KR101894097B1

KR101894097B1 - 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR101894097B1
Application number: KR1020160151226A
Authority: KR
Inventors: 이지희
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2018-09-03
Also published as: KR20170057842A

Abstract

본 발명은 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법은 다수의 치료 후보 물질 중 폐 염증 및 폐 섬유증 치료에 효과적인 물질을 손쉽게 확인하고 이를 획득할 수 있게 함으로써 신규의 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 약물 개발 및 확인에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법{A method for screening material for treating lung inflammation and fibrosis}

본 발명은 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

염증성 폐질환이란 폐렴(대엽성 폐렴, 소엽성 폐렴, 급성 괴사성 폐렴, 급성 간질성 폐렴), 만성 폐쇄성 폐질환, 폐농양 및 폐결핵 등과 같은 폐와 관련되어 염증반응으로 야기되는 질환을 의미한다.

폐렴(pneumonia)이란 폐포 내 또는 간질 내의 염증을 말하나, 일반적으로 폐렴이라고 할 경우는 폐포 내에 염증성 삼출액이 출연하는 경우로 염증 범위에 따라 대엽성과 기관지성 폐렴(소엽성 폐렴)으로 분류한다.

만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)이란 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환이며, 폐기종, 만성 기관지염 등이 이에 속한다.

또한, 폐 섬유증은 폐 염증에서 발생하는 질병으로, 아직 그 원인이 알려지지 않았다. 병원균 또는 화학물질들이 폐로 들어가면, 폐의 상피세포들 및 폐포의 대식세포들이 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 여러 면역세포들을 손상 부위로 불러 모아 인터류킨 및 케모카인들을 방출하여 몸에서 병원균 및 화학물질을 제거하고자 한다. 폐 섬유증은 이러한 폐 염증이 치유되지 않고 계속적으로 재발하여 발생하는 병으로, 폐 실질세포가 점차 수축되고 딱딱하게 굳어져 폐 기능을 잃게 되어 호흡 부전으로 사망에 이르는 병이다. 폐 섬유증 환자의 평균 생존기간은 진단 후 4년에서 6년 정도로 알려져 있으며, 폐 섬유증 치료제 개발이 절실히 요구되고 있으나, 현재 효과 있는 치료제는 없는 실정이다. 미 식품의약국(FDA)으로부터 폐 섬유증 치료제로 승인을 받은 약물이 전무한 상태이며, 현재는 단지 상태를 호전시키거나 생활의 질을 향상시키기 위한 대증적 치료 방법만이 사용되고 있다.

즉, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증과 같은 질환에 있어서, 항염증제를 비롯한 일반적 약물 이외에는 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 특이적으로 질환을 본질적으로 치료할 수 있는 치료 약물이 개발되지 않은 실정이다.

그런데, 이러한 치료 약물을 개발하기 위해서는 각고의 노력이 필요로 된다. 예컨대, 신약 개발은 통상적으로 5000~2만개의 신약 후보물질을 탐색한 후 그 중 250~10개의 물질을 선발하여 비임상 시험을 거치고, 거기서 다시 10개 미만의 물질을 선발하여 1상, 2상, 3상 임상 시험을 거쳐 최종적으로 1개의 물질을 신약으로 개발하여 신약판매허가를 받고 시판하는 과정으로 이루어진다. 이 과정에서 10년 내지 15년의 시간이 소요되고 많은 인력과 비용이 투입된다.

이에 따라, 신약 후보물질 선정단계에서 약물 활성이 명백하게 확인되어, 상기 신약 개발의 단계를 단축시킬 필요가 있다. 일반적으로 신약 후보물질은 컴퓨터상에서 후보물질의 구조를 확인하여 탐색하기도 하고(in-silico), 세포에 후보물질을 처리하여 효과를 확인하여 탐색하는 방법(in-vitro)이 사용된다. 그러나 폐 염증 내지 폐 섬유증과 관련한 약물 스크리닝 방법에 관하여 상기와 같은 방법들이 개발된 바가 매우 적다.

이에 따라, 새로운 신약 개발에 있어서는 신약 개발 초창기 단계부터 폐 염증 내지 폐 섬유증 치료 약물의 효능에 대하여 예측할 수 있는 우수한 스크리닝 방법에 관하여 개발될 필요성이 있으며, 이러한 후보물질의 스크리닝을 효과적으로 수행한다면, 막대한 비용과 긴 시간이 소요되는 신약 개발 과정이 보다 수월하게 이루어질 수 있을 것이다.

본 발명은 (a) 폐 섬유증 또는 폐 염증 유발 물질을 실험동물에게 투여하는 단계;

(b) 시험 물질을 상기 실험동물에게 투여하는 단계; 및

(c) 상기 실험동물의 세포에서 STAT6의 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 시험물질을 접촉한 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에서 STAT6 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계; 및

(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 STAT6의 인산화 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 치료 효과를 갖는 물질을 보다 효과적으로 스크리닝하여 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 치료제 신약으로 개발할 물질을 발굴하기 위한 것이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 치료제로 이용 가능한 사멸 세포 처리에 따른 치료 메커니즘에 대해 연구 개발한 결과, STAT6 및 관련 유전자의 발현 변화 확인을 통해 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 관한 치료 물질의 스크리닝이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(b) 시험 물질을 상기 실험동물에게 투여하는 단계; 및

본 발명은 (a) 폐 섬유증 또는 폐 염증 유발 물질을 실험동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 유발 물질로 알려진 어떠한 물질이라도 사용하여 상기 질환을 유발한 동물 모델을 제조할 수 있다. 바람직하게는 블레오마이신 처리에 의해 유도된 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 실험동물일 수 있다. 예컨대, 블레오마이신을 실험동물로 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떤 실험동물에 처리하고, 이로 인해 질환이 유도된 동물 모델 그 자체 또는 이로부터 분리된 세포를 사용할 수 있다. 본 실험 동물모델은 예를 들어 마우스, 햄스터, 랫트, 페렛, 기니피그, 토끼, 개, 영장류, 돼지 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다. 본 실험동물은 인간을 제외할 수 있다.

상기 분리된 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포는 조직, 세포분쇄액, BAL fluid 등의 다양한 시료의 형태로써 이용될 수 있으며, 폐포 대식세포, 폐포 세포 등의 모든 종류의 폐 세포를 포함한다.

상기 (a)단계에서 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 유발 물질은 특성에 맞는 경로로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 인두 흡입을 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 생체 내에서 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 반응이 유발되지 않은 상태와 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 반응이 유발된 상태에서 발현 또는 활성화되는 물질들은 서로 다르다. 따라서 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 예방 및 치료용 후보 물질을 스크리닝하기 위해서는 일단 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 질환을 유발할 필요가 있다.

본 발명에 따른 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제 스크리닝 방법은 (b) 시험 물질을 상기 실험동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서 ‘시험 물질’이란 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이러한 시험물질의 투여는 경구 및 비경구 투여를 포함하여, 통상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 예컨대, 경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

시험 물질의 투여량은 약물의 종류 및 약물 효능에 따라 당업자의 통상의 지식에 따라 적절한 수준의 투여량으로 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법은 (c) 상기 실험동물의 세포에서 STAT6의 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함한다.

상기 인산화 정도의 측정은 인산화 STAT6의 생성 정도를 측정하거나, STAT6의 발현 감소를 측정하거나, 인산화 STAT6와 STAT6의 발현 비율을 측정하는 등의 시험 물질 처리 후 STAT6의 변화를 확인함으로써 확인될 수 있다. 시험 물질 처리에 따라 인산화가 음성 대조군과 대비하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 100%, 2배, 3배 또는 그 이상 증가하게 되면, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다. 또한, 양성 대조군과 동등 수준의 인산화 정도를 나타내면 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다. 본 발명에 있어서, 대조군 시료는 정상 대조군, 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제에 대해 알려진 치료물질 대조군을 포함하여 시험물질 처리에 따라 STAT6의 인산화 정도를 비교 판단 할 수 있는 모든 시료 그룹을 의미한다.

상기 STAT6의 인산화 정도는 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, (c) 단계에서 STAT6 인산화 정도는 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 확인할 수 있다. STAT6의 인산화 진행은 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 질환이 유발된 실험동물에서 STAT6 인산화 변화를 단시간 내에 확인할 수 있다. 시험 물질 처리에 따라 인산화가 증가하게 되면, 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다.

예컨대, 음성 대조군과 대비하여 인산화가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 100%, 2배, 3배 또는 그 이상 증가하게 되면, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다. 또한, 양성 대조군과 대비하여 동등 수준의 효과를 나타내는 약물이라면 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 STAT6의 인산화 정도에 추가로 PPARγ의 발현 및 활동도 정도를 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. PPARγ의 발현 정도는 앞서와 마찬가지로 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. PPARγ의 활동도는 예컨대 ELISA 기법을 기본으로 하는 TransAM 키트(제조품명: TransAM PPARγ 키트)로 측정 가능하다. 시험 물질 처리에 따라 PPARγ의 발현 및 활동도가 증가하는 경우 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다.

또한, PPARγ 표적 유전자로 예컨대, CD36, MMR(macrophage mannose receptor), Arg1(arginase 1) 등에 대한 측정 및 이의 발현 정도를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. CD36, MMR, Arg1 등은 PPARγ의 신호 경로에 관여하는 물질에 해당하며, CD36, MMR, Arg1 등이 시험 물질 처리에 따라 그 발현이 증가하게 되면 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다.

또한, 실험동물에서 폐 섬유화 증가의 지표가 되는 하이드록시피롤린(Hydroxyproline)의 발현 유도 변화를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 시험 약물 처리에 따라 하이드록시피롤린의 발현이 감소되는 경우 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다.

또한, 실험동물에서 하기 ⅰ 내지 ⅳ로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성들 중 1 이상을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.

ⅰ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 호중구 수의 감소,

ⅱ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 총 단백질 양의 감소,

ⅲ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 전염증성 사이토카인 발현 감소,

ⅳ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 항염증성 사이토카인 발현 증가.

여기서 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이란 염증반응 시 발현, 분비되어 염증반응이 일어나는 것을 촉진하는 사이토카인을 의미하며, TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α), IL-1β(Interleukin-1β), MIP-2(macrophage inflammatory protein 2) 등이 있다. 항염증성 사이토카인은 염증반응 유발 직후에 급증하는 경향이 있다. 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)이란 염증반응이 일어나면 서서히 발현, 분비되어 염증반응을 억제하는 작용을 하는 사이토카인을 의미하며, TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 등이 있다.

본 발명은 (a) 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;

본 발명의 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제 스크리닝 방법은 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포는 폐 염증 및/또는 폐 섬유증을 가진 환자의 세포, 동물 세포, 이들의 조직을 모두 포함하는 것이다. 또한, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 유발 물질을 통해 질환이 유도된 세포도 이용 가능하며, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 유발 물질로 알려진 어떠한 물질도 사용가능하다. 바람직하게는 블레오마이신 처리에 의해 유도된 폐 염증 및/또는 폐 섬유증 세포일 수 있다. 예컨대, 블레오마이신을 실험동물로 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떤 실험동물에 처리하고, 이로 인해 질환이 유도된 동물 모델 그 자체 또는 이로부터 분리된 세포를 사용할 수 있다. 본 실험 동물모델은 예를 들어 마우스, 햄스터, 랫트, 페렛, 기니피그, 토끼, 개, 영장류, 돼지 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 마우스일 수 있다. 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포는 조직, 세포분쇄액, BAL fluid 등의 다양한 시료의 형태로써 이용될 수 있으며, 폐포 대식 세포 등의 모든 종류의 폐 세포를 포함한다.

상기 시험 물질의 접촉은 In vitro 및 In vivo 상의 모든 접촉을 의미하며, 시험물질이 In vitro 상에서 세포에 처리되거나 In vivo 상에서 동물 등에 투여되는 것을 모두 포함한다.

본 발명의 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제 스크리닝 방법은 상기 시험물질을 접촉한 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에서 STAT6 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계; 및 대조군 시료와 비교하여 상기 STAT6의 인산화 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 STAT6 단백질의 인산화 정도는 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 STAT6은 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 STAT6을 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 대조군 시료는 정상 대조군, 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제에 대해 알려진 치료물질 대조군을 포함하여 시험물질 처리에 따라 STAT6의 인산화 정도를 비교 판단 할 수 있는 모든 시료 그룹을 의미한다. 음성 대조군과 대비하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 100%, 2배, 3배 또는 그 이상 증가하게 되면, 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다. 또한, 양성 대조군과 대비하여 동등 수준의 효과를 나타내는 약물이라면 폐 염증 및/또는 폐 섬유증에 대한 치료 효능을 가지는 약물로 판단될 수 있다. 즉, STAT6의 인산화를 증진시키는 시험물질은 치료 약물로써 선별될 수 있다.

본 발명의 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 물질을 스크리닝하는 방법은 다수의 치료 후보 물질 중 폐 염증 및 폐 섬유증 치료에 효과적인 물질을 손쉽게 확인하고 이를 획득할 수 있게 함으로써 신규의 폐 염증 및 폐 섬유증 치료용 약물 개발 및 확인에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 폐 염증 및 폐 섬유증 치료 물질로 사멸 세포 주입 및 STAT6 활성화 억제에 따른 STAT6 및 JAK3의 활성 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 사멸 세포 주입 및 STAT6 활성화 억제에 따른 PPARγ 발현 및 활동도 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 STAT6의 억제에 따른 PPARγ 표적 유전자의 발현 억제를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 STAT6의 억제에 따른 사멸 세포 주입의 항-염증 효과 감소를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 STAT6의 억제에 따른 사멸 세포 주입의 항-섬유화 효과 감소를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 STAT6의 억제 시 사멸 세포 주입에 따른 마우스의 생존률 증가효과의 감소를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 사멸 세포 주입 및 STAT6 억제에 따른 STAT6 활성 변화 확인

20 내지 25 g의 SPF 수컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio, Sungnam, Korea)가 이화여자대학교 의학 연구소의 동물 관리위원회 승인된 실험 프로토콜 하에 사용되었다. Bleomycin (30 μl로 5 U/kg 체중)을 포함하는 용액 투여를 위해 마우스 인두 흡입이 사용되었다. Bleomycin 처리 이틀 후, 식염수, 50 μl 식염수 내 10 × 10⁶개의 apoptotic Jurkat 세포(ApoJ) 또는 50 μl 식염수 내 10 × 10⁶개의 Viable Jurkat 세포가 인두 흡입을 통해 기도 내로 투여되었다. 마우스는 세포 주입 2시간 후 및, Bleomycin 처리 7일 및 14일에 각각 10마리씩 희생되었다. 즉시 억제 실험 (immediate inhibition experiments)을 위하여, 선택적 STAT6 억제제 AS1517499 (AS, 10 mg/kg 복강 투여)는 Bleomycin 처리 이틀 후 10 × 10⁶개의 apoptotic 세포와 동시에 투여되었다. 마우스는 apoptotic 세포 투여 후 2시간째에 희생되었다. 장기 억제 실험 (long-term inhibition experiments)을 위해, AS1517499의 1차 투여 후, 억제제는 하루 1회 투여되었고, 마우스는 Bleomycin 투여 7일째 및 14일째 희생되었다.

희생된 마우스를 이용하여, 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage, BAL)이 수행되고, 세포 카운팅은 electronic Coulter Counter fitted with a cell sizing analyzer (Coulter Model ZBI with a channelizer 256; Coulter Electronics, Bedfordshire, UK)로 수행되었다. BAL 후, 폐는 적출되고, 즉시 액체 질소에서 얼려졌고 -70 ℃에 저장되었다.

한편, 기관지폐포세척액에서 현탁된 폐포 대식세포는 트립판 블루 검정에 의해 95 % 이상 생존률이 결정되었다. 폐포 대식세포는 접착 (60분)에 의해 분리되었다.

폐 염증 및 폐 섬유증 치료 물질로 알려진 사멸 세포 처리에 따른 STAT6의 활성 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏을 위하여, 폐 조직 호모제네이트 시료는 10 % SDS 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리되었다. 분리된 단백질은 전기영동을 통해 니트로셀룰로오스 페이퍼에 옮겨졌다. 멤브레인은 phosho-STAT6/STAT6에 대한 항체로 처리되고, 화학 발광을 통해 확인되었다.

그 결과를 도 1의 A에 나타내었다.

도 1의 A에서 확인되는 바와 같이, 블레오마이신에 의해 유도된 폐 염증 및 폐 섬유증 질환 모델에서 치료물질인 사멸 세포의 투여는 STAT6의 인산화를 증가시킴이 확인되었다. 그러나, 이러한 STAT6의 인산화는 STAT6 억제제인 AS1517499 투여에 따라 감소되는 것이 확인되었다.

또한, 폐포대식세포에서의 STAT6의 활성 변화를 면역형광법을 이용하여 추가적으로 확인하였다. 4% 파라포름알데히드로 폐포 대식세포를 고정하고, Triton X-100로 투과처리(permeabilized) 후, 마우스 단클론 항-인산화 STAT6 항체(Santa Cruz)로 4 ℃에서 밤새 염색하였다. 그 다음, 세포를 인산완충액으로 3회 세척하고, 형광 이소티오시아네이트(isothiocyanate)-결합 donkey anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoReseach,West Grove, PA)와 함께 배양하였다. 슬라이드를 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)를 함유한 배지가 장착된 Vectashield(Vector Laboratories, Youngstown, OH)에 장착하였다. 모든 슬라이드를 488 / 543 nm 여기(excitation)로 설정된 필터가 장착된 공초점 현미경(LSM5 PASCAL; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화하였다.

그 결과를 도 1의 B에 나타내었다.

도 1의 B에서 확인되는 바와 같이, 블레오마이신 처리 2일 및 7일 후 BLM(Bleomycin)+ApoJ(apoptotic Jurkat) 처리 군에서의 STAT6의 인산화는 BLM+Sal(식염수) 처리군에 비해 증가되었다. 하지만 STAT6의 억제제를 공동투여한 군(BLM+ApoJ+AS)은 사멸세포 처리에 따른 STAT6의 인산화 증가효과가 감소됨을 확인하였다.

즉, 폐 조직에서 치료 물질의 처리는 STAT6의 인산화를 증가시키는 것이 확인되었다.

STAT6의 상류(upstream) 키나아제인 JAK3(Janus kinases 3)의 활성 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 폐 조직 호모제네이트 시료 및 총 세포 용해물(50 mg protein/lane)을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리시켰다. 분리된 단백질을 전기영동을 통해 니트로셀룰로오스 페이퍼에 옮겼다. 멤브레인을 phosho-JAK3/JAK3에 대한 항체로 처리하고, 화학 발광을 통해 확인하였다.

그 결과를 도 1의 C에 나타내었다.

도 1C에서 확인되는 바와 같이, 블레오마이신 처리 후 사멸 세포의 투여는 폐 조직에서 JAK3의 인산화를 증가시키며, AS1517499를 함께 투여한 경우 STAT6와는 달리 JAK3의 인산화 증가에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 즉, 사멸 세포의 투여는 JAK3의 신호전달 후 STAT6를 활성화시킴을 확인하였다.

< 실시예 2> STAT6 억제에 따른 PPARγ 및 표적 유전자의 발현 억제 확인

실시예 1과 동일한 실험 모델을 기초로 하여, 사멸세포 투여 및 STAT6 억제제 처리에 따른 PPARγ 및 표적유전자의 활성을 확인하였다.

PPARγ의 발현 변화는 q-PCR을 이용하여 확인하였다. 유전자 발현을 StepOnePlus system (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)의 real-time qPCR을 사용하여 분석하였으며, qPCR 검정을 위해 50 ng의 cDNA가 사용되었다. PCR 증폭을 위해 표 1의 프라이머 세트가 Primer Express software를 사용하여 디자인되었다. 모든 데이터는 GAPDH로 노말라이즈되었고, 대조군에 대한 Fold change 및 α-튜블린에 대한 상대밀도로 기재하였다.

[표 1] 프라이머 서열

그 결과를 도 2의 A 내지 C에 나타내었다. 도 2의 A 및 B 각각은 폐포 대식세포(AM) 및 폐 조직에서의 Fold change 결과를 나타낸 것이며, 도 2의 C는 폐 조직에서의 상대밀도 결과를 나타낸다.

도 2의 A 내지 C에서 확인되는 바와 같이, 폐포 대식세포(AM) 및 폐 조직(Lung tissue)에서 사멸 세포 처리에 따라 PPARγ의 발현이 크게 증가하는 것이 확인되었다. 이러한 PPARγ의 발현 증가는 STAT6 억제제 처리에 따라 감소되어, PPARγ의 발현 증가와 기능적 활성이 STAT6의 신호 경로에 의존하는 것임이 확인되었다.

PPARγ 활동도는 폐조직의 핵 추출물에서 제조사(Activ Motif, Carlsbad, CA)의 지시에 따라 ELISA 기법을 기본으로 하는 TransAM 키트를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2의 D에 나타내었다.

도 2의 D에서 확인되는 바와 같이, PPARγ 활동도는 사멸세포 투여에 따라 증가되었고, AS1517499 투여에 따라 PPARγ 활동도가 감소되는 것이 확인되었다.

또한, 추가적으로 PPARγ의 변화를 면역형광법을 이용하여 확인하였다. 4% 파라포름알데히드로 폐포 대식세포를 고정하고, 마우스 단클론 항-PPARγ 항체(Santa Cruz)로 4 ℃에서 밤새 염색하였다. 그 다음 세포를 인산완충액으로 3회 세척하고, 형광 이소티오시아네이트(isothiocyanate)-결합 donkey anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoReseach,West Grove, PA)와 함께 배양하였다. 슬라이드를 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)를 함유한 배지가 장착된 Vectashield(Vector Laboratories, Youngstown, OH)에 장착하였다. 모든 슬라이드를 488 / 543 nm 여기(excitation)로 설정된 필터가 장착된 공초점 현미경(LSM5 PASCAL; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화하였다.

그 결과를 도2의 E에 나타내었다.

도 2의 E에서 확인되는 바와 같이, 블레오마이신 처리 후 사멸 세포 투여에 의해 PPARγ의 발현이 크게 증가하였으나(BLM+ApoJ), STAT6 억제제 처리에 따라 PPARγ의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(BLM+ApoJ+AS).

PPARγ 표적 유전자들의 발현 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 실험 모델을 기초로 폐포 대식세포 및 폐조직에서 CD36, MMR 및 Arg1의 발현 변화를 q-PCR을 통해 확인하였다. qPCR을 위한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2] 프라이머 서열

그 결과를 도 3의 A 및 B에 나타내었다. 도 3의 A는 폐포 대식세포(AM)에서의 결과를 나타내며, 도 3의 B는 폐 조직(Lung tissue)에서의 결과를 나타낸다.

도 3의 A 및 B에서 확인되는 바와 같이, PPARγ와 관련성이 높은 표적유전자로 CD36, MMR 및 Arg1는 사멸 세포 처리에 따라 그 발현 수준이 크게 증가하였다.

그러나, STAT6 억제제인 AS1517499 투여에 따라 이들의 발현 수준이 크게 감소하는 것이 확인되었다. 즉, STAT6의 인산화는 PPARγ의 발현 증가에 영향을 미칠 뿐만 아니라 PPARγ의 표적 유전자들의 발현 증가에도 영향을 미치는 것이 확인되어, STAT6의 인산화 확인을 통해 치료 물질로의 스크리닝이 가능함이 확인되었다.

< 실시예 3> STAT -6의 억제에 따른 사멸 세포 주입의 항-염증 효과 감소 확인

STAT-6 신호가 억제되는 경우에 항염증 효과가 감소함을 확인함으로써, STAT6 신호를 억제하는 약물을 피해야 함을 확인하였다.

실시예 1과 동일한 실험 모델을 기초로 하여, 제조된 BAL fluid에서의 TNF-α 및 MIP-2 단백질 수준, 호중구 수 및 총 단백질 수준의 변화를 확인하였다.

TNF-α 및 MIP-2의 단백질 수준은 제조사(R&D Systems, Minneapolis, MN)의 지시서에 따라 TNF-α, MIP-2, ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

호중구의 수는 세포 크기 분석기가 포함된 electronic Coulter Counter(Coulter Model ZBI with a channelizer 256; Coulter Electronics, Bedfordshire, UK)를 사용하여 측정되었다.

또한, 기관지폐포 세척 (bronchoalveolar lavage, BAL) 시료의 단백질 농도는 혈액 폐 상피 세포 barrier integrity의 지시자로 사용하여, BAL fluid 내 총 단백질 함량은 제조사의 프로토콜에 따라 측정되었다.

그 결과를 도 4의 a 내지 d에 나타내었다.

도 4의 a 및 b는 2일 째 희생된 마우스의 BAL fluid 시표에서의 TNF-α 및 MIP-2 발현 변화를 보여준다. 도 4의 a 및 b에서 확인되는 바와 같이, 사멸 세포 투여에 따라 염증 인자인 TNF-α 및 MIP-2의 발현이 크게 감소하였지만, STAT6 억제제인 AS1517499 (AS)투여에 따라 염증 인자들의 발현이 크게 증가한 것이 확인되었다.

또한, 도 4의 c에서 확인되는 바와 같이, 사멸세포 주입에 따라 감소된 호중구 세포의 발현이 STAT6 억제제 처리에 따라 다시 증가하는 것이 확인되었다.

또한, 도 4의 d에서 확인되는 바와 같이, 사멸세포 주입에 따라 감소된 총 단백질 발현 량이 STAT6 억제제 처리에 따라 다시 증가하는 것이 확인되었다.

위 결과로부터, 치료 물질 투여에 따른 염증 관련 인자들의 변화가 STAT-6 신호와 관련성이 있음이 확인되었다.

< 실시예 4> STAT -6의 억제에 따른 사멸 세포 주입의 항-섬유화 효과 감소 확 인

STAT-6 신호가 억제되는 경우에 항-섬유증 효과가 감소함을 확인함으로써, STAT6 신호를 억제하는 약물을 피해야 함을 확인하였다.

실시예 1과 동일한 실험 모델을 기초로 하여, 제조된 BAL fluid에서의 TGF-β1 및 HGF 단백질 수준 변화를 확인하고, 14일째 폐 조직 파쇄액에서 α-SMA(a-smooth muscle actin)의 수준을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, 전체 폐에서 콜라겐 축적이 14일 째 하이드록시프로린 함량을 측정함으로써 확인되었다.

TGF-β1 및 HGF 단백질 수준은 제조사(R&D Systems, Minneapolis, MN)의 지시서에 따라 TGF-β1 및 HGF ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

α-SMA 및 fibronectin의 수준은 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

폐 하이드록시프롤린 함량은 제조사(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China PR)의 지시서에 따라 하이드록시프롤린 검정 키트를 사용하여 측정하였다.

그 결과를 도 5의 a 내지 d에 나타내었다.

도 5의 a 및 b에 나타낸 바와 같이, 사멸세포 주입에 따라 14일째 획득한 기관지폐포 세척액에서 TGF-β1이 감소하고, HGF가 증가하는 것이 확인되었으나, STAT6 억제제인 AS1517499 (AS) 투여에 따라 사멸세포 주입으로 유도되는 TGF-β1 감소 및 HGF 증가 효과가 반전되어 항 섬유증 효과가 감소되는 것이 확인되었다.

또한, 도 5의 c에 나타낸 바와 같이, α-SMA과 fibronectin(Fn)의 단백질 수준은 사멸세포 주입에 따라 감소하였으나, AS1517499 (AS) 투여에 따라 다시 증가하여 항 섬유증 효과가 감소되는 것이 확인되었다.

마찬가지로, 도 5의 d에서 확인되는 바와 같이, 하이드록시프롤린의 수준은 사멸세포 주입에 따라 감소되는 것이 확인되었으나, AS1517499 (AS) 투여에 따라 다시 증가하여 항 섬유증 효과가 감소되는 것이 확인되었다.

위 결과로부터, 치료 물질 투여에 따른 섬유증 관련 인자들의 변화가 STAT6 신호와 관련성이 있음이 확인되었다.

< 실시예 5> STAT -6의 억제에 따른 실험모델의 생존률 감소 확인

STAT6 신호가 억제되는 경우에 실험동물의 생존률이 감소함을 확인함으로써, STAT6 신호를 억제하는 약물을 피해야 함을 확인하였다.

실시예 1과 동일한 실험 모델을 기초로 하여, 블레오마이신 투여 후 각 군당 20마리의 마우스 생존률을 14일 동안 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 블레오마이신만을 처리한 군(BLM)은 14일 내에 약 50% 만이 생존하였다. 반면 블레오마이신과 함께 사멸세포를 투여한 군(BLM+ApoJ)은 생존률이 증가하였다(생존률 80%). 그러나, STAT6의 억제제인 AS1517499를 공동투여한 군(BLM+AS+ApoJ)은 사멸세포 주입에 따른 생존률을 감소시킴을 확인하였다.

위 결과로부터, 치료 물질 투여에 따른 생존률 변화가 STAT6 신호와 관련성이 있음이 확인되었다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A method for screening material for treating lung inflammation and fibrosis <130> P15-151-REA-EWHA <150> KR 10-2015-0161113 <151> 2015-11-17 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma Foward Primer <400> 1 gccctttggt gactttatgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma Reverse Primer <400> 2 cagcaggttg tcttggatgt 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 Forward Primer <400> 3 ttgtacctat actgtggcta aatgaga 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 Reverse Primer <400> 4 cttgtgtttt gaacatttct gctt 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMR Forward Primer <400> 5 agaaaatgca caagagcaag c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMR Reverse Primer <400> 6 ggaacatgtg ttctgcgttg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg1 Forward Primer <400> 7 gtggggaaag ccaatgaag 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg1 Reverse Primer <400> 8 gcttccaact gccagactgt 20

Claims

(a) 폐 섬유증 또는 폐 염증 유발 물질을 인간을 제외한 실험동물에게 투여하는 단계;
(b) 시험 물질을 상기 실험동물에게 투여하는 단계; 및
(c) 상기 실험동물의 세포에서 STAT6의 인산화가 증가된 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 폐 섬유증 또는 폐 염증 유발 물질은 블레오마이신인 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 실험동물은 마우스인 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 시험 물질 투여는 경구 또는 비경구 투여인 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 STAT6의 인산화 증가는 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정되는 것인 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
삭제
제1항에 있어서, (d) 실험동물의 세포에서 PPARγ의 발현 증가를 확인하는 단계를 더 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
(d) 상기 실험동물에서 하기 ⅰ 내지 ⅳ로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성들 중 1 이상을 나타내는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법:
ⅰ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 호중구 수의 감소,
ⅱ.폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 총 단백질 양의 감소,
ⅲ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 전염증성 사이토카인 발현 감소,
ⅳ. 폐조직, 폐세포 용해물 또는 기관지폐포세척액으로부터 선택된 어느 하나 이상에서 항염증성 사이토카인 발현 증가.
제1항에 있어서, (d) 상기 실험동물에서 PPARγ 발현 및 활동도의 증가와, CD36, MMR 및 Arg1으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 증가를 확인하는 단계를 더 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, (d) 상기 실험동물에서 하이드록시피롤린의 발현 감소를 확인하는 단계를 더 포함하는, 폐 염증 또는 폐 섬유증 치료제의 스크리닝 방법.
(a) 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질을 접촉한 폐 염증 또는 폐 섬유증 세포에서 STAT6 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 STAT6의 인산화 정도가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 또는 폐 염증 치료제 스크리닝 방법.