggtgagcca gcaccttggc tgaaattgct ttgtgaactt ttcgg <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-254 <400> 8 tccgaaaagt tcacaaagca atttcagcca aggtgctggc tcacccctgc tccagccact gtcccc
6Θ <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-255 <400> 9 atgccgcata ggcctccgag caggacccc <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-261 <400> 10 gctaaatatt gaattccctt tatgtgtaac tcttggctga agc
<210> | 11 |
<211> | 48 |
<212> | DNA |
PL 222 220 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter PCR GAB-262 <400> 11 tagcaatatt gaattcgcag gaaaaggaca agcagcgaaa attcacgc 48 <210> 12 <211> 1715 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Manll-GnTIII <400> 12
atgaagttaa | gccgccagtt | caccgtgttc | ggcagtgcga | tcttctgtgt | ggtgattttc | 60 |
tcgctctacc | tgatgctgga | ccggggtcac | ttagactacc | ccaggaaccc | gcgccgcgag | 120 |
ggctccttcc | ctcagggcca | gctctcaatg | ttgcaagaaa | aaatagacca | tttggagcgt | 180 |
ttgctagctg | agaataatga | gatcatctca | aatattagag | actcagtcat | caatttgagt | 240 |
gagtctgtgg | aggatggtcc | gaaaagttca | caaagcaatt | tcagccaagg | tgctggctca | 300 |
cccctgctcc | agccactgtc | ccctagcaag | gccaccgaag | aactgcaccg | ggtggacttc | 360 |
gtgttgccgg | aggacaccac | agagtatttt | gtgcgcacca | aagctggcgg | tgtgtgcttc | 420 |
aaaccaggta | ccaggatgct | ggagaaacct | tctccagggc | ggacagagga | gaagaccaag | 480 |
gtggctgagg | ggtcctcggt | ccggggtcct | gctcggaggc | ctatgcggca | tgtgttgagt | 540 |
gcacgggagc | gcctgggagg | ccggggcact | aggcgcaagt | gggttgagtg | tgtgtgcctg | 600 |
ccaggctggc | acgggcccag | ctgcggggtg | cccactgtgg | tccagtattc | caacctgccc | 660 |
accaaggagc | gcctggtacc | cagggaggtg | ccgaggcggg | ttatcaacgc | catcaacatc | 720 |
aaccatgagt | tcgacctgct | ggatgtgcgc | ttccatgagc | tgggcgatgt | tgtggacgcc | 780 |
tttgtggtct | gcgaatccaa | tttcaccgcc | tacggggagc | ctcggccgct | caagttccga | 840 |
gagatgctga | ccaatggcac | cttcgagtac | atccgccaca | aggtgctcta | cgtcttcctg | 900 |
gaccacttcc | cacctggtgg | ccgtcaggac | ggctggattg | cagacgacta | cctgcgtacc | 960 |
ttcctcaccc | aggatggtgt | ctcccgcctg | cgcaacctgc | gacctgatga | cgtctttatc | 1020 |
atcgacgacg | cggacgagat | ccctgcgcgt | gatggtgtgc | tgttcctcaa | gctctacgat | 1080 |
PL 222 220 B1
ggctggacag | agcccttcgc | cttccatatg | cgcaagtccc | tgtatggttt | cttttggaag | 1140 |
caaccaggca | cacggaggtg | gtgtcaggct | gcaccattga | catgctgcag | gctgtgtatg | 12ΘΘ |
ggctggacgg | catccgcctg | cgccgccgtc | agtactacac | catgcccaac | tttcgacagt | 1260 |
atgagaaccg | caccggccac | atcctagtgc | agtggtctct | cggcagcccc | ctgcacttcg | 1320 |
cgggctggca | ctgctcctgg | tgcttcacac | ccgagggcat | ctacttcaaa | ctcgtgtcgg | 1380 |
cccagaatgg | tgacttcccc | cgctggggtg | actacgagga | caagagggac | ctcaattaca | 1440 |
tccgaagctt | gattcgcact | gggggatggt | tcgacggcac | gcagcaggag | taccctcctg | 1500 |
cagaccccag | tgaacacatg | tatgctccta | agtacctgct | caagaactat | gaccagttcc | 1560 |
gctacttgct | cgaaaatccc | taccgggagc | ccaagagcac | tgtagagggt | gggcgccgga | 1620 |
accagggctc | agacggaagg | tcatctgctg | tcaggggcaa | gttggataca | acggagggcc | 1680 |
cggaacagaa | actgatctct | gaagaggacc | tgtag | 1715 |
<210> 13 <211> 571 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GnTIII <4Θ0> 13
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 15 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
PL 222 220 B1
PL 222 220 B1
PL 222 220 B1
500 505 510
Leu Leu Lys Asn Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr 515 520 525
Arg Glu Pro Lys Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser 530 535 540
Asp Gly Arg Ser Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly 545 550 555 560
Pro Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 565 570 <210> 14 <211> 1722 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydowa GnTI-GnTIII <400> 14
atgctgaaga | agcagtctgc | agggcttgtg | ctgtggggcg | ctatcctctt | tgtggcctgg | 60 |
aatgccctgc | tgctcctctt | cttctggacg | cgcccagcac | ctggcaggcc | accctcagtc | 120 |
agcgctctcg | atggcgaccc | cgccagcctc | acccgggaag | tgattcgcct | ggcccaagac | 180 |
gccgaggtgg | agctggagcg | gcagcgtggg | ctgctgcagc | agatcgggga | tgccctgtcg | 240 |
agccagcggg | ggagggtgcc | caccgcggcc | cctcccgccc | agccgcgtgt | gcctgtgacc | 300 |
cccgcgcccc | tgctccagcc | actgtcccct | agcaaggcca | ccgaagaact | gcaccgggtg | 360 |
gacttcgtgt | tgccggagga | caccacagag | tattttgtgc | gcaccaaagc | tggcggtgtg | 420 |
tgcttcaaac | caggtaccag | gatgctggag | aaaccttctc | cagggcggac | agaggagaag | 480 |
accaaggtgg | ctgaggggtc | ctcggtccgg | ggtcctgctc | ggaggcctat | gcggcatgtg | 540 |
ttgagtgcac | gggagcgcct | gggaggccgg | ggcactaggc | gcaagtgggt | tgagtgtgtg | 600 |
tgcctgccag | gctggcacgg | gcccagctgc | ggggtgccca | ctgtggtcca | gtattccaac | 660 |
ctgcccacca | aggagcgcct | ggtacccagg | gaggtgccga | ggcgggttat | caacgccatc | 720 |
aacatcaacc | atgagttcga | cctgctggat | gtgcgcttcc | atgagctggg | cgatgttgtg | 780 |
PL 222 220 B1
gacgcctttg tggtctgcga atccaatttc accgcctacg gggagcctcg gccgctcaag | 840 |
ttccgagaga tgctgaccaa tggcaccttc gagtacatcc gccacaaggt gctctacgtc | 900 |
ttcctggacc acttcccacc tggtggccgt caggacggct ggattgcaga cgactacctg | 960 |
cgtaccttcc tcacccagga tggtgtctcc cgcctgcgca acctgcgacc tgatgacgtc | 1020 |
tttatcatcg acgacgcgga cgagatccct gcgcgtgatg gtgtgctgtt cctcaagctc | 1080 |
tacgatggct ggacagagcc cttcgccttc catatgcgca agtccctgta tggtttcttt | 1140 |
tggaagcaac caggcacact ggaggtggtg tcaggctgca ccattgacat gctgcaggct | 1200 |
gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc cgccgtcagt actacaccat gcccaacttt | 1260 |
cgacagtatg agaaccgcac cggccacatc ctagtgcagt ggtctctcgg cagccccctg | 1320 |
cacttcgcgg gctggcactg ctcctggtgc ttcacacccg agggcatcta cttcaaactc | 1380 |
gtgtcggccc agaatggtga cttcccccgc tggggtgact acgaggacaa gagggacctc | 1440 |
aattacatcc gaagcttgat tcgcactggg ggatggttcg acggcacgca gcaggagtac | 1500 |
cctcctgcag accccagtga acacatgtat gctcctaagt acctgctcaa gaactatgac | 1560 |
cagttccgct acttgctcga aaatccctac cgggagccca agagcactgt agagggtggg | 1620 |
cgccggaacc agggctcaga cggaaggtca tctgctgtca ggggcaagtt ggatacaacg | 1680 |
gagggcccgg aacagaaact gatctctgaa gaggacctgt ag | 1722 |
<210> 15 <211> 573 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa fuzji GNTI-GnTIII <400> 15
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu 15 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro 20 25 30
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
PL 222 220 B1
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gin Asp Ala Glu Val Glu 50 55 60
Leu Glu Arg Gin Arg Gly Leu Leu Gin Gin Ile Gly Asp Ala Leu Ser 65 70 75 80
Ser Gin Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gin Pro Arg 85 90 95
Val Pro Val Thr Pro Ala Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys 100 105 110
Ala Thr Glu Glu Leu His Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr 115 120 125
Thr Glu Tyr Phe Val Arg Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro 130 135 140
Gly Thr Arg Met Leu Glu Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys 145 150 155 160
Thr Lys Val Ala Glu Gly Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro 165 170 175
Met Arg His Val Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Thr 180 185 190
Arg Arg Lys Trp Val Glu Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro 195 200 205
Ser Cys Gly Val Pro Thr Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys 210 215 220
Glu Arg Leu Val Pro Arg Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile 225 230 235 240
Asn Ile Asn His Glu Phe Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu 245 250 255
PL 222 220 B1
Gly Asp Val Val Asp Ala Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala 260 265 270
Tyr Gly Glu Pro Arg Pro Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly 275 280 285
Thr Phe Glu Tyr Ile Arg His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His 290 295 300
Phe Pro Pro Gly Gly Arg Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu 305 310 315 320
Arg Thr Phe Leu Thr Gin Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg 325 330 335
Pro Asp Asp Val Phe Ile Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg 340 345 350
Asp Gly Val Leu Phe Leu Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe 355 360 365
Ala Phe His Met Arg Lys Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gin Pro 370 375 380
Gly Thr Leu Glu Val Val Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gin Ala 385 390 395 400
Val Tyr Gly Leu Asp Gly Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr 405 410 415
Met Pro Asn Phe Arg Gin Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val 420 425 430
Gin Trp Ser Leu Gly Ser Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser 435 440 445
Trp Cys Phe Thr Pro Glu Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin 450 455 460
PL 222 220 B1
Asn | Gly | Asp | Phe | Pro | Arg | Trp | Gly | Asp | Tyr | Glu | Asp | Lys | Arg | Asp | Leu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Asn | Tyr | Ile | Arg | Ser | Leu | Ile | Arg | Thr | Gly | Gly | Trp | Phe | Asp | Gly | Thr |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Gin | Gin | Glu | Tyr | Pro | Pro | Ala | Asp | Pro | Ser | Glu | His | Met | Tyr | Ala | Pro |
5ΘΘ | 505 | 510 | |||||||||||||
Lys | Tyr | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr | Asp | Gin | Phe | Arg | Tyr | Leu | Leu | Glu | Asn |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Pro | Tyr | Arg | Glu | Pro | Lys | Ser | Thr | Val | Glu | Gly | Gly | Arg | Arg | Asn | Gin |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Ser | Asp | Gly | Arg | Ser | Ser | Ala | Val | Arg | Gly | Lys | Leu | Asp | Thr | Thr |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Glu | Gly | Pro | Glu | Gin | Lys | Leu | Ile | Ser | Glu | Glu | Asp | Leu |
565 570 <210> 16 <211> 398 <212> PRT <213> Nieznane <220>
<223> <400> | Sekwencja 16 | i aminokwasowa GalT z | : pBlueGalT |
Met Arg 1 | Leu Arg | Glu Pro Leu Leu Ser 5 | Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 10 15 |
Ala Ser | Leu Gin 20 | Arg Ala Cys Arg Leu 25 | Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 30 |
His Leu | Gly Val 35 | Thr Leu Val Tyr Tyr 40 | Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 45 |
Arg Leu 50 | Pro Gin | Leu Val Gly Val Ser 55 | Thr Pro Leu Gin Gly Gly Ser 60 |
PL 222 220 B1
PL 222 220 B1
Met Asp Lys | Phe | Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly Gly | |||||||||||||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Val | Ser | Ala | Leu | Ser | Lys | Gin | Gin | Phe | Leu | Thr | Ile | Asn | Gly | Phe | Pro |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Asn | Asn | Tyr | T rp | Gly | Trp | Gly | Gly | Glu | Asp | Asp | Asp | Ile | Phe | Asn | Arg |
305 | 310 | 315 | 32Θ | ||||||||||||
Leu | Val | Phe | Arg | Gly | Met | Ser | Ile | Ser | Arg | Pro | Asn | Ala | Val | Val | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Arg | Cys | Arg | Met | Ile | Arg | His | Ser | Arg | Asp | Lys | Lys | Asn | Glu | Pro | Asn |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Pro | Gin | Arg | Phe | Asp | Arg | Ile | Ala | His | Thr | Lys | Glu | Thr | Met | Leu | Ser |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Gly | Leu | Asn | Ser | Leu | Thr | Tyr | Gin | Val | Leu | Asp | Val | Gin | Arg | Tyr |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Pro | Leu | Tyr | Thr | Gin | Ile | Thr | Val | Asp | Ile | Gly | Thr | Pro | Ser | ||
385 | 390 | 395 | |||||||||||||
<210> | 17 | ||||||||||||||
<211> | 3435 | ||||||||||||||
<212> 1 | DNA | ||||||||||||||
<213> 1 | Homo | sapiens |
<220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Man II <4Θ0> 17
atgaagttaa | gccgccagtt | caccgtgttc | ggcagtgcga | tcttctgtgt | ggtgattttc | 60 |
tcgctctacc | tgatgctgga | ccggggtcac | ttagactacc | ccaggaaccc | gcgccgcgag | 120 |
ggctccttcc | ctcagggcca | gctctcaatg | ttgcaagaaa | aaatagacca | tttggagcgt | 180 |
ttgctagctg | agaataatga | gatcatctca | aatattagag | actcagtcat | caatttgagt | 240 |
gagtctgtgg | aggatggtcc | gaaaagttca | caaagcaatt | tcagccaagg | tgctggctca | 300 |
catcttctgc | cctcacaatt | atccctctca | gttgacactg | cagactgtct | gtttgcttca | 360 |
PL 222 220 B1
caaagtggaa | gtcacaattc | agatgtgcag | atgttggatg | tttacagtct | aatttctttt | 420 |
gacaatccag | atggtggagt | ttggaagcaa | ggatttgaca | ttacttatga | atctaatgaa | 480 |
tgggacactg | aaccccttca | agtctttgtg | gtgcctcatt | cccataacga | cccaggttgg | 540 |
ttgaagactt | tcaatgacta | ctttagagac | aagactcagt | atatttttaa | taacatggtc | 600 |
ctaaagctga | aagaagactc | acggaggaag | tttatttggt | ctgagatctc | ttacctttca | 660 |
aagtggtggg | atattataga | tattcagaag | aaggatgctg | ttaaaagttt | aatagaaaat | 720 |
ggtcagcttg | aaattgtgac | aggtggctgg | gttatgcctg | atgaagctac | tccacattat | 780 |
tttgccttaa | ttgatcaact | aattgaagga | catcagtggc | tggaaaataa | tataggagtg | 840 |
aaacctcggt | ccggctgggc | tattgatccc | tttggacact | caccaacaat | ggcttatctt | 900 |
ctaaaccgtg | ctggactttc | tcacatgctt | atccagagag | ttcattatgc | agttaaaaaa | 960 |
cactttgcac | tgcataaaac | attggagttt | ttttggagac | agaattggga | tctgggatct | 1020 |
gtcacagata | ttttatgcca | catgatgccc | ttctacagct | atgacatccc | tcacacttgt | 1080 |
ggacctgatc | ctaaaatatg | ctgccagttt | gattttaaac | gtcttcctgg | aggcagattt | 1140 |
ggttgtccct | ggggagtccc | cccagaaaca | atacatcctg | gaaatgtcca | aagcagggct | 1200 |
cggatgctac | tagatcagta | ccgaaagaag | tcaaagcttt | ttcgtaccaa | agttctcctg | 1260 |
gctccactag | gagatgattt | ccgctactgt | gaatacacgg | aatgggattt | acagtttaag | 1320 |
aattatcagc | agctttttga | ttatatgaat | tctcagtcca | agtttaaagt | taagatacag | 1380 |
tttggaactt | tatcagattt | ttttgatgcg | ctggataaag | cagatgaaac | tcagagagac | 1440 |
aagggccagt | cgatgttccc | tgttttaagt | ggagattttt | tcacttatgc | cgatcgagat | 1500 |
gatcattact | ggagtggcta | ttttacatcc | agaccctttt | acaaacgaat | ggacagaatc | 1560 |
atggaatctc | atttaagggc | tgctgaaatt | ctttactatt | tcgccctgag | acaagctcac | 1620 |
aaatacaaga | taaataaatt | tctctcatca | tcactttaca | cggcactgac | agaagccaga | 1680 |
aggaatttgg | gactgtttca | acatcatgat | gctatcacag | gaactgcaaa | agactgggtg | 1740 |
gttgtggatt | atggtaccag | actttttcat | tcgttaatgg | ttttggagaa | gataattgga | 1800 |
aattctgcat | ttcttcttat | tttgaaggac | aaactcacat | acgactctta | ctctcctgat | 1860 |
accttcctgg | agatggattt | gaaacaaaaa | tcacaagatt | ctctgccaca | aaaaaatata | 1920 |
ataaggctga | gtgcggagcc | aaggtacctt | gtggtctata | atcctttaga | acaagaccga | 1980 |
PL 222 220 B1
atctcgttgg | tctcagtcta | tgtgagttcc | ccgacagtgc | aagtgttctc | tgcttcagga | 2040 |
aaacctgtgg | aagttcaagt | cagcgcagtt | tgggatacag | caaatactat | ttcagaaaca | 2100 |
gcctatgaga | tctcttttcg | agcacatata | ccgccattgg | gactgaaagt | gtataagatt | 2160 |
ttggaatcag | caagttcaaa | ttcacattta | gctgattatg | tcttgtataa | gaataaagta | 2220 |
gaagatagcg | gaattttcac | cataaagaat | atgataaata | ctgaagaagg | tataacacta | 2280 |
gagaactcct | ttgttttact | tcggtttgat | caaactggac | ttatgaagca | aatgatgact | 2340 |
aaagaagatg | gtaaacacca | tgaagtaaat | gtgcaatttt | catggtatgg | aaccacaatt | 2400 |
aaaagagaca | aaagtggtgc | ctacctcttc | ttacctgatg | gtaatgccaa | gccttatgtt | 2460 |
tacacaacac | cgccctttgt | cagagtgaca | catggaagga | tttattcgga | agtgacttgc | 2520 |
ttttttgacc | atgttactca | tagagtccga | ctataccaca | tacagggaat | agaaggacag | 2580 |
tctgtggaag | tttccaatat | tgtggacatc | cgaaaagtat | ataaccgtga | gattgcaatg | 2640 |
aaaatttctt | ctgatataaa | aagccaaaat | agattttata | ctgacctaaa | tgggtaccag | 2700 |
attcaaccta | gaatgacact | gagcaaattg | cctcttcaag | caaatgtcta | tcccatgacc | 2760 |
acaatggcct | atatccagga | tgccaaacat | cgtttgacac | tgctctctgc | tcagtcttta | 2820 |
ggggtttcga | gtttgaatag | tggtcagatt | gaagttatca | tggatcgaag | actcatgcaa | 2880 |
gatgataatc | gtggccttga | gcaaggtatc | caggataaca | agattacagc | taatctattt | 2940 |
cgaatactac | tagaaaaaag | aagtgctgtt | aatacggaag | aagaaaagaa | gtcggtcagt | 3000 |
tatccttctc | tccttagcca | cataacttct | tctctcatga | atcatccagt | cattccaatg | 3060 |
gcaaataagt | tcttctcacc | tacccttgag | ctgcaaggtg | aattctctcc | attacagtca | 3120 |
tctttgcctt | gtgacattca | tctggttaat | ttgagaacaa | tacagtcaaa | ggtgggcaat | 3180 |
gggcactcca | atgaggcagc | cttgatcctc | cacagaaaag | ggtttgattg | tcggttctct | 3240 |
agcaaaggca | cagggctgtt | ttgttctact | actcagggaa | agatattggt | acagaaactt | 3300 |
ttaaacaagt | ttattgtcga | aagtctcaca | ccttcatcac | tatccttgat | gcattcacct | 3360 |
cccggcactc | agaatataag | tgagatcaac | ttgagtccaa | tggaaatcag | cacattccga | 3420 |
atccagttga | ggtga | 3435 |
<210> 18
PL 222 220 B1 <211> 1144 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Man II <400> 18
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 1 5 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser His Leu Leu Pro Ser Gin Leu Ser Leu Ser Val Asp 100 105 110
Thr Ala Asp Cys Leu Phe Ala Ser Gin Ser Gly Ser His Asn Ser Asp 115 120 125
Val Gin Met Leu Asp Val Tyr Ser Leu Ile Ser Phe Asp Asn Pro Asp 130 135 140
Gly Gly Val Trp Lys Gin Gly Phe Asp Ile Thr Tyr Glu Ser Asn Glu 145 150 155 160
Trp Asp Thr Glu Pro Leu Gin Val Phe Val Val Pro His Ser His Asn 165 170 175
PL 222 220 B1
PL 222 220 B1
PL 222 220 B1
Lys Asp Lys Leu Thr Tyr Asp Ser Tyr Ser Pro Asp Thr Phe Leu Glu 610 615 620
Met Asp Leu Lys Gin Lys Ser Gin Asp Ser Leu Pro Gin Lys Asn Ile 625 630 635 640
Ile Arg Leu Ser Ala Glu Pro Arg Tyr Leu Val Val Tyr Asn Pro Leu 645 650 655
Glu Gin Asp Arg Ile Ser Leu Val Ser Val Tyr Val Ser Ser Pro Thr 660 665 670
Val Gin Val Phe Ser Ala Ser Gly Lys Pro Val Glu Val Gin Val Ser 675 680 685
Ala Val Trp Asp Thr Ala Asn Thr Ile Ser Glu Thr Ala Tyr Glu Ile 690 695 700
Ser Phe Arg Ala His Ile Pro Pro Leu Gly Leu Lys Val Tyr Lys Ile 705 710 715 720
Leu Glu Ser Ala Ser Ser Asn Ser His Leu Ala Asp Tyr Val Leu Tyr 725 730 735
Lys Asn Lys Val Glu Asp Ser Gly Ile Phe Thr Ile Lys Asn Met Ile 740 745 750
Asn Thr Glu Glu Gly Ile Thr Leu Glu Asn Ser Phe Val Leu Leu Arg 755 760 765
Phe Asp Gin Thr Gly Leu Met Lys Gin Met Met Thr Lys Glu Asp Gly 770 775 780
Lys His His Glu Val Asn Val Gin Phe Ser Trp Tyr Gly Thr Thr Ile 785 790 795 800
Lys Arg Asp Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asp Gly Asn Ala 805 810 815
PL 222 220 B1
Lys | Pro Tyr Val 820 | Tyr Thr Thr Pro Pro Phe Val Arg Val Thr His | Gly | ||||||||||||
825 | 830 | ||||||||||||||
Arg | Ile | Tyr | Ser | Glu | Val | Thr | Cys | Phe | Phe | Asp | His | Val | Thr | His | Arg |
835 | 84Θ | 845 | |||||||||||||
Val | Arg | Leu | Tyr | His | Ile | Gin | Gly | Ile | Glu | Gly | Gin | Ser | Val | Glu | Val |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Ser | Asn | Ile | Val | Asp | Ile | Arg | Lys | Val | Tyr | Asn | Arg | Glu | Ile | Ala | Met |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Lys | Ile | Ser | Ser | Asp | Ile | Lys | Ser | Gin | Asn | Arg | Phe | Tyr | Thr | Asp | Leu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Asn | Gly | Tyr | Gin | Ile | Gin | Pro | Arg | Met | Thr | Leu | Ser | Lys | Leu | Pro | Leu |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Gin | Ala | Asn | Val | Tyr | Pro | Met | Thr | Thr | Met | Ala | Tyr | Ile | Gin | Asp | Ala |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Lys | His | Arg | Leu | Thr | Leu | Leu | Ser | Ala | Gin | Ser | Leu | Gly | Val | Ser | Ser |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Leu | Asn | Ser | Gly | Gin | Ile | Glu | Val | Ile | Met | Asp | Arg | Arg | Leu | Met | Gin |
945 | 95Θ | 955 | 960 | ||||||||||||
Asp | Asp | Asn | Arg | Gly | Leu | Glu | Gin | Gly | Ile | Gin | Asp | Asn | Lys | Ile | Thr |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Ala | Asn | Leu | Phe | Arg | Ile | Leu | Leu | Glu | Lys | Arg | Ser | Ala | Val | Asn | Thr |
980 | 985 | 990 |
Glu Glu Glu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Ser His Ile 995 1000 1005
Thr Ser 1010
Ser Leu Met Asn
His
1015
Pro Val Ile
Pro Met Ala Asn Lys 1020
PL 222 220 B1
Phe | Phe 1025 | Ser | Pro | Thr | Leu | Glu 1030 | Leu | Gin | Gly | Glu | Phe 1035 | Ser | Pro | Leu |
Gin | Ser | Ser | Leu | Pro | Cys | Asp | Ile | His | Leu | Val | Asn | Leu | Arg | Thr |
1040 | 1045 | 1050 | ||||||||||||
Ile | Gin | Ser | Lys | Val | Gly | Asn | Gly | His | Ser | Asn | Glu | Ala | Ala | Leu |
1055 | 1060 | 1065 | ||||||||||||
Ile | Leu | His | Arg | Lys | Gly | Phe | Asp | Cys | Arg | Phe | Ser | Ser | Lys | Gly |
1070 | 1075 | 1080 | ||||||||||||
Thr | Gly | Leu | Phe | Cys | Ser | Thr | Thr | Gin | Gly | Lys | Ile | Leu | Val | Gin |
1085 | 1090 | 1095 | ||||||||||||
Lys | Leu | Leu | Asn | Lys | Phe | Tle | Val | Glu | Ser | Leu | Thr | Pro | Ser | Ser |
1100 | 1105 | 1110 | ||||||||||||
Leu | Ser | Leu | Met | His | Ser | Pro | Pro | Gly | Thr | Gin | Asn | Ile | Ser | Glu |
1115 | 1120 | 1125 | ||||||||||||
Ile | Asn | Leu | Ser | Pro | Met | Glu | Ile | Ser | Thr | Phe | Arg | Ile | Gin | Leu |
1130 | 1135 | 1140 |
Arg <21Θ> 19 <211> 1116 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja nukleotydowa Manll-GalT <400> 19 atgaagttaa gccgccagtt caccgtgttc ggcagtgcga tcttctgtgt tcgctctacc tgatgctgga ccggggtcac ttagactacc ccaggaaccc ggctccttcc ctcagggcca gctctcaatg ttgcaagaaa aaatagacca ttgctagctg agaataatga gatcatctca aatattagag actcagtcat ggtgattttc gcgccgcgag tttggagcgt caatttgagt
120
180
240
PL 222 220 B1
gagtctgtgg | aggatggtcc | gaaaagttca | caaagcaatt | tcagccaagg | tgctggctca | 300 |
cccgcctgcc | ctgaggagtc | cccgctgctt | gtgggcccca | tgctgattga | gtttaacatg | 360 |
cctgtggacc | tggagctcgt | ggcaaagcag | aacccaaatg | tgaagatggg | cggccgctat | 420 |
gcccccaggg | actgcgtctc | tcctcacaag | gtggccatca | tcattccatt | ccgcaaccgg | 480 |
caggagcacc | tcaagtactg | gctatattat | ttgcacccag | tcctgcagcg | ccagcagctg | 540 |
gactatggca | tctatgttat | caaccaggcg | ggagacacta | tattcaatcg | tgctaagctc | 600 |
ctcaatgttg | gctttcaaga | agccttgaag | gactatgact | acacctgctt | tgtgtttagt | 660 |
gacgtggacc | tcattccaat | gaatgaccat | aatgcgtaca | ggtgtttttc | acagccacgg | 720 |
cacatttccg | ttgcaatgga | taagtttgga | ttcagcctac | cttatgttca | gtattttgga | 780 |
ggtgtctctg | ctctaagtaa | acaacagttt | ctaaccatca | atggatttcc | taataattat | 840 |
tggggctggg | gaggagaaga | tgatgacatt | tttaacagat | tagtttttag | aggcatgtct | 900 |
atatctcgcc | caaatgctgt | ggtcgggagg | tgtcgcatga | tccgccactc | aagagacaaa | 960 |
aaaaatgaac | ccaatcctca | gaggtttgac | cgaattgcac | acacaaagga | gacaatgctc | 1020 |
tctgatggtt | tgaactcact | cacctaccag | gtgctggatg | tacagagata | cccattgtat | 1080 |
acccaaatca | cagtggacat | cgggacaccg | agctag | 1116 |
<210> 20 <211> 371 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa Manll-GalT <400> 20
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys 15 10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
PL 222 220 B1
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly 100 105 110
Pro Met Leu Ile Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala 115 120 125
Lys Gin Asn Pro Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp 130 135 14Θ
Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg 145 150 155 160
Gin Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gin 165 170 175
Arg Gin Gin Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gin Ala Gly Asp 180 185 190
Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gin Glu Ala 195 200 205
Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu 210 215 220
Ile Pro Met Asn Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg 225 230 235 240
His Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val 245 250 255
Gin Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe Leu Thr
PL 222 220 B1
260
270
265
Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp 275 280 285
Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro 290 295 300
Asn Ala Val Val Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys 305 310 315 320
Lys Asn Glu Pro Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys 325 33Θ 335
Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu 340 345 350
Asp Val Gin Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly 355 360 365
Thr Pro Ser 370 <210> 21 <211> 460 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej Gntlll <400> 21
Pro Leu Leu Gin Pro Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Glu Glu Leu His 15 10 15
Arg Val Asp Phe Val Leu Pro Glu Asp Thr Thr Glu Tyr Phe Val Arg 20 25 30
Thr Lys Ala Gly Gly Val Cys Phe Lys Pro Gly Thr Arg Met Leu Glu 35 40 45
PL 222 220 B1
Lys Pro Ser Pro Gly Arg Thr Glu Glu Lys Thr Lys Val Ala Glu Gly 50 55 60
Ser Ser Val Arg Gly Pro Ala Arg Arg Pro Met Arg His Val Leu Ser 65 70 75 80
Ala Arg Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Thr Arg Arg Lys Trp Val Glu 85 90 95
Cys Val Cys Leu Pro Gly Trp His Gly Pro Ser Cys Gly Val Pro Thr 100 105 110
Val Val Gin Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Lys Glu Arg Leu Val Pro Arg 115 120 125
Glu Val Pro Arg Arg Val Ile Asn Ala Ile Asn Ile Asn His Glu Phe 130 135 140
Asp Leu Leu Asp Val Arg Phe His Glu Leu Gly Asp Val Val Asp Ala 145 150 155 160
Phe Val Val Cys Glu Ser Asn Phe Thr Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Pro 165 170 175
Leu Lys Phe Arg Glu Met Leu Thr Asn Gly Thr Phe Glu Tyr Ile Arg 180 185 190
His Lys Val Leu Tyr Val Phe Leu Asp His Phe Pro Pro Gly Gly Arg 195 200 205
Gin Asp Gly Trp Ile Ala Asp Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Leu Thr Gin 210 215 220
Asp Gly Val Ser Arg Leu Arg Asn Leu Arg Pro Asp Asp Val Phe Ile 225 230 235 240
Ile Asp Asp Ala Asp Glu Ile Pro Ala Arg Asp Gly Val Leu Phe Leu 245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Gly Trp Thr Glu Pro Phe Ala Phe His Met Arg Lys
PL 222 220 B1
260
270
265
5er Leu Tyr Gly Phe Phe Trp Lys Gin Pro Gly Thr Leu Glu Val Val 275 280 285
Ser Gly Cys Thr Ile Asp Met Leu Gin Ala Val Tyr Gly Leu Asp Gly 290 295 300
Ile Arg Leu Arg Arg Arg Gin Tyr Tyr Thr Met Pro Asn Phe Arg Gin 305 310 315 320
Tyr Glu Asn Arg Thr Gly His Ile Leu Val Gin Trp Ser Leu Gly Ser 325 330 335
Pro Leu His Phe Ala Gly Trp His Cys Ser Trp Cys Phe Thr Pro Glu 340 345 350
Gly Ile Tyr Phe Lys Leu Val Ser Ala Gin Asn Gly Asp Phe Pro Arg 355 360 365
Trp Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Arg Asp Leu Asn Tyr Ile Arg Ser Leu 370 375 380
Ile Arg Thr Gly Gly Trp Phe Asp Gly Thr Gin Gin Glu Tyr Pro Pro 385 390 395 400
Ala Asp Pro Ser Glu His Met Tyr Ala Pro Lys Tyr Leu Leu Lys Asn 405 410 415
Tyr Asp Gin Phe Arg Tyr Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Arg Glu Pro Lys 420 425 430
Ser Thr Val Glu Gly Gly Arg Arg Asn Gin Gly Ser Asp Gly Arg Ser 435 440 445
Ser Ala Val Arg Gly Lys Leu Asp Thr Thr Glu Gly 450 455 460 <210> 22
PL 222 220 B1 <211> 271 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej GalT <400> 22
Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro 1 5
Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile 10 15
Glu Phe Asn Met Pro Val Asp Leu 20
Glu Leu Val Ala Lys Gin Asn Pro 25 30
Asn Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr 35 40
Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro 45
His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro 50 55
Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu 60
Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His 65 70
Pro Val Leu Gin Arg Gin Gin Leu 75 80
Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn 85
Gin Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn 90 95
Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly 100
Phe Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr 105 11Θ
Asp Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser 115 120
Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn 125
Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe 130 135
Ser Gin Pro Arg His Ile Ser Val 140
Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser 145 150
Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly 155 160
Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin 165
Gin Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe 170 175
PL 222 220 B1
Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn 180 185 190
Arg Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val 195 200 205
Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro 210 215 220
Asn Pro Gin Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu 225 230 235 240
Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg 245 25Θ 255
Tyr Pro Leu Tyr Thr Gin Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 260 265 270 <210> 23 <211> 100 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sekwencja aminokwasowa domeny lokalizacji Man II w aparacie Golgiego <4ΘΘ> 23
Met Lys Leu Ser Arg Gin Phe Thr Val Phe Gly Ser Ala Ile Phe Cys
10 15
Val Val Ile Phe Ser Leu Tyr Leu Met Leu Asp Arg Gly His Leu Asp 20 25 30
Tyr Pro Arg Asn Pro Arg Arg Glu Gly Ser Phe Pro Gin Gly Gin Leu 35 40 45
Ser Met Leu Gin Glu Lys Ile Asp His Leu Glu Arg Leu Leu Ala Glu 50 55 60
Asn Asn Glu Ile Ile Ser Asn Ile Arg Asp Ser Val Ile Asn Leu Ser 65 70 75 80
PL 222 220 B1
Glu Ser Val Glu Asp Gly Pro Lys Ser Ser Gin Ser Asn Phe Ser Gin 85 90 95
Gly Ala Gly Ser 100
<210> | 24 | |
<211> | 102 | |
<212> | PRT | |
<213> | Sekwencja | sztuczna |
<220> | ||
<223> | Sekwencja | aminokwa |
<400> 24
Met Leu Lys Lys Gin Ser Ala Gly Leu Val Leu Trp Gly Ala Ile Leu 15 10 15
Phe Val Ala Trp Asn Ala Leu Leu Leu Leu Phe Phe Trp Thr Arg Pro 20 25 30
Ala Pro Gly Arg Pro Pro Ser Val Ser Ala Leu Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45
Ser Leu Thr Arg Glu Val Ile Arg Leu Ala Gin Asp Ala Glu Val Glu 50 55 60
Leu Glu Arg Gin Arg Gly Leu Leu Gin Gin Ile Gly Asp Ala Leu Ser 65 70 75 80
Ser Gin Arg Gly Arg Val Pro Thr Ala Ala Pro Pro Ala Gin Pro Arg 85 90 95
Val Pro Val Thr Pro Ala 100
PL 222 220 B1
Claims (1)
- Zastrzeżenia patentoweKomórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera (a) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową, która zawiera domenę katalityczną β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazy III (GnTIII) lub β (1,4)-galaktozylotransferazy (GalT) i domenę lokalizacji w aparacie Golgiego β (1,2)-N-acetyloglukozaminylotransferazy I (GnTI) lub mannozydazy II (ManII); i (b) co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza, przy czym polipeptyd ten jest wybrany z grupy składającej się z cząsteczki całego przeciwciała, fragmentu przeciwciała oraz fuzji białkowej, przy czym ten polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza obejmuje region Fc ludzkiej IgG, a fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości wystarczającej do modyfikowania oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym domena katalityczna GnTIII ma aktywność GnTIII i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją z SEK. ID. NR: 21 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, domena katalityczna GalT ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 22 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, natomiast domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję co najmniej w 90% identyczną z sekwencją z SEK. ID. NR: 23 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, a domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 24 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptydem wytwarzanym przez tę komórkę gospodarza jest IgG lub jej fragment.Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptydem wytwarzanym przez tę komórkę gospodarza jest IgG1 lub jej fragment.Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że fuzja polipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GnTIII.Komórka gospodarza według zastrz. 4, znamienna tym, że domena katalityczna GnTIII ma aktywność GnTIII i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 21 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.Komórka gospodarza według zastrz. 4, znamienna tym, że domena katalityczna GnTIII ma aktywność GnTIII i obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 21.Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że fuzja polipeptydowa obejmuje domenę katalityczną GalT.Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że domena katalityczna GalT ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 22 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że domena katalityczna GalT ma aktywność GalT i obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 22 Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji Man II.Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 23 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi.Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, ż domena lokalizacji w aparacie Golgiego Man II obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK.ID.NR: 23.Komórka gospodarza według zastrz. 1, znamienna tym, że domeną lokalizacji w aparacie Golgiego jest domena lokalizacji GnTI.PL 222 220 B114. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową co najmniej w 95% identyczną z sekwencją aminokwasową z SEK. ID. NR: 24 z konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi15. Komórka gospodarza, według zastrz. 13, znamienna tym że domena lokalizacji w aparacie Golgiego GnTI obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 24.16. Komórka gospodarza według zastrz. 1-15, znamienna tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększoną funkcję efektorową w wyniku tej modyfikacji.17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększona cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc.18. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z komórkami NK.19. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z makrofagami.20. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi.21. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z monocytami.22. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę.23. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych.24. Komórka gospodarza według zastrz. 16, znamienna tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone piętnowanie komórek T.25. Komórka według z zastrz. 1-15, znamienna tym, że polipeptyd wytworzony przez tę komórkę wykazuje w wyniku tej modyfikacji zwiększone powinowactwo do receptora Fc.26. Komórka gospodarza według zastrz. 25, znamienna tym, że receptorem Fc jest receptor aktywujący Fc-,'.27. Komórka gospodarza według zastrz. 25, znamienna tym, że receptorem Fc jest receptor FoyRIIIA.28. Komórka gospodarza według z zastrz. 1-15, znamienna tym, że jest komórką CHO, komórką BHK, komórką NSO, komórką SP2/0, komórką szpiczaka YO, mysią komórką szpiozaka P3X63, komórką PER, komórką PER.C6 lub komórką hybrydoma.29. Komórka gospodarza według z zastrz. 1-15, znamienna tym, że polipeptydem wytwarzanym przez komórkę gospodarza jest przeciwciało anty-CD20.30. Komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że przeciwciałem anty-CD20 jest IDEC-C2B8.31. Komórka gospodarza według z zastrz. 1-15, znamienna tym, że polipeptydem wytwarzanym przez komórkę gospodarza jest chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 wobec ludzkich komórek raka nerki.32. Komórka gospodarza według z zastrz. 1-15, znamienna tym, że co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę jest transfekowanym kwasem nukleinowym.33. Komórka gospodarza według dowolnego z zastrz. 1-15, znamienna tym, że co najmniej jeden kwas nukleinowy kodujący fuzję polipeptydową jest połączony funkcjonalnie z konstytutywnym elementem promotorowym.34. Komórka gospodarza według zastrz. 32, znamienna tym, że co najmniej jeden transfekowany kwas nukleinowy koduje przeciwciało anty-CD20, chimerowe przeciwciało monoklonalne chCE7 przeciw ludzkiemu nerwiakowi, chimerowe przeciwciało monoklonalne chG250 przeciw rakowi komórek nerki, chimerowe przeciwciało monoklonalne ING-1 przeoiw ludzkim rakom okrężnicy, płuc i sutka, humanizowane monoklonalne przeciwciało 3622W94 antyludzki antygen 17-1A, humanizowane przeciwciało A33 przeciw rakowi okrężnicy i odbytu człowieka, przeciwciało R24 przeciw czerniakowi człowieka skierowane przeciwko gangliozydowi GD3, ohimerowe przeciwciało monoklonalne SF-25 przeciw rakowi płasko komórkowemu człowieka, przeciwciało anty-ludzki EGFR, przeciwciało anty-ludzki EG-FRvIII, przeciwciało anty-ludzki PSMA, przeciwciało anty-ludzki PSCA, przeciwciało anty-ludzki CD22,PL 222 220 B1 przeciwciało anty-ludzki CD30, przeciwciało anty-ludzki CD33, przeciwciało anty-ludzki CD38 człowieka, przeciwciało anty-ludzki CD40, przeciwciało anty-ludzki CD45, przeciwciało anty-ludzki CD52, przeciwciało anty-ludzki CD138, przeciwciało anty-ludzki wariant HLA-DR, przeciwciało anty-ludzki EpCAM, przeciwciało anty-ludzki CEA, przeciwciało anty-ludzki MUC1, przeciwciało anty-ludzkie białko rdzenia MUC1, przeciwciało przeciw nieprawidłowo glikozylowanemu ludzkiemu MUC1, przeciwciało przeciw wariantom ludzkiej fibronektyny zawierającym domenę ED-B lub przeciwciało anty-ludzki HER2/neu.Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza, znamienny tym, że obejmuje:a. hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 1-15 w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie tego polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza, przy czym ta fuzja polipeptydowa jest wyrażana w ilości dostatecznej do modyfikacji oligosacharydów w regionie Fc polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza; ib. izolowanie polipeptydu wytwarzanego przez komórkę gospodarza.Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez tę komórkę gospodarza wykazuje zwiększoną funkcję efektorową w wyniku modyfikacji.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest cytotoksyczność komórkowa, w której pośredniczy Fc.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z komórkami NK.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z makrofagami.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone wiązanie się z monocytami.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiekszone wiązanie się z komórkami wielojądrzastymi.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone bezpośrednie przekazywanie sygnału indukującego apoptozę.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększona funkcją efektorową jest zwiększone dojrzewanie komórek dendrytycznych.Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że zwiększoną funkcją efektorową jest zwiększone piętnowanie komórek T.Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększone wiązanie się z receptorem Fc w wyniku modyfikacji.Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że receptorem Fc jest receptor aktywujący Fc. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że receptorem Fc jest receptor FcγRIIIA.Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększony udział przeciętych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu.Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększony udział oligosacharydów niefukozylowanych w regionie Fc takiego polipeptydu.Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe.Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że niefukozylowane oligosacharydy są złożone. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że polipeptyd wytwarzany przez komórkę gospodarza wykazuje zwiększony udział przeciętych niefukozylowanych oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu.Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że przecięte niefukozylowane oligosacharydy są hybrydowe.Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że przecięte niefukozylowane oligosacharydy są złożone.Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że co najmniej 20% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte niefukozylowane oligosacharydy.Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że co najmniej 25% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte, niefukozylowane oligosacharydy.PL 222 220 B157. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że co najmniej 30% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte, niefukozylowane oligosacharydy.58. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że co najmniej 35% oligosacharydów w regionie Fc takiego polipeptydu stanowią przecięte, niefukozylowane oligosacharydy.Rysunki
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44130703P | 2003-01-22 | 2003-01-22 | |
US49125403P | 2003-07-31 | 2003-07-31 | |
US49514203P | 2003-08-15 | 2003-08-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL393644A1 PL393644A1 (pl) | 2011-06-06 |
PL222220B1 true PL222220B1 (pl) | 2016-07-29 |
Family
ID=32777012
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL393646A PL222222B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Sposób wytwarzania polipeptydu |
PL393641A PL222219B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL393644A PL222220B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL393645A PL222206B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL377967A PL224786B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza |
PL393647A PL222221B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL415463A PL224787B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL393646A PL222222B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Sposób wytwarzania polipeptydu |
PL393641A PL222219B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
Family Applications After (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL393645A PL222206B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL377967A PL224786B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza |
PL393647A PL222221B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza |
PL415463A PL224787B1 (pl) | 2003-01-22 | 2004-01-22 | Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, fuzje polipeptydowe, komórki gospodarza, sposób wytwarzania fuzji polipeptydowych, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8367374B2 (pl) |
EP (4) | EP1587921B1 (pl) |
JP (4) | JP5425365B2 (pl) |
KR (2) | KR101498588B1 (pl) |
CN (1) | CN103540600B (pl) |
AT (1) | ATE475708T1 (pl) |
AU (2) | AU2004205802B2 (pl) |
CA (1) | CA2513797C (pl) |
CZ (1) | CZ308720B6 (pl) |
DE (1) | DE602004028337D1 (pl) |
ES (3) | ES2543734T3 (pl) |
HK (1) | HK1089205A1 (pl) |
IL (2) | IL169805A (pl) |
MX (1) | MXPA05007781A (pl) |
NO (1) | NO339270B1 (pl) |
NZ (5) | NZ567320A (pl) |
PL (7) | PL222222B1 (pl) |
SG (2) | SG2013005590A (pl) |
WO (1) | WO2004065540A2 (pl) |
Families Citing this family (232)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6136311A (en) | 1996-05-06 | 2000-10-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of cancer |
EP2261229A3 (en) | 1998-04-20 | 2011-03-23 | GlycArt Biotechnology AG | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
JP3528611B2 (ja) * | 1998-07-16 | 2004-05-17 | Jfeスチール株式会社 | 結束材の切断方法及びその装置 |
EP1423510A4 (en) | 2001-08-03 | 2005-06-01 | Glycart Biotechnology Ag | ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES |
EP1587921B1 (en) * | 2003-01-22 | 2010-07-28 | GlycArt Biotechnology AG | Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function |
JPWO2004087761A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2006-07-27 | 麒麟麦酒株式会社 | ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製 |
EA202091901A1 (ru) | 2003-11-05 | 2020-11-24 | Роше Гликарт Аг | АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ |
TW200539855A (en) * | 2004-03-15 | 2005-12-16 | Wyeth Corp | Calicheamicin conjugates |
AU2004224925C1 (en) * | 2004-08-30 | 2011-07-21 | Biotest Ag | Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof |
WO2006082515A2 (en) | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Glycart Biotechnology Ag | Antigen binding molecules that bind egfr, vectors encoding same, and uses thereof |
CN101128486A (zh) | 2005-02-18 | 2008-02-20 | 米德列斯公司 | 缺乏岩藻糖残基的抗cd30单克隆抗体 |
AU2006226060A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-09-28 | Glycart Biotechnology Ag | Antigen binding molecules directed to MCSP and having increased Fc receptor binding affinity and effector function |
EP1888649A2 (en) * | 2005-05-09 | 2008-02-20 | GlycArt Biotechnology AG | Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors |
US7566456B2 (en) * | 2005-06-23 | 2009-07-28 | Haiming Chen | Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases |
SG164379A1 (en) | 2005-07-21 | 2010-09-29 | Genmab As | Potency assays for antibody drug substance binding to an fc receptor |
CN101291954B (zh) * | 2005-08-26 | 2013-03-27 | 罗氏格黎卡特股份公司 | 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子 |
ATE509033T1 (de) | 2006-03-20 | 2011-05-15 | Univ California | Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting |
MX2008011905A (es) * | 2006-03-21 | 2008-09-30 | Genentech Inc | Terapia de combinacion. |
US7846724B2 (en) | 2006-04-11 | 2010-12-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies |
WO2008008482A2 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Genentech, Inc. | Altered br3-binding polypeptides |
AR062223A1 (es) * | 2006-08-09 | 2008-10-22 | Glycart Biotechnology Ag | Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas |
AU2007312367B2 (en) | 2006-10-12 | 2012-09-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody |
KR20090130029A (ko) * | 2007-03-07 | 2009-12-17 | 글리코파이, 인크. | 푸코실화가 변형된 당단백질의 제조 |
EP1995309A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-26 | Vivalis | Recombinant protein production in avian EBx® cells |
CN103382487A (zh) | 2007-06-15 | 2013-11-06 | 麦迪卡格公司 | 修饰植物中的糖蛋白产生 |
CA2698343C (en) | 2007-09-04 | 2018-06-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
CA2697482C (en) | 2007-09-05 | 2016-05-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy with type i and type ii anti-cd20 antibodies |
KR101554753B1 (ko) | 2007-10-01 | 2015-09-22 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 메소텔린에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도 |
US20090098118A1 (en) | 2007-10-15 | 2009-04-16 | Thomas Friess | Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
BRPI0819593A2 (pt) | 2007-12-21 | 2015-05-05 | Genentech Inc | "método para tratamento de um paciente com artrite reumatóide (ra)" |
US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
JP5990365B2 (ja) * | 2007-12-26 | 2016-09-14 | バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト | Cd138を標的とする剤及びその使用 |
PL2242772T3 (pl) * | 2007-12-26 | 2015-05-29 | Biotest Ag | Immunokonjugaty nakierowane na CD138 i ich zastosowanie |
EP2238169A1 (en) * | 2007-12-26 | 2010-10-13 | Biotest AG | Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates |
JP2011508738A (ja) * | 2007-12-26 | 2011-03-17 | バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト | Cd138発現腫瘍細胞のターゲティングを向上させる方法及び剤 |
CN101918451A (zh) * | 2008-01-15 | 2010-12-15 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 抗CCR5的afucosylated抗体及其用途 |
KR101054362B1 (ko) * | 2008-07-03 | 2011-08-05 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법 |
JP5813505B2 (ja) | 2008-07-18 | 2015-11-17 | メディカゴ インコーポレイテッド | 新規インフルエンザウイルス免疫エピトープ |
US8394924B2 (en) * | 2008-10-23 | 2013-03-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed engagement of activating Fc receptors |
ES2712732T3 (es) | 2009-02-17 | 2019-05-14 | Cornell Res Foundation Inc | Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico |
AR075982A1 (es) | 2009-03-31 | 2011-05-11 | Roche Glycart Ag | Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion |
CA2754646A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | Roche Glycart Ag | Treatment of cancer with a humanized anti-egfr igg1 antibody and irinotecan |
PE20120591A1 (es) | 2009-04-02 | 2012-05-23 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla |
AU2010233993A1 (en) | 2009-04-07 | 2011-09-08 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-ErbB-1/anti-c-Met antibodies |
US20100256340A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-07 | Ulrich Brinkmann | Trivalent, bispecific antibodies |
AU2010233994A1 (en) | 2009-04-07 | 2011-09-22 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-ErbB-3/anti-c-Met antibodies |
US9289509B2 (en) * | 2009-05-06 | 2016-03-22 | Biotest Ag | Uses of immunoconjugates targeting CD138 |
MX2011011925A (es) | 2009-05-27 | 2011-12-06 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos. |
JP5808052B2 (ja) | 2009-05-29 | 2015-11-10 | 中外製薬株式会社 | Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物 |
US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
TWI409079B (zh) | 2009-08-14 | 2013-09-21 | Roche Glycart Ag | 非典型岩藻醣化cd20抗體與苯達莫斯汀(bendamustine)之組合療法 |
CA2769595A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Roche Glycart Ag | Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone |
TW201113037A (en) | 2009-08-28 | 2011-04-16 | Hoffmann La Roche | Antibodies against CDCP1 for the treatment of cancer |
TWI412375B (zh) | 2009-08-28 | 2013-10-21 | Roche Glycart Ag | 人類化抗cdcp1抗體 |
AU2010288469A1 (en) | 2009-08-31 | 2012-03-01 | Roche Glycart Ag | Affinity-matured humanized anti CEA monoclonal antibodies |
AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
US20120302737A1 (en) | 2009-09-16 | 2012-11-29 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
KR101436219B1 (ko) | 2009-10-26 | 2014-09-01 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법 |
EP3511023A1 (en) | 2009-12-02 | 2019-07-17 | Imaginab, Inc. | J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use |
ES2571226T3 (es) | 2009-12-22 | 2016-05-24 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos anti-HER3 y usos de los mismos |
US20110158987A1 (en) | 2009-12-29 | 2011-06-30 | F. Hoffmann-Laroche Ag | Novel antibody formulation |
TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
CN102844049B (zh) | 2010-04-27 | 2016-06-01 | 罗切格利卡特公司 | 无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂的联合疗法 |
US20120100166A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-04-26 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof |
WO2012010582A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Roche Glycart Ag | Anti-cxcr5 antibodies and methods of use |
WO2012018771A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Genentech, Inc. | Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers |
EA034742B1 (ru) | 2010-08-13 | 2020-03-16 | Роше Гликарт Аг | Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения |
KR101653030B1 (ko) | 2010-08-13 | 2016-08-31 | 로슈 글리카트 아게 | 항-테나신-c a2 항체 및 이의 사용 방법 |
AR082693A1 (es) | 2010-08-17 | 2012-12-26 | Roche Glycart Ag | Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf |
KR101586128B1 (ko) | 2010-08-24 | 2016-01-15 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 디술피드 안정화 ― Fv 단편을 포함하는 이중특이적 항체 |
MX2013006739A (es) | 2010-12-16 | 2013-07-17 | Roche Glycart Ag | Terapia combinada de anticuerpo cd20 afucosilado con inhibidor de mdm2. |
JP5766296B2 (ja) | 2010-12-23 | 2015-08-19 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用 |
JPWO2012105699A1 (ja) * | 2011-02-03 | 2014-07-03 | 株式会社イーベック | 補体依存性生物活性の高い抗体の産生法 |
RU2013139267A (ru) | 2011-02-10 | 2015-03-20 | Рош Гликарт Аг | Улучшенная иммунотерапия |
RS62238B1 (sr) | 2011-02-10 | 2021-09-30 | Roche Glycart Ag | Mutantni interleukin-2 polipeptidi |
RU2607038C2 (ru) | 2011-02-28 | 2017-01-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Антигенсвязывающие белки |
EP2681240B1 (en) | 2011-02-28 | 2017-08-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Monovalent antigen binding proteins |
JP6046642B2 (ja) | 2011-03-02 | 2016-12-21 | ロシュ グリクアート アーゲー | Cea抗体 |
EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
WO2012162561A2 (en) | 2011-05-24 | 2012-11-29 | Zyngenia, Inc. | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
FR2976811A1 (fr) | 2011-06-22 | 2012-12-28 | Lfb Biotechnologies | Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom |
KR20140048292A (ko) | 2011-08-23 | 2014-04-23 | 로슈 글리카트 아게 | 항-mcsp 항체 |
PL2748202T3 (pl) | 2011-08-23 | 2018-12-31 | Roche Glycart Ag | Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen |
BR112014006537A2 (pt) | 2011-09-23 | 2017-11-28 | Roche Glycart Ag | anticorpos biespecíficos, formulação farmacêutica, usos de um anticorpo biespecífico, método de tratamento, ácido nucleico, vetores de expressão, célula hospedeira e método para a produção de um anticorpo biespecífico |
US9994610B2 (en) | 2011-10-19 | 2018-06-12 | Roche Glycart Ag | Separation method for fucosylated antibodies |
US20130302274A1 (en) | 2011-11-25 | 2013-11-14 | Roche Glycart Ag | Combination therapy |
KR20140100571A (ko) | 2011-12-08 | 2014-08-14 | 바이오테스트 아게 | Cd138을 타겟팅하는 면역접합체의 용도 |
TWI593705B (zh) * | 2011-12-28 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient |
WO2013113641A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Roche Glycart Ag | Use of nkp46 as a predictive biomarker for cancer treatment with adcc- enhanced antibodies |
CN104105711B (zh) | 2012-02-10 | 2018-11-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 单链抗体及其他异多聚体 |
RU2014138586A (ru) | 2012-03-02 | 2016-04-20 | Рош Гликарт Аг | Прогностический биомаркер для лечения рака антителами с повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью |
US9751942B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-09-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof |
EP2852610B1 (en) | 2012-05-23 | 2018-07-11 | Glykos Finland Oy | Production of fucosylated glycoproteins |
MX2014014162A (es) | 2012-05-24 | 2015-02-04 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos multiespecificos. |
TWI797443B (zh) | 2012-05-30 | 2023-04-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗原結合分子之篩選或製造方法 |
CN104411718B (zh) | 2012-06-27 | 2018-04-24 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区缀合物的方法及其用途 |
CN104395339A (zh) | 2012-06-27 | 2015-03-04 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途 |
AU2013291964B2 (en) * | 2012-07-18 | 2017-12-14 | Glycotope Gmbh | Novel therapeutic treatments with anti-HER2 antibodies having a low fucosylation |
PL3434695T3 (pl) | 2012-08-07 | 2021-05-17 | Roche Glycart Ag | Ulepszona immunoterapia |
EP2912060B1 (en) | 2012-10-29 | 2019-12-25 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Compositions and methods for inhibiting pathogen infection |
EP2727941A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-07 | MAB Discovery GmbH | Method for the production of multispecific antibodies |
WO2014067642A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Mab Discovery Gmbh | Method for the production of multispecific antibodies |
EP2727942A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-07 | MAB Discovery GmbH | Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3 |
EP2727943A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-07 | MAB Discovery GmbH | Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3 |
TWI693073B (zh) | 2012-12-21 | 2020-05-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 對gpc3標的治療劑療法為有效之患者投與的gpc3標的治療劑 |
EP3557260B1 (en) | 2012-12-21 | 2022-05-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy |
AR094403A1 (es) | 2013-01-11 | 2015-07-29 | Hoffmann La Roche | Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3 |
WO2014114595A1 (en) | 2013-01-23 | 2014-07-31 | Roche Glycart Ag | Predictive biomarker for cancer treatment with adcc-enhanced antibodies |
ES2829499T3 (es) | 2013-02-05 | 2021-06-01 | Engmab Sarl | Método para la selección de anticuerpos contra BCMA |
EP2762496A1 (en) | 2013-02-05 | 2014-08-06 | EngMab AG | Method for the selection of antibodies against BCMA |
RU2015140921A (ru) | 2013-02-26 | 2017-04-03 | Роше Гликарт Аг | Антитела к mcsp |
CN110538322A (zh) | 2013-03-13 | 2019-12-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗体配制剂 |
UA118028C2 (uk) | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
CA2916362A1 (en) | 2013-06-24 | 2014-12-31 | Masami Suzuki | Therapeutic agent comprising humanized anti-epiregulin antibody as active ingredient for non-small-cell lung carcinoma excluding adenocarcinoma |
CN105612182B (zh) | 2013-10-11 | 2019-12-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 多特异性结构域交换共有可变轻链抗体 |
WO2015082446A1 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Treatment of cancer using an anti-cdcp1 antibody and a taxane |
TWI702316B (zh) | 2013-12-04 | 2020-08-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫 |
CN105899535A (zh) | 2013-12-17 | 2016-08-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法 |
UA117289C2 (uk) | 2014-04-02 | 2018-07-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Мультиспецифічне антитіло |
JP6827319B2 (ja) | 2014-05-08 | 2021-02-10 | 中外製薬株式会社 | Gpc3標的治療剤療法が有効である患者に投与されるgpc3標的治療剤 |
EP3904388A1 (en) * | 2014-05-27 | 2021-11-03 | Academia Sinica | Fucosidase from bacteroides and methods using the same |
PL3148581T3 (pl) | 2014-05-30 | 2020-05-18 | Henlix Biotech Co., Ltd. | Przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) |
CA2954974A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
AU2015318001B2 (en) | 2014-09-15 | 2021-03-25 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
US20160082120A1 (en) | 2014-09-23 | 2016-03-24 | Genentech, Inc. | METHODS OF USING ANTI-CD79b IMMUNOCONJUGATES |
WO2016079050A1 (en) | 2014-11-20 | 2016-05-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules cd3 abd folate receptor 1 (folr1) and pd-1 axis binding antagonists |
EP3227332B1 (en) | 2014-12-03 | 2019-11-06 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
CN115109158A (zh) | 2015-05-07 | 2022-09-27 | 阿吉纳斯公司 | 抗ox40抗体及其使用方法 |
CN116196414A (zh) | 2015-05-11 | 2023-06-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法 |
EP3108897A1 (en) | 2015-06-24 | 2016-12-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias |
WO2016207304A2 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Mab Discovery Gmbh | Monoclonal anti-il-1racp antibodies |
KR20180021864A (ko) | 2015-06-29 | 2018-03-05 | 제넨테크, 인크. | 장기 이식에서 사용하기 위한 유형 ii 항-cd20 항체 |
EA202092435A3 (ru) | 2015-08-03 | 2021-06-30 | Энгмаб Сарл | Моноклональные антитела против bcma |
EP3331564A4 (en) | 2015-08-07 | 2019-05-22 | Imaginab, Inc. | AGAINST MOLECULE TREATED ANTIGEN-BONDING CONSTRUCTS |
EP3662930A1 (en) | 2015-09-24 | 2020-06-10 | AbVitro LLC | Hiv antibody compositions and methods of use |
CA2997406C (en) | 2015-12-09 | 2024-05-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies or cytokine release |
JP2019517991A (ja) | 2016-03-01 | 2019-06-27 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 低減したadcpを有するオビヌツズマブ及びリツキシマブ変異体 |
EP3241845A1 (en) | 2016-05-06 | 2017-11-08 | MAB Discovery GmbH | Humanized anti-il-1r3 antibodies |
EP3455252B1 (en) | 2016-05-11 | 2022-02-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Modified anti-tenascin antibodies and methods of use |
EP3252078A1 (en) | 2016-06-02 | 2017-12-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer |
EP3257866A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-20 | Academisch Medisch Centrum | Modified anti-tnf antibody and use thereof in the treatment of ibd |
EP4295918A3 (en) | 2016-11-02 | 2024-03-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma |
EP3551225A1 (en) | 2016-12-07 | 2019-10-16 | Agenus Inc. | Antibodies and methods of use thereof |
WO2018147960A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Imaginab, Inc. | Extension sequences for diabodies |
SG11201909218RA (en) | 2017-04-03 | 2019-11-28 | Hoffmann La Roche | Antibodies binding to steap-1 |
TWI707871B (zh) | 2017-04-05 | 2020-10-21 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 抗lag3抗體 |
CA3059468A1 (en) | 2017-04-27 | 2018-11-01 | Tesaro, Inc. | Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof |
EP3401332A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-14 | MAB Discovery GmbH | Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions |
JP2020521791A (ja) | 2017-06-02 | 2020-07-27 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | がんの治療のためのii型抗cd20抗体及び抗cd20/cd30二重特異性抗体 |
JP2020528061A (ja) | 2017-07-26 | 2020-09-17 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | BET阻害剤、Bcl−2阻害剤及び抗CD20抗体を用いた併用療法 |
CA3070774A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-28 | Five Prime Therapeutics, Inc. | B7-h4 antibodies and methods of use thereof |
US11674125B2 (en) * | 2017-12-18 | 2023-06-13 | The General Hospital Corporation | Glycoengineering |
KR102575787B1 (ko) | 2017-12-21 | 2023-09-08 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Hla-a2/wt1에 결합하는 항체 |
EP3731865A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody |
TWI829667B (zh) | 2018-02-09 | 2024-01-21 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 結合gprc5d之抗體 |
CA3091161A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Five Prime Therapeutics, Inc. | B7-h4 antibody dosing regimens |
EP3755720A1 (en) | 2018-02-21 | 2020-12-30 | Five Prime Therapeutics, Inc. | B7-h4 antibody formulations |
AU2019228600A1 (en) | 2018-03-02 | 2020-09-24 | Five Prime Therapeutics, Inc. | B7-H4 antibodies and methods of use thereof |
AU2019245243A1 (en) | 2018-03-29 | 2020-09-03 | Genentech, Inc | Modulating lactogenic activity in mammalian cells |
US11555071B2 (en) | 2018-06-03 | 2023-01-17 | Lamkap Bio Beta Ltd. | Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47 |
JP2022502488A (ja) | 2018-09-21 | 2022-01-11 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | 粘液を透過するのを制限するための合成結合剤 |
TWI835885B (zh) | 2018-10-15 | 2024-03-21 | 美商戊瑞治療有限公司 | 用於癌症之組合療法 |
BR112021010908A2 (pt) | 2018-12-06 | 2021-08-31 | Genentech, Inc. | Método para tratamento de linfoma difuso de grandes células b, kit e imunoconjugado |
WO2020127619A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to cd3 |
AR117468A1 (es) | 2018-12-21 | 2021-08-11 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPO QUE SE UNE A VEGF Y A IL-1b Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN |
US20220153875A1 (en) | 2019-03-19 | 2022-05-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain |
MX2021013825A (es) | 2019-05-14 | 2022-01-18 | Genentech Inc | Procedimientos de uso de inmunoconjugados anti-cd79b para tratar el linfoma folicular. |
AR119382A1 (es) | 2019-07-12 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso |
AR119393A1 (es) | 2019-07-15 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a nkg2d |
EP4004045A1 (en) | 2019-07-31 | 2022-06-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antibodies binding to gprc5d |
CR20220019A (es) | 2019-07-31 | 2022-02-11 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se fijan a gprc5d |
CA3146616A1 (en) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | Matthew Dominic CASCINO | Compositions and methods of treating lupus nephritis |
US20210130492A1 (en) | 2019-09-18 | 2021-05-06 | Genentech, Inc. | Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use |
CA3153880A1 (en) | 2019-10-18 | 2020-06-09 | Juana Elva HERNANDEZ MONTALVO | Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma |
EP3831849A1 (en) | 2019-12-02 | 2021-06-09 | LamKap Bio beta AG | Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 |
CR20220256A (es) | 2019-12-18 | 2022-08-31 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4 |
EP4114860A1 (en) | 2020-03-06 | 2023-01-11 | Go Therapeutics, Inc. | Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses |
CA3169908A1 (en) | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Genentech, Inc. | Modified mammalian cells having reduced host cell proteins |
BR112022021441A2 (pt) | 2020-04-24 | 2022-12-13 | Genentech Inc | Métodos para tratar linfoma folicular e linfoma difuso de grandes células b e kits |
TW202208423A (zh) | 2020-05-17 | 2022-03-01 | 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 | Sars-cov-2抗體及其選擇和使用方法 |
BR112022024996A2 (pt) | 2020-06-08 | 2022-12-27 | Hoffmann La Roche | Anticorpos, ácido nucleico, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, composição farmacêutica, agente terapêutico, uso do anticorpo e método para tratar um indivíduo com hepatite b |
TWI811703B (zh) | 2020-06-19 | 2023-08-11 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 與cd3及cd19結合之抗體 |
JP2023530961A (ja) | 2020-06-19 | 2023-07-20 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Cd3に結合する抗体 |
TW202216767A (zh) | 2020-06-19 | 2022-05-01 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 與CD3及FolR1結合之抗體 |
WO2021255146A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to cd3 and cea |
MX2022016453A (es) | 2020-06-24 | 2023-02-01 | Genentech Inc | Lineas celulares resistentes a la apoptosis. |
CA3187277A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells |
AU2021308653A1 (en) | 2020-07-17 | 2023-02-16 | Genentech, Inc. | Anti-Notch2 antibodies and methods of use |
CN116234577A (zh) | 2020-08-10 | 2023-06-06 | 阿斯利康(英国)有限公司 | 用于治疗和预防covid-19的sars-cov-2抗体 |
WO2022047222A2 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Genentech, Inc. | Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins |
WO2022049165A1 (en) | 2020-09-04 | 2022-03-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibody that binds to vegf-a and ang2 and methods of use |
JP2023545566A (ja) | 2020-10-20 | 2023-10-30 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Pd-1軸結合アンタゴニストとlrrk2阻害剤との併用療法 |
AR123855A1 (es) | 2020-10-20 | 2023-01-18 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-mertk conjugados con peg y métodos de uso |
WO2022152656A1 (en) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells |
KR20230131205A (ko) | 2021-01-13 | 2023-09-12 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 병용 요법 |
JP2024509695A (ja) | 2021-02-03 | 2024-03-05 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法 |
JP2024512324A (ja) | 2021-03-05 | 2024-03-19 | ジーオー セラピューティクス,インコーポレイテッド | 抗グリコcd44抗体およびその使用 |
AR125074A1 (es) | 2021-03-12 | 2023-06-07 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecíficos anti-klk5 / klk7 y métodos de uso |
JP2024511970A (ja) | 2021-03-15 | 2024-03-18 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ループス腎炎の治療の組成物及び方法 |
EP4326855A1 (en) | 2021-04-19 | 2024-02-28 | Genentech, Inc. | Modified mammalian cells |
EP4326271A1 (en) | 2021-04-23 | 2024-02-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Prevention or mitigation of nk cell engaging agent-related adverse effects |
TW202244059A (zh) | 2021-04-30 | 2022-11-16 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 用抗cd20/抗cd3雙特異性抗體進行治療之給藥 |
EP4330282A1 (en) | 2021-04-30 | 2024-03-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate |
CA3218170A1 (en) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Jamie Harue HIRATA | Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma |
KR20240010469A (ko) | 2021-05-21 | 2024-01-23 | 제넨테크, 인크. | 관심 재조합 생성물의 생성을 위한 변형된 세포 |
IL308015A (en) | 2021-06-09 | 2023-12-01 | Hoffmann La Roche | A combination of a specific BRAF inhibitor (paradox breaker) and a PD-1 spindle-binding antagonist for use in cancer treatment |
EP4370545A1 (en) | 2021-07-12 | 2024-05-22 | Genentech, Inc. | Structures for reducing antibody-lipase binding |
KR20240032889A (ko) | 2021-07-14 | 2024-03-12 | 제넨테크, 인크. | 항-c-c 모티프 케모카인 수용체 8(ccr8) 항체 및 사용 방법 |
EP4373859A1 (en) | 2021-07-22 | 2024-05-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Heterodimeric fc domain antibodies |
CN117794953A (zh) | 2021-08-03 | 2024-03-29 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 双特异性抗体及使用方法 |
AU2022324456A1 (en) | 2021-08-05 | 2024-02-15 | Go Therapeutics, Inc. | Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses |
JP2024530189A (ja) | 2021-08-07 | 2024-08-16 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | びまん性大細胞型b細胞リンパ腫を処置するために抗cd79bイムノコンジュゲートを使用する方法 |
TW202325733A (zh) | 2021-09-03 | 2023-07-01 | 美商Go治療公司 | 抗醣化-lamp1抗體及其用途 |
KR20240109604A (ko) | 2021-09-03 | 2024-07-11 | 고 테라퓨틱스, 인크. | 항-글리코-cMET 항체 및 그의 용도 |
TW202342095A (zh) | 2021-11-05 | 2023-11-01 | 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 | 用於治療和預防covid—19之組成物 |
CN118284625A (zh) | 2021-11-26 | 2024-07-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗tyrp1/抗cd3双特异性抗体与tyrp1特异性抗体的组合疗法 |
AR127887A1 (es) | 2021-12-10 | 2024-03-06 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a cd3 y plap |
WO2023141445A1 (en) | 2022-01-19 | 2023-07-27 | Genentech, Inc. | Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use |
TW202342510A (zh) | 2022-02-18 | 2023-11-01 | 英商Rq生物科技有限公司 | 抗體 |
US20230414750A1 (en) | 2022-03-23 | 2023-12-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy |
WO2023201299A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | Genentech, Inc. | Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use |
WO2023198727A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use |
WO2023209177A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Astrazeneca Uk Limited | Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same |
TW202402810A (zh) | 2022-05-11 | 2024-01-16 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 與vegf—a及il6結合之抗體及其使用方法 |
US12054552B2 (en) | 2022-09-21 | 2024-08-06 | Sanofi Biotechnology | Humanized anti-IL-1R3 antibody and methods of use |
WO2024077239A1 (en) | 2022-10-07 | 2024-04-11 | Genentech, Inc. | Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies |
WO2024102734A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Genentech, Inc. | Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome |
WO2024100170A1 (en) | 2022-11-11 | 2024-05-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to hla-a*02/foxp3 |
WO2024155807A1 (en) | 2023-01-18 | 2024-07-25 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies and uses thereof |
WO2024156672A1 (en) | 2023-01-25 | 2024-08-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to csf1r and cd3 |
WO2024167898A1 (en) | 2023-02-07 | 2024-08-15 | Go Therapeutics, Inc. | ANTIBODY FUSION PROTEINS COMPRISING ANTI-GLYCO-MUC4 ANTIBODIES AND MIC PROTEIN α1-α2 DOMAINS, AND THEIR USES |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
PL174721B1 (pl) | 1992-11-13 | 1998-09-30 | Idec Pharma Corp | Przeciwciało monoklonalne anty-CD20 |
EP0831880A4 (en) | 1995-06-07 | 2004-12-01 | Imclone Systems Inc | ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH |
US6180320B1 (en) | 1998-03-09 | 2001-01-30 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Method of manufacturing a semiconductor device having a fine pattern, and semiconductor device manufactured thereby |
EP2261229A3 (en) | 1998-04-20 | 2011-03-23 | GlycArt Biotechnology AG | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
EP1224309A2 (en) * | 1999-10-21 | 2002-07-24 | Monsanto Company | Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants |
EP2251426A1 (en) * | 1999-10-26 | 2010-11-17 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mammalian-type glycosylation in plants |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
ES2252261T3 (es) | 2000-06-28 | 2006-05-16 | Glycofi, Inc. | Metodos para producir glicoproteinas modificadas. |
EP1383800A4 (en) | 2001-04-02 | 2004-09-22 | Idec Pharma Corp | RECOMBINANT ANTIBODIES CO-EXPRESSED WITH GNTIII |
AU2003219402B2 (en) * | 2002-03-19 | 2008-05-08 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | GnTIII (UDP-n-acethylglucosamine:beta-D mannoside beta (1,4)-N-acethylglucosaminy ltransferase III) expression in plants |
EP1587921B1 (en) * | 2003-01-22 | 2010-07-28 | GlycArt Biotechnology AG | Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function |
-
2004
- 2004-01-22 EP EP04704310A patent/EP1587921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 PL PL393646A patent/PL222222B1/pl unknown
- 2004-01-22 PL PL393641A patent/PL222219B1/pl unknown
- 2004-01-22 NZ NZ567320A patent/NZ567320A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 KR KR1020137008302A patent/KR101498588B1/ko active IP Right Grant
- 2004-01-22 EP EP10075271.6A patent/EP2264151B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 SG SG2013005590A patent/SG2013005590A/en unknown
- 2004-01-22 NZ NZ591970A patent/NZ591970A/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 PL PL393644A patent/PL222220B1/pl unknown
- 2004-01-22 WO PCT/IB2004/000844 patent/WO2004065540A2/en active Application Filing
- 2004-01-22 PL PL393645A patent/PL222206B1/pl unknown
- 2004-01-22 EP EP20100075272 patent/EP2264152B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 ES ES10075272.4T patent/ES2543734T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 DE DE602004028337T patent/DE602004028337D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 PL PL377967A patent/PL224786B1/pl unknown
- 2004-01-22 CZ CZ2005490A patent/CZ308720B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 AU AU2004205802A patent/AU2004205802B2/en not_active Expired
- 2004-01-22 MX MXPA05007781A patent/MXPA05007781A/es active IP Right Grant
- 2004-01-22 CA CA2513797A patent/CA2513797C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 AT AT04704310T patent/ATE475708T1/de active
- 2004-01-22 JP JP2006500338A patent/JP5425365B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 CN CN201310218123.8A patent/CN103540600B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 US US10/761,435 patent/US8367374B2/en active Active
- 2004-01-22 NZ NZ541503A patent/NZ541503A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 PL PL393647A patent/PL222221B1/pl unknown
- 2004-01-22 EP EP20100075273 patent/EP2248892B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 NZ NZ603037A patent/NZ603037A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 KR KR1020057013639A patent/KR101292000B1/ko active IP Right Grant
- 2004-01-22 NZ NZ582315A patent/NZ582315A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-01-22 ES ES10075273.2T patent/ES2542885T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 SG SG2008049439A patent/SG179292A1/en unknown
- 2004-01-22 ES ES10075271.6T patent/ES2574993T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-22 PL PL415463A patent/PL224787B1/pl unknown
-
2005
- 2005-07-21 IL IL169805A patent/IL169805A/en active IP Right Grant
- 2005-08-18 NO NO20053872A patent/NO339270B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-25 HK HK06109471.3A patent/HK1089205A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-01-19 IL IL203402A patent/IL203402A/en active IP Right Grant
- 2010-02-04 AU AU2010200408A patent/AU2010200408C1/en not_active Expired
- 2010-06-09 JP JP2010132494A patent/JP2010233578A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-02-05 US US13/759,925 patent/US8859234B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2013-07-12 JP JP2013146287A patent/JP5953271B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-04-24 JP JP2015089240A patent/JP2015142590A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2513797C (en) | Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function | |
ES2349777T3 (es) | Constructos de fusión y uso de los mismos para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de fc y función efectora. | |
RU2623167C2 (ru) | КОНСТРУКЦИИ СЛИЯНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ПОВЫШЕННЫМИ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ | |
AU2012213963B2 (en) | Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function |