JP2023056001A - Tgf-b-受容体外部ドメイン融合分子及びその使用 - Google Patents
Tgf-b-受容体外部ドメイン融合分子及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(i)抗体重鎖の第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含む第2の領域を含む第1の単一鎖ポリペプチド、及び2つのTGF-β受容体外部ドメイン(TβRII-ECD)を含む第1の領域、ここで、第1の領域のC末端が、第2の領域のN末端に連結される、及び
(ii)抗体重鎖の第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含む第2の領域を含む第2の単一鎖ポリペプチド、及びタンデムに連結された2つのTGF-β受容体外部ドメイン(TβRII-ECD)を含む第1の領域、ここで、第1の領域のC末端は、第2の領域のN末端に連結され、第1の単一鎖ポリペプチドは、第2の単一鎖ポリペプチドと架橋される。
現在、全てのトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β1、β2及びβ3)アイソフォームに結合して中和するポリペプチドコンストラクトが提供されている。これらのポリペプチドは、TGF-β受容体外部ドメインを利用して、TGF-β1及びTGF-β3を含む様々なTGFβ種をトラップ又は隔離し、TGF-β2をある程度拡張する。本発明のポリペプチドコンストラクトが、TGF-β1及び-β3を中和する効力は、本明細書で実証されるように、関連するコンストラクトよりも驚くほどはるかに高い。この理由から、本コンストラクトは、癌、線維性疾患及び特定の免疫障害等の医学的適応症の治療のための医薬品として特に有用であると予想される。
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF (配列番号4)。
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (配列番号1)。
PPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (配列番号5)。
SEEYNTSNPDTHTCPPCPAPE (配列番号16)、SEEYNTSNPDVEPKSSDKTHTCPPCPAPE (配列番号19)、SEEYNTSNPDGGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPE (配列番号22)ヒトIgG1ヒンジ配列のバリエーションを組み込む; 及びSEEYNTSNPDERKCCVECPPCPAPP (配列番号13) 及びSEEYNTSNPDVECPPCPAPP (配列番号25) ヒトIgG2ヒンジ配列のバリエーションを組み込む; 及びそれらと実質的に同一の配列。
T22d35-Fc:
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号10)
T22d35-Fc-IgG2-v2(CC):
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号23)
T22d35-Fc-IgG1-v1(CC):
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号14)
T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC):
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号17); 及び
T22d35-Fc-IgG1-v3(GSL-CC):
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号20)。
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (配列番号1、本明細書ではT2mとも称される).
を含み得る。
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF
-リンカー-
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(配列番号5、本明細書ではT22d35とも称される)ここで、非限定的な一実施形態において、リンカーは、配列番号6に対応する; 及びそれと実質的に同一の配列、
等の同一又は異なるTGF-βスーパーファミリー受容体外部ドメインであり得る。「実質的に同一」は、上記定義の通りである。
産生及び精製
一過性CHO発現
様々なTβRII-ECD融合変異体(T2m-Fc及びT22d35-Fc等)は、それぞれ、重鎖Fc領域で構成され、それらのN末端にシグナル配列MDWTWRILFLVAAATGTHA(配列番号11)を含む。コンストラクトのDNAコード領域は、合成で調製され(Biobasic Inc.又はGenescript USA Inc.)、pTT5哺乳類発現プラスミドベクターのHindIII(5’末端)及びBamH1(3’末端)部位にクローニングされた(Durocher et al, 2002)。融合タンパク質は、IgG重鎖(それぞれ、T2m-HC及びT22d35-HC)コンストラクトに融合した重鎖T2m又はT22d35を使用したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。簡単に説明すると、T2m-HC又はT22d35-HCプラスミドDNAは、4mMグルタミン及び0.1%Kolliphor p-188(Sigma)を含むFreeStyle F17培地(Invitrogen)のCHO-3E7細胞の2.5L及び4.6L培養にそれぞれトランスフェクトし、37℃で維持された。トランスフェクション条件: DNA(80%プラスミドコンストラクト、15%AKTプラスミド、5%GFPプラスミド): PEIプロ(比率=1:2.5):PEI(ポリエチレンイミン)プロ(ポリプラス)(比率=1:2.5)。トランスフェクションの24時間後で、10%トリプトンN1フィード(TekniScience Inc.)及び0.5mMバルプロ酸(VPA、Sigma)を加え、温度を32℃にシフトして融合タンパク質の産生及び分泌を促進し、トランスフェクション後15日間維持した後、細胞が回収された。最終回収時の細胞生存率は、89.6%であった。
様々なFc-融合TβRII-ECDタンパク質をコードする標的遺伝子を発現するベクターで細胞にトランスフェクトすることによってCHOBRI/rcTA細胞プールが生成された。トランスフェクションの翌日、細胞は、250rpmで5分間遠心分離され、選択培地(50μMのメチオニンスルホキシミンを加えたPowerCHO2培地)に0.5×106細胞/mLの密度で播種された。14~18日間、2~3日ごとに選択培地が交換され、0.5×106細胞/mLで接種された。細胞数及び生存率は、上記Cedex Innovatis自動細胞カウンターCedexアナライザーで測定された。細胞数及び生存率は、上記Cedex Innovatis製自動細胞カウンターCedexアナライザーで測定された。細胞の生存率が95%を超えると、125又は250mL三角フラスコに0.2×106細胞/mLでプールが接種された。流加培養では、CHOBRI/rcTA細胞プールが上記のように接種された。接種後3日目に、細胞密度が3.5~4.5×106細胞/mLに達した際に、2μg/mLのクメイト(cumate)を加えることにより、組換えタンパク質の発現が誘導された。MSX濃度は、125μMに調整され、F12.7フィード(Irvine Scientific)が加えられた後、温度が32℃にシフトされた。2~3日ごとに、培養物に5%(v:v)F12.7が供給され、組換えタンパク質(pA-HPLC)及びグルコース(VITROS 350、Orthoclinical Diagnostics、USA)の濃度測定のためにサンプルが回収された。17mMの最小濃度を維持するために、グルコースが加えられた。
CHO細胞から回収した上清は、濾過され(0.2μm)、プロテインA MabSelect Sureカラム(GEヘルスケア)にロードされた。2カラム容量のPBSでカラムが洗浄され、3カラム容量の0.1Mクエン酸ナトリウムpH3.6でタンパク質が溶出された。収量を最大にするために、フロースルーが、プロテインAカラムにリロードされ、上記のように溶出された。溶出画分は、1M Trisで中和され、融合タンパク質を含む画分がプールされ、その後、製剤バッファー(Ca2+を含まない、Mg2+を含まないDPBS)で平衡化されたHi-load Superdex S200 26/80サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(GEヘルスケア)にロードされた。タンパク質は、1カラム容量の製剤バッファーを使用して溶出され、連続する画分に収集され、280nmのUV吸光度で検出された。次いで、融合タンパク質を含むメインピークSEC画分がプールされ、濃縮された。プールされた画分のProt-A及びSEC精製融合タンパク質の完全性は、還元及び非還元条件下(SYPRO Ruby染色)でUPLC-SEC及びSDS-PAGE(4~15%ポリアクリルアミド)によってさらに分析された。UPLC-SECの場合、DPBS(Hyclone、マイナスCa2+、マイナスMg2+)中の2~10μgのタンパク質が、Waters BEH200 SECカラムに注入され、Waters Acquity UPLC H-Class Bio-Systemを使用して、室温で8.5分間、0.4mL/分の流量で分離された。280nmでタンパク質のピークが検出された(Acquity PDA検出器)。
ヒトA549非小細胞肺癌細胞を、ATCC(Cat# CCL-185、Cedarlane、Burlington、ON)から購入した。細胞は、5%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(MEM)で培養された。MC-38マウス大腸腺癌細胞を、Kerafast(Cat# ENH204、Boston、MA)から購入し、2mM L-グルタミン及び10%ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改変MEMで培養した。両方の細胞株は、5%CO2を加えた加湿雰囲気で37℃に維持された。
ヒトA549肺癌細胞は、96ウェルプレートに播種された(5×103細胞/ウェル)。翌日、TGF-βトラップ融合タンパク質の一連の希釈液の非存在下又は存在下で、完全培地中の10pM TGF-βが、RTで30分インキュベートされた後、細胞に加えられた。21時間のインキュベーションの後、条件培地が採取され、2μg/mLビオチン化マウス抗ヒトIL-11抗体(MAB618、R&D Systems、Minneapolis、MN)でコーティングされたMSDストレプトアビジンゴールドプレートに加えられた。18時間後(4℃)、プレートは、0.02Tween20を含むPBSで洗浄され、2μg/mL SULFOタグ付きヤギ抗ヒトIL-11抗体(AF-218-NA、R&D Systems Minneapolis、MN)が加えられ、プレートが室温で1時間インキュベートされた。最終洗浄の後、プレートは、MESO QuickPlex SQ120マシン(Meso Scale Diagnostics、Gaithersburg、MD)で読み取られた。IL-11読み出しは、TGF-βのみで処理したコントロール細胞と比較したIL-11放出パーセントとして表された。Graphpad Prism(4-PLアルゴリズム((log(阻害剤)VS.レスポンス-可変スロープ(4つのパラメーター))が使用され、IC50が計算された(必要に応じて自動外れ値オプションが使用された)。
雌のC57BL/6-Eliteマウス(5~7週齢)をCharles River Laboratories(Wilmington、MA)から購入した。13匹のC57BL/6マウスに0日目に3×105のMC-38細胞を右側腹部に皮下注射した。腫瘍が、50~100mm3の容量に達した際(5日目)、動物は、2つのコホートに分けられ、治療が開始された:
・コホート1(動物7匹): アイソタイプコントロール(CTL IgG; BioxCell InVivo MAb Rat IgG2b、抗-KLH; クローン LTF-2、Cat# BE0090); 100μLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中200μg、腹腔内(i.p.)、5、7、9及び11日目。
・コホート2(動物6匹): T22d35-Fc、100μL PBS中5mg/kg、i.p.、5、9、12及び16日目。
腫瘍は、治療を開始してから最大15日間、デジタルキャリパーを使用して週に2回測定された。腫瘍体積は、前述の改変楕円式(Tvol=π/6×(長さ×幅×幅))を使用してこれらの測定値から計算された(Tomayko et al., 1986)。
融合コンストラクト設計
目的のTGF-βトラップを生成するために、TβRII-ECDシングレット(T2mと名付けた)を別のそのようなシングレットに融合し、それにより、ヒト(h)IgG2 Fc領域とヒトIgG1 Fc領域の重鎖のN末端に結び付けられた外部ドメインダブレット(T22d35と名付けた)を形成する。図1は、T2m及びT22d35の模式図(図1A)及びアミノ酸配列(図1B)を示す。これらのモジュールは、T2m-Fc(図2B)及びT22d35-Fcバリアント(図2C)融合を生成するために、いくつかのリンカーバリエーション(図2E)を使用してIgG Fc領域の重鎖のN末端に融合された(図2A)。これらの融合体の配列は、図2Dに示される。また、Fcドメインのヒンジ領域のシステイン残基の数、異なるIgGアイソタイプ(ヒトIgG1対IgG2)、及びT22d35とFcドメインのN末端のリンカーとして様々な長さと性質を探索するT22d35-Fcのバリアントを設計した(図2E、2F及び2G)。これらのバリエーションは、T22d35-Fc設計の機能性及び製造性の特性を調査し、最終的に最適化することを目的とする。
一過性CHO材料の精製
それぞれの融合タンパク質コンストラクトは、CHO-3E7細胞で一時的に発現され(表1参照)、その後、プロテインAアフィニティーカラムを使用して条件培地が回収され、及び精製され、続いて分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。T2m-Fc(図3A)及びT22d35-Fc(図4A)のSEC溶出プロファイルは、これらの融合タンパク質が、比較的純粋で凝集体が無いことを示した。画分6~11(T2m-Fc)及び7~10(T22d35-Fc)がプールされ、5.6mg/ml(T2m-Fc)及び6.03mg/ml(T22d35-Fc)に濃縮された。T2m-Fc及びT22d35-Fcの最終収量は、それぞれ267mg及び168であった。最終産物(SECプールされた画分で示される)は、UPLC-SECで純度>99%であることが示された(図3B及び4B)。SDS-PAGE評価(図3C及び4C、Sypro RUBY染色)は、還元条件下で~60kDa及び~90kDaのT2m-Fc及びT22d35-Fcのバンドを示しているが、約90kDa及び150kDaのバンドは検出可能であり、非還元条件下で、それぞれ完全に構築された高純度のT2m-Fc及びT22d35-Fc融合タンパク質を示す。産生及び精製の詳細の概要は、表1に記載される。合わせて、これらの結果は、T2m-Fc及びT22d35-Fc融合タンパク質の良好な製造可能性を示す。
N末端及びC末端のFc融合T22d35バリアントは、その発現レベル及び生物学的特性のいくつかを比較するために、CHOBRI/rcTA細胞で安定して発現された。各バリアントのコード領域を哺乳動物細胞発現プラスミドに連結し、トランスフェクション後、各バリアントを安定して発現する細胞の富化プールが選択された。バリアント間の主な違いは、T22d35ダブレットをFcドメインから分離するリンカー領域を含むアミノ酸配列に見出され得る(N末端融合の場合)が、C末端Fc融合の場合、各バリアント間の違いは、タンパク質の先端のアミノ末端にある(表2)。
図7A/B/Cに示すように、A549細胞IL-11放出アッセイを使用して、T2m-Fc及びT22d35-Fc融合タンパク質のTGF-β中和能を非Fc融合T22d35単一鎖ダブレットトラップと比較した。このデータは、全てのTGF-βアイソタイプについて、T22d35-Fcの効力が、T2m-Fc及び非Fc融合T22d35単一鎖トラップの効力よりも優れていることを示し、TGF-β1及びTGF-β3の計算されたIC50は、それぞれ、0.003348及び0.003908nMである(表5)。これらの値は、T22d35よりも少なくとも970倍、少なくとも240倍優れた効力(TGF-β1及びTGF-β3のIC50は、それぞれ、3.253及び0.9491nM)、及びT2m-Fcよりも615倍及び24倍高い(TGF-β1及びTGF-β3のIC50は、それぞれ、2.059及び0.0943nM)。加えて、T22d35-Fcは、TGF-β1及び-β3よりもはるかに少ない範囲であるが、TGF-β2を中和する。対照的に、T2m-Fc又はT22d35単一鎖トラップの何れについても、TGF-β2の中和は観察されない。T22d35-Fcトラップの中和効力は、TGF-1βと-β3で類似するが、T2m-Fcバリアントは、TGF-β1と比較してTGF-β3に対して~22倍高い中和効力(それぞれ、2.059nM及び0.0943nM)を示したことに注意すべきである。追加のN末端Fc融合T22d35融合体の評価[T22d35-Fc-IgG2-v2(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)、T22d35-Fc-IgG1-v2(SCC)、及びT22d35-Fc-IgG1-v3(GSL-CC)](図8、表6)は、これら融合体の全てが、匹敵するTGF-β1中和効力を示すことを表し、これは、T22d35-Fcの効力に非常に類似する。T22d35-Fc-IgG1-v1(CC)バリアントの追加評価(図9)は、T22d35-Fcバリアントと一致して、TGF-β1及び-β3の中和効力が非常に類似する(IC50=それぞれ、0.003327nM及び0.003251nM)ことを確認したが、この効力は、TGF-β2の方がはるかに低い(IC50=17.33nM)。
T22d35-Fc融合タンパク質(配列番号10)は、同系MC-38マウス結腸癌モデルを使用してインビボで評価された(図9)。T22d35-Fc融合体で処置した動物の腫瘍の増殖を、コントロールIgG(CTL IgG)で処置した動物の腫瘍の増殖と比較した。図9に示すように、治療後11日目までの腫瘍増殖の有意な差は観察されなかったが、CTL IgG(2元配置分散分析)と比較した場合、15日目にT22d35-Fcで処置した動物の腫瘍体積で腫瘍増殖の有意な減少が確認され得る。このデータは、T22d35-Fcの投与により、CTL IgGで処理した群と比較して、MC-38の増殖の抑制が有意に引き起こされていることを示し、これは、インビボでのTGF-β1の遮断は、この結腸直腸癌の同系モデルにおける腫瘍の増殖を抑止できることを示唆する。
1.トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β)アイソタイプの効果を阻害するために有用なポリペプチドコンストラクトであって、前記コンストラクトが、以下:
配列番号1のアミノ酸配列を含む第2のTGF-β受容体外部ドメイン(TβR-ECD)にタンデムに連結される配列番号1のアミノ酸配列を含む第1のTGF-β受容体外部ドメイン(TβR-ECD)を含む第1の領域、及び
抗体重鎖の第2の定常ドメイン(CH2)及び/又は第3の定常ドメイン(CH3)を含む第2の領域
を含み;
ここで、前記第2の領域のN末端は、前記第1の領域のC末端に結合され; 及び
前記第2のTβR-ECDは、配列番号8のアミノ酸配列によってCH2ドメイン又はCH3ドメインに連結される、ポリペプチドコンストラクト。
2.前記ポリペプチドコンストラクトが、単一のTβR-ECDを有する対応するコンストラクトよりも少なくとも20倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、又は600倍高い効力でTGF-β活性を阻害する、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
3.前記ポリペプチドコンストラクトが、非Fc融合TβR-ECDダブレットよりも少なくとも100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍又は900倍高い効力でTGF-β活性を阻害する、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
4.前記第2の領域が、抗体重鎖のFc領域を含む、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
5.前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDそれぞれが、TGF-βII型受容体外部ドメイン(TβRII-ECD)を含む、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
6.前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDが、同一のTGF-βアイソタイプに結合する、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
7.前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDが、TGF-β1及びTGF-β3の両方にそれぞれ結合する、態様6に記載のポリペプチドコンストラクト。
8.前記第1のTβR-ECDのC末端が前記第2のTβR-ECDのN末端に直接融合する、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
9.前記第1のTβR-ECD及び/又は前記第2のTβR-ECDが、配列番号1のアミノ酸配列からなる、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
10.前記第2の領域が、IgG抗体の重鎖の前記CH2及びCH3ドメインを含む、態様1~9の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト。
11.前記IgG抗体が、IgG1又はIgG2抗体である、態様10に記載のポリペプチドコンストラクト。
12.前記第2の領域が、前記コンストラクトを他のコンストラクトと架橋するためのシステイン残基を含むヒンジ領域を含む、態様1~11の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト。
13.前記第2の領域が、配列番号12、配列番号15、配列番号18、及び配列番号24からなる群から選択される、態様1~12の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト。
14.配列番号10、配列番号14、配列番号17、配列番号20、及び配列番号23からなる群から選択される、態様1に記載のポリペプチドコンストラクト。
15.前記コンストラクトが、少なくとも1つのジスルフィド架橋によってそれぞれの抗体定常ドメイン間に連結された第1及び第2のポリペプチドコンストラクトを含む二量体ポリペプチドである、態様1~14の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト。
16.前記二量体ポリペプチドが、
第1及び第2の領域を含む第1の単鎖ポリペプチド;及び
前記第1の単鎖ポリペプチドと同一のポリペプチドを含む第2の単鎖ポリペプチド
を含み、
ここで、前記第2の領域が、抗体重鎖の前記第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)、並びに所定の抗体の重鎖可変領域を含み;
ここで、前記第1の領域が、2つのTβRII-ECDを含み;及び
ここで、前記第2の領域のN末端が、前記第1の領域のC末端に連結される、
態様15に記載のポリペプチドコンストラクト。
17.態様1~16の何れかに記載のポリペプチドコンストラクトをコードする核酸分子。
18.態様17に記載の核酸分子を含むベクター。
19.選択された発現宿主により分泌可能な形態で、態様1~18の何れかに記載の何れかのポリペプチドコンストラクトをコードする核酸配列を含む核酸分子。
20.前記核酸配列が、配列番号10、配列番号14、配列番号17、配列番号20、及び配列番号23からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、態様19に記載の核酸分子。
21.前記核酸配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32及び配列番号33からなる群から選択される、態様20に記載の核酸分子。
22.態様1~16の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト及び医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物。
23.態様17に記載の核酸分子又は態様18に記載のベクターを含むトランスジェニック細胞宿主。
24.前記第1のポリペプチドコンストラクトと同一の第2のポリペプチドコンストラクトをコードする第2の核酸分子又は第2のベクターをさらに含む、態様23に記載のトランスジェニック細胞宿主。
25.二量体ポリペプチドを産生する方法であって、前記宿主を培養し、その宿主を増殖させることにより前処理された培地から態様15又は態様16に記載の二量体ポリペプチドコンストラクトを回収することを含む、方法。
26.病状、疾患又は障害の治療のための、態様1~16の何れかに記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
27.前記病状、疾患又は障害が、癌、眼疾患、線維性疾患、又は結合組織の遺伝的障害を含む、態様26に記載の医薬組成物。
28.配列番号14を含むポリペプチドコンストラクト。
29.ホモ二量体としての、態様28に記載のポリペプチドコンストラクト。
30.態様28に記載のポリペプチドコンストラクトを含む医薬組成物。
31.癌の治療のための、態様28に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
32.配列番号14からなるポリペプチドコンストラクト。
33.ホモ二量体としての、態様32に記載のポリペプチドコンストラクト。
34.態様32又は態様33に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
35.癌の治療のための、態様32又は態様33に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
Claims (35)
- トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β)アイソタイプの効果を阻害するために有用なポリペプチドコンストラクトであって、前記コンストラクトが、以下:
配列番号1のアミノ酸配列を含む第2のTGF-β受容体外部ドメイン(TβR-ECD)にタンデムに連結される配列番号1のアミノ酸配列を含む第1のTGF-β受容体外部ドメイン(TβR-ECD)を含む第1の領域、及び
抗体重鎖の第2の定常ドメイン(CH2)及び/又は第3の定常ドメイン(CH3)を含む第2の領域
を含み;
ここで、前記第2の領域のN末端は、前記第1の領域のC末端に結合され; 及び
前記第2のTβR-ECDは、配列番号8のアミノ酸配列によってCH2ドメイン又はCH3ドメインに連結される、ポリペプチドコンストラクト。 - 前記ポリペプチドコンストラクトが、単一のTβR-ECDを有する対応するコンストラクトよりも少なくとも20倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、又は600倍高い効力でTGF-β活性を阻害する、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記ポリペプチドコンストラクトが、非Fc融合TβR-ECDダブレットよりも少なくとも100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍又は900倍高い効力でTGF-β活性を阻害する、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第2の領域が、抗体重鎖のFc領域を含む、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDそれぞれが、TGF-βII型受容体外部ドメイン(TβRII-ECD)を含む、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDが、同一のTGF-βアイソタイプに結合する、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第1のTβR-ECD及び前記第2のTβR-ECDが、TGF-β1及びTGF-β3の両方にそれぞれ結合する、請求項6に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第1のTβR-ECDのC末端が前記第2のTβR-ECDのN末端に直接融合する、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第1のTβR-ECD及び/又は前記第2のTβR-ECDが、配列番号1のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第2の領域が、IgG抗体の重鎖の前記CH2及びCH3ドメインを含む、請求項1~9の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記IgG抗体が、IgG1又はIgG2抗体である、請求項10に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第2の領域が、前記コンストラクトを他のコンストラクトと架橋するためのシステイン残基を含むヒンジ領域を含む、請求項1~11の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記第2の領域が、配列番号12、配列番号15、配列番号18、及び配列番号24からなる群から選択される、請求項1~12の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 配列番号10、配列番号14、配列番号17、配列番号20、及び配列番号23からなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記コンストラクトが、少なくとも1つのジスルフィド架橋によってそれぞれの抗体定常ドメイン間に連結された第1及び第2のポリペプチドコンストラクトを含む二量体ポリペプチドである、請求項1~14の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 前記二量体ポリペプチドが、
第1及び第2の領域を含む第1の単鎖ポリペプチド;及び
前記第1の単鎖ポリペプチドと同一のポリペプチドを含む第2の単鎖ポリペプチド
を含み、
ここで、前記第2の領域が、抗体重鎖の前記第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)、並びに所定の抗体の重鎖可変領域を含み;
ここで、前記第1の領域が、2つのTβRII-ECDを含み;及び
ここで、前記第2の領域のN末端が、前記第1の領域のC末端に連結される、
請求項15に記載のポリペプチドコンストラクト。 - 請求項1~16の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクトをコードする核酸分子。
- 請求項17に記載の核酸分子を含むベクター。
- 選択された発現宿主により分泌可能な形態で、請求項1~18の何れか1項に記載の何れかのポリペプチドコンストラクトをコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 前記核酸配列が、配列番号10、配列番号14、配列番号17、配列番号20、及び配列番号23からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項19に記載の核酸分子。
- 前記核酸配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32及び配列番号33からなる群から選択される、請求項20に記載の核酸分子。
- 請求項1~16の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト及び医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物。
- 請求項17に記載の核酸分子又は請求項18に記載のベクターを含むトランスジェニック細胞宿主。
- 前記第1のポリペプチドコンストラクトと同一の第2のポリペプチドコンストラクトをコードする第2の核酸分子又は第2のベクターをさらに含む、請求項23に記載のトランスジェニック細胞宿主。
- 二量体ポリペプチドを産生する方法であって、前記宿主を培養し、その宿主を増殖させることにより前処理された培地から請求項15又は請求項16に記載の二量体ポリペプチドコンストラクトを回収することを含む、方法。
- 病状、疾患又は障害の治療のための、請求項1~16の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
- 前記病状、疾患又は障害が、癌、眼疾患、線維性疾患、又は結合組織の遺伝的障害を含む、請求項26に記載の医薬組成物。
- 配列番号14を含むポリペプチドコンストラクト。
- ホモ二量体としての、請求項28に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 請求項28に記載のポリペプチドコンストラクトを含む医薬組成物。
- 癌の治療のための、請求項28に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
- 配列番号14からなるポリペプチドコンストラクト。
- ホモ二量体としての、請求項32に記載のポリペプチドコンストラクト。
- 請求項32又は請求項33に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
- 癌の治療のための、請求項32又は請求項33に記載のポリペプチドコンストラクト、及び医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物。
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