ES2253788T3 - Ensayo de agente anti-fibrotico. - Google Patents
Ensayo de agente anti-fibrotico.Info
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Abstract
SE HA DESARROLLADO UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA SELECCIONAR AGENTES ANTICICATRIZANTES Y ANTIFIBROTICOS. ESTE PROCEDIMIENTO OFRECE SIMPLICIDAD, ES REPRODUCIBLE Y PUEDE ADOPTARSE PARA SELECCIONAR UN GRAN NUMERO DE NUEVOS AGENTES POTENCIALMENTE ANTIFIBROTICOS. ESTE PROCEDIMIENTO TIENE CARACTERISTICAS EN COMUN CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO BAEC/BASMC, PERO ES MAS SENSIBLE Y NO REQUIERE LA SELECCION DE UN GRAN NUMERO DE LINEAS CLONALES PARA DESARROLLAR UN PROCEDIMIENTO EFECTIVO. EN ESTE SISTEMA, DE FORMA SIMILAR CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO, LA ACTIVACION DEL L-TGF- BE 1 SE PRODUCE MEDIANTE VARIOS MECANISMOS INDEPENDIENTES QUE COMPRENDEN LA UNION DEL COMPLEJO LATENTE CON LOS RECEPTORES M6P/IGF-II, LA TROMBOSPONDINA Y/O LA TRANSGLUTAMINASA DE TEJIDOS DE TIPO II. PERO, EN CONTRASTE CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO, ESTE SISTEMA DEPENDIENTE DE LOS MACROFAGOS NO PARECE INVOLUCRAR A LA PLASMINA. UTILIZANDO ESTE PROCEDIMIENTO, SE IDENTIFICARON NUEVOS AGENTES ANTIFIBROTICOS TALES COMO EL IGF-2 (UTILIZADO SEPARADAMENTE O EN COMBINACION CON EL IGFBP2 COMO VEHICULO DE ADMINISTRACION), LOS INHIBIDORES DE LA TRANSGLUTAMINASA DE TEJIDOS DE TIPO II Y AGENTES ANTIINFLAMATORIOS (TALES COMO LA HIDROCORTISONA). SE HA PROPUESTO UN NUEVO MECANISMO POTENCIAL DE ACCION PARA LA MANOSA 6-FOSFATO QUE SE BASA EN LA DESREGULACION DEL RECEPTOR DEL M6P/IGF-II Y TGF- BE 1 MARN.
Description
Ensayo de agente
anti-fibrótico.
El Factor de Crecimiento Transformante \beta
(TGF-\beta) es un proteína reguladora del
crecimiento potente y una molécula clave implicada en diversos
trastornos fibróticos (cicatrización). La mayoría de las células
secretan TGF-\beta1 en una forma de peso
molecular alta predominantemente inactiva,
TGF-\beta latente
(L-TGF-\beta).
TGF-\beta latente está compuesto de un péptido
asociado a la latencia amino-terminal (LAP) asociado
de manera no covalente al TGF-\beta maduro
carboxi-terminal. El péptido asociado a latencia
está unido por puentes disulfuro a una segunda proteína no
relacionada estructuralmente, la proteína de unión a
TGF-\beta latente (LTBP), que juega un papel en el
procesamiento y secreción de TGF-\beta1 (1).
Un mecanismo principal para regular la actividad
de TGF-\beta sucede a través de factores que
controlan el procesamiento de la forma latente a la biológicamente
activa de la molécula. La activación fisicoquímica puede suceder por
extremos de pH, calor, agentes caotrópicos (dodecil sulfato sódico,
urea) y desglicosilación (2, 3, 4, 5). La activación in vivo
es más compleja y no está bien entendida.
La activación mediada por células se consiguió
por primera vez por co-cultivos de pericitos o
células de músculo liso con células del endotelio capilar (6, 7).
Este procedimiento requiere la interacción de dos tipos celulares
de la misma especie. La activación aparentemente está mediada por
plasmina ya que la activación se bloquea por inhibidores de
plasmina/serín proteasa (8). La activación celular se cree que
requiere la unión del TGF-\beta latente al
receptor de manosa-6-fosfato/factor
de crecimiento II tipo insulina (9) mediante las moléculas de
manosa-6-fosfato encontradas en el
componente LAP de la forma latente de TGF-\beta
(10). La transglutaminasa de tipo II tisular también se ha mostrado
como un requisito para la activación en este modelo dependiente de
células que puede funcionar para entrecruzar el
TGF-\beta latente con las moléculas de matriz
(11). El requisito final para la activación implica LTBP. Se ha
propuesto que LTBP es necesaria para concentrar el complejo
TGF-\beta latente en la superficie celular donde
se activa posteriormente, supuestamente por transglutaminasa tisular
y/o plasmina (12). Se han identificado y clonado tres diferentes
LTBP (13-15) que pueden indicar un mecanismo
potencial por el que las células pueden controlar las interacciones
de los complejos de TGF-\beta latente con sitios
tisulares o tipos celulares específicos. Además, hay informes de que
la activación de TGF-\beta sucede
independientemente de estos mecanismos por la unión del complejo
latente a trombospondina, una glicoproteína asociada a matriz
extracelular (16,
17).
17).
Aunque
L-TGF-\beta no se activa en
condiciones normales de cultivo salvo que se preparen
co-cultivos, las células en cultivos homotípicos
pueden inducirse para formar TGF-\beta activo por
aplicación de agentes específicos. Entre estos agentes están los
retinoides, que inducen la activación de
TGF-\beta1 latente en queratinocitos, células
endoteliales y osteoclastos (18, 19, 20). La activación de
TGF-\beta1 inducida por retinoides es dependiente
de plasmina (18, 19). Los anti-estrógenos
(tamoxifeno o toremifina) indujeron la producción de
TGF-\beta activo en fibroblastos fetales y
células de carcinoma de mama (21). La exposición de células del
endotelio arterial o capilar bovino a bFGF (Factor de Crecimiento
de Fibroblastos básico) in vitro también provocó la
activación de TGF-\beta aparentemente por un
mecanismo dependiente de plasmina (22). Las vesículas de matriz de
condrocitos osteocondrales de la zona de crecimiento fueron capaces
de activar TGF-\beta latente cuando se incubaron
con 1,25-dihidroxi vitamina D3 a través de la
acción directa de la vitamina sobre la membrana de la vesícula de la
matriz extracelular (23). Además, hay informes de que pequeñas
cantidades de TGF-\beta1 activo podrían detectarse
en medios condicionados de células epiteliales de próstata humanas
(24), líneas celulares de melanoma (25) y células de glioblastoma
(26); sin embargo, el mecanismo de esta activación aún no se
entiende.
Hasta la fecha, ninguno de los sistemas que
generan TGF-\beta1 activo se ha utilizado como
modelo de exploración para agentes con capacidad potencial de
sostener la latencia de TGF-\beta1. El
procedimiento de co-cultivo se ha estudiado
ampliamente y se dilucidaron los mecanismos responsables de la
activación de TGF-\beta1 en este sistema. Sin
embargo, este procedimiento de co-cultivo carece de
reproducibilidad y tiene el importante requisito de exploración de
grandes cantidades de clones celulares para producir un sistema
eficaz.
El objetivo de estos estudios fue desarrollar un
nuevo modelo in vitro para la activación de
TGF-\beta para la exploración posterior de
moléculas con capacidades potenciales de impedir esta activación.
Como TGF-\beta ha demostrado se un factor clave
en cicatrización y trastornos fibróticos, se esperaría que los
agentes que demostraron ser activos en dicho ensayo funcionaran
como anti-fibróticos y
anti-cicatrizantes in vivo.
Se ha desarrollado un nuevo procedimiento para
explorar e identificar moduladores de la formación de cicatriz, tal
como agentes anti-cicatrizantes y
anti-fibróticos. Este procedimiento ofrece
simplicidad, es reproducible y podría adoptarse para explorar
grandes cantidades de compuestos moduladores para identificar nuevos
agentes anti-fibróticos potenciales.
Este procedimiento tiene características en común
con el sistema de co-cultivo de células del
endotelio arterial bovino/células del músculo liso arterial bovino
(BAEC/BASMC), pero es más sensible y no requiere explorar grandes
cantidades de líneas clonales para desarrollar un procedimiento
eficaz.
En este nuevo sistema, similar al sistema de
co-cultivo, la activación de
L-TGF-\beta1 sucede por varios
mecanismos independientes que implican la unión del complejo
latente a receptores de
manosa-6-fosfato/factor de
crecimiento-II tipo insulina
(M6P/IGF-II), trombospondina y/o transglutaminasa
tisular de tipo II. Pero, al contrario del sistema de
co-cultivo, este sistema dependiente de macrófagos
no parece implicar plasmina.
Usando este procedimiento, se identificaron
nuevos agentes anti-fibróticos potenciales, tales
como factor de crecimiento II de tipo insulina definido como
IGF-II, (usado por separado o en combinación con la
proteína-2 de unión al factor de crecimiento tipo
insulina (IGFBP-2) como vehículo de suministro),
inhibidores de transglutaminasa tisular de tipo II y agentes
anti-inflamatorios (tales como hidrocortisona).
Se ha propuesto un nuevo mecanismo de acción para
M6P en este documento que se basa en la regulación negativa del
receptor de M6P/IGF-II y el ARNm de
TGF-\beta1.
Figura 1. Se muestra la activación de
TGF-\beta1 por macrófagos.
Figura 2. Se muestra la expresión de ARNm para
TGF-\beta1 en macrófagos.
Figura 3. Se muestra la expresión de ARNm para
Transglutaminasa II tisular en macrófagos tratados con
hidrocortisona.
Se obtuvieron de Sigma Chemicals
D-manosa 6-fosfato,
alfa-D(+) manosa 1-fosfato (M1P),
monodansilcadaverina (DCA; sustrato competidor para
transglutaminasa tisular de tipo II, TGasa II), cistamina (inhibidor
dirigido de sitio activo de TGasa II),
putrescina-diclorhidrato, DMSO (óxido de dimetil
sulfóxido), LPS (lipopolisacárido) de Salmonella abortus equi,
ácido retinoico todo trans (RA) e hidrocortisona. La albúmina de
suero bovina (BSA)-libre de endotoxina se adquirió
de Calbiochem. Las soluciones madre de ácido retinoico e
hidrocortisona se prepararon en etanol. Las soluciones madre se
diluyeron en serie en medio de cultivo para producir una
concentración final del 0,5%. Esta concentración de etanol provocó
la producción o activación de TGF-\beta1. La
solución madre de monodansilcadaverina se preparó en DMSO. La
concentración final de DMSO (1:1000) usada en las condiciones
experimentales no tuvo efectos sobre la producción o activación de
TGF \beta (datos no mostrados). IGF-II humano
recombinante se adquirió de Bachem, Inc. Los anticuerpos
neutralizantes monoclonales frente al activador de plasminógeno
uroquinasa humano (uPA) se obtuvieron de American Diagnostica, Inc.
El anticuerpo neutralizante monoclonal
anti-trombospondina humana (clon I,A4.1) se adquirió
de Life Technologies. El TGF-\beta1 latente
humano recombinante (rHLTGF-\beta1) se obtuvo de R
& D Systems. La agarosa Sea Kem GTG era de FMC, Bio Products.
Los marcadores de tamaño de ARN, los marcadores Q X 174 DNA/Hae III
y el kit de ELISA para TGF-\beta1 se adquirieron
de Promega. La Transcriptasa Inversa SuperScript^{TM} II Rnase
H^{-} se obtuvo de Life Technologies. La ADN Polimerasa AmpliTaq
se obtuvo de Perkin Elmer Cetus. El kit de extracción de ARN RNeasy
se adquirió de Qiagen. Todos los medios de cultivo celular se
adquirieron de Life Technologies. El Suero Bovino Fetal (FBS) se
obtuvo de HyClone. Los macrófagos peritoneales de ratón
IC-21 transformados con SV-40,
fibroblastos dérmicos fetales humanos (1502), fibroblastos neonatos
humanos (43 SK) y una línea celular de adenocarcinoma de próstata
humana se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las
líneas celulares de melanoma humanas de Bowes y
HMB-2 se recibieron de Josef Bizik (Bratislava). Las
células del endotelio arterial bovino (BAEC) y las células del
músculo liso arterial bovino (BASMC) se obtuvieron de Cell
Application. Las IGFBP-1 y 2 (Proteína de Unión al
Factor de Crecimiento tipo Insulina) de rata purificadas se
obtuvieron de Dr. Beverly Peterkofsky (NIH, Bethesda,
MD).
MD).
Se mantuvieron macrófagos peritoneales
IC-21 de ratón transformados con
SV-40 en RPMI-1640 suplementado con
suero bovino fetal al 10%. Los cultivos se sembraron en placas de
100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC. El medio se
cambió a intervalos de 2 días. Se hicieron crecer fibroblastos
dérmicos fetales y neonatos humanos en DMEM suplementado con suero
bovino fetal al 10% en presencia de Hepes 6 mM, 50 I.U./ml de
penicilina y 50 mcg/ml de estreptomicina. Los cultivos se sembraron
en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC.
Las líneas celulares de melanoma humanas de Bowes y
HMB-2 se mantuvieron en medio esencial mínimo de
Eagle (MEM) suplementado con glutamina 2 mM, aminoácidos no
esenciales al 1%, FBS al 5% y antibióticos. Las células se
sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5%
a 37ºC. Las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata humanas
se hicieron crecer en Mezcla Nutriente F 12K suplementada con FBS
al 7%, se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en
CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células del endotelio arterial bovino se
mantuvieron en DMEM suplementado con CS al 10%, glutamina y
antibióticos. Las células de músculo liso se cultivaron en MEM alfa
suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina y antibióticos.
Se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al
5% a 37ºC.
Los procedimientos para la preparación de medios
condicionados se han descrito previamente (22). Brevemente, para el
experimento de retinoide, las células BAEC se hicieron crecer hasta
confluencia en placas de 35 mm. Los cultivos se aclararon con PBS
(Solución Salina Tamponada con Fosfato), y se incubaron en 1 ml de
DMEM libre de suero que contenía BSA al 0,1% y ácido retinoico (10
\muM) o vehículo (etanol al 0,5%). La incubación se realizó
durante 24 h. El medio se aspiró, las células se lavaron con PBS y
después se incubaron en 1 ml de DMEM/BSA al 0,1% durante 12 h
adicionales para producir medio condicionado. Los medios
condicionados se centrifugaron y usaron en el ensayo de ELISA para
la evaluación de TGF-\beta1.
Para experimentos de co-cultivo,
se sembraron BAEC y BASMC por separado en placas de 35 mm a una
densidad de 40 x 10^{4} células en DMEM/CS (Suero de Ternera) al
10% o 3,2 x 10^{5} BAEC y 0,8 x 10^{5} BASMC en las mismas
placas de 35 mm. Después de la unión celular (aproximadamente 2 h)
las células se aclararon con PBS y se incubaron en 1 ml de DMEM/BSA
al 0,1% durante 6 h para producir medios condicionados. Los Medios
Condicionados se centrifugaron y se usaron en el ensayo de
ELISA.
Se hicieron crecer células de melanoma (Bowes y
HMB-2) y de adenocarcinoma de próstata en placas de
100 mm hasta confluencia. Los medios se aspiraron, los cultivos se
lavaron con PBS y se aplicó medio libre de suero apropiado que
contenía BSA al 0,1% durante 24 h. Los medios se recogieron y se
almacenaron para su posterior evaluación de
TGF-\beta1 por ELISA.
Los macrófagos cultivados se quitaron de la placa
con 3 ml de PBS. El PBS se equilibró con 15 ml de
RPMI-1640 que contenía FBS al 10%. Las células se
contaron y después se sembraron en placas de 100 mm a 1 x 10^{6}
células/placa. Cuando los macrófagos cultivados alcanzaron
aproximadamente un 70% de confluencia (2-3 días) se
lavaron con PBS y se aplicaron medio RPMI-1640 que
contenía FBS al 5% y 10 ng/ml de LPS (Figura 1). Después de 24 h de
activación con LPS, las células se lavaron suavemente con PBS. En
este punto, el medio condicionado de los fibroblastos dérmicos
fetales confluyentes se recogió y se distribuyeron 5 ml en cada
placa que contenía macrófagos. Las células se incubaron durante 24
h adicionales, se recogieron los medios, se depositaron por
centrifugación a 600 x g durante 10 min y se almacenaron a 4ºC antes
de la evaluación de TGF-\beta1 por ELISA. Cada
condición se hizo por duplicado. Las células, lavadas con PBS, se
recogieron para una extracción de ARN total.
Los fibroblastos dérmicos fetales se sembraron en
placas de 100 mm a 1 x 10^{6} células/placa. Las células se
hicieron crecer hasta confluencia (2-3 días). Los
cultivos se lavaron con PBS y se aplicó medio fresco, DMEM
suplementado con FBS al 10% o medio AIM-V (un medio
libre de suero) para condiciones libres de suero durante 24 h
(Figura 1). El medio se recogió y se combinó para obtener una
combinación homogénea de TGF-\beta1 latente. La
recogida del medio se hizo justo antes de la aplicación en el ensayo
de macrófagos.
Para los experimentos en los que se
co-cultivaron macrófagos y fibroblastos fetales, los
dos tipos celulares se sembraron en placas de 100 mm a una densidad
de 1 x 10^{6} fibroblastos fetales y 0,8 x 10^{6} macrófagos.
Después de la unión celular (aproximadamente 2 h) las células se
aclararon con PBS y se incubaron en 10 ml de
RPMI-1640/FBS al 5%, +/-LPS durante 24 h para
producir medios condicionados. Los medios condicionados se
centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se usaron en el
ensayo de ELISA.
Se sembraron fibroblastos neonatos humanos en
placas de 100 mm a 1 x 10^{6} células/pocillo. Cuando las células
alcanzaron confluencia se lavaron con PBS y los cultivos se trataron
con diferentes concentraciones de M6P (1, 10, 50, 100, y 200
\muM) durante 24 y 48 h en condiciones libres de suero. Además,
las células se trataron con dos concentraciones de Manosa
1-Fosfato (M1P) (100 y 200 \muM) durante 24 y 48
horas. El ARN total se extrajo y se evaluó para la expresión de los
ARNm del receptor de M6P/IGF-II, el receptor de
TGF-\beta1 y de tipo I de
TGF-\beta por reacción en cadena de la polimerasa
con transcripción inversa semi-cuantitativa
(RT-PCR). Cada tratamiento se realizó por duplicado
y se realizaron análisis repetitivos.
Se realizaron ensayos ELISA usando un kit Promega
y se siguió el protocolo proporcionado por el fabricante. Se
diluyeron 1:4 ó 1:20 alícuotas de los sobrenadantes celulares que
contenían FBS al 10% para medir TGF-\beta1 activo
y total, respectivamente. Se ensayaron los medios condicionados
libres de suero sin diluir para TGF-\beta1 total
y diluidos 10 veces para TGF-\beta1 total. Cada
medida se realizó por duplicado. El desarrollo de color se controló
con el uso de un lector de microplaca (Molecular Devices) a 450
nm.
Las células se lavaron con PBS, seguido de la
adición del tampón de extracción proporcionado con el kit (kit de
extracción de ARN RNeasy). Las células lisadas se rasparon de la
placa y se recogieron en microtubos. Las muestras se congelaron a
-70ºC antes del análisis o se evaluaron directamente siguiendo el
protocolo del fabricante. Se midió la absorbancia a 260 nm y 280 nm
y se evaluó la integridad del ARN por geles de agarosa con
formaldehído desnaturalizante teñidos con bromuro de etidio.
El análisis de transferencia de Northern se
realizó como se ha descrito previamente (27). Brevemente, las
muestras de ARN total (5 \mug) se diluyeron en
formaldehído-tampón MOPS y se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa Sea Kem GTG al 1,2%
desnaturalizante junto con marcadores de tamaño de ARN. El ARN se
transfirió a una membrana de nitrocelulosa por transferencia
capilar. Las manchas de transferencia se prehibridaron durante 3 h
a 42ºC en una solución que contenía sulfato de dextrano al 10%,
solución de Denhardt 2 x, formamida al 50%, 5 x SSPE (cloruro
sódico 0,75 M, fosfato sódico 0,05 M, ácido
etilendiaminotetraacético 0,005 M)/SDS al 0,1%, y 250 \mug/ml de
ADN de testículo de salmón partido. La solución de hibridación fue
esencialmente la misma excepto en que se incluyó una sonda de ADN
marcada con ^{32}P dCTP y 150 \mug/ml de ADN de testículo de
salmón. La hibridación se realizó durante 16 h a 42ºC. Las etapas de
lavado después de la hibridación se realizaron del siguiente modo:
dos veces durante 15 min con 2 x SSC (cloruro sódico 0,75 M, citrato
sódico 0,075 M) a 65ºC, una durante 30 min con 2 x SSC/SDS al 0,1%
a 65ºC y uno durante 10 min con 0,1 x SSC a 65ºC. Las manchas de
transferencia se expusieron a una película de rayos X con pantallas
de intensificación durante 2 días a
-80ºC.
-80ºC.
La sonda usada para la hibridación se preparó por
Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa
(RT-PCR). El radiomarcaje de las sondas de ADNc se
realizó por traslado de mella como se ha descrito previamente
(27).
El procedimiento usado para transcribir el ARN
total se describió en detalle previamente (28). Brevemente, la
reacción se realizó en un volumen total de 25 \mul que contenía
tampón de transcriptasa inversa 1 x (Tris-HCl 50
mM, pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM), DTT 10 mM (Ditiotreitol),
2,5 mM de cada dNTP (Desoxinucleótidos), 100 \mug/ml de BSA
acetilada, 4 unidades de rRNasin (inhibidor de ribonucleasa), 200
unidades de Transcriptasa Inversa SuperScript^{TM} RNase H^{-},
0,1 \mug de oligo (dT)_{12-18} y 1 mg de
ARN total. La incubación se realizó durante 1 h a 42ºC y se terminó
por la adición de un volumen igual de agua fría.
Se usó una parte de la primera reacción de la
cadena de ADNc en PCR, que se realizó en 25 \mul que contenían
Tris-HCl 16 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, gelatina al 0,01%, 200 \muM de cada dNTP, 1 \muM de cada
oligonucleótido con sentido y antisentido y 2,5 unidades de ADN
polimerasa AmpliTaq. La amplificación se realizó durante 35 ciclos.
Cada ciclo constaba de: desnaturalización 1 min a 95ºC; hibridación
a 55ºC (óptimo para el par de oligonucleótidos usados) durante 2
min; y elongación a 72ºC, 3 min. Para el ciclo de elongación final
fue 7 min. Los productos de reacción se separaron por electroforesis
en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro
de etidio. Los tamaños se determinaron usando marcadores Q X 174
DNA/Hae III. Las digestiones con enzimas de restricción se
realizaron para confirmar la especificidad de los productos de PCR.
Se usó densitometría para análisis cuantitativo de los geles teñidos
con bromuro de etidio.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención sin, sin embargo, limitar la misma a los mismos.
Se demostrará que el modelo de la invención tiene
potencial como procedimiento rápido para explorar e identificar
agentes anti-fibróticos
(anti-cicatrizantes). Este sistema también será útil
para dilucidar los mecanismos implicados en la activación de
TGF-\beta1, y pueden aumentar el entendimiento de
la naturaleza de las interacciones entre
TGF-\beta1 y otras moléculas presentes en el medio
de una herida tal como trombospondina, IGF y TGasa II.
\newpage
Se ha informado de que BAEC tratadas con ácido
retinoico (RA) producen cantidades detectables de
TGF-\beta1 activo (19). Los experimentos
preliminares se realizaron para aplicar este procedimiento como
sistema de exploración para moléculas
anti-fibróticas. Sin embargo, se observó que incluso
células BAEC no tratadas producían TGF-\beta1
activo (Tabla 1). Esto podría explicarse por la heterogeneidad de la
población celular; es posible que una pequeña cantidad de células
contaminantes, es decir, células de músculo liso, contribuyeran a
este efecto. En presencia de RA o vehículo (etanol), las células
generaron cantidades similares de TGF-\beta1
activo (Tabla 1). La Manosa 6-Fosfato ha demostrado
bloquear la activación de TGF-\beta1 compitiendo
con la unión de TGF-\beta al receptor de
M6P/IGF-II (9). Sin embargo, cuando se ensaya a una
concentración de 100 mM en este sistema, M6P no tuvo efectos
inhibidores significativos, similares a M1P (Tabla 1). Estos
resultados indican que el procedimiento puede no ser suficiente
para evaluar moléculas anti-fibróticas.
Ejemplo Comparativo
2
Los experimentos preliminares se realizaron con
el objetivo de adoptar el sistema de co-cultivo
publicado para explorar agentes anti-fibróticos. Se
sabe que este sistema es dependiente de plasmina y ha demostrado
generar un 2-5% de TGF-\beta
activo (22). El co-cultivo de células del endotelio
arterial bovino y células del músculo liso arterial bovino generó
hasta un 8,2% de TGF-\beta activo (Tabla 1) medido
por ELISA. Uno de los problemas observados durante el
co-cultivo fue la muy baja reproducibilidad del
ensayo. Además, después de pocos pases, las células perdieron
completamente su capacidad de activar TGF-\beta1.
Esto no fue sorprendente ya que el co-cultivo
requiere la exploración de varios clones de células endoteliales y
del músculo liso para desarrollar un sistema eficaz. La Manosa
6-Fosfato, cuando se ensayó a 100 \muM, no inhibió
significativamente la activación de TGF-\beta1 en
este ensayo. Por lo tanto, se decidió no proceder más con este
sistema.
\vskip1.000000\baselineskip
Células | TGF-\beta1 activo (pg/ml) | TGF-\beta1 total (pg/ml) | % Activo |
BAEC solo | 274 | 3100 | 8,9 |
BAEC+ETOH | 315 | 3324 | 9,5 |
BAEC+RA (10 \muM) | 276 | 2667 | 10,3 |
BAEC+RA+M6P | 287 | 3544 | 8,1 |
BAEC+RA+M1P | 280 | 3686 | 7,6 |
Co-cultivo | 56 | 687 | 8,2 |
Co-cultivo+M6P | 58 | 770 | 7,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
BAEC-células del endotelio
arterial bovino
RA-ácido retinoico
M6P-manosa-6-fosfato
M1P-manosa-1-fosfato
Se ha demostrado que las células cancerosas,
tales como cáncer de mama humano, algunas líneas celulares de
melanoma y líneas celulares de adenocarcinoma de próstata, liberan
de manera constitutiva TGF-\beta1 biológicamente
activo en el medio de cultivo (24, 25, 29). Como el sistema de
cultivo celular homotípico sería de ventaja debido a su
simplicidad, se hizo un intento de aplicar células cancerosas como
procedimiento para la activación de TGF-\beta1.
Se demostró que la línea celular de melanoma de Bowes secretaba
TGF-\beta1 sustancialmente más activo que células
HMB-2 y el porcentaje de
TGF-\beta1 activo con relación al total, fue
aproximadamente del 29,3% y el 4,2%, respectivamente. Las células
de adenocarcinoma de próstata humanas produjeron
TGF-\beta1 menos activo que las líneas celulares
de melanoma (Tabla 2).
Células | TGF-\beta1 activo (pg/ml) | TGF-\beta1 total (pg/ml) | % Activo |
Melanoma de Bowes | 198 | 675 | 29,3 |
Melanoma HMB-2 | 46 | 1007 | 4,6 |
Células de Adenocarcinoma | 18 | 815 | 2,2 |
de Próstata Humanas |
\vskip1.000000\baselineskip
En contraste con el co-cultivo,
se demostró que M6P, DCA y anticuerpos
anti-trombospondina no tenían efecto sobre la
activación de TGF-\beta1 en células de melanoma o
de cáncer de próstata (Tabla 3). Estos resultados indicaron que la
activación de TGF-\beta1 sucedía
independientemente del receptor de M6P/IGF-II, TGasa
II o trombospondina.
Para determinar si la activación de
TGF-\beta1 por células cancerosas sucede de manera
intracelular o mediante procesamiento extracelular de
L-TGF-\beta1, se aplicaron medios
condicionados de fibroblastos fetales (fuente de
L-TGF-\beta1) a células de
melanoma. Sin embargo, no hubo activación adicional de
TGF-\beta1 que sugiriera que el mecanismo
intracelular, en lugar del extracelular, está implicado en el
procesamiento de la molécula latente (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Mecanismo | Tratamiento | % TGF-\beta1 Activo (STD) |
BOWES | ||
Receptor de M6P/IGF II | M6P 100 \muM | 113,5 (3,5) |
Transglutaminasa Tipo II | DCA 100 \muM | 145 (0,34) |
Trombospondina | Anti-Trombospondina dil 1:1500 | 85,9 (27) |
Activación extracelular | AIM-V/1502 | 94,1 (8,4) |
HMB-2 | ||
Receptor de M6P/IGF II | M6P 100 \muM | 108,4 (17,9) |
Transglutaminasa Tipo II | DCA 100 \muM | 110,7 (7,5) |
Trombospondina | Anti-Trombospondina dil 1:1500 | 97,2 (18,0) |
Activación extracelular | AIM-V/1502 | 90,9 (11,7) |
Células de adenocarcinoma | ||
Receptor de M6P/IGF II | M6P 100 \muM | 91,8 (8,5) |
Transglutaminasa Tipo II | DCA 100 \muM | 91,1 (3,0) |
Trombospondina | Anti-Trombospondina dil 1:1500 | 107,1 (8,6) |
\vskip1.000000\baselineskip
M6P-manosa-6-fosfato
DCA-dansilcadaverina
La observación de estudios previos de que
macrófagos tratados con LPS estaban expresando niveles más altos de
ARNm para TGasa II que células no tratadas indicó que estas células
pueden ser capaces de la activación de TGF-\beta1
por un mecanismo dependiente de TGasa II. Para ensayar esta
hipótesis, los macrófagos se trataron con LPS en presencia de
medios condicionados con fibroblastos fetales como fuente de
TGF-\beta1 latente. Se especuló que la adición de
TGF-\beta1 exógeno latente en este sistema puede
aumentar la sensibilidad del ensayo ya que el nivel de
TGF-\beta1 total producido por macrófagos es
relativamente bajo (644 pg/ml en presencia de FBS al 10%) en
comparación con el nivel observado de medios condicionados con
fibroblastos (1786 pg/ml).
Los macrófagos (MQ) secretaron
TGF-\beta1 predominantemente en forma latente
(Tabla 4). Cuando las células se trataron con LPS (MQ+LPS) el nivel
de TGF-\beta1 activo estuvo por debajo del límite
de detección de ELISA. De manera similar, el nivel de
TGF-\beta1 activo en medios condicionados de
fibroblastos fetales (FF-CM), tanto en presencia de
suero (FF-CM) como en medios libres de suero
(FF-CM SF) fue casi indetectable (7,2 y 5,7 pg/ml,
respectivamente). En contraste, aplicando medios condicionados con
fibroblastos a los macrófagos (MQ+FF-CM) se provocó
una inducción de 10 veces en el nivel de
TGF-\beta1 activo (Tabla 4). El tratamiento de
macrófagos con LPS antes de la incubación con medios condicionados
con fibroblastos provocó una activación adicional de
TGF-\beta1 (MQ+LPS+FF-CM).
La activación también sucedió en condiciones
libres de suero (MQ+FF-CM SF). Es interesante
observar que el pretratamiento con LPS no potenció la proporción de
activación de TGF-\beta1 (Tabla 4). Esto puede
indicar que los cofactores del suero son importantes en la
activación mediada por LPS.
Tratamiento | TGF-\beta1 activo (pg/ml) | |
MQ | No detectable | |
MQ+LPS | No detectable | |
FF-CM | 7,2 | |
MQ+FF-CM | 71,1 | |
MQ+LPS+FF-CM | 154 | |
FF-CM (SF) | 5,7 | |
MQ+FF-CM (sf) | 98,3 | |
MQ+LPS+FF-CM (SF) | 93,3 |
MQ-macrófagos
LPS-lipopolisacáridos
FF-fibroblasto fetal
FF-CM-medios
condicionados con fibroblasto fetal
SF-libre de suero
La sustitución en los medios con forma latente
recombinante purificada de TGF-\beta1 se ensayó en
un intento de determinar las necesidades para los medios
condicionados con fibroblastos en el ensayo de macrófagos. Sólo el
3,3% de rHLTGF-\beta1 se activó por macrófagos
cuando el tratamiento con LPS se omitió (Tabla 5). Cuando se
trataron los macrófagos con LPS antes de la exposición de
TGF-\beta1 latente, la activación fue más alta y
alcanzó el 12,2% (Tabla 5). Esto indica que la sensibilidad del
sistema de la invención podría manipularse por LPS y que las
cantidades de TGF-\beta1 latente usadas
inicialmente para la activación podrían titularse para efectos
máximos.
Tratamiento | TGF-\beta1 activo (pg/ml) | TGF-\beta1 total (pg/ml) | % activo |
Sin LPS, 200 pg/ml de rHLTGF-\beta1 | 10,9 (7,2) | 324 (7,2) | 3,3 |
LPS, 200 pg/ml de rHLTGF-\beta1 | 48,8 (3,5) | 399 (44,5) | 12,2 |
LPS-lipopolisacárido
rHLTGF-\beta1-TGF-\beta1
latente humano recombinante
El co-cultivo de macrófagos y
fibroblastos fetales provocó la activación de
TGF-\beta1. El nivel de
TGF-\beta1 activo fue de 16,0 pg/ml en macrófagos
no tratados con LPS y 14,4 pg/ml en macrófagos tratados con LPS,
respectivamente (Tabla 6). Como el nivel de
TGF-\beta1 activo fue relativamente bajo, este
sistema no se aplicó más.
Tratamiento | TGF-\beta1 activo (pg/ml) | TGF-\beta1 total (pg/ml) | % activo |
No tratado | 16,0 (1,4) | 2535 | 0,6 |
Tratado con LPS | 14,4 (0,2) | 2459 | 0,6 |
LPS-lipopolisacárido
Los experimentos descritos aquí caracterizan un
nuevo modelo in vitro para la activación de
TGF-\beta1 de la presente invención. El modelo
utiliza macrófagos transformados de ratón y su capacidad para
activar TGF-\beta1 latente suministrado con medio
condicionado con fibroblastos o como una forma latente recombinante.
El modelo de la invención ofrece varias ventajas sobre los sistemas
existentes. Hasta la fecha, el modelo de co-cultivo
fue el sistema más definido y caracterizado. Sin embargo, este
modelo de la invención ofrece sensibilidad más alta y es más eficaz
en términos de generación de TGF-\beta1 activo que
el sistema de co-cultivo. La concentración de
TGF-\beta1 activo presentada para el sistema de
co-cultivo es aproximadamente 15-50
pg/ml (22). Esto representa sólo un 2-5% del total
de TGF-\beta1 presente en medio condicionado de
co-cultivo (22). La cantidad de
TGF-\beta1 activo generada por macrófagos en el
procedimiento de la presente invención es hasta 10 veces más alta y
representa hasta un 12% del total de
TGF-\beta1.
El procedimiento de la presente invención es
simple y se basa en el cultivo celular homotípico. En contraste, en
el modelo de co-cultivo, deben estar presentes dos
tipos celulares y deben satisfacerse varios requisitos. Los tipos
celulares deben estar en contacto o en proximidad muy cercana para
producir TGF-\beta1 activo ya que el
co-cultivo de células endoteliales sobre una
superficie de 1-2 mm por encima de un monocapa de
células de músculo liso no logra producir
TGF-\beta1 activo (35). Parece que existe una
fuerte especificidad de especie ya que las células del endotelio
arterial bovino no activan TGF-\beta1 latente en
presencia de células de músculo liso humanas o de cerdo (36). La
sensibilidad de este procedimiento de la presente invención podría
manipularse ya que la fuente de TGF-\beta1
latente que se activa por macrófagos no se limita a medios
condicionados con fibroblastos.
El TGF-\beta1 latente
recombinante también se convirtió a la forma activa. Una desventaja
principal del sistema de co-cultivo es la ausencia
de reproducibilidad. Se necesita explorar grandes cantidades de
clones celulares BAEC y SMC para desarrollar un procedimiento
eficaz. Esto requiere el aislamiento de varios clones celulares y
posterior ensayo laborioso ya que las células, después de doblar
varias veces la población, necesitan remplazarse. En contraste, los
macrófagos transformados usados en la presente invención son capaces
de cultivo continuo y están fácilmente disponibles para análisis de
rutina.
Otra limitación del modelo de
co-cultivo es el hecho de que este sistema no logra
producir TGF-\beta1 activo en presencia de LPS en
el medio de cultivo tisular (37) obtenido del agua o suero de
ternera. Se informó de que el LPS encontrado en el medio de cultivo
tisular regulaba negativamente los niveles de ARNm para TGasa II y
TGF-\beta1 en células del endotelio arterial
bovino (37). Esto crea una necesidad de ensayar cada conjunto de
medio de cultivo tisular y suero para la presencia de LPS para
generar TGF-\beta1 activo. En contraste, la
presente descripción mostró que los macrófagos inducidos por LPS
expresaban niveles más altos de TGasa II que células no tratadas.
Esto puede indicar que LPS induce la activación de
TGF-\beta1 a través de la regulación positiva de
los niveles de TGasa II en macrófagos mientras que suprime la
activación de TGF-\beta1 regulando negativamente
TGasa II en células endoteliales. También es evidente que el
procedimiento de la presente invención es más versátil que el
sistema de co-cultivo.
Se hizo un intento para determinar si los
mecanismos implicados en la activación de
TGF-\beta1 son similares a los descritos para
co-cultivos de BAEC y BASMC. Se ensayaron varios
mecanismos alternativos, que implicaron el receptor de
M6P/IGF-II, TGasa II, trombospondina y mecanismos
dependientes de plasmina. Los resultados mostraron que, de manera
similar al co-cultivo, M6P a 100 y 50 \muM inhibió
la activación de TGF-\beta1 al 32,9% \pm 11,5 y
69,6% \pm 1,77 de niveles de control, respectivamente (Tabla 7).
Como se esperaba, M1P, que no se une al receptor de
M6P/IGF-II, no impidió esta activación (Tabla
7).
La dansilcadaverina (DCA), cuando se ensayó a 100
\muM, fue un inhibidor fuerte ya que el nivel de
TGF-\beta activo disminuyó al 18,3% \pm 1,55 de
niveles de control (Tabla 6). En contraste, la cistamina, que se
ensayó en combinación con M6P no mostró efecto aditivo sobre la
activación de TGF-\beta1 (Tabla 6).
La putrescina, a dos concentraciones diferentes
ensayadas (50 y 100 \muM), también tuvo algún efecto inhibidor ya
que TGF-\beta1 activo disminuyó al 33,4% \pm
28,8 y 80,6 \pm 15,5 de niveles de control, respectivamente. Es
interesante observar que la combinación de ambos, M6P y putrescina
(50 \muM y 100 \muM, respectivamente) no tuvo efecto inhibidor
aditivo sobre la activación de TGF-\beta1 (Tabla
7).
En contraste con el sistema de
co-cultivo, un anticuerpo frente al activador de
plasminógeno uroquinasa (uPa) ensayado a 400 ng/ml no mostró ningún
efecto en el procedimiento del ensayo de la presente invención
(Tabla 7). Esto indica que la plasmina no está implicada en la
activación de TGF-\beta1 en este modelo de la
invención. Por otro lado, un anticuerpo frente a trombospondina
inhibió la activación de TGF-\beta1 al 64,1% \pm
6,0 de control (Tabla 7) lo que sugirió que la trombospondina juega
un papel en esta activación.
\vskip1.000000\baselineskip
Tratamiento | % de Control (STD) | |
M6P 50 \muM | 69,6 (1,7) | |
M6P 100 \muM | 32,9 (11,5) | |
M1P 100 \muM | 85,9 (28,2) | |
Dansilcadaverina 100 \muM | 18,3 (1,6) | |
Putrescina 50 \muM | 33,4 (28,8) | |
Putrescina 100 \muM | 80,6 (15,5) | |
M6P 50 \muM+Putrescina 100 \muM | 57,4 (6,8) | |
M6P 50 \muM+Cistamina 100 \muM | 65,8 (11,3) | |
400 ng/ml de Anti-PA | 105,0 (4,8) | |
Anti-TSP dil 1:1500 | 64,1 (6,0) |
\vskip1.000000\baselineskip
M6P-manosa-6-fosfato
M1P-manosa-1-fosfato
Anti-PS-anticuerpo
frente al activador de plasminógeno
Anti-TSP-anticuerpo
frente a trombospondina
Los mecanismos implicados en la activación de
TGF-\beta1 en el procedimiento modelo de la
presente invención son similares a los descritos para el sistema de
co-cultivo o cultivo celular homotípico empleando
BAEC o queratinocitos tratados con RA. Un aspecto del mecanismo es
la interacción del complejo TGF-\beta latente con
el receptor de M6P/IGF-II ya que la presencia de
M6P en el ensayo de macrófagos, similar al sistema de
co-cultivo, bloqueó la conversión de
TGF-\beta1 latente a su forma activa. El segundo
mecanismo descrito en el sistema de co-cultivo
implicó Tgasa II tisular. Los resultados del procedimiento de ensayo
de la presente invención mostraron que la presencia de inhibidores
de esta enzima evitaba la generación de TGF-\beta1
activo lo que indica que TGasa II juega un papel en esta
activación. La interacción molecular de la trombospondina con
TGF-\beta1 latente es suficiente para provocar
actividad biológica en el sistema de co-cultivo. De
manera similar, en el procedimiento de la presente invención, los
anticuerpos frente a trombospondina provocaron una supresión
significativa de TGF-\beta1 activo que indica que
la trombospondina puede contribuir a la activación de la forma
latente. La plasmina ha demostrado ser necesaria para la activación
de TGF-\beta1 en el sistema de
co-cultivo. Los anticuerpos frente a uPA bloquearon
de manera eficaz la producción de TGF-\beta1
activo en co-cultivos, pero no fueron eficaces en
el procedimiento de ensayo de la presente invención. Esto indica que
los macrófagos pueden activar TGF-\beta1 por un
mecanismo independiente de actividad plasmina.
Los niveles totales de
TGF-\beta1 se evaluaron después de diferentes
tratamientos en el ensayo de macrófagos y fue evidente que el
TGF-\beta1 total no se vio afectado de manera
significativa por los diferentes tratamientos (Tabla 8).
Tratamiento | TGF-\beta1 total (STD) (pg/ml) |
LPS+CM | 2418,7 (246) |
M6P (100 \muM) | 2472,6 (374,5) |
DCA (100 \muM) | 2302 (219,3) |
LPS+CM (libre de suero) | 1454,9 (76,7) |
M6P 100 \muM | 1649,8 (71,7) |
LPS-lipopolisacárido
CM-medios condicionados
M6P-manosa-6-fosfato
DCA-dansilcadaverina
De manera similar, los niveles de ARNm para
TGF-\beta1 permanecieron igual independientemente
del tratamiento de los macrófagos con PBS, LPS solo o tratamientos
de LPS con M6P o DCA medido por transferencia de Northern (Figura
2).
Usando el procedimiento de ensayo de la presente
invención, se identificaron varias moléculas
anti-fibróticas potenciales nuevas. El efecto de
IGF-II sobre la activación de
TGF-\beta1 se investigó ya que la ocupación del
receptor de M6P/IGF-II con IGF-II
podría inhibir estéricamente la unión de M6P en LAP a este receptor.
Se demostró que IGF-II inhibía la activación de
TGF-\beta1. El efecto era específico ya que
IGFBP-1 fue capaz de invertir esta inhibición
compitiendo con el receptor celular para el ligando libre. Por otro
lado, IGFBP-2 no tuvo efecto sobre la acción de
IGF-II en este sistema. Esto concuerda con los
resultados de experimentos in vivo e in vitro previos
de que IGFBP-1 es un inhibidor más potente de las
funciones mediadas por IGF (32). Como IGFBP-2 no
impidió los efectos inhibidores de IGF-II sobre la
activación de TGF-\beta1, puede usarse como un
vehículo de suministro para IGF-II in vivo
protegiendo frente a la degradación de IGF-II
mientras que permite la acción de IGF-II.
Aunque IGF-II no fue eficaz a 5
nM, concentraciones más altas (15 y 30 nM) tuvieron un efecto
inhibidor dependiente de dosis sobre la activación de
TGF-\beta1 (Tabla 9). Además, se ensayaron
concentraciones en aumento de IGF-II (5 a 30 nM)
con concentración constante de M6P (50 \muM). Los resultados
demostraron que el efecto inhibidor óptimo se consiguió con 15 nM
de IGF-II (Tabla 9) y el nivel de
TGF-\beta1 activo disminuyó al 38,7% de control
(Tabla 9).
Tratamiento | % de control (STD) | |
IGF-II 5 nM | 105,6 (12,4) | |
IGF-II 15 nM | 65,1 (10,8) | |
IGF-II 30 nM | 54,3 (17,6) | |
IGF-II 5 nM+M6P 50 \muM | 62,2 (15,5) | |
IGF-II 15 nM+M6P 50 \muM | 38,7 (10,4) | |
IGF-II 30 nM+M6P 50 \muM | 51,4 (17,6) | |
M6P 50 \muM | 69,6 (1,7) |
IGF-II-factor de
crecimiento-II tipo insulina
M6P-manosa-6-fosfato
Como IGF-II existe en circulación
o en los tejidos como una forma compleja asociada a IGFBP (30, 31),
se ensayaron dos formas de bajo peso molecular de IGFBP,
IGFBP-1 y 2 para su capacidad de afectar a la acción
inhibidora de IGF-II. Cuando se ensayaron por
separado o en combinación con M6P, IGFBP 1 y 2 no mostraron ningún
efecto inhibidor significativo (Tabla 10). Sin embargo,
IGFBP-1, pero no IGFBP-2, fue capaz
de invertir el efecto inhibidor mediado por IGF-II
sobre la activación de TGF-\beta1. Estos
resultados se confirmaron cuando se ensayaron IGFBP 1 y 2 en la
combinación de IGF-II con M6P (Tabla 10). Estos
resultados están de acuerdo con los descubrimientos previos de que
IGFBP-1 es un inhibidor más potente de las funciones
\hbox{mediadas por IGF que IGFBP-2 (32).}
Tratamiento | % de control (STD) |
IGF-II (15 nM) | 65,1 (10,8) |
M6P (50 \muM) | 69,6 (1,7) |
IGFBP-1 (2 ng/ml) | 76,4 (8,7) |
IGFBP-2 (2 ng/ml) | 77,9 (4,5) |
IGFBP-1+M6P | 77,4 (2,4) |
IGFBP-2+M6P | 70,9 (0,5) |
IGFBP-1+IGF-II | 97,6 (11,8) |
IGFBP-2+IGF-II | 55,5 (9,3) |
IGFBP-1+IGF-II+M6P | 76,5 (14,9) |
IGFBP-2+IGF-II+M6P | 35,5 (27,3) |
IGF-II-factor de
crecimiento-II tipo insulina
M6P-manosa-6-fosfato
IGFBP-1-proteína
de unión-1 al factor de crecimiento tipo
insulina
IGFBP-2-proteína
de unión-2 al factor de crecimiento tipo
insulina
Como la curación de heridas fetales (sin
cicatriz) está asociada a reacción no inflamatoria en el sitio de
la herida, en oposición a la respuesta inflamatoria observada en la
curación de heridas en adultos (cicatrización) (33) se planteó la
hipótesis de que modulando el nivel de respuesta inflamatoria se
podría regular el nivel de TGF-\beta1 activo y
supuestamente la calidad de la cicatriz.
Se ensayaron los agentes
anti-inflamatorios en el procedimiento del ensayo de
la presente invención para su capacidad de modular los niveles de
activación de TGF-\beta1. Fue evidente que la
hidrocortisona a una concentración 1 \muM inhibió la activación
de TGF-\beta1 al 64,0% de control (Tabla 11).
Concentración | % de control (STD) | |
Hidrocortisona | 1 \muM | 64,0 (0,4) |
\vskip1.000000\baselineskip
En un intento de identificar el mecanismo de esta
inhibición, el nivel de ARNm se evaluó para TGasa II en macrófagos
tratados con hidrocortisona 1 \muM. El análisis densitométrico de
productos de RT-PCR (Figura 3) reveló que el nivel
de ARNm para TGasa II se redujo al 37,5% por este tratamiento.
Uno de los importantes descubrimientos de este
estudio es la acción anti-fibrótica potencial de
hidrocortisona. Como el tratamiento de macrófagos con este agente
reguló negativamente los niveles de ARNm de TGasa II, es posible
que la hidrocortisona ejerza su acción
anti-fibrótica a través de un mecanismo dependiente
de TGasa II. El uso in vivo de
anti-inflamatorios puede tener el valor añadido de
no sólo reducir el nivel de infiltrado inflamatorio, sino también
reducir los niveles acompañantes altos de factores de crecimiento
incluyendo TGF-\beta1 y afectar adicionalmente a
la formación de cicatriz.
El procedimiento de ensayo de la presente
invención demostró la reducción de TGF-\beta1
activo para varias clases de moléculas, incluyendo inhibidores de
TGasa II, M6P, IGF-II y el agente
anti-inflamatorio, hidrocortisona. La necesidad de
macrófagos en este nuevo ensayo permite la evaluación de agentes
anti-inflamatorios que representan importantes
terapias anti-cicatrizantes potenciales. La ausencia
de dichas células en el sistema de co-cultivo no
permitiría su uso para ensayar
anti-inflamatorios.
Además, se informa de un nuevo mecanismo de
acción para M6P en este documento. La regulación negativa del nivel
de ARNm sucede para el receptor de M6P/IGF-II y
TGF-\beta1 en fibroblastos cultivados después de
tratamiento con M6P. Además, la disminución en los niveles de ARNm
parece ser específica de isoforma ya que M1P no muestra dichos
efectos.
Se diseñaron experimentos adicionales con el
objetivo de caracterizar el modo de acción de M6P. Los estudios
iniciales han demostrado que los niveles de receptores de
M6P/IGF-II en las heridas tratadas con M6P se
regulaban negativamente 3 días después de hacerse la herida. Esto
puede proporcionar otro mecanismo por el que M6P puede ejercer su
función como inhibidor de la activación de
TGF-\beta1. La expresión de ARNm para el receptor
de M6P/IGF-II se evaluó en fibroblastos de seres
humanos neonatos tratados con varias dosis de M6P (1, 10, 50, 100 y
200 \muM) durante 24 y 48 horas. La expresión no se vio afectada
con 1-100 \muM de M6P después de 24 h de
tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con 200 \muM de M6P
provocó la regulación negativa del ARNm para el receptor (Tabla
13). Después de 48 h, se observó la disminución con
50-200 \muM de M6P (Tabla 13). Se observó una
regulación negativa similar cuando el nivel de ARNm de
TGF-\beta1 se investigaba después de tratamiento
con M6P. Por otro lado, el nivel de ARNm del receptor de tipo I de
TGF-\beta permanecía sin cambiar durante el
transcurso de tiempo de tratamiento. La Manosa
1-Fosfato, ensayada a las dos concentraciones más
altas (100 y 200 \muM), no mostró efectos sobre el receptor de
M6P/IGF-II ni los niveles de ARNm de
TGF-\beta1.
\vskip1.000000\baselineskip
M6P (\muM) | Receptor de M6P/IGF-II 24 h | 48 h | TGF-\beta1 24 h | 48 h |
1 | 98,4 (20,6) | 112,8 (21,4) | 80,9 (11,1) | 86,3 (15,9) |
10 | 86,1 (3,2) | 108 (7,1) | 116,2 (25,1) | 78,8 (26,5) |
50 | 74 (36,6) | 59,3 (1,4) | 119,3 (24,4) | 75 (42,4) |
100 | 85,4 (25) | 42,2 (3,2) | 95,6 (31) | 57,5 (15,9) |
200 | 57,5 (5,2) | 39,6 (1,3) | 62,5 (27,7) | 28,8 (23) |
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Claims (5)
1. Un procedimiento para identificar
moduladores de la formación de tejido cicatricial que comprende:
(a) incubar macrófagos estimulados con LPS con
una fuente exógena de TGF-\beta1 latente que
contiene un compuesto modulador; y
(b) medir la cantidad de
TGF-\beta1 activo producido por los
macrófagos.
2. El procedimiento de la reivindicación
1, en el que los macrófagos son macrófagos peritoneales
IC-21 de ratón transformados con
SV-40.
3. El procedimiento de acuerdo con
cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente del
TGF-\beta1 latente exógeno es un medio de cultivo
celular condicionado de fibroblastos fetales.
4. El procedimiento de la reivindicación
3, en el que el medio de cultivo celular contiene suero.
5. El procedimiento de la reivindicación
1 ó 2, en el que la fuente del TGF-\beta1 latente
exógeno es una forma latente recombinante de
TGF-\beta1.
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