CN108404125A - 用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肺纤维化的IL‑1β疫苗，通过将IL‑1β的抗原表位插入PfTrx载体序列，构建的重组PfTrx‑IL‑1β疫苗可以成功刺激机体产生高效价的抗IL‑1β中和性抗体，明显减轻经博莱霉素诱导后产生的肺纤维化。IL‑1β疫苗免疫可以明显抑制小鼠肺组织胶原沉积；同时降低小鼠体内的TGF‑β1、CTGF及PDGFB的表达水平，这些特点都极有利于减缓肺纤维化的进程。因此，IL‑1β疫苗有望被开发成为治疗肺纤维化的有效手段。

Description

用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用

技术领域

本发明属于肺纤维化治疗药物领域，具体涉及一种用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用。

背景技术

肺纤维化(或称肺间质纤维化，pulmonary fibrosis,PF)是以弥漫性肺泡单位慢性炎症和间质纤维组织增生、细胞外基质沉积为主要病理改变的一大组疾病。PF通常因弥漫性间质性肺疾病引起，包括粉尘吸入、自身免疫、药物、放射线或感染等，也有相当一部分患者无明确原因(特发性肺纤维化，idiopathicpulmonary fibrosis,IPF)。病变进行性进展，最终可导致肺组织不可逆性破坏，严重影响患者呼吸功能。近年PF的发生呈明显上升趋势。大部分PF性疾病无有效的病因治疗，传统的抗PF治疗经多年临床验证已趋于否定，新型抗PF药物效果有限而且价格昂贵，故寻找安全、优效、方便、低成本的抗PF治疗手段是目前研究的重要课题。

白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)家族已知有3个成员：IL-1α,IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)。IL-1是关键的炎症因子之一，在机体抵御感染中起着重要作用。正常组织或细胞不表达IL-1β，一旦固有免疫细胞受到警报分子(alarmin)刺激，则可经由NF-κB途径表达和分泌IL-1β，为炎症组织中主要的IL-1。除了直接的促炎作用外，作为一种早期反应炎症因子，IL-lβ可促进趋化因子、IL-6、TNF-α等多种炎症因子及基质金属蛋白酶等介质的生成，募集中性粒细胞，扩大炎症反应。多项研究证实，肺纤维化性疾病如结节病、尘肺、IPF患者肺灌洗液巨噬细胞分泌IL-1β高于正常，IL-1β在间质性肺疾病及PF过程中起着重要作用。

细胞因子疫苗是近年来免疫学研究的一个热点，主要原理是将无免疫原性的细胞因子与载体蛋白偶联或重组表达，以载体蛋白提供Th表位，或将细胞因子制成超抗原，直接激发B淋巴细胞，使机体能对细胞因子发生体液免疫应答，产生抗细胞因子抗体，中和在某一疾病中起主要作用的细胞因子，缓解由过多细胞因子引致的疾病或病理状态，从而达到治疗疾病的目的。

目前，选择性阻断IL-1β的药物主要有以下三种：阿那白滞素(anakinra)，为重组、非糖基化的人白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)，适用于对1个或多个缓解病症的抗风湿性药物(DMARD)治疗无效的18岁及以上中重度活动性类风湿性关节炎(RA)患者。列洛西普(rilonacept)，IL-1受体拮抗药。用于治疗家族性寒冷型自身炎症综合征和穆-韦(Muckle-Wells)两氏综合征。卡那奴单抗(Ilarus)，是抗IL-1β单克隆抗体。用于周期性发热综合征，家族性寒冷自身炎症综合证等罕见和严重的自身炎症性疾病。

以上药物都可以特异性的拮抗IL-1β，但具有以下缺点：①价格高昂，患者经济负担重；②阿那白滞素半衰期短，需要每天注射，使用不便，患者依存性差，同时临床疗效中等；③容易引起过敏，使用药物后可干扰患者对新的抗原如疫苗的正常免疫反应。同时，上述药物迄今未能应用于肺纤维化的治疗。故探索拮抗IL-1β后对PF的作用效果，寻找安全、优效、方便、低成本的抗PF治疗手段是目前研究的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种重组疫苗，该重组疫苗是将将白细胞介素1β的抗原表位插入激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体中装配而成；所述重组疫苗的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

白细胞介素1β的抗原表位有两个，是其与受体结合的关键部位，分别位于aa38-57位和aa86-105位，两个表位以柔性氨基酸linker GPGP相串联。

其中，aa38-57的氨基酸为QQVVFSMSFVQGEESNDKIP；aa86-105的氨基酸为DPKNYPKKKMEKRFVFNKIE。

所述的激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体是经过改造的载体，经过改造的PfTrx载体在外源片段插入位点两侧含有两个半胱氨酸残基，能够形成稳定的二硫键，将插入序列锁定。

本发明还公开了上述重组疫苗在制备抗肺纤维化的药物中的应用。

所述的药物为降低肺组织中α-SMA、TGF-β1、CTGF、Col1a2及PDGFB mRNA表达水平的药物。

所述的药物为降低肺组织中α-SMA、TGF-β1、CTGF及Col1a2蛋白质表达水平的药物。

本发明还公开了上述重组疫苗在制备抗白细胞介素1β的中和性抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β疫苗，通过将白细胞介素1β的抗原表位插入PfTrx载体，构建可以在大肠杆菌中高效表达，并且在高温条件下含量及结构也未受明显影响的白细胞介素1β重组疫苗。该疫苗可以刺激机体产生高效价的抗IL-1β中和性抗体，用该疫苗免疫后的小鼠，经博莱霉素诱导后产生的小鼠肺纤维化程度明显减轻。

通过实验验证，本发明的白细胞介素1β疫苗免疫可以明显抑制小鼠肺组织中胶原的合成，同时免疫后小鼠体内的转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)及血小板源性生长因子B(Platelet derived growth factor subunit B，PDGFB)的水平也明显下降，这极有利于减缓肺纤维化的进程。结果表明，白细胞介素1β疫苗可以成功抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。因此，白细胞介素1β疫苗有望被开发为治疗肺纤维化的有效手段。

附图说明

图1为重组蛋白PfTrx-IL-1β、PfTrx的原核表达及纯化图；

图2为重组蛋白PfTrx及PfTrx-IL-1β刺激机体产生的抗体滴度图；

图3为验证PfTrx-IL-1β多克隆抗体的Western blot图；

图4为验证抗体具有中和活性的细胞增殖实验(CCK8)；

图5为免疫及造模时间图；

图6为小鼠肺组织HE染色图；其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组；

图7为小鼠肺组织天狼猩红染色图；其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组；

图8为小鼠肺组织羟脯氨酸总量测定分析图；

图9为小鼠肺组织中α-SMA表达的免疫组化染色图；其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组；

图10-1为Western blot法检测各组小鼠肺组织中α-SMA的表达水平图；

图10-2为Western blot法检测各组小鼠肺组织中α-SMA的表达水平的统计分析图；

图11为Real-time PCR法检测肺组织中α-SMA的mRNA水平图；

图12为Real-time PCR法检测肺组织中Col1a2的mRNA水平图；

图13为Real-time PCR法检测肺组织中TGF-β1的mRNA水平图；

图14为Real-time PCR法检测肺组织中CTGF的mRNA水平图；

图15为Real-time PCR法检测肺组织中PDGFB的mRNA水平图；

图16-1为Western blot法检测各组小鼠肺组织中TGF-β1的表达水平图；图16-2为Western blot法检测各组小鼠肺组织中TGF-β1的表达水平的统计分析图；

图17-1为Western blot法检测各组小鼠肺组织中CTGF的表达水平图；

图17-2为Western blot法检测各组小鼠肺组织中CTGF的表达水平的统计分析图；

图18-1为Western blot法检测各组小鼠肺组织中Col1a2的表达水平图；图18-2为Western blot法检测各组小鼠肺组织中Col1a2的表达水平的统计分析图。

具体实施方式

本发明提供用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β(IL-1β)重组疫苗，成功将IL-1β的抗原表位插入PfTrx载体，该疫苗能在大肠杆菌高效表达，表达产物可溶性好，在70℃高温处理下含量及结构也未受明显影响。使用该疫苗免疫的小鼠，经博莱霉素诱导后产生的肺纤维化程度明显减轻。在进一步的研究中我们发现IL-1β疫苗免疫可以明显抑制小鼠肺组织中胶原合成及TGF-β1、CTGF及PDGFB等促纤维化因子的释放，这极有利于减缓肺纤维化的进程。结果表明，IL-1β疫苗可以成功抑制博莱霉素诱导的小鼠的肺纤维化。

PfTrx为激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)。由意大利帕尔马大学生命科学系Simone Ottonello教授赠送的原核表达质粒pET26b-PfTrx，携带有可供外源肽片段插入的PfTrx。经过改造后的PfTrx在外源片段插入位点两侧含有两个半胱氨酸残基，可以形成稳定的二硫键(C-C)，将插入序列锁定，使其不能与PfTrx本身的肽段之间折叠，而且有助于插入片段保持一定的高级结构。经初步验证，使用该载体表达的重组蛋白在大肠杆菌中表达效率高，产物可溶性好，同时，胰岛素还原试验证实重组蛋白能耐受70℃高温处理而其含量及结构未受明显影响。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、pET28-PfTrx-IL-1β重组蛋白表达载体构建

(1)pET28-PfTrx的载体构建

pET26-PfTrx质粒由帕尔马大学生命科学系(Department of Life Sciences,Biochemistry and Molecular Biology Unit,University of Parma,Italy)SimoneOttonello教授赠送(Canali E,Bolchi A,Spagnoli G,Seitz H,Rubio I,Pertinhez TA,Müller M,Ottonello S.A high-performance thioredoxin-based scaffold for peptideimmunogen construction:proof-of-concept testing with a human papillomavirusepitope.Sci Rep,2014；4:4729)。其编码区首尾分别引入Nde I及Xho I位点。前期试验发现，以pET26b质粒载体表达的PfTrx及其重组蛋白经加热处理虽然可以使PfTrx有效浓集，但纯度仍不理想，而且其中含有大量的内毒素，后期去内毒素操作较为困难。为此，本实验室将PfTrx使用Nde I和Xho I消化分离后，插入pET28-a(+)的相应位点，构建了pET28-PfTrx质粒，借此引入了6×His标签以便进一步纯化和降低内毒素含量。

(2)PfTrx-IL-1β融合蛋白的设计

IL-1β分子中与受体结合的关键部位位于以下两段：

aa38-57(QQVVFSMSFVQGEESNDKIP)；

aa86-105(DPKNYPKKKMEKRFVFNKIE)

上述两段肽人、鼠同源，因此，设计将这两段肽以GPGP linker串联，融合入PfTrx制备重组疫苗。预测表达的重组蛋白序列为(如SEQ.ID.NO.1所示)：

MIIEYDGEIDFTKGRVVLWFSIPGCGPSAGQQVVFSMSFVQGEESNDKIPGPGPDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEGSG PCRLVERFMTELSEYFEDIQIVHINAGKWKNIVDKFNILNVPTLVYLKDGREVGRQNLIRSKEEILKKLKELQE。

(3)扩增IL-1β编码序列

IL-1β

F:5’-GCTGCAGGGCAACAAGTGGTGTTCTCCATGTCCTTTGTACAAGGAGAAGAAAGTAATGACAAAA TACCTGGTCCGG-3’(斜体为Pst I酶切位点，下划线处为互补序列)；

R:5’-GGGATCCTTCTATCTTGTTGAAGACAAATCGCTTTTCCATCTTCTTCTTTGGGTAATTTTTGGGATCGGGACCCGGACCAGGTATTTTGTCATTAC-3’(斜体为BamH I酶切位点，下划线处为互补序列)。

由于正反向引物有部分片段反向互补，故可直接通过PCR得到含Pst I及BamH I酶切位点的IL-1β片段。将此PCR产物电泳割胶回收后，连接入pGEM-Teasy载体，构建重组质粒pGEM-Teasy-IL-1β,转入E.coli DH5α中，提取质粒，并送上海生工公司测序，结果正确。

(4)IL-1β的编码序列插入pET-28a(+)载体

将所构建的pGEM-Teasy-IL-1β及pET28-PfTrx质粒，在扩增后均使用Pst I及BamHI双酶切，并行琼脂糖电泳及割胶回收所得的IL-1β片段及pET28-PfTrx载体，并使用DNA T4连接酶构建pET28-PfTrx-IL-1β质粒。

2、pET28-PfTrx及pET28-PfTrx-IL-1β的原核表达及纯化

(1)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行蛋白诱导表达；

(3)由于PfTrx-IL-1β重组蛋白继承了PfTrx的高耐热性，故将表达产物经70℃或更高的温度加热，通过变性沉淀杂质蛋白来初步纯化后，再行Ni-NTA纯化，PBS透析；

(4)分析原核表达及纯化产物。

参见图1，细菌裂解上清及Ni-NTA纯化洗脱产物经12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色分析，可见pET28-PfTrx在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约15kDa的重组蛋白PfTrx条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经加热及Ni-NTA系统纯化后可见约15kDa的重组蛋白PfTrx纯化条带。pET 28-PfTrx-IL-1β在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约19kDa的重组蛋白PfTrx-IL-1β条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经Ni-NTA系统非变性条件下纯化后可见约19kDa的重组蛋白PfTrx-IL-1β纯化条带。

(5)除内毒素处理：

重组蛋白液中加入1％体积的Triton X-114，4℃摇床振荡1小时，30℃水浴1小时，14,000rpm，25℃离心15分钟，吸出上层水相。同样程序重复3次以上，直至取样测定内毒素含量低于0.2EU/ml。加入甘油至终浓度10％，-20℃保存。

3、重组蛋白免疫原性验证

(1)免疫

1)选择6周龄的ICR雄性小鼠

2)动物分组(5只/组)

正常组：注射PBS溶液0.1mL；

PfTrx组：注射重组蛋白PfTrx 0.1mL(含50μg重组蛋白)；

PfTrx-IL-1β组：注射重组蛋白PfTrx-IL-1β0.1mL(含50μg重组蛋白)。首次免疫加入完全弗氏佐剂，第二次加不完全佐剂，第三次以后不加佐剂。

3)免疫方法：小鼠腹壁消毒，每只小鼠按上述方法腹腔注射重组蛋白或PBS溶液。由于小鼠腹壁薄，需要“Z”字形进针，以免注射的液体从注射部位漏出。

4)每2周免疫一次，共免疫5次。

(2)制备用于抗体滴度检测的ELISA板

1)原核表达纯化PfTrx；

2)包被：用50mM碳酸盐缓冲液稀释自行原核表达纯化的HBc-IL-1β，并按照100ng/孔包被96孔酶标板。包被后保鲜膜封好，4℃过夜；

3)封闭：向包被后的酶标板微孔中，按照300μL/孔加入封闭液(10％牛血清)，4℃孵育过夜，吸出封闭液，风干后－20℃保存，备用；同时包被PfTrx做为对照。

(3)间接ELISA法检测免疫小鼠抗体滴度

结果显示：免疫4次后取小鼠尾血清，分别用HBc-IL-1β，PfTrx包板行ELISA实验检测各组小鼠抗体滴度。结果表明PfTrx-IL-1β免疫组小鼠均产生高效价抗IL-1β抗体(表1)。PfTrx免疫组小鼠产生高效价抗PfTrx抗体(表2)。抗体滴度以log值对比分析参见图2。

表1抗PfTrx-IL-1β多克隆抗体滴度测定结果

表2抗PfTrx多克隆抗体滴度测定结果

(4)Western blot法验证血清中抗体的特异性

购买商品化的重组人IL-1β(rhIL-1β，recombinant human IL-1β，中国SinoBiological Inc.)，Western blot法验证PfTrx-IL-1β免疫后的小鼠血清中是否含有能特异性识别rhIL-1β的抗IL-1β抗体。

结果显示，以rhIL-1β为抗原，一抗为PBS注射后小鼠的血清(1:500)，未见rhIL-1β蛋白条带；一抗为PfTrx多抗血清(1:500)，未见rhIL-1β蛋白条带；一抗为PfTrx-IL-1β多抗血清(1:500)，可见rhIL-1β蛋白条带(参见图3)。因此，PfTrx-IL-1β多抗血清中含有抗IL-1β抗体，并且可以特异性的结合rhIL-1β，可用于下游实验。

(5)观察免疫对小鼠各脏器的影响

首次免疫后5个月，处死小鼠，取心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器置于4％多聚甲醛中固定24小时。石蜡包埋后切片，苏木紫&伊红(HE)染色，显微镜下进行组织学观察。结果显示PfTrx-IL-1β免疫对小鼠心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器无明显影响。

4、IL-1β抗体中和重组人IL-1β的活性

(1)取对数生长期的小鼠Th2细胞D10.G4.1，0.5％胰酶消化后用RPM1640完全培养基调整细胞悬液的浓度；

(2)以每孔2000个细胞/孔接种于96孔板，置于37℃、含5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；

(3)细胞的分组方法：

PBS对照组：不加处理；

rhIL-1β组：培养基中加rhIL-1β至终浓度2pg/ml。

rhIL-1β+正常抗体组：rhIL-1β2pg/ml+未免疫小鼠血清。

rhIL-1β+PfTrx抗血清组：rhIL-1β2pg/ml+PfTrx免疫小鼠血清。

rhIL-1β+PfTrx-IL-1β抗血清组：rhIL-1β2pg/ml+PfTrx-IL-1β免疫小鼠血清。

培养72h后，CCK-8法计数细胞。

结果显示，rhIL-1β可以促进D10.G4.1细胞增殖，加入PfTrx-IL-1β抗血清后，rhIL-1β的促增殖作用减弱，同时对照血清不影响rhIL-1β的作用，证实PfTrx-IL-1β抗血清有中和rhIL-1β刺激D10.G4.1细胞增殖的作用，参见图4。

5、白细胞介素1β疫苗抑制小鼠肺纤维化

(1)免疫小鼠，动物分组方法及免疫方法同第三节所述；

(2)检测抗体滴度

首次免疫后，第4周开始，以间接ELISA法检测PfTrx组抗PfTrx的抗体滴度；PfTrx-IL-1β组检测抗IL-1β抗体滴度。此后每2周检测一次，直至首次免疫后第8周。

PfTrx-IL-1β免疫4次后取小鼠尾血清，用HBc-IL-1β包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗IL-1β抗体(表3)。PfTrx免疫4次后取小鼠尾血清，用PfTrx全长包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗PfTrx抗体(表4)。

表3PfTrx-IL-1β多克隆抗体滴度测定结果

表4PfTrx多克隆抗体滴度测定结果

(3)博莱霉素(BLM)制备小鼠肺纤维化模型

免疫结束后1周，开始制备肺纤维化模型。制备方法为：

1)生理盐水配置BLM至终浓度2.4mg/kg。

2)生理盐水配置5％水合氯醛。

3)气管滴注给药之前，按0.08mL/10g给与5％水合氯醛麻醉小鼠。麻醉成功后，将小鼠仰面悬置于实验台斜面上，直视下使用长约1.5cm的20GA套管针软管于导丝引导下进行气管插管，验证插管成功后，向套管内注入生理盐水或BLM溶液(PfTrx/BLM组、PfTrx-IL-1β/BLM组及BLM组按3.0mg/kg经气管灌注BLM混合溶液。正常组给与对应生理盐水)，滴注结束后继续向气管内注入气体，并提起小鼠上肢正置旋转30s使药物均匀分布于肺内。操作过程中，动作尽量轻柔，以减少损伤，注意动物保暖。

4)小鼠麻醉苏醒后，于标准条件下继续饲养。密切观察小鼠毛色、饮食及行为状态等一般状况，每日记录体重，将各时间点体重与初始体重比较，计算并观察小鼠体重变化。于气管内滴注BLM后28d处死小鼠，收集肺组织，用于病理切片制备与观察。具体免疫时间及BLM肺纤维化造模参见图5。

5)麻醉小鼠后，眼球采血收集血清，称重并记录肺湿重；肺系数为肺湿重(mg)与小鼠体重(g)之比；剪取左下肺组织块固定，其余肺组织保存于-80℃冰箱备用。

(4)评价小鼠肺纤维化程度

1)HE染色

肺组织于4％多聚甲醛固定24h后，石蜡包埋、切片，苏木精&伊红法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，观察组织改变。

(a)烤片：肺组织切片放置于60℃烤箱中1h，融解组织表面的石蜡；

(b)脱蜡及水化：二甲苯I，10min→二甲苯II，10min→二甲苯III，10min→无水乙醇I，5min→无水乙醇II，5min→95％乙醇，5min→75％乙醇，5min→自来水洗涤3次→蒸馏水洗涤3次；

(c)苏木精染色：切片放入苏木精水溶液中染色10min，自来水冲洗片刻，1％盐酸酒精中分化30s，自来水冲洗片刻，氨水中反蓝1min，流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻；

(d)伊红染色：切片入70％和90％酒精中脱水各10min；入酒精伊红染色液染色2～3min；

(e)脱水透明：75％乙醇，5min→95％乙醇，5min→无水乙醇I，5min→无水乙醇II，5min→二甲苯I，5min→二甲苯II，5min→中性树胶封片，烘干；显微镜下观察肺组织病理形态(×200)。

结果如图6所示，其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组)。给予BLM气管内滴注后28d，BLM组和PfTrx/BLM组小鼠肺组织正常结构消失，组织内梭形细胞聚集成团，间质成分增多，肺泡腔消失；PfTrx-IL-1β/BLM组小鼠肺泡间隔增宽，肺野内可见小的纤维细胞团，病变程度明显改善(比例尺：200μm)。

2)天狼星红染色评价肺纤维化程度

a)将厚度为6μm的肺组织石蜡切片置于37℃温箱中烘烤1小时。

b)脱蜡和水化：

顺序为：二甲苯2min→二甲苯2min→二甲苯2min→无水乙醇2min→无水乙醇2min→95％酒精2min→85％酒精2min→自来水洗至少3min→蒸馏水洗1min。

c)将切片放于0.1％苦味酸-天狼猩红染液中约1小时(染液配方：0.1g天狼星红，饱和苦味酸溶液100ml)。

d)将切片从染缸中取出，蒸馏水冲洗约30S，二甲苯透明。

e)中性树胶封片。

f)普通光学显微镜下观察染色结果：可见胶原被天狼猩红染成红色，细胞质被苦味酸染成黄色。

g)按修订版Achroft纤维化评分标准对肺脏纤维化程度进行评价(表5)。

表5肺纤维化评分标准

h)天狼星红染色(参见图7，其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组)，按Achroft纤维化评分标准评价的肺纤维化评分结果显示，正常组小鼠无肺纤维化，均为0分；PfTrx-IL-1β免疫组小鼠肝纤维化评分为3–4分；而PfTrx免疫组与BLM模型组的小鼠肺纤维化评分均为5–7分(表6)。

表6按修订版Achroft纤维化评分标准

注：PfTrx-IL-1β/BLM组肺纤维化评分明显低于BLM组和PfTrx/BLM组，*P<0.05。

3)使用羟脯氨酸检测试剂盒测定肺组织中的羟脯氨酸总量

结果显示，PfTrx-IL-1β免疫组小鼠肺脏的羟脯氨酸总量明显低于PfTrx免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。参见图8。

6、IL-1β疫苗抑制肺纤维化的机制

(1)PfTrx-IL-1β疫苗抑制BLM导致的胶原沉积

1)免疫组化检测α-SMA表达情况

(a)肺组织切片经烤片、脱蜡、水化步骤(具体操作同HE染色)后，自来水洗片3次，蒸馏水洗片3次；

(b)3％过氧化氢(用甲醇稀释)滴加在组织切片上，室温静置20min，消除内源性过氧化物酶作用；蒸馏水洗片3次，每次2min；切片置于PBS中浸泡5min；

(c)滴加正常山羊血清封闭，室温下放置2h；

(d)吸除血清，滴加抗α-SMA抗体(以含封闭用山羊血清稀释为1:500，Thermo)，室温孵育1h，4℃过夜；

(e)次日，取出切片，在37℃复温45min。PBST洗片3次，每次5min；

(f)滴加生物素标记的抗小鼠二抗工作液，置于37℃湿盒中孵育1h；PBST洗片3次，每次5min；

(g)滴加HRP标记的链霉卵白素，37℃湿盒中孵育30min；PBST洗片3次，每次5min；

(h)DAB显色，自来水充分冲洗切片；

(i)苏木素复染2min，盐酸酒精分化液分化；自来水冲洗10min；

(j)脱水、透明、封片(具体操作同HE染色)。

结果显示，PfTrx-IL-1β免疫组肺组织α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx免疫组与模型组。参见图9，其中，(a)为正常组、(b)为BLM组、(c)为PfTrx/BLM组、(d)为PfTrx-IL-1β/BLM组。

2)Western blot法检测α-SMA表达情况

2.1取各组小鼠肺组织各50mg置于2mL EP管中；毎管中加入800μL RIPA裂解液，0.1M PMSF至终浓度为1mM；同时加入蛋白酶抑制剂Cocktail。使用组织粉碎机充分粉碎肺组织；然后使用超声波细胞粉碎机以30％超声强度处理肺组织2min；操作均在冰浴中进行。在4℃条件下，15000rpm离心肺组织裂解液10min，留取上清至新EP管；BCA法测蛋白浓度。

2.2配制12％SDS-PAGE凝胶，50μg蛋白/孔上样电泳。转膜封闭后以5％脱脂奶粉按1:800稀释小鼠抗α-SMA抗体，1:1000稀释小鼠抗β-action抗体；4℃孵育过夜；次日TBST洗膜后以5％脱脂奶粉按1:10000稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗；室温孵育1h后TBST洗膜显影。

参见图10，结果显示，PfTrx-IL-1β免疫组肺组织α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

(2)PfTrx-IL-1β疫苗抑制促纤维化因子表达

1)Real-time PCR法检测PfTrx-IL-1β疫苗对小鼠肺组织促纤维化因子表达水平的影响

a)Trizol法提取组织总RNA；定量；-70℃保存；

b)逆转录PCR法将组织总RNA逆转录为cDNA；反应产物cDNA定量；Real-time PCR引物序列如表7：

表7Real-time PCR引物

c)以cDNA为模板，进行Real-time PCR

Real-time PCR反应体系：

SYBR Premix EX TaqII(2×)10μL

primer F(10μM)0.4μL

primer R(10μM)0.4μL

cDNA模板0.5μL

dH2O加至20μL

Real-time PCR反应条件：

stage 1：预变性

95℃30s 20℃/s 1个循环

stage 2：PCR反应

95℃5s 20℃/s 40个循环

60℃30s 20℃/s

stage 3：融解曲线分析

65℃5s 20℃/s

95℃10s 0.1℃/s。

d)软件分析数据：

β-actin为内参基因，其余基因为待测基因；实验每个样本设3个复孔，实验重复3次。取得同一实验组Ct值的平均值。将对照组目的基因的Ct平均值减去该样本内参β-actin的Ct平均值，其差值为ΔCt值；在所有实验组中设定对照组为实验参照样本，其他的实验组与对照组进行比较，其差值为ΔΔCt值，计算2-ΔΔCt值；再计算每个样本的3次的2-ΔΔCt值的平均值，即为所需最后结果。可以通过比对这一数值来检测不同样本中目的基因的丰度。

结果显示，经Real-time PCR方法分析，PfTrx-IL-1β免疫组肺组织的α-SMA、COL1a2、TGF-β1、CTGF、PDGFB的表达水平明显低于PfTrx免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。参见图11-15。

2)Western blot法检测PfTrx-IL-1β疫苗对小鼠肺组织中TGF-β1、CTGF及Col1a2蛋白质表达水平的影响

a)从组织中提取总蛋白的方法同上；

b)Western blot法检测各组肝组织中TGF-β1、CTGF及Col1a2蛋白质表达水平。

参见图16-18，结果显示，IL-1β疫苗降低肺组织中TGF-β1、CTGF及Col1a2蛋白质表达水平。

7、统计学分析

实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间均数比较采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)和图基事后检验(Tukey'spost hoc test)，双侧P<0.05为显著性检验标准。

综合本发明的以上结果表明，将IL-1β的抗原表位插入PfTrx载体序列，构建重组PfTrx-IL-1β疫苗可以成功刺激机体产生高效价的抗IL-1β中和性抗体，明显减轻经博莱霉素诱导后产生的肺纤维化。IL-1β疫苗免疫可以明显抑制小鼠肺组织胶原沉积；同时降低小鼠体内的TGF-β1、CTGF及PDGFB的表达水平，这些特点都极有利于减缓肺纤维化的进程。因此，IL-1β疫苗有望被开发成为治疗肺纤维化的有效手段。

序列表

<120> 用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Ile Glu Tyr Asp Gly Glu Ile Asp Phe Thr Lys Gly Arg Val

1 5 10 15

Val Leu Trp Phe Ser Ile Pro Gly Cys Gly Pro Ser Ala Gly Gln Gln

20 25 30

Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys

35 40 45

Ile Pro Gly Pro Gly Pro Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met

50 55 60

Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Gly Ser Gly Pro Cys Arg

65 70 75 80

Leu Val Glu Arg Phe Met Thr Glu Leu Ser Glu Tyr Phe Glu Asp Ile

85 90 95

Gln Ile Val His Ile Asn Ala Gly Lys Trp Lys Asn Ile Val Asp Lys

100 105 110

Phe Asn Ile Leu Asn Val Pro Thr Leu Val Tyr Leu Lys Asp Gly Arg

115 120 125

Glu Val Gly Arg Gln Asn Leu Ile Arg Ser Lys Glu Glu Ile Leu Lys

130 135 140

Lys Leu Lys Glu Leu Gln Glu

145 150

Claims (7)

1.一种重组疫苗，其特征在于，该重组疫苗是将白细胞介素1β的抗原表位插入激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体中装配而成；

所述重组疫苗的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于，白细胞介素1β的抗原表位有两个，是其与受体结合的关键部位，分别位于aa38-57位和aa86-105位，两个表位以柔性氨基酸linker GPGP相串联。

3.根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于，所述的激烈火球菌硫氧还蛋白PfTrx载体是经过改造的载体，经过改造的PfTrx载体在外源片段插入位点两侧含有两个半胱氨酸残基，能够形成稳定的二硫键，将插入序列锁定。

4.权利要求1～3中任意一项所述的重组疫苗在制备抗肺纤维化的药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肺组织中α-SMA、TGF-β1、CTGF、Col1a2及PDGFB mRNA表达水平的药物。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肺组织中α-SMA、TGF-β1、CTGF及Col1a2蛋白质表达水平的药物。

7.权利要求1～3中任意一项所述的重组疫苗在制备抗白细胞介素1β的中和性抗体中的应用。