KR19990022522A - 사람 혈관 내피 성장 인자 2 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 VEGF2 폴리펩타이드 및 이러한 VEGF2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA(RNA)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 기술에 의해 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 이러한 폴리펩타이드에 대한 항체 및 길항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 좌상 치유를 자극시키고 혈관 조직 복구를 위해 이러한 폴리펩타이드를 이용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양 성장 및 염증을 억제시키고, 당뇨병성 망막증, 류마치스 관절염 및 건선을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따라 VEGF2 암호화 서열에서 돌연 변이 및 숙주로부터 유도된 시료에서 VEGF2 단백질의 농도 변화를 검출하는 진단 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 1994년 3월 8일자로 로젠 씨 등이 미국 특허 및 상표청에 출원한 출원 번호 제08/207,550호의 부분 연속 출원이다.
본 발명은 새로이 동정된 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 용도 및 이러한 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 다수의 혈관 내피 성장 인자군으로서 동정되어 왔다. 더욱 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 때때로 이후에 VEGF2로써 언급되는, 혈관 내피 성장 인자 2이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩타이드의 작용의 억제에 관한 것이다.
새로운 혈관의 항성 또는 맥관형성은 태아 발육, 연속적인 성장 및 조직 회복에 필수적이다. 그러나, 맥관형성은 신형성과 같은 특정의 병리학적 상태, 예를 들면 종양 및 교종의 필수적인 부분이며, 비정상적인 맥관형성은 염증, 류마치스 관절염, 건선 및 당뇨병성 망막증과 같은 기타 질병과 연관되어 있다[참조:Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science 235:442-447, (1987)].
산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 분자 모두는 내피 세포와 기타 세포 유형에 대한 유사분열물질이다. 안지오트로핀 및 안지오게닌은 맥관형성을 유도시킬 수 있으나, 이들의 작용은 명확하지 않다[참조: Folkman, J., 1993, Cancer Medicine pp. 153-170, Lea and Febiger Press]. 혈관 내피 세포에 대한 고도의 선택적인 유사분열물질은 혈관 내피 성장 인자 또는 혈관 침투 인자(VPF)로서 또한 알려져 있는 VEGF이다[참조: Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 13:19-32, (1992)]. 혈관 내피 성장 인자는 분비된 맥관형성 유사분열물질이며 이의 타겟 세포 특이성은 혈관 내피 세포에만 한정된 것으로 여겨진다.
쥐의 VEGF 유전자는 특성화되어 있으며 맥관형성에 있어서 이의 발현 양식은 분석되어 있다. VEGF의 영구적인 발현은 천공된 내피에 인접한 상피 세포, 즉 맥락총 및 신장 사구체내에서 관측된다. 이러한 데이터는 내피 세포 성장 및 분화의 다기능 조절자로서의 VEGF의 역할과 일치한다[참조: Breier, G. et al., Development, 114:521-532(1992)].
VEGF는 혈소판-기원한 성장 인자(PDGF)의 α쇄 및 β쇄, 간엽 세포와 태반 성장 인자(PLGF)에 대한 유사분열물질 및 내피 세포 유사분열물질과 구조적으로 관련되어 있다. 이들 3개의 단백질은 동일한 군에 속하며 보존된 모티프(motif)를 공유한다. 이황화물 결합 형성에 기여하는 8개의 시스테인 잔기가 이 단백질내에서 엄격하게 보존되어 있다. 또는, 스플라이싱(splicing)된 mRNA가 VEGF, PLGF 및 PDGF모두에 대해 동정되며 이들 상이한 스플라이싱 산물은 생물학적 활성 및 수용체-결합 특이성에 있어 상이하다. VEGF 및 PDGF는 동종-이량체 또는 이종-이량체로서 작용하며 고유의 타이로신 키나제 활성에 이은 수용체 이량체화를 유발하는 수용체에 결합한다.
VEGF는 다른 스플라이싱에 기인한 121, 165, 189 및 206개 아미노산의 상이한 형태 4개를 갖는다. VEGF121 및 VEGF165는 가용성이고 맥관형성을 촉진하는 반면, VEGF189 및 VEGF206은 세포 표면내에서 프로테로글리칸을 함유하는 헤파린에 결합한다. VEGF의 일시적 및 공간적인 발현은 혈관의 생리학적 증식과 연관되어 있다[참조: Gajdusek, C. M., and Carbon, S. J., Cell Physiol., 139:570-579, (1989); McNeil, P.L, Muthukrishnan, L., Warder, E., D'Amore, P.A., J. Cell. Biol., 109:811-822, (1989)]. 이의 고 친화성 결합 부위는 조직 단편의 내피 세포상에만 편재되어 있다[참조: Jakeman, L.B., et al., Clin. Invest. 89:244-253, (1989)]. 이러한 인자는 하수체 세포와 몇몇 종양 세포주로부터 분리될 수 있으며, 일부 사람 교종에 관련되어 있다[참조: Plate, K.H. Nature 359:845-848, (1992)]. 흥미롭게도, VEGF121 또는 VEGF165의 발현은 차이니즈 햄스터 난소 세포상에 누드 마우스에서 종양을 형성하는 능력을 부여한다[참조: Ferrara, N., et al., J. Clin. Invest. 91:160-170, (1993)]. 항-VEGF 모노클로날 항체에 의한 VEGF 작용의 억제는 면역-결핍성 마우스에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: Kim, K.J., Nature 362:841-844, (1993). 또한, VEGF 수용체의 우세한-네가티브 돌연변이체는 마우스에서 교아종의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.
혈관 침투 인자는 또한 심지어 상처가 나은 후에도 혈장 단백질에 대한 지속적인 미세혈관 고침투능에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 정상적인 좌상 치유의 특징이다. 이것은 VRF가 좌상 치유에 있어 중요한 인자임을 암시한다[참조: Brown, L.F. et al., J. Exp. Med., 176:1375-9(1992)].
VEGF의 발현은 혈관화 조직(예: 폐, 심장, 태반 및 충실성 종양)에서 높으며 이는 일시적 및 공간적으로 맥관 형성과 연관된다. VEGF는 또한 생체내에서 맥관 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 맥관형성은 정상 조직, 특히 혈관 조직의 보수에 있어 필수적이므로, VEGF를 혈관 조직 보수의 촉진(즉, 아테롬성 동맥경화증)에 사용하는 것이 제안되어 있다.
첸(Chen) 등에게 1991년 12월 17일에 허여된 미국 특허 제5,073,492호는 환경에 VEGF, 효과기 및 혈청-기원한 인자를 가함을 포함하여 적절한 환경내에서 내피 세포 성장을 상승적으로 증진시키는 방법을 기술하고 있다. 또한, 혈관 내피 세포 성장 인자 C 아-단위 DNA가 폴리머라제 쇄 반응 기술에 의해 제조되었다. DNA는 이종-이량체 또는 동종-이량체로서 존재할 수 있는 단백질을 암호화한다. 단백질은 포유동물 혈관 내피 세포 유사분열물질이며 그 자체로써, 1992년 9월 30일에 공개된 유럽 특허원 제92302750.2호에 기술된 바와 같이 혈관 발달 및 보수의 증진에 유용하다.
본 발명의 폴리펩타이드는 사람 VEGF에 대한 아미노산 서열 상동성을 기본으로 하여 신규한 혈관 내피 성장 인자로써 추정적으로 동정되었다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 신규의 성숙한 폴리펩타이드와 생물학적으로 활성이고 진단학적으로 또는 치료적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 기원이다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, mRNA, DNA, cDNA, 게놈성 DNA 및 생물학적으로 활성이고 진단학적으로 또는 치료적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 상기 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에서 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 원핵 숙주 세포 및/또는 재조합 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 단백질을 연속적을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 기술에 의해 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 이러한 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 치료 목적, 예를 들면 맥관형성 및 좌상-치유를 자극하고 혈관 조직 보수를 촉진시키는 목적에 사용하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 이러한 폴리펩타이드에 대한 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 이러한 폴리펩타이드의 작용을 억제하는, 예를 들면 종양의 성장을 억제하고, 당뇨병성 망막증, 염증, 류마치스 관절염 및 건선을 치료하는데 사용할 수 있는 이러한 폴리펩타이드에 대한 길항제가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 본 발명의 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 본 발명의 핵산 서열에 있어서의 돌연변이와 관련된 질병 또는 질병에 대한 위험도를 진단하는 방법 및 이러한 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 과학적 연구, DNA 의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 실험관내 목적을 위한 이러한 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하는 방법이 제공된다.
본 발명의 상기 및 기타 측면은 본원의 교시로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
하기 도면은 본 발명의 양태를 설명하는 것이며 청구의 범위에 포함되는 것으로써 본 발명의 영역을 한정함을 의미하지는 않는다.
도 1은 본 발명의 폴리펩타이드의 cDNA 서열 및 상응하는 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산에 대한 표준 1문자 약어가 사용된다. 서열분석은 373 자동화된 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, Inc. 제조원)를 사용하여 수행한다. 서열분석 정확도는 97%보다 큰 것으로 예견된다.
도 2는 본 발명의 폴리펩타이드와 사람 PDEF/VEGF군의 또 다른 일원간의 아미노산 서열 상동성을 도시한 것이다. 박스 영역은 8개의 보존된 시스테인 잔기의 보존된 서열 및 위치를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 폴리펩타이드의 시험관내 전사, 해독 및 전기 영동 후의 겔의 사진을 나타낸다. 레인 1은14C 및 레인보우 M.W. 마커이고, 레인 2는 FGF 대조이고, 레인 3은 M13-리버스 및 순방향 프라이머에 의해 제조된 VEGF2이고, 레인 4는 M13-리버스 및 VEGF-F4 프라이머에 의해 제조된 VEGF2이고, 레인 5는 M13-리버스 및 VEGF-F5 프라이머에 의해 제조된 VEGF2이다.
도 4는 VEGF2 폴리펩타이드가 Sf9 세포로 이루어진 바큘로바이러스 시스템에서 발현되는 것을 나타낸다. 배지로부터 단백질 및 세포들의 세포질은 환원 조건 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
도 5는 본 발명의 핵산 서열로 감염된 Sf9 세포로부터 배지가 침전되고, 재현탁된 침전물이 SDS-PAGE에 의해 분석되고, 꼬마지에 브릴리언트 블루로 염색된 것을 나타낸다.
도 6은 VEGF가 환원제인 β-머캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 배지 상청액으로부터 정제되고, SDS-PAGE에 의해 분석되고, 꼬마지에 브릴리언트 블루로 염색된 것을 나타낸다.
도 7은 RP-300 칼럼(0.21 x 3cm, Applied Biosystems, Inc.)을 사용하여 정제된 VEGF2를 역상 HPLC 분석한 것을 나타낸다. 칼럼은 0.1% 트리플루오로아세트산(용매 A)으로 평형시키고, 단백질은 0.07% TFA를 함유하는 아세토니트릴로 구성된 0 내지 60% 용매 B로부터 7.5분 구배로 용리시켰다. 단백질 용리는 215 nm(적색선) 및 280 nm(청색선)의 흡수도로 모니터링된다. 용매 B의 백분율은 녹색선으로 나타난다.
도 8은 염기성 섬유아세포 성장 인자에 비해 혈관 내피 세포의 성장에 대해 부분적으로 -정제된 VEGF2 단백질의 효과를 나타낸다.
도 9는 혈관 내피 세포의 성장에 대한 정제된 VEGF2 단백질의 효과를 나타낸다.
유전자라는 용어는 폴리펩타이드 쇄를 제조하는데 연루된 DNA의 단편을 의미하고; 이는 암호화 영역에 선행하는 영역 및 후행하는 영역(리더 및 트레일러 영역) 뿐만 아니라 개개의 암호화 단편(엑손) 사이에 개재되는 서열(인트론)을 포함한다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩타이드 또는 1995년 3월 24일 ATCC 기탁 번호 제97161호로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드 또는 도 1의 아미노산 잔기보다 적은 수의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드)가 제공된다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 초기 단계의 사람 배아(8 내지 9주) 파골세포종, 성인 심장 또는 몇몇 유방암 세포주로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 9주된 초기 단계의 사람 배아로부터 추정된 cDNA 라이브러리에서 밝혀졌다. 이것은 VEGF/PDGF 군과 구저적으로 관련되어 있다. VEGF2는 성숙한 단백질이 396개의 아미노산을 포함하도록 대략적으로 제 1의 23 아미노산 잔기가 추정되는 리더 서열인 419개의 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 개방된 판독 프레임을 포함하고, 단백질은 사람 혈관 내피 성장 인자(30% 상동성), 이어서 PDGF α(23%) 및 PDGF β(22%)에 대해 가장 큰 아미노산 서열 상관 관계를 나타낸다.
8개의 모든 시스테인이 군의 4개의 일원 모두 내에 보존되어 있다는 사실은 특히 중요하다(도 2의 박스 영역 참조). 또한 PDGF/VEGF 군에 대한 신호, PXCVXXXRCXGCCN는 VEGF2내에 보존되어 있다(도 2 참조).
본 발명의 VEGF2 폴리펩타이드는 특정의 리더 서열과 완전한 길이의 폴리펩타이드의 활성 단편을 암호화하는 완전한 길이의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 의미한다. 활성 단편은 서열 2 및 도 2에서 나타낸 바와 같은 완전한 길이의 아미노산 서열의 전체 419개 아미노산 보다 적은 아미노산을 갖는 완전한 길이의 아미노산 서열의 특정 부위를 포함함을 의미하지만, 여전히 도 2에 나타낸 보존된 8개의 시스테인 잔기를 포함하며 이러한 단편은 여전히 VEGF2 활성을 포함한다.
정상적인 조직에 존재하는 2개 이상의 교호 스플라이싱된 VEGF2 mRNA 서열이 존재한다. 완전한 길이 및 절단된 길이 각각에 상응하는 2개의 VEGF2 mRNA 서열의 크기는 도 3에 나타내고, 레인 5는 본 발명의 VEGF2 폴리펩타이드를 암호화하는 교호 스플라이싱된 mRNA의 존재를 지시하는 2개의 밴드를 보여준다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 cDNA, 게놈성 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 이 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있으며, 일본쇄는 암호화 쇄 또는 비-암호화(안티-센스) 쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일할 수 있거나 유전 코드의 과다 또는 퇴화의 결과로써 도 1의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙된 폴리펩타이드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.
도 1의 성숙한 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 폴리펩타이드에 대한 유일한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드( 및 임의로 추가의 암호화 서열)와 인트론 또는 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'와 같은 비-암호화 서열을 포함할 수 있다.
즉, 용어 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드에 대한 유일한 암호화 서열과 추가의 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기한 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 천연적으로 존재하는 대립형질성 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드의 비-천연적으로 존재하는 변이체일 수 있다.
즉, 본 발명은 도 1에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 도 1의 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이체는 결실 변이체, 치환 변종 및 첨가 또는 삭제 변이체를 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 도 1에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 천연적으로 존재하는 대립형질성 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 문헌에 공지된 바와 같이, 대립형질성 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가를 가질 수 있으며, 실질적으로 암호화된 폴리펩타이드의 작용을 변경시키지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열의 변경된 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 정제하도록 하는 마커 서열에 프레임 방향으로(in frame) 융합된 암호화 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩타이드의 정제를 위해 제공되는 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태크(tag)일 수 있는데, 예를 들면 마커 서열은 포유동물 숙주(예; COS-7 세포)가 사용되는 경우 헤마글루티닌(HA) 태크일 수 있다. 이 HA 태크는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 기원한 에피토프에 상응한다.[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)].
용어 유전자는 폴리펩타이드 쇄를 생성하는데 있어 포함된 DNA의 단편을 의미하며, 이는 선행 및 이어지는 암호화 서열[리더 또는 트레일러] 및 개개의 암호화 단편(엑손)사이에 끼어 있는 서열(인트론)을 포함한다.
본 발명의 완전한 길이의 유전자 단편은 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로써 사용되어 완전한 길이의 cDNA를 분리시키거나 유전자와 유사성이 높은 서열 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 서열을 갖는 기타 cDNA를 분리시킬 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 바람직하게는 30개 이상의 염기를 가지며 예를 들면, 50개 이상의 염기를 포함할 수 있다. 이 프로브는 또한 완전한 길이의 전사체 및 게놈성 클론에 상응하는 cDNA 클론 또는 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 포함하는 클론을 동정하는데 사용될 수 있다. 스크린의 예는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하기 위한 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 유전자의 암호화 영역을 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오타이드는 사람 cDNA, 게놈성 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린하는데 사용되어 프로브가 하이브리드화하는 라이브러리의 구성원을 측정할 수 있다.
본 발명은 추가로 서열간에 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상이 상동성인 경우 상술한 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상술한 폴리뉴클레오타이드에 대한 스트링전트 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 스트링전트 조건이란, 하이브리드화가 서열간의 상동성이 95% 이상 및 바람직하게는 97% 이상인 경우에만 일어남을 의미한다. 바람직한 양태에서 상술한 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오타이드는 도 1(서열 1)의 cDNA에 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
추가로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하고 상술한 바와 같이 이에 대해 동일성을 가지며 활성을 보유하거나 보유하지 않은 20개 이상의 염기, 바람직하게는 30개 염기 이상 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 염기를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 서열 1의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 폴리뉴클레오타이드의 회수용 프로브로서 또는 진단 프로브 또는 PCR 파리어머로서 사용될 수 있다.
즉, 본 발명은 서열 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 30기 이상의 염기 및 바람직하게는 50개 이상의 염기를 갖는 이의 단편에 대해 70% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본원에 언급된 기탁물은 특허 목적을 위해 미생물 기탁의 국제적 승인의 부터페스트 조약하에 유지될 것이다. 이 기탁물은 단순히 당해 분야의 숙련가의 편의성을 위해 제공되며 이 기탁물은 35 U.S.C. §112하에 요구되는 허가를 필요로 하지 않는다. 기탁된 물질중에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 서열 및 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 본원에서 참조로 도입되며 본원의 어떠한 서열 기술과 불일치하는 경우 조절된다. 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데 요구될 수 있는 면허가 요구될 수 있으며 이러한 면허가 본원에 의해 승인되지는 않는다.
본 발명은 또한 도 1의 추정된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.
도 1 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 언급하는 경우 용어 단편, 유도체 및 동족체는 도 2에 나타낸 바와 같은 VEGF 단백질의 보존된 모티프(motif) 및 필수적으로 동일한 생물학적 작용 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드, 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.
도 1 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (i)아미노산 잔기중 하나 이상이 보존되거나 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화된 것이거나 암호화 된 것이 아닐 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (iii) 성숙한 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예; 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합된 것, (iv) 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩타이드와 융합된 것 또는 (v) 서열 2에 나타낸 소수의 아미노산 잔기를 포함하며 보존된 모티프를 보유하고 여전히 폴리펩타이드의 VEGF 군의 활성 특성을 보유한 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 동족체는 본원의 교시로부터 당해 분야의 숙련가의 영역에 속한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 분리된 형태이며, 바람직하게는 동종성으로 정제된다.
용어 분리된은 원래의 환경(즉, 이것이 천역적으로 존재하는 경우 천연 환경)으로부터 물질이 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물중에 존재하는 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않으나, 천연 시스템중에 같이 존재하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 천연 환경의 일부가 아닌 경우에도 여전히 분리된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 폴리펩타이드(특히 성숙한 폴리펩타이드) 및 서열 2의 폴리펩타이드와 70% 이상의 유사성을 갖고(바람직하게는 70% 이상 동일하고) 더욱 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 90% 이상 유사성을 가지며(더욱 바람직하게는 95% 이상이 동일하며) 더욱더 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 95% 이상이 유사성을 갖고(더욱더 바람직하게는 90% 이상이 동일하고) 또한 30개 이상의 아미노산 및 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 일반적으로 포함하는 폴리펩타이드의 부위를 갖는 이러한 폴리펩타이드의 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
당해 분야에 공지된 바와 같이 2개의 폴리펩타이드간의 유사성은 아미노산 서열과 제2의 폴리펩타이드의 서열에 대한 하나의 폴리펩타이드의 보존된 아미노산 치환체를 비교함으로써 측정한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 단편 또는 일부는 펩타이드 합성에 의해 상응하는 완전한 길이의 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있으므로, 이 단편은 완전한 길이의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편 또는 일부를 사용하여 본 발명의 완전한 길이의 폴리뉴클레오타이드를 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 가공한 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 사용하여 유전적으로 가공(인공적 항온 변환되거나 형질전환되거나 형질감염)될 수 있다. 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 가공된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 본 발명의 VEGF2 유전자를 증폭시키기에 적합하도록 개질된 통상의 영양 배지중에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이미 사용된 것이며, 당해 분야의 숙련가에게 명확할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술에 의해 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 즉, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 각종 발현 벡터중 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 즉 SV40의 유도체; 세균 플라스미드; 파아지 DNA; 바큘로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA, 바이러스 DNA(예: 박시니아, 아데노바이러스, 포울 폭스 바이러스 및 슈도래비스)의 조합으로부터 기원한 벡터를 포함한다. 그러나, 다른 어떠한 벡터도 숙주 세포내에서 복제가능하며 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다.
적절한 DNA 서열은 각종 방법에 의해 벡터내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위내로 삽입될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야의 숙련가 영역내에 속한다.
발현 벡터중 DNA 서열은 적절한 발현 조절 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 이러한 프로모터의 예로써, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac 또는 trp, 파아지 람다 PL프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스내 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 프로모터가 언급될 수 있다. 발현 벡터는 또한 해독 개시 및 전사 터미네이터에 대한 리보소옴 결합 부위를 포함한다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다.
또한, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 포함함으로써 진핵 세포 배양물의 경우 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 또는 이. 콜라이의 경우 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질 전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공한다.
상술한 바와 같은 적절한 DNA 서열을 포함하는 벡터 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 사용하여 적절한 숙주를 형질전환시킴으로서 숙주가 단백질을 발현하도록 할 수 있다.
적절한 숙주의 대표적인 예로써는, 다음이 언급될 수 있다: 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 타이피루리움(Salmonella typhimurium)과 같은 세균 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보우스 흑색종(Bowes melanoma); 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당해 분야의 숙련가의 영역내에 포함된다.
더욱 특히, 본 발명은 또한 상기에서 광범위하게 기술한 바와 같은 서열 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물을 포함한다. 작제물은 본 발명의 서열이 정 또는 역 배향으로 삽입된 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 본 양태의 바람직한 측면에서, 작제물은 추가로 예를 들면, 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함한다. 적합한 벡터 및 프로모터 다수는 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 시판된다. 하기 벡터가 예로써 제공된다. 세균: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pBS, pD10, 파아지스크립트(phargescript), psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK23303, pDR540, pRIT5(Pharmacia). 진핵 세포: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK23, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia). 그러나, 다른 기타 플라스미드 또는 벡터도 숙주네에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용될 수 있다.
프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별가능한 마커를 가진 기타 벡터를 사용하여 어떠한 바람직한 유전자로부터도 선별할 수 있다. 2개의 적절한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특수하게 명명된 세균 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL및 trp를 포함한다. 진핵세포 프로모터는 CMV 이미디에이트 얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 얼리 및 레이트 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당해 분야의 숙련가의 수준에 포함된다.
추가의 양태로서, 본 발명은 상술한 작제물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있거나 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포내로 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감영, DEAE-덱스트란 중재된 형질감염 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 수행될 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Moleular Biology, (1986)].
숙주내 작제물은 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 산물을 생산하기 위한 통상의 방법중에 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 펩타이드 합성기에 의해 합성적으로 제조할 수 있다.
성숙한 단백질은 포유동물, 효모, 세균 또는 기타 세포내에서 적절한 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. 세포-유리된 해독 시스템을 또한 사용함으로써 본 발명의 DNA 작제물로부터 기원한 RNA를 사용하여 단백질을 생산할 수 있다. 진핵 숙주 및 원핵 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있다.
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 벡터내로 인핸서 서열(enhancer sequence)을 삽입시킴으로써 증가된다. 인핸서는 프로모터상에서 자체의 전사를 증가시키기 위해 작용하는 일반적으로 약 10 내지 300bp의 DNA 시스-작용 성분이다. 예로 100 내지 270bp의 복제 오리진 레이트 부위상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 레이트 부위상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서이다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 오리진 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선별 가능한 마커, 즉, 이 콜라이 및 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) TRP1 유전자의 암피실린 내성 유전자 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하는 고-발현된 유전자로부터 기원한 프로모터를 포함할 것이다. 이러한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제 또는 열 쇽 단백질과 같은 당분해 효소를 암호화하는 오페론으로부터 기원할 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 및 말단 서열 및 바람직하게는 세포질 영역 또는 세포외 배지내로 해독된 단백질의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적절한 상태로 조립될 수 있다. 임의로, 이종 서열은 바람직한 특성, 즉, 발현된 재조합 산물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 동정 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
세균용의 유용한 발현 벡터는 적합한 해독 개시 및 말단 시그날과 함께 목적한 단백질을 암호화하는 구조적 DNA를 작동가능한 판독상으로 작용성 프로모터에 삽입시킴에 의해 작제할 수 있다. 이 벡터는 하나 이상의 표현형성 선별 마커와 벡터를 유지시키고 바람직하게는, 숙주내에서 증폭시키는 복제 오리진을 포함할 것이다. 형질전환용으로 적합한 원핵 숙주는, 비록 다른 것이 또한 선택 여부에 따라 사용될 수 있다고 해도, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudimonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)내의 다양한 종을 포함한다.
비제한적인 대표적 예로써, 세균용의 유용한 발현 벡터는 잘 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전 성분을 포함하는 시판되는 플라스미드로부터 기원한 세균 복제 오리진과 선별가능한 미터를 포함할 수 있다. 이러한 시판되는 벡터는 예를 들면, pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)를 포함한다. 이러한 pBR322 골격(backbone) 선별은 적절한 프로모터와 발현될 구조 서열과 결합된다.
적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장에 이어, 선별된 마커는 적절한 수단(예: 온도 이동 또는 화학제 도입)에 의해 유도되며 세포는 추가의 기간동안 배양된다.
세포를 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴시키며, 수득된 조 추출물을 추가의 정제를 위해 보관한다.
단백질의 발현중에 사용된 미생물 세포는 동결-해동 주기, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제의 사용을 포함하는 통상의 방법으로 파괴시킬 수 있으며, 이러한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
각종의 포유동물 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175 (1981)]에 기술된 바와 같은 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주 및 상용성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주(예: C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주)를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적합한 프로모터 및 인핸서와 또는 특정의 필수적인 리보소옴 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 말단 서열 및 5' 플랭킹 비전사된 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스로부터 기원한 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 요구되는 비전사된 유전 성분을 제공할 수 있다.
폴리펩타이드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉티 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 경우에 따라, 단백질 리폴딩(refolding) 단계를 성숙한 단백질 구조를 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종의 정제 단계에서 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 천연적으로 정제된 산물 또는 화학적 합성 방법의 산물 또는 진핵 세포 또는 숙주 세포(예: 배양물중 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포)에 의해 제조된 산물일 수 있다. 재조합 생산 방법중에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 당화하거나 비-당화시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 서열 2의 VEGF2 폴리펩타이드에서 초기 46 아미노산을 제한 것은 혈관 내피 세포에 대한 잠재적인 유사분열 물질이고, 이들의 성장 및 증식을 자극한다. 사람의 여러 조직으로부터 20 ㎍의 RNA가32P-VEGF2에 의해 프로브된 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 VEGF2 핵산 서열에 대해 수행된 노던 블롯 분석의 결과는 이러한 단백질이 심장 및 폐에서 능동적으로 발현되고, 이는 더 나아가 유사분열물질 활성의 증거이다라는 것을 나타낸다.
따라서, VEGF2 폴리펩타이드를 사용하여 혈관형성을 촉진하는데, 예를 들면 관상 바이패스 수술이 수행된 이식 조직의 성장을 자극시킬 수 있다. VEGF2는 또한 좌상 치유를 자극하는데, 특히 손상된 조직에 재혈관 형성하거나 허혈 및 새로운 모세 혈관형성이 필요한 부위에서 2차적인 혈액 흐름을 자극하기 위해 사용될 수 있다. VEGF2를 사용하여 욕창, 정맥 궤양 및 당뇨병성 궤양을 포함하는 피부 궤양과 같은 깊은 좌상을 치료할 수 있다. 또한, VEGF2를 사용하여 깊은 화상 및 피부 이식체 또는 피부판이 화상 및 손상을 회복시키는데 사용되는 손상을 치료할 수 있다. VEGF2는 또한 성형술, 예를 들면 외상으로부터의 열상 및 수술과 연관된 개열의 회복에 사용될 수 있다.
이와 동일한 맥락에서, VEGF2는 손상된 골격, 치근막 또는 인대 조직의 성장을 유도할 수 있다. VEGF2는 또한 질병 도는 외상에 의해 손상된 시멘트질 및 치근막 인대를 포함하는 치아의 지지 조직을 재생시키는데 사용될 수 있다.
혈관형성은 좌상을 깨끗하고 비-감염된 상태로 유지시키는데 있어 중요하기 때문에, VEGF2는 수술 및 후속적인 개열의 회복과 연관하여 사용할 수 있다. 또한, 감염 위험이 매우 높은 복부 좌상의 치료에도 사용될 수 있다.
VEGF2는 혈관 이식 수술에서 내피형성(endothelialization)을 촉진하는데 사용될 수 있다. 이식된 물질 또는 합성 물질을 사용한 혈관 이식편의 경우, VEGF2는 이식편의 표면 또는 혈관 내피 세포의 성장을 촉진하는 연결부에 적용될 수 있다. VEGF2는 또한 심근경색의 결과 심근 조직의 손상을 회복시키는데 사용될 수 있다. VEGF2는 또한 허혈후 심장 혈관계를 회복시키는데 사용될 수 있다. VEGF2는 또한 관상 동맥 질환 및 말초 질환과 CNS 혈관 질환의 결과로서 손상된 혈관 조직을 치료하는데 사용될 수 있다.
VEGF2는 또한 체내로 이식되어 이식된 물질의 거부를 최소화시키고 이식된 물질의 혈관화를 자극하는 인공 보철 또는 천연 기관을 피복하는데 사용될 수 있다.
VEGF2는 또한 예를 들면, 아테롬성 동맥경화중 및 혈관 조직이 손상되는 기구 혈관형성술에 따른 혈관 조직 회복에 사용될 수 있다.
VEGF2 핵산 서열 및 VEGF2 폴리펩타이드는 또한 화학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조와 관련된 실험관내 목적 및 사람 질환을 치료하기 위한 진단제 및 치료제의 제조를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, VEGF2는 혈관 내피 세포를 실험관애 배양하는데 사용될 수 있는데, 여기서, VEGF2는 10pg/ml 내지 10ng/ml의 농도로 배양 배지에 가해진다.
완전한 길이 VEGF2 유전자의 단편은 유전자에 대한 고도의 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 유전자를 분리시키기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 보다 많은 수의 염기를 가질 수도 있지만, 일반적으로 50개 이상의 염기 쌍을 갖는다. 이 프로브는 완전한 길이 전사에 상응하는 cDNA 클론 및 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 VEGF2 유전자를 함유하는 게놈 클론(들)을 동정하기 위해 사용될 수도 있다. 스크린의 예는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 VEGF2 유전자의 암호화 영역을 분리시키는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오타이드는 라이브러리의 어떤 구성원에 프로브가 하이브리드화되는지를 측정하기 위해 사람의 cDNA, 게놈성 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린하는 데 사용된다.
본 발명은 VEGF2 수용체의 동정 방법을 제공한다. 수용체를 암호화하는 유전자는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다수의 방법, 예를 들면, 리간드 패닝(ligand panning) 및 FACS 분류[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]에 의해 동정될 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝은 폴리아데닐화된 RNA가 VEGF2에 반응하는 세포로부터 제조되고 이 RNA로부터 창조된 cDNA 라이브러리가 혼주물내로 분리되어 VEGF2에 반응하지 않는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는데 사용되는 경우에 사용된다. 유리 슬라이드상에서 성장한 형질감염된 세포는 표지된 VEGF2에 노출된다. VEGF2는 부위-특이적인 단백질 키나제에 대한 인지 부위의 요오드처리 또는 봉입을 포함하는 각종 수단에 의해 표지시킬 수 있다. 고정 및 항온처리에 이어서, 슬라이드를 자가방사선 분석에 적용시킨다. 양성 혼주물을 동정하고 아-혼주물을 제조하여 반복된 아-혼주 및 재스크리닝 방법을 사용하며 궁극적으로는 추정된 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득함으로써 재형질감염시킨다.
수용체 동정을 위한 다른 시도로써, 표지된 VEGF2를 세포막 또는 수용체 분자를 발현하는 추출물 제제와 광친화적으로 연결시킬 수 있다. 가교-결합된 물질을 PAGE로 용해하고 X-선 필름에 노출시킨다. 다음 VEGF2를 포함하는 표지된 착물을 절개하고, 펩타이드 단편내로 용해시키며 단백질 미세서열분석에 적용시킨다. 미세서열분석으로부터 수득된 아미노산 서열을 사용하여 변성된 올리고뉴클레오타이드 프로브 세트를 설계함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 추정되는 수용체를 암호화하는 유전자를 동정한다.
본 발명은 또한 VEGF2 효능제 또는 길항제를 동정하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 예는 공유사분열물질(comitogen) Con A의 존재하에서 사람 내피 세포의 증식을 현저하게 자극하는 VEGF2의 능력의 장점을 취한다. 내피 세포를 수득하여 Con-A(Calbiochem, La Jolla, CA)로 보충된 반응 혼합물중 96-웰 평편-바닥 배양 플레이트(Costear, Cambridge, MA)내에서 배양한다. Con A, 본 발명의 폴리펩타이드 및 스크리닝할 화합물을 가한다. 37℃에서 항온처리한 후, 항온처리물을 1μCi의3[H] 티미딘(5Ci/mmol; 1Ci = 37BGq; NEN)으로3[H]이 도입되기에 충분한 시간 동안 펄스시키고 유리 섬유 여과기(Cambridge Technology, Watertown, MA)상에 수거한다. 배양물의 3회 평균3[H]-티미딘 도입(cpm)을 액체 신틸레이션 계측기(Beckman Instruments Irvine, CA)를 사용하여 측정한다. 화합물이 배제된 경우의 대조군 검정과 비교한 것으로써 현저한3[H] 티미딘 도입은 내피 세포 증식의 자극을 나타낸다.
길항제를 검정하기 위해, 상술한 검정을 수행하고 VEGF2의 존재하에서3[H] 티미딘 도입을 억제하는 화합물의 능력을 화합물이 VEGF2에 대한 길항제인지로 나타낸다. 달리는, VEGF2와 강력한 길항제를 막-결합된 VEGF2 수용체 또는 재조합 수용체와 경쟁적 결합 검정에 적절한 조건하에서 결합시켜 검출할 수 있다. VEGF2는 방사활성에 의해 표지시킬 수 있으므로, 수용체에 결합된 VEGF2 분자의 수는 강력한 길항제의 효율을 결정할 수 있다.
또한, 공지된 제2의 전령 시스템의 반응에 이은 VEGF2와 수용체의 상호작용을 측정하고 화합물의 존재 또는 부재를 비교한다. 이러한 제2 전령 시스템은 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시타이드 가수분해를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 방법에서는 포유동물 세포 또는 VEGF2 수용체를 발현하는 막 제제를 화합물의 존재하에 표지된 VEGF2와 함께 항온처리한다. 이러한 상호작용을 증진시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정한다.
강력한 VEGF2 길항제는 항체 또는 일부의 경우 폴리펩타이드에 결합하여 효율적으로 VEGF2 작용을 제거하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 강력한 깅항제는 VEGF2 수용체에 결합하는 밀접하게 관련된 단백질일 수 있으나, 이들은 폴리펩타이드의 불활성형이므로 VEGF2의 작용을 방지한다. 이러한 길항제의 예는 VEGF2 폴리펩타이드의 우세한 네가티브 돌연변이체, 예를 들면 VEGF2의 이종-이량 체형의 한쪽 쇄가 우세할 수 있고 생물학적 활성이 보유되지 않도록 돌연변이될 수 있는 돌연변이체를 포함한다. 우세한 네가티브 돌연변이체의 예는 다른 이량체와 상호작용하여 야생형 VEGF2를 형성할 수 있으나, 수득되는 동종-이량체는 불활성이 어서 특징적인 VEGF2 활성을 나타내지 않는 이량체성 VEGF2의 트렁케이트(truncate)된 버전을 포함한다.
다른 강력한 VEGF2 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술은 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드의 결합을 기본으로 하는 삼중-나선의 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 암호화 부위를 사용하여 길이가 10 내지 40개 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오타이드를 전사에 포함된 유전자 영역에 상보성이 되도록 설계함으로써[참조: triple helix, Lee et al., Nucl, Acids Res., 6:303 (1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)], VEGF2의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드화하며 VEGF2 폴리펩타이드내로 mRNA 분자의 해독을 차단한다[참조: Antisense-Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]. 상술된 올리고뉴클레오타이드는 또한 세포로 수송됨으로써 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 VEGF2의 생산을 억제할 수 있다.
강력한 VEGF2 길항제는 또한 폴리펩타이드의 활성 부위에 결합하여 점유함으로써 정상적인 생물학적 활성이 방지되도록 기질에 대해 수용불가능한 촉매 부위를 만드는 소 분자를 포함한다. 소 분자의 예는 소 펩타이드 또는 펩타이드-유사 분자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
길항제는 충실성 종양 변이에 필요한 제한적인 맥관형성을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
VEGF2를 암호화하는 mRNA는 악성 표현형의 VEGF2 폴리펩타이드의 역할을 지시하는 2개 이상의 유방암 세포주에서 적절한 수준으로 발현되는 것을 밝혀졌다. 교종은 본 발명의 길항제로 치료될 수 있는 신생물 유형이다.
길항제는 또한 증가된 혈관 침투성에 의해 유발된 염증을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환외에, 길항제는 또한 당뇨병성 망막증, 류마치스 관절염 및 건선을 치료하는데 사용될 수 있다.
길항제를 예를 들면, 이후에 기술된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와의 조성물로 사용될 수 있다.
VEGF2 폴리펩타이드 및 효능제와 길항제는 적합한 약제학적 담체와 배합하여 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 또는 효능제 또는 길항제와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 제형은 투여 형태에 적합하여야 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 성분 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 당국에 의한 승인을 반영하는, 약제 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 당국에 의해 서술된 형의 치침과 연관된다. 또한, 약제학적 조성물은 기타 치료학적 화합물과 함께 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피하내, 비강내 또는 경피내 경로와 같은 통상의 방식으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 특수한 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 체중 kg당 약 10㎍이상의 양으로 투여되며 대부분의 경우 이들은 하루에 체중 kg당 약 8mg을 초과하지 않는 양으로 투여될 것이다. 대부분의 경우, 용량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여 하루에 체중 kg당 약 10㎍ 내지 약 1mg이다.
VEGF2 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드인 효능제 또는 길항제는 또한 유전자 치료요법으로 흔히 언급되는 생체내 이러한 폴리펩타이드의 발현에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
즉, 예를 들어, 골수 세포와 같은 세포를 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)로 생체외에서 가공한 다음 가공된 세포를 폴리펩타이드로 치료할 환자에게 제공할 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 세포를 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용함에 의해 당해 분야에 공지된 방법으로 가공할 수 있다.
유사하게, 세포는 예를 들면, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 생체내에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 생체내에서 가공할 수 있다. 당해분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위한 생산 세포를 생체내에서 세포를 가공하고 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 방법에 의한 본 발명의 폴리펩타이드를 투여하는 방법들은 본 발명의 교시로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 가공되는 세포에 대한 발현 비히클은 레트로 바이러스 입자 이외의 것, 예를 들면 아데노바이러스일 수 있으며, 이들은 적합한 수송 비히클과의 배합후 생체내에서 세포를 가공하는데 사용될 수 있다.
앞서 언급한 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 기원할 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 비장 괴상 바이러스, 로우스 사코마 바이러스(Rous sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 아비안 백혈증 바이러스(avian leukosis virus), 기본 아페 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 사람 면역결핍성 바이러스, 아데노바이러스, 척수증식성 육종 바이러스 및 포유동물 종양 바이러스와 같은 레트로 바이러스를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 한 양태로써, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이로스로부터 기원한다.
벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터[참조: Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989)] 또는 기타 특정의 프로모터(예: 히스톤, 폴 III 및 β-액틴 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵 세포 프로모터와 같은 세포성 프로모터)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 사용될 수 있는 기타 바이러스 프로모터는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 B19 파르보바이러스 프로모터를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 적합한 프로모터의 선별은 본원에 포함된 교시로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터와 같은 아데노바이러스 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 같은 이종 프로모터; 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 열 쇽 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 헤르페스 단성 티미딘 키나제 프로모터(Herpes Simplex thymidine kinse promoter)와 같은 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR(상기 기술한 변형된 레트로바이러스 LTR 포함); β-액틴 프로모터 및 사람 성장 호르몬 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 프로모터는 또한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 조절하는 본래의 프로모터일 수 있다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터는 생산 세포주를 형성시키기 위한 패키징 세포주를 인공적 항원 변환시키는데 사용할 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예는 PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 전체가 본원에서 참조로 도입된 문헌[참조: Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pgs. 5-14 (1990)]에 기술된 바와 같은 DNA 세포주를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 벡터는 당해 분야에 공지된 어떠한 수단을 통해 패키징 세포를 인공적항원변환시킬 수 있다. 이러한 수단은 일렉트로포레이션, 리포좀의 사용, CaPO4침전의 사용을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 양태로써, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀내로 봉입시키거나 지질에 커를링시킨 후, 숙주에게 투여할 수 있다.
생산 세포주는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터를 생성한다. 다음 이러한 레트로바이러스 벡터 입자를 실험관내 또는 생체내에서 진핵 세포를 인공적항원변환시키는데 사용할 수 있다. 인공적항원변환된 진핵세포는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 발현할 것이다. 인공적항원변환될 수 있는 진핵 세포는 배아 긴 세포, 배아 암 세포 및 조혈성 간세포, 간세포, 섬유아세포, 근원 세포, 케라티노사이트(keratinocyte), 내피 세포 및 기관지 상피 세포를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 VEGF2 핵산 서열중의 돌연변이체의 존재와 관련된 질환 또는 질환 위험성을 검출하기 위한 진단 검정의 일부로서의 VEGF2 유전자의 용도에 관한 것이다.
VEGF2 유전자내 돌연변이체를 수반하는 개인은 각종 기술에 의해 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들면 혈액, 뇨, 타액, 조직생검 및 부검 물질로부터 수득할 수 있다. 게놈성 DNA는 검출에 직접 사용할 수 있거나 분석전에 PCR을 사용함으로써 효소적으로 증폭시킬 수 있다[참조: Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)]. RNA 또는 cDNA를 또한 동일한 목적을 위해 사용할 수 있다. 예로써 VEGF2를 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VEGF2 돌연변이체를 동정하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교하여 증폭된 산물의 크기에 있어서의 변화에 의해 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 방사표지된 VEGF2 RNA 또는 달리는, 방사선 표지된 VEGF2 안티센스 DNA 서열에 하이브리드화시킴에 의해 동정할 수 있다. 완전하게 짝을 이룬 서열은 RNase A 결실 또는 융점의 차이에 의해 짝을 이루지 않은 듀플렉스(duplex)로부터 구별될 수 있다.
DNA 서열 차이를 기준으로 하는 유전적 시험은 변성제의 존재 또는 부재하에 겔내 DNA 단편의 전기영동적 이동성에 있어서의 변화를 검출함으로써 달성할 수 있다. 작은 서열 결실 및 삽입은 고 분해 겔 전기영동에 의해 가시화할 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 상이한 DNA 단편의 이동성의 특수한 융점 또는 부분 융점 온도에 따른 상이한 위치에서 겔내에서 지연되는 변성된 포름아미드 구배 겔상에서 구별될 수 있다[참조: Myers et al., Science, 23:1242 (1985)].
특이적 위치에서의 서열 변화는 또한 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 검정 또는 화학적 분해 방법에 의해 알 수 있다[참조: Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)].
즉, 특이적 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 분해, 직접적인 DNA 서열분석 또는 제한 효소[즉, 제한 단편 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphisms:RFLP)] 및 게놈성 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법으로 달성할 수 있다.
더욱 통상적인 겔-전기영동 및 DNA 서열분석외에, 돌연변이는 또한 반응계 자체내 분석으로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 정상의 대조군 조직 샘플과 비교하여 단백질의 과-발현이 질병의 존재 또는 질병에 걸릴 가능성, 예를 들면 비정상적 세포 분화를 검출할 수 있으므로 각종 조직내에서 변경된 수준의 VEGF2 단백질을 검출하기 위한 진단적 검정에 관한 것이다. 숙주로부터 기원한 샘플중에서 VEGF2 단백질의 수준을 검출하는데 사용된 검정은 당해분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며 방사면역검정, 경쟁적-결합 검정, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 검정 및 샌드위치(sanwich) 검정을 포함한다. ELISA 검정[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Chapter 6, (1991)]은 우선 VEGF2 항원에 대해 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조함을 포함한다. 또한 리로터 항체를 모노클로날 항체에 대해 제조한다. 이 리포터 항체에 방사활성, 형광성 또는 본예에서의 서양고추냉이 퍼옥시다제 효소와 같은 검출가능한 시약을 부착시킨다. 샘플을 숙주로부터 제거하고 샘플중의 단백질이 결합하는 고체 지지체, 즉 폴리스티렌 디쉬상에서 항온처리한다. 다음 디쉬상의 어떠한 유리된 단백질 결합 부위를 소 혈청 알부민과 같은 비-특이적인 단백질과 함께 항온처리하여 덮는다. 다음, 모노클로날 항체가 폴리스티렌 디쉬에 부착된 어떠한 VEGF2 단백질에 부착되는 시간 동안 디쉬내에서 항온 처리한다. 모든 결합되지 않은 모노클로날 항체를 완충제로 세척한다. 서양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬내에 위치시켜 VEGF2에 결합된 어떠한 모노클로날 항체에 대한 리포터 항체의 결합을 수득한다. 부착되지 않은 리포터 항체는 세척한다. 다음 퍼옥시다제 기질을 디쉬에 가하며 주어진 시간 동안 발색된 색상의 양은 표준 곡선에 대해 비교하는 경우 환자 샘플의 주어진 용적중에 존재하는 VEGF2 단백질의 양의 척도이다.
VEGF2에 대해 특이적인 항체를 고체 지지체에 부착시키는 경쟁적 검정을 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 예를 들면, 방사활성으로 표지하고, 숙주로부터 기원한 샘플을 고체 지지체상에 통과시켜 표지의 양을 예를 들면, 액체 신틸레이션 크로마토그래피로 검출하며, 이 양은 샘플중 VEGF2의 양과 관련될 수 있다.
샌드위치 검정은 ELISA 검정과 유사하다. 샌드위치 검정에서는 VEGF2를 고체 지지체상에 통과시켜 고체 지지체에 부착되어 있는 항체에 결합시킨다. 다음 제 2의 항체를 VEGF2에 결합시킨다. 다음 표지되어 있고 제 2의 항체에 특이적인 제 3의 항체를 고체 지지체위에 통과시켜 제 2의 항체에 결합시킨 후 양을 적량한다.
본 발명의 서열은 또한 염색체 동정에 가치가 있다. 이 서열은 개인 염색체상의 특수 위치를 특이적으로 타겟화하여 이와 하이브리드화할 수 있다. 더우기, 현재 염색체상에서의 특이적인 위치를 동정하는 것이 요구된다. 실제적인 서열 데이타(반복된 다형성)를 기준으로 하는 소수의 염색체 표시 시약이 염색체 위치를 표시하는데 유용하다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNA의 맵화는 질병과 연관된 유전자를 지닌 이들 서열을 연관시키는데 있어 중요한 제 1단계이다.
요약하면, 서열을 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 제조함으로써 염색체에 맵화할 수 있다. cDNA의 컴퓨터 분석은 게놈성 DNA내에 1개의 엑손이상으로 확장되지 않아서 증폭 공정을 복잡하게 하는 프라이머를 신속하게 선별하는데 사용된다. 다음 이들 프라이머를 개인 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 이들 하이브리드만이 증폭된 단편을 생산할 것이다.
체세포 하이브리드의 PCR 맵화는 특수한 염색체에 대한 특수 DNA를 지정하는 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 본 발명을 사용함으로써, 아국재화를 특이적 염색체 또는 거대한 게놈성 클론의 혼주물로부터의 단편의 패널로 동일한 방식에 의해 달성할 수 있다. 이 염색체에 맵화시키는데 유사하게 사용될 수 있는 기타의 맵화 방법은 반응계 자체내 하이브리드와, 표지된 유동-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 염색체 특이적인-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한 하이브리드화에 의한 예비선별을 포함한다.
중기상 염색사에 대한 cDNA 클론의 형광 자체 하이드리드화(Fluorescene in situ hybridization)를 사용하여 정밀한 염색체 위치를 1 단계로 제공할 수 있다. 이러한 기술은 50 또는 60개 염기로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 이 기술에 관해서는 버만(Verman) 등의 문헌[참조: Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques. Pergamon Press, New York (1988)]을 참조한다.
서열이 정확한 염색체 위치에 맵화되면, 염색체상에서 서열의 물리적 위치는 유전자 맵 데이터와 관련될 수 있다[이러한 데이터는 예를 들면 존 홉킨스 대학 웰치 메디칼 라이브러리(Johns Hopkins University Welch Medical Library)에서 입수 가능한 V. McKusick, Mendelian Ingeritance in Man에 기록되어 있다]. 다음 동일한 염색체 영역에 맵화된 유전자와 질병간의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동유전)을 통해 동정한다.
다음, 영향받은 개인과 영향받지 않은 개사람의 cDNA 또는 게놈성 서열에 있어서의 차이를 측정하는 것이 필수적이다. 돌연변이가 영향받은 개인의 일부 또는 전부에서 관측되나 어떠한 정상인에서도 관측되지 않는다면, 이 돌연변이는 질병의 유발인자일 것이다.
물리적 맵핑 및 유전적 맵핑 기술의 현 해결법을 사용하여, 질병과 연관된 염색체 영역에 정확하게 위치한 cDNA는 50 내지 500개의 강력한 유발 유전자중 하나일 수 있다(이것은 1메가염기 맵핑 해석 및 20kb당 1개의 유전자로 추정된다).
폴리펩타이드, 이의 단편 또는 기타 유도체 또는 이의 동족체, 또는 이들을 발현하는 세포는 이에 대한 항체를 생산하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 이들 항체는 예를 들면, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 키메라성, 일본쇄 및 사람화된 항체외에, Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 분야에 공지된 각종 방법을 사용하여 이러한 항체와 단편을 생산할 수 있다.
본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는 폴리펩타이드를 동물내로 직접 주입하거나 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 사람을 제외한 동물에 투여하여 수득할 수 있다. 다음 이렇게 수득된 항체는 폴리펩타이드 자체에 결합할 것이다. 이러한 방식으로, 심지어 폴리펩타이드의 단편만을 암호화하는 서열을 사용하여 전체의 천연 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다. 다음 이러한 항체를 사용하여 폴리펩타이드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩타이드를 분리할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위하여, 연속적인 세포주 배양으로 생산된 항체를 제공하는 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 이의 예에는 하이브리도마 기술(참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256; 495-497) 트리오마 기술(trioma technique), 사람 B-세포 하이브리도마 기술(참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 및 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(참조: Cole, et al., 1985, in Monoclonal Abtibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)이 포함된다.
일본쇄 항체를 제조하기 위해 기술된 기술(미국 특허 제4,946,778호)을 채택하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 일본쇄 항체를 생산할 수 있다. 또한, 트랜스게닉 마우스(transgenic mouse)를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 산물에 대한 사람화된 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 더 설명할 것이나, 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다. 모든 부 또는 양은 달리 제시하지 않는한, 중량 기준이다.
하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위하여, 특정의 흔히 나타나는 방법 및/또는 용어를 기술할 것이다.
플라스미드는 소문자 p를 선행하고/하거나 이어서 대문자 및/또는 숫자로 지명한다. 본원에서의 출발 플라스미드는 시판되거나, 비제한적으로 공용되거나 또는 공지된 방법에 따라 유용한 플라스미드로부터 작제할 수 있다. 또한 기술된 것과 동일한 플라스미드는 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이다.
DNA의 분해는 DNA내 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 분해함을 말한다. 본 원에서 사용된 각종의 제한 효소는 시판되고 있으며 이들의 반응 조건, 조인자 및 이들의 요구조건은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해서는 통상적으로 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 단편이 약 20㎕의 완충액중 약 2 단위의 효소와 함께 사용된다. 플라스미드 작제용 DNA를 분리할 목적을 위해서는, 통상적으로 5 내지 50㎍의 DNA를 거대 용량중 20 내지 250 단위의 효소로 분해한다. 특정 제한 효소에 대해 적절한 완충액 및 기질양은 제조업자에 의해 정의되어 있다. 37℃에서 약 1시간의 항온처리 시간이 통상적으로 사용되지만, 제조업자의 지시에 따라 변할 수 있다. 분해후, 반응을 폴리아크릴아미드 겔상에서 직접 전기영동하여 목적한 단편을 분리한다.
분해된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.
올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 2개의 상보적인 폴리데옥시뉴클레오타이드 쇄를 말한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 가하지 않으면 다른 올리고뉴클레오타이드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈포스포릴화되지 않는 단편에 연결될 것이다.
연결은 2개의 이본쇄 핵산 단편사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 말한다(참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146). 달리 제시하지 않는 한, 연결은 공지된 완충액 및 대략 등몰량의 연결될 DNA 단편 0.5㎍당 T4 DNA 리가제(리가제) 10 단위를 사용하는 조건하에서 달성할 수 있다.
달리 기술하지 않는 한, 형질전환은 문헌[참조:Graham, F. and Van der Eb, A., virology, 52:456-457 (1973)]의 방법에 의해 기술된 바와 같이 수행한다.
실시예 1
사람 조직 및 유방암 세포주에서 VEGF2의 발현 패턴
노던 블롯 분석은 사람 조직 및 사람 유방암 세포주에서 VEGF2 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해 수행하였다. 전체적인 세포의 RNA 시료는 RNAzolTMB 시스템으로 분리시켰다(Biotecx Laboratories, Inc.). 각각의 유방 조직 및 특정된 세포주로부터 분리된 전체 RNA 약 10㎍을 1% 아가로스 겔 상에서 분리시키고, 나일론 필터 상으로 블롯팅시켰다(Molecular Cloning, Sambrook Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989). 표지화 반응은 50ng DNA 단편을 사용하여 Stratagene Cloning Systems, Inc., Prime-It kit에 따라 행해졌다. 표지된 DNA는 Select-G-50 Column 5 프라임--3 프라임, Inc, Boulder, CO, USA로 정제하였다. 이어서, 필터는 0.5 M NaPO4및 7% SDS 중에서 1,000,000cpm/ml로 65℃에서 밤새 방사선 활성으로 표지된 완전한 길이의 VEGF2 유전자로 하이브리드화시켰다. 실온에서 2회 및 60℃에서 2회 0.5 X SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, 필터는 보강 스크린으로 -70℃에서 밤새 노츨시켰다. 1.6Kd의 메시지가 2개의 유방암 세포주에서 관찰되었다.
실시예 2
바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하는 VEGF2의 클로닝 및 발현
N-말단에 46 아미노산이 없는 VEGF2 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC#97161)을 유전자의 5' 및 3' 서열에 대응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
5' 프라이머는 서열 TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCC GCC ATG GAG GCC ACG GCT TAT GC(서열 4)을 갖고, BamHI 제한 효소 부위(굵음) 및 VEGF2의 5' 서열에 상보적인 17 뉴클레오타이드 서열(nt. 150-166)을 함유한다.
3' 프라이머는 서열 GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGG TCT(서열 5)를 갖고, 정지 코돈 및 정지 코돈 전의 15 nt 서열을 포함하며, VEGF2의 3' 서열에 상보적인 18 뉴클레오타이드 및 제한 효소 XbaI에 대한 분해 부위를 포함한다.
증폭된 서열을 통상의 시판되는 키트(Geneclean, BIO 101, Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다. 다음 단편을 엔도뉴클레아제 BamH1 및 XbaI로 분해한 다음 1% 아가로즈 겔상에서 다시 정제한다. 이 단편을 BamH1 및 XbaI 부위에서 pAcGP67A 바큘로바이러스 전달 벡터(PHarmingen)에 연결한다. 이 연결을 통해 VEGF2 cDNA를 바큘로바이러스 gp67 유전자의 시그날 서열과 프레임 방향으로 클로닝하고 벡터내 시그날 서열의 3' 말단에 위치시킨다. 이것을 pAcGP67A-VEGF2로 지명한다.
발현용 pRG1 벡터에 gp67 유전자의 시그날 서열을 지닌 VEGF2를 클로닝하기 위해, 시그날 서열과 일부 상부 서열을 지닌 VEGF2를 pAcGP67A-VEGF2 플라스미드로부터 VEGF2 cDNA의 상부에 위치한 Xho 제한 엔도뉴클레아제 부위와 XhoI 및 XbaI 제한 효소에 의한 XbaI 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 절단한다. 이 단편을 1% 아가로즈 겔상에서 벡터의 나머지로부터 분리하고 Geneclean 키트를 사용하여 정제한다. 이것을 F2로 지명한다.
PRG1 벡터(pVL941 벡터의 변형)를 바큘로바이러스를 사용한 VEGF2 단백질의 발현에 사용한다(참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station bulletin No. 1555). 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamH1, Sma1, XbaI, BhlII 및 Asp718에 대한 인지 부위를 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제 XhoI에 대한 부위는 BamH1 부위의 상부에 위치한다. Xho1 및 BamHI 사이의 서열은 pAcGp67A(테입 상의 정적 위치) 벡터내의 서열과 동일하다. 시미안 바이러스(simian virus: SV) 40 의 폴리아데닐화 부위는 상이한 폴리아데닐화에 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터와 동일한 배향으로 삽입한 후 폴리헤드린 유전자의 폴리아데실화 시그날을 삽입한다. 폴리헤드린 서열을 공감염된 야생형 바이러스 DNA의 세포-중재된 동종 재조합에 대한 바이러스 서열에 의해 양쪽 측면에서 플랭킹된다. pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 많은 다른 바큘로바이러스 벡터를 pRG1 대신에 사용한다(참조:Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39).
플라스미드를 제한 효소 XboI 및 XbaI로 분해한 후 송아지 장 포스파타제를 사용하여 당해 분야에 공지된 방법으로 탈포스포릴화시킨다. 다음 DNA를 시판되는 키트(Geneclean BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다. 이 벡터 DNA를 V2로 지명한다.
단편 F2 및 탈포스포릴화된 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제와 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시키며 이 세포가 효소 BamH1 및 XbaI을 사용하여 VEGF2 유전자를 지닌 플라스미드(pBac gp67-VEGF2)을 포함하는지를 확인한다. 클론된 단편의 서열을 DNA 서열분석으로 확인한다.
플라스미드 pBac gp67-VEGF2 5㎍을 시판하는 선형화된 바큘로바이러스(BaculoGoldTMbaculovirus DNA, Pharmingen, San Diego, CA.) 1.0㎍을 사용하여 지질감염법(참조: Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]으로 공감염시킨다.
BaculoGoldTM바이러스 DNA 1㎍ 및 플라스미드 pBac A2GP-VEGF2 5㎍을 혈청 유리된 그레이스 배지(Grace's medium: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD)의 멸균 웰중에 혼합한다. 이후, 리포펙틴 10㎕ 및 그레이스 배지 90㎕를 가하고, 혼합에서 실온에서 15분간 항온처리한다. 다음 형질감염 혼합물을 혈청이 없는 그레이스 베지 1ml가 들어있는 35mm의 조직 배양 플레이트에 종균 배양된 Sf9 곤충 세포에 적가한다. 이 플레이트를 앞뒤로 흔들어 새로이 가해진 용액과 혼합한다. 다음 이 플레이트를 27℃에서 5시간 항온처리한다. 5시간 후, 형질감염된 용액을 플레이트로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml를 가한다. 이 플레이트를 인큐베이터내에 다시 넣고 27℃에서 4일간 계속 항온처리한다.
4일 후, 상층액을 수집하고 서머스(Summers) 및 스미드(Smith) 등이 기술한 바와 유사하게 플라크 검정을 수행한다. 변형으로서 블루 갈(Blue Gal)(참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg)과 함께 아가로즈 겔을 사용하여 청색으로 염색된 플라크를 용이하게 분리한다(참조: 플라그 검정의 상세한 기술은 또한 Life Technologies Inc., Gaithersbug사에서 배포한 곤충 세포 배양 및 바큘로바이롤로지에 대한 사용자 지침서 9 내지 10면에서 찾을 수 있다).
일련의 희석 후 4일째에, 바이러스를 세포에 가하고, 청색 염색된 플라크를 에펜도르프의 끝으로 집어올린다. 다음 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브내에 재현탁시킨다. 아가를 약간 원심분리하여 제거하고 재조합 바큘로바이러스를 함유하는 상층액을 35mm짜리 디쉬내에 종균배양된 Sf9 세포를 감염시키는데 사용한다. 4일후 이 배양 디쉬의 상층액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.
Sf9 세포를 10% 혈-불활성시킨 FBS로 보충된 그레이스 배지내에서 성장시킨다. 이 세포를 1의 감염 다중성(MOI)에서 재조합 바큘로바이러스 V-A2GP-VEGF2를 감염시킨다. 6시간후, 배지를 제거하고 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지(Life Technologies Inc., Gaithersburg)로 교체한다. 42시간후 5μCi의35S-메티오닌과 5μCi의35S 시스테인(Amersham)을 가한다. 이 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 항온처리하고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동방사선 사진을 가시화한다.
배지 및 Sf9 세포의 세포질로부터의 단백질을 환원 및 비-환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분석한다(도 4 참조). 배지를 50mM MES, pH 5.8에 대해 투석한다. 침전물을 투석후 수득하고 100mM 나트륨 시트레이트, pH 5.0중에 재현탁시킨다. 재현탁된 침전물을 다시 SDS-PAGE로 분석하고 꼬마지에 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색한다.
배지 상층액을 또한 50mM MES, pH 5.8중에 1:10으로 희석시키고 1ml/분의 유동 속도에서 SP-650M 컬럼(1.0×6.6cm, Toyopearl)에 적용시킨다. 단백질을 200, 300 및 500mM NaCl에서 단계별 구배로 용출시킨다. 500mM에서의 용출을 사용하여 VEGF2를 수득한다. 용출물을 환원제인 β-머캅토에탄올의 존재 또는 부재하에서 SDS-PAGE로 분석하고 꼬마지에 브릴리언트 블루로 염색한다(도 6 참조).
실시예 3
COS 세포에서 재조합 VEGF2의 발현
플라스미드 VEGF2-HA의 발현은 1) 복제의 SV40 장기, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 이. 콜라이 복제 장기, 4) 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위가 후속하는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터 pcDNAI/Amp(Invitrogne)로부터 유도된다. 그의 3' 말단에 프레임 방향으로 융합된 HA 태그 및 전체 VEGF2 전구체를 암호화하는 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝시키고, 그에 따라 제조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 하에 지시된다. HA 태그는 이미 기재된 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다(참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37:767, (1984)). 타켓 단백질에 대한 HA 태그의 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체에 의해 재조합 단백질의 용이한 검출을 허용한다.
플라스미드 작제 전략은 다음과 같이 기재한다:
VEGF2를 암호화하는 DNA 서열, ATCC # 97161을 2개의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 작제하였고: 즉, 5' 프라이머(CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA)(서열 6)는 BamHI 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 VEGF2 암호화 서열의 18 뉴클레오타이드를 함유하고; 3' 서열(CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTC TGG TCT 3')(서열 7)는 XbaI 부위, HA 태그, XhoI 부위 및 VEGF2 암호화 서열의 최종 15 뉴클레오타이드에 대한 상보 서열(정지 코돈을 포함하지 않음)을 함유한다. 따라서, PCR 생성물은 BamHI 부위, XhoI 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 프레임 방향으로 융합된 HA 태그가 후속하는 암호화 서열, HA 태그 다음의 해독 말단 정지 코돈 및 XbaI 부위를 포함한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp는 BamHI 및 XbaI 제한 효소를 사용하여 분해시키고 연결시켰다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037)로 형질전환시키고, 형질 전환된 배양액을 암피실린 배지 플레이트 상에서 평판 배양시키고, 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재를 제한 분석에 의해 조사하였다. 재조합 VEGF2의 발현을 위해, COS 세포들을 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터에 의해 형질감염시켰다(참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). VEGF2-HA 단백질의 발현은 방사선 표지법 및 면역침전법에 의해 검출하였다(참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). 세포들을 형질 감염 2일 후,35S-시스테인에 의해 8시간 동안 표지시켰다. 이어서 배양 배지를 수집하고, 세포들을 계면활성제 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH7.5)으로 헹구어 냈다(참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984)). 모든 세포 헹굼액 및 배양 배지는 HA 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 침전시켰다. 침전된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다.
실시예 4
혈관 내피 세포의 성장에 대한 부분-정제된 VEGF2 단백질의 효과
1일 째에, 사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 4% 송아지 태아 혈청(FBS), 16유니트/ml 헤파린, 및 50유니트/ml 내피 세포 성장 보충액(ECGS, Biotechnique, Inc.)을 함유하는 M199 배지에 2-5x104세포/35mm 접시 밀도로 파종하였다. 2일째에, 배지를 10% FBS, 8유니트/ml 헤파린을 함유하는 M199로 대체하였다. 서열 2의 VEGF2 단백질 - 초기 45 아미노산 잔기(VEGF) 및 기본적인 FGF(bFGF)를 도시된 농도로 첨가하였다. 4일 및 6일 째에, 배지를 대체시켰다. 8일 째에, 세포수를 코울터 계수기에 의해 측정하였다(도 8 참조).
실시예 5
혈관 내피 세포의 성장에 대한 정제된 VEGF2 단백질의 효과
1일 째에, 사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)를 4% 송아지 태아 혈청(FBS), 16유니트/ml 헤파린, 및 50유니트/ml 내피 세포 성장 보충액(ECGS, Biotechnique, Inc.)을 함유하는 M199 배지에 2-5x104세포/35 mm 접시 밀도로 파종하였다. 2일 째에, 배지를 10% FBS, 8유니트/ml 헤파린을 함유하는 M199로 대체하였다. 서열 2의 정제된 VEGF2 단백질 - 초기 45 아미노산 잔기를 이러한 시점에서 배지에 첨가하였다. 4일 및 6일 째에, 배지를 신선한 배지 및 보충액으로 대체시켰다. 8일 째에, 세포수를 코울터 계수기에 의해 측정하였다(도 9 참조).
실시예 6
유전자 치료요법을 통한 발현
피부 생검에 의해 대상으로부터 섬유아세포를 수득한다. 수득되는 조직을 조직-배양 배지중에 두고 소 조각으로 분리한다. 조직의 작은 조각을 조지 배양 플라스크의 습윤 표면상에 두며, 대략 10개의 조각을 각각의 플라스크내에 둔다. 이 플라스크를 거꾸로 하여, 밀봉하고, 실온에서 밤새 둔다. 실온에서 24시간 후, 이 플라스크를 거꾸로 하면 조직의 조각은 플라스크의 바닥에 고정된 채로 존재하며 신선한 배지[즉, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 햄스(Ham's) F12 배지]를 가한다. 다음 이것을 37℃에서 대략 1주일동안 항온처리한다. 이때에, 신선한 배지를 가하고 연속해서 매 7일마다 변화시킨다. 추가로 배양 2주일 후, 섬유아세포의 단층이 나타난다. 단층을 트립신처리하고 큰 플라스크로 옮긴다.
몰로니 뮤린 육종 바이러스의 긴 말단 반복단위로 플랭킹된 pMV-7(참조:Kirschmeier, P.T. et al. DNA, 7:219-25 (1988)]을 EcoRI 및 HindIII로 분해하고 연속해서 송아지 장 포스파타제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로즈 겔상에서 단편화하고 유리 비드를 사용하여 정제한다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 각각 5' 및 3' 말단 서열에 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 포함하며 3' 프라이머는 HindIII 부위를 포함한다. 동량의 몰로니 뮤린 육종 바이러스 선형 쇄와 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 T4 DNA 리가제의 존재하에 함께 가한다. 수득되는 혼합물을 2개의 단편의 연결에 적절한 조건하에 유지시킨다. 연결 혼합물을 사용하여 세균 HB101을 형질감염시킨 후, 이를 벡터가 적절히 삽입된 목적하는 유전자를 가지는지를 확인할 목적으로 가나마이신을 함유하는 아가상에 둔다.
암포트로픽(amphotropic) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양물내에서 10% 송아지 형청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신이 들어 있는 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium: DMEM)중에서 합치 밀도로 성장시킨다. 다음 유전자를 포함하는 MSV 벡터를 배지에 가하고 패키징 세포를 벡터로 인공적 항온변화시킨다. 이제 패키징 세포는 유전자를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생성한다(패키징 세포를 이후로 생산자 세포로 언급한다).
신선한 배지를 인공적 항온변화시킨 생산자 세포로 가하고, 연속적으로 배지를 합치된 생산자 세포의 10cm 플레이트로부터 수거한다. 감염성 바이러스 입자를 포함하는 소모된 배지를 밀리포어 여과를 통해 여과하여 분리된 생산자 세포를 제거하고 이 배지를 사용하여 섬유아세포 세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 아-합치된 플레이트로부터 제거하고 생산자 세포로부터의 배지로 빠르게 교체한다. 이 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 바이러스의 역가가 높은 경우, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염된 것이므로 선별이 요구되지는 않는다. 역가가 매우 낮은 경우, neo 또는 his와 같은 선별가능한 마커를 갖는 레트로바이러스 벡터를 사용하여야 한다.
다음 가공된 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 3 마이크로캐리어 비드(cytodex 3 microcarrier bead)상에서 합치상태로 성장시킨 후 숙주내로 주입한다. 이제 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산한다.
본 발명의 다수의 변형 및 변화가 상기 교시의 측면에서 가능하므로, 첨부된 청구의 범위 영역내에서, 본 발명은 특별히 기술된 것 외에 달리 실행될 수 있다.
서열 목록
(1) 일반 정보
(i) 출원인: 후 등
(ii) 발명의 명칭: 사람 혈관 내피 성장 인자 2
(iii) 서열의 수: 10
(iv) 거주 주소:
(A) 주소: 스튜어트 앤드 올스타인 세치 실필란 바인 바이른 카렐라
(B) 거리: 6벡커 팜 로드
(C) 시: 로즈랜드
(D) 주: 뉴저지주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 07068
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 타입: 3.5인치 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PS/2
(C) 운용 시스템: MS-DOS
(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙트 5.1
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호: 08/465,968
(B) 출원일: 1995년 6월 6일
(C) 분류:
(vii) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: 08/207,550
(B) 출원일: 1994년 3월 8일
(viii) 대리인/위임자 정보:
(A) 성명: 페라로 그레고리 디
(B) 등록번호: 36,134
(C) 참조/서류 번호: 325800-288
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호: 201-994-1700
(B) 팩스번호: 201-994-1744
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 1674 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(xi) 서열 기술:
[서열 1]
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 419 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 본쇄형:
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 2]
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 14 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 본쇄형:
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 펩타이드
(xi) 서열 기술:
[서열 3]
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 50 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 올리고뉴클레오타이드
(xi) 서열 기술:
[서열 4]
TGTAATACGA CTCACTATAG GGATCCCGCC ATGGAGGCCA CGGCTTATGC50
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 올리고뉴클레오타이드
(xi) 서열 기술:
[서열 5]
GATCTCTAGA TTAGCTCATT TGTGGTCT28
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 올리고뉴클레오타이드
(xi) 서열 기술:
[서열 6]
CGCGGATCCA TGACTGTACT CTACCCA27
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 60 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 분쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 올리고뉴클레오타이드
(xi) 서열 기술:
[서열 7]
CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAC TCGAGGCTCA TTTGTGGTCT60
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 196 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 본쇄형:
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 8]
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 241 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 본쇄형:
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 9]
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성
(A) 길이: 231 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 본쇄형:
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열 기술:
[서열 10]
Claims (20)
- (a) 서열 2로 제시된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;(b) (a)의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화될 수 있고 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 일원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
- 제2항에 있어서, 서열 2로 제시된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제2항에 있어서, 서열 2로 제시된 -46 내지 373번의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제2항에 있어서, 서열 2로 제시된 1 내지 373번의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- (a) ATCC 기탁 번호 97161에 함유된 DNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;(b) ATCC 기탁 번호 97161에 함유된 DNA에 의해 발현된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;(c) (a) 및 (b)의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화될 수 있고 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및(d) (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 일원을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제2항의 DNA를 함유하는 벡터.
- 제7항의 벡터에 의해 유전공학적으로 가공된 숙주 세포.
- 제8항의 숙주 세포로부터 상기 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 제조방법.
- 제7항의 벡터에 의해 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포의 제조방법.
- (i) 서열 2의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; (ii) 서열 2의 아미노산 1 내지 아미노산 373을 포함하는 폴리펩타이드 및 (iii) ATCC 기탁 번호 97161의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드.
- 제11항의 폴리펩타이드에 대한 효능제로서 효과적인 화합물.
- 제11항의 폴리펩타이드에 대한 길항제로서 효과적인 화합물.
- 치료 유효량의 제11항의 폴리펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF2를 필요로 하는 환자의 치료방법.
- 제14항에 있어서, 치료 유효량의 폴리펩타이드가 폴리펩타이드를 암호화하고, 생체 내에서 폴리펩타이드를 발현시키는 DNA를 환자에게 제공함으로써 투여되는 치료방법.
- 치료 유효량의 제12항의 화합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF2를 필요로 하는 환자의 치료방법.
- 치료 유효량의 제13항의 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF2의 억제를 요하는 환자의 치료방법.
- 제11항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서 돌연변이를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩타이드의 발현과 관련된 질병 또는 이러한 질병에 대한 민감성의 진단방법.
- 숙주로부터 유도된 시료 중에서 제11항의 폴리펩타이드의 존재를 분석하는 단계를 포함하는 진단방법.
- 폴리펩타이드에 대한 수용체(여기서, 상기 수용체는 화합물이 수용체에 결합되는 것에 반응하여 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 제2 성분과 관련되어 있다)를 이의 표면 상에 발현시키는 세포를 이 수용체에 결합시키는 조건하에 스크린될 화합물과 접촉시키는 단계 및화합물과 수용체의 상호 작용에 의해 발생된 신호의 존재 또는 부재를 검출함으로써 화합물이 수용체에 결합되고 수용체를 활성화시키거나 억제하는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 제11항의 폴리펩타이드에 대한 수용체에 결합되고 수용체를 황성화시키거나 억제하는 화합물의 동정방법.
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