CN111303271B - 一种用于治疗肺纤维化的血小板源性生长因子重组疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗肺纤维化的血小板源性生长因子(PDGF)重组疫苗,将PDGF的抗原表位(aa72‑87,QVRKIEIVRKKPIFKK)插入激烈火球菌硫氧还原蛋白(PfTrx)的原核质粒pET28‑PfTrx中,表达纯化重组疫苗PfTrx‑PDGF16(72‑87),该重组疫苗可以成功刺激机体产生高效价的抗PDGF中和性抗体,明显减轻经博莱霉素(BLM)诱导后产生的小鼠肺纤维化。PfTrx‑PDGF16(72‑87)重组疫苗免疫可以明显减轻博莱霉素气管灌注后急性期肺组织的炎症反应,抑制小鼠肺脏胶原生成以及细胞基质的增多、沉积;同时还可以降低小鼠肺组织的TGF‑β1、CTGF、α‑SMA、Col1a2、Col3a1的表达水平,这些特点都极有利于减缓肺纤维化的进程。
Description
技术领域
本发明属于肺纤维化治疗药物领域,具体涉及一种用于治疗肺纤维化的血小板源性生长因子重组疫苗及其应用。
背景技术
肺纤维化(或称肺间质纤维化,pulmonary fibrosis,PF)是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变,其病程多呈慢性进展。PF的病因常见的有环境、职业、物理和化学因素等,例如石棉、粉尘、药物、放射损伤、有害气体吸入等。一些免疫性疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、皮肌炎、硬皮病等也可伴发PF。PF多在40-50岁发病,多为散发,男性稍多于女性,估计发病率3~5人/10万,且近年来发病率呈明显上升趋势。大部分PF无有效的病因治疗,患者的5年生存率仅为30%-50%,非药物治疗手段包括氧疗、机械通气、肺移植等。目前新型的用于治疗特发性肺纤维化的药物吡非尼酮(Pirfenidone)及尼达尼布(Nintedanib),价格高,并且只对部分人群有效。故探索更有效,经济的抗肺纤维化药物是目前医学研究领域面临的重要课题。
血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)是30多年前从人的血小板中分离出来的肽类生长因子,该家族由PDGFA、B、C、D四个成员组成,通过二硫键的连接形成同型或异型二聚体,从而产生五种形式,即PDGF-AA、-AB、-BB、-CC和-DD。其中,PDGF-BB是唯一能与三种PDGF受体PDGF-Rαα、PDGFRαβ及PDGFRββ均可结合的分子,也是目前与配体特异性结合位点研究最为清楚的分子,在纤维化及癌症中发挥重要作用。很多新型的分子靶向药物作用机制包括抑制PDGF受体(PDGFR),如治疗慢性粒细胞白血病的甲硫酸伊马替尼(Imatinib)、达沙替尼(Dasatinib)及尼洛替尼(Nilotinib);用于胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌的舒尼替尼(Sunitinib)及索拉非(Sorafenib)。而用于治疗肺纤维化的新药吡非尼酮(Pirfenidone),则能减少炎症细胞积聚,抑制成纤维细胞受到如转化生长因子β(TGF-β)和PDGF刺激后引起的细胞增殖、纤维化相关蛋白和细胞因子产生以及细胞外基质的合成和积聚。尼达尼布(Nintedanib)是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂,可抑制多种受体酪氨酸激酶(RTK),包括血小板衍生生长因子受体α和β(PDGFRα、β)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR),发挥抗纤维化和抗炎作用。由此可见,PDGF在肺纤维化的发生发展过程中起重要的作用,抑制PDGF的作用可以起到拮抗肺纤维化的作用。
细胞因子是指由多种免疫细胞产生的一种具有高活性、多功能的小分子物质,在维持生命活动中发挥重要作用。然而,在疾病病理过程,某些细胞因子的异常表达及活化却促进了疾病的发生发展。因此,阻断或拮抗病理情况下高度表达的细胞因子,是近年来在疾病诊疗过程中的又一重要手段,最为著名的就是治疗类风湿性关节炎的生物制剂TNF-α拮抗剂。然而,现有的生物制剂多为通过基因工程手段表达的针对细胞因子的单克隆抗体或者可溶性受体,属于被动免疫,存在过敏的可能,费用高,需多次使用等一系列问题,因此抗细胞因子疫苗应运而生。
抗细胞因子疫苗是通过主动免疫的方式,刺激机体产生针对自身细胞因子的抗体,从而阻断病理状态的细胞因子活性。现有的细胞因子疫苗在动物实验中研究很多,包括抗IL-1β疫苗用于治疗糖尿病和关节炎、抗IL-27疫苗治疗关节炎等,初步治疗效果可靠。然而疫苗制备前期投入大,需要选取合适的抗原表位以及载体,制备的疫苗是否具有免疫原性,可以刺激机体产生高滴度的针对性抗体,产生的抗体是否可以中和致病性细胞因子的活性,是否可以抑制疾病的进展,都需要大量的实验验证,因此采用疫苗的方式抑制致病性细胞因子的作用研究相对较少,目前尚未有针对PDGF的疫苗来治疗肺纤维化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗肺纤维化的血小板源性生长因子重组疫苗及其应用。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一种用于治疗肺纤维化的短肽,该短肽为血小板源性生长因子PDGF-B的抗原表位,位于aa72-87位,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
本发明公开了一种重组疫苗,由上述氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的短肽插入激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体中装配而成,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
优选地,该重组疫苗在体内能够产生拮抗PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D生物学活性的中和性抗体。
本发明还公开了上述的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的重组疫苗在制备抗肺纤维化药物中的应用。
优选地,所述的药物为降低肺组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平的药物。
优选地,所述的药物为降低肺泡灌洗液中白细胞数量及渗出的药物。
优选地,所述的药物为降低肺组织中Ⅰ型胶原Col1a2、Ⅲ型胶原Col3a1、α-SMA、TGF-β1及CTGF含量的药物。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种用于治疗肺纤维化的重组蛋白疫苗,通过将血小板源性生长因子(PDGF)的抗原表位(aa72-87,QVRKIEIVRKKPIFKK)插入激烈火球菌硫氧还蛋白(PfTrx)载体,构建重组疫苗PfTrx-PDGF16(72-87)。该重组疫苗可以刺激机体产生高效价的抗PDGF中和性抗体,该抗体可与PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D发生交叉反应,对PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D均有中和作用。用该重组疫苗免疫后的小鼠,经博莱霉素诱导后产生的肺纤维化程度明显减轻。
通过实验验证,本发明的PDGF重组疫苗免疫可以明显减轻博莱霉素诱导后急性期小鼠肺组织中炎性渗出及炎症因子表达水平,降低肺纤维化阶段小鼠肺组织中Ⅰ型胶原含量。另外,免疫后小鼠体内的TGF-β1、结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)的水平也明显下降,这有利于减缓肺纤维化的进程。结果表明,PDGF重组疫苗可以成功抑制博莱霉素诱导的小鼠的肺纤维化。因此,PDGF重组疫苗有望被开发为治疗肺纤维化的有效手段。
附图说明
图1为重组蛋白PfTrx-PDGF16(72-87)、PfTrx的原核表达及纯化图;
图2为重组蛋白PfTrx及PfTrx-PDGF16(72-87)刺激机体产生的抗体滴度图;其中,(a)为PDGF-B包板,PfTrx及PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后血清抗体滴度测定结果;(b)为PfTrx包板,PfTrx及PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后血清抗体滴度测定结果;
图3为验证Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)多克隆抗体的Western blot图;
图4为验证纯化的Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)多克隆抗体具有中和rPDGF-A、rPDGF-B、rPDGF-C和rPDGF-D生物学活性的直方图;
图5为免疫及造模时间图;
图6为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺组织HE染色图;其中,(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组(×200);
图7-1为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺泡灌洗液白细胞计数图;
图7-2为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺泡灌洗液蛋白定量结果;
图8-1为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺组织总重;
图8-2为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺系数;
图9为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺组织IL-1βmRNA表达水平图;
图10为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺组织IL-6mRNA表达水平图;
图11为博莱霉素气管灌注后3天小鼠肺组织TNF-αmRNA表达水平图;
图12为博莱霉素气管灌注后28天肺组织羟脯氨酸总量测定图;
图13为博莱霉素气管灌注后28天小鼠肺组织HE红染色图;其中,(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组(×200);
图14为博莱霉素气管灌注后28天小鼠肺组织天狼猩红染色图;其中,(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组(×200);
图15为Real-time法检测博莱霉素气管灌注后28天肺组织纤维化指标TGF-β1图;
图16为Real-time法检测博莱霉素气管灌注后28天肺组织纤维化指标CTGF图;
图17为Real-time法检测博莱霉素气管灌注后28天肺组织纤维化指标α-SMA图;
图18-1为Real-time法检测博莱霉素气管灌注后28天肺组织纤维化指标Col1a2图;
图18-2为Real-time法检测博莱霉素气管灌注后28天肺组织纤维化指标Col3a1图;
图19-1为博莱霉素气管灌注后28天小鼠肺组织中α-SMA表达的Western blot图;
图19-2为博莱霉素气管灌注后28天小鼠肺组织中α-SMA表达分析图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
本发明提供一种用于治疗肺纤维化的PDGF重组疫苗,该重组疫苗是将血小板源性生长因子(PDGF-B)的抗原表位(aa72-87,QVRKIEIVRKKPIFKK)插入激烈火球菌硫氧还原蛋白(PfTrx)的原核表达质粒pET28-PfTrx中装配而成。
经该重组疫苗免疫小鼠,可使小鼠产生高效价的抗PDGF中和性抗体,该抗体可以与PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D发生交叉反应。经该疫苗免疫后的小鼠,博莱霉素诱导后产生的肺纤维化程度明显减轻。
在进一步的研究中,得到结论:该PDGF重组疫苗免疫可以明显减少肺组织细胞外基质的沉积,抑制小鼠肺内的肌成纤维细胞的分化,减少其胶原的合成与分泌,进而发挥抗纤维化作用。另外,免疫后小鼠体内的TGF-β1、α-SMA、CTGF、Col1a2、Col3a1的水平也明显下降,这极有利于减缓肺纤维化的进程。结果表明,PDGF重组疫苗可以成功抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。
1、PfTrx-PDGF16(72-87)疫苗的制备
(1)pET28-PfTrx的载体构建
参照专利《用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用》(专利号ZL201810214405.3)。
(2)PDGF16(72-87)抗原表位的预测
利用B细胞表位预测软件(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.html在线预测),针对PDGF-B与血小板源性生长因子受体(PDGFR)作用的位点,设计了16个氨基酸的短肽,即QVRKIEIVRKKPIFKK(72位到87位),标记为PDGF16(72-87)。
(3)PDGF16(72-87)编码序列的克隆
采用PCR技术以正常人基因组cDNA为模板,扩增PDGF16(72-87)编码序列,引物序列如下:
PDGF16(72-87)F 5’-CCCTCGAGCAGGTGAGGTGAGAAAGATT-3’
(斜体为XhoI酶切位点)
PDGF16(72-87)R5’-CCCGGATCCCTTCTTAAAGATTGGCTTCTTC-3’(斜体为BamH I酶切位点)
(4)pET28-PfTrx-PDGF16(72-87)原核表达载体的构建
1)将PDGF16(72-87)的PCR产物琼脂糖电泳割胶纯化后连接入pGEM-Teasy载体,构建重组质粒pGEM-Teasy-PDGF16(72-87),转入E.coli DH5α中,提取质粒,并送上海生工公司测序正确。
2)将所构建的pGEM-Teasy-PDGF16(72-87)及pET28-PfTrx质粒,在扩增后均使用XhoI及BamHI双酶切,并行琼脂糖电泳及割胶回收所得的PfTrx-PDGF16(72-87)片段及pET28-PfTrx载体,并使用DNA T4连接酶构建pET28-PfTrx-PDGF16(72-87)质粒。
(5)pET28-PfTrx及pET28-PfTrx-PDGF16(72-87)的原核表达及纯化
1)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行蛋白诱导表达。
2)由于PfTrx-PDGF16(72-87)重组蛋白继承了PfTrx的高耐热性,故将表达产物经70℃或更高的温度加热,通过变性沉淀杂质蛋白来初步纯化后,再行Ni-NTA纯化,PBS透析。
(6)分析原核表达及纯化产物
细菌裂解上清及Ni-NTA纯化洗脱产物经12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色分析,结果参见图1,从图中可见pET28-PDGF16(72-87)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约16kDa的重组蛋白PfTrx-PDGF16(72-87)条带,而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带;经Ni-NTA系统非变性条件下纯化后可见约16kDa的重组蛋白PfTrx-PDGF16(72-87)纯化条带。
2、PfTrx-PDGF16(72-87)重组疫苗的免疫原性验证
(1)免疫
1)选择6周龄的ICR雄性小鼠;2)动物分组(10只/组)
正常组:注射PBS溶液0.1mL;
PfTrx组:注射重组蛋白PfTrx0.1mL(含50μg重组蛋白);PfTrx-PDGF16(72-87)组:注射重组蛋白PfTrx-PDGF16(72-87)0.1mL(含50μg重组蛋白)。
2)免疫方法:小鼠腹壁消毒,每只小鼠按上述方法腹腔注射重组蛋白或PBS溶液。由于小鼠腹壁薄,需要“Z”字形进针,以免注射的液体从注射部位漏出。
3)每2周免疫一次,共免疫5次。
(2)制备用于抗体滴度检测的ELISA板
1)包被:用50mM碳酸盐缓冲液将实验室原核表达纯化的PDGF-B稀释,并按照100ng/孔包被96孔酶标板。包被后保鲜膜封好,4℃过夜;
2)封闭:向包被后的酶标板微孔中,按照200μL/孔加入封闭液(10%牛血清),4℃孵育过夜,吸出封闭液,风干后-20℃保存,备用;
(3)间接ELISA法检测免疫小鼠抗体滴度
结果显示:PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后取小鼠尾血清,用PDGF-B包被的酶标板行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗PDGF抗体(表1)。PfTrx免疫用PfTrx包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗PfTrx抗体(表2)。
表1抗PDGF16(72-87)多克隆抗体滴度测定结果
表2抗PfTrx多克隆抗体滴度测定结果
此外,抗体滴度以log值对比分析参见图2,图2(a)结果显示,PBS及PfTrx免疫后无抗PDGF-B抗体产生,PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后抗PDGF-B抗体滴度随免疫次数的增多而增高,最高可达1:51200;(b)为PfTrx包板检测免疫后抗PfTrx抗体滴度结果,PBS组无抗PfTrx的抗体产生,而PfTrx及PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后抗PfTrx抗体滴度均随免疫次数的增多而增高。
(4)验证血清中抗体的特异性
Western blot法验证PfTrx-PDGF16(72-87)免疫后的小鼠血清中是否含有能特异性识别重组PDGF-B(Cynomolgus PDGFB/PDGF-BB Protein,rPDGF-B,北京义翘神州生物有限公司)的抗PDGF抗体。
参见图3,结果显示,以rPDGF-B为抗原,一抗为PBS注射后小鼠的血清(1:500),未见rPDGF-B蛋白条带;一抗为PfTrx多抗血清(1:500),未见rPDGF-B蛋白条带;一抗为PfTrx-PDGF16(72-87)多抗血清(1:500),可见rPDGF-B蛋白条带。因此,PfTrx-PDGF16(72-87)多抗血清中含有抗PDGF抗体,并且可以特异性的结合rPDGF-B,可用于下游实验。
(5)观察免疫对小鼠各脏器的影响
首次免疫后10周,处死小鼠,取心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器置于4%多聚甲醛中固定24小时。石蜡包埋后切片,苏木紫&伊红(HE)染色,显微镜下进行组织学观察。结果显示PfTrx-PDGF16(72-87)免疫对小鼠心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器无明显影响。
3、Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体与rPDGFA,B,C,D的亲和性验证
1)PDGFA(Mouse PDGFA Protein,北京义翘神州生物有限公司),PDGFB(MousePDGF-B/PDGF-2Protein,北京义翘神州生物有限公司),PDGFC(Human PDGF-CCBiologically Active Protein,Novusbio),PDGFD(Recombinant mouse PDGF-D,RDsystem)分别包被于96孔酶标板,20ng/孔,4℃过夜,次日10%牛血清4℃孵育过夜后,吸出封闭液,风干后-20℃保存,备用;
2)用10%牛血清将anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体倍比稀释,1:400开始,分别加入PDGFA,B,C,D包被的微孔中,37℃孵育1小时,PBST洗涤后,山羊抗小鼠二抗稀释后加入上述微孔,37℃再孵育1小时,PBST洗涤后,加入底物液及终止液后,酶标比色计测定OD值。
结果参见表3:
表3抗PfTrx多克隆抗体与PDGFA,B,C,D亲和性
从表3可以看出,anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体可以与PDGFA,B,C,D发生交叉反应,亲和力相比抗体与PDGF-C最高,PDGF-A与PDGF-D次之,PDGF-B最低。
4、Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体对PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D的中和活性验证
(1)取对数生长期的小鼠NIH3T3细胞,0.5%胰酶消化后用DMEM完全培养基调整细胞悬液的浓度;
(2)以每孔1000个细胞/孔接种于96孔板,置于37℃、含5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养;
(3)细胞的分组方法:
PBS对照组:不加处理;
rPDGF-A组:培养基中加rPDGF-A至终浓度25ng/ml;
rPDGF-A+正常抗体组:rPDGF-A 25ng/ml+未免疫小鼠IgG。
rPDGF-A+Anti-PfTrx组:rPDGF-A25ng/ml+Anti-PfTrx免疫组小鼠IgG。
rPDGF-A+Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)组:rPDGF-A25ng/ml+Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)小鼠IgG。
培养72h后,CCK-8法计数细胞,绘制随抗体浓度的增加对rPDGF-A抑制作用的直方图。
同法做Anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体对PDGF-B(5ng/ml)的中和活性。
rPDGF-C(50ng/ml)及rPDGF-D(80ng/ml)做法同上。
结果参见图4,rPDGF-A,rPDGF-B,rPDGF-C,rPDGF-D均可以促进NIH3T3细胞增殖,加入不同浓度纯化的anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体后,其抑制PDGFs的作用随抗体浓度的增加而增强,证实纯化的anti-PfTrx-PDGF16(72-87)抗体有中和rPDGF-A,rPDGF-B,rPDGF-C,rPDGF-D促进NIH3T3细胞增殖的作用。
5、PfTrx-PDGF16(72-87)重组疫苗抑制小鼠肺纤维化
(1)免疫小鼠及免疫方法同第三节所述;
动物分组:正常组、BLM组、PfTrx/BLM组、PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组。
(2)检测抗体滴度
首次免疫后,第4周开始,以间接ELISA法检测PfTrx组抗PfTrx的抗体滴度;PfTrx-PDGF16(72-87)组检测抗PDGF16(72-87)抗体滴度。此后每2周检测一次,直至首次免疫后第8周。
PfTrx-PDGF16(72-87)免疫4次后取小鼠尾血清,用PDGF-B包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗PDGF抗体(表4)。PfTrx免疫4次后取小鼠尾血清,用PfTrx包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗PfTrx抗体(表5)。
表4抗PDGF多克隆抗体滴度测定结果
表5 PfTrx多克隆抗体滴度测定结果
(3)BLM制备小鼠肺纤维化模型
免疫5次后开始制备肺纤维化模型。制备方法为:
1)使用生理盐水将浓度为10mg/mL的博莱霉素(bleomycin,BLM)溶液稀释到2.5mg/mL。
2)除外正常组外,其余每只小鼠麻醉后气管内滴注BLM溶液,剂量2.5mg/kg。正常组小鼠给予生理盐水气管滴注。密切观察小鼠一般状态及体重变化,记录小鼠存活情况,于气管内滴注BLM后3d、28d处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液、血清及肺组织标本。具体免疫及造模时间见图5。
(4)BLM肺损伤动态观察
1)密切观察小鼠毛色、饮食及行为状态等一般状况,每日记录体重,将各时间点体重与初始体重比较,计算并观察小鼠体重变化。
2)标本采集
于气管内滴注BLM后3d、28d处死小鼠。仔细分离出气管、肺脏及心脏,称重记录后,气管插管,PBS灌洗肺泡,收集支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF),回收率约85%,4℃保存,剪取左下肺组织块固定,其余肺组织保存于-80℃冰箱备用。
(5)气管内滴注BLM后3d处死小鼠,观察急性期肺部炎症指标
1)HE染色评估肺组织病理形态变化
如图6,给予BLM气管内滴注后3天,BLM组和PfTrx/BLM组小鼠肺组织出现间质水肿,炎细胞浸润,肺泡腔内有液体渗出等急性炎症表现,而PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组小鼠肺组织仅有少量细胞浸润,肺泡腔渗出少。
2)BALF分析
①分离灌洗液上清及细胞
a)1000rpm离心BALF 10min后收集上清,用于蛋白含量测定;
b)红细胞裂解液重悬细胞,轻柔吹打数次,1000rpm离心10min弃上清;
c)重复步骤b)一次;
d)500ulPBS重悬细胞。
②使用细胞计数板计数灌洗液中的细胞总数。
③BCA法测定灌洗液上清的蛋白浓度。
结果参见图7-1、图7-2、图8-1和图8-2,从图中看可以看出,BLM经气管滴注后3天,小鼠肺组织总重、肺系数(肺重mg/体重g)、BALF蛋白浓度、BALF细胞总数较正常组明显增加,PfTrx-PDGF16(72-87)免疫组小鼠肺脏的BALF蛋白浓度、BALF细胞总数明显低于PfTrx免疫组与模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
3)Real-time PCR法检测小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6炎症指标情况。
①Trizol法提取组织总RNA;定量;-70℃保存;
②逆转录PCR法将肺组织总RNA逆转录为cDNA;③以cDNA为模板,进行Real-timePCR。
a).所用Real-time PCR引物序列如表6:
表6 Real-time PCR引物
b).Real-time PCR反应体系:
SYBR Premix EX TaqII(2×)10μL;primer F(10μM)0.4μL;
primer R(10μM)0.4μL;cDNA模板0.5μL;dH2O加至20μL;
c).Real-time PCR反应条件:
stage 1:预变性,95℃30s 20℃/s 1个循环;
stage 2:PCR反应,95℃5s 20℃/s 40个循环,60℃30s 20℃/s;
stage 3:融解曲线分析,65℃5s 20℃/s,95℃10s 0.1℃/s。
d).软件分析数据:
β-actin为内参基因,其余基因为待测基因;实验每个样本设3个复孔,实验重复3次。取得同一实验组Ct值的平均值。将对照组目的基因的Ct平均值减去该样本内参β-actin的Ct平均值,其差值为ΔCt值;在所有实验组中设定对照组为实验参照样本,其他的实验组与对照组进行比较,其差值为ΔΔCt值,计算2-ΔΔCt值,通过比对这一数值来检测不同样本中目的基因的丰度。
参见图9、图10和图11,结果显示,PfTrx-PDGF16(72-87)免疫组小鼠肺脏的IL-1β、IF-6、TNF-α的mRNA水平明显低于PfTrx免疫组与模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
(6)气管内滴注BLM后28d处死小鼠,观察肺纤维化情况
1)肺组织中羟脯氨酸含量测定
参见图12,结果显示PfTrx-PDGF16(72-87)免疫组小鼠肺脏的羟脯氨酸总量明显低于PfTrx免疫组与模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
2)肺组织病理学观察
①HE染色评估肺组织病理形态变化
参见图13,HE染色结果显示,正常组肺组织结构完整,肺泡完整,间隔均匀一致;BLM组肺组织结构破坏,大量间质细胞及细胞外基质存在于肺组织中,梭形纤维细胞聚集成团;PfTrx/BLM组肺组织病理表现与模型组类似;PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组肺组织损伤程度明显减轻,肺组织内纤维组织增生程度显著低于PfTrx/BLM组和BLM组。
②天狼猩红染色评估肺组织内胶原沉积情况
a).按Achroft纤维化评分标准对肺脏纤维化程度进行评价(表7)。
表7肺纤维化评分标准[166]
b).天狼星红染色(参见图14,其中,(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组,按Achroft纤维化评分标准结果显示,正常组小鼠无肝纤维化,记为0分;PfTrx-PDGF16(72-87)/BLM组免疫组小鼠肝纤维化评分多为3-4分;而PfTrx/BLM免疫组与模型组的小鼠肺纤维化评分为5-7分(表8)。
表8按修订版Achroft纤维化评分标准
3)PfTrx-PDGF16(72-87)疫苗抑制肺组织纤维化相关因子表达以肺组织cDNA为模板行Real-time PCR,软件分析数据,分析方法同上;所用Real-time PCR引物序列如表9:
表9 Real-time PCR引物
参见图15、图16、图17、图18-1和18-2,结果显示,PfTrx-PDGF16(72-87)疫苗免疫组小鼠肺组织中TGF-β1、CTGF、α-SMA、Col1a2、Col3a1的mRNA表达水平明显低于BLM造模组及PfTrx对照。
4)Western blot法检测α-SMA表达情况
参见图19-1和图19-2,结果显示,PfTrx-PDGF16(72-87)免疫组肺脏的α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx免疫组与模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
6、统计学分析
实验结果以均数±标准误(mean±SEM)表示,用SPSS 19.0软件进行统计学分析,多组间均数比较采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)和图基事后检验(Tukey'spost hoc test),双侧P<0.05为显著性检验标准。
综上所述,本发明将PDGF的抗原表位(aa72-87,QVRKIEIVRKKPIFKK)插入激烈火球菌硫氧还原蛋白(PfTrx)的原核质粒pET28-PfTrx中,表达纯化重组疫苗PfTrx-PDGF16(72-87),该重组疫苗可以成功刺激机体产生高效价的抗PDGF抗体,并且可以与PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D发生交叉反应,明显减轻经博莱霉素(BLM)诱导后产生的小鼠肺纤维化。PfTrx-PDGF16(72-87)重组疫苗免疫可以明显减轻博莱霉素气管灌注后急性期肺组织的炎症反应,抑制小鼠肺脏胶原生成以及细胞基质的增多、沉积;同时还可以降低小鼠肺组织的TGF-β1、CTGF、α-SMA、Col1a2、Col3a1的表达水平,这些特点都极有利于减缓肺纤维化的进程。因此,PfTrx-PDGF16(72-87)重组疫苗有望被开发成为治疗肺纤维化的有效手段。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 西安交通大学医学院第一附属医院
<120> 一种用于治疗肺纤维化的血小板源性生长因子重组疫苗及其应用
<141> 2020-02-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ile Ile Gly Thr Ala Gly Gly Ile Ala Pro Thr Leu Gly Ala Val
1 5 10 15
Val Leu Thr Pro Ser Ile Pro Gly Cys Gly Pro Ser Ala Gly Gly Pro
20 25 30
Ala Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Leu Pro Ile Pro Leu Leu Gly Ser
35 40 45
Gly Pro Cys Ala Leu Val Gly Ala Pro Met Thr Gly Leu Ser Gly Thr
50 55 60
Pro Gly Ala Ile Gly Ile Val His Ile Ala Ala Gly Leu Thr Leu Ala
65 70 75 80
Ile Val Ala Leu Pro Ala Ile Leu Ala Val Pro Thr Leu Val Thr Leu
85 90 95
Leu Ala Gly Ala Gly Val Gly Ala Gly Ala Leu Ile Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Gly
115 120
Claims (6)
1.一种用于治疗肺纤维化的短肽在制备抗肺纤维化疫苗中的应用,其特征在于,该短肽为血小板源性生长因子PDGF-B的抗原表位,位于aa72-87位,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.一种重组疫苗,其特征在于,由一种用于治疗肺纤维化的短肽插入激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体中装配而成,所述用于治疗肺纤维化的短肽氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示,所述激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.权利要求2所述的重组疫苗在制备抗肺纤维化药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的药物为降低肺组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平的药物。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的药物为降低肺泡灌洗液中白细胞数量及渗出的药物。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的药物为降低肺组织中Ⅰ型胶原Col1a2、Ⅲ型胶原Col3a1、α-SMA、TGF-β1及CTGF含量的药物。
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