DE69734894T2

DE69734894T2 - Testverfahren für antifibrotischen wirkstoff

Info

Publication number: DE69734894T2
Application number: DE69734894T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey C. Geesin; Anna Gosiewska
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2017-10-25
Also published as: AU740052B2; DE69734894D1; WO1998017304A1; CA2269711A1; JP2001511885A; ATE312620T1; EP0956036B1; AU6810798A; ES2253788T3; EP0956036A4; EP0956036A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β) ist ein wirksames, wachstumsregulatorisches Protein und ein Schlüsselmolekül, das mit verschiedenen fibrotischen (narbenbildenden) Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Die meisten Zellen sezernieren TGF-β1 in einer vorwiegend inaktiven Hochmolekulargewichtsform, latentes TGF-β (L-TGF-β). Latentes TGF-β ist aus einem aminoterminalen, Latenz-assoziierten Peptid (LAP) gebildet, das nichtkovalent mit dem Carboxyl-terminalen, reifen TGF-β assoziiert ist. Das Latenz-assoziierte Peptid ist an ein zweites, strukturell nicht verwandtes Protein über ein Disulfid gebunden, latentes TGF-β-Bindungsprotein (LTBP), das eine Rolle bei dem Prozessieren und bei der Sekretion des TGF-β 1 spielt (1).
Ein wichtiger Mechanismus der Regulation der TGF-β-Aktivität geschieht durch Faktoren, die das Prozessieren des Moleküls von der latenten zur biologisch aktiven Form kontrollieren. Physiochemische Aktivierung kann durch extreme Werte des pHs, Hitze, chaotrope Agentien (Natriumdodecylsulfat, Harnstoff) und Deglykosylierung (2, 3, 4, 5) eintreten. Die Aktivierung in vivo ist komplexer und nicht gut verstanden.
Zellvermittelte Aktivierung wurde zuerst mittels Co-Kulturen von Perizyten oder glatten Muskelzellen mit kapillaren Endothelzellen erreicht (6, 7). Dieses Verfahren erfordert die Interaktion von zwei Zelltypen derselben Spezies. Die Aktivierung wird offensichtlich durch Plasmin vermittelt, da die Aktivierung durch Plasmin/Serin-Proteaseinhibitoren geblockt wird (8). Es scheint, dass für die zelluläre Aktivierung die Bindung des latenten TGF-β an den Mannose-6-Phosphat/Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-II-Rezeptor (9) via Mannose-6-Phosphat-Moleküle, die auf der LAP-Komponente der latenten Form des TGF-β gefunden wurden (10), erforderlich ist. Tissue-Typ II Transglutaminase hat sich auch als ein Erfordernis für die Aktivierung dieses Zell-abhängigen Modells erwiesen, das funktionieren kann, um latentes TGF-β an Matrixmoleküle quer zu vernetzen (11). Die letzte Voraussetzung zur Aktivierung umfaßt das LTBP. Es ist vorgeschlagen worden, dass LTBP notwendig für die Konzentrierung des latenten TGF-β-Komplexes auf der Zelloberfläche ist, wo es nachfolgend Konzentrierung des latenten TGF-β-Komplexes auf der Zelloberfläche ist, wo es nachfolgend aktiviert wird, vermutlich durch tissue-Transglutaminase und/oder Plasmin (12). Drei unterschiedliche LTBPs sind identifiziert worden und kloniert worden (13–15), was auf einen möglichen Mechanismus hinweisen kann, bei dem Zellen die Interaktionen der latenten TGF-β-Komplexe mit spezifischen Gewebsstellen oder Zelltypen kontrollieren können. Zusätzlich gibt es Berichte über TGF-β-Aktivierung, die unabhängig von diesen Mechanismen durch Bindung des latenten Komplexes an Thrombospondin, ein an die extrazelluläre Matrix assoziiertes Glykoprotein (16, 17), stattfindet.
Obgleich L-TGF-β unter normalen Kulturbedingungen nicht aktiviert ist, außer wenn Co-Kulturen präpariert wurden, können Zellen in homotypischen Kulturen induziert werden, um aktives TGF-β durch den Einsatz von spezifischen Agentien zu bilden. Unter diesen Agentien sind Retinoide, die die Aktivierung des latenten TGF-β1 in Keratinozyten, Endothelzellen und Osteoklasten (18, 19, 20) induzieren. Retinoid-induzierte Aktivierung von TGF-β1 hängt von Plasmin (18, 19) ab. Anti-Östrogene (Tamoxifen oder Toremifin) induzieren die Produktion von aktiven TGF-β in fötalen Fibroblasten und Mammakarzinomzellen (21). Das Exponieren arterieller oder kapillarer Endothelzellen von Rindern gegenüber bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor) in vitro, resultierte auch in der Aktivierung des TGF-β, offensichtlich durch einen Plasmin-abhängigen Mechanismus (22). Kostochondrale Chondrozyten-Matrixvesikel der Wachstumszone waren fähig, latentes TGF-β, wenn es mit 1,25-Dihydroxy Vitamin D3 durch eine direkte Aktion des Vitamins auf die extrazelluläre Matrixvesikelmembran (23) inkubiert worden war, zu aktivieren. Zusätzlich gibt es Berichte, dass kleine Mengen von aktivem TGF-β1 in konditioniertem Medium von menschlichen Prostata-Epithelzellen (24) Melanoma-Zellinien (25) und Glioblastomazellen (26) nachgewiesen werden konnten. Jedoch ist der Mechanismus dieser Aktivierung nicht verstanden.
Bis heute ist keines der Systeme, die aktives TGF-β1 herstellen, als ein Screening-Modell für Agentien mit der möglichen Fähigkeit, die Latenz des TGF-β1 aufrechtzuerhalten, verwendet worden. Die Co-Kulturmethode ist ausführlich untersucht worden und die Mechanismen, die für die Aktivierung des TGF-β1 in diesem System verantwortlich sind, wurden aufgeklärt. Allerdings fehlt dieser Co-Kulturmethode die Reproduzierbarkeit und sie hat als eine wichtige Voraussetzung, eine große Anzahl von Zellklonen zu überprüfen, um ein effektives System herzustellen.
Das Ziel dieser Studien war es, ein neues in vitro-Modell zur TGF-β-Aktivierung zu entwickeln, zum nachfolgenden Überprüfen von Molekülen mit potentiellen Fähigkeiten, um mit ihrer Aktivierung zu interferieren. Da TGF-β sich als ein Schlüsselfaktor in der Narbenbildung und bei fibrotischen Erkrankungen gezeigt hat, könnte man erwarten, dass Agentien, die sich in solch einem Test aktiv gezeigt haben, anti-fibrotisch und anti-narbenbildend in vivo wirken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein neues Verfahren zum Überprüfen und Identifizieren von Modulatoren der Narbenbildung, wie z. B. anti-narbenbildende und anti-fibrotische Agentien, ist entwickelt worden. Dieses Verfahren bietet Simplizität, ist reproduzierbar und könnte übernommen werden, um eine große Anzahl von Modulatorverbindungen zu überprüfen, um neue potentielle anti-fibrotische Agentien zu identifizieren.
Dieses Verfahren hat Eigenschaften mit dem Co-Kultursystem der arteriellen Endothelzellen/arteriellen glatten Muskelzellen (BAEC/BASMC) von Rindern gemeinsam, aber es ist sensitiver und erfordert nicht das Überprüfen einer großen Anzahl von klonalen Linien, um ein effektives Verfahren zu entwickeln.
In diesem neuen System, ähnlich dem Co-Kultursystem, geschieht die Aktivierung des L-TGF-β1 durch verschiedene unabhängige Mechanismen, die die Bindung des latenten Komplexes an Mannose-6-Phosphat/Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-II (M6P/IGF-II) Rezeptoren, Thrombospondin und/oder tissue-Typ II Transglutaminase mit einschließen. Aber im Gegensatz zu dem Co-Kultursystem scheint dieses Makrophagen-abhängige System Plasmin nicht mit einzubeziehen.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden potentielle neue anti-fibrotische Agentien identifiziert, wie zum Beispiel Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Π, definiert als IGF-II, (einzeln verwendet oder in Kombination mit Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-II (IGFBP-2) als ein Zustellungsvehikel), tissue-Typ II Transglutaminase-Inhibitoren und anti-entzündliche Agentien (wie zum Beispiel Hydrokortison).
Ein neuer Wirkmechanismus für M6P ist hier vorgeschlagen worden, der auf der Herunterregulation des M6P/IGF-II-Rezeptors und der TGF-β1 mRNAs basiert ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Aktivierung des TGF-β1 durch Makrophagen ist gezeigt.
2. Die Expression der mRNA für TGF-β1 in Makrophagen ist gezeigt.
3. Die Expression von mRNA für tissue-Transglutaminase II in Makrophagen, die mit Hydrokortison behandelt sind, ist gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
MATERIALIEN
D-Mannose-6-phosphat, Alpha-D(+)-mannose-1-phosphat (M1P), Monodansylcadaverin (DCA; Substratkonkurrent für tissue-Typ II Transglutaminase, TGase II), Cystamin (aktiver zielgerichteter Inhibitor der TGaseII), Putrescin-dihydrochlorid, DMSO (Dimethylsulphoxid), LPS (Lipopolysaccharid) von Salmonella abortus aqui, all-trans-Retinsäure (RA) und Hydrokortison wurden von Sigma Chemicals besorgt. Rinderserumalbumin (BSA)-endotoxinfrei wurde von Calbiochem erworben. Stammlösungen der Retinsäure und des Cortisons wurden in Ethanol hergestellt. Stammlösungen wurden serienmäßig in Kulturmedium verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,5% zu erhalten. Diese Ethanolkonzentration hatte keinen Effekt auf die Herstellung oder Aktivierung des TGF-β1. Monodansylcadaverin-Stammlösung wurde in DMSO hergestellt. Die Endkonzentration des DMSO (1:1000), die in den experimentellen Bedingungen verwendet wurde, hatte keinen Effekt auf die TGF-β-Produktion oder Aktivierung (Daten nicht gezeigt). Rekombinantes menschliches IGF-II wurde von Bachem Inc. erworben. Monoklonaler neutralisierender Antikörper gegen menschlichen Urokinase Plasminogenaktivator (uPA) wurde von American Diagnostica, Inc., besorgt. Monoklonaler anti-menschlicher Thrombospondinneutralisierender Antikörper (Klon I, A4.1) wurde von Life Technologies erworben.
Rekombinantes menschliches latentes TGF-β1 (rHLTGF-β1) wurde von R&D Systems besorgt. Sea Kem GTG Agarose war von FMC, Bio Products. RNA-Größenmarker, QX 174 DNA/Hae III-Marker und TGF-β1 ELISA Kit wurden von Promega erworben. SuperScript^TM II RNase H Reverse Transkriptase wurde von Life Technologies besorgt. AmpliTaq DNA-Polymerase wurde von Perkin Elmer Cetus besorgt. Der RNeasy RNA-Extraktionskit wurde von Qiagen erworben. Alle Zellkulturmedien wurden von Life Technologies erworben. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von HyClone besorgt. Peritoneale Makrophagen IC-21 der Maus, transformiert mit SV-40, menschliche fötale dermale Fibroblasten (1502), menschliche neonatale Fibroblasten (43 SK) und die menschliche Prostata-Adenokarzinomzellinie wurden von der American Type Culture Collection besorgt. Die menschlichen Melanoma-Zellinien Bowes und HMB-2 kamen von Josef Bizik (Bratislava). Arterielle endotheliale Zellen (BAEC) von Rindern und arterielle glatte Muskelzellen (BASMC) von Rindern wurden von Cell Application erworben. Aufgereinigte Ratten-IGFBP-1 und 2 (Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein) wurden von Dr. Beverly Peterkofsky (NIH, Bethesda, MD) besorgt.
EXPERIMENTELLE METHODEN
Zellkultur
Peritoneale Makrophagen IC-21 der Maus, transformiert mit SV-40, wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, gehalten. Kulturen wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C wachsengelassen. Das Medium wurde nach Intervallen von 2 Tagen ausgetauscht. Menschliche fötale und neonatale dermale Fibroblasten wurden in DMEM wachsengelassen, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, in der Gegenwart von 6 mM Hepes, 50 I.U./ml Penicillin und 50 mcg/ml Streptomycin. Kulturen wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C wachsengelassen. Die menschlichen Melanoma-Zellinien Bowes und HMB-2 wurden in Eagle's Minimalem Essentiellen Medium (MEM) gehalten, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 5% FBS und Antibiotika. Die Zellen wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C wachsengelassen. Die menschliche Prostata-Adenomakarzinomzellinie wurde in F 12K Nutrient Mix, ergänzt mit 7% FBS, wachsengelassen, in 100 mm Kulturschalen ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C wachsengelassen. Rinderarterielle Endothelzellen wurden in DMEM gehalten, ergänzt mit 10% CS, Glutamin und Antibiotika. Glatte Muskelzellen wurden in alpha MEM kultiviert, ergänzt mit 10% Kälberserum, Glutamin und Antibiotika. Sie wurden in 100 mm Kulturschalen ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C wachsengelassen.
Herstellung von konditioniertem Medium (CM) von BAECs und BASMCs Die Verfahren zur Herstellung von konditioniertem Medium sind früher beschrieben worden (22). In Kürze, für das Retinoid-Experiment, wurden BAEC-Zellen bis zur Konfluenz in 35 mm Kulturschalen wachsengelassen. Die Kulturen wurden mit PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen und in 1 ml Serum-freiem DMEM, das 0,1 % BSA und Retinsäure (10 μM) oder Vehikel (0,5% Ethanol) enthielt, inkubiert. Die Inkubation wurde 24 Stunden durchgeführt. Das Medium wurde abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und dann in 1 ml DMEM/0,1 % BSA weitere 12 Stunden inkubiert, um konditioniertes Medium herzustellen. Die konditionierten Medien wurden zentrifugiert und in dem ELISA-Test zur TGF-β1-Evaluierung verwendet.
Für Co-Kulturexperimente wurden BAECs und BASMCs separat in 35 mm Kulturschalen bei einer Dichte von 40 × 10⁴ Zellen in DMEM/10% CS (Kälberserum) oder 3,2 × 10⁵ BAECs und 0,8 × 10⁵ BASMCs in denselben 35 mm Kulturschalen ausgesät. Nach Zellanhaftung (ungefähr 2 h) wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 1 ml DMEM/0,1% BSA 6 h inkubiert, um konditioniertes Medium herzustellen. Konditioniertes Medium wurde zentrifugiert, und in dem ELISA-Test verwendet.
Herstellung von konditioniertem Medium von Krebszellen
Melanomazellen (Bowes und HMB-2) und Prostata-Adenomakarzinomzellen wurden in 100 mm Kulturschalen bis zur Konfluenz wachsengelassen. Die Medien wurden abgesaugt, die Kulturen mit PBS gewaschen und geeignetes serumfreies Medium, das 0,1% BSA enthält, wurde 24 h appliziert. Die Medien wurden gesammelt und für die nachfolgende TGF-β1 Evaluierung durch ELISA aufbewahrt.
Makropliagen-Aktivierungstest
Aktivierung von Makrophagen mit Lipopolysacchariden (LPS)
Kultivierte Makrophagen wurden aus der Kulturschale mit 3 ml PBS herausgehoben. Das PBS war mit 15 ml RPMI-1640, das 10% FBS beinhaltet, abgeglichen worden. Die Zellen wurden gezählt und dann in 100 mm Platten bei einer Dichte von 1 × 10⁶-Zellen pro Kulturschale ausgesät. Sobald die kultivierten Makrophagen ungefähr 70% Konfluenz (2–3 Tage) erreicht hatten, wurden sie mit PBS gewaschen und RPMI-1640-Medium, das 5% FBS und 10 ng/ml LPS enthält, wurde verabreicht (1). Nach 24 h Aktivierung mit LPS wurden die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen. An diesem Punkt wurde konditioniertes Medium von konfluenten fötalen dermalen Fibroblasten gesammelt und 5 ml auf jede Kulturschale, die Makrophagen enthält, verteilt. Die Zellen wurden für zusätzliche 24 h inkubiert, das Medium gesammelt, bei 600 × g 10 min lang herunterzentrifugiert und vor der TGF-β1-Evaluierung durch ELISA bei 4°C gelagert. Jede Gegebenheit wurde im Duplikat durchgeführt. Die Zellen, mit PBS gewaschen, wurden für die Gesamt-RNA Extraktion geerntet.
Herstellung des konditionierten Mediums von fötalen dermalen Fibroblasten für den Makrophagen-Aktivierungstest
Fötale dermale Fibroblasten wurden in 100 mm Kulturschalen bei einer Dichte von 1 × 10⁶-Zellen pro Kulturschale ausgesät. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsengelassen (2–3 Tage). Die Kulturen wurden mit PBS gewaschen und frisches Medium, entweder DMEM, ergänzt mit 10% FBS, oder AIM-V-Medium (ein serumfreies Medium) für serumfreie Bedingungen, wurde für 24 h verabreicht (1). Das Medium wurde gesammelt und vereinigt, um einen homogenen Pool von latentem TGF-β1 zu erhalten. Das Sammeln des Mediums wurde genau vor der Verabreichung in dem Makrophagentest vorgenommen.
Co-Kultur- von Makrophagen und fötalen Fibroblasten
Für die Experimente, wo Makrophagen und fötale Fibroblasten co-kultiviert waren, wurden die zwei Zelltypen in 100 mm Kulturschalen bei einer Dichte von 1 × 10⁶ fötalen Fibroblasten und 0,8 × 10⁶ Makrophagen ausgesät. Nach Zellanhaftung (ungefähr 2 h) wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 10 ml RPMI-1640/5% FBS, +/– LPS für 24 h inkubiert, um konditioniertes Medium herzustellen. Die konditionierten Medien wurden wie oben beschrieben zentrifugiert und in dem ELISA-Test verwendet.
Behandlung von menschlichen neonatalen Fibroblasten mit Mannose-6-phosphat (M6P) Menschliche neonatale Fibroblasten wurden in 100 mm Kulturschalen bei einer Dichte von 1 × 10⁶-Zellen pro Kulturschale ausgesät. Sobald die Zellen Konfluenz erreichten, wurden sie mit PBS gewaschen und die Kulturen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von M6P (1, 10, 50, 100 und 200 μM) für 24 und 48 h unter serumfreien Bedingungen behandelt. Zusätzlich wurden die Zellen mit zwei Konzentrationen von Mannose-1-phosphat (M1P) (100 und 200 μM) für 24 und 48 h behandelt. Die gesamte RNA wurde extrahiert und auf Expression des M6P/IGF-II-Rezeptors, TGF-β1 und TGF-β-Rezeptortyp I mRNAs durch semiquantitative reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) getestet. Jede Behandlung lief in Duplikaten ab und wiederholende Analysen wurden durchgeführt.
ELISA für TGF-β1
ELISA-Tests wurden unter Verwendung eines Promega-Kits durchgeführt und das Protokoll, das von dem Hersteller zur Verfügung gestellt wurde, wurde befolgt. Aliquots der Zellüberstände, die 10% FBS enthalten, wurden 1:4 oder 1:20 für die Messung von jeweils aktiven und gesamten TGF-β1 verdünnt. Serumfreies konditioniertes Medium wurde unverdünnt auf aktives und 10mal verdünnt auf gesamtes TGF-β1 getestet. Jede Messung wurde in Duplikaten durchgeführt. Farbentwicklung wurde mit Hilfe eines Mikroplatten-Lesegerätes (Molecular Devices) bei 450 nm protokolliert.
Gesamt-RNA-Extraktion
Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe des Extraktionspuffers, der mit dem Kit (RNeasy RNA-Extraktionskit) zur Verfügung gestellt war. Die lysierten Zellen wurden von der Kulturschale abgekratzt und in Mikroröhrchen gesammelt. Proben wurden entweder bei –70° vor der Analyse eingefroren oder direkt unter Beachtung des Herstellerprotokolls bewertet. Absorption bei 260 und 280 mit wurde gemessen und die Intaktheit der RNA wurde durch denaturierende Formaldehyd-Agarosegele, die mit Ethidiumbromid angefärbt waren, ausgewertet.
Northern Blot Analyse
Northern Blot Analyse wurde wie früher beschrieben ausgeführt (27). In Kürze, GesamtRNA-Proben (5 μg) wurden in Formaldehyd-MOPS-Puffer verdünnt und einer Elektrophorese in einem denaturierenden 1,2% Sea Kem GTG-Agarosegel, zusammen mit den RNA-Größenmarkern, unterworfen. RNA wurde auf eine Nitrozellulosemembran durch Kapillartransfer transferiert. Die Blots wurden für 3 h bei 42°C in einer Lösung, die 10% Dextransulfat, 2 × Denhardt's Lösung, 50% Formamid, 5 × SSPE (0,75 M Natriumchlorid, 0,05 M Natriumphosphat, 0,005 M Ethylendiamintetraessigsäure)/0,1% SDS und 250 μg/ml gescherte Lachsspermien-DNA enthält, prähybridisiert. Die Hybridisierungslösung war im wesentliche die gleiche, mit Ausnahme, dass eine ³²P dCTP-markierte DNA-Probe und 150 μg/ml Lachsspermien-DNA mit inbegriffen war. Die Hybridisierung wurde 16 h bei 42°C durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden Waschschritte wie folgt durchgeführt: Zweimal 15 min mit 2 × SSC (0,75 M Natriumchlorid, 0,075 M Natriumcitrat) bei 65°C, einmal für 30 min mit 2 × SSC/0,1% SDS bei 65°C und einmal für 10 min mit 0,1 × SSC bei 65°C. Blots wurden einem X-Ray-Film mit intensivierenden Schirmen (intensifying screens) für 2 Tage bei –80°C ausgesetzt.
Die Probe, die für die Hybridisierung verwendet wurde, wurde durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) hergestellt. Radiomarkierung der cDNA-Proben wurde durch Nick-Translation, wie vorher beschrieben (27), durchgeführt.
Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion
Das Verfahren, das verwendet wird, um Gesamt-RNA zu transkribieren, wurde im Detail früher beschrieben (28). In Kürze, die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl, das 1 × reverse Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂), 10 mM DTT (Dithiothreitol), 2,5 mM jedes der dNTPs (Deoxynukleotide), 100 μg/ml acetyliertes BSA, 4 Einheiten der rRNasin (Ribonuklease-Inhibitor), 200 Einheiten der SuperScript^TM RNase H reverse Transkriptase, 0,1 μg oligo (dT)_12-18 und 1 μg der Gesamt- RNA enthielt, durchgeführt. Inkubation wurde 1 h lang bei 42°C durchgeführt und wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von kaltem Wasser beendet.
Ein Teil der ersten Strang-cDNA-Reaktion wurde bei der PCR verwendet, die in 25 μl, das 16 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 200 μM jedes dNTPs, 1 μM jeweils sense- und antisense-Oligonukleotide und 2,5 Einheiten der AmpliTaq-DNA-Polymerase enthielt, durchgeführt wurde. Amplifizierung wurde 35 Zyklen lang durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus: Denaturierung 1 min bei 95°C; Abkühlen lassen bei 55°C (optimal für das verwendete Paar von Oligonukleotiden) für 2 min; und Verlängerung bei 72°C, 3 min. Für den Endzyklus dauerte die Verlängerung 7 min. Reaktionsprodukte wurden durch 2%-ige Agarosegel-Elektrophorese separiert und durch Einfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Größen wurden unter Verwendung der Q X 174 DNA/Hae-III-Marker bestimmt. Restriktionsverdau wurde durchgeführt, um die Spezifität des PCR-Produktes zu bestätigen. Densitometrie wurde für die quantitative Analyse der Ethidiumbromid-gefärbten Gele verwendet.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung, ohne jedoch dasselbe dabei zu limitieren.
BEISPIELE
Es wird gezeigt, dass das erfinderische Modell das Potential eines schnellen Verfahrens zum Überprüfen und Identifizieren anti-fibrotischer (anti-narbenbildender) Agentien hat. Dieses System wird auch nützlich bei der Aufklärung der Mechanismen, die in der TGF-β1-Aktivierung involviert sind, sein und kann unser Verständnis über die Beschaffenheit der Interaktionen zwischen TGF-β1 und anderen Molekülen, die in dem Wundumfeld anwesend sind, wie zum Beispiel Thrombospondin, IGFs und TGase II, erhöhen.
Beispiel 1
BAEC behandelt mit Retinsäure (RA)
Es wurde berichtet, dass BAEC, behandelt mit Retinsäure (RA), nachweisbare Mengen von aktivem TGF-β1 herstellt (19). Vorläufige Experimente wurden durchgeführt, um dieses Verfahren als ein Screening-System für anti-fibrotische Moleküle einzuführen. Es wurde jedoch beobachtet, dass selbst unbehandelte BAEC-Zellen aktives TGF-β1 herstellten (Tabelle 1). Dies könnte durch die Heterogenität der Zellpopulation erklärt werden; es ist möglich, dass eine kleine Anzahl von kontaminierenden Zellen, z. B. glatte Muskelzellen, zu diesem Effekt beigesteuert haben. In der Gegenwart von RA oder Vehikel (Ethanol) erzeugten die Zellen ähnliche Mengen von aktivem TGF-β1 (Tabelle 1). Für Mannose-6-phosphat wurde gezeigt, dass es die Aktivierung von TGF-β1 blockiert, indem es mit TGF-β um die Bindung an den M6P/IGF-ll-Rezeptor konkurriert (9). Sobald es jedoch in diesem System bei einer Konzentration von 100 μM getestet wurde, zeigte M6P keine signifikanten hemmenden Effekte, ähnlich dem M1P (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren nicht ausreichend sein kann, um anti-fibrotische Moleküle zu ermitteln.
Vergleichendes Beispiel 2.
BAEC und BASMC Co-Kultursystem
Vorläufige Experimente wurden mit dem Ziel ausgeführt, das publizierte Co-Kultursystem zur Überprüfung anti-fibrotischer Agentien zu übernehmen. Dieses System ist dafür bekannt, Plasmin-abhängig zu sein und hat gezeigt, 2–5% aktives TGF-β zu erzeugen (22). In unseren Händen bildeten eine Co-Kultur von arteriellen Endothelzellen und arteriellen glatten Muskelzellen von Rindern bis zu 8,2% aktives TGF-β (Tabelle 1), wie mit ELISA gemessen. Eines der Probleme, die während der Co-Kultur beobachtet wurden, war die sehr niedrige Reproduzierbarkeit des Testes. Darüber hinaus verloren die Zellen nach einigen Passagen vollständig die Fähigkeit TGF-β1 zu aktivieren. Dies war nicht erstaunlich, da die Co-Kultur zur Entwicklung eines effektivien Systems das Überprüfen von verschiedenen Klonen der Endothel- und glatten Muskelzellen erfordert. Wenn Mannose-6-phosphat bei 100 μM getestet wurde, inhibierte es nicht signifikant die TGF-β1-Aktivierung in diesem Test. Daher wurde entschieden, nicht mit diesem System weiter fortzufahren. Tabelle 1
Tabellenabkürzungen:

BAEC

– arterielle Endothelzellen von Rindern

RA

– Retinsäure

M6P

– Mannose-6-phosphat

M1P

– Mannose-1-phosphat

Charakterisierung des TGF-β1 Aktivierungsweges durch Krebszellen
Es ist gezeigt worden, dass Krebszellen, wie zum Beispiel menschlicher Brustkrebs, einige Melanomazellinien und Prostata-Adenokarzinomzellinien biologisch aktives TGF-β1 konstitutiv in das Kulturmedium freisetzen (24, 25, 29). Da da homotypische Zellkultursystem wegen seiner Einfachheit von Vorteil sein würde, wurde ein Versuch gemacht, um Krebszellen für ein Verfahren zur TGF-β1-Aktivierung zu implementieren. Es wurde gezeigt, dass die Melanomzellinie Bowes substantiell mehr aktives TGF-β1 sezerniert als die HMB-2-Zellen und das der Prozentsatz von aktiven, relativ zu totalem TGF-β1, jeweils ungefähr 29,3% und 4,2% war. Menschliche Prostata-Adenokarzinomzellen stellten weniger aktives TGF-β1 her als Melanomazellinien (Tabelle 2). Tabelle 2. Aktivierung des TGF-β1 durch Krebszellen
Im Gegensatz zur Co-Kultur wurde gezeigt, dass M6P, DCA und anti-Thrombospondin-Antikörper keinen Effekt auf eine TGF-β1-Aktivierung in entweder Melanoma oder Prostata-Krebszellen hatte (Tabelle 3). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung des TGF-β1 unabhängig von M6P/IGF-ll Rezeptor, TGase II oder Thrombospondin stattfand.
Um zu bestimmen, ob die Aktivierung des TGF-β1 durch Krebszellen intrazellulär oder durch extrazelluläre Prozessierung des L-TGF-β 1 eintritt, wurde konditioniertes Medium von fötalen Fibroblasten (Quelle des L-TGF-β1) für Melanomazellen eingesetzt. Es gab jedoch keine weitere Aktivierung des TGF-β1, was darauf hinwies, dass eher der intrazelluläre als der extrazelluläre Mechanismus in die Prozessierung des latenten Moleküles verwickelt ist (Tabelle 3). Tabelle 3. Charakterisierung der TGF-β1-Aktivierung durch Melanoma- und Prostata-Adenokarzinomzellen
Tabelleanabkürzungen:

M6P

– Mannose-6-phosphat

DCA-Dansylcadaverin
TGF-β1-Aktivierung durch Makrophagen
Die Beobachtung von vorherigen Studien, dass LPS-behandelte Makrophagen höhere Spiegel von mRNA der TGase II exprimieren als unbehandelte Zellen, zeigte, dass diese Zellen zur Aktivierung des TGF-β1 durch einen TGase II-abhängigen Mechanismus fähig sein können. Um diese Hypothese auszutesten, wurden Makrophagen mit LPS in der Gegenwart von konditioniertem Medium fötaler Fibroblasten, als einer Quelle von latentem TGF-β1, behandelt. Es wurde spekuliert, dass das Zufügen von latentem exogenen TGF-β1 in dieses System die Sensitivität des Testes erhöhen kann, da der Spiegel von Gesamt-TGF-β1 der durch Makrophagen hergestellt wird, relativ niedrig ist (644 pg/ml in der Gegenwart von 10% FBS), verglichen zu dem Spiegel, der in Fibroblasten-konditioniertem Medium beobachtet wurde (1786 pg/ml).
Makrophagen (MQ) sezernierten TGF-β1 überwiegend in der latenten Form (Tabelle 4). Wenn die Zellen mit LPS (MQ + LPS) behandelt wurden, war der Spiegel an aktivem TGF-β1 unter der Nachweisgrenze des ELISA. Ähnlich war der Spiegel von aktivem TGF-β1 in konditioniertem Medium von fötalen Fibroblasten (FF-CM), sowohl in der Gegenwart von Serum (FF-CM) wie auch in serumfreien Medium (FF-CM SF) fast nicht nachweisbar (jeweils 7,2 und 5,7 pg/ml). Im Gegensatz dazu resultierte das Hinzufügen von Fibroblastenkonditioniertem Medium zu Makrophagen (MQ + FF-CM) in einer 10-fachen Induktion im Spiegel von aktivem TGF-β1 (Tabelle 4). Behandlung von Makrophagen mit LPS vor der Inkubation mit Fibroblasten-konditioniertem Medium resultierte in einer weiteren Aktivierung des TGF-β1 (MQ + LPS + FF-CM).
Die Aktivierung trat auch unter serumfreien Bedingungen ein (MQ + FF-CM SF). Interessanterweise verstärkte die Vorbehandlung mit LPS nicht die Aktivierungsrate des TGF-β1 (Tabelle 4). Dies kann daraufhinweisen, dass Serum-Co-Faktoren wichtig in der LPS-vermittelten Aktivierung sind. Tabelle 4. TGF-β1-Aktivierung durch Makrophagen
Tabellenabkürzungen:

MQ

– Makrophagen

LPS

– Lipopolysaccharide

FF

– Fötale Fibroblasten

FF-CM

– Fötale Fibroblasten-konditioniertes Medium

SF

– Serumfrei

Die Ersetzung mit der aufgereinigten rekombinanten latenten Form von TGF-β1 im Medium wurde in einem Versuch getestet, um die Voraussetzung für Fibroblasten-konditioniertes Medium in dem Makrophagen-Test zu bestimmen. Nur 3,3% von rHLTGF-βl wurde von Makrophagen aktiviert, wenn die Behandlung mit LPS ausgelassen wurde (Tabelle 5). Wenn Makrophagen mit LPS vor dem Kontakt mit TGF-β1 behandelt wurden, war die Aktivierung höher und erreichte 12,2% (Tabelle 5). Dies zeigt, dass die Sensitivität des erfinderischen Systems durch LPS beeinflusst werden könnte und dass die Mengen von latentem TGF-β1, die anfänglich für die Aktivierung verwendet wurden, für Maximaleffekte titriert werden könnten. Tabelle 5. Aktivierung des rHLTGF-β1 durch Makrophagen
Tabellenabkürzungen:

LPS

– Lipopolysaccharid

rHLTGF-β1

– rekombinantes humanes latentes TGF-β1

Co-Kultur von Makrophagen und fötalen Fibroblasten resultierten auch in der Aktivierung von TGF-β1. Der Spiegel von aktivem TGF-β1 war jeweils 16,0 pg/ml in LPS-unbehandelten und 14,4 pg/ml in LPS-behandelten Makrophagen (Tabelle 6). Da der Spiegel von aktiven TGF-β1 relativ niedrig war, wurde dieses System nicht weiter verfolgt. Tabelle 6. Aktivierung von TGF-β1 durch Co-Kulturen von Makrophagen und fötalen Fibroblasten
Tabellenabkürzungen:

LPS

– Lipopolysaccharide

Die hier beschriebenen Experimente charakterisieren ein neues in vitro Modell zur TGF-β1-Aktivierung der vorliegenden Erfindung. Das Modell verwendet transformierte Makrophagen der Maus und ihre Fähigkeit latentes TGF-β1 zu aktivieren, entweder mit Fibroblastenkonditioniertem Medium oder als eine rekombinante latente Form bereitgestellt. Das erfinderische Modell bietet verschiedene Vorteile gegenüber existierenden Systemen. Bis heute war das Co-Kulturmodell das am besten definierte und charakterisierte System. Jedoch bietet dieses erfinderische Modell höhere Sensitivität und ist effizienter in der Erzeugung von aktivem TGF-β1 als das Co-Kultursystem. Die Konzentration von aktivem TGF-β1, für das Co-Kultursystem berichtet, ist ungefähr 15 bis 50 pg/ml (22). Dies repräsentiert nur 2–5 % des Gesamt TGF-β1, das in dem Co-Kultur-konditioniertem Medium anwesend ist (22). Die Menge von aktivem TGF-β1, das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Makrophagen erzeugt wird, ist bis zu 10 mal höher und repräsentiert bis zu 12% des gesamten TGF-β1.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist einfach und ist auf der homotypischen Zellkultur basiert. Im Gegensatz dazu müssen in dem Co-Kulturmodell zwei Zelltypen anwesend sein und eine Anzahl von Voraussetzungen müssen erfüllt sein. Die Zelltypen müssen entweder in Kontakt sein oder in sehr enger Nachbarschaft, um aktives TGF-β1 zu produzieren, da das Co-Kultivieren von Endothelzellen auf einer Oberfläche 1–2 mm oberhalb eines Monolayers von glatten Muskelzellen scheitert, um aktives TGF-β1 herzustellen (35). Eine starke Spezies-Spezifität scheint zu existieren, da rinderarterielle Endothelzellen latentes TGF-β1 in der Gegenwart von menschlichen oder glatten Muskelzellen der Schweine nicht aktivieren (36). Die Sensitivität dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung könnte beeinflusst werden, da die Quelle von latenten TGF-β1, das von Makrophagen aktiviert wird, nicht auf Fibroblasten-konditioniertes Medium begrenzt ist. Rekombinantes latentes TGF-β1 wurde ebenso in die aktive Form überführt. Ein großer Nachteil des Co-Kultursystems ist das Fehlen der Reproduzierbarkeit. Eine große Anzahl von BAEC und SMC-Zellklonen muß überprüft werden, um ein effektives Verfahren zu entwickelt. Dies erfordert die Isolierung einer Anzahl von Zellklonen und nachfolgendes umständliches Testen, da die Zellen nach mehreren Populationsverdopplungen ersetzt werden müssen. Im Gegensatz dazu sind transformierte Makrophagen, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, fähig eine kontinuierliche Kultur zu bilden und sind ohne weiteres für Routine-Analyse verfügbar.
Eine andere Begrenzung des Co-Kulturmodelles ist die Tatsache, dass dieses System scheitert, aktives TGF-β1 in der Gegenwart von LPS in dem Gewebskulturmedium (37) abgeleitet aus Wasser oder Kälberserum, herzustellen. Es wurde berichtet, dass LPS, das in dem Gewebskulturmedium gefunden wurde, die mRNA-Spiegel für TGase II und TGF-β1 in rinderarteriellen Endothelzellen herunterreguliert (37). Dies schafft einen Bedarf jede Charge des Gewebskulturmediums und Serums auf die Gegenwart von LPS zu testen, um aktives TGF-β1 herzustellen. Im Gegensatz dazu zeigte die vorliegende Offenbarung, dass LPS-induzierte Makrophagen höhere Spiegel von TGase II exprimierten als unbehandelte Zellen. Dies kann daraufhinweisen, dass LPS die Aktivierung von TGF-β1 durch Hochregulation der TGase II-Spiegel in Makrophagen induziert, während es die Aktivierung des TGF-β1 durch Herunterregulierung der TGase II in Endothelzellen unterdrückt. Es ist auch offensichtlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung vielseitiger ist als das Co-Kultursystem.
Beispiel 3
Die Mechanismen der Aktivierung von TGF-β1 im Makrophagen-Test
Ein Versuch wurde gemacht, um zu bestimmen, ob die Mechanismen, die in der Aktivierung von TGF-β1 in dem Makrophagen-Test involviert sind, ähnlich zu denen sind, die für die Co-Kulturen von BAEC und BASMC beschrieben wurden. Mehrere alternative Mechanismen wurden ausgetestet, die die M6P/IGF-II-Rezeptor, TGase II, Thrombospondin und Plasminabhängige Mechanismen betrafen. Die Ergebnisse zeigten, dass ähnlich zur Co-Kultur, M6P bei 100 und 50 μM die TGF-β1-Aktivierung auf jeweils 32,9% ± 11,5 und 69,6% ± 1,77 der Kontrollspiegel inhibierte (Tabelle 7). Wie erwartet störte M1P, das nicht an dem M6P/IGF-II-Rezeptor bindet, diese Aktivierung (Tabelle 7).
Wenn Dansylcadaverin (DCA) bei 100 μM getestet wurde, war es ein starker Inhibitor, da sich der Spiegel an aktivem TGF-β auf 18,3% ± 1,55 der Kontrollspiegel (Tabelle 6) erniedrigte. Im Gegensatz dazu zeigte Cystamin, das in der Kombination mit M6P getestet wurde, keinen additiven Effekt auf die TGF-β1-Aktivierung (Tabelle 6).
Putrescin, das bei zwei verschiedenen Konzentrationen (50 und 100 μM) getestet wurde, hatte auch einen gewissen inhibitorischen Effekt, da sich aktives TGF-β1 jeweils auf 33,4% ± 28,8 und 80,6% ± 15,5 der Kontrollspiegel erniedrigte. Interessanterweise hatte die Kombination von beiden M6P und Putrescin (jeweils 50 μM und 100 μM) keinen additiven inhibitorischen Effekt auf die TGF-β1-Aktivierung (Tabelle 7).
Im Gegensatz zu dem Co-Kultursystem zeigte ein Antikörper gegen den Urokinase-Plasminogenaktivator (uPA), getestet bei 400 ng/ml, keinen Effekt in dem Verfahren des vorliegenden Erfindungtests (Tabelle 7). Dies zeigt, dass Plasmin in diesem erfinderischen Modell nicht in der Aktivierung von TGF-β1 involviert ist. Andererseits inhibierte ein Antikörper gegen Thrombospondin die TGF-β1-Aktivierung auf 64,1% ± 6,0 der Kontrolle (Tabelle 7), was daraufhinweist, dass Thrombospondin eine Rolle in dieser Aktivierung spielt. Tabelle 7. Inhibierung der TGF-β1-Aktivierung durch M6P, TGase II-Inhibitoren und anderes
Tabellenabkürzungen:

M6P

– Mannose-6-Phosphat

M1P

– Mannose-1-phosphat

Anti-PA

– Antikörper gegen Plasminogen-Aktivator

Anti-TSP

– Antikörper gegen Thrombospondin

Die Mechanismen, die in der Aktivierung von TGF-β1 in dem Modellverfahren der vorliegenden Erfindung involviert sind, sind ähnlich zu denen, die für die Co-Kultur oder das homotypische Zellkultursystem beschrieben wurden, die entweder BAEC oder Keratinozyten, behandelt mit RA, verwenden. Ein Aspekt des Mechanismus ist die Interaktion von latentem TGF-β-Komplex mit dem M6P/IGF-II-Rezeptor, da die Gegenwart von M6P in dem Makrophagentest, ähnlich zu dem Co-Kultursystem, die Umwandlung von latentem TGF-β1 in seine aktive Form blockierte. Der zweite Mechanismus, der in dem Co-Kultursystem beschrieben ist, involvierte Gewebe TGase II. Die Ergebnisse des Testverfahrens der vorliegenden Erfindung zeigten, dass die Gegenwart von Inhibitoren dieses Systems die Erzeugung von aktivem TGF-β1 verhinderten, was darauf hinweist, dass TGase II eine Rolle bei dieser Aktivierung spielt. Die molekulare Interaktion von Thrombospondin mit latentem TGF-β1 ist ausreichend, um eine biologische Aktivität in dem Co-Kultursystem hervorzurufen. Ebenso hatten in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Antikörper gegen Thrombospondin eine signifikante Unterdrückung von aktivem TGF-β1 zur Folge, wasdarauf hinweist, dass Thrombospondin zu der Aktivierung der latenten Form beitragen kann. Plasmin hat sich erwiesen für die Aktivierung von TGF-β1 in dem Co-Kultursystem erforderlich zu sein. Antikörper gegen uPA blockierten effizient die Herstellung von aktivem TGF-β1 in Co-Kulturen, aber waren ineffektiv in dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung. Dies zeigt, dass Makrophagen TGF-β1 durch einen von der Plasminaktivität unabhängigen Mechanismus aktivieren können.
Die Gesamt TGF-β1-Spiegel wurden nach verschiedenen Behandlungen in dem Makrophagentest berechnet und es war offensichtlich, dass Gesamt TGF-β1 nicht-signifikant durch die verschiedenen Behandlungen betroffen war (Tabelle 8). Tabelle 8. Die Konzentration von Gesamt TGF-β1 nach verschiedenen Behandlungen in dem Makrophagentest
Tabellenabkürzungen:

LPS

– Lipopolysaccharide

CM

– konditioniertes Medium

M6P

– Mannose-6-phosphat

DCA

– Dansylcadaverin

Ebenso blieben die Spiegel von mRNA für TGF-β1 die gleichen, trotz Behandlung der Makrophagen mit PBS, LPS alleine oder kombinierten Behandlungen von LPS mit M6P oder DCA, wie durch Northern Blot gemessen (2).
Beispiel 4
Testen von möglichen antifibrotischen Agentien in dem Makrophagentest
Unter Verwendung des Testverfahrens der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene neue potentielle antifibrotische Moleküle identifiziert. Der Effekt von IGF-II auf die TGF-β1-Aktivierung wurde untersucht, da die Besetzung des M6P/IGF-II-Rezeptors mit IGF-II die Bindung von M6P an LAP zu diesem Rezeptor sterisch inhibieren könnte. Es wurde gezeigt, dass IGF-II die TGF-β1-Aktivierung inhibierte. Der Effekt war spezifisch, da IGFBP-1 fähig war, diese Inhibierung durch Kompetition mit dem Zellrezeptor für den freien Liganden umzukehren. Andererseits hatte IGFBP-2 keinen Effekt auf die IGF-II-Aktion in diesem System. Dies stimmt mit den Ergebnissen von früheren in vivo- und in vitro-Experimenten überein, dass IGFBP-1 ein stärkerer Inhibitor der IGF-vermittelten Funktionen ist (32). Da IGFBP-2 nicht mit den IGF-II-inhibitorischen Effekten auf die TGF-β1-Aktivierung interferiert, kann es als ein Liefervehikel für IGF-II in vivo verwendet werden, in dem es gegen den IGF-II-Abbau schützt, wohingegen es die IGF-II-Wirkung erlaubt.

Während IGF-II bei 5 nM nicht effektiv war, hatten höhere Konzentrationen (15 und 30 nM) einen Dosis-abhängigen inhibitorischen Effekt auf die TGF-β1-Aktivierung (Tabelle 9). Zusätzlich wurden ansteigende Konzentrationen von IGF-II (5 bis 30 nM) mit konstanter Konzentration von M6P (50 μM) getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass ein optimaler inhibitorischer Effekt mit 15 nM IGF-II (Tabelle 9) erreicht werden konnte und der Spiegel von aktivem TGF-β1 auf 38,7% der Kontrolle (Tabelle 9) abnahm. Tabelle 9. Inhibierung der TGF-β1-Aktivierung durch die IGFs-Familie

Behandlung	% Kontrolle (STD)
IGF-II 5 nM	105,6 (12,4)
IGF-II 15 nM	65,1 (10,8)
IGF-II 30 nM	54,3 (17,6)
IGF-II 5 nM + 50 μM M6P	62,2 (15,5)
IGF-II 15 nM + 50 μM M6P	38,7 (10,4)
IGF-II 30 nM + 50 μM M6P	51,4 (17,6)

50 μM M6P

69,6 (1,7)

Tabellenabkürzungen:

IGF-II

–Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor II

M6P

– Mannose-6-phosphat

Da IGF-II in der Zirkulation oder innerhalb der Gewebe als eine komplexe Form mit IGFBPs (30, 31) assoziiert existiert, wurden zwei Niedermolekulargewichtsformen des IGFBPs, IGFBP-1 und 2 auf ihre Fähigkeit, die inhibitorische Wirkung des IGF-II zu beeinflussen, getestet. Wenn separat oder in Kombination mit M6P getestet, zeigten IGFBPs 1 und 2 keine signifikanten inhibitorischen Effekte (Tabelle 10). Jedoch war IGFBP-1 aber nicht IGFBP-2 fähig, den IGF-II-vermittelten inhibitorischen Effekt auf die TGF-β1-Aktivierung umzukehren. Diese Ergebnisse wurden bestätigt, wenn IGFBPs-1 und 2 in der Kombination von IGF-II mit M6P (Tabelle 10) getestet wurden. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den früheren Befunden, dass IGFBP-1 ein gröβerer Inhibitor der IGFs-vermittelten Funktionen ist als IGFBP-2 (32). Tabelle 10. Inhibierung der TGF-β1-Aktivierung durch IGF-II und IGFBPs 1 und 2
Tabellenabkürzungen:

IGF-II

– Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor II

M6P

– Mannose-6-phosphat

IGFBP-1

– Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein-1

IGFBP-2

– Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein-2

Da die fötale (narbenlos) Wundheilung mit keiner entzündlichen Reaktion an der Wundstelle verbunden ist, im Gegensatz zu der entzündlichen Reaktion die bei der erwachsenen (Narbenbildung) Wundheilung beobachtet wird (33), wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Modulieren des Grades der entzündlichen Reaktion den Grad von aktivem TGF-β1 regulieren könnte und vermutlich die Beschaffenheit der Narbe kontrollieren könnte. Antientzündliche Agentien wurden in den Testverfahren der vorliegenden Erfindung auf ihre Fähigkeit die Spiegel von aktivem TGF-β1 zu modulieren getestet. Es war offensichtlich, dass Hydrokortison bei einer Konzentration von 1 μM die TGF-β1-Aktivierung auf 64,0% der Kontrolle (Tabelle 11) inhibierte. Tabelle 11. Inhibierung des TGF-β1 durch Hydrokortison
In einem Versuch, den Mechanismus dieser Inhibierung zu identifizieren, wurde der Spiegel der mRNA für TGase II in Makrophagen, die mit 1 μM Hydrokortison behandelt worden waren, berechnet. Densitometrische Analyse der RT-PCR-Produkte (3) machte deutliche, dass der Spiegel der mRNA für TGase I durch diese Behandlung auf 37,5% reduziert wurde.
Eine der wichtigen Befunde dieser Studie ist die mögliche antifibrotische Wirkung von Hydrokortison. Da die Behandlung von Makrophagen mit diesem Agens die TGase I mRNA-Spiegel herunterregulierie, ist es möglich, dass Hydrokortison seine antifibrotische Wirkung durch einen TGase II-abhängigen Mechanismus ausübt. Die in vivo Verwendung von antientzündlichen Substanzen kann den zugefügten Wert haben nicht nur den Spiegel von entzündlichen Infiltraten zu reduzieren sondern auch die begleitenden hohen Spiegel von Wachstumsfaktoren, einschließlich TGF-β zu reduzieren und weiterhin die Narbenbildung zu beeinflussen.
Das Testverfahren der vorliegenden Erfindung wies die Reduktion von aktivem TGF-β1 durch verschiedene Molekülklassen nach, einschließlich TGase II-Inhibitoren, MGP, IGF-II und das anti-entzündliche Agens Hydrokortison. Der Bedarf an Makrophagen in diesem neuen Test erlaubt die Ermittlung von anti-entzündlichen Agentien, die wichtige potentielle anti-Narbentherapien darstellen. Das Fehlen solcher Zellen in dem Co-Kultursystem würde seine Verwendung, um anti-entzündliche Substanzen zu testen, nicht erlauben.
M6P-Anti-Narbenbildungsmechanismus
Zusätzlich wird hier über einen neuen Wirkmechanismus für MGP berichtet. Eine Herunterregulierung des mRNA-Spiegels geschieht für MGP/IGF-II-Rezeptor und TGF-β1 in kultivierten Fibroblasten nach der Behandlung mit M6P. Weiterhin scheint die Abnahme der mRNA-Spiegel isoform-spezifisch zu sein, da M1P solche Effekte nicht zeigte.
Es wurden weitere Experimente mit dem Ziel entworfen, die Wirkungsweise des MGP zu charakterisieren. Anfängliche Studien haben gezeigt, dass Spiegel an MGP/IGF-II-Rezeptoren innerhalb der Wunden, die mit MGP behandelt waren, drei Tage nach der Verwundung herunterreguliert waren. Dies kann einen anderen Mechanismus zur Verfügung stellen, bei dem MGP seine Funktion als ein Inhibitor der TGF-β1-Aktivierung ausüben kann. Die Expression für den MGP/IGF-II-Rezeptor wurde in menschlichen Fibroblasten von Neugeborenen, die mit verschiedenen Dosen von MGP (1, 10, 50, 100 und 200 μM) für 24 und 48 h behandelt worden waren, ausgewertet. Die Expression wurde mit 1–100 μM MGP nach 24 h Behandlung nicht beeinflusst. Jedoch resultierte die Behandlung mit 200 μM MGP in einer Herunterregulation der mRNA des Rezeptors (Tabelle 13). Nach 48 h wurde die Abnahme bei 50–200 μM MGP (Tabelle 13) beobachtet. Eine ähnliche Herunterregulation wurde beobachtet, wenn der Spiegel der TGF-β1 mRNA nach MGP-Behandlung untersucht wurde. Andererseits war der Spiegel der TGF-β1-Rezeptor Typ 1 mRNA während des Zeitverlaufes der Behandlung unverändert. Mannose-1-phosphat, bei den zwei höchsten Konzentrationen (100 und 200 μM) getestet, zeigte keine Effekte auf beide M6P/IGF-II-Rezeptor und TGF-β1 mRNA-Spiegel. Tabelle 13. Die Expression des M6P/IGF-II-Rezeptors und der TGF-β1 cDNAs in Fibroblasten von Neugeborenen, gemessen durch RT-PCR
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Claims

Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren der Narbengewebebildung, umfassend: (a) Inkubieren von LPS-stimulierten Macrophagen mit einer exogenen Quelle von latentem TGF-β1 enthaltend eine Modulatorverbindung; und (b) Messen der Menge von aktivem TGF-β1, hergestellt durch die Macrophargen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Macrophargen Maus peritoneale Macrophagen IC-21, transformiert mit SV-40, sind.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Quelle des exogenen latenten TGF-β1 ein konditioniertes Zellkulturmedium von fötalen Fibroblasten ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Zellkulturmedium Serum enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Quelle des exogenen, latenten TGF-β1 eine rekombinante latente Form von TGF-β1 ist.