CN114303061A - 调节细胞外基质移动 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法。此类调节剂可用于调节ECM向需要沉积ECM的部位，例如，伤口移动的方法中，从而允许治疗涉及ECM沉积的状况。由于所述调节剂可以是抑制剂或促进剂，因此可以通过本发明的装置和方法处理过量或不足的ECM沉积。

Description

调节细胞外基质移动
技术领域
本发明提供了方法，用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂。此类调节剂可用于调节ECM向需要沉积ECM的部位(例如伤口)移动的方法中，从而允许治疗涉及ECM沉积的状况。由于调节剂可以是抑制剂或促进剂，因此可以通过本发明的手段和方法处理过量或不足的ECM沉积。
背景技术
在哺乳动物中，当成纤维细胞的特殊群体迁移到伤口中，在伤口部位处局部沉积结缔组织基质的栓时，就会形成瘢痕1。伤口中产生瘢痕的成纤维细胞，即肌成纤维细胞的起源尚不清楚，因此，从广义上讲，其作用机制是2。肌成纤维细胞可能来自多种来源，如乳头状(上部)和网状(下部)真皮层3、周细胞4、脂肪细胞5-6，以及骨髓来源的循环单核细胞7。
尽管瘢痕是一个广泛研究的重大临床挑战，但瘢痕、肌成纤维细胞的起源以及其获得这种独特能力的机制仍然不清楚。事实上，当正常瘢痕形成失败时，结果要么是慢性伤口无法愈合，要么是瘢痕和纤维化加重8-10。受损的伤口和过度的瘢痕对患者和全球医疗系统来说是一个巨大的负担，仅在美国，每年就要花费数百亿美元。因此，了解这一基本的修补过程对于恢复和保护受损成人器官的正常功能至关重要。
之前已经证明，背部皮肤上的所有瘢痕都来自一个独特的成纤维细胞谱系，在胚胎发生12-13中表达Engrailed-1基因。这种细胞系不仅存在于皮肤中，而且也存在于皮下筋膜层中。皮下筋膜是一种凝胶状粘弹性膜状基质，在皮肤和身体下方的刚性结构之间形成无摩擦滑动界面。例如，在小鼠背部皮肤中，皮下筋膜是一个单个结缔薄片，由肉质盘状肌(PC)与皮肤分离，而在人类中，没有中间肌肉，皮下筋膜相对较厚，由几个与上部皮肤层连续的膜层组成。人类的面部层包括成纤维细胞、淋巴管、脂肪组织、神经血管片和神经元14-15。
瘢痕的主要成分是细胞外基质(ECM)。ECM的过度和不足沉积是不可取的，因为其可能分别导致纤维增生性疾病或慢性伤口。在现有技术中进行了许多尝试，以处理与瘢痕过程中ECM沉积过多或不足有关的医疗状况，但该过程仍不清楚，这阻碍了有益治疗选项的发展。因此，在瘢痕形成过多或不足的情况下，仍然需要提供进一步的治疗选项。
因此，需要满足在治疗瘢痕形成过多或不足时提供进一步选择的需要。
本发明解决了这一需求，并在治疗涉及ECM沉积的情况时提供了选项，例如过度或不足的瘢痕形成。这种情况可能是ECM在需要ECM沉积的场所过度沉积，也可能是ECM在需要ECM沉积的场所沉积不足。
发明内容
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法，包括
(a)用标签接触可通过从哺乳动物受试者活检获得的器官组织的细胞外基质；
(b)将所述标记的器官组织细胞外基质与感兴趣的化合物接触；
(c)与通过活检从未接触所述感兴趣的化合物的哺乳动物受试者获得的标记的器官组织细胞外基质相比，确定所述感兴趣的化合物是否调节ECM向所述需要沉积ECM的部位的移动，其中，对需要沉积ECM的所述部位的ECM运动的调节表明所述感兴趣的化合物是所述ECM运动的调节剂。
本发明还可包括如本文别处所述的方法，其中调节是抑制。
此外，本发明还可包括如本文别处所述的方法，其中调节是促进。
本文还设想了如本文别处所述的方法，其中所述器官组织包括筋膜基质、浆膜和/或外膜。
本发明还可包括如本文别处所述的方法，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
本发明还可包括如本文别处所述的方法，其中ECM包括蛋白质、多糖和/或蛋白聚糖。
本发明还包括本文别处所述的方法，其中标签为染料或标签。优选地，染料是荧光染料。
此外，本发明可包括本文别处所述的方法，其中细胞外基质成分的伯胺基团被标记。
本文还设想了如本文别处所述的方法，其中标签共价偶联到细胞外基质成分。
此外，本发明还可包括如本文别处所述的方法，其中，通过将所述细胞外基质与包括所述标签的纸质材料接触，可实现将所述哺乳动物受试者通过活检获得的器官组织的细胞外基质与标签接触。
本发明还可以设想本文别处定义的方法，其中在步骤(a)、(b)和/或(c)期间存在所述哺乳动物的体腔流体。
本发明还可包括本文别处所述的方法，进一步包括步骤(a'),将所述哺乳动物受试者通过活检获得的器官组织与包括在ECM中的可视化细胞标签接触。
本文中也可包括如本文别处所述的方法，其中器官组织来自皮肤、肾脏、肺、心脏、肝脏、骨、腹膜、肠、膈膜或胸膜。
根据第二方面，本发明涉及一种用于识别与细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动相关的生物标记物的方法，包括：
(a)用标签接触通过活检从哺乳动物个体获得的器官组织的细胞外基质；
(b)从所述标记的ECM中分离蛋白质，其向所述需要沉积ECM的部位移动；
(c)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列，从而将所述蛋白质识别为与ECM运动相关的生物标记物。
此外，根据第三方面，本发明涉及一种化合物，用于调节细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选用于治疗涉及ECM沉积的状况。
本发明还可包括如本文别处所述的用途的化合物，其中ECM运动由筋膜基质介导。
本发明还可包括如本文别处所述的用途的化合物，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
本发明还包括如本文别处所述的用途的化合物，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括成纤维细胞。
本文还设想了如本文别处所述的用途的化合物，其中ECM包括蛋白质、多糖和/或蛋白聚糖。
此外，本发明还可包括如本文别处所述的用途的化合物，其中需要沉积ECM的部位为伤口。
此外，本发明还可包括如本文别处所述的用途的化合物，其中调节是抑制。优选地，抑制ECM向需要沉积ECM的部位移动可防止ECM在所述部位过度沉积。更优选地，ECM过度沉积与纤维增生性疾病相关。
此外，本发明还可以设想如本文别处所述的用途的化合物，其中涉及ECM沉积的状况是ECM过度沉积。优选地，ECM过度沉积与纤维增生性疾病相关。
此外，本发明还可包括如本文别处所述的用途的化合物，其中调节是促进。优选地，促进ECM向需要沉积ECM的部位移动可防止ECM在所述部位沉积不足。更优选地，ECM沉积不足与慢性伤口相关。
本文还设想了如本文别处所述的用途的化合物，其中涉及ECM沉积的状况是ECM沉积不足。优选地，ECM沉积不足与慢性伤口相关。
此外，本发明还可包括本文别处所述的用途的化合物，其中所述化合物可通过识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法获得，如本文别处所述。
附图说明
图1：筋膜是伤口的主要细胞来源。a.嵌合移植物的示意图，用于确定真皮和筋膜对伤口的细胞贡献。b.伤口和伤口边缘总标记细胞(TdTomato+和GFP+)中TdTomato+或GFP+细胞百分比的量化。N＝从4个生物重复中分析的26个切片。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。c.伤口组织切片显示14dpw时皮肤来源的TdTomato+细胞(红色)和筋膜来源的GFP+细胞(绿色)。d-e.肌成纤维细胞(aSMA)、神经(TUBB3)、血管(PECAM1-CD31)、巨噬细胞(MOMA-2)和淋巴管(LYVE1)的免疫染色和贡献量化。虚线划出了伤口区域。箭头表示最初的受伤部位。标尺＝200微米。
图2：筋膜EPF侵入伤口决定瘢痕严重程度。a.使用嵌合移植物标记真皮或筋膜EPF的示意图说明。b.组织学图像与DAPI(蓝色)共染色，显示深部(顶部)或浅部(底部)损伤后，筋膜EPF(绿色，左侧)或真皮EPF(右侧)侵入伤口床。c.两种损伤情况下的伤口大小。N＝从5个生物复制品中分析的53和70个图像。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。d.两种损伤情况下的筋膜和真皮EPF数量。N＝27、32、27和22个来自5个生物复制的图像。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。e-f.来自筋膜(d)和真皮EPF(e)的伤口中EPF分数和伤口大小的XY图。皮尔逊相关，置信区间＝95％。虚线划破了伤口。标尺＝200微米。
图3：筋膜基质导向伤口。a.成人筋膜(左)和真皮(右)的三维渲染SHG(a)和SEM图像(b)，显示不同的基质纤维排列。c.散点图显示分形维数和空隙率值，分别用于评估SHG图像中纤维排列的复杂性和孔隙率。N＝5和3个分析图像。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。d.培养中3D渲染C57BL6/J新生儿筋膜活检的XY延时图像。在时间0(左)和30小时(右)显示筋膜基质运动的SHG(青色)和自体荧光(绿色)信号。线条显示时间上的长度减少。e.SHG和自体荧光通道追踪点的长度-时间图显示培养中筋膜基质明显收缩。f.原位筋膜基质标记的示意图说明。在WT小鼠背部皮肤损伤之前，皮下注射FITC NHS酯以标记筋膜基质。g.左：组织切片显示受伤后指定时间点的筋膜基质(FITC，绿色)和胶原+III+VI(品红)。右图：未受伤、3和5dpw时FITC信号的二次抽样分形维数图，以及14dpw时胶原信号的二次抽样分形维数图。h.伤口中总胶原I+III+VI信号的FITC信号覆盖量化。N＝从3个生物重复中分析的3、4、7和4个切片。单因素方差分析，Tukey多重比较。i.散点图，显示g中二次抽样地图的平均分维和空隙度值。箭头表示原始损伤部位。分隔筋膜室的线条。标尺＝30微米(a-b)、500微米(d)和200微米(g)。
图4：筋膜EPF介导瘢痕形成基质转向伤口。a.植入ePTFE膜以阻止筋膜放电进入伤口的示意图。b.植入ePTFE或假对照伤口的伤口闭合图(左)。伤口大小根据受伤后指定时间点拍摄的照片(右)确定。N＝3个生物重复。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。c.组织学显示DPW63处植入ePTFE(右)或假对照(左)的伤口。Masson三色染色(上图)和胶原(洋红)结合免疫标记(中)表明，筋膜参与伤口愈合过程是瘢痕形成的必要状况。伤口边缘的高倍图像(cI II，底部)显示存在多克隆真皮EPF(橙色、青色和红色)，不能在ePTFE膜顶部形成瘢痕组织。d.筋膜释放实验的示意图说明。e.筋膜释放或对照伤口的伤口闭合图(左)。伤口大小根据受伤后指定时间点拍摄的照片(右)确定。N＝从8个生物复制品中分析的8个图像。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。f.Masson的三色染色图像显示受伤后3、5和7天(从上到下)的伤口从筋膜释放(右侧)或对照伤口(左侧)显示筋膜释放延迟伤口愈合过程。g.R26iDTR新生儿部分筋膜细胞耗竭实验的示意图说明。将AAV6-Cre或AAV6-GFP对照病毒颗粒注射到两个伤口之间的皮肤中，然后每天全身暴露于DT中七天。h.Masson三色染色和荧光图像显示Cre转导(右)或对照GFP转导(左)小鼠的伤口7dpw。箭头表示绿色荧光蛋白阳性细胞。i.在这两种情况下，其厚度均为微米。N＝从3个生物重复中分析的4个和8个切片。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。j.在带有标记筋膜ECM的嵌合皮肤移植物中筋膜EPF耗竭的示意图描述。k.胶原(青色)免疫检测显示DT-(右侧)或载体对照移植物(左侧)伤口中的筋膜基质(洋红色)。l.Alexa Fluor 647信号覆盖量化证明筋膜EPF消融严重损害筋膜基质向伤口床的放电。N＝从3个生物重复中分析的6个切片。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。虚线分隔ePTFE膜的部位。虚线划出了伤口的边界。箭头表示最初的受伤部位。箭头表示DT治疗小鼠中剩余的标记筋膜基质。标尺＝50微米(cI和cII)、200微米(h)和500微米(c.f.h和k)。PC＝肉盘菌。
图5：瘢痕疙瘩起源于皮下筋膜。a-b.人体背部皮肤和腹部皮肤的宏观照片和马森三色染色，显示皮下脂肪中嵌入的筋膜层。箭头表示筋膜组织。c.分别对人背部皮肤筋膜、真皮和瘢痕疙瘩瘢痕冰冻切片进行CD26和CD44、NOV和a-SMa、FAP免疫染色。d.CD26、CD44、FAP和NOV信号的相对荧光强度。n＝4，采用Tukey检验的单因素方差分析，95％置信区间。e-f.En1Cre上NOV(CCN3，蓝色)的免疫染色；R26mTmG14 dpw瘢痕。g.NOV表达的相对荧光强度。n＝3个生物重复的6个图像，单因素方差分析，Tukey检验，95％置信区间。虚线和虚线分别分隔瘢痕和筋膜。标尺：2毫米(a-b)、50微米(c)和200微米(e-f)。
图6：浅筋膜对伤口愈合作用的模型。表面损伤通过经典的成纤维细胞迁移和从头基质沉积过程愈合。为了应对深度损伤，筋膜外肌(筋膜组织)由筋膜EPF引导进入伤口。筋膜来源的成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和周围神经迅速堵塞开放性伤口。筋膜基质经历最初的扩张，然后进行收缩和重塑，直到形成成熟的瘢痕。
图7：使用DiI染料追踪筋膜细胞。a.筋膜DiI标签示意图说明。b.伤口组织学显示未受伤对照组和14dpw中的DiI+(红色)细胞，与DAPI(蓝色)共染色。c.用DiI标记的筋膜细胞(红色)和间充质/成纤维细胞标记物ITGB1(CD29)、ER-TR7、THY1(CD90)和PDGFRA的阳性细胞部分(右侧)对伤口床进行免疫标记(绿色，左侧)。d.DiI+单核细胞/巨噬细胞(MOMA-2)、淋巴管(LYVE1)、内皮细胞(PECAM1/CD31)和神经(TUBB3)的免疫标记和部分。N＝从5个生物复制品中分析的4到5个图像。虚线划出了伤口的边界。标尺＝200微米。Ep＝表皮。PC＝肉盘菌。
图8：筋膜EPF穿过PC肌。a.成纤维细胞分析的门控策略。用选定的门(红线，见“方法”)对单组进行选通。b.筋膜和真皮中成纤维细胞(Lin-)和谱系阳性细胞的百分比N＝4个独立实验。双因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。c.筋膜和真皮中EPF(GFP+，Lin-)和ENF(TDF+，Lin-)种群的代表性散点图。d.筋膜与真皮中总EPF(GFP+，Lin-)和ENF(TDF+，Lin-)以及其它驻留细胞类型(e)部分的量化。N＝4个独立实验。双因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。e.从筋膜与真皮中的总细胞量化内皮细胞(CD31+)、淋巴管(Lyve1+)、巨噬细胞(F4/80+)和神经细胞(CD271+)部分。N＝3个技术复制品，来自一窝窝。双因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。f.3D渲染En1Cre的XZ视图(左)和XY横截面(右)；R26mtmg成人筋膜。g.三维渲染En1Cre的XY视图；R26mTmG新生儿背部皮肤。在筋膜(腹侧)朝上的情况下进行成像，以显示离散解剖部位的拓扑多样性。h.前肢连接处前方部位的XYZ鸟瞰图(顶部)和YZ横截面(底部)，显示存在穿过皮肤-肌肉层的EPF(箭头)。i.中胸廓水平肌肉断裂处的XY视图，显示两个部位的EPF。j.En1Cre的三维渲染XY视图图像；R26VT2/Gk3新生儿背部皮肤，位于神经穿过的肌肉开口处。EPF通过所有皮肤层保持其多克隆状态。布罗肯线划定了PC肌肉层。k.三维渲染En1Cre的XY视图(顶部)和XZ(下方)横截面；R26mTmG成人浅表伤口(3dpw)。在表皮(背侧)朝上的情况下进行成像，以显示来自PC肌肉下方的筋膜EPF。虚线划出表皮。标尺＝1500微米(g)、100微米(f.i-j)和500微米(k)。PC＝肌束，v＝血管，nb＝神经束。
图9：筋膜和真皮EPF在稳定状况下保持其部位，伤口中的筋膜EPF在长期内得到清除。a.未损伤状况下真皮与筋膜EPF嵌合体的示意图描述。b.筋膜(左)或真皮(右)EPF的组织学图像追踪嵌合体。c.来自筋膜EPF的瘢痕追踪(绿色)嵌合体，CD26(红色)免疫标记，与DAPI(蓝色)共染色，以应对70dpw的深度损伤。d.来自筋膜-(左)或真皮-(右)EPF的伤口追踪(绿色)嵌合体，以响应14dpw时的浅(下)或深(上)损伤。切片用DAPI(蓝色)和半胱天冬酶3免疫染色(红色)共同染色。e.对Cas3阳性的筋膜或真皮衍生EPF(GFP+)部分进行量化。数值表示为伤口床或真皮或筋膜控制区域中总标记细胞(GFP+)的百分比。N＝从5个生物复制品中分析的图像。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。线划出筋膜和真皮之间的边界。虚线划出了伤口床或瘢痕。标尺＝200微米。
图10：损伤时筋膜EPF表达并下调主要伤口成纤维细胞标记物。a.皮肤与筋膜EPF的示意图描述追踪了两种损伤情况下的嵌合体。b-f.针对成纤维细胞标记物DPP4(CD26，b)、DLK1(c)、CD24(d)、CD34(e)和LY6A(SCA1，f)的免疫标记。g.标记物阳性EPF量化分析区域(顶部)(底部)。标记物阳性细胞的比例在筋膜中的筋膜EPF中较高，但在伤口中的筋膜EPF中降低，表明迁移到伤口后表达降低。N＝从4个生物复制品中分析的5个图像。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。虚线划出了伤口的边界。标尺＝200微米。
图11：筋膜和真皮成纤维细胞成纤维细胞标记物的流动细胞计量分析。a.成纤维细胞门控策略(Lin-，见“方法”)分析。b.筋膜或真皮来源成纤维细胞中成纤维细胞标记物表达的组织图。c.总成纤维细胞群中标记物阳性细胞的百分比。双尾T检验，置信区间＝95％。d.上图：成纤维细胞的门控策略(Lin-，见“方法”)和筋膜ENF和-EPF的代表性散点图。分类后的GFP+EPF用于后续抗体标记。下图：代表性散点图，显示筋膜EPF中Sca1和PDGFR1以及CD26和CD29的表达。
图12：筋膜而非真皮基质引导进入伤口。a.嵌合皮肤移植中筋膜基质标记的示意图描述。与之前一样分离R26VT2/GK3背部皮肤样本的筋膜活检，并与Alexa Fluor 647 NHS酯孵育，以荧光标记基质。将基质标记的筋膜与R26mtmg小鼠背部皮肤碎片结合，并像之前一样进行表面损伤。b.左：组织学显示筋膜细胞(绿色)、筋膜基质(品红)和皮肤细胞(红色)。右图：青色通道显示针对I、III和VI型胶原的联合免疫标记，以描绘伤口7dpw中的总胶原含量。c.Alexa Fluor 647信号覆盖率——在规定的时间点对伤口中的总胶原I+III+VI信号进行量化。N＝从3个生物重复中分析的4个和9个切片。非配对双尾T检验，置信区间＝95％。d.伤口14dpw显示筋膜细胞(绿色)、筋膜基质(洋红)、皮肤细胞(红色)，以及针对I、III和VI型胶原(青色)的联合免疫标记。e-f.“d”中插入物的高倍图像，显示基质标签在伤口床(e)中减少，但在筋膜(f)的较深区域中没有减少。g.深部损伤真皮EPF追踪嵌合体中双基质标记的示意图描述。h.7个dpw伤口的组织学显示真皮EPF(绿色)、筋膜基质(品红)、真皮基质(青色)和TDF(红色)。筋膜基质移位并堵塞开放性伤口，允许真皮细胞迁移至伤口。i.深部损伤筋膜EPF追踪嵌合体中双基质标记的示意图描述。j.14个dpw伤口的组织学显示筋膜EPF(绿色)、筋膜基质(品红)、真皮基质(青色)和TDF(红色)。真皮基质保持不变，筋膜基质重塑。k.表面损伤真皮中双基质标记的示意图-EPF追踪嵌合体。l.14个dpw伤口的组织学显示真皮EPF(绿色)、筋膜基质(洋红色)、真皮基质(青色)、TdTomato(红色)和胶原+III+VI(白色)。表面损伤通过重新沉积而不是真皮基质移位来愈合。虚线划出了伤口的床。箭头标记了最初的受伤部位。连续的线条划出表皮真皮边缘。标尺＝500微米(b)、100微米(d-f)和200微米(h、j和l)。
图13：筋膜基质内的凝固级联形成焦痂。a-b.从显示筋膜基质向成熟瘢痕基质转变的二次抽样图中得出的平均分维(a)和空隙率(b)图。N＝5、5、8和3张从三个生物复制品分析的图像。单因素方差分析，Tukey检验。置信区间＝95％。c.左：组织学切片显示受伤后指定时间点的筋膜基质(FITC，绿色)、SELP(红色)和DAPI(蓝色)。右：定义时间点的SELP(白色)信号。血小板浸润并在筋膜基质内被激活。表面凝结的血小板簇与筋膜基质一起形成焦痂。箭头表示最初的受伤部位。分隔筋膜室的线条。标尺＝200微米。
图14:ePTFE膜植入物不会产生慢性炎症反应。a.CD45(绿色)免疫染色和DAPI(洋红)反染色在7个dpw假手术和ePTFE植入伤口中。在ePTFE膜的早期时间点显示免疫细胞的更高渗透性。b.CD45阳性细胞占切片总细胞的比例。N＝3，从3个生物重复中分析3个切片。双尾学生T检验，置信区间＝95％。c.MOMA-2(红色)、TNFa(绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色用于7和63dpw epTFE植入伤口。在存在ePTFE膜的情况下显示出类似数量的单核细胞/巨噬细胞和TNFa表达。d-e.切片中总细胞中MOMA-2阳性单核细胞/巨噬细胞的分数(d)和TNFa信号的平均灰度值(e)。N＝从3个生物重复中分析的3、3、3和3个切片。单因素方差分析，Tukey检验，置信区间＝95％。f.在7个dpw假手术和ePTFE植入伤口中对SELP(绿色)和DAPI(洋红)进行免疫染色。显示即使在存在ePTFE膜的情况下也会发生凝固。g.SELP信号的平均灰度值。N＝3，从3个生物重复中分析3个切片。双尾学生T检验，置信区间＝95％。布罗肯线界定了ePTFE膜。标尺＝200微米和100微米(插入)。
图15:EPF消融而非筋膜中的增殖抑制抑制体外基质导向。a.与En1Cre的DAPI(洋红)共染色的胶原I、III和VI(绿色)的免疫标记；用DT或溶媒对照在针刺治疗后第0天和第6天进行R26iDTR活检。b.胶原密度量化定义为总截面积中的胶原面积。N＝从3个生物复制品中分析的3个图像。双因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。c.细胞密度量化定义为细胞数(DAPI)除以胶原面积。N＝从3个生物复制品中分析的图像。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，置信区间＝95％。d.3D渲染的En1Cre的XY延时图像；用DT治疗1小时的培养物中的R26iDTR新生儿筋膜活检。0小时(左)、15小时(中)和25小时(右)的SHG(青色)和自体荧光(绿色)信号显示EPF消耗后ECM缺乏运动。直线显示SHG通道中两个跟踪点之间的距离。e.SHG跟踪点的长度-时间图和DT治疗或对照样品的自荧光通道。f.培养后2天，对用足叶乙甙治疗的筋膜活检中的Ki67(绿色)和DAPI(洋红)进行免疫染色。g.Ki67阳性细胞占切片总细胞的比例。N＝从2-3个生物重复中分析的3、3、3和2个切片。单因素方差分析，Tukey多重比较，置信区间＝95％。h.3D渲染C57BL6/J新生儿筋膜活检的XY延时图像，用培养物中100mM依托泊苷治疗。在时间0(左)和35小时(右)显示筋膜基质运动的SHG(青色)和自体荧光(绿色)信号。线条显示时间上的长度减少。i.对照组和治疗样本的SHG通道追踪点的长度-时间图显示，在没有细胞增殖的情况下，培养中筋膜基质明显收缩。j-k.25小时后的总收缩(e)和成像前25小时的平均基质速度。双尾学生T检验。置信区间＝95％。标尺＝50微米(f)、200微米(a和h)和500微米(d)。
图16：细胞增殖通过筋膜基质转向进行伤口堵塞。a.原位筋膜基质标记和EdU脉冲的示意图说明。b.左：组织学切片显示受伤后指定时间点的筋膜基质(FITC，绿色)、EdU(红色)和DAPI(蓝色)。右：定义时间点的EdU(白色)信号。c.伤口中EdU阳性细胞占全部EdU阳性细胞的比例。N＝从3个生物重复中分析的3、4、6和4个切片。单因素方差分析，Tukey多重比较。箭头表示EdU阳性细胞核。箭头表示最初的受伤部位。分隔筋膜室的线条。标尺＝200微米。
图17：触发损伤后ECM的体内运动。刷牙是为了模拟腹膜表面的损伤。ECM根据本发明进行标记。刷牙后9小时和72小时，监测ECM的移动。ECM向刷牙部位移动，模拟受伤。
图18：本发明用于识别细胞外基质(ECM)运动调节剂的方法的示例性实施例的示意性概述。
图19：触发损伤后ECM的体内运动。ECM被贴上标签，并监测其向受伤方向移动。显示肝脏、肺、肾、心脏和腹膜。
图20：存在ECM运动调节剂时对ECM运动的体内影响。在肝组织内产生损伤，施用一种潜在的调节剂，监测ECM运动。GM6001(MMP抑制剂)、1400W(iNOS抑制剂)、LY255283(白三烯B4受体拮抗剂)和组织蛋白酶G抑制剂(组织蛋白酶G抑制剂)用作具有抗纤维化表型的调节剂。此外，Elastial(弹性蛋白酶抑制剂)被用作具有促纤维化表型的调节剂。
图21：通过SCAD分析筛选1280种化学品。(a)SCAD检测方案和第5天SCAD组织的组织学图像；(b)26种化学物质的组织学图像显示异常瘢痕效应(抗瘢痕或促瘢痕)，瘢痕严重程度有明显趋势，标尺50μm；(c)26种化学物质的分形维数和孔隙率分析表明，从抗瘢痕化学物质到促瘢痕化学物质，具有明显的高孔隙率和低复杂度的趋势；(d)26次化学攻击的摘要。
图22：筋膜萌芽和织带的特征。(a)从第0天到第4天筋膜成纤维细胞迁移的动态变化，标尺100μm；(b)En1cre的Ki67染色；从第0天到第4天，R26mTmG筋膜组织，标尺50μm；(c)(d)筋膜成纤维细胞迁移的萌芽和织带特性的卡通插图；(e)En1cre的屏幕截图和跟踪轨迹；R26第2天至第5天筋膜实时成像，标尺100μm；(f)En1cre的屏幕截图和跟踪轨迹；R26mCherry第7天至第9天筋膜实时成像，标尺100μm
图23：重新测试筋膜侵入试验中的26种化学品。(a)26种化学物质入侵指数；(b)筋膜浸润试验中26种化学物质的单细胞图像，瘢痕条10μm
图24：前三种抗瘢痕化学物质的代表性全套组织图像。其表现出较低的侵袭指数，细胞结缔减少，细胞形态异常，标尺为100μm，20μm。
图25：通过hedgehog途径的抗瘢痕形成作用。(a)使用抗瘢痕化学治疗降低筋膜组织中Gli1蛋白的表达；(b)使用抗瘢痕化学治疗减弱筋膜组织中aSMA的表达；(c)和(d)使用抗瘢痕化学治疗降低ki67的表达，增加caspase3的表达；标尺50μm。
图26：抗瘢痕化学物抑制筋膜在皮肤中的活动性。
图27：抗瘢痕化学品抑制体内瘢痕形成。
图28：筋膜浸润试验的特征。
(a)从第0天到第4天筋膜生长的Brightfield图像。箭头表示细胞入侵的距离；(b)En1cre的屏幕截图和跟踪轨迹；R26第1天至第2天筋膜实时成像，标尺为100μm；(c)第0天至第4天筋膜离体培养的侵袭指数和收缩指数的动态变化；(e)(f)移植筋膜成纤维细胞的出芽和织带行为。
图29：筋膜浸润试验的特征。
(a)En1cre的截图；R26mCherry第2天至第5天筋膜活体显像显示细胞在迁移过程中增殖；(b)En1cre的截图；R26mTmG第2天至第5天筋膜活体成像显示两个细胞彼此之间的结缔距离，标尺为50μm
图30：浅表损伤诱导器官范围的基质动员。
a)NHS-FITC标记显示肝脏、腹膜和盲肠的表面ECM结构。三个生物复制品的代表性图像SHG：二次谐波产生。标尺：15μM。显示NHS-FITC穿透深度的组织学切片的代表性免疫荧光图像。标尺：10μM。b)局部电穿孔损伤模型中肝表面ECM的贴片介导命运追踪。c)肝表面基质在损伤反应时流动。电穿孔后24小时小鼠肝脏的立体显微镜图像与未受损对照组比较。三个生物复制品的代表性图像。标尺概述：2000μM；高倍镜：100μM。d)流体基质在肝表面伤口愈合过程中重组。电穿孔后24小时和14天肝脏的典型H&E组织学和多光子图像。标尺概述：50μM；高倍镜：15μM.e)贴片介导的腹膜表面命运追踪和刷牙局部损伤显示30分钟后周围纤维成分(NHS-FITC+)进入伤口区域(NHS-AF568+)的运动。三个生物复制品的代表性立体显微镜图像。标尺概述：1000μM；高倍镜：100μM。f)腹膜表面基质流剖腹闭合反应。剖腹术后1分钟和24小时小鼠腹膜的立体显微镜图像。三个生物复制品的代表性图像。标尺概述：2000μM。g)流体基质电流流到伤口持续三天。指定时间点后肝脏和腹膜伤口裂解物的FITC强度，n＝三个生物重复。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，95％可信区间。h)流体基质采用网状结构关闭腹膜剖腹闭合术。三个生物复制的典型H&E组织学和多光子图像。标尺概述：50μM；高倍率：15μM。
图31：流体基质在伤口中转化为刚性框架。
a)贴片介导的体内交联分析概述(参见方法)。b)增加链霉亲和素下拉样品的FITC强度表明，随着时间的推移，肝创伤中的交联作用逐渐增强。n＝三个生物重复。单因素方差分析，多重比较Tukey检验，95％可信区间。c)四周大的腹膜(AF568+)和盲肠(FITC+)器官融合。n>三个生物复制的代表性图像。d)4周龄粘连患者腹膜和盲肠间基质融合。免疫标记显示腹膜胶原1在盲肠修复中的作用。n>三个生物复制的代表性图像。e)腹膜基质融合肝脏并流到表面。n>三个生物复制的代表性图像。标尺：50μM。f)器官基质组分之间的交联在两周后开始。盲肠：NHS-FITC。腹膜：NHS EZ-LINK生物素。n＝三个生物重复。
图32：流体基质为组织修复提供了许多原始成分。
a)基于蛋白质组学的流体基质系统鉴定工作流程。b)流体基质来源于多器官的深度和层次。c)流体基质组分主要由胶原和ECM糖蛋白组成。d)流体基质中单个蛋白质的丰度因器官而异。e)肝脏的流体基质遗传了促再生、腹膜流体更多促纤维化成分。分类基于uniport条目。f)肝流体基质蛋白与代谢调节有关，而腹膜和宫颈流体成分与纤维化反应有关。
图33：中性粒细胞直接基质流
a)肝电穿孔后细胞群的可视化。b)肝细胞群在肝电穿孔时表现出不同的ECM表面受体表达模式。c)快速迁移的细胞群上调了有限数量的表面受体基因。d)Lyz2Cre穿越方案；Ai14转基因小鼠系，Lyz2+细胞表达dTomato。e)扩展视频7的快照显示Lyz2+细胞在肝脏表面转运基质元素。箭头高亮显示单个单元格。三个生物复制品的代表性图像。标尺：50μM。f)成群的Lyz2+细胞聚集FITC+流体基质。三个生物复制品的代表性图像。标尺：50μM。g)Lyz2+细胞以非吞噬形式运输FITC+流体元素。三个生物复制品的代表性图像。标尺：5μM。h)FITC+流体基质元素的聚集富含Ly6g+阳性细胞。三个生物复制品的代表性免疫标记图像。标尺：5μM。i)流体基质流由Ly6g+阳性细胞介导，可通过局部应用脂蛋白进行指导。三个生物复制品的代表性立体显微镜。标尺：500μM。j)中性粒细胞在损伤时上调CD11b、CD18和NOS反应。k)靶向抑制中性粒细胞ECM受体、群集介质和NOS应激酶阻断肝电穿孔后的流体基质流动。n＝4单因素方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间，***，p＝0.0001。
图34：手术后纤维粘连源自流体基质元素
a)小鼠和人类腹部手术后粘连组织切片的代表性免疫荧光图像。小鼠腹腔用NHS-AF568盲肠标记NHS-FITC，术后4周处死小鼠。标尺：20μM。
图35：器官损伤调节中性粒细胞上的CD11b和CD18
a)肝损伤期间单个细胞群与总数的百分比。b)肝损伤期间细胞群的时间依赖性丰度。c)肝电穿孔后细胞丰度的可视化。d)活化中性粒细胞群的亚群。e)活化的中性粒细胞在损伤后表现出持续较高的CD11b和CD18表达。
图36：中性粒细胞协调腹膜基质运动
a)转基因小鼠系的杂交方案；Lyz+细胞表达dTomato。b)扩展视频7的快照显示Lyz2+细胞通过腹膜表面运输基质元素。箭头高亮显示单个单元格。三个生物复制品的代表性图像。标尺：50μM。c)成群的Lyz2+细胞在腹膜表面聚集FITC+流体基质。三个生物复制品的代表性图像。标尺：概述：500μM；高倍镜：50μM。d)器官损伤后24小时，大多数Lz2阳性细胞携带FITC+元素。单因素方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间。***，p＝0.0001。e)腹膜上聚集的FITC+流体基质元素富含Ly6g+阳性细胞。三个生物复制品的代表性免疫标记图像。标尺：5μM。f)靶向抑制中性粒细胞ECM受体、群集介质和NOS应激酶阻断腹膜损伤后流体基质流动。n＝4单因素方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间，***，p＝0.0001。
图37：基质流支持再生和瘢痕形成
a)肝电穿孔装置中的治疗方案概述(见方法)。b)抑制流体基质内流导致肝电穿孔部位的伤口愈合受损。三个>＝生物复制的代表性免疫荧光图像。标尺：50μM。单向方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间，***，p＝0.0001。c)腹膜宫颈设置中的治疗方案概述(见方法)。d)治疗方案抑制腹膜和宫颈损伤部位的基质流动，n>＝4个生物重复。电穿孔后7天，FITC-NHS标记的肝脏组织切片的代表性免疫荧光图像。标尺：50μM。单因素方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间。e)抑制基质流动可阻断体内粘附形成，n>＝3个生物复制。FITC-NHS组织切片的代表性免疫荧光图像显示腹膜损伤后5天。标尺：100μM。单因素方差分析，Dunnett多重比较，95％置信区间，***，p＝0.0001。
图38：NHS指导的伤口区域标记
a)实验装置方案。小鼠肝脏电穿孔。第2天，进行NHS罗丹明腹膜内注射或对照PBS注射。30分钟后，收获器官。b)肝脏的典型立体显微镜图像。
图39：生物标志物发现的工作流程。
a)胸膜内注射NHS酯后，安装博莱霉素。14天后采集器官和血液。b)博莱霉素安装14天后NHS-FITC标记小鼠肺的组织切片。c)提取14天后用博莱霉素治疗的小鼠肺脏中鉴定的蛋白质。d)提取博莱霉素14天后在小鼠血液中发现的蛋白质。
图40：基质运动
(a)设置的图片。肝和腹膜组织损伤后局部标记。24小时后采集器官，裂解伤口部位，测量FITC量。b)对抑制剂实验进行定量。n＝4。
图41：细胞外基质命运追踪显示肺损伤期间间质基质浸润
(A)胸膜基质命运追踪设置的工作流程。小鼠胸膜内注射N-羟基琥珀酰亚胺-异硫氰酸荧光素(NHS-FITC)标记混合物，两周后采集肺。(B)表面基质在2周内保持稳定。小鼠肺的光片图像(n＝6)。标尺：500μM。(C)胸膜基质命运追踪显示细胞外基质池。小鼠肺表面的多光子图像(n＝6)。标尺：100μM(概述)和15μM(高放大率)。(D)博莱霉素诱导损伤模型的工作流程。小鼠胸膜内注射NHS-FITC标记混合物。第二天注入博莱霉素，两周后收获肺部。(E)(F)博莱霉素损伤后胸膜表面基质深入间质。博莱霉素损伤后两周小鼠肺的光片显微镜和组织学图像(n＝6)。统计比较采用非配对t检验。标尺：整个器官500μM，组织学500μM(概述)和15μM(高倍)。(G)间质纤维化斑块充满浸润的基质。博莱霉素损伤后两周小鼠肺的H&E和荧光图像(n＝6)。统计比较采用非配对t检验。标尺：100μM。(H)胸膜基质池耗尽博来霉素诱导的损伤。博莱霉素损伤后两周小鼠肺表面的多光子图像(n＝3)。标尺：100μM(概述)和15μM(高放大率)。
图42：免疫细胞协调流体瘢痕运动
(A)小鼠体外流体瘢痕追踪分析的工作流程。(B)与免疫细胞孵育48小时后，免疫细胞增加胸膜表面蛋白质的损失(n＝3)。对照组＝无免疫细胞的小鼠肺；健康＝补充了来自健康人类志愿者的免疫细胞的小鼠肺；IPF＝补充有肺病患者免疫细胞的小鼠肺。标尺：100μM。表示的数据为平均值±标准差。单因素方差分析用于多重比较(对照组48小时与健康和IPF免疫细胞比较，*P<0.05；*健康与IPF比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。(C)免疫细胞在孵育48小时后加速小鼠肺活检的间质流体瘢痕侵袭。NHS酯标记ECM在小鼠肺活检中的运动曲线图。所代表的数据为平均值±标准差。单因素方差分析用于多重比较(对照组48小时与健康和IPF免疫细胞比较，*P<0.05；*健康与IPF比较，
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图43：人类侵入基质与流体瘢痕组织相似
(A)流体基质侵入人类肺组织(n＝2)。标尺：200μM和100μM(i)。(B)流体基质在间隙结构中聚集(n＝2)。标尺：100μM和20μM(i)。(C)人类流体基质系统蛋白质组学鉴定的工作流程。(D)人胸膜流体基质组分含有丰富的纤维成分(n＝5)。(E)GO富集显示浸润基质类似于萎缩性瘢痕组织，具有异常的弹性组织形态。(F)侵入的基质含有纤维构造块和交联酶。
图44：流体基质流的消融防止肺纤维化
(A)流体瘢痕组织遗传SRC依赖性酪氨酸激酶信号。人类蛋白质组信号的GO富集。(B)Nintedanib治疗方案在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的工作流程。(C)Nintedanib拯救博莱霉素诱导损伤后的胸膜基质池(n＝5)。(D)博莱霉素损伤后两周小鼠肺的免疫荧光和H&E图像(n＝5)。统计比较采用非配对t检验。标尺：500μM和100μM(免疫染色)。
图45：博莱霉素诱导胸膜表面的结构变化和蛋白质损失。
(A)博莱霉素诱导的肺炎在14天后增加了小鼠肺表面的局部厚度(n＝3)。(B)纤维化肺有更复杂的表面结构(n＝3)。
图46：小鼠胸膜流体基质池与流体瘢痕组织相似。
(A)质谱实验模式。(B)流体基质主要由胶原元素组成(n＝5)。(C)胸膜流体基质组分含有纤维和基底成分(n＝5)。(D)流体基质成分类似于萎缩性瘢痕组织。(n＝5)
图47：流体瘢痕元素显示不同的流动性剖面图A)流动性系数的计算。B)流体瘢痕元素显示出明显的流动性曲线(n＝5)。
图48：表1的B部分显示了用各自化合物治疗的组织补片的H和H染色。
具体实施方式
为了克服现有技术中迄今为止所述方法的一些缺点，即仍然需要在治疗过度或不足瘢痕形成方面提供进一步的选择，本发明的发明者惊奇地发现，慢性和过度的皮肤创伤可归因于筋膜基质的流动性。因此，本发明者在此提供有希望的新方法，用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂。
本发明者现在惊奇地发现，瘢痕起源于筋膜中的预制基质，例如皮下筋膜，其进入需要沉积细胞外基质(ECM)的部位，例如伤口。通过使用基质追踪技术、活体成像、遗传谱系追踪和解剖命运图模型，将筋膜识别为皮肤瘢痕等来源，使得本发明者能够识别瘢痕形成的机制。引人注目的是，本发明者发现瘢痕主要来源于与其预制基质捆绑的筋膜成纤维细胞。在受伤后，这种装配作为一种可移动的密封剂进入开放性伤口，不仅可以将基质的塞子，还可以将血管、免疫细胞和神经向上拖入皮肤外层。因此，本发明者观察到筋膜成纤维细胞在受伤后上升到需要修补的部位，从而拖拽其周围的细胞外胶状基质，包括嵌入的血管、巨噬细胞和周围神经，形成瘢痕。对筋膜成纤维细胞的基因消融阻止基质归巢到伤口中并导致不良瘢痕，而在皮肤下放置一层不渗透膜以防止筋膜成纤维细胞向上迁移，则导致慢性开放性伤口。因此，筋膜包含一个专门的预制套件，特别是哨兵成纤维细胞，嵌入一个可移动的密封剂中，将愈合伤口所需的所有细胞类型和基质成分预装配在一起。本发明者的发现表明，慢性和过度的皮肤创伤可归因于筋膜基质的流动性。
虽然现有技术侧重于纤维化或瘢痕疙瘩的终点表型，但本发明允许侧重于起点。事实上，本发明者首次成功地在体内标记ECM，并因此能够实时观察其向损伤部位的移动。这允许在比之前知道的更早的时间点干扰ECM沉积，从而为本文所述的治疗选项开辟了新的途径。
因此，本发明涉及一种用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法，包括(a)用标签接触可通过从哺乳动物受试者活检获得的器官组织的细胞外基质；(b)将所述标记的器官组织细胞外基质与感兴趣的化合物接触；(c)与通过活检从未接触所述感兴趣的化合物的哺乳动物受试者获得的标记的器官组织细胞外基质相比，确定所述感兴趣的化合物是否调节ECM向所述需要沉积ECM的部位的移动，其中，对需要沉积ECM的所述部位的ECM运动的调节表明所述感兴趣的化合物是所述ECM运动的调节剂。
识别ECM向需要沉积ECM的位置移动的调节剂的方法包括对ECM进行标记。因此，通过标记ECM，ECM可以可视化以便观察。观察ECM移动可以识别ECM移动的调节剂，因为调节剂可能会减少或加速ECM移动。如上所述，通过对标记ECM运动的可视化，可以在减少ECM运动的基础上识别作为ECM运动抑制剂的调节剂，而可以在加速ECM运动的基础上识别作为ECM运动促进者的调节剂。在不受理论约束的情况下，假设减少ECM移动将导致ECM在需要ECM沉积的部位(如伤口)的沉积减少，而加速ECM移动将导致ECM在需要ECM沉积的部位(如伤口)的沉积加快。
此处使用时，减少ECM移动相当于抑制ECM移动。抑制ECM向需要ECM沉积的位置移动，优选地防止ECM在所述位置过度沉积。
本文中使用的加速ECM移动等同于促进ECM移动。促进ECM向需要ECM沉积的位置移动优选地防止ECM在所述位置的沉积不足。
“识别ECM运动的调节剂”或“识别ECM运动的调节剂”包括屏蔽此类调节剂，以及一旦识别或屏蔽，隔离(即提供此类调节剂)。
步骤(a)
根据本发明的“细胞外基质(ECM)”指由细胞分泌的细胞外分子的集合。本发明器官组织的ECM可由胶原原纤维、微纤维和弹性纤维组成，嵌入透明质酸和蛋白聚糖中。优选地，所述ECM包含蛋白质、多糖和/或蛋白聚糖。这些部件可指根据本发明的ECM部件。此类ECM组分可共价连接至用于接触ECM的所述标签，尤其是器官组织的ECM组分可通过哺乳动物受试者的活检获得。优选地，ECM还可包括如本文所述的筋膜基质、浆膜和/或外膜细胞，例如巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞，其中优选成纤维细胞。ECM蛋白质，例如本文所述的标记ECM蛋白质，在本文中优选地用作ECM运动的替代标记。
用于将所述组织的ECM与标签接触的器官组织可指组织样品/片，其包括来自本文别处定义的器官的细胞。器官组织也可以是指活检穿孔机，所述穿孔机由来自所述组织样本/件的活检穿孔机创建。在这种情况下，“活检穿孔机”是指使用医疗诊断中重要的工具(也称为活检穿孔机)制作的小而圆的器官组织样本，所述工具能够以清晰定义的直径打孔/冲压出所述器官组织的小块。优选地，可使用直径为2mm的一次性圆形活检穿孔机。它产生均匀的圆形活检(穿孔活检)，减少变异性。然而，用于将所述组织的ECM与标签接触的器官组织也可以是本文别处定义的整个器官，例如器官提取。当所述器官组织指上文定义的组织样本/片时，可通过从哺乳动物受试者处活检获得。根据本发明的活检是一种医学试验，涉及从哺乳动物受试者中提取器官组织进行检查，以根据本发明的方法识别所述ECM运动的调节剂。当器官组织可通过活检获得时所应用的技术为本领域技术人员所知。根据本发明的方法，通过对哺乳动物受试者进行活检可获得的所述器官组织可以是健康的或患病的器官组织。
优选地，根据本发明的方法从所述哺乳动物受试者通过活检获得的所述器官组织来自皮肤、肾脏、肺、心脏、肝脏、骨、腹膜、肠、膈肌或胸膜。更优选地，根据本发明的方法，可从所述哺乳动物受试者通过活检获得/获得的所述器官组织为皮肤。所述哺乳动物对象可以是本领域技术人员已知的任何哺乳动物。优选地，所述哺乳动物对象是人类。因此，在本发明的优选实施例中，可通过活检从人(优选成人)获得器官组织。
“通过活检获得”或“通过活检获得”不限于经典活检。甚至可能是整个器官的退出。然而，包括本文所述的经典活检和活组织检查。当在本发明的上下文中提及“活检”时，意味着在活检期间或活检时或活检后，例如由于刷牙或任何其它刺激而损伤器官组织，从而产生需要ECM沉积的部位，除非器官组织可能已经具有一个或多个需要ECM沉积的部位。后者可在病变器官组织的情况下实现，例如ECM沉积可能过多或不足。
优选地，根据本发明方法的所述器官组织包括筋膜基质、浆膜和/或外膜。更优选地，根据本发明方法的所述器官组织包括筋膜基质。本发明方法中使用的筋膜基质、浆膜和/或外膜优选包含巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
筋膜基质的特征可能是含有表达α-SMA、CD90、ER-TR7、PDGFRα、Sca1、βIIITubulin、CD31、MOMA-2、F4/80、CD24、CD34、CD26、DIk1、Fn1、Col14a1、Emilin2、Gsn和/或Nov的细胞。在这种情况下，“表达”一词指“表达”表面或细胞质标记物，如α-SMA、CD90、ER-TR7、PDGFRα，Sca1、βIIITubulin、CD31、MOMA-2、F4/80、CD24、CD34、CD26、DIk1、Fn1、Col14a1、Emilin2、Gsn和/或Nov或所述术语在提及诸如En1的谱系标记时指“已表达”的细胞。
Engrailed-1系阳性成纤维细胞或Engailed-1既往成纤维细胞(EPF)是小鼠背部皮肤和颅骨真皮瘢痕组织发育的主要贡献者，而Wnt1系阳性成纤维细胞是小鼠口腔瘢痕组织发育的主要贡献者。背部真皮内的胚胎谱系具有许多功能属性和特征，例如通常与术语“成纤维细胞”相关的类似纺锤形形态。然而，这种谱系不仅存在于皮肤中，也存在于下面的浅筋膜中。这些负责瘢痕沉积的成纤维细胞谱系(如EPF)来源于循环中的成纤维细胞样细胞。EPF可能是指En1谱系阳性的成纤维细胞，这意味着胚胎发生过程中祖先/祖细胞表达En1，但EPF很可能在E18.5–P10阶段(可从小鼠收集皮肤组织的发育阶段)不表达ENGRAIED-1(En1)。
Engrailed-1(和Wnt1)仅在胚胎发育期间短暂表达。En1是一种转录因子，在发育过程中很早就启动并调节多个下游靶基因的表达。En1基因标志着细胞的谱系。一旦开启，无论En1是否在细胞中表达，细胞及其子代都是EPF。因此，En1不是标记细胞的表面标记，而是一个谱系标记，从而定义了胚胎谱系。
在野生型小鼠系统或人类中，没有直接的方法标记EPF。因此，替代标记物，如CD26或下文提到的其它成纤维细胞标记物，可用于标记EPF。CD26标记了很大比例的EPF(94％)，并提供了EPF相对于历史上从未表达过Engrailed的ENF的最高倍富集度。ENF不参与瘢痕组织的形成。通过在不同解剖位置分别移植成体ENF和EPF，已确定EPF和ENF形成瘢痕的能力差异是细胞固有的和永久的，这是两种不同成纤维细胞类型的体内行为(Rinkevich等人，2015年，Science 348(6232))。
对于人类样本，可进一步使用成纤维细胞的bellow pan标记物，例如N-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)和/或血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)和β(PDGFRβ)，这是瘢痕形成的所有重要指标和标记物。上述成纤维细胞的bellow pan标记物也可用于小鼠。
当在本发明方法的步骤a)中使用术语“接触”或“接触”时，意味着如本文别处所定义的器官组织的所述ECM与所述标签接触，所述标签共价连接到所述ECM组分。在优选实施例中，术语“接触”或“接触”指“选择性接触”或“接触”。在此上下文中，“选择性接触”是指并非器官组织的整个ECM与本文别处定义的所述标签接触，而是与所述器官组织的所述ECM的一个或多个部分接触。换言之，当本文使用术语“选择性接触”时，所述器官组织的ECM的限定的非常特定的点与本文别处定义的所述标签接触，从而在本发明的器官组织上执行局部ECM标记。优选地，对由ECM组成的蛋白质进行标记。然而，也可以设想ECM的其它成分可以被标记，例如碳水化合物。
标签是一种分子或材料，可检测(如视觉、电子或其它)信号，指示器官组织样本中标签的存在和/或浓度。因此，例如，样品中标记分子的存在、位置和/或浓度可以通过检测由(可检测)标签产生的信号来检测。标签可以直接或间接检测。应了解，所述标签可在任何位置附着或并入分子，例如蛋白质、多肽或其它实体。应了解，在某些实施例中，标签可与适当底物(例如，荧光素)反应以产生可检测信号。特别是，可检测标签可以是荧光团、酶(过氧化物酶、荧光素酶)、放射性同位素、荧光蛋白。其它可检测标签包括化学发光标签、电化学发光标签、生物发光标签、聚合物、聚合物颗粒、金属颗粒、半抗原和染料。
荧光团(或荧光色素)是一种荧光化合物，在光激发时可重新发光。荧光团的实例包括5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-羧酰胺己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明和诸如Cy2、Cy3和Cy5的染料，任选地经取代的香豆素包括AMCA、PerCP、，藻胆蛋白包括R-藻红蛋白(RPE)和别藻红蛋白(APC)、得克萨斯红、普林斯顿红、无机荧光标记物，例如基于半导体材料的颗粒，如包覆的CdSe纳米晶。
荧光蛋白的实例包括示例性荧光蛋白，例如，天狼星、蓝铜矿、EBFP、EBFP2、TagBFP、绿松石、ECFP、蔚蓝、CyPet、TagCFP、mTFPl、mUkGl、mAGl、AcGFPl、TagGFP2、EGFP、GFP、mWasabi、EmGFP、YFP、TagYPF、YPT、EYFP、黄玉、SYFP2、金星、黄水晶、黄水晶、mKO、mK02、mOrange、mOrange2、TagRFP、TagRFP-T，mStrawberry、mRuby、mCherry、mRaspberry、mKate2、mPlum、mNeptune、mKalama2、T-Sapphire、mAmetrine、mKeima、UnaG、dsRed、eqFP611、Dropa、KFP、EosFP、Dendra和IrisFP。
用作酶标签的酶的实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP或AP)、b-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、b-N-乙酰氨基葡萄糖酶、b-葡萄糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。
放射性标签的示例包括氢、碘化物、钴、硒、氚、碳、硫和磷的放射性同位素。2H、3H、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、67Ga、76Br、99mTc(Tc-99m)、mIn、123I、125I、131I、153Gd、169Yb和186Re。
根据本发明，所述标签优选为染料或标签。当所述标签是染料时，优选荧光染料。荧光染料是指与荧光团偶联的试剂。具体而言，所述试剂系指N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯(NHS)或磺基二氯酚(SDP)-酯。当用于本发明时，NHS酯指N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯。NHS或SDP酯与细胞外胺反应，如蛋白质的N端和标记ECM成分的赖氨酸。与荧光团(如Alexa 488、Alexa 568、Alexa 647、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、太平洋蓝)共轭的NHS/SDP酯用于可视化ECM。
如上所述，NHS酯足以标记胞外胺。解开ECM移动现象的一个关键步骤是可能使移动的材料在伤口区域交联。蛋白质的伯胺和不同蛋白质类别的肽是共价连接的。由于NHS酯类也标记伯胺，发明者询问自己伤口部位的重组是否导致游离胺基团的增加，以及他们是否可以通过腹腔内应用NSH-酯类来观察这些情况。发明者在这里的发现有许多潜在的意义。数据显示，在腹部伤口区域有伯胺的聚集，可通过NHS连接反应进行标记(图38)。这将允许通过简单的腹膜内注射来标记任何腹部伤口。通过使用NHS酯与更深波长的报告器耦合，这将在临床上打开伤口可视化的新维度。
在一个优选实施方案中，本发明的NHS酯可用于标记伯胺。在另一实施例中，本发明的NHS酯可用于标记本文定义的伤口中的胺和伯胺。NHS酯标记可用于诊断方法。诊断方法可能有助于愈合或伤口进展。在这种情况下，如上文所述，将NHS酯与另一报告分子结合可能是有利的。在一个优选实施方案中，NHS酯染色剂可与任何种类的报告剂或荧光染料结合。
优选地，此类荧光染料包括但不限于Alexa Fluor 488 NHS-ESTER、NHS荧光素(5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)、Alexa Fluor 568 NHS酯、太平洋蓝琥珀酰亚胺酯、AlexaFluor 647 NHS酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯)，Alexa Fluor 488 5-SDP-酯或NHS罗丹明(5/6-羧基-四甲基-罗丹明琥珀酰亚胺酯)。上述荧光染料中的每一种都能够标记来自本文别处所述的每个器官组织的ECM基质的ECM成分。
一种诊断伤口愈合过程的方法，其中所述方法包括向患者全身施用NHS酯，从而标记伤口中的胺。诊断伤口愈合的方法，其中NHS酯与报告分子结合。
除了对伤口进行成像外，效应分子还可以与NHS酯偶联，从而通过单次全局注射靶向伤口区域。这种效应分子可能是治疗性化合物。如果NHS酯与化合物偶联或连接，则任何类型的化合物都可能适用。然而，首选的是治疗慢性伤口的治疗性化合物。与NHS酯偶联的化合物可能是如本文所述的细胞外基质(ECM)运动的调节剂。
如图38所示，NHS酯可以全身或局部给药。在又一实施例中，将本发明的NHS酯注射到血液流中以标记伤口中的伯胺。在这种情况下，NHS酯可能用于监测伤口愈合的进展。在另一种情况下，NHS酯可能与化合物偶联，以全身性靶向伤口。如果NHS酯与化合物偶联或连接，则任何类型的化合物都可能适用。然而，首选的是治疗慢性伤口的化合物。与NHS酯偶联的化合物可能是如本文所述的细胞外基质(ECM)运动的调节剂。
一种包含NHS酯的治疗性化合物，根据需要向患者施用，其中患者患有慢性伤口。一种包含NHS酯的治疗性化合物用于治疗慢性伤口，其中所述化合物被全身投与，意味着将其注射到血流中。一种用于诊断伤口的NHS酯，其中系统地施用NHS酯并由此标记伤口。用于诊断伤口的NHS酯，其中NHS酯进一步与报告分子结合。由于NHS酯在注入血流时能够标记伤口的伯胺，因此可用于监测伤口的延伸或愈合过程。
本文所述的NHS酯标记伤口，可通过将NHS酯染色剂注射到血液流中，从而标记初级细胞外胺来建立，其可在手术期间或之后用于监测延长或愈合手术伤口(图38)。同样，NHS酯注射液也适用于标记慢性伤口。慢性伤口可能涉及表皮、真皮和筋膜，包括愈合过程不佳的伤口，这意味着它们无法在正常时间内或以正常预期方式愈合。任何创伤、手术、疾病、感染、年龄、药物、循环不良或神经病变都可能导致愈合不良。所有这些原因都可能与筋膜和筋膜蛋白调节有关。因此，慢性伤口的愈合可能受到细胞外基质(ECM)运动调节因子的影响，从而影响ECM的运动。
一种治疗性化合物，包含NHS酯和细胞外基质(ECM)运动调节剂，根据需要给予患者，其中患者患有慢性伤口。一种包含NHS酯和细胞外基质(ECM)运动调节剂的治疗性化合物，用于治疗慢性创伤，其中所述化合物作为注射到血流中的系统性投与。
本文还包括本发明方法中使用的标签是“标签”。“标签”可以是亲和力标签(也称为纯化标签)，例如生物素标签、组氨酸标签、Flag标签、链霉亲和素标签、链霉II标签、肠肽、麦芽糖结合蛋白、IgA或IgG Fc部分、蛋白A或蛋白G。优选，用于本发明方法且还与NHS/SDP酯共轭的所述标签是生物素标签。因此，本文别处定义的此类标签也可用于通过蛋白质生物化学(如蛋白质印迹或质谱)分析ECM成分。
根据可用作荧光染料试剂的酯，可使用特定反应缓冲液。当NHS酯用作荧光染料100mM pH 9的试剂时，优选使用碳酸氢盐缓冲液。令人惊讶的是，酯反应缓冲液混合物可以应用于本文其它地方定义的每个器官，而不会产生可检测的毒性副作用。
当将可通过所述哺乳动物受试者的活检获得的器官组织的ECM与本文别处定义的标签接触时，使用包含所述标签的纸质材料。因此，标签，尤其是可由标签和反应缓冲液组成的标签溶液，可局部(在ECM的一个或多个部分/点上)施加在本文别处定义的器官组织ECM上，优选使用此类小纸片。此类纸质材料应为非反应性材料，这意味着所述材料本身不会与所述器官组织的所述ECM成分相互作用/反应，和/或所述纸质材料应包含碱性pH。因此，所述纸质材料能够吸收标签，尤其是标签溶液，导致器官组织上的局部ECM标记。纸质材料的示例包括但不限于Whatman滤纸。在优选实施例中，使用2mm Whatman滤纸，并在将所述滤纸置于所述器官组织的ECM上之前，在所述滤纸上施用/添加0.3μl的标记溶液。
特别是，本文别处定义的所述标签针对本文别处定义的ECM组分的伯胺基团。换句话说，当应用本发明的方法时，优选地标记ECM组分的伯胺基团。胺是含有一个碱性氮原子和一个离子对的化合物和官能团。它们可以根据氮上取代基的性质和数量进行分类。自然界中有伯胺、仲胺和叔胺。伯胺(也称伯胺基)是氨中三个氢原子中的一个被烷基或芳香族取代时产生的。重要的伯烷基胺包括甲胺、大多数氨基酸，而伯芳胺包括苯胺。根据本发明的方法，如本文别处所定义的所述ECM组分的某些氨基酸的伯胺基通过如上所述的所述标签进行标记。在优选实施方案中，标记本文别处定义的所述ECM组分的赖氨酸伯胺基团。
琥珀酰亚胺(NHS)-酯标记的胺染色在标记所有含胺的ECM成分时有效，并且不像标记一个特定靶点的抗体那样具有选择性。所述染色是针对死亡组织进行的，需要碱性pH值，因此假设会损伤活组织。发明者现在惊奇地发现，活体离体组织可以被染色而不受损伤。因此，目前还没有关于NHS/SDP酯在活组织上使用的报告，因此没有方法可以显示器官上所有含胺的ECM分子。
在本文别处定义的所述器官组织的所述ECM与所述标签接触后，优选与包含根据本发明的标签的纸质材料接触，所述器官组织可进一步用活检冲头冲压成本文别处描述的活检冲头。如上所述，所述器官组织的ECM与所述标签接触的步骤(标记步骤)，随后冲孔成小的活检针头的步骤也可以按其它顺序完成。
还设想ECM的组分，特别是蛋白质已经包含，例如非标准氨基酸，其能够与本文所述的标签反应。例如，可获得转基因动物，其表达包含不寻常或非标准氨基酸的蛋白质，其能够与如本文所述的标签反应。
本发明的方法还可以通过进一步包括步骤(a')来扩展，即将可通过从所述哺乳动物受试者活检获得的所述器官组织与包含在ECM中的可视化细胞的标签接触。在这种情况下，所述标签是指通过横向扩散扩散并捕获整个细胞的亲脂性膜荧光染料。如本文别处所述，可在器官组织的ECM与第一标签接触之前或之后执行附加标记步骤。这种膜染色可能有助于更好地识别/跟踪ECM向需要沉积ECM的部位的移动。
步骤(b)
当在本发明方法的步骤b)中使用术语“接触”或“接触”时，指将所述感兴趣化合物直接添加到放置在培养基中的器官组织上，或将所述化合物添加到放置器官组织的培养基中，所述感兴趣化合物用于测试其是否调节ECM向需要沉积ECM的部位的移动。通过简单地以任一方式(向培养基中或明确地向器官组织上)添加本发明的感兴趣化合物，可在大约一小时或一夜后观察第一ECM动态。然而，当认为有必要时，接触可进一步包括向血流中添加化合物或标记化合物。这种给药可以是全身给药，即注射。
术语“感兴趣化合物”指在本发明方法中测试的化合物，以确定所述化合物是否为所述ECM运动的调节剂。这种调节剂可以是抑制剂，因此一旦抑制剂与所述标记的器官组织ECM接触，就可以抑制所述ECM向需要沉积ECM的部位移动。然而，这种调节剂也可指启动子/诱导子，从而一旦启动子与所述标记的器官组织ECM接触，就促进/诱导所述ECM向需要沉积ECM的部位移动。优选地，感兴趣化合物可以是抑制剂。更优选地，所述感兴趣化合物系指蛋白酶抑制剂。蛋白酶通常包括金属蛋白酶、弹性蛋白酶或组织蛋白酶等。金属蛋白酶可分为金属内肽酶，如基质金属肽酶(MMP1、2、3、8和9)和金属外肽酶。在本发明中，已显示金属蛋白酶(MMP)抑制剂GM6001对胶原酶(MMP 1，8)、明胶酶(MMP 2，9)和溶糖素(MMP 3)特异性反应。
当基于ECM移动减少而将感兴趣化合物确定为ECM移动的抑制剂时，这导致需要ECM沉积的部位的ECM沉积减少，则所述感兴趣化合物可能具有抗纤维化表型。所述感兴趣化合物指但不限于金属蛋白酶(MMP)抑制剂GM6001；1400W和L-Name，iNOS抑制剂；LY255283和CP-105696，白三烯B4受体拮抗剂；以及组织蛋白酶-G抑制剂、组织蛋白酶-G抑制剂(图20)、表1中的分子，尤其是盐酸多沙普兰、盐酸阿莫洛芬、新戊酸氟美松、帕莫酸吡嗪、磺胺喹恶啉钠盐、哌拉西林钠盐、碘克沙醇、甲基海因-5-(D)、伊曲康唑、盐酸氮卓斯汀、盐酸阿霉素、，倍他米松、硫链球菌素、氯法齐明、脱水盐酸纳曲酮、瑞格列奈、盐酸丙氧卡因、马来酸替加色罗、苯丁氮酮、丙酸氟替卡松、哌万匹林、醋酸氟考酮、苄星青霉素、盐酸卤凡特林、磺胺甲氧基哒嗪、左旋诺氟沙星、麦地松、柠檬酸草胺盐、，酮咯酸氨丁三醇、羟萘甲酸苯那敏、氟伐他汀钠盐、依替膦酸、二钠盐、马来酸甲丙嗪盐、哈洛普金、美伐他汀、多潘立酮、阿法骨化醇、吡嗪酰胺、依本那明(-)、米诺地尔、磺胺苯唑、炔诺酮、法莫替丁、二金字塔、盐酸戊烯和盐酸奈福泮。
当基于加速ECM运动而将感兴趣化合物确定为ECM运动的促进剂，从而导致ECM在需要ECM沉积的部位加速沉积时，所述感兴趣化合物可能具有促纤维化表型。此类感兴趣化合物指但不限于具有促纤维化表型的弹性蛋白酶抑制剂Elastial(图20)。
如果化合物可能是所述ECM向需要沉积ECM或“促进/诱导”的部位移动的抑制剂，则本文使用的术语“调制”或“调制”以及本文其它地方更详细地描述的术语是指“抑制(promote/induce)”，如果化合物可能是所述ECM向需要沉积ECM的位置移动的促进剂/诱导剂。
步骤(c)
当本文使用本发明方法步骤c)中的术语“确定”或“确定”时，可通过目视检查或蛋白质生物化学方法完成或实现。术语“目视检查”是指通过使用显微镜(优选通过使用荧光立体显微镜)观察所述感兴趣化合物是否确实调节了本文别处定义的ECM运动。与器官组织的ECM相比，通过目视检查或甚至通过本领域技术人员已知的任何蛋白质生物化学方法进行所述测定/检查，也可通过本文别处定义的活组织检查从哺乳动物受试者(或从已经用于获取用于本发明方法步骤a的器官组织的同一哺乳动物受试者)获得，其已根据本发明进行标记，然而，未与本文其它地方所述的所述利息复合物接触。
在上述定义的本发明方法的步骤(a)、(b)和/或(c)期间，可能存在所述哺乳动物体腔的流体。对于步骤(a)，当器官组织的ECM与包含在所述溶液中的所述标签接触时，如上所述，所述标记可以存在于所述标记溶液中。当所述流体出现在本发明方法的步骤(b)中时，可将其添加到培养基中，其中将已经具有标记ECM的器官组织放入培养基中，以进行培养，培养基也可包含感兴趣化合物。
体腔是生物体内产生的容纳器官的空间。它衬有一层细胞，并填充有优选用于本发明方法中的流体，以保护器官在生物体移动时免受损伤。在本发明的方法中，所述哺乳动物的体腔的流体可增强标记或培养效果。
根据第二方面，本发明涉及一种用于识别与细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动相关的生物标记物的方法，包括(a)用标签接触可通过活检从哺乳动物受试者获得的器官组织的细胞外基质；(b)从所述标记的ECM中分离蛋白质，其向所述需要沉积ECM的位置移动；(c)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列，从而将所述蛋白质识别为与ECM运动相关的生物标记物。
不同器官ECM的生物标记物示例见表2至表4。
步骤(a)如本文所述，在识别ECM向需要沉积ECM的场所移动的调节剂的方法中执行。
步骤(b)通过应用通常已知的从膜、纸质材料等表面分离蛋白质的手段和方法进行。事实上，由于在步骤(a)中，最好对ECM组成的蛋白质进行标记，因此可以看到此类蛋白质向需要ECM沉积的位置移动。这种ECM蛋白被用作ECM向需要ECM沉积的部位移动的替代物。因此，在ECM内向需要沉积ECM的部位移动的任何此类ECM蛋白质可能是与ECM向需要沉积ECM的部位移动相关联的合适生物标记物。换句话说，如本文所述识别的这种ECM蛋白质可指示ECM运动。在病理性医疗状况(例如纤维化或慢性伤口)的情况下，此类生物标记物的存在、数量或缺失可指示病理性医疗状况的程度或范围。
步骤(c)是通过应用已知的手段和方法来确定步骤(b)中分离的一种或多种蛋白质的至少部分氨基酸序列来执行的，如MALDI-TOF、HPLC等
，现有技术中的理解是哺乳动物通过不完全理解的机制形成瘢痕以快速修补伤口并确保生存。事实上，目前的伤口愈合模型提出成纤维细胞迁移到伤口部位，在那里它们局部启动基质沉积，然后重塑成成熟的瘢痕。根据他们的发现，本发明者提出了一种修正模型(见图6)，其中筋膜成纤维细胞将其局部复合基质引导到伤口中，在深度损伤中局部重塑。因此，瘢痕原基不是由真皮成纤维细胞沉积基质，而是由筋膜成纤维细胞控制，这是一种快速封闭开放伤口的高效机制。事实上，本发明者发现，伤口越大，筋膜的贡献就越丰富。这意味着筋膜成纤维细胞引导基质是一种机制，其演变为修补大而深的开放性伤口，而较小的较浅的伤口似乎通过经典的真皮成纤维细胞从头沉积机制愈合。然而，更浅表伤口的愈合并不排除本发明者揭示的机制。因此，表面伤口的愈合可能包括两种机制，一种是通过从头沉积，另一种是涉及本发明者发现的ECM运动。
流行的科学观点认为，身体的结缔组织仅仅是细胞和器官的被动支撑框架，这种结缔纤维细胞称为ECM静止。发明者通过发现跨内脏辐射的流体基质系统来反驳这一观点。他们表明，损伤会引起内脏器官和壁器官的流体基质涌出。然后将所述未成熟流体基质现场交联，以建立刚性框架，从而在器官的结构连续性中再生缺口，并保持器官的完整性和功能。
这些发现挑战了几个广泛持有的观念。发明者可以摒弃的第一条教条是ECM是静态的。其次，他们现在已经看到，新的解剖结构不仅来自刚性基质的从头沉积，而且来自新基质和梭状流体基质的混合物。最后，数据表明，成纤维细胞不再是组织重建的主要贡献者，而是相对未被重视的免疫活性细胞，即中性粒细胞的工作。综上所述，发明者的发现表明，由于中性粒细胞在器官范围内的侵入，流体基质的储库进入组织构建部位，从而形成刚性结构。然后，流体基质作为新的刚性解剖结构和组织修复构造块在受伤器官中发挥作用。
因此，在一个优选实施方案中，可在监测愈合进展过程中确定或针对中性粒细胞的存在。在另一实施例中，刺激中性粒细胞进入伤口以增加ECM向需要ECM沉积的部位的移动可能是有利的。这种刺激可以通过使用化合物或细胞因子来建立。
流体基质是纤维化瘢痕和再生的原材料库，发明者推测流体基质的特定蛋白质成分决定了成人组织修复过程中形成的发散刚性结构。事实上，流体元素的组成因器官而异。而在肝脏中，许多酶和促再生蛋白是流体部分的一部分，而腹膜成分主要由纤维和促纤维成分组成，这些成分是瘢痕构造块。
通过展示中性粒细胞在引导这种流体基质材料进入伤口中的中心作用，发明者还发现了炎症和组织修复之间一个令人兴奋的新联系，他们以各种方式做到了这一点。免疫细胞在几分钟内将浑浊基质元素运送到器官表面。然而，转录组学分析表明，中性粒细胞通过激活多种途径为这一努力进行转录准备。一种途径涉及胶原结合整合素CD11b和CD18的上调，它们在基质运动中起着重要作用，因为阻断抗体降低了基质电流。另一个途径涉及LTB4和一氧化氮合酶，局部放置LTB4形成新的基质沉积，而抑制一氧化氮抑制基质流动。因此，中性粒细胞调节成人器官修复的各个方面。
因此，在另一种情况下，阻止ECM移动可能是有利的。通过使用本文建立的推理，可通过使用中性粒细胞中和抗体建立对ECM运动的抑制。首选的中性粒细胞中和抗体可针对Ly6g、CD11b或CD18。
发明者已经看到，流动基质动员是成人组织和器官创伤修复的一般原则，他们推测这实际上更为普遍。也就是说，流动可能与发育有关(器官发生)。他们进一步推测，胚胎发育过程中新刚性框架的出现是通过类似的流体基质过程实现的，“流体基质储存库和水流”是身体计划中新出现的生物学原理。他们的发现表明，在健康的成人器官中没有基质电流，这表明有强大的力量阻止基质水库的流动，而反平衡的力量在整个成人生命中激活基质流。
就本发明者所知，本申请中记录的基体运动的范围和大小；参见示例，在受伤或再生设置期间从未观察到。
本发明者的发现揭示了复合组织基质在损伤过程中前所未有的动态和运动范围，所述运动由筋膜的专门成纤维细胞介导。因此，筋膜作为瘢痕形成基质的外基质，这些发现表明基质转向伤口是筋膜对大面积损伤的主要反应。
本发明者的研究发现，筋膜会形成大瘢痕，并且其堵塞会导致慢性开放性伤口，这表明皮肤的慢性和过度伤口愈合表型范围，如糖尿病和溃疡性伤口，增生性瘢痕，尤其是瘢痕疙瘩瘢痕，都可能是由筋膜引起的。事实上，浅筋膜在不同的物种、性别、年龄和解剖皮肤位置有很大差异24。在一些哺乳动物中，浅筋膜是疏松的，而在人、狗和马中，浅筋膜较厚，有较大的结缔组织带。人体皮肤的浅筋膜在身体不同部位的厚度也不同25。例如，下胸部、背部、大腿和手臂有更厚的多层膜，正是这些解剖部位容易形成大的瘢痕疙瘩瘢痕。而其它部位如足部则有更薄或不存在的筋膜。
此外，根据第三方面，本发明涉及一种化合物，用于调节细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选治疗涉及ECM沉积的状况。
“涉及ECM沉积的状况”是一种需要ECM沉积的医疗状况。如本发明者所发现的，ECM可以输送组分，当沉积在需要ECM沉积的位置时，这些组分有助于瘢痕形成，优选影响瘢痕形成。有时需要调节ECM运动，从而调节ECM沉积，从而形成瘢痕。
因此，本发明提供了用于识别调节剂和ECM向需要ECM沉积的部位移动的方法和手段，以及用于调制(例如，抑制或促进)ECM向需要ECM沉积的部位移动的医疗应用，优选治疗涉及ECM沉积的状况。
事实上，如果瘢痕过度生成，这种情况是不希望出现的。因此，本发明提供用于抑制ECM向需要ECM沉积的部位移动的医学应用，优选治疗涉及ECM沉积的状况。这种情况是，例如，ECM过度沉积，可能与纤维增生性疾病有关。
同样，如果瘢痕生成不足，也不希望出现这种情况。因此，本发明提供了促进ECM向需要ECM沉积的位置移动的医疗应用，优选治疗涉及ECM沉积的状况。这种情况是，例如，ECM沉积不足，可能与慢性伤口有关。
“需要ECM沉积的部位”或“需要ECM沉积的部位”，如本文所述，是指器官组织内向哺乳动物身体发出ECM沉积要求信号的部位。所述信号由(例如)伤口等引起的伤害触发。通常，修补伤口需要ECM沉积。因此，需要ECM沉积的部位优选为伤口。“伤口”是指由于暴力等原因导致哺乳动物身体组织连续性中断，暴力被理解为包括外部机构的任何行动，例如手术。所述术语包括开放性和闭合性伤口。
根据本发明者的发现，如本文所述且可如本文所述可视化的ECM运动由筋膜基质介导。筋膜基质、浆膜和/或外膜可包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。具体而言，筋膜基质、浆膜和/或外膜可包括成纤维细胞。
用于调制ECM向需要沉积ECM(相当于ECM沉积)的位置移动的方法中的化合物可以是任何化合物，例如小分子或类似物。这种化合物包括细胞或来自细胞的材料。
例如，可根据本文所述的本发明方法测试化合物对ECM运动调制的影响。简言之，通过对哺乳动物受试者进行活检获得的器官组织的细胞外基质与标签接触；所述标记的器官组织的细胞外基质与感兴趣的化合物接触，即用于调节ECM向需要ECM沉积的部位移动的方法中的潜在化合物；确定所述感兴趣化合物是否调节ECM向所述需要沉积ECM的部位的移动，与通过活检从未接触所述感兴趣化合物的哺乳动物受试者获得的标记的器官组织细胞外基质相比，其中，对需要沉积ECM的所述位置的ECM运动的调制表明所述感兴趣化合物是所述ECM运动的调节剂。作为调节剂，感兴趣化合物可抑制ECM移动或促进ECM移动。
优选地，根据用于识别ECM向需要ECM沉积的部位移动的调节剂(例如抑制剂或促进剂)的方法(如本文所述)，在用于调制ECM向需要ECM沉积的部位移动的方法中使用的化合物，优选可识别治疗涉及ECM沉积的状况。这样确定的化合物随后可用于调制ECM向需要ECM沉积的位置移动的方法中，优选治疗涉及ECM沉积的状况。因此，本发明提供一种化合物，其可通过以下方法获得/获得：或识别ECM向需要ECM沉积的部位移动的调节剂(例如抑制剂或促进剂)，如本文所述，用于调制ECM向需要ECM沉积的部位移动，优选治疗涉及ECM沉积的状况。
然而，尽管优选，但不必按照本发明者提供的识别此类调制器的方法对用于本发明EM运动调制方法的化合物进行测试。事实上，只要能够调节ECM向需要ECM沉积的位置的移动，就可以使用任何化合物。如有必要，可按本文所述(如上文所述)测试朝向需要ECM沉积的位置的ECM移动。
优选地，化合物用于在治疗涉及ECM沉积的状况时调制ECM向需要ECM沉积的位置移动的方法。由于本发明者首次发现ECM运动将用于疤痕形成的部件输送到需要ECM沉积的部位，因此本发明提供了涉及ECM沉积的条件的早期可能。因此，治疗涉及ECM沉积的状况优选允许防止ECM在需要ECM沉积的部位过度沉积或ECM在需要ECM沉积的部位沉积不足。
事实上，抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。因此，ECM向需要ECM沉积的位置移动的调制器可以优选为抑制剂。也就是说，本发明涉及一种用于抑制细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法中的化合物，优选治疗涉及ECM沉积的状况。优选地，抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。ECM过度沉积的一个例子与纤维增生性疾病有关。
“纤维性”疾病或“纤维增生性”疾病是指以瘢痕形成和/或结缔组织过度产生细胞外基质为特征的疾病。纤维性疾病可能是组织损伤的结果。它几乎可以发生在哺乳动物身体的每个器官中。纤维化或纤维增生性疾病的示例包括但不限于特发性肺纤维化、纤维化间质性肺病、间质性肺炎、非特异性间质性肺炎的纤维化变体、囊性纤维化、肺纤维化、矽肺、石棉肺、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)，肺动脉高压、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肾小球硬化、x肾纤维化、糖尿病肾病、心脏病、纤维化性瓣膜性心脏病、系统性纤维化、类风湿性关节炎、手术(如修补疝气的手术)、化疗药物诱导的纤维化等导致的过度疤痕，辐射诱导的纤维化、黄斑变性、视网膜和玻璃体视网膜病变、动脉粥样硬化和再狭窄。纤维性疾病或紊乱、纤维增生性疾病或紊乱，以及有时在本文中使用的纤维化，在本文中可互换使用。
对于肝脏和剖腹手术部分为局部损伤的腹膜(图40a)，发明者可以证明赖氨酰氧化酶和弹性蛋白酶的抑制导致ECM运动增加。运动蛋白的抑制仅在腹膜中显示对ECM电流的抑制作用。热休克因子抑制阻断了两个器官的ECM电流。在蛋白酶抑制剂中，广谱MMP抑制剂GM6001被证明是最有效的。
利用发明者的信号通路分析，他们确定了抑制或放大基质流动的多个分子。有趣的是，一些效应分子如博来司他丁和西利奥布列文只影响一个器官的基质电流。
对于腹膜，赖氨酰氧化酶BAPN和蛋白酶弹性蛋白酶抑制剂II和弹力素增加了周围组织的ECM运动。因此，在优选实施例中，BAPN和Elastational可用于增加腹膜周围组织的ECM运动。
赖氨酰氧化酶抑制剂，用于增加腹膜周围组织的ECM运动。用于增加ECM运动的赖氨酰氧化酶抑制剂，其中赖氨酰氧化酶抑制剂为BAPN。一种赖氨酰氧化酶抑制剂，用于增加腹膜组织的伤口愈合能力。赖氨酰氧化酶抑制剂，用于提高腹膜组织的伤口愈合能力。
运动蛋白Ciliobrevin D和(S)-硝基贝贝司他丁、热休克因子槲皮素、KNK437和蛋白酶组织蛋白酶B抑制剂GM6001和贝司他丁降低了ECM在腹膜周围的运动。
在优选实施方案中，西利奥布列文D，(S)-硝基博来司他丁、槲皮素、KNK437、组织蛋白酶B抑制剂、GM6001和贝司他丁可用于减少腹膜周围的ECM移动。
运动蛋白抑制剂、热休克因子或蛋白酶，用于减少腹膜组织纤维化。
对于肝脏，赖氨酰氧化酶BAPN、蛋白酶弹性蛋白酶抑制剂II和弹力素增加了ECM的运动。因此，在优选实施例中，BAPN和弹力素可用于增加肝周围组织的ECM运动。
赖氨酰氧化酶抑制剂，用于增加肝脏周围组织的ECM运动。赖氨酰氧化酶抑制剂，用于增加肝脏周围组织的ECM运动，其中赖氨酰氧化酶抑制剂为BAPN。一种赖氨酰氧化酶抑制剂，用于提高肝组织的伤口愈合能力。赖氨酰氧化酶抑制剂，用于提高肝组织的伤口愈合能力。
热休克蛋白Qercetin和KNK437、蛋白酶组织蛋白酶B抑制剂、MMP12和组织蛋白酶G抑制剂以及GM6001降低基质移动。在又一实施例中，Qercetin、KNK437、组织蛋白酶B抑制剂、MMP12、组织蛋白酶G抑制剂和GM6001可用于减少ECM在肝脏周围的运动。
一种运动蛋白抑制剂，一种用于减少肝组织纤维化的蛋白酶，其中所述运动蛋白抑制剂为槲皮素或KNK437，其中所述蛋白酶抑制剂为组织蛋白酶B抑制剂、MMP12、组织蛋白酶G抑制剂或GM6001。槲皮素用于减少肝组织纤维化。KNK437用于减少肝组织纤维化。组织蛋白酶B抑制剂，用于减少肝组织纤维化。MMP12用于减少肝组织纤维化。组织蛋白酶G抑制剂，用于减少肝组织纤维化。GM6001用于减少肝组织纤维化。
由于流体基质的成分因器官而异，因此在确定适当的生物标记物后，可以应用基质电流的器官特异性调节剂。
总之，发明者展示了一种将分子附着到伤口上的新方法、肺纤维化的新潜在标记物以及调节基质运动的信号通路。
博莱霉素诱导的肺纤维化有不同程度的严重性。因此，稳健的生物标记物应根据肺纤维化的严重程度显示不同的丰度。
到目前为止，人们一直认为新合成的结缔组织在损伤后会产生肺部疤痕。本发明者在此提供的数据描绘了一幅新的画面，揭示了活化后从胸膜迁移到间质的流体瘢痕组织系统。这类新流体瘢痕带来了纤维构造块以及相应的酶，使组织在现场成熟为固定的疤痕组织。因此，肺部的疤痕主要是通过重组原有结缔组织形成的。
成纤维细胞仍有可能沉积基质以促进瘢痕形成，这是对冲洗的二次反应。事实上，实验表明，在没有基质冲洗的情况下，成纤维细胞保持休眠和不活动状态。因此，基质冲洗仍有可能使成纤维细胞周围的结缔组织硬化，进而激活成纤维细胞进一步分泌或重塑成纤维细胞周围的新基质。
来自小鼠和人类的流体基质蛋白质组学数据表明，人类肺部灌洗导致表面弹性大大降低。这些发现也揭示了炎症和纤维化之间的联系。单核细胞和淋巴细胞不仅能触流体发瘢痕组织的侵袭，还能加速新生结缔组织的向内运动和增生。事实上，慢性肺病患者的免疫细胞已为基质操纵“做好准备”，并进一步增强这种效果，这一事实具有令人兴奋的治疗意义。这表明，流体运动和纤维化的速度取决于个体免疫细胞的“启动”状态，对这种“启动”机制的深入理解可以为对抗纤维化的发病提供新的治疗和诊断机会。
综上所述，发明者在本文中介绍的关于肺部的发现，以及先前关于皮肤的发现(参考文献)，表明疏松结缔组织是真皮疤痕的来源，暗示基质运动是一种生发疤痕机制，并对全身损伤作出反应。
首次对肺组织进行质谱分析，发现博莱霉素与对照动物的肺中存在不同数量的蛋白质。这表明最初标记的蛋白质由于刺激而发生变化。纤维蛋白原等蛋白质可形成网状结构。这可能是因为纤维蛋白原与主要标记蛋白共价结合。事实上，发明者还能够在动物血液中识别出初始标记的肺基质丰度不同的蛋白质(图39，表c)。
从上述图39表c中可以看出，与小鼠肺中的其它受试蛋白质相比，Hmgcs2、Bhmt的折叠变化最高(分别为93和52)。因此，在一个优选实施方案中，Myo1e和Hnmpa3表达可指示肺组织中的纤维化或肺纤维化。
在血液样本中发现了不同的标记物。如图39表d所示，与血液中其它受试蛋白质相比，Myo1e、Hnmpa3显示出最高的倍数变化。因此，在一个优选实施方案中，血液中的Myo1e和Hnmpa3表达可指示纤维化或肺纤维化。肺活检分析可与血液中纤维化标志物分析相结合。因此，本发明设想肺组织标记物Hmgcs2、Bhmt和血液标记物Myo1e和Hnmpa3的高表达。
总之，发明者在此表明，在纤维化事件期间，流体元素在肺基质动员期间进入血流。这些元素可被检测或作为纤维化事件的生物标志物。
相反，促进ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置沉积不足。因此，ECM向需要ECM沉积的位置移动的调制器可以优选为促进剂。也就是说，本发明涉及一种用于促进细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法中的化合物，优选治疗涉及ECM沉积的状况。促进ECM运动的化合物例如为赖氨酰氧化酶抑制剂BAPN或趋化因子，其将中性粒细胞吸引到需要ECM沉积的部位，优选趋化因子脂氧素A4。由于发明者已经发现，神经营养因子是进入需要ECM沉积的部位的第一批细胞之一，并且中性粒细胞能够为所述部位的沉积招募ECM材料，很明显，吸引中性粒细胞的趋化因子可能能够启动ECM沉积，从而启动自然愈合过程。这可能有利于未按照自然路径闭合的慢性伤口或加快伤口闭合。对于其它需要修复受损组织的炎症性疾病也可能是有利的。
最好促进ECM向需要沉积ECM的位置移动，以防止所述位置的ECM沉积不足。ECM沉积不足的一个例子与慢性伤口有关。“慢性伤口”是指不能像大多数伤口那样在一系列有序的阶段和可预测的时间内愈合的伤口(最好如本文所定义)；在两到三个月内无法愈合的伤口通常被认为是慢性的。例如，慢性伤口通常在炎症阶段停留太长时间，并在皮肤和有时深层组织中保持开放状态。慢性伤口可能永远无法愈合，也可能需要数年才能愈合。
虽然现有技术侧重于关于例如纤维化或瘢痕疙瘩的终点表型，但由于本发明者的发现，本发明允许关注起点。事实上，本发明者首次成功地对ECM进行体内标记，因此可以实时观察其向需要ECM沉积的部位的移动，例如伤口，例如由损伤引起的伤口。这使得干扰ECM沉积的时间点比以前早得多，从而打开了以前不可用的新治疗选项。换言之，本发明的治疗方法应用调节ECM向需要ECM沉积的位置移动的化合物，优选地允许防止ECM在需要ECM沉积的位置过度或不足沉积，因为本发明者阐明了哺乳动物身体用来修补伤口的机制——通过ECM运动。
因此，本发明中与本文所述治疗方面相关的方法优选用于防止ECM在需要ECM沉积的部位过度沉积或ECM在需要ECM沉积的部位沉积不足。在本发明之前，这样的早期(预防性)治疗是不可能的，因为本发明者阐明的机制既不已知也不理解。然而，由于本发明，ECM运动的机制已被理解，因此，有了新治疗选项，特别是预防性治疗在需要ECM沉积的部位过度沉积或ECM在需要ECM沉积的部位沉积不足。实际上，作为ECM向需要ECM沉积的位置移动的抑制剂的调制器可以理想地防止由于抑制ECM移动而导致ECM过度沉积，而作为ECM向需要ECM沉积的位置移动的促进者的调制器可以理想地防止由于促进ECM移动而导致ECM沉积不足。
通过遵循本发明的教导，本发明者已经能够识别出用于调制ECM向需要ECM沉积的位置移动的方法中的化合物，优选如本文所述治疗涉及ECM沉积的状况。特别是基质金属蛋白酶抑制剂，如GM6001；丝氨酸蛋白酶抑制剂，如组织蛋白酶G抑制剂；iNOS抑制剂，如W1400；或白三烯B4受体拮抗剂，如LY255283被鉴定并应用于体内。如图20所示，基质金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、iNOS抑制剂或白三烯B4受体拮抗剂能够抑制ECM向需要沉积ECM的部位移动，如伤口。事实上，图20所示的每个器官都产生了损伤，需要ECM沉积。然而，基质金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、iNOS抑制剂或白三烯B4受体拮抗剂抑制ECM向损伤部位移动。
因此，基质金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、iNOS抑制剂或白三烯B4受体拮抗剂、热休克抑制剂、运动蛋白抑制剂和中性粒细胞中和抗体是用于调节ECM向需要ECM沉积的部位移动的方法中的优选化合物，优选如本文所述治疗涉及ECM沉积的状况。基质金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、iNOS抑制剂或白三烯B4受体拮抗剂、热休克抑制剂、运动蛋白抑制剂和中性粒细胞中和抗体是本发明的ECM运动抑制剂。因此，它们具有抗纤维增殖作用。
尤其是弹性蛋白酶抑制剂，如elastial，已被鉴定并应用于体内。如图20所示，弹性蛋白酶抑制剂能够促进ECM向需要沉积ECM的部位移动，如伤口。事实上，图20所示的每个器官都产生了损伤，需要ECM沉积。可以看出，弹性蛋白酶抑制剂促进ECM向损伤部位移动。
因此，弹性蛋白酶抑制剂是用于调节ECM向需要ECM沉积的部位移动的方法中的优选化合物，优选如本文所述治疗涉及ECM沉积的状况。弹性蛋白酶抑制剂是本发明的ECM运动促进剂。因此，它们具有促纤维增殖作用。
需要注意的是，除非上下文另有明确指示，否则本文中使用的单数形式“一”、和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“试剂”的引用包括一种或多种此类不同试剂，对“方法”的引用包括对本领域普通技术人员已知的可修改或替代本文所述方法的等效步骤和方法的引用。
除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指所述系列中的每个元素。术语“至少一个”指的是一个或多个，如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。此类等同物意欲包括在本发明中。
本文中使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“所有或任何其它元素的组合”。
术语“小于”或“大于”不包括具体数字。
示例如，小于20表示小于所示的数字。类似地，大于或大于表示大于或大于指示数，例如，大于80％表示大于或大于指示数的80％。
除非上下文另有要求，否则在本规范和后续权利要求中，“包括”一词以及“包括”和“包括”等变体，将理解为包括规定的整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或一组整数或步骤。当在本文中使用时，术语“包括”可替换为术语“包括”或“包括”，或者有时在本文中使用术语“具有”。当在本文中使用时，“包括”不包括任何未指定的元素、步骤或成分。
术语“包括”指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“大约”指正负10％，优选正负5％，更优选正负2％，最优选正负1％。
在本规范的整个描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数包括复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应理解为考虑了多元性以及单一性。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以有所不同。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明仅由权利要求书定义。
本规范全文引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论是上文还是下文，均以引用方式全部并入本规范。此处的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借先前的发明提前披露。如果通过引用纳入的材料与本规范相矛盾或不一致，本规范将取代任何此类材料。
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以下示例仅用于说明目的，可更好地理解本发明及其优点。这些示例无意以任何方式限制本发明的范围。
本发明还具有以下特征：
1.一种用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法，包括
(a)用标签接触可通过从哺乳动物受试者活检获得的器官组织的细胞外基质；
(b)将所述标记的器官组织细胞外基质与感兴趣的化合物接触；
(c)与通过活检从未接触所述感兴趣的化合物的哺乳动物受试者获得的标记的器官组织细胞外基质相比，确定所述感兴趣的化合物是否调节ECM向所述需要沉积ECM的部位的移动，其中，对需要沉积ECM的所述部位的ECM运动的调节表明所述感兴趣的化合物是所述ECM运动的调节剂。
2.根据第1项所述的方法，其中调制是抑制。
3.根据第1项所述的方法，其中调制是提升。
4.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述器官组织包括筋膜基质、浆膜和/或外膜。
5.根据前述项中任一项所述的方法，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
6.根据前述项中任一项所述的方法，其中ECM包括蛋白质、多糖和/或蛋白聚糖。
7.根据前述项中任一项所述的方法，其中标签为染料或标签。
8.根据第7项所述的方法，其中所述染料为荧光染料。
9.根据前述项中任一项所述的方法，其中标记细胞外基质成分的胺基。
10.根据第9项所述的方法，其中细胞外基质组分的胺基由NHS酯标记。
11.根据第9项和第10项所述的方法，其中所述胺为伯胺。
12.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述标签共价偶联至细胞外基质成分。
13.根据前述项中任一项所述的方法，其中，通过将所述细胞外基质与包括所述标签的纸状材料接触，实现将通过所述哺乳动物受试者的活检获得的器官组织的细胞外基质与标签接触。
14.根据前述项中任一项所述的方法，其中在步骤(a)、(b)和/或(c)期间存在所述哺乳动物的体腔流体。
15.根据前述项中任一项所述的方法法，还包括步骤(a')将可通过活检从所述哺乳动物受试者获得的所述器官组织与包括在ECM中的可视化细胞的标签接触。
16.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述器官组织来自皮肤、肾脏、肺、心脏、肝脏、骨、腹膜、肠、膈膜或胸膜。
17.一种用于识别与细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动相关的生物标记物的方法，包括：
(a)用标签接触通过活检从哺乳动物个体获得的器官组织的细胞外基质；
(b)从所述标记的ECM中分离蛋白质，其向所述需要沉积ECM的部位移动；
(c)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列，从而将所述蛋白质识别为与ECM运动相关的生物标记物。
18.一种化合物，用于调节细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选治疗涉及ECM沉积的状况。
19.根据第18项所述的化合物，其中ECM运动由筋膜基质介导。
20.根据第18项或第19项所述的化合物，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
21.根据第18项至第20项中任一项所述的化合物，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括成纤维细胞。
22.根据第18项至第21项中任一项所述的化合物，其中ECM包括蛋白质、多糖和/或蛋白聚糖。
23.根据第18项至第22项中任一项所述的化合物，其中需要沉积ECM的部位为伤口。
24.根据第18项至第23项中任一项所述的化合物，其中调制为抑制。
25.根据第24项所述的化合物，其中所述抑制剂为表1中的任一分子。
26.根据第24项和第25项所述的化合物，其中ECM运动抑制剂选自盐酸多沙普兰、盐酸阿莫洛芬、新戊酸氟美松、帕莫酸吡嗪、磺胺喹恶啉钠盐、哌拉西林钠盐、碘克沙醇、甲基海因-5-(D)、伊曲康唑、盐酸氮卓斯汀、，盐酸阿霉素、倍他米松、硫链霉素、氯法齐明、脱水盐酸纳曲酮、瑞格列奈、盐酸丙氧卡因、马来酸替加色罗、苯丁氮酮、丙酸氟替卡松、匹万匹西林、醋酸氟考酮、苄星青霉素、盐酸哈洛芬酯、磺胺甲氧基哒嗪、左旋诺氟沙星、，美曲松、枸橼酸草酸胺盐、酮咯酸氨丁三醇、羟萘甲酸苯那敏、氟伐他汀钠盐、乙屈膦酸、二钠盐、马来酸甲丙嗪盐、氟罗沙星、美伐他汀、多潘立酮、阿法骨化醇、吡嗪酰胺、依本那明(-)、米诺地尔、磺胺苯唑、炔诺酮、法莫替丁、二金字塔、盐酸戊烯，盐酸奈福泮。
27.根据第24项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
28.根据第27项所述的化合物，其中ECM的过度沉积与疤痕和纤维增生性疾病相关。
29.根据第28项所述的化合物，其中所述纤维增生性疾病为特发性肺纤维化、纤维化间质性肺病、间质性肺炎、非特异性间质性肺炎的纤维化变体、囊性纤维化、肺纤维化、矽肺、石棉肺、哮喘中的任一种，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺动脉高压、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肾小球硬化、肾纤维化、糖尿病肾病、心脏病、纤维化瓣膜性心脏病、系统纤维化、类风湿性关节炎、手术导致的过度瘢痕，例如，固定疝气的手术、化疗药物诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化、黄斑变性、视网膜和玻璃体视网膜病变、动脉粥样硬化和再狭窄。
30.根据第18项至第23项中任一项所述的化合物，其中涉及ECM沉积的条件为ECM过度沉积。
31.根据第30项所述的化合物，其中ECM过度沉积与纤维增殖性疾病相关。
32.根据第18项至第23项中任一项所述的化合物，其中调制为促进。
33.根据第32项所述的化合物，其中促进ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置沉积不足。
34.根据第33项所述的化合物，其中ECM沉积不足与慢性伤口有关。
35.根据第18至23项和第32至34项中任一项所述的化合物，其中涉及ECM沉积的条件是ECM沉积不足。
36.根据第35项所述的化合物，其中ECM沉积不足与慢性伤口有关。
37.根据第18-36项中任一项所述的化合物，其中所述化合物可通过第1-16项中任一项的方法获得。
38.一种化合物，用于抑制细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选治疗涉及过度ECM沉积的状况。
39.根据第38项所述的化合物，其中需要沉积ECM的部位为伤口。
40.根据第38项和第39项所述的化合物，其中对ECM运动的抑制可防止ECM在与结疤相关的所述部位过度沉积。
41.根据第38项至第40项所述的化合物，其中所述化合物是ECM运动的抑制剂。
42.根据第38项至第41项所述的化合物，其中所述抑制剂为表1中的任一分子。
43.根据第38项和第42项所述的化合物，其中所述抑制剂选自以下组：盐酸多沙普兰、盐酸阿莫洛芬、新戊酸氟美松、帕莫酸吡嗪、磺胺喹啉钠盐、哌拉西林钠盐、碘克沙醇、甲基海因-5-(D)、伊曲康唑、盐酸氮卓斯汀、盐酸阿霉素，倍他米松、硫链球菌素、氯法齐明、脱水盐酸纳曲酮、瑞格列奈、盐酸丙氧卡因、马来酸替加色罗、苯丁氮酮、丙酸氟替卡松、哌万匹林、醋酸氟考酮、苄星青霉素、盐酸卤凡特林、磺胺甲氧基哒嗪、左旋诺氟沙星、麦地松、柠檬酸草胺盐、，酮咯酸氨丁三醇、羟萘甲酸苯那敏、氟伐他汀钠盐、依替膦酸、二钠盐、马来酸甲丙嗪盐、哈洛普金、美伐他汀、多潘立酮、阿法骨化醇、吡嗪酰胺、依本那明(-)、米诺地尔、磺胺苯唑、炔诺酮、法莫替丁、二金字塔、盐酸戊烯和盐酸奈福泮。
44.根据第43项所述的化合物，其中所述抑制剂优选为抗纤维化剂伊曲康唑、硫链霉素或氟伐他汀钠盐中的任何一种。
45.一种用于治疗肝内电子伤口的化合物，其中所述化合物为赖氨酰氧化酶抑制剂。
46.根据第45项所述的化合物，其中赖氨酰氧化酶抑制剂能够调节肝脏周围ECM组织的运动。
47.根据第46项所述的化合物，其中调制为促进。
48.根据第47项所述的化合物，其中促进ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置沉积不足。
49.根据第48项所述的化合物，其中ECM沉积不足与慢性伤口有关。
50.根据第45项至第49项所述的化合物，其中赖氨酰氧化酶抑制剂为BAPN。
51.一种用于治疗腹膜内电子伤口的化合物，其中所述化合物为赖氨酰氧化酶抑制剂。
52.根据第51项所述的化合物，其中赖氨酰氧化酶抑制剂能够调节腹膜组织周围ECM组织的运动。
53.根据第52项所述的化合物，其中调制为促进。
54.根据第53项所述的化合物，其中促进ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置沉积不足。
55.根据第54项所述的化合物，其中ECM沉积不足与慢性伤口有关。
56.根据第51项至第55项所述的化合物，其中赖氨酰氧化酶抑制剂为BAPN。
57.BAPN用于促进腹膜周围ECM组织的运动。
58.一种诊断纤维增生性疾病的方法，包括
(a)从纤维增生性疾病的风险患者获得血样或活组织检查；
(b)确定活检组织或血液中是否可检测纤维增生性疾病标记，其中检测血液或活检组织中的纤维增生性疾病标记指示纤维增生性疾病。
59.根据第58项所述的方法，其中所述方法还包括将检测的增殖性疾病标记物的量与对照值进行比较。
60.一种诊断肺纤维化的方法，包括
(a)从肺纤维化风险患者获得血样；
(b)确定血液中是否可检测肺纤维化标志物；
其中，检测血液中肺纤维化标记物的浓度指示肺纤维化。
61.根据第60项所述的方法，其中所述方法还包括将检测的肺纤维化标记物的量与对照值进行比较。
62.根据第61项所述的方法，其中血液中测定的肺纤维化标记物优选为Myo1e或Hnmpa3。
63.一种诊断肺纤维化的方法，包括(a)从肺纤维化风险患者获得肺活检；(b)确定肺活检组织中是否可检测肺纤维化标记，其中检测肺活检组织中的肺纤维化标记指示肺纤维化。
64.根据第63项所述的方法，其中所述方法还包括将检测的肺纤维化标记物的量与对照值进行比较。
65.根据第63项和第64项所述的方法，其中肺活检组织中测定的标记物优选为Hmgcs2或Bhmt。
66.一种治疗纤维化的方法，包括向需要的受试者投与有效量的中性粒细胞中和抗体，其中中和中性粒细胞阻止ECM移动，从而阻止ECM沉积形成纤维化组织，如果与纤维化组织的预治疗相比，纤维化组织减少，则继续治疗。
67.一种治疗纤维增生性疾病的方法，其中根据第58、60和63项中的任一项诊断纤维增生性疾病，其中治疗包括根据需要向患者复合施用至少一种ECM运动抑制剂，从而减少导致纤维增生性组织的过度ECM沉积。
68.根据第67项所述的方法，其中ECM抑制剂为第42项至第44项中的任一项。
69.根据第67项和第68项所述的方法，其中所述方法进一步包括监测单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，优选中性粒细胞。
70.根据第69项所述的方法，其中所述ECM运动抑制剂与另一ECM运动抑制剂结合，优选中性粒细胞中和抗体。
71.一种用于治疗骨髓增生的化合物，其中所述化合物为中性粒细胞中和抗体。
72.根据第71项所述的化合物，其中所述中性粒细胞中和抗体能够调节ECM组织的运动。
73.根据第72项所述的化合物，其中调制为抑制。
74.根据第73项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
75.根据第74项所述的化合物，其中ECM过度沉积与纤维化相关。
76.根据第71项至第75项所述的化合物，其中所述中性粒细胞中和抗体优选针对Ly6g、CD11b或CD18。
77.一种治疗肺纤维化的方法，包括根据需要向患者施用至少一种中性粒细胞中和抗体，从而抑制ECM移动和过度沉积到肺组织中，其中ECM过度沉积到肺组织中导致纤维化。
78.根据第77项所述的方法，其中所述中性粒细胞表达的整合素多于同一患者的其它中性粒细胞群。
79.根据第78项所述的方法，其中所述整合素优选为CD11b或CD18。
80.根据第77项至第79项所述的方法，其中所述中性粒细胞中和抗体优选针对Ly6g、CD11b或CD18。
81.一种中性粒细胞中和抗体，用于抑制细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选治疗涉及ECM沉积的状况。
82.根据第81项所述的方法，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
83.根据第82项所述的化合物，其中ECM的过度沉积与划痕有关。
84.根据第81项至第83项所述的方法，其中中性粒细胞中和抗体优选针对Ly6g、CD11b或CD18。
85.一种用于治疗伤口的化合物，其中所述化合物为趋化因子。
86.根据第85项所述的化合物，其中向需要的患者施用趋化因子。
87.根据第85项和第86项所述的化合物，其中所述趋化因子系经系统或局部施用。
88.根据第85项至第87项所述的化合物，其中所述趋化因子吸引中性粒细胞。
89.根据第85项至第88项所述的化合物，其中吸引中性粒细胞可促进ECM进入伤口，从而促进伤口愈合。
90.根据第85项至第89项所述的化合物，其中所述伤口为慢性伤口。
91.根据第85项至第90项所述的化合物，其中所述趋化因子优选为脂蛋白A4。
92.一种防止损伤后瘢痕形成的方法，包括使用至少一种ECM运动抑制剂，其中所述方法包括使用至少一种ECM运动抑制剂接触损伤部位，并且其中ECM运动抑制剂能够减少ECM沉积到损伤部位，从而减少疤痕的形成。
93.根据第92项所述的方法，其中ECM运动抑制剂为表1中的任一分子。
94.根据第92项和第93项所述的方法，其中ECM运动抑制剂为第43项中的任一项。
95.根据第92项至第94项所述的方法，其中所述抑制剂进一步为中性粒细胞中和抗体、白三烯受体活性抑制剂或一氧化氮合成抑制剂。
96.根据第92项至95项所述的方法，其中损伤部位在损伤部位的整个深度上与ECM运动抑制剂接触。
97.根据第92项至第96项所述的方法，其中靠近损伤部位的筋膜与ECM运动抑制剂接触。
98.根据第92项至第97项所述的方法，其中所述损伤为外科创伤。
99.一种用于防止疤痕形成的组合物，其包括项目93至95中的ECM运动抑制剂。
100.一种用于防止瘢痕形成的化合物，其中所述化合物是中性粒细胞白三烯受体活性的抑制剂。
101.根据第100项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂根据需要施用于患者。
102.根据第100项和第101项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂系统或局部施用。
103.根据第100项至第102项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂阻断中性粒细胞，从而阻断ECM移动和沉积，从而导致瘢痕形成。
104.根据第100项至第103项所述的化合物，其中所述伤口为慢性伤口。
105.根据第100项和第104项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂优选为LY255283或CP-105696。
106.一种用于防止瘢痕形成的化合物，其中所述化合物是中性粒细胞一氧化氮合成的抑制剂。
107.根据第106项所述的化合物，其中向需要的患者施用一氧化氮合成抑制剂。
108.根据第106项和第107项所述的化合物，其中所述一氧化氮合成抑制剂系全身或局部施用。
109.根据第106项至第108项所述的化合物，其中所述伤口为慢性伤口。
110.根据第106项至第109项所述的化合物，其中一氧化氮合成抑制剂阻断中性粒细胞，从而阻断ECM移动和沉积，从而导致疤痕形成。
111.根据第106项和第110项所述的化合物，其中所述一氧化氮合成抑制剂优选为W1400或L-Name。
112.一种治疗纤维化的方法，包括使用至少一种细胞外基质(ECM)运动抑制剂来减少ECM向需要较少ECM沉积的部位的运动，其中所述方法包括将哺乳动物受试者器官组织的细胞外基质与标记的ECM运动抑制剂接触，并且其中，朝向所述需要较少ECM沉积的位置的减少的ECM移动指示所述抑制剂减少过量ECM沉积。
113.根据第112项所述的方法，其中所述标签为NHS酯。
114.根据第112项和第113项所述的方法，其中NHS酯标签允许评估ECM向需要较少ECM沉积的场地移动是否在治疗之后减少。
115.根据第112项和第114项所述的方法，其中ECM运动的抑制剂为表1中的任何一种分子。
116.根据第112项至第115项所述的方法，其中所述抑制剂为第43项所述分子中的任何一种。
117.根据第112至116项所述的方法，其中ECM运动抑制剂选自中性粒细胞中和抗体、中性粒细胞白三烯受体活性抑制剂、中性粒细胞一氧化氮合成抑制剂、运动蛋白抑制剂，蛋白酶抑制剂或热休克蛋白抑制剂。
118.根据第112项至第117项所述的方法，其中所述NHS酯化合物组合物系经系统投与。
119.一种用于治疗肠内营养的化合物，其中所述化合物是中性粒细胞白三烯受体活性的抑制剂。
120.根据第119项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂被投与需要的患者。
121.根据第119项和第120项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂系统或局部施用。
122.根据第119项至第121项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂阻断中性粒细胞，从而阻断ECM运动。
123.根据第119项至第122项所述的化合物，其中ECM运动导致ECM沉积，从而形成纤维化组织。
124.根据第119项和第123项所述的化合物，其中白三烯受体活性抑制剂优选为LY255283或CP-105696。
125.一种用于治疗纤维化的化合物，其中所述化合物是中性粒细胞一氧化氮合成的抑制剂。
126.根据第125项所述的化合物，其中向需要的患者施用一氧化氮合成抑制剂。
127.根据第125项和第126项所述的化合物，其中所述一氧化氮合成抑制剂系全身或局部施用。
128.根据第125项至第127项所述的化合物，其中所述伤口为慢性伤口。
129.根据第125项至第128项所述的化合物，其中中性粒细胞一氧化氮合成抑制剂阻断中性粒细胞，从而阻断ECM运动。
130.根据第129项所述的化合物，其中阻断ECM移动可阻断过量ECM沉积并由此形成纤维化组织。
131.根据第125项和第130项所述的化合物，其中所述一氧化氮合成抑制剂优选为W1400或L-Name。
132.一种用于治疗肝组织纤维化的化合物，其中所述化合物是运动蛋白抑制剂。
133.根据第132项所述的化合物，其中运动蛋白抑制剂调节肝脏周围ECM组织的运动。
134.根据第133项所述的化合物，其中调制为抑制。
135.根据第134项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
136.根据第135项所述的化合物，其中ECM的过度沉积与肝纤维化相关。
137.根据第132项至第136项所述的化合物，其中所述运动蛋白抑制剂为槲皮素或KNK437。
138.一种用于治疗肝组织纤维化的化合物，其中所述化合物是蛋白酶抑制剂。
139.根据第138项所述的化合物，其中蛋白酶抑制剂能够调节肝脏周围ECM组织的运动。
140.根据第139项所述的化合物，其中调制为抑制。
141.根据第140项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
142.根据第141项所述的化合物，其中ECM的过度沉积与肝纤维化相关。
143.根据第138项至第142项所述的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂为组织蛋白酶B抑制剂、MMP12、组织蛋白酶G抑制剂或GM6001。
144.一种组织蛋白酶B抑制剂，用于抑制肝脏周围ECM组织的运动。
145.一种MMP12，用于抑制肝脏周围ECM组织运动。
146.一种组织蛋白酶G抑制剂，用于抑制肝脏周围ECM组织的运动。
147.一种GM6001，用于抑制肝脏周围ECM组织的运动。
148.一种用于治疗肝组织纤维化的组合物，其中所述组合物包括槲皮素、KNK437、组织蛋白酶B抑制剂、MMP12、组织蛋白酶G抑制剂和GM6001中的任一种。
149.一种用于治疗腹膜组织内纤维化的化合物，其中所述化合物是热休克因子的抑制剂。
150.根据第149项所述的化合物，其中热休克因子抑制剂能够调节腹膜组织周围ECM组织的运动。
151.根据第150项所述的化合物，其中调制为抑制。
152.根据第151项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
153.根据第152项所述的化合物，其中ECM过度沉积与纤维化相关。
154.根据第150至153项所述的化合物，其中热休克因子抑制剂为槲皮素或KNK437。
155.一种槲皮素，用于抑制腹膜周围ECM组织的运动。
156.一种KNK437，用于抑制腹膜周围ECM组织的运动。
157.一种用于治疗腹膜组织纤维化的化合物，其中所述化合物是运动蛋白抑制剂。
158.根据第157项所述的化合物，其中运动蛋白抑制剂能够调节腹膜组织周围ECM组织的运动。
159.根据第158项所述的化合物，其中调制为抑制。
160.根据第159项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
161.根据第160项所述的化合物，其中ECM过度沉积与纤维化相关。
162.根据第157项至第161项所述的化合物，其中所述运动蛋白抑制剂为西利奥布列文D或(S)-硝基博来司他丁。
163.一种用于治疗腹膜组织纤维化的化合物，其中所述化合物是蛋白酶抑制剂。
164.根据第163项所述的化合物，其中蛋白酶抑制剂能够调节腹膜组织周围ECM组织的运动。
165.根据第164项所述的化合物，其中调制为抑制。
166.根据第165项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
167.根据第166项所述的化合物，其中ECM过度沉积与纤维化相关。
168.根据第163项至第167项所述的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂为组织蛋白酶B抑制剂、GM6001或贝斯汀。
169.一种用于治疗腹膜纤维化的组合物，其中所述组合物包括槲皮素、KNK437、BAPN、西利奥布列文D、(S)-硝基博来司他丁、组织蛋白酶B抑制剂、GM6001或贝司他丁。
170.一种用作ECM运动抑制剂的化合物，其中所述化合物为硝胺。
171.根据第170项所述的化合物，其中抑制ECM向需要沉积ECM的位置移动可防止ECM在所述位置过度沉积。
172.根据第170项和第171项所述的化合物，其中ECM的过度沉积与疤痕和纤维增生性疾病相关。
173.根据第172项所述的化合物，其中所述纤维增殖性疾病为纤维化、肺纤维化、系统性硬化、肝硬化、心血管疾病、进行性肾病和黄斑变性中的任一种。
174.一种组合物，包括与化合物连接的NHS酯的。
175.根据第174项所述的组合物，其中NHS酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯。
176.根据第174项和第175项所述的组合物，其中NHS酯能够靶向伯胺。
177.根据第176项所述的组合物，其中初级胺出现在伤口中。
178.根据第174项至第177项所述的组合物，其中所述组合物系经系统投与。
179.根据第174项至第178项所述的组合物，其中所述NHS酯在局部或全身施用后允许靶向伤口。
180.根据第174项至第179项所述的组合物，其中所述化合物可通过项目1至16中任一项的方法获得。
181.根据第174项至第180项所述的组合物，其中所述化合物选自ECM运动调节剂、趋化因子、白三烯受体活性抑制剂和一氧化氮合成抑制剂。
182.根据第181项所述的组合物，其中所述趋化因子优选为脂蛋白A4。
183.根据第181项所述的组合物，其中白三烯受体活性抑制剂优选为LY255283或CP-105696。
184.根据第181项所述的组合物，其中所述一氧化氮合成抑制剂优选为W1400或L-Name。
185.一种用于诊断伤口的NHS酯，其中当全身施用时，NHS酯能够结合伤口细胞外基质中的细胞外胺，从而标记伤口中的细胞外胺。
186.根据第185项所述的用于诊断伤口的NHS酯，其中NHS酯进一步与报告分子结合。
187.一种诊断组合物，其包括NHS酯，其能够结合细胞外基质中的细胞外胺并结合报告分子，根据需要施用于患者，其中NHS酯能够将报告分子靶向于伤口的细胞外胺，从而为伤口贴上诊断标签。
188.根据第187项所述的诊断组合物，其中所述患者患有至少一种伤口。
189.一种检测内伤延伸的方法，其中所述方法包括向具有内伤的患者施用NHS酯，从而在伤口中标记使可检测伤口延伸的细胞外胺190。
190.根据第189项所述的方法，其中NHS酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯。
191.根据第189项和第190项所述的方法，其中NHS酯与报告分子结合。
192.根据第189项至第191项所述的方法，其中所述NHS酯系经系统投与。
193.一种用于治疗伤口的治疗组合物，其包括NHS酯和能够结合治疗伤口的化合物，其中NHS酯能够结合伤口的细胞外胺，从而将所述化合物靶向伤口。
194.根据第193项所述的治疗组合物，其中所述化合物可通过第1项至第16项中任一项的方法获得。
195.根据第193项和第194项所述的治疗组合物，其中所述化合物选自ECM运动调节剂、趋化因子、白三烯受体活性抑制剂和NOS抑制剂。
196.根据第195所述的治疗组合物，其中所述化合物为趋化因子，优选趋化因子脂蛋白A4。
197.根据第195项所述的治疗组合物，其中所述化合物为白三烯受体活性抑制剂，优选LY255283或CP-105696。
198.根据第195项所述的治疗组合物，其中所述化合物为NOS抑制剂，优选W1400或L-Name。
199.一种用于治疗慢性伤口的方法，包括：(a)用NHS酯化合物组合接触器官组织的细胞外基质；(b)执行步骤(b)之后，监测慢性伤口的进展情况，(c)如果慢性伤口组织减少，与慢性伤口预治疗相比，则继续进行治疗。
200.根据第199项所述的方法，其中在步骤(a)之前，能够结合到伤口中的胺的NHS酯与适合于愈合伤口的化合物结合，从而产生NHS酯化合物组合。
201.根据第199项和第200项所述的方法，其中在执行步骤(b)后，对慢性伤口的进展监测1小时至10天。
202.根据第199项至第201项所述的方法，其中所述化合物可通过第1项至第16项中任一项的方法获得。
203.一种治疗慢性伤口的方法，包括向有需要的患者施用有效量的NHS酯化合物组合，其中NHS酯能够靶向慢性伤口的伯胺，从而将所述化合物靶向慢性伤口，确定慢性伤口的愈合进程，如果慢性创伤组织比慢性创伤前减少，则继续治疗。
204.一种用于治疗伤口的方法，包括：(a)将器官组织的细胞外基质与NHS酯化合物组合接触；(b)执行步骤(b)之后，监测慢性伤口的进展情况，(c)如果伤口组织减少，与伤口预治疗相比，则继续进行治疗。
205.根据第204项所述的方法，其中在步骤(a)之前，将能够结合到伤口中的伯胺的NHS酯与用于伤口愈合的化合物结合，从而产生NHS酯-化合物组合。
206.根据第204项和第205项所述的方法，其中所述伤口为手术伤口。
207.根据第204项和第206项所述的方法，其中，在执行步骤(b)后，对伤口的进展监测1小时至3天。
208.一种治疗伤口的方法，包括向需要其的受试者施用有效量的NHS酯化合物组合，确定伤口愈合进展，并且如果伤口组织与伤口愈合前相比减少，则继续伤口愈合。
209.根据第199项、第203项、第204项和第208项所述的方法，其中NHS酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯。
210.根据第199项、第203项、第204项和第208项所述的方法，其中所述化合物可通过第1项至第16项中任一项所述的方法获得。
211.根据第199项、第203项、第204项和第208项所述的方法，其中所述化合物选自ECM运动调节剂、趋化因子、白三烯受体活性抑制剂和NOS抑制剂。
212.根据第211项所述的方法，其中所述化合物为趋化因子，优选趋化因子脂蛋白A4。
213.根据第211项所述的方法，其中所述化合物为白三烯受体活性抑制剂，优选LY255283或CP-105696。
214.根据第211项所述的方法，其中所述化合物为NOS抑制剂，优选W1400或L-Name。
215.一种用于识别与细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动相关的生物标记物的方法，包括：(a)用标签接触通过活检从哺乳动物个体获得的器官组织的细胞外基质；(b)从所述标记的ECM中分离蛋白质，其向所述需要沉积ECM的部位移动；(c)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列，从而将所述蛋白质识别为与ECM运动相关的生物标记物。
216.根据第215项所述的方法，其中所述标签为N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺酯。
217.一种生物标记物，可通过第215项所述的方法获得。
218.根据第217项所述的生物标记物，其中所述器官为肝脏。
219.根据第218项所述的生物标记物，其中所述生物标记物选自以下各项组成的群组：Rps4x、Calr、Gdi1、1SV、Ephx1、Cct2、Cth、Foxe3、Hadh、Acsf2、Hsp90aa1、Uba1、Slc25a13、Tuba1b、Prdx6、Ywhag、Ccdc18、Krt8、Actn4、Atp5a1、Lama2、Uqcrc1、Tubb4b、Capza1、Acaa2、Nudt7、Egfr、Acsm1、Got2、Hspa9、Sdha、Otc、Npnt、Cat、Synpo、Vcp、Etfb、Hnrnpa2b1、Sod1、Itch、Krt17、Bsg、Tst、Mdh1、Eef2、Gstm1、Pebp1、Spr、Eno1、Bdh1、Cps1、Ak3、Anxa5、Aldh2、Ppia、Hspa1l、Blvrb、Eci1、Slc27a2、Cyp2e1、Pccb、Ephx2、Gpd1、Hspd1、Rps3、Glt8d2、Myo3b、Ca3、Pygl、Tpi1、Hsp90ab1、Cyp2d10、Ndufs1、Inmt、Slc35g2、Glo1、Rpsa、Csad、Hpd、Uroc1、Sardh、Actb、Agrn、Ndrg2、Suclg2、Scp2、Atp5c1、Aox3、Lyz1、Aldh1l1、Glud1、Prdx1、Hnrnpa3、Clu、Hba、Mtco2、Dars、Lonp2、Ftcd、Prdm16、Usp5、Tufm、Ushbp1、Gbe1、Hspa8、Myh9、Pfn1、Tkt、Sdhb、Ighg1、Arsj、Hnrnpk、Selenbp1、Aco2、Pzp、Aldh6a1、Sec14l2、Sord、Hsd17b4、Eef1a1、Pgk1、Aldh8a1、Gnmt、Acsl1、Cyp3a11、Ldha、Aco1、Pgm1、Cbs、Serpinc1、Pbld2、Hmgcl、Tuba4a、Idh1、Hadha、Hmgcs2、Krt10、Stard10、Asl、Psmd2、Cyp2f2、Comt、Hsp90b1、Mdh2、Akr1c6、Anxa2、Atp1a1、Aldh7a1、Cltc、Cyp2d26、Hnrnpf、Abhd14b、Ces3a、Ubb、Uox、Akr1a1、Rps20、Anxa6、Hbb-b1、Arf3、Abcd3、Chdh、H3f3c、Ywhaz、Aldh4a1、Bhmt、Myl6、Acat1、Tkfc、Mccc2、Ahcy、Rnh1、Sucla2、Hgd、Isoc2a、Fdps、Dhrs1、Pkhd1l1、Krt18、Rgn、Cct8、Pck1、Got1、Krt72、Tinagl1、Krt42、Tgm2、Ass1、Me1、Acadvl、Gdi2、Hist1h4a、Ddx5、Haao、Agxt、Krt75、Mfap4、Aldob、Pdha1、Dmgdh、Cntf、Hagh、Hist1h2bc、Fmo5、Cs、Tcp1、Aldh9a1、Dcaf8、Aldh1a1、Mug1、Gapdh、Coq8a、Adgrl1、Eif5a、Psmd1、Pipox、Ak2、Lcp1、Vtn、Krt2、Eef1b、Nid2、Hadhb、Serpina1d、Rbm20、Fabp5、Trap1、Alb、Abat、Pklr、Ndufab1、Nit2、Hint2、Pgam1、Acly、Krt5、Eif3a、Nid1、Iqgap2、Fbp1、Urad、Ckm、Fasn、Reep6、Prdx5、Krt14、Pgrmc1、Tpm3、Rps5、Gstp1、Ehhadh、Etfa、Psmd12、Cyp2c50、Kng1、Mif、H2afz、Akr7a2、Lonp1、Selenbp2、Acat2、Hspg2、Ttc38、Rps9、Cox5a、Nsdhl、Xirp2、Hnrnpm、Ivd、Vim、Apoe、Copg2、Ssr1、Amdhd1、Klb、Atxn2、Adh5、Acox1、Hacl1、Gpt、Mthfd1、Mipep、Rpn2、Ttpa、Etfdh、Rplp0、Psmc6、Rpl6、Krt1、Esd、Eif4a1、Khk、Copa、Dbi、Fn1、Pdcd6ip、Ugdh、Gtf3c1、Gabrb3、Rps25、Atp5o、Por、Emilin1、Sds、Klhl1、Mycn、Prdx3、Aifm1、Ywhae、Slc27a5、Lamb2、Cyp2c54、Gsto1、Col6a6、Akr1d1、Sec13、Krt77、Col4a2、Cct3、Jup、9913 GN、Aldoa、Ywhaq、Bsn、Col6a2、Xrra1、Hdlbp、Gstz1、Ncl、Adh1、Dld、Asap2、Acox2、Uso1、Cyp3a13、Krt76、Fip1l1、Park7、Cfl1、Fbln1、Kyat3、Cpne7、Hint1、Gpx1、Hoxa4、Lap3、Cyb5a、Sephs2、Gsta3、Col4a3、Cyp2u1、Rrbp1、Cpt2、Krt79、Txn、Fabp1、Idh2、Acadm、Ces1、Akr1c13、Iigp1、Lamb1、Lama4、Grhpr、Mpo、Cct4、1 SV、Lrpprc、Rpl4、Fmo1、Marc2、Rpf1、Pde8b、Sec31a、Cyp2d9、Col5a2、Krt19、Msn、Rdh7、Cbr1、Lama5、Psmb3、Prelp、D1Pas1、Prdx2、Ecm1、Col7a1、Plg、Rpl3、Ncf2、Lamc1、Pah、Fbn2、Lta4h、Dhdh、Col6a4、Aass、Lmna、Acaa1b、Ddx1、Dsp、Krt16、Rpl15、Cmbl、Myl12b、Rab35、Senp5、Trim33、Mmrn2、Itih1、Adk、Reg3g、Cyp2c29、F13b、Acadl、Urgcp、Agmat、Ugt2b17、Rps14、Stard9、Lrfn1、Acaca、Acad11、Snd1、Acaa1a、Prodh、Col6a5、Rpl22、Cdkn2aip、Glyat、Uqcrc2、Rplp1、Lum、Dpf1、Acads、Gata3、Insrr、Dync1i1、Ccs、P4hb、Cyb5r3、Dpyd、Maob、Rack1、Ppa1、Nkapl、Fah、Cdc42bpg、Rps16、Shmt1、Dclk3、Nudt6、Cdc42、Hibadh、Rplp2、Col4a1、Serpina3m、Saa2、Mtch2、Pxdn、Atp5b、Batf3、Glul、Ugt1a1、Serpina1b、Eef1d、Pgd、Ltbp4、Lgals9、Aldh3a2、Decr1、Dbt、Mccc1、Banf1、Serpina1e、Col3a1、Acta2、Ywhab、Slc25a20、Chd7、Cyp2c40、Rad23b、Serpinf2、Col15a1、Chat、F13a1、Serpina1c、Cyb5b、Tfap2d、Fbn1、Nedd4、Rai1、Pabpc1、Mat1a、Col11a1、Dgcr8、Ddt、Acacb、Rpl9、Ptbp1、Dmbt1、Krt7、Col2a1、Col6a1、Megf6、Eef1g、Tf、Col4a4、Cox5b、Tgfbi、C1qbp、S100a11、Rps12、Gys2、Rnf43、Fam208b、Flg2、Apoa1、Pcbp1、Tnc、Fbln5、Rabepk、Ambp、Hpx、Upk1b、Vwf、Mlk4、Fh、Pnma1、Eif4g1、S100a8、Flna、Adipoq、Eif4h、Loxl1、Col18a1、Hal、Ltbp1、Anks1b、Kcnk4、Mup2、Ces1d、Bcl9、Col1a2、Fam65c、Aspdh、C4b、Slc25a5、Calml3、Dpysl2、Krt35、Sod2、Sall2、Myo16、Anxa7、Pggt1b、Zc3h12a、Vdac2、Atn1、Myh11、Il15ra、Msra、Hsd11b1、Hdgf、LRWD1、Pcca、Krt71、Dpt、Fgb、Apoa4、Sfswap、Efl1、Itih4、A1bg、Tnrc6c、Lasp1、Pdlim1、Zfhx3、Mgst1、Col8a1、Pc、Prg2、Ahsg、Myh4、Sptan1、Serpina3k、Hsd17b10、Krt4、Postn、Hrg、Atp8a2、Bgn、Col14a1、Polr2d、Col1a1、Anxa1、Ltk、Col16a1、Ttn、Arg1、Dcn、Col5a1、Krt6a、Fga、Efemp1、Acsl5、Col12a1、Ces2a、Arhgap5、Hspa5、Urah、S100a9、Cycs、Ptms、Rpl27a、Aqp1、Elk4、Pdia3、Fgg、Ftl1、Isoc1、Fus以及C3。
220.根据第219项所述的生物标记物，其中所述生物标记物优选为Ambp、F13a1、F13b、Itih1或PZP。
221.根据第217项所述的生物标记物，其中所述器官为腹膜。
222.根据第221项所述的生物标记物，其中所述生物标记物选自以下各项组成的群组：Lamc1、Nid1、Lama2、Syne2、Tpm2、Col6a2、Lamb2、Mmp20、Eno3、Col6a1、Krt86、Col14a1、Atp5b、Art3、Tinagl1、Lama4、1SV、Mb、Hspg2、Anxa1、Acta1、Cc2d1a、Pkm、Pygm、Apoc1、Myh3、Mdh2、Nid2、Aldoa、Plg、Apoe、Ca3、Col6a6、Tnnt3、Pgam2、Srl、Col16a1、Krt77、Vwf、Rad54l2、Pvalb、Myh7、Gsn、Dcn、Lamb1、Col15a1、Pgm1、Pgk1、Fam160b2、Aco2、Col4a2、Myh4、Mpo、Hspa8、Prelp、Ralgapa1、Prdx6、Prg2、Tnnc2、Atp5a1、Vdac1、Ldha、Efl1、Fga、Myh8、Reg3b、Fgg、Lum、Cps1、Magi3、Pfkm、Omd、Cpe、Tpi1、Ak1、Fam208b、Meltf、Krt33a、Serpina1b、Serpinf2、Col4a1、Ttn、Des、Sypl2、Hspd1、Tgfbi、Klhdc9、Mgp、Hapln1、Akap13、C3、Atp2a1、Bhmt、Fbn2、Kcng4、Mylpf、Bgn、Myot、Rev3l、Csf2rb、Mfap4、Cacna2d1、Filip1l、Fgb、Myom1、Osbpl8、Camsap1、Col9a2、Col5a1、Actn3、Egfbp2、Tpm1、Hrg、Matn1、Fbn1、Myoz1、Tmem207、Krt19、Ltbp4、Fhdc1、S100a11、Ubb、Tpm3、Ogn、Cdkn2aip、Ppa1、Emilin1、Serpina3m、Cpa3、Dpt、Lgals1、Tef、Ckm、Ampd1、Efhc1、Mmp9、S100b、Fasn、Cxcr1、Rgn、Tuba4a,Plch2、Hnrnpa2b1、Hpx、Cilp2、Kmt2a、Prdx1、Capza1、Chrnd、Casq1、S100a1、Pc、Apoa1、Col10a1、Spn、Actn2、Npepps、Apoa4、Arhgap5、Fnbp4、Bcl9、Serpina3k、Mvb12a、Sord、Ecm1、Ushbp1、Insrr、Aspn、Gapdh、Alb、Plec、Tprn、Krt10、Eef1a1、Comp、Clu、Lama5、Ppip5k1、Col5a2、Dsp、Postn、Ppfia3、Actc1、Tf、Wipf1、Itih4、Col11a1、Sepp1、Cycs、Asb3、Tgm2、Serpina1d、Fn1、Map2k4、Abcc3、Krtap3-1、Tmem184c、Vim、Fbln5、Cma1、Slc25a37、Myo3b、Med1、Col2a1、Amy2、Ube3b、Apobec2、Tnni2、Eno1、Lef1、Ryr1、Loxl1、Tuba1b、Bsg、Nup98、Ass1、Acan、Sgf29、Rps15、Krt42、Col1a2、Aldh2、Dock8、Cys1、Obscn、Fbxo48、Col9a1、Kiaa1109、Wdfy3、Taco1、Lyz1、GMCL1P1、Krtap15-1、Hsp90ab1、Krt6a、Hbb-b1、Ddx25、Foxe3、Mnt、Ppia、Gabrb3、Spp1、Pou2f3、Eef1a2、Dopey2、Pcca、Fmod、Pank1、Met、Prdx2、Hba、Chad、Tmem45a、F13a1、Krt16、Irf4、Cdh13、Aldob、Klhl41、Dgcr2、Ogdh、Hmcn2、Peli3、Sparc、Ywhab、Thbs4、Hist1h2bc、Hist1h4a、Matn3、S100a9、Adipoq、Col1a1、Asap2、Krt14、Krt75、Anxa6、Tcap、Cpb2、Atf4、Ldb3、Calml3、Ighg1、Trim33、Chat、Acaa1b、Brd3、Tubb4b、Hoxa4、Myl1、Spata6l、S100a8、Riok3、Alms1、Jup、Krt35、Isoc2a、Myh1、Krt76、Grem1、Gnmt、Elavl2、Hcls1、Krt34、Pdha1、Krt17、Hivep2、Mrps2、Ica1、Col11a2、H2afz、Flnc、Mybpc2、Mtco2、Vtn、Tmprss6、Rtn1、Krt8、Col3a1、Col12a1、Mknk2、Anxa5、Timmdc1、Acat1、Eif3a、Bmp2k、Krt5、Ccdc18、Gsk3a、Pde8b、Krt2、Actb、Krt1、Krt72、Cd22、Krt79、Krt24、Krtap19-5、Anxa2、Serpinc1、9913GN、Bcl2l14、Banp、Med19、Arg1、Zmym3、Upf1、Slc25a4以及Ndrg2。
223.根据第222项所述的生物标记物，其中所述生物标记物优选为腹膜ECM中的Grem1、Ogn、Chad或MMP9。
224.根据第217项所述的生物标记物，其中所述器官为鹿茸。
225.根据第224项所述的生物标记物，其中生物标记物选自以下各项组成的群组：Lamb1、Ubac1、Col4a2、Serpina1c、Col19a1、Tln1、Lamb2、Col8a1、Cdc37、Clu、Col4a1、Krt31、Postn、Lama5、Epg5、Ino80d、Pcca、Lamc1、Golga4、Nid2、Ptrf、Lum、Hrg、Vtn、Hspg2、Krt6a、C1qbp、Banf1、Trerf1、Col16a1、Hnrnpa3、Lama4、Col4a4、Tgfbi、Myh11、1SV、Serpinf2、Col15a1、Acta2、Gp2、Dpt、Cep295nl、Insrr、Fn1、Tgm2、Tpm1、Als2、Anxa6、Myl6、Plg、Lama2、Pigr、Selp、Serpina1d、Muc2、Nid1、Ecm1、Tpm2、Col3a1、Runx1、Fgb、Flna、Pc、Fga、Ltbp1、Col6a4、Col5a1、Jchain、Synm、Serpina3k、Tubb5、Fgg、Usp18、Serpinc1、Flnc、Dscaml1、Phkb、Npnt、Col5a2、Ahsg、Krt16、Itln1b、Apoa4、Mfap5、Smtn、Col6a2、Fbln2、Synpo2、Fbn2、Col1a1、Fbn1、Iglc2、Col6a1、Ltbp4、Col1a2、Dmbt1、Palld、Prelp、Col6a5、Col18a1、Reg3g、Reg3b、Loxl1、Pou3f3、Col2a1、Hap1、Smchd1、Trpv6、Svs4、Adamtsl4、Exd2、Clca1、Ace、Krt85、Hspb1、Des、Hspd1、Ckmt1、Ivl、Zg16、Tinagl1、Abca3、Got2、Emilin1、Fndc7、Hnrnpa2b1、Slc25a4、Actn1、Myl9、Cnn1、Tubb4b、Ptma、Vim、Ca1、Epx、Col12a1、Prg2、Tagln、S100a8、Alb、Tuba1b、9913GN、Hnrnpk、Colec12、D1Pas1、Pglyrp1、Ezr、S100a9、Tpm3、Nlrp3、Cdsn、Psmb7、Hist2h2aa1、Mbl2、Efemp1、Krt5、Diras2、Krt79、Vcl、Lyz1、Krt42、Itih4、S100a11、Krt1、Krt77、Krt14、Krt76、Arg1、Cyfip2、Pkd1l3、Calml3、Nup214、Atp5a1、Hist1h2bc、Prdx1、Krt2、Ppia、Ykt6、Hist1h1c、Nes、Gapdh、Krt17、Dsp、Spag5、Pde8b、Lipc、Krt75、Txn、S100a6、Jup、Actb、Krt10、Mpo、H3f3c、Krt71、Dsg1b、Hspa2、Apoa1、Pkm、Hba、Plec、Hbb-b1、Eef1a1、Anxa2、Tmprss13、Anxa1、Krt25、Tnc、Rgs8、Ubb、Psmb4、Krt80、Pkp1、Cfl1、Myh9、Tgm1、Ywhaz、Hbb-b2、Poli、Hsp90ab1、Eef2、Brap、Krt24、Lmna、Prdx2、Srcin1、Rps3、Nccrp1、Mylk、Tgm3、Krt23、Cpa4、Psmb2、Eno1、Pgk1、Blmh、Eif6、Aldh9a1、Krt19、Fabp5、Krt35、Psmb5、Serpina1e、Vdac2、Hspa5、Gsdma3、Aldoa、Tpi1、Hal、Krt73、Set、Krt13、Eif4a1、Pof1b、Krt12、Psma1、Ankrd17、Capn1、Ccdc6、Psma3、Krt4、Psma6、Psma7、Ide、Ahcy、Mast1、Rpl22以及Vdac1。
本发明的示例
本发明中使用的材料和方法
小鼠和基因分型。
所有小鼠品系(C57BL/6J、En1Cre、R26VT2/GK3、R26mtmg、R26iDTR、Rag2–/–、Fox ChaseSCID)要么从查尔斯河杰克逊实验室获得，要么如前所述在斯坦福大学研究动物设施12产生。动物被安置在亥姆霍兹中心。动物设施的房间保持恒温恒湿，光照周期为12小时。动物们可以自由地获得食物和水。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并根据第55.2-1-54-2532-61-2016和55.2-2532-02-19-23进行注册，并根据严格的政府和国际指南进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。来自双转基因报告小鼠的Cre阳性(Cre+)动物通过背部真皮中的相关荧光进行鉴定。进行基因分型以区分含有200碱基对(bp)Cre片段(Cre+/-)的小鼠系和野生型(Cre–/-)。按照制造商的指南，使用QuickExtractDNA提取液(Epicenter)从耳夹中提取基因组DNA。向每个24μl PCR中添加DNA提取物(1μl)。使用含有1×珊瑚缓冲液、10mM dNTPs、0.625单位Taq聚合酶、0.5μM正向引物“Cre_genotype_4F”-5ATT GCT GTC ACT TGG TCG TGG C-3”(SEQ ID NO:2，Sigma)和0.5μM反向引物“Cre_genotype_4R”-5GGA AAA TGC TTC TGT CCG TTT GC-3(SEQ ID NO:3，Sigma)的Taq PCR核心试剂盒(Qiagen)建立反应混合物。进行PCR时，在94℃下初始变性10min，扩增30个周期(在94℃下变性30s，在56℃下杂交30s，在72℃下延伸30s)，在72℃下最终延伸8min，然后冷却至4℃。在每个实验中，包括阴性对照(非模板和提取)和阳性对照。反应在Eppendorf主循环器中进行。反应通过凝胶电泳进行分析。
病毒颗粒产生。
表达GFP或Cre重组酶的腺相关病毒血清型6(AAV6)是通过将pAAV-U6-sgRNA-CMV-GFP(Addgene，8545142)或pAAV-Cre重组酶载体(Takara-Bio，6654)、pRC6和pHelper质粒(从AAVpro无辅助系统(Takara-Bio，6651)中获得)转染
Figure BDA0003505645070000591
细胞系(Takara-Bio，632273)产生的。用PEI转染试剂进行转染，72小时后收集病毒。使用
Figure BDA0003505645070000592
试剂盒(Takara Bio，6666)提取AAV6病毒，并使用实时PCR计算滴度。
人类皮肤样本。
通过慕尼黑红十字会医院整形美容外科科(参考号2018-157)和皮肤科和过敏科，从18-65岁的捐赠者身上收集了来自不同解剖位置的新鲜人体皮肤和疤痕活组织检查，慕尼黑伊萨尔技术大学克林库姆研究中心(参考号85/18S)。所有受试者在皮肤活检前均获得知情同意。采集后，直接处理这些样品进行组织培养或用PFA固定，然后进行冷冻切片或石蜡切片，然后进行组织学或免疫荧光分析。
筋膜体外培养。
使用了两个体外系统。为了实时显示基质结构的变化，从P0 C57BL/6J新生儿中切除直径为2mm的活组织切片，并进行实时成像(SCAD分析，专利申请号PLA17A13)。为了确定DT治疗的有效性，在嵌合移植物实验中手动将肌肉与筋膜与其余皮肤分离，并在环境温度下与DT在不同浓度下孵育1h。接下来，用PBS洗涤样品，并在37℃、5％二氧化碳的试管中，在补充有10％血清(赛默飞世尔)、1％青霉素/链霉亲和素(赛默飞世尔)、1％谷氨酰胺(赛默飞世尔)和1％非必需氨基酸溶液(赛默飞世尔)的DMEM/F12(赛默飞世尔)中培养。每隔一天常规交换一次培养基。在培养第6天用2％多聚甲醛固定样本，并进行组织学处理。
组织学。
组织样品在4℃下用2％多聚甲醛固定在PBS中过夜。样品用PBS冲洗三次，嵌入最佳切割温度(OCT，Sakura Finetek)中，并在干冰上快速冷冻。在CryostarTM NX70低温恒温器(赛默飞世尔)中制作6微米切片。根据制造商指南，使用Sigma-Aldrich三色染色试剂盒进行Masson三色染色。对于免疫标记，切片风干5分钟，并用-20℃冷冻丙酮固定20分钟。切片用PBS冲洗三次，并在室温下用10％的PBS血清封闭1h。然后，在室温下将切片与一抗在封闭溶液中孵育3h。然后用PBS冲洗切片三次，并在室温下与二级抗体在封闭溶液中孵育60min。最后，切片在PBS中冲洗三次，并用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的荧光安装介质进行安装。使用的主要抗体：山羊抗aSMA(1:50，Abcam)，兔抗TUBB3(1:100，Abcam)，鼠抗THY1(CD90)(1:100，Abcam)，鼠抗CD24(1:50，BD biosciences)，兔抗DPP4(CD26)(1:150，Abcam)，兔抗PECAM1(CD31)(1:10，Abcam)，鼠抗CD34(1:100，Abcam)，兔抗胶原I(1:150，Rockland)，兔抗胶原III(1:150，Abcam)，兔抗胶原VI(1:150，Abcam)，兔抗DLK1(1:200，Abcam)，鼠抗ERTR7(1:200，Abcam)，鼠抗F4/80(1:400，Abcam)，兔抗LYVE1(1:100，Abcam)，鼠抗MOMA2(1:100，Abcam)，山羊抗PDGFRA(1:50，研发系统)，鼠抗LY6A(Sca1:150，Biolegend)，大鼠抗CD44(1:100，Abcam)，兔抗NOV/CCN3(1:20，Elabscience)，绵羊抗FAP(1:100，研发系统)。针对合适物种的PacificBlue、AlexaFluor488、AlexaFluor568或AlexaFluor647共轭抗体(1:500，Life technologies)用作二级抗体。
显微镜检查。
组织切片使用蔡司AxioImager进行成像。Z2m(卡尔蔡司)。对于伤口的整体安装3D成像，将固定样本用低熔点琼脂糖(Biozym)嵌入35mm玻璃底皿(Ibidi)中，并静置固化30分钟。使用徕卡SP8多光子显微镜(德国徕卡)进行成像。对于筋膜培养物的实时成像，样本如上图所示嵌入。注意安装样品时，蒙皮朝上朝向物镜。然后添加成像介质(DMEM/F-12；SiR-DNA 1:1000)。在多光子显微镜下进行超过20小时的延时成像。使用改进的培养系统，加热和气体控制(ibidi 10915和11922)，以保证成像期间的生理和稳定条件。温度控制设置为35℃，添加5％CO2的空气。每小时记录二次谐波信号和绿色自荧光作为参考。使用Imaris9.1.0(位平面)和ImageJ(1.52i)处理3D和4D数据。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。
图像分析。
使用ImageJ分析组织学图像。为了在命运图实验中量化标记细胞，发明者手动定义了伤口、周围真皮和相邻筋膜区域。发明者将伤口定义为两侧近毛囊两侧的区域，从表皮底部向下延伸到毛囊凸起的水平。周围真皮区域被定义为紧靠两侧伤口床的200微米区域。筋膜区域定义为伤口正下方的组织。通过量化DAPI和所需标记(如DiI、GFP等)通道双阳性的颗粒，确定每个区域中标记细胞的数量。通过量化标记基质和胶原I+III+VI染色信号双阳性的区域，确定标记基质在伤口区域的覆盖率。En1Cre的细胞密度；用DT治疗的R26iDTR培养物通过将总细胞(DAPI)除以基质面积(胶原I+III+VI)来量化，胶原密度计算为整个切片面积的胶原面积覆盖率。通过跟踪二次谐波产生(SHG)和自荧光通道中样品上两个最远点的长度，确定活体成像培养中的基质运动。在时间0时，纵向标准化为原始长度。使用第0天的原始区域对每个时间点的伤口大小进行标准化。从疤痕中部随机选取两个侧面毛囊作为参考，对疤痕长度进行量化。通过平均灰度值计算相对荧光强度(RFI)，并对真皮图像进行归一化。分形分析是使用ImageJ插件“FracLac”29(FracLac2015Sep090313a9390)进行的，其设置和预处理与前面描述的相同。
动物筋膜的DiI标记。
使用活检冲头在8-10周龄C57BL6/J小鼠背部创建两个直径为5mm的全层切除伤口。将10-20μl亲脂性“VybrantTM DiI”染料(Life technologies，V22885)注射到背部肌肉正上方的暴露筋膜中。伤后第9天和第14天采集受伤组织，并通过荧光显微镜进行组织学和成像处理。
嵌合皮肤移植。
从R26mtmg、R26VT2/GK3、En1Cre的背部皮肤收集直径为6mm的全厚度活组织切片；R26mtmg，En1Cre；R26iDTR，或C57BL6/J成年小鼠。在荧光立体显微镜(M205 FA，徕卡)下，使用Dumont#5镊子(精细科学工具)和26G针头，以肌状盘状肌层作为解剖学参考，小心地将筋膜和肌层与真皮和表皮分离。来自En1的筋膜+肌肉样本的EPFCre；R26iDTR小鼠在环境温度下用20mg/ml的白喉毒素(Sigma-Aldrich，D0564)或仅用DMEM/F12作为载体孵育1h，然后用PBS进行3个洗涤步骤。此时，通过在环境温度下将100μM Alexa FluorTM NHS-ester(Lifetechnologies，A20006)或太平洋蓝琥珀酰亚胺酯(赛默飞世尔，P10163)在PBS中培养1h，然后用PBS进行3个洗涤步骤，对基质样品进行标记。通过将一种小鼠品系的表皮+真皮部分置于另一种品系的肌肉+筋膜的顶部，并在4℃下在含有2ml DMEM/F12的35mm培养皿中静置20min来制备嵌合体。特别注意保留不同层的原始顺序(从上到下：表皮->真皮->肌肉->筋膜)。然后，在活检中间用活检打孔器从嵌合移植物中取出2毫米的“深”全层厚度。为了创造“浅表”伤口，在重建底部之前，仅在表皮+真皮的一半进行2mm切除。然后将“受伤”嵌合移植物移植到8-10周龄RAG2-/-或Fox Chase SCID免疫缺陷小鼠背部新制作的直径为4mm的全层切除伤口中。在移植前，采取预防措施清除新鲜伤口中的宿主血液，并在结束麻醉前让移植物干燥至少20分钟，以增加移植成功率。为了防止小鼠移除移植物，在移植物顶部放置透明敷料(Tegaderm，3M)。
原位基质跟踪和EdU脉冲。
C57BL6/J小鼠在受伤前4天和2天接受皮下注射20微升10mg/ml FITC NHS-ester，生理盐水中含有0.1M碳酸氢钠pH9(46409，Life technologies)。在受伤后2、6或13天，小鼠在PBS中接受200μl i.p.注射1mg/ml EdU。在EdU脉冲24小时后采集样本，并进行冷冻切片和荧光显微镜成像处理。
流式细胞仪。
筋膜和真皮与C57BL6/J或En1Cre的背部皮肤物理分离；R26mTmG小鼠在荧光立体显微镜下与之前一样。收获的组织用外科剪刀切碎，并用含有1mg/ml胶原酶IV、0.5mg/ml透明质酸酶的酶混合物消化，和25U/ml DNA酶I(Sigma-Aldrich)在37℃下培养30分钟。过滤得到的单细胞悬浮液，并在4℃下与结合/未结合的一级抗体(稀释度1:200)孵育30分钟，然后在需要时在4℃下使用合适的二级抗体培养30分钟。清洗细胞并用Sytox蓝色染料(稀释度1:1000。Life technologies，S34857)染色，以排除死细胞。使用FACSAria III(BDBioscience)对细胞进行流式细胞计数分析。使用的主要抗体：抗DLK1(Abcam)、抗CD9(Santa Cruz)、抗CD271(LNGFR)(Miltenyi)、抗F4/80(Abcam)、抗790-抗NG2(Santa Cruz)、FITC-抗DPP4(CD26)(eBioscience)、抗PerCP-EFFluor710-抗ITGB1(CD29)(eBioscience)、抗CD34(Abcam)、PerCP-Cy5。5-抗CD24(eBioscience)、APC-Fire750-抗CD34(Biolegend)、APC-抗ITGA7(研发系统)、PerCP-Cy5。5-抗LY6A(Sca1)(eBioscience)、PE-Vio770-抗PDGFRA(Miltenyi)、PerCP-Vio700-抗CD146(Miltenyi)、APC-抗PECAM1(CD31)(eBioscience)、EFFLuor660-抗LYVE1(赛默飞世尔)、APC-LY76(TER119)、APC-抗EPCAM(CD326)和APC-抗PTPRC(CD45)。使用的二级抗体：AlexaFluor488山羊抗兔(生命技术)，AlexaFluor568山羊抗鼠(生命技术)。
扫描电子显微镜。
收集成年C57BL6/J小鼠的皮肤活组织切片，并像以前一样手动分离筋膜。然后用多聚甲醛和戊二醛(各占3％)将样品固定在pH值为7.4的0.1％二碳酸钠缓冲液中过夜(德国电子显微镜科学公司)。样品在逐步乙醇中脱水，并通过临界点法干燥，使用CO2作为过渡流体(Polaron Critical Point Dryer CPC E3000；Quorum Technologies)，并通过扫描电子显微镜观察(JSM 6300F；JEOL，德国)。
ePTFE膜植入物。
用活检冲头在8周大的En1Cre背部造成两个直径为6mm的全层切除伤口；R26VT2/GK3或C57BL6/J小鼠。在周围皮肤和下面的背侧骨骼肌之间植入直径为8mm的无菌ePTFE不透膜
Figure BDA0003505645070000631
以覆盖右侧的开放性伤口。为此，使用Dumont#5镊子和抹刀(10090-13，精细科学工具)松开周围皮肤。双层膜植入时附着面朝外，以促进真皮细胞附着，而光滑表面与筋膜直接接触。左侧假对照伤口接受了相同的程序，没有植入任何薄膜。在指定的时间点对每个伤口进行拍照，并使用ImageJ对伤口区域进行拍照。受伤后任何给定时间点的伤口大小表示为初始(第0天)伤口面积的百分比。伤后7或63天，采集样本并进行组织学处理。
释放成年小鼠的筋膜损伤。
用活检冲头在8周龄雄性C57BL6/J小鼠背部造成两个直径为5mm的全层切除伤口。左侧伤口周围的皮肤使用消毒镀金3x5 mm genepaddles(哈佛器械，#45-0122)与下方骨骼肌分离，以释放筋膜层。右侧伤口作为对照。在指定的时间点对每个伤口进行数字拍照，并使用Photoshop(Adobe Systems，加利福尼亚州圣何塞)对伤口区域进行拍照。受伤后任何给定时间点的伤口大小表示为初始(第0天)伤口面积的百分比。在指定时间点采集的组织进行冷冻切片和Masson三色染色进行组织学检查。
用AAV6-Cre病毒颗粒对幼鼠进行筋膜细胞消融和DT治疗。
在出生后第11天(P11)R26iDTR小鼠背部，使用活检冲头创建两个直径为3mm的全厚度切除伤口。在两个伤口之间的区域皮下注射20μl表达Cre的6型腺相关病毒(AAV6-Cre)或表达AAV6的对照eGFP(AAV6-eGFP)，病毒滴度为5x1011/ml。将PBS中1ng/μl的白喉毒素(DT)溶液以5ng/g的剂量每天腹腔注射给每只小鼠一次，持续7天。伤后7天采集组织。
统计数字。
所有图均表示平均值，误差条表示SEM。使用GraphPad Prism软件(6.0版，GraphPad)进行统计分析。统计测试值和p值在图例和相应图中规定。为方便起见，低于0.0001的p值等于0.0001。
示例1：伤口成纤维细胞、血管系统、巨噬细胞和神经来源于皮下筋膜。
为了绘制所有有助于伤口的细胞的起源图，发明者通过将嵌合物、皮肤和筋膜、移植物移植到活体动物中，开发了一种命运图绘制技术(图1a和“方法”)。发明者从所有细胞中组成性表达GFP的小鼠身上获取筋膜，并分别从组成性表达TdTomato的小鼠身上获取皮肤，并在GFP+筋膜上重新组装TdTomato+皮肤。发明者在移植的中段做了一个全厚的伤口，然后将整个嵌合组织移植到成年小鼠的背部。在这些移植实验中，通过分别分析GFP+或TdTomato+细胞的相对存在，可以从供者筋膜或真皮观察宿主伤口中的整个细胞贡献。
伤后14天(dpw)，伤口床中80.04±3.443％的标记细胞为GFP+，表明为筋膜起源(图1b)。GFP+筋膜衍生细胞堵塞整个伤口，并与覆盖伤口的新生表皮接壤(图1c)。来自筋膜的细胞也聚集在周围的真皮中，占伤口周围0.2mm半径内标记细胞总数的35.46±4.938％(图1b-c)。81.63±12.84％来自筋膜的aSMA+伤口成纤维细胞，更引人注目的是，神经、内皮、，伤口内的巨噬细胞也主要来源于筋膜(表1，图1d-e)。
接下来，发明者采用了一种独立的体内标记方法，将DiI染料直接注入筋膜(参见“方法”和图7a)。与嵌合体移植实验相似，在14dpw时，DiI标记的细胞填充伤口和周围真皮，而在未损伤的对照组中，标记的细胞保留在筋膜中(图7b)。伤口中56.71±9.319％的筋膜来源细胞是表达ITGB1、ER-TR7、THY1或PDGFRa的成纤维细胞(图7c)。伤口中多达18.94±2.371％的筋膜来源细胞为单核细胞/巨噬细胞，筋膜对伤口淋巴管、内皮细胞和神经也有贡献(图7d)。
总之，两种独立的命运图方法证明筋膜是真皮表面伤口中成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和周围神经的主要贮存器。
示例2：疤痕的严重程度取决于筋膜上有多少成纤维细胞。
发明者先前表明，所有瘢痕形成成纤维细胞在胚胎发生早期表达ENGRAIED-1(En1)，发明者将这些细胞称为En1系阳性成纤维细胞或EPF。通过将En1-Cre重组酶驱动因子(En1Cre)与双色荧光报告子(R26mtmg)杂交，发明者可以在皮肤和筋膜室中追踪所有GFP+EPF12-13。然后，发明者使用En1Cre分析了筋膜与真皮的细胞构成；R26mTmG双转基因小鼠。成纤维细胞是主要的筋膜细胞类型(占总活细胞的71.1％)，而真皮占总成纤维细胞的比例显著较低(56.4％，图8a-b)。从总成纤维细胞组分来看，筋膜中的EPF(GFP+)比Engrailed1幼稚成纤维细胞(ENF，TDF+)多两倍(分别为61.2％和31.8％)。而在真皮中，EPF的含量高出6倍(EPF和ENF分别为83.13％和12.78％，图8c-d)。筋膜也富含再生细胞类型，包括内皮细胞(CD31)和淋巴管(Lyve-1)，而筋膜和真皮中的巨噬细胞(F4/80)和神经细胞(CD271)组成相似(图8e)。因此，较高的成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞含量以及较低的EPF/ENF比率将筋膜与真皮区分开来。
然后，发明者使用双光子显微镜生成整个背筋膜层的高分辨率3D图像。EPF被楔入筋膜内一种特殊的多层结构中。EPF在背腹轴上以连续垂直薄片的单层排列(图8f)。整个背部均有筋膜EPF(图8g)。侧视图3D图像显示EPF从筋膜延伸并穿过PC肌肉的地形连续性(图8h)。PC肌肉层结束的区域，如肢体连接处附近，显示连续的EPF穿过真皮和筋膜层，没有清晰的边界(图8i)。此外，在穿过神经束和血管的PC开口处观察到类似的EPF连续体(图8j)。为了观察筋膜EPF是否容易进入上层，发明者在En1Cre中产生了切除伤口；R26mTmG成年小鼠。仅在3dpw后，观察到EPF聚集体从下方肌肉层的裂缝向上涌向开放伤口(图8k)。总的来说，观察结果表明，筋膜EPF在受伤时很容易穿过上真皮层，并且不受PC肌肉的阻碍，PC肌肉看起来多孔且易于接近。
损伤越深，产生的疤痕越严重。因此，发明者通过分析深部和浅部伤口中筋膜和真皮的成纤维细胞贡献程度，研究了这种相关性是否可归因于筋膜。
为了更精确地追踪成纤维细胞的贡献，发明者通过使用这些小鼠进行嵌合皮肤移植(En1Cre；R26mTmg)，将遗传谱系追踪方法与解剖命运图相结合。发明者使用带有可追踪的EPF和无法追踪的补充组织的筋膜或真皮，然后仅通过真皮而不是下面的筋膜制造表面伤口，或者通过两个组织进行深度切除(图2a)。
14天后，深部损伤的伤口大小是浅部损伤的1.7倍(图2b-c)。深部伤口的筋膜EPF数量是浅部伤口的两倍，而真皮EPF在这两种情况下保持不变(图2d)。伤口中筋膜EPF的丰度与伤口大小直接相关，因此疤痕严重程度，而真皮EPF没有相关性(图2e-f)。在未受伤的对照移植物中未观察到这些隔室之间的交叉，表明筋膜EPF向上流入是由损伤引起的(图9a-b)。
为了确定筋膜成纤维细胞在伤口中的最终命运，发明者用可追踪的筋膜EPF对嵌合移植物进行了长期追踪。10周后，伤口床上完全没有筋膜EPF(图9c)。发明者发现，在早期创伤阶段，皮肤和筋膜EPF的细胞死亡率相似且较低(<5％)(图9d-e)，表明筋膜来源的成纤维细胞通过非凋亡机制从成熟瘢痕中清除。
在确定筋膜EPF是指导和实施创伤的原代细胞后，发明者试图通过共免疫染色将筋膜EPF置于先前报道的成纤维细胞谱系标记的框架中。先前用于定义伤口成纤维细胞CD24、CD34、DPP4(CD26)、DLK1和LY6A(Sca1)的其它来源和谱系的标记物在筋膜型EPF中比真皮型EPF更为突出，并且所有五种标记物在进入伤口时都被令人惊讶地下调(图10)。流式细胞术证实在未损伤的情况下，筋膜成纤维细胞与真皮成纤维细胞中DPP4(CD26)、ITGB1(CD29)、LY6A(SCA1)和PDGFRa的表达较高(图11a-c)。分类的筋膜EPF也显示低细胞异质性，主要人群表达Sca1+PDGFRα+(87.0％)和CD26+CD29+(72.8％，图11d)。这一广泛的标志物融合强调筋膜EPF是创伤成纤维细胞的最终细胞来源。
示例3：筋膜基质转向产生疤痕。
然后，发明家们研究了筋膜凝胶本身。二次谐波产生(SHG)信号和扫描电镜照片均显示筋膜中有大量的胶原纤维呈卷曲排列，表明存在松弛和不成熟的基质储库(图3a-b)。纤维排列的分形分析表明，筋膜呈现出更密集的基质结构，具有高分形维数和低空隙率值。另一方面，真皮基质显示较厚的胶原纤维，其拉伸和编织性更强(图3c)。
筋膜基质本身的不成熟促使我们检查它是否可以作为皮肤伤口临时基质组织的储存库。为了回答这个问题，发明家们首先开发了一个孵化室，可以在数天内对筋膜基质进行实时成像(见“方法”)。值得注意的是，超过30小时的SHG信号记录以11.4μm/h的速率照亮了整个基质在筋膜上的转向(图3d-e)。假设在体内有类似的速率，筋膜基质本身在7天内可以移动约2mm，并说明哺乳动物中临时基质沉积的动力学。
为了测试筋膜基质是否在体内向上射入伤口，发明者开发了一种技术，使用嵌合移植物追踪筋膜基质并绘制其命运图。在这项新试验中，发明者切除筋膜，并使用AlexaFluor 647NHS-ester对其基质进行荧光标记。发明者将标记的筋膜与未标记的受伤真皮结合，并将嵌合移植物移植到宿主背部皮肤中(图12a)。伤后7天，筋膜中的标记基质向上延伸，堵塞开放性伤口(图12b)。定量显示，筋膜衍生基质覆盖伤口中总I、III和VI胶原含量的74.78±12.94％(图12c)。活体成像和基质示踪实验表明，筋膜基质运动不是单个成纤维细胞拉动单个纤维的结果。相反，这些是柔韧的基质凝胶的运动，向上延伸以塑造伤口。发明者遵循荧光标记进入晚期伤口阶段，发现荧光标记在伤口床的特定区域随时间减少(图12d)。穿梭和标记基质的高倍图像表明，这些区域的信号减少反映了晚期伤口中基质纤维的主动重塑(图12e-f)。
然后，发明家们询问真皮基质是否也可以控制。利用嵌合体实验，发明者用不同的荧光NHS-ester标记真皮和筋膜。只有筋膜基质能够堵塞开放性伤口(图12g-j)，而真皮基质完全不动。皮肤基质在浅表损伤中也保持不动，通过重新基质沉积愈合(图12k-l)。
为了明确证明筋膜基质被导入并堵塞开放性伤口，发明者在受伤前用FITC NHS-ester原位标记筋膜基质(图3f)。与嵌合体实验相似，伤口内的主要基质被标记，因此起源于筋膜。分形测量显示，虽然筋膜纤维通常以平行片状排列，但在伤口边缘，这些片状物膨胀3dpw，形成高度多孔的塞子，基质纤维构象紊乱(图3g、i和图13a-b)。令人惊讶的是，在受伤七天后，筋膜基质也出现在焦痂中(图3g)。在3和7dpw时，SELP+激活的血小板浸润并聚集在筋膜基质纤维之间(图13c)，表明血小板激活和凝固最终在焦痂中，与筋膜基质运动平行发生。7dpw时，伤口内筋膜标记的纤维被压缩成更厚更复杂的纤维排列，直到形成成熟的瘢痕基质结构(图3i和图13a-b)。覆盖伤口的原位标记筋膜基质在随后的时间点经历了基质重塑(图3g-h)，与嵌合体实验中所见相似。
示例4：EPF引导筋膜基质进入伤口。
为了测试来自筋膜的基质转向是否是由EPFs引起的，发明者通过在筋膜和PC肌肉层之间植入不可渗透的双面ePTFE膜，产生了深度切除伤口，并将筋膜与上部皮肤物理分离(图4a)。由于其非粘附性，临床上通常使用ePTFE膜来避免腹腔镜腹壁切口疝修补术后的粘连。因此，双表面ePTFE膜的平滑界面朝下放置，从而防止筋膜细胞附着。将薄膜植入En1Cre制造的背部皮肤伤口中；R26VT2/GK3小鼠(又名彩虹小鼠)，以记录来自筋膜或真皮的EPF的相对贡献。令人惊讶的是，在整个实验过程中，接受ePTFE膜植入的伤口始终保持完全开放。而假对照组在21天内完全封闭，带膜植入物的伤口即使在受伤后两个月也无法闭合或收缩(图4b)。收获伤口的组织学切片显示，EPF从ePTFE膜下的伤口边缘拖出，不产生疤痕，而对照伤口形成正常疤痕(图4c)。ePTFE膜不抑制免疫细胞内流(7dpw，图14a-b)，并表现出与对照伤口相似的单核细胞和巨噬细胞内流，TNFa表达较低(图14c-e)。ePTFE膜既不影响也不抑制真皮与膜之间边界处的凝血级联反应(图14f-g)。这些结果表明，用ePTFE膜观察到的伤口愈合不良并不反映慢性炎症或凝血不良，而是由筋膜成纤维细胞介导的筋膜转向阻滞。这些发现进一步支持了疤痕来源于筋膜的观点，因为在没有筋膜运动的情况下，真皮EPF或真皮基质无法修复有疤痕的伤口。
然后，发明者询问，在没有屏障植入物的情况下，真皮和筋膜之间单独的机械分离是否会影响基质导向和疤痕形成。为了解决这个问题，发明者在野生型小鼠上进行了完全切除伤口，并物理释放了新鲜伤口周围PC肌肉下方的筋膜(图4d)。释放的筋膜伤口的伤口闭合和疤痕形成明显延迟，并且伤口在早期保持开放状态，与膜植入后记录的情况类似。筋膜释放伤口最终闭合，但有明显延迟(图4e-f)。
为了明确地将筋膜EPF与基质导向伤口联系起来，发明者采用两种不同的策略对筋膜EPF进行基因消融。首先，发明者使用了以Cre依赖方式表达白喉毒素受体(DTR)的转基因系(R26iDTR)。这条线使我们能够在接触白喉毒素(DT)时耗尽表达Cre重组酶的细胞。因此，发明者产生了表达Cre的腺相关病毒颗粒(AAV6 Cre)，并将其注射到R26iDRT幼崽的筋膜中，所述筋膜位于新制作的全切除伤口下方(图4g)。AAV6-Cre转导的含DT的瘢痕大小明显小于对照组(AAV6-eGFP，图4h-i)。
在第二种独立方法中，发明者使用En1Cre；R26iDTR双转基因小鼠，其中DTR表达仅限于EPF，使其易受DT介导的消融。为了证实筋膜中EPF的消融，发明者培养了来自En1Cre的筋膜活检组织；R26iDTR体外急性暴露于DT 1小时后6天。单次暴露2μg/ml DT可阻止对照样品和伤口中观察到的胶原纤维密度的正常增加(纤维收缩和沉积，图15a-b)，并导致筋膜内细胞密度降低2.5倍(图15c)。经DT对筋膜移植物的实时成像显示，25小时内没有任何基质转向(图15d-e)，证实筋膜EPF是基质运动的细胞主角。
接下来，发明者利用来自野生型小鼠的真皮和来自En1Cre的筋膜制造了嵌合移植物；R26iDTR小鼠。发明者如前所述使用DT消融筋膜EPF，然后荧光标记基质，并将皮肤移植物移植到背部皮肤中(图4j)。14天后，伤口完全没有筋膜基质(图4k-l)。相反，标记的基质留在伤口床下方的筋膜层。体外成像和体内示踪实验都最终证明，筋膜驻留的EPF主动引导基质封闭开放性伤口，基质引导是筋膜特有的机制。
为了检查成纤维细胞增殖是否先于基质导向(图16a)，发明者在基质跟踪实验中分析了增殖率。损伤后第一天，伤口下方的筋膜凝胶扩张，而细胞增殖在损伤后第7天及以后达到高峰(图16b-c)，表明基质导向不需要增殖。此外，使用增殖抑制剂足叶乙甙对筋膜基质运动没有影响(图15f-k)。综上所述，研究结果证明筋膜基质可以作为一种膨胀的密封剂，在不依赖细胞增殖的情况下快速堵塞深层伤口。
示例5：人类筋膜和瘢痕疙瘩疤痕具有成纤维细胞特征。
人类瘢痕疙瘩是一种不正常的疤痕，其临床特征为早期和未解决的伤口(如瘙痒、炎症和疼痛)，逐渐扩展到损伤部位以外27。这些尚未解决的人类疤痕特征促使我们研究人类皮肤和瘢痕疙瘩组织中筋膜和筋膜成纤维细胞的存在。发明者在人体皮肤的皮下空间发现了穿过多个解剖皮肤位置的问题带(图5a-b)。此外，小鼠筋膜成纤维细胞标记物如FAP和CD26在人皮下筋膜和人瘢痕疙瘩瘢痕中高表达，而在健康人真皮中低表达。筋膜限制性细胞粘附蛋白NOV/CCN3在人和小鼠筋膜以及人瘢痕疙瘩和小鼠瘢痕中显著表达(图5c-g)。在小鼠和人类的筋膜和瘢痕疙瘩疤痕上保留筋膜标记表明人类过度皮肤疤痕的共同筋膜来源。
示例6：组织动员抑制剂诱导无瘢痕修复
通过将筋膜动员到损伤部位形成疤痕。尽管伤口是一个广泛研究的主要临床挑战，但这种贴片修复的机制仍然不清楚。在这里，发明者揭示了一种独特的细胞机制，即成纤维细胞发芽和织带形成筋膜动员和瘢痕形成。发明者用1280个小分子文库筛选活的筋膜外植体，并发现一类对基质生物发生影响可忽略不计的表型化学物质，但通过停止筋膜活动(称为基质运动抑制剂)完全抑制瘢痕形成。发明者表明，基质运动抑制剂可以改变成纤维细胞的发芽和织带。通过硫链霉素、氟伐他汀钠盐和伊曲康唑抑制出芽和织带，可减少筋膜果冻的运动，并减少动物伤口的疤痕。所述发现将出芽和织带作为纤维化瘢痕形成的一种生发机制，并将其作为一种新的治疗空间，其中基质运动抑制剂为一系列人类纤维化疾病提供了一种新的治疗方法。
方法
小鼠系和动物实验
En1cre；R26mTmG，En1cre；R26mCherry、C57BL/6J是从查尔斯河或杰克逊实验室购买的，或如前所述在斯坦福大学的研究动物设施中生产的(Rinkevich Y等人，2015年)。动物被安置在赫尔姆霍兹-岑特鲁姆-门钦的动物设施中，恒温恒湿，光照周期为12小时。免费提供食物和水。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并在项目55.2-1-54-2532-61-16下注册，并在严格的政府和国际准则下进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。
对于活体小鼠的化学研究，在野生型小鼠背部皮肤上制作夹板伤口。通过切割外径为12mm、内径为6mm的环，用0.5mm硅酮片(CWS-S-0.5，Grace Bio Labs)制备夹板环。在用洗涤剂清洗和用水冲洗后，夹板用70％乙醇消毒30分钟，并在细胞培养罩中风干，保存在无菌瓶中。用100μl MMF(美托咪定、咪达唑仑和芬太尼)麻醉小鼠。用理发器去除背部毛发，然后用脱毛膏脱毛3-5分钟。用直径5mm的活检冲头(Stiefel)造成两个全层切除伤口。夹板的一侧涂上硅酮弹性体超级胶(Kwik Sil粘合剂，世界精密仪器公司)，并放置在伤口周围。夹板用5条6.0尼龙缝线固定，缝合后立即皮内注射最终浓度为250μM的75μl/伤口盐水稀释化学溶液。用MMF拮抗剂使小鼠从麻醉中恢复，并给予安乃近(500mg安乃近/250ml饮用水)作为术后镇痛。在D21上采集疤痕样本。
对于筋膜标记研究，在手术前4天和2天，将2mg/ml NHS荧光素染料皮下注射到野生型小鼠背部皮肤中。标记后，在小鼠背部皮肤上制作切除伤口，并从手术日起每周三次使用最终浓度为250μM的75μl生理盐水稀释化学溶液。在D7上采集疤痕样本。
体外皮肤外植体试验
首先断头处死C57BL/6J野生型小鼠出生后第0天(P0)的新生儿。然后分离背部皮肤，进行2mm全厚度活检(
Figure BDA0003505645070000711
Stiefel)，包括表皮、真皮和深皮下筋膜层。整个皮肤组织外植体系统被称为盘状瘢痕(SCAD)分析(专利申请号PLA17A13)。SCAD组织保存在DMEM/F12细胞培养基(Life Technologies)中，并在37℃培养箱中添加10％FBS(LifeTechnologies)、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔)、1％谷氨酰胺(赛默飞世尔)、1％青霉素和链霉素(赛默飞世尔)，培养箱中提供95％氧气和5％二氧化碳。每隔一天更换一次培养基，直到第5天收集并固定SCAD进行组织学分析。值得注意的是，切除的皮肤在培养基中被真皮侧朝上浸没，这将易瘢痕的成纤维细胞限制在外植体上，并阻止它们粘附在组织培养板上。
Prestwick
Figure BDA0003505645070000712
(PCL)和化学品自动筛选
Prestwick库包括1280个经FDA、欧洲药品管理局(EMA)或其它机构批准的小分子，涵盖一系列主要解剖治疗类别，包括中枢神经系统(19％)、心血管系统(11％)，代谢(24％)和传染病(16％)。根据化合物供应商的报告，化合物的纯度>90％。PCL提供了一个额外的优势，因为所有化学品都具有稳定的物理化学性质，显示出高度的化学多样性，并且具有已知的人体生物利用度和安全性数据。所有这些信息有助于降低质量低的概率，并节省初步筛选过程的成本。
为了适应中等规模筛选方法，发明者将SCAD外植体系统调整为96孔板(Falcon)格式，每个孔包括一个活检。然后，新的96孔SCAD管道与Prestwick化学库批准的1280个小分子相结合。使用高通量筛选平台系统进行平板和液体处理，所述平台系统由Perkinlemer(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的Sciclone G3液体处理器组成。在第0天，用溶解于100％二甲基亚砜(DMSO，Carl Roth)中的相应化合物(1mM储备溶液)或单独的DMSO治疗追。使用96阵列头将0.5μl化合物/DMSO转移至每孔200μl DMEM/F12培养基中，以将最终DMSO浓度保持在2.5μM。然后将组织培养(37℃；5％CO2)72h，然后再进行第二轮化合物培养，所述第二轮化合物通过每孔交换细胞培养基并转移2.5μM化合物/DMSO进行放入新鲜的培养基中。再培养48小时(37℃；5％CO2)后，收集组织并固定以进行组织学处理和成像。
体外筋膜三维(3D)培养筋膜侵袭分析
为了创建一个模拟体内生理环境的3D环境，发明者建立了筋膜基质凝胶(康宁)系统。为了观察筋膜成纤维细胞的动态变化，发明者分离了En1cre的P4至P6新生儿的背部皮肤；R26mTmG小鼠系。在徕卡M205 FA立体显微镜下，来自所述双转基因小鼠系的Cre阳性新生儿在背部皮肤上显示绿色荧光信号。通过使用DMEM/F12培养基将储备小份稀释至6mg/ml的浓度来制备Matrigel。然后将150μl制备的凝胶添加到35mm细胞培养皿(Ibidi)的中心。从背部皮肤进行4mm活检，然后从背部皮肤组织分离筋膜组织。然后将分离的筋膜组织嵌入凝胶中，并在37℃下固化一小时。然后将组织凝胶系统保存在DMEM/F12培养基(LifeTechnologies)中，并添加10％FBS(Life Technologies)、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔)、1％谷氨酰胺(赛默飞世尔)，1％青霉素和链霉素(赛默飞世尔)，置于37℃培养箱中，提供95％氧气和5％二氧化碳。每隔一天更换一次培养基，直到第4天收集并固定组织。用于Matrigel系统的固定，组织在2％多聚甲醛(VWR)和0.1％戊二醛(Sigma)中固定1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Life Technologies)洗涤三次，并在4℃下储存在PBS中。
侵袭指数和收缩指数测量
每天用brightfield显微镜记录筋膜组织，以检查侵袭和收缩情况组织的收缩状态。侵袭指数通过以下公式计算：侵袭指数＝(SD4-SD0)/SD0
SD4和SD0分别代表第4天和第0天的组织大小(包括迁移面积)。收缩指数通过以下公式计算：收缩指数＝(TD0–TD4)/TD0
TD4和TD0分别代表第4天和第0天的原始组织大小(不包括迁移区域)。
组织学
除另有说明外，所有样品均在4℃下在PBS中的2％多聚甲醛(VWR)中固定过夜，并用PBS洗涤三次。然后将样品嵌入最佳切割温度化合物(OCT，Sakura Finetek)中，并在干冰上快速冷冻。使用低温恒温器(Cryostar NX70，赛默飞世尔)制作6μm冷冻切片，并将冷冻切片玻片储存在-20℃下。根据制造商的说明，使用三色染色试剂盒(Sigma-Aldrich)进行Masson三色染色。图像由蔡司AxioImager记录。Z2m(卡尔蔡司)与布莱特菲尔德频道。在Masson三色染色中，肌纤维和角蛋白染色为红色，胶原染色为蓝色，细胞质染色为浅红色，细胞核染色为黑色。
3D染色和整体成像
为了表征在Matrigel中培养的筋膜样本的特性，发明者固定了整个凝胶(其中嵌入筋膜组织)并进行3D染色。样品在室温下浸泡在PBSGT(使用0.2％明胶(Sigma)、0.5％Triton X-100(Sigma)和0.01％硫柳汞(Sigma)实施的1x PBS)中过夜，并在室温下与在PBSGT中稀释的一级抗体孵育三天。然后用PBSGT清洗组织三次，每次至少30分钟，并与在PBSGT中稀释的二级抗体孵育一天。最后，用PBSGT冲洗组织三次，并在4℃下储存在PBS中，直至成像。采用徕卡SP8多光子显微镜进行三维整体成像。
3D染色中应用的一级和二级抗体：aSMA(ab21027，Abcam)、Ki 67(ab16667，Abcam)、切割的Caspase-3(9661S，细胞信号)、Gli1(ab49314，Abcam)、驴抗兔AF647(A-31573，生命技术)、驴抗山羊AF647(A-21447，生命技术)。
实时成像
在Matrigel中培养的筋膜组织固定在2％低熔点琼脂糖(Biozym)中，并在室温下固化。然后添加不含酚红的DMEM/F12培养基，以在成像期间保持组织存活。利用蔡司AxiooObserver Z1显微镜对从En1cre获得的组织进行了四维(4D)延时成像；R26mCherry小鼠系或徕卡SP8多光子显微镜，用于从En1cre获得的组织；R26mTmG小鼠系。将样品放置在具有加热和气体控制(Ibidi)的合格培养箱中。将培养箱温度调整至35℃，并在成像期间使用5％二氧化碳进行支撑。从En1cre记录组织的Brightfield和mCherry信号；R26mCherry；记录En1cre组织的绿色荧光蛋白(GFP)和TDP信号；R26mTmG。
细胞跟踪
4D延时成像在Imaris 9.3.1(位平面)软件中进行最大强度投影。使用ImageJ的Trackmate函数对投影数据集进行细胞迁移和细胞跟踪分析。根据数据和样本的性质，对水滴直径、阈值和分段检测器等变量进行了调整。对于轨迹的第四维，颜色渐变作为时间的函数应用于各个轨迹(蓝色，轨迹的第一个时间点；橙色，轨迹的最后一个时间点)。
数据分析
使用Imaris 9.3.1(位平面)处理3D图像和时间序列视频。亮度和对比度被修改以排除假阳性信号并获得更好的可见度。使用ImageJ插件“FracLac”29(FracLac2015SEP09313A9390)(Karperien A，1999-2003)进行分形分析。分形维数(DF)值和空隙率(Lac)值采用盒计数法计算(滑动和收紧网格设置为默认样本大小，最小像素密度阈值设置为0.40)。
统计和再现性
使用GraphPad Prism软件(7.0版，GraphPad)进行统计分析。如相应图例所示，使用Tukey或Dunnett多重比较试验的方差分析(ANOVA)确定统计显著性。除非另有说明，所有结果都是用至少三个独立实验或三个结果一致的生物样品重复的。细胞追踪是由三部电影衍生出来的。对两个样本进行3D染色，并在样本的三个不同部位记录图像。结果
通过复合筛选鉴定出抗纤维化和促纤维化药物
为了确定筋膜如何在伤口中移动/集中形成疤痕的机制，发明者利用了整个皮肤筋膜外植体，其中均匀集中的疤痕在体外形成(Correa Gallegos等人，2019)。简单地说，发明者从小鼠背部切除了2mm厚的全厚度皮肤活组织检查，包括表皮、真皮和深皮下筋膜层(参见方法)。皮肤筋膜外植体在培养基中面朝上浸入筋膜，以限制易瘢痕成纤维细胞在外植体中，并阻止其粘附在组织培养板上。在这些条件下，外植体在5天的时间内形成均匀的疤痕，使皮肤收缩并折叠(图21a)。外植体技术通过动员/集中结缔组织形成疤痕来模拟筋膜伤口反应，如动物，包括伤口中心致密不透明的细胞外基质堵塞和皮肤收缩。
为了发现筋膜动员和瘢痕形成的新抑制剂，发明者通过高通量筛选平台将皮肤筋膜移植系统与1280FDA批准的小分子(Prestwick文库)相结合。Prestwick库选择了一系列具有强大物理化学特性的化学品，这些化学品具有已知的生物利用度和临床安全性数据。库是开始筛选的理想场所，因为它涵盖了所有主要的治疗化学类，如中枢神经系统、心血管系统、代谢和传染病。
我们对1280个小分子进行的初步表型筛选确定了122种化学物质(9.53％“命中率”)，这些化学物质持续改变了筋膜结缔组织的活动/集中程度以及疤痕大小和严重程度(A部分如表1，B部分如图48)。为了进一步验证疤痕表型的有效性，发明者手动重复了122种“命中”化学物质的化学筛选，每种化学物质有6个生物重复。
表1：(A部分)122种“命中率”化学物质
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表1的B部分如图48所示，包括用表1所列的相应化合物治疗的组织样品的H和E染色。
发明者根据疤痕的总体尺寸和形态，将疤痕活性点击分为18个不同的表型组。例如，某些外植体组产生了大量的疤痕，扩展到皮肤外植体边界之外，其收缩和弯曲类似于增生性疤痕(图21b)。其它组的疤痕中心有密集的成纤维细胞灶；或具有异常多孔和增厚基质纤维的疤痕；或具有薄且松散连接的网状基质的脆性疤痕。也有一些小组在皮肤收缩最小的情况下显著减少了疤痕。值得注意的是，一小部分化学物质完全消除了疤痕的形成；外植体缺乏任何可见的疤痕，保持平坦，无法收缩(图21b)。这尤其令人惊讶，因为目前几乎没有已知的抗瘢痕药物可用。
为了进一步分类和分级疤痕表型和严重程度的范围，发明者通过测定ECM晶格组织的分形维数(DF)和空隙率(孔隙度)值，对所有样本组进行分形分析(Jiang等人，2018)。分形孔隙度和空隙率是细胞外基质的一般组织结构的测量，与正常健康皮肤相比，疤痕具有更高的分形维数(FD)和更低的空隙率(L)值(图21c)。
结合组织形态计量学和分形分析，我们可以将化学物质的表型组扩展到26个不同的等级/严重程度，每个等级/严重程度都具有独特的疤痕表型。在26种化合物中，10种化合物产生了更严重的疤痕，而16种化合物减少了疤痕并具有可测量的抗纤维化作用(图21b)。有趣的是，抗瘢痕化合物来自一系列治疗类别，包括抗真菌、抗菌、抗炎、抗蠕虫、降脂、镇痛、支气管扩张和镇痛化合物，似乎针对不同的作用模式(表1)。
筋膜成纤维细胞在体外形成网状结构
为了观察动员/集中筋膜结缔组织的早期机制，发明者将成纤维细胞系报告小鼠(En1Cre)与转基因报告小鼠(R26mTmG)杂交。双转基因后代(En1Cre；R26mTmG)在En1启动子下表达GFP，从而用GFP基因标记筋膜中的纤维化谱系细胞(EPF)。发明者从这只双转基因小鼠的背部皮肤上切除筋膜外植体，并进行高分辨率实时成像，以跟踪整个疤痕形成过程中的单个EPF。筋膜果冻内的EPF在果冻内彼此之间逐渐增加结缔(图28a、图29a)。这种增加的结缔是通过形成多个成纤维细胞的芽来介导的，这些芽沿着主要的EPF延伸。新的芽很快与相邻的芽相连，在筋膜果冻内形成一个相互连接的细胞网，伴随着侵入速度的大幅增加和整个筋膜尺寸的变化，从组织的原始边界向外延伸(图28c-d，29b)。
为了更好地可视化筋膜成纤维细胞的发芽和网状动力学，发明者将成纤维细胞谱系特异性启动子(En1)小鼠与核mCherry报告系杂交，从而能够通过计算追踪和绘制所有成纤维细胞动力学。来自En1Cre的筋膜外植体的实时成像；从第2天到第5天，R26mCherry双转基因小鼠显示细胞结缔形成细胞簇网络。自动跟踪数据还显示了成纤维细胞网络的形成，这些成纤维细胞不断地长出新的细丝，这些细丝相互吻合，形成一个相互连接的成纤维细胞网(图22e)。Ki67染色和活体成像的免疫标记显示，细胞在迁移和发芽过程中经历了增殖(图22b、图29a)。与原始组织断开连接的大量筋膜成纤维细胞的实时成像揭示了筋膜固有的自我收缩特性，跟踪轨迹证实了这一特性(图22f)。
通过筋膜上的二次筛选确定了三种顶级抗疤痕剂
然后，发明者确定了小分子的抗疤痕作用。发明者从En1的背部皮肤中分离出筋膜；R26<mTmG>双转基因小鼠，分别用26个小分子培养整个筋膜外植体，测量出侵袭指数(Si)＝(SD4-SD0)/SD0(见方法)作为发芽和网状化的一个指标。在26个小分子存在的情况下，侵袭指数的变化精确地模拟了原始屏幕上的抗瘢痕和促瘢痕作用(图23a)。具体而言，前五名的抗瘢痕化合物显著抑制细胞迁移，侵袭指数较低(图23a)。筋膜的单细胞成像显示，小分子通过改变连接筋膜成纤维细胞的细胞膜突起的类型、数量和大小来抑制网状结构(图23b)。
在五种顶级的抗瘢痕化学物质中，芬苯达唑(210)和帕莫酸吡咯酯(1040)对筋膜组织有毒性作用，因此发明者将重点放在其它三种上进行机理研究。三种抗纤维化药物伊曲康唑(1139)、硫链菌素(522)和氟伐他汀钠盐(859)均显著干扰细胞结缔间的数量，并完全抑制筋膜内的发芽和网状结构，而对照筋膜显示出广泛的芽生和网状结构，随后侵入速度和筋膜整体尺寸的变化显著增加(图24)。
抗疤痕剂通过Sonic-Hedgehog抑制成纤维细胞网状结构
为了更好地理解导致疤痕形成的网状结构的分子基础，发明家们仔细研究了“hit”化学物质的分子靶点。所有三种抗瘢痕化学物质，包括促瘢痕化学物质，都以多种方式有效地靶向hedgehog通路信号，并且在所有三种抗瘢痕化学物质存在时，Gli-1核蛋白表达显著降低(图25a)。硫链霉素降低转录因子FoxM1的结合活性；Gli1信号的正调节剂(REF)。而伊曲康唑通过阻止SMO移动到初级纤毛膜从而抑制所述途径来抑制Gli核活性(James等人，2010)。事实上，治疗伊曲康唑的样本中没有Gli1的表达。此外，细胞没有被激活成肌成纤维细胞，因为aSMA表达被捕获在细胞核而不是细胞质中。第三种抗瘢痕药物氟伐他汀抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，这是一种胆固醇生物发生中的限速酶，是刺猬途径激活所必需的(Huang P等人，2016；Giovanni-Luchetti等人，2016)。然而，Gli1在氟伐他汀治疗样本中弱表达，并且存在完整的细胞结缔网络形成。这可能是因为胆固醇合成没有完全被阻断，细胞可以被激活成肌成纤维细胞(图25b)。因此，发明者得出结论，抗纤维化化学物质聚集在SHH信号通路上，以调节成纤维细胞发芽和网状结构，这是将筋膜果冻动员到损伤部位所必需的。
据报道，hedgehog途径还可诱导增殖和抑制凋亡。Ki67和caspase 3染色显示硫链霉素、伊曲康唑和氟伐他汀样品的细胞增殖活性降低(图25c)，而细胞死亡增加(图25d)。
抗瘢痕剂在体内抑制筋膜活动
发现这些化合物会改变发芽和网状结构，发明者接着检查这些物质如何影响活体动物生理创伤中的筋膜活动。首先，发明者在动物体内用FITC-NHS-ester染料标记皮下筋膜层，然后在筋膜标记的小鼠背部制作全厚度切除伤口，并在每周注射方案下使用上述3种单独化合物进行伤口愈合。在受伤后第7天收集皮肤伤口，以确定筋膜活动的程度，并在受伤后第21天确定最终伤口大小和疤痕严重程度。在二甲基亚砜对照组中，筋膜基质凝胶从伤口的各个侧面进入伤口，在第7天时，伤口被标记的基质凝胶大片完全堵塞。另一方面，所有三种抗瘢痕药物都显著减少了筋膜向伤口的移动。氟伐他汀完全抑制基质果冻的运动。伊曲康唑和硫代链霉素纳索抑制了筋膜胶状物的运动，只有边缘结缔组织碎片重新定位到伤口中，而对照组没有出现明显的移位(图26)。
抗瘢痕剂抑制体内瘢痕形成
接下来，发明者在体内夹板伤口模型中测试了三种化学物质，以记录它们对瘢痕形成的总体影响。三色染色显示，所有三种抗瘢痕化学物质在受伤后第21天都会留下较小的疤痕(图27)。因此，这一结果与体外SCAD试验和筋膜浸润试验的结果完全一致。
示例7：全身性基质储存库促进器官愈合和再生
受损器官通过形成新组织修复损伤，重建确保存活的结构和机械连续体，但目前尚不清楚组织如何重新填充和重建受伤部位。特别是，人们认为局部成纤维细胞分泌新的细胞外基质。
在这里，发明家们专注于三种不同的内脏器官，以揭示损伤修复的基础。通过在活体小鼠损伤前分别标记肝脏、盲肠和腹膜的细胞外基质，发明者证明了基质本身在损伤反应中起主要作用。因此，发明者发现了结缔组织内流体类基质的储存库，这些组织通过器官喷涌来修复肝脏、盲肠和腹膜伤口。
利用蛋白质组学分析，发明者发现了导致再生或瘢痕形成和纤维粘连的不同流体基质成分。通过单细胞分析和机理研究，发明者发现中性粒细胞协调基质流动，并以多种方式为基质运输提供功能性准备。阻断中性粒细胞粘附，其趋化或一氧化氮信号抑制基质流动，抑制术后粘附和肝再生。全身性流体基质库的发现改变了创伤修复的传统观点，并为一系列人类疾病/条件下的创伤和过度瘢痕提供了广阔的潜在治疗空间。
方法
动物
获得所有小鼠系(C57BL/6J、B6.129P2-Lyz2tm1(cre)、Ifo/J(Lyz2Cre)、B6；129S6Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai14))，由Jackson实验室或Charles River提供，并根据欧盟指令2010/63在亥姆霍兹动物设施中繁殖和维护。动物被安置在单独的通风笼(IVC)中，动物饲养室保持恒定的温度和湿度，光照周期为12小时。动物们可以自由饮水和进食。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并在项目编号ROB-55.2-2532.Vet_02-19-133或ROB-2532.Vet_02-19-148下注册，并在严格的政府和国际准则下进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。
损伤模型
手术前30分钟，小鼠接受安乃近(200mg/kg体重)的预先皮下注射。通过腹腔注射美托咪定(500mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和芬太尼(50mg/kg)混合物(以下简称MMF)进行麻醉。监测麻醉深度通过脚趾反射进行评估。眼睛被贝潘申乳膏覆盖以避免脱水，腹部被剃毛并用倍他定和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)消毒。将动物背部置于39℃的加热板上。通过皮肤和腹膜进行中线剖腹手术(1-1.5cm)。四个钩子，位于切口周围，固定在一个牵开器和磁性底板上，可以清楚地进入腹腔和肝脏。
通过电穿孔镊子以1s间隔施加30V 50ms脉冲8个周期，诱导肝脏表面局部损伤。在切口闭合前，用移液管将丁丙诺啡(0.1mg/kg)注入腹部，以进行术后初始镇痛。对于长期镇痛，每日注射安乃近(诺伐尔金，200mg/kg)。腹膜和皮肤用两条单独的4-0丝线(Ethicon)缝合。切口闭合后，通过皮下鸡尾酒注射阿替帕咪唑(1mg/kg)和氟马西尼(0.25mg/kg)对抗美托咪定和咪唑安定，唤醒小鼠。老鼠被允许在一个加热垫上恢复，然后被单独安置。在指定的时间点后处死小鼠并获得肝组织。在腹膜模型中，手术程序如上所述，但腹膜区域有标记。
为了诱导肝脏和腹膜之间的粘连，在肝脏的电穿孔侧和腹膜的对侧施加磨损。在腹腔-盲肠粘连模型中，用刷子损伤盲肠和腹膜表面，放置两个手术结，并在两个器官的伤口侧涂抹滑石粉。免疫细胞敲除按如下方式进行：在手术前2小时，在无菌PBS中腹腔注射浓度为10μM的抑制剂。以200μg/20g体重的浓度应用中和抗体(Bio X细胞)。氯膦酸盐脂质体(脂质体)，CP-105696和LY255283(Sigma-Aldrich)，TD139(Probechem)，以10μM的浓度施用W1400(Enzo)和L-NAME(Biocat)。通过将试剂浸泡在带有100nM溶液的无菌滤纸中并将滤纸涂抹在肝脏表面上5分钟，局部施用脂毒素(默克密理博)。
人类组织
所有人的样本都是在德国慕尼黑工业大学(NR.173/18S)的地方伦理委员会的批准下从慕尼黑工业大学KLIKUM ReChts Der-ISAR外科病区获得的。术中对粘连进行诊断，并从各个器官解剖，准备进一步分析。
将ECM标记在器官表面
琥珀酰亚胺酯(NHS-esters；赛默飞世尔)在二甲基亚砜中稀释至25mg/ml的浓度，并储存在-80℃下。为了获得基质的异位标记，发明者通过将NHS-ester1:1与100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合生成标记溶液。无菌Whatman滤纸(Sigma-Aldrich)穿刺活检，将其浸泡在NHS标签溶液中，并局部放置在肝脏表面。一分钟后，取下标签冲头。对于全局腹部标记，将20μl NHS标记溶液与100μl无菌PBS混合并注射i.p.。对于运动测量器官表面，用NHS-FITC 1.0cm(近)或2cm(远)2mm滤过片标记。
组织制备
器官切除后，器官在4℃温度下在2％甲醛中固定过夜。第二天，固定的组织在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，GIBCO，#14190-094)中清洗三次，根据用途，或者包埋、冷冻在最佳切割温度化合物(Sakura，#4583)中并储存在-20℃下，或者储存在4℃含有0.2％明胶的PBS中(Sigma-Aldrich，#G1393)，0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich，#X100)和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich，#T8784)(PBS-GT)。将固定组织嵌入最佳切割温度(OCT)化合物中，并按照标准方案用Microm HM 525(Thermo Scientific)切割。简言之，简言之，将切片固定在-20℃的冰冷丙酮中5分钟，然后用PBS清洗。然后在室温下封闭切片，使其与PBS中的10％血清非特异性结合60分钟，然后在封闭溶液O/N中在4℃下与一级抗体一起孵育。第二天，清洗后，切片在RT下与荧光二级抗体一起在PBS中孵育120分钟。最后，切片用Hoechst 33342核酸染色剂(Invitrogen，#H1399)清洗和孵育，用ddH2O清洗，用
Figure BDA0003505645070000861
(Southern Biotech，#0100-01)固定，并在4℃的黑暗中储存。主要抗体：兔抗I型胶原(1:150，Rockland)，兔抗细胞角蛋白(1:100，Sigma-Aldrich)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗纤维连接蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，兔抗HSPG2(1:100，Elabscience)，兔抗角蛋白9(1:100，Elabscience)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗切割半胱天冬酶3(1:100，Abcam)，兔抗层粘连蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，仓鼠抗PDPNa(1:100，Abcam)，鼠抗LY6G(Sca1)(1:100，Abcam)，兔抗MMP23(1:100，Elabscience)，兔抗卵黄连蛋白(1:100，Elabscience)和兔抗WT1(1:100，Abcam)。针对合适物种的Alexa Fluor 488-、Alexa Fluor 568-或Alexa Fluor 647-共轭抗体(1:500，Life technologies)用作二级抗体。H&E染色按照制造商的方案(Sigma)进行。
显微镜
组织切片在M205 FCA立体显微镜(徕卡)下成像。对于组织的整体安装3D成像，将固定样品用低熔点琼脂糖(Biozym)包埋在35mm的玻璃底皿(Ibidi)中并固化30分钟。使用徕卡SP8多光子显微镜(德国徕卡)进行成像。对于肝脏和腹膜组织的延时成像，样本如上图所示嵌入。然后添加成像介质(DMEM/F-12)。在M205 FCA立体显微镜下进行延时成像。使用改进的培养系统，加热和气体控制(ibidi，目录号10915和11922)，以保证成像期间的生理和稳定条件。温度控制设置为35℃，添加5％CO2的空气。使用Imaris 9.1.0(位平面)和ImageJ(1.52i)处理2D、3D和4D数据。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。
蛋白质生物化学
使用组织裂解器(Qiagen)快速冷冻和研磨组织。将粉碎的组织重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，1mM原钒酸钠，9.5mM氟化钠，10mM丙酮酸钠，10mMβ-甘油磷酸)，补充蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，皮尔斯)，并在冰上保持10min。对样品进行超声波处理，并在10000g下旋转5分钟。上清液储存在-80℃下。根据制造商的方案(皮尔斯)，通过BCA分析测定蛋白质浓度。
蛋白质下拉如下。使用下拉缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释裂解物，并根据制造商的说明在4℃旋转器上使用dynabeads(赛默飞世尔)培养过夜。第二天，用洗涤缓冲液1(20mM Tris HCl pH7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl并补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和洗涤缓冲液2(20mM Tris HCl pH 7.5，0.5％Triton X-100，100mM NaCl)稀释样品两次，并补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂，最后用洗涤液冲洗两次洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl)。然后将微珠重新悬浮在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl和50mM DTT)中，并在37℃下培养30分钟。最后，将样品在98℃下煮沸5分钟，并将上清液储存在-80℃下。裂解物的荧光强度在Fluostar optima荧光计(BMGlabtech)中测定。
质谱
用EZ-LINK-NHS 100:1 FITC-NHS混合物局部标记组织。24小时后，器官被切除。将原始标记的组织块从移动的基质部分分离出来并快速冷冻。如上所述进行组织溶解。样品通过改进的FASP程序23进行消化。在使用DTT和IAA进行还原和烷基化后，蛋白质在
Figure BDA0003505645070000883
离心过滤器(Sartorius Vivacon 500 30kDa)上离心，用8M尿素在0.1M Tris/HCl pH 8.5中洗涤三次，用50mM碳酸铵洗涤两次。过滤器上的蛋白质在室温下用0.5μgLys-C(德国Neuss Wako Chemicals)消化2小时，在37℃下用1μg胰蛋白酶(德国曼海姆Promega)消化16小时。通过离心(14000g下10分钟)收集肽，用0.5％TFA酸化并在-20℃下储存，直到消化后的肽自动加载到配有纳米捕集柱(100μm ID x 2cm，Acclaim PepMAP 100C18，5μm，
Figure BDA0003505645070000882
LC包装，德国不来梅赛默费世尔科学公司)的95％缓冲液a(2％ACN，0.1％甲酸(FA))中的HPLC系统(赛默费希尔科学公司)HPLC级水)和5％缓冲液B(98％ACN，0.1％FA在HPLC级水中)的浓度为30μl/min。5min后，在分析柱(nanoEase MZ HSS T3柱，
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1.8μm，75μm x 250mm，水)上以250nl/min的流动速率在0.1％甲酸中以3％到40％的105min非线性乙腈梯度洗脱和分离肽。洗脱肽在Q Extractive HF质谱仪(德国不来梅赛默飞世尔科学公司)中在线分析，所述质谱仪与带有纳米喷雾离子源的HPLC系统耦合，并在数据依赖模式下运行。以60000的分辨率记录MS光谱，在每个MS1循环后，选择10个最丰富的肽离子进行裂解。原始光谱导入Progenesis QIS软件(版本4.1，非线性动力学，Waters)。在特征对齐和标准化后，将光谱导出为mascot通用文件，并使用mascot(Matrix Science，版本2.6.2)在SwissProt小鼠数据库(16872序列)中进行搜索，搜索参数如下：10ppm肽质量公差和0.02Da片段质量公差，允许两次缺失切割，氨基甲基化被设定为固定修饰，巯基丙酰基、蛋氨酸和脯氨酸氧化被允许作为可变修饰。当使用mascot过滤器分数截止值13和适当的显著性阈值p进行搜索时，mascot集成诱饵数据库搜索计算出的平均错误发现率<1％。
肽分配重新导入Progenesis QI软件，并总结分配给每个蛋白质的所有独特肽的丰度。所得的单个蛋白质的标准化丰度用于使用嵌套设计计算样本组之间的蛋白质比率和p值(ANOVA)。使用EnrichR webtool 24,25进行基因本体分析。细胞外元素通过数据库搜索来识别http://matrisomeproject.mit.edu/。
单细胞RNA序列
每个实验组的三个肝脏在每次测序运行中汇集。对于每个肝脏，用4mm圆形活检冲头将电穿孔区域打孔，然后用细剪刀将其切成小块(约1mm2)。在对照肝脏中使用相同但无损伤的区域。在37℃条件下，在恒定搅拌(180rpm)下，通过酶消化法在5mL酶混合物中进一步处理产生的片段，所述酶混合物由dispase(50酪蛋白水解单位/mL)、胶原酶(2mg/mL)和DNase(30mg/mL)组成，持续30min。添加5ml补充有10％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)可抑制酶活性。将悬浮液中的分离细胞通过70mm过滤器，并在4℃下以500×g离心5min。进行红细胞裂解(赛默飞世尔00-4333-57)2min，并用PBS中的10％FBS停止。在另一个离心步骤后，在Neubauer室中对细胞进行计数，并对单细胞分离和生存能力进行严格评估。总计250000个细胞在补充有0.04％牛血清白蛋白的2.5ml PBS中等分，并以100个细胞/ml的最终浓度加载DropSeq。DropSeq实验如前26所述进行。简言之，使用微流控PDMS装置(Nanoshift)，将单个细胞与条形码珠(马萨诸塞州威尔明顿Chemgenes Corporation)以120珠/uL的最终浓度共同封装在液滴中。每个样品收集15分钟的液滴。液滴破碎后，收集、洗涤珠粒，并准备珠粒上mRNA逆转录(Maxima RT，赛默飞世尔)。在使用核酸外切酶I(新英格兰生物实验室)去除未使用的引物后，对珠子进行计数、等分(2000个珠子/反应，等于～100个细胞/反应)，并通过13个PCR循环(与前面描述的相同的引物、化学和循环条件26)进行预扩增。将PCR产物汇集在一起，并在0.6x清洁珠(CleanNA)上放置两次。标记前，将cDNA样本加载到2100生物分析仪(安捷伦)上的DNA HighChip上，以确保转录本的完整性、纯度和数量。对于每个样本，Nextera XT(Illumina)使用定制的P5引物(集成DNA技术)标记来自约1000个细胞的1ng预扩增cDNA。在Illumina HiSeq4000上，使用0.2nM变性样品和5％PhiX尖峰对单细胞文库进行100bp配对末端序列测定。对于read 1的引物，使用0.5μMRead1CustSeqB(引物序列：GCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACAGTAC(序列ID号：1))。
结果
流体基质通过器官喷涌而出，导致伤口
受损组织通过组织和基质的复杂混合物重建，其来源尚不清楚。发明者最近在皮肤上证明，疏松结缔组织(基质)是真皮疤痕的来源。因此，他们开始测试类神经基质系统也可能被动员以应对内脏器官损伤的可能性。
为此，发明者使用N-羟基琥珀酰亚胺酯荧光素(NHS-FITC，图30a，方法)对活体小鼠内脏(浆膜)和壁(外膜)器官表面的基质进行局部标记并绘制命运图。首先，发明者将肝脏作为模型系统；标记的肝基质的病灶明显与二次谐波信号一致，表明体内标记技术忠实地标记细胞外胶原纤维。基质标记方法揭示了基质的多层结构，比仅通过二次谐波信号看到的结构要详细得多。染料酯标记显示未成熟排列的微小纤维和多纤维聚集体的体积，填充较大成熟胶原纤维之间的空间(图30a)。为了了解这种新的安排是否是内脏器官的一个普遍方面，发明家们检查了盲肠和腹膜器官的表面。在这里，发明者观察到同样体积的微小细胞外纤维材料，仅二次谐波显微镜也无法察觉。盲肠和腹膜具有沿整个器官表面定向的成熟和编织的胶原纤维，在未成熟组织中有大量的微纤维，填充编织的成熟胶原纤维之间的空隙。
然后，发明者开始测试这些体积的未成熟基质的流动性，方法是像以前一样局部应用染料酯，并对这些局部基质池进行“归趋映射”(图30b和方法)。在成年健康动物中，标记的肝基质池在24小时内没有移动(图30c)。为了测试基质在损伤条件下的流动性，发明者专注于基于不可逆电穿孔的临床肝损伤模型。不可逆电穿孔方法可作为各种癌症消融治疗方案的替代临床方法14。不可逆电穿孔产生的烧蚀条件会导致局部肝细胞死亡(因此是不可逆的)，随后出现修复反应，最终恢复肝脏组织形态和功能，而无疤痕组织。发明者通过在肝脏的六个不同位置局部标记基质池，将基质标记与不可逆电穿孔相结合，创建具有明确边界的圆形标签(图30c)。然后，发明者通过电穿孔破坏了一个离散的远端肝脏位置。受伤后24小时内，基质池从原来的封闭位置移动并广泛混合。重要的是，标记的基质池经历了重大移位，大量涌入并用基质完全填充伤口。这些发现表明，损伤诱导了器官范围内的流体基质定向运动。扩展视频1显示了肝脏中的两个刚性和流体基质隔室。通过二次谐波信号(majenta)观察到的刚性框架沐浴在延伸到伤口区域的大量蛋白质(绿色)中，并且在结构上与通过二次谐波信号观察到的刚性框架不同(图30d)。24小时后对伤口进行的三维成像显示，伤口完全被大量基质堵塞(图30d)。在它们的末端，基质蛋白释放出粘附并包裹刚性基质框架的细丝，并与相邻的健康结缔组织相互连接。损伤后两周，matrixhad重建了支持肝再生的新网状组织(图30d)。
为了研究其它器官中是否存在类似的基质系统，发明者使用了第二种与临床相关的器官损伤模型，即临床切口(剖腹手术)和腹膜局部磨损。与肝脏的研究结果相似，腹膜损伤导致标记的基质大量涌出整个腹膜表面。标记基质的病灶广泛混合，并在几分钟内喷入伤口(图30e、图30f)，正如发明者最初在肝脏中发现的那样。腹膜基质喷涌发生在远离损伤部位并穿过整个腔壁的地方，腹膜中的ECM运动动力学与肝脏中的首次相似，在损伤后几分钟内开始，并在三天内持续将基质注入伤口(图30g)。事实上，腹膜运动甚至比肝脏更剧烈。在所有实验动物中，腹膜伤口的FITC标记信号量明显高于肝脏伤口。这也可能表明腹膜基质特别富含蛋白质和纤维，这一点发明者随后提出。图30h显示了穿过腹膜的基质流体移动的不同步骤的快照三维图像。当它被推进时，流体基质保持盘绕，随后重新排列，纤维在伤口中积聚。
将流体基质转化为伤口中的刚性框架
以研究热基质何时成熟为刚性框架。发明者测试了运输流体元素是否在伤口中发生纤维交联。发明者在两个不同的位置标记活体小鼠肝脏表面，一个使用NHS-EZ-LINK生物素，另一个使用NHS-FITC酯(图31a)。通过伤口部位的EZ-LINK生物素标记蛋白质的链霉亲和素介导，可以获得潜在的交联FITC标记蛋白质，受伤后，发明者将EZ-LINK标记蛋白质从链霉亲和素珠上拉下，在富含洗涤剂的缓冲液中洗涤并去除那些具有脆弱相互作用的蛋白质(参见方法)。在72小时的时间过程中，下拉样品中的FITC信号稳步增加，表明来自不同部位的流体基质在伤口中积聚，并经历交联，形成成熟、稳定互连的基质(图31b)。为了从视觉上证明流体基质来自远处，甚至不同器官的基质可以在伤口内混合和交联，发明者应用了一种外科粘连小鼠模型，其中腹膜和盲肠之间形成粘连(图31c和方法)。发明者用不同颜色的酯结合物(分别为NHS-FITC和NHS-AF568)标记腹膜和盲肠基质，并发现基质在损伤部位混合，纤维粘连带形成。图31d显示了粘连部位盲肠和腹膜基质的混合和重叠(图31d)。此外，腹膜胶原(红色)有助于盲肠修复(图31d)，表明基质穿过器官边界，有助于邻近器官的结构修复。当发明者标记肝脏和腹膜基质并诱导它们之间的粘连时，发生了相同类型的器官内纤维交联(图31f)。
从功能上证明来自两个独立器官(盲肠和腹膜)的元素之间发生交联，发明者用一种不同的EZ-LINK NHS生物素酯类型标记腹膜基质，用另一种不同的FITC-NHS-ester类型标记盲肠，并通过局部磨损诱导这两个器官之间的局部粘连(图31d和方法)。两周后，伤口裂解液中含有丰富的绿色(盲肠)和EZ-LINK NHS生物素(腹膜)标记蛋白。下拉实验盲肠和腹膜之间发生了明显的交联。总的来说，这些发现揭示了流体基质系统，所述系统利用来自偏远地区甚至独立器官的块来补充伤口，并且这些流体元素交叉连接在伤口中形成成熟结缔组织。
流体基质是组织修复的清单
接下来，发明者试图通过质谱法确定损伤模型中流体基质的蛋白质成分。简单地说，发明者在肝脏、腹膜和盲肠上使用改性生物素结合的EZ-link sulfo-NHS-ester标记基质池，并将其置于损伤模型中。受伤24小时后，发明者通过链霉亲和素从伤口部位收集基质和基质蛋白，然后收集所有标记肽的蛋白质组学(图32a)。蛋白质组学清单显示，数百种细胞外蛋白被转移到起源于多个器官深度和层次的器官伤口中(图32b)。表2-4显示了基质中蛋白质的完整列表。基质由许多基质蛋白组成，如糖蛋白、蛋白多糖和ECM相关蛋白，但纤维状胶原纤维(如I型和III型胶原)是最丰富的部分(图32c和32d)。发明者还检测参与组织重塑、基底膜形成和稳定性的交联酶，如赖氨酰氧化酶和转谷氨酰胺酶，如IV、VI型胶原或层粘连蛋白，弹性纤维相关蛋白，如原纤维，以及许多其它有助于组织重塑的糖蛋白和蛋白聚糖，纤维凝块形成、纤维蛋白溶解、肉芽形成和瘢痕组织形成(图32d)。明显丰富的成分可分为促再生或纤维化。例如，进入肝创伤的基质富含与组织再生相关的调节因子，如Ambp、F13a1、F13b、Itih1、Kng1和PZP，所有这些都支持细胞生长和修复(图32e)。而进入腹膜伤口的基质表现为促纤维化，富含胶原纤维和ECM糖蛋白，可诱导细胞外基质组织、成熟和瘢痕形成。此外，腹膜部分包括胶原纤维，如9、10、11型胶原，以及纤维化瘢痕形成的仲裁者，如Grem1、Ogn、Chad、MMP9、MMP20，这些在肝脏或盲肠基质中完全缺失，所有这些都支持并形成纤维化瘢痕。样本分布的主成分分析表明，肝脏、盲肠和腹膜的基质成分具有器官特异性和独特性。例如，进入肝脏伤口的基质富含氧化应激调节因子、代谢酶和脂质代谢，而进入腹膜伤口的基质明显促纤维化(图32f)。
这些分析表明，虽然流体基质为修复过程的多个步骤提供了构造块，但其成分是器官特异性的，并且是随后修复反应的指标，即再生或疤痕。
接下来，发明家们试图比较这些发现是否转化为人类伤口。发明者从术后出现粘连的患者身上采集样本，并通过免疫荧光测定其蛋白质组成。重要的是，发明者发现它们由在小鼠腹膜具体基质部分中发现的相同外膜蛋白成分组成(图34a)。这表明人类伤口修复的发展方式与小鼠相同，通过从远端外膜和浆膜部位动员流体基质。
中性粒细胞将流体基质注入伤口
接下来，发明者检查了ECM运动和炎症发作之间的可能联系，因为两者都在伤口反应的早期阶段起作用。为了全面探索基质运动中所有可能的细胞因子，发明者采用了电穿孔肝脏的高度平行单细胞转录组学。
在电穿孔后1天和7天，对健康肝脏中超过25054个细胞(见方法)进行单细胞RNA测序，发现伤口内有17个不同的细胞群，主要是髓系细胞，如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞(图33a和图35a、b和c)。然后，发明者对所有17个簇进行筛选，以确定膜受体的动态存在，这意味着细胞ECM粘附促进了基质的移动(图33b)。基质细胞和免疫细胞均表现出高ECM结合活性，具有多种ECM结合细胞表面受体。然而，只有巨噬细胞/中性粒细胞表现出与基质重新定位到伤口重叠的动态存在和迁移评分(图33c)。为了确定巨噬细胞和中性粒细胞在基质运动中的任何可能作用，发明者在Lyz2Cre中进行了肝脏电穿孔和腹膜剖腹损伤模型；Ai14转基因小鼠(图33d、图36和方法)，其中红色(dTomato)荧光报告基因在所有髓系细胞中表达，并允许其可视化。对这些小鼠肝脏和腹膜伤口的实时成像显示，髓样细胞通过大量器官表面迁移而在伤口中积聚。发明者发现，大多数(如果不是全部的话)红色标记的髓样细胞(n＝90％)从原始标记部位迁移到伤口，携带FITC阳性基质的“背包”(图33e、f和图36a、b、d和c)。回装FITC阳性流体基质的髓样细胞没有红、绿信号的胞浆重叠，表明细胞没有内化、摄取或吞噬基质(图33g)。事实上，免疫标记显示损伤后24小时肝脏和腹膜上有中性粒细胞(Ly6G+)聚集，这明显与器官表面的基质有关(图33h和图36e)。发明者不仅发现单个骨髓细胞携带FITC阳性基质，而且还发现了骨髓聚集灶，最有可能是中性粒细胞群，在伤口附近产生大量局部FITC阳性基质沉积。这些数据表明，中性粒细胞是基质流动性的重要组成部分。
为了研究中性粒细胞是否负责基质动员，发明者采用了化学细胞耗竭策略，结合基质命运图和器官损伤。用Ly6g中和抗体消耗或停止中性粒细胞完全阻断肝脏和腹膜中的流体基质流动，而用氯膦酸盐化学消耗巨噬细胞对基质动员没有影响(图33i和k)。接下来，发明者将重点放在中性粒细胞活化上，并在单细胞分析中发现，中性粒细胞在早期伤口内上调整合素CD11b和CD18，并且在整个3天的喷涌过程中保持表达(图33j和图35d和e)。事实上，针对这两种表面受体的中和抗体导致受伤动物的基质运动减少或完全停止(图33k和图36f)。然后，研究人员检查了中性粒细胞聚集是否可以解释基质动员。中性粒细胞中白三烯介导的信号在其积聚到伤口中起关键作用22，白三烯受体活性抑制剂完全阻断基质进入伤口(图33k和图36f)。值得注意的是，在没有伤口的情况下，局部利用趋化因子脂蛋白A4的中性粒细胞，导致基质的募集(图33i和k)。这表明中性粒细胞群确实在局部指导基质运动和沉积。发明者还发现中性粒细胞中的氧化应激和一氧化氮合成在损伤反应早期上调(图33j)。事实上，一氧化氮合成抑制剂或其功能完全阻断了肝脏和腹膜损伤模型中的基质动员(图33k和图36f)。
在没有基质动员的情况下，伤口无法愈合。在肝脏，阻止基质进入伤口导致完全的再生障碍。肝脏伤口扩大，无法闭合，缺乏结构组织(图37a和b)。类似地，阻断腹膜中的基质动员，完全消除纤维粘连的形成，动物体内没有任何粘连形成的迹象(图37c-e)。
发明者得出结论，器官拥有含有结缔组织内的流体基质储库，损伤会触发器官范围内的流体基质动员，进入新的组织构建部位，从而促进组织修复和再生。此外，中性粒细胞在执行、引导和将基质沉积到伤口中具有新发现的重要作用。
表2：肝脏样本中所鉴定的蛋白质
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表3：腹膜样本中所鉴定的蛋白质
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表4：盲肠样品中所鉴定的蛋白质
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示例8：NHS-ester将分子定向靶向伤口区域ECM移动现象中的一个基本步骤是在伤口区域交联移动的材料。蛋白质的伯胺和不同蛋白质类别的肽是共价连接的。由于NHS-ester也标记伯胺，发明者问自己伤口部位的重组是否导致游离胺基团的增加，以及发明者是否可以通过腹腔内应用NSH酯来观察这些游离胺基团。
方法
动物
获得所有小鼠系(C57BL/6J、B6.129P2-Lyz2tm1(cre)、Ifo/J(Lyz2Cre)、B6；129S6Gt(ROSA)26Sortm14(CAG TdTomato)Hze/J(Ai14))，由Jackson实验室或Charles River提供，并根据欧盟指令2010/63在亥姆霍兹动物设施繁殖和维护。动物被安置在单独的通风笼(IVC)中，动物饲养室保持恒定的温度和湿度，光照周期为12小时。动物们可以自由饮水和进食。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并在项目编号ROB-55.2-2532.Vet_02-19-133或ROB-2532.Vet_02-19-148下注册，并在严格的政府和国际准则下进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。
小鼠模型
小鼠在手术前30分钟接受安乃近(200mg/kg体重)的预先皮下注射。通过腹腔注射美托咪定(500mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和芬太尼(50mg/kg)混合物(以下简称MMF)进行麻醉。监测麻醉深度通过脚趾反射进行评估。眼睛被贝潘申乳膏覆盖以避免脱水，腹部被剃毛并用倍他定和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)消毒。将动物背部置于39℃的加热板上。通过皮肤和腹膜进行中线剖腹手术(1-1.5cm)。四个钩子，位于切口周围，固定在一个牵开器和磁性底板上，可以清楚地进入腹腔和肝脏。
对肝脏表面进行标记。通过电穿孔钳，施加电压30V，脉冲50ms，间隔1秒，周期8次，诱导肝脏表面局部损伤。在切口闭合前，用移液管将丁丙诺啡(0.1mg/kg)注入腹部，以进行术后初始镇痛。对于长期镇痛，每日注射安乃近(诺伐尔金，200mg/kg)。腹膜和皮肤用两条单独的4-0丝线(Ethicon)缝合。切口闭合后，通过皮下鸡尾酒注射阿替帕咪唑(1mg/kg)和氟马西尼(0.25mg/kg)对抗美托咪定和咪唑安定，唤醒小鼠。老鼠被允许在一个加热垫上恢复，然后被单独安置。在指定的时间点后处死小鼠，获得肝组织。在腹膜模型中，手术程序如上所述，但腹膜区域有标记。
在手术前2小时注射浓度为10μM溶于无菌PBS i.p.中的相应小分子的抑制剂。
标记ECM组分
琥珀酰亚胺酯(NHS-ester；赛默飞世尔)的标记在二甲基亚砜中稀释至25mg/ml，并在-80℃下储存。对于局部基质染色，通过将NHS-ester1:1与100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合生成标记溶液。对于全局腹部标记，将20μl NHS标记溶液与100μl无菌PBS混合并注射i.p.。
组织制备
器官切除后，器官在4℃温度下在2％甲醛中固定过夜。第二天，固定的组织在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，GIBCO，#14190-094)中清洗三次，根据用途，或者包埋、冷冻在最佳切割温度化合物(Sakura，#4583)中并储存在-20℃下，或者储存在4℃含有0.2％明胶的PBS中(Sigma-Aldrich，#G1393)，0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich，#X100)和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich，#T8784)(PBS-GT)。将固定组织嵌入最佳切割温度(OCT)中，并用Microm HM 525(Thermo Scientific)切割。简言之，将切片固定在-20℃的冰冷丙酮中5分钟，然后用PBS清洗。然后在室温下封闭切片，使其与PBS中的10％血清非特异性结合60分钟，然后在封闭溶液O/N中在4℃下与一级抗体一起孵育。第二天，清洗后，切片在RT下与荧光二级抗体一起在PBS中孵育120分钟。最后，切片用Hoechst 33342核酸染色剂(Invitrogen，#H1399)清洗和孵育，在ddH2O中清洗，用
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(SouthernBiotech，#0100-01)固定，并在4℃的黑暗中储存。一级抗体：兔抗I型胶原(1:150，Rockland)，兔抗细胞角蛋白(1:100，Sigma-Aldrich)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗纤维连接蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，兔抗HSPG2(1:100，Elabscience)，兔抗角蛋白9(1:100，Elabscience)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗切割半胱天冬酶3(1:100，Abcam)，兔抗层粘连蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，仓鼠抗PDPNa(1:100，Abcam)，鼠抗LY6G(Sca1)(1:100，Abcam)，兔抗MMP23(1:100，Elabscience)，兔抗卵黄凝集素(1:100，Elabscience)和兔抗WT1(1:100，Abcam)。针对合适物种的Alexa Fluor 488-、Alexa Fluor 568-或Alexa Fluor 647共轭抗体(1:500，Life technologies)用作二级抗体。根据MMM进行的H&E染色。
显微镜
使用M205 FCA立体显微镜(徕卡)对组织切片进行成像。使用Imaris9.1.0(位平面)和ImageJ(1.52i)处理2D、3D和4D数据。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。
蛋白质生物化学
使用组织裂解器(Quiagen)快速冷冻和研磨组织。将粉碎的组织重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，1mM原钒酸钠，9.5mM氟化钠，10mM丙酮酸钠，10mMβ-甘油磷酸)，并补充蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，皮尔斯)，并在冰上保持10min。样品用10.000g超声波处理并旋转5分钟。上清液储存在-80℃。根据制造商协议(皮尔斯)，通过BCA分析测定蛋白质浓度。
蛋白质下拉如下。使用下拉缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，100mM NaCl，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释裂解物，并根据制造商的说明在4℃旋转器上使用dynabeads(赛默飞世尔)培养过夜。第二天，用洗涤缓冲液1(20mM Tris-HCl pH7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和洗涤缓冲液2(20mM Tris-HCl pH 7.5，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，最后用洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl)洗涤两次。然后将珠子重新悬浮在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl和50mM DTT)中，并在37℃的洗脱缓冲液中培养30分钟。最后，将样品在98℃下煮沸5分钟，并将上清液储存在-80℃下。在Fluostar optima荧光计(BMGlabtech)中测定裂解物的荧光强度。
质谱
用EZ-LINK-NHS 100:1 FITC-NHS混合物局部标记组织。24小时后，移除器官，将原始标记的组织块从移动的基质部分分离并快速冷冻。如上所述进行组织溶解。使用改进的FASP程序25消化样品。在使用DTT和IAA进行还原和烷基化后，在
Figure BDA0003505645070001731
离心过滤器(Sartorius Vivacon 50030kDa)上离心蛋白质，用8M尿素在0.1M Tris/HCl pH 8.5中洗涤三次，用50mM碳酸铵洗涤两次。过滤器上的蛋白质在室温下使用0.5μg Lys-C(德国NeussWako Chemicals)消化2小时，在37℃下使用1μg胰蛋白酶(德国曼海姆Promega)消化16小时。通过离心(14000g下10分钟)收集肽，用0.5％TFA酸化并在-20℃下储存，直到消化后的肽自动加载到配有纳米捕集柱(100μm ID x 2cm，Acclaim PepMAP 100 C18，5μm，
Figure BDA0003505645070001732
LC包装，德国不来梅赛默费希尔科学公司)的95％缓冲液a(2％ACN，0.1％甲酸(FA))中的HPLC系统(赛默费希尔科学公司)HPLC级水)和5％缓冲液B(98％ACN，0.1％FA在HPLC级水中)的浓度为30μl/min。5min后，在分析柱(nanoEase MZ HSS T3柱，
Figure BDA0003505645070001733
1.8μm，75μm x 250mm，水)上以250nl/min的速率在0.1％甲酸中以3％至40％的105min非线性乙腈梯度洗脱和分离肽。洗脱肽在Q Extractive HF质谱仪(德国不来梅赛默飞世尔科学公司)中在线分析，所述质谱仪与带有纳米喷雾离子源的HPLC系统耦合，并在数据依赖模式下运行。以60000的分辨率记录MS光谱，在每个MS1循环后，选择10个最丰富的肽离子进行裂解。原始光谱导入Progenesis QIS软件(版本4.1，非线性动力学，Waters)。在特征对齐和标准化后，将光谱导出为Mascot通用文件，并使用Mascot(Matrix Science，版本2.6.2)在SwissProt小鼠数据库(16872序列)中进行搜索，搜索参数如下：10ppm肽质量公差和0.02Da片段质量公差，允许两次缺失切割，氨基甲基化被设定为固定修饰，巯基丙酰基、蛋氨酸和脯氨酸氧化被允许作为可变修饰。当在Mascot过滤器分数截止值为13的情况下进行搜索时，Mascot集成诱饵数据库搜索计算出平均错误发现率<1％，并将适当的显著性阈值p.
肽分配重新导入到Progenesis QI软件中，并且分配给每个蛋白质的所有独特肽的丰度总结。所得的单个蛋白质的标准化丰度用于使用嵌套设计计算样本组之间的蛋白质比率和p值(ANOVA)。使用EnrichR webtool 26,27进行基因本体分析。
结果
用镊子电极电穿孔小鼠肝脏会导致背侧和腹侧的局部损伤。通过腹膜内注射NHS-罗丹明酯可以观察到电穿孔的这些圆形侧面(图38a和b)。
发明者在这里的发现有许多潜在的意义。数据显示，在腹部伤口区域有初级胺的积累。这些可以通过NHS连接反应进行标记。这将允许腹部伤口通过简单的腹膜内注射来标记。通过使用NHS-ester与更深波长的报告器相结合，这将为临床伤口可视化打开一个新的维度。除了图像伤口外，效应分子(如药物)也可以通过全局注射与NHS-ester偶联，以靶向伤口区域。
例9：基质运动元素作为纤维化病理学的生物标记物
纤维化过程发生时间长，通常识别得太晚。到目前为止，还没有有意义的早期纤维化过程的生物标志物。
ECM运动以快速动力学方式进行。因此，发明家们问我们自己这样一个问题：是否部分动员的元素被转移到循环的血液中，以及发明家是否在血液中检测到这些流体元素。这些流体元素可以提供有关纤维化过程阶段的信息。由于发明者已经观察到这些成分具有器官特异性，因此所述方案甚至可以提供器官特异性生物标记物。
方法
动物
获得所有小鼠系(C57BL/6J、B6.129P2-Lyz2tm1(cre)、Ifo/J(Lyz2Cre)、B6；129S6-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai14))，由Jackson实验室或Charles River提供，并根据欧盟指令2010/63在亥姆霍兹动物设施繁殖和维护。动物被安置在单独的通风笼(IVC)中，动物饲养室保持恒定的温度和湿度，光照周期为12小时。动物们可以自由饮水和进食。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并在项目编号ROB-55.2-2532.Vet_02-19-133或ROB-2532.Vet_02-19-148下注册，并在严格的政府和国际准则下进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。
小鼠模型
小鼠在手术前30分钟接受安乃近(200mg/kg体重)的预先皮下注射。通过腹腔注射美托咪定(500mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和芬太尼(50mg/kg)混合物(以下简称MMF)进行麻醉。监测麻醉深度通过脚趾反射进行评估。眼睛被贝潘申乳膏覆盖以避免脱水，腹部被剃毛并用倍他定和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)消毒。将动物背部置于39℃的加热板上。通过皮肤和腹膜进行中线剖腹手术(1-1.5cm)。四个钩子，位于切口周围，固定在一个牵开器和磁性底板上，可以清楚地进入腹腔和肝脏。
对肝脏表面进行标记。通过电穿孔钳，施加电压30V，脉冲50ms，间隔1秒，周期8次，诱导肝脏表面局部损伤。在切口闭合前，用移液管将丁丙诺啡(0.1mg/kg)注入腹部，以进行术后初始镇痛。对于长期镇痛，每日注射安乃近(诺伐尔金，200mg/kg)。腹膜和皮肤用两条单独的4-0丝线(Ethicon)缝合。切口闭合后，通过皮下鸡尾酒注射阿替帕咪唑(1mg/kg)和氟马西尼(0.25mg/kg)对抗美托咪定和咪唑安定，唤醒小鼠。老鼠被允许在一个加热垫上恢复，然后被单独安置。在指定的时间点后处死小鼠，获得肝组织。在腹膜模型中，手术程序如上所述，但腹膜区域有标记。
在手术前2小时注射浓度为10μM溶于无菌PBS i.p.中的相应小分子的抑制剂。
ECM组分
琥珀酰亚胺酯(NHS-ester；赛默飞世尔)的标记在DMSO中稀释至25mg/ml，并在-80℃下储存。对于局部基质染色，通过将NHS-ester1:1与100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合生成标记溶液。对于全局腹部标记，将20μl NHS标记溶液与100μl无菌PBS混合并注射i.p.。
组织制备
器官切除后，器官在4℃温度下在2％甲醛中固定过夜。第二天，固定的组织在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，GIBCO，#14190-094)中清洗三次，根据用途，或者包埋、冷冻在最佳切割温度化合物(Sakura，#4583)中并储存在-20℃下，或者储存在4℃含有0.2％明胶的PBS中(Sigma-Aldrich，#G1393)，
Figure BDA0003505645070001761
声波风廓线仪X-100(Sigma-Aldrich，#X100)和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich，#T8784)(PBS-GT)。将固定组织嵌入最佳切割温度(OCT)中，并用Microm HM 525(Thermo Scientific)切割。简言之，将切片固定在-20℃的冰冷丙酮中5分钟，然后用PBS清洗。然后在室温下封闭切片，使其与PBS中的10％血清非特异性结合60分钟，然后在封闭溶液O/N中在4℃下与一级抗体一起孵育。第二天，清洗后，切片在RT下与荧光二级抗体一起在PBS中孵育120分钟。最后，切片用Hoechst 33342核酸染色剂(Invitrogen，#H1399)清洗和孵育，在
Figure BDA0003505645070001762
中清洗，用Fluoromount-G(Southern Biotech，#0100-01)固定，并在4℃的黑暗中储存。一级抗体：兔抗I型胶原(1:150，Rockland)，兔抗细胞角蛋白(1:100，Sigma-Aldrich)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗纤维连接蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，兔抗HSPG2(1:100，Elabscience)，兔抗角蛋白9(1:100，Elabscience)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗切割半胱天冬酶3(1:100，Abcam)，兔抗层粘连蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，仓鼠抗PDPNa(1:100，Abcam)，鼠抗LY6G(Sca1)(1:100，Abcam)，兔抗MMP23(1:100，Elabscience)，兔抗卵黄凝集素(1:100，Elabscience)和兔抗WT1(1:100，Abcam)。针对合适物种的Alexa Fluor 488-、Alexa Fluor 568-或Alexa Fluor 647共轭抗体(1:500，Life technologies)用作二级抗体。根据MMM进行的H&E染色。
显微镜
使用M205 FCA立体显微镜(徕卡)对组织切片进行成像。使用Imaris9.1.0(位平面)和ImageJ(1.52i)处理2D、3D和4D数据。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。
蛋白质生物化学
使用组织裂解器(Quiagen)快速冷冻和研磨组织。将粉碎的组织重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，1mM原钒酸钠，9.5mM氟化钠，10mM丙酮酸钠，10mMβ-甘油磷酸)，并补充蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，皮尔斯)，并在冰上保持10min。样品用10.000g超声波处理并旋转5分钟。上清液储存在-80℃。根据制造商协议(皮尔斯)，通过BCA分析测定蛋白质浓度。
蛋白质下拉如下。使用下拉缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，100mM NaCl，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释裂解物，并根据制造商的说明在4℃旋转器上使用dynabeads(赛默飞世尔)培养过夜。第二天，用洗涤缓冲液1(20mM Tris-HCl pH7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和洗涤缓冲液2(20mM Tris-HCl pH 7.5，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，最后用洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl)洗涤两次。然后将珠子重新悬浮在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl和50mM DTT)中，并在37℃的洗脱缓冲液中培养30分钟。最后，将样品在98℃下煮沸5分钟，并将上清液储存在-80℃下。在Fluostar optima荧光计(BMGlabtech)中测定裂解物的荧光强度。
质谱
用EZ-LINK-NHS 100:1 FITC-NHS混合物局部标记组织。24小时后，移除器官，将原始标记的组织块从移动的基质部分分离并快速冷冻。如上所述进行组织溶解。使用改进的FASP程序25消化样品。在使用DTT和IAA进行还原和烷基化后，在
Figure BDA0003505645070001771
离心过滤器(Sartorius Vivacon 50030kDa)上离心蛋白质，用8M尿素在0.1M Tris/HCl pH 8.5中洗涤三次，用50mM碳酸铵洗涤两次。过滤器上的蛋白质在室温下使用0.5μg Lys-C(德国NeussWako Chemicals)消化2小时，在37℃下使用1μg胰蛋白酶(德国曼海姆Promega)消化16小时。通过离心(14000g下10分钟)收集肽，用0.5％TFA酸化并在-20℃下储存，直到消化后的肽自动加载到配有纳米捕集柱(100μm ID x 2cm，Acclaim PepMAP 100 C18，5μm，
Figure BDA0003505645070001781
LC包装，德国不来梅赛默费希尔科学公司)的95％缓冲液a(2％ACN，0.1％甲酸(FA))中的HPLC系统(赛默费希尔科学公司)HPLC级水)和5％缓冲液B(98％ACN，0.1％FA在HPLC级水中)的浓度为30μl/min。5min后，在分析柱(nanoEase MZ HSS T3柱，
Figure BDA0003505645070001782
1.8μm，75μm x 250mm，水)上以250nl/min的速率在0.1％甲酸中以3％至40％的105min非线性乙腈梯度洗脱和分离肽。洗脱肽在Q Extractive HF质谱仪(德国不来梅赛默飞世尔科学公司)中在线分析，所述质谱仪与带有纳米喷雾离子源的HPLC系统耦合，并在数据依赖模式下运行。以60000的分辨率记录MS光谱，在每个MS1循环后，选择10个最丰富的肽离子进行裂解。原始光谱导入Progenesis QIS软件(版本4.1，非线性动力学，Waters)。在特征对齐和标准化后，将光谱导出为Mascot通用文件，并使用Mascot(Matrix Science，版本2.6.2)在SwissProt小鼠数据库(16872序列)中进行搜索，搜索参数如下：10ppm肽质量公差和0.02Da片段质量公差，允许两次缺失切割，氨基甲基化被设定为固定修饰，巯基丙酰基、蛋氨酸和脯氨酸氧化被允许作为可变修饰。当在Mascot过滤器分数截止值为13的情况下进行搜索时，Mascot集成诱饵数据库搜索计算出平均错误发现率<1％，并将适当的显著性阈值p.
肽分配重新导入到Progenesis QI软件中，并且分配给每个蛋白质的所有独特肽的丰度总结。所得的单个蛋白质的标准化丰度用于使用嵌套设计计算样本组之间的蛋白质比率和p值(ANOVA)。使用EnrichR webtool 26,27进行基因本体分析。
结果
肺纤维化是一种通常对人类致命的疾病，无法治疗或没有生物标记物可供选择。因此，发明者在小鼠肺纤维化模型中测试了生物标记物假说。应用博莱霉素后，2周内肺内出现纤维化斑块。首先，发明者检查模型中是否存在流体基质元素的移动。因此，发明者遵循2种设置(图39a)。为了检查肺的表面活性，发明者在胸膜内注射NHS-FITC，并在其它动物NHS-EZ-LINK中注射蛋白质。两周后，发明者可以观察到胸膜基底层成分大量补充到内肺(图39b)。对肺组织和血液的质谱分析显示，博莱霉素类动物的蛋白质显著富集(图39c和d)。
博莱霉素诱导的肺纤维化的严重程度因动物而异。因此，稳健的生物标记物应根据肺纤维化的严重程度显示不同的丰度。首次对肺组织进行质谱分析，发现博莱霉素与对照动物的肺中蛋白质含量不同。这表明最初标记的蛋白质由于刺激而发生变化。纤维蛋白原等蛋白质可形成网状结构。这可能是因为纤维蛋白原与主要标记蛋白共价结合。事实上，发明者们还能够在动物血液中识别出最初标记的肺基质丰度不同的蛋白质。总之，发明者在此表明，在纤维化事件期间，流体元素在肺基质动员期间进入血流。这些元素可以被检测或可作为纤维化事件的生物标志物。
示例10：基质运动路径分析
由于ECM运动是一种全球性现象，发明者希望找出哪些信号通路和介体在基质电流中起作用。在这里，基质研究了肝脏和腹膜中的电流。在此，发明者研究了肝脏和腹膜中的基质电流。
方法
动物
获得所有小鼠系(C57BL/6J，B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J(Lyz2Cre)，B6；129S6Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai14))，由Jackson实验室或Charles River提供，并根据欧盟指令2010/63在亥姆霍兹动物设施繁殖和维护。动物被安置在单独的通风笼(IVC)中，动物饲养室保持恒定的温度和湿度，光照周期为12小时。动物们可以自由饮水和进食。所有动物实验均由上巴伐利亚州政府审查和批准，并在项目编号ROB-55.2-2532.Vet_02-19-133或ROB-2532.Vet_02-19-148下注册，并在严格的政府和国际准则下进行。本研究符合有关动物研究的所有相关道德规范。
小鼠模型
小鼠在手术前30分钟接受预先皮下注射安乃近(200mg/kg体重)。通过腹腔注射美托咪定(500mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和芬太尼(50mg/kg)混合物(以下简称MMF)进行麻醉。监测麻醉深度通过脚趾反射进行评估。眼睛被贝潘申乳膏覆盖以避免脱水，腹部被剃毛并用倍他定和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)消毒。将动物背部置于39℃的加热板上。通过皮肤和腹膜进行中线剖腹手术(1-1.5cm)。四个钩子，位于切口周围，固定在一个牵开器和磁性底板上，可以清楚地进入腹腔和肝脏。
对肝脏表面进行标记。通过电穿孔钳，施加电压30V，脉冲50ms，间隔1秒，周期8次，诱导肝脏表面局部损伤。在切口闭合前，用移液管将丁丙诺啡(0.1mg/kg)注入腹部，以进行术后初始镇痛。对于长期镇痛，每日注射安乃近(诺伐尔金，200mg/kg)。腹膜和皮肤用两条单独的4-0丝线(Ethicon)缝合。切口闭合后，通过皮下鸡尾酒注射阿替帕咪唑(1mg/kg)和氟马西尼(0.25mg/kg)对抗美托咪定和咪唑安定，唤醒小鼠。老鼠被允许在一个加热垫上恢复，然后被单独安置。在指定的时间点后处死小鼠，获得肝组织。在腹膜模型中，手术程序如上所述，但腹膜区域有标记。
在手术前2小时注射浓度为10μM溶于无菌PBS i.p.中的相应小分子的抑制剂。
标记ECM组分
丁二酰亚胺酯(NHS-ester；赛默飞世尔)在二甲基亚砜中稀释至25mg/ml，并在-80℃下储存。对于局部基质染色，通过将NHS-ester1:1与100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合生成标记溶液。对于全局腹部标记，将20μl NHS标记溶液与100μl无菌PBS混合并注射i.p.。
组织准备
器官切除后，在4℃温度下，将器官固定在2％甲醛中过夜。第二天，固定的组织在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，GIBCO，#14190-094)中清洗三次，根据用途，或者包埋、冷冻在最佳切割温度化合物(Sakura，#4583)中并储存在-20℃下，或者储存在4℃含有0.2％明胶的PBS中(Sigma-Aldrich，#G1393)，0.5％
Figure BDA0003505645070001801
声波风廓线仪X-100(Sigma-Aldrich，#X100)和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich，#T8784)(PBS-GT)。将固定组织嵌入最佳切割温度(OCT)中，并用Microm HM 525(Thermo Scientific)切割。简言之，将切片固定在-20℃的冰冷丙酮中5分钟，然后用PBS清洗。然后在室温下封闭切片，使其与PBS中的10％血清非特异性结合60分钟，然后在封闭溶液O/N中在4℃下与一级抗体一起孵育。第二天，清洗后，切片在RT下与荧光二级抗体一起在PBS中孵育120分钟。最后，切片用Hoechst 33342核酸染色剂(Invitrogen，#H1399)清洗和孵育，在
Figure BDA0003505645070001811
中清洗，用Fluoromount-G(Southern Biotech，#0100-01)固定，并在4℃的黑暗中储存。一级抗体：兔抗I型胶原(1:150，Rockland)，兔抗细胞角蛋白(1:100，Sigma-Aldrich)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗纤维连接蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，兔抗HSPG2(1:100，Elabscience)，兔抗角蛋白9(1:100，Elabscience)，兔抗Ki67(1:100，Abcam)，兔抗切割半胱天冬酶3(1:100，Abcam)，兔抗层粘连蛋白(1:100，Abcam)，兔抗HSP70(1:100，Elabscience)，仓鼠抗PDPNa(1:100，Abcam)，鼠抗LY6G(Sca1)(1:100，Abcam)，兔抗MMP23(1:100，Elabscience)，兔抗卵黄凝集素(1:100，Elabscience)和兔抗WT1(1:100，Abcam)。针对合适物种的Alexa Fluor 488-、Alexa Fluor 568-或Alexa Fluor 647共轭抗体(1:500，Life technologies)用作二级抗体。根据MMM进行的H&E染色。
显微镜检查
使用M205 FCA立体显微镜(徕卡)对组织切片进行成像。使用Imaris 9.1.0(位平面)和ImageJ(1.52i)处理2D、3D和4D数据。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。
蛋白质生物化学
使用组织裂解器(Quiagen)快速冷冻并研磨组织。将粉碎的组织重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，1mM原钒酸钠，9.5mM氟化钠，10mM丙酮酸钠，10mMβ-甘油磷酸)，并补充蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，皮尔斯)，并在冰上保持10min。样品用10.000g超声波处理并旋转5分钟。上清液储存在-80℃。根据制造商协议(皮尔斯)，通过BCA分析测定蛋白质浓度。
蛋白质下拉如下。使用下拉缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，100mM NaCl，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释裂解物，并根据制造商的说明在4℃旋转器上使用dynabeads(赛默飞世尔)培养过夜。第二天，用洗涤缓冲液1(20mM Tris-HCl pH7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和洗涤缓冲液2(20mM Tris-HCl pH 7.5，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，最后用洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl)洗涤两次。然后将珠子重新悬浮在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl和50mM DTT)中，并在37℃的洗脱缓冲液中培养30分钟。最后，将样品在98℃下煮沸5分钟，并将上清液储存在-80℃下。在Fluostar optima荧光计(BMGlabtech)中测定裂解物的荧光强度。
质谱
用EZ-LINK-NHS 100:1 FITC-NHS混合物局部标记组织。24小时后，移除器官，将原始标记的组织块从移动的基质部分分离并快速冷冻。如上所述进行组织溶解。使用改进的FASP程序消化样品。在使用DTT和IAA进行还原和烷基化后，蛋白质在
Figure BDA0003505645070001821
离心过滤器(Sartorius Vivacon 500 30kDa)上离心，用8M尿素在0.1M Tris/HCl pH 8.5中洗涤三次，用50mM碳酸铵洗涤两次。过滤器上的蛋白质在室温下使用0.5μg Lys-C(德国NeussWako Chemicals)消化2小时，在37℃下使用1μg胰蛋白酶(德国曼海姆Promega)消化16小时。通过离心(14000g下10分钟)收集肽，用0.5％TFA酸化并在-20℃下储存，直到消化后的肽自动加载到配有纳米捕集柱(100μm ID x 2cm，Acclaim PepMAP 100 C18，5μm，
Figure BDA0003505645070001822
LC包装，德国不来梅赛默费希尔科学公司)的95％缓冲液a(2％ACN，0.1％甲酸(FA))中的HPLC系统(赛默费希尔科学公司)HPLC级水)和5％缓冲液B(98％ACN，0.1％FA在HPLC级水中)的浓度为30μl/min。5min后，在分析柱(nanoEase MZ HSS T3柱，
Figure BDA0003505645070001823
1.8μm，75μm x 250mm，水)上以250nl/min的流动速率在0.1％甲酸中以3％至40％的105min非线性乙腈梯度洗脱和分离肽。洗脱肽在Q Extractive HF质谱仪(德国不来梅赛默飞世尔科学公司)中在线分析，所述质谱仪与带有纳米喷雾离子源的HPLC系统耦合，并在数据依赖模式下运行。以60000的分辨率记录MS光谱，在每个MS1循环后，选择10个最丰富的肽离子进行裂解。原始光谱导入Progenesis QIS软件(版本4.1，非线性动力学，Waters)。在特征对齐和标准化后，将光谱导出为Mascot通用文件，并使用Mascot(Matrix Science，版本2.6.2)在SwissProt小鼠数据库(16872序列)中进行搜索，搜索参数如下：10ppm肽质量公差和0.02Da片段质量公差，允许两次缺失切割，氨基甲基化被设定为固定修饰，巯基丙酰基、蛋氨酸和脯氨酸氧化被允许作为可变修饰。当使用Mascot过滤器分数截止值13和适当的显著性阈值p进行搜索时，Mascot集成诱饵数据库搜索计算出的平均错误发现率<1％。
肽分配重新导入Progenesis QI软件，并总结分配给每个蛋白质的所有独特肽的丰度。所得的单个蛋白质的标准化丰度用于使用嵌套设计计算样本组之间的蛋白质比率和p值(ANOVA)。使用EnrichR webtool26,27进行基因本体分析。
结果
为了分析ECM的运动，发明者选择了肝脏的电穿孔模型，如果是腹膜，则选择剖腹切片作为局部损伤(图40a和方法)。研究表明，赖氨酰氧化酶和弹性蛋白酶的抑制导致基质移动增加。运动蛋白的抑制仅对腹膜基质电流有抑制作用。热休克因子抑制阻断了两个器官的基质电流。在蛋白酶抑制剂中，广谱MMP抑制剂GM6001被证明是最有效的。
利用发明者的信号通路分析，他们确定了抑制或放大基质流动的多个分子。有趣的是，一些效应分子如博来司他丁和西利奥布列文只影响一个器官的基质电流。由于流体基质的组成因器官而异，因此在确定适当的生物标记物后，可以应用基质电流的器官特异性调节剂。
总之，他们展示了一种将分子附着到伤口上的新方法、肺纤维化的新潜在标志物以及调节基质运动的信号通路。
示例11：流体基质储液罐冲洗肺部导致纤维化
肺部疾病会导致炎症、结缔组织基质增生和纤维化瘢痕形成导致器官衰竭。虽然纤维化的机制尚不清楚，但它被认为是通过成纤维细胞从头合成和沉积细胞外基质发生的。在这里，发明家们发现，肺实际上被一个现成的类基质外膜贮存器所覆盖，这种损伤会触发大量的这种贮存器进入小鼠肺，最终形成纤维化疤痕。此外，这些基质外膜储库也存在于离体人体病变肺样本中。通过对小鼠和人类肺部的质谱分析，发明者发现流体基质冲洗释放了基底膜、弹性纤维、胶原纤维和交联酶，降低了肺表面弹性，同时使肺变硬。
针对小鼠的机制，发明者证明免疫细胞触发流体基质冲洗，而肺部疾病患者的免疫细胞会加剧这种效应。通过揭示炎症如何释放基质储库，研究结果揭示了一种从根本上改变纤维化过程观点的新现象。因此，这项研究为各种无法治愈且难以诊断的肺部疾病开辟了新的治疗和诊断途径。
方法
患者来源的PFA和ST组织
本研究中使用的所有组织(PFA、ST)均获得患者的适当知情同意。所有实验程序均按照加拿大多伦多儿童医院的研究伦理委员会(REB 1000055059)进行。本研究中使用的原发肿瘤培养物来自手术切除前未接受放疗或化疗的患者。
患者来源的PFA和ST细胞培养
本研究中使用的所有样本均获得患者的适当知情同意。所有实验程序均按照病童医院(加拿大多伦多)的研究伦理委员会进行。本研究建立了患者来源的PFA室管膜瘤细胞系(MDT-PFA1、MDT-PFA2、MDT-PFA3、MDT-PFA4、MDT-PFA5、MDT-PFA7、MDT-PFA8、MDT-PFA9、MDT-PFA13、MDT-PFA15)和幕上室管膜瘤细胞系(MDT-ST1、MDT-ST4)。GBM和DIPG、K27M细胞培养物分别来自Peter Dirks博士(加拿大儿童医院)和Nada Jabado博士(加拿大麦吉尔大学)。所有细胞培养均通过STR指纹图谱证实与原始肿瘤相匹配，肿瘤组织可用。以下PFA和ST细胞培养物来自男性患者：MDT-PFA1、MDT-PFA2、MDT-PFA3、MDT-PFA5、MDT-PFA7、MDT-PFA8、MDT-PFA9、MDT-PFA13、MDT-PFA15、MDT-ST4。以下PFA和ST细胞培养来自女性患者：MDT-PFA4、MDT-ST1。人类胎儿神经干细胞、fNSC(HF7450、HF6562)和永生化正常人星形胶质细胞(iNHA)分别来自Peter Dirks博士(加拿大儿童医院)和Nada Jabado博士(加拿大麦吉尔大学)。
鼠舍与饲养
所有小鼠繁殖和程序均按照表型基因组学中心(多伦多)的批准进行。成对的C57BL/6J小鼠从杰克逊实验室获得，用于小鼠繁殖。解剖交配的C57BL/6J雌性小鼠的胚胎，收集E10、E12、E14、E16和E18妊娠时间点的后脑组织。解剖C57BL/6J幼仔的后脑，收集出生后P0、P5、P7和P14时间点的组织。
体内基质命运追踪
发明者通过将5μl NHS-ester(25mg/ml)与5μl 100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合，并与40μl PBS混合至总体积为50μl来生成标记溶液。使用30G套管在异氟醚麻醉下在胸膜内施用标记溶液。
博莱霉素致肺炎模型
博莱霉素的口咽部给药诱导肺纤维化是在拮抗麻醉下在C57BL/6J小鼠(6-8周龄)中进行的。在脚趾挤压反射消失后，将老鼠放在上颌门牙上，从而保持直立姿势。舌头被小心地固定并用镊子固定在一边，而动物的鼻子被镊子盖住。通过闭上鼻子，老鼠被迫用嘴呼吸。在移液管的帮助下，将博来霉素以2单位/kg KGW的剂量溶解在80ml PBS中，小心地注入咽喉。动物吸入溶液后，立即将其转移到热板中(持续时间约30至60秒)。拮抗后，动物被饲养14天。在博莱霉素安装前1小时添加Nintedanib，每隔一天腹膜内添加10μM。
肺活检的体外培养
使用C57BL/6J雄性小鼠(6-8周龄)研究肺基质的运动。取出器官后，制作小鼠肺4mm活检穿孔。为了获得基质的异位标记，发明者通过将NHS-ESTER1:1与100mM pH 9.0碳酸氢钠缓冲液混合来生成标记溶液。无菌Whatman滤纸(Sigma-Aldrich)活检穿孔，浸泡在NHS标签溶液中，并局部放置在肺活检表面。一分钟后，取下标签冲头。小鼠肺活检在RPMI培养基(10％FBS、1％Pen/Strep和0.1％AmB)中共培养，所述培养基由从健康和特发性肺纤维化(IPF)供体分离的不同亚型免疫细胞(0.1×106细胞/活检)组成。然后在离体条件下培养带有免疫细胞的小鼠肺活检，并在37℃下提供5％CO2。
48小时后，用4％福尔马林固定小鼠肺活检组织，并在40℃下培养过夜，然后进行PBS清洗。如上文所述，获取、标记并培养24小时的人肺组织。
组织制备组织学
器官切除后，在4℃温度下，将器官固定在2％甲醛中过夜。第二天，固定的组织在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，GIBCO，#14190-094)中清洗三次，根据用途，或者包埋、冷冻在最佳切割温度化合物(Sakura，#4583)中并储存在-20℃下，或者储存在4℃含有0.2％明胶的PBS中(Sigma-Aldrich，#G1393)，
Figure BDA0003505645070001851
声波风廓线仪X-100(Sigma-Aldrich，#X100)和0.01％硫柳汞(Sigma-Aldrich，#T8784)(PBS-GT)。将固定组织嵌入最佳切割温度(OCT)中，并用Microm HM 525(Thermo Scientific)切割。简言之，将切片固定在-20℃的冰冷丙酮中5分钟，然后用PBS清洗。然后在室温下封闭切片，使其与PBS中的10％血清非特异性结合60分钟，然后在封闭溶液O/N中在4℃下与一级抗体一起孵育。第二天，清洗后，切片在RT下与荧光二级抗体一起在PBS中孵育120分钟。最后，切片用Hoechst 33342核酸染色剂(Invitrogen，#H1399)清洗和孵育，用ddH2O清洗，用
Figure BDA0003505645070001861
(SouthernBiotech，#0100-01)固定，并在4℃的黑暗中储存。
三维多光子成像
对于多光子成像，将样品嵌入4％NuSieve GTG琼脂糖溶液(Lonza，#50080)中。使用耦合到可调谐脉冲激光(光谱物理学，Insight DS+)的25倍水浸物镜(HC IRAPO L 25x/1.00W)进行成像。多光子激发的图像记录与外部，非退火混合照片(HyDs)。以下带通(BP)滤波器用于二次谐波产生(SHG)的HC 405/150 BP，绿色通道瓷砖的ET 525/50 BP使用徕卡应用套件X(徕卡v3.3.0)合并，具有平滑重叠混合，数据使用Imaris软件(v9.1.3，位平面)可视化。
三维光片成像
使用改进的3DISCO方案对整个样品进行染色和清除(Ertürk等人，2012年)。样品在升序四氢呋喃(Sigma-Aldrich，#186562)系列(50％、70％、3x 100％；各60分钟)中脱水，随后在二氯甲烷(Sigma-Aldrich，#270997)中清除30分钟，最后浸入苄基醚(Sigma-Aldrich，#108014)中。用光片荧光显微镜(LaVision BioTec)对浸泡在苄基醚中的清除样品进行成像。浸没在苄基醚中时，用白光激光器(SuperK Extreme EXW-9；NKT Photonics)在平面光片的两侧照亮试样。通过以5mm的台阶垂直移动样品室，通过激光光片记录光学切片。使用Imaris成像软件(v9.1.3，Bitplane)获得三维重建。
组织学和小鼠离体成像
组织切片在M205 FCA立体显微镜(徕卡)和蔡司AxioImager Z2m(卡尔蔡司)下成像。小鼠活检穿孔在M205 FCA立体显微镜(徕卡)下成像。数据用Imaris 9.1.3(位平面)和ImageJ(1.52i)处理。对比度和亮度进行了调整，以获得更好的可见度。Thunderning采用荧光安装和标准参数设置进行组织学切割。
免疫细胞分离
健康对照组和间质性肺病患者的人外周血收集在EDTA-管中，并在两小时内处理。使用密度梯度离心法分离PBMC(Stemcell，目录#07851)。收集PMBC层和红细胞(RBC)正上方的白细胞，以分离不同的免疫细胞亚群。
单核细胞和淋巴细胞分离
将PBMC层一分为二，并对不同细胞亚型进行
Figure BDA0003505645070001871
(Miltenyi Biotec，目录#130-092-545)珠分离。
a)根据泛单核细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录#130-096-537)提供的方案，使用一半进行单核细胞分离。
b)另一半用于分离淋巴细胞。(i)首先用CD19微球(Miltenyi Biotec，目录#130-050-301)进行分离，并收集对应于B细胞的阳性部分。(ii)然后，使用阴性部分，根据人类Pan T分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录#130-096-535)提供的方案分离T细胞。粒细胞分离
在进行上述分离的同时，使用红细胞的白细胞颗粒分离不同的粒细胞亚型。最初，将细胞重新悬浮在PBS中，并以300g离心15分钟。在下一步中，使用TQ Prep工作站(BeckamCoulter，目录#6605429)对颗粒进行红细胞裂解。用PBS洗涤溶解的颗粒，并以300g离心10分钟，以获得所有粒细胞。
为了能够分离不同的粒细胞亚型，发明者采用了CD16微球(Miltenyi Biotec，目录#130-045-701)，遵循使用
Figure BDA0003505645070001872
的磁隔离方案。产生的阴性部分对应于粒细胞，阳性部分对应于中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的混合群体。用流式细胞术确定不同细胞类型的质量。
蛋白质生物化学
使用组织裂解器(Quiagen)快速冷冻并研磨组织。将粉碎的组织重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，1mM原钒酸钠，9.5mM氟化钠，10mM丙酮酸钠，10mMβ-甘油磷酸)，补充蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，皮尔斯)，并在冰上保持10min。对样品进行超声波处理，并在10000g下旋转5分钟。上清液储存于-80℃。根据制造商协议(皮尔斯)，通过BCA-分析测定蛋白质浓度。
蛋白质下拉如下。使用下拉缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，100mM NaCl，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释裂解物，并根据制造商的说明，在4℃下使用Dynabeads在旋转器上培养过夜。第二天，用洗涤缓冲液1(20mM Tris-HCl pH 7.5，1％Triton X-100，2％SDS，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)和洗涤缓冲液2(20mMTris-HCl pH 7.5，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂)稀释样品两次，最后用洗涤液洗涤两次缓冲液3(20mM Tris-HCl pH 7.5和100mM NaCl)。然后将珠子重新悬浮在洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl和50mM DTT)中，并在37℃下培养30分钟。最后，将样品在98℃下煮沸5分钟，并将上清液储存在-80℃下。
质谱分析
如上所述进行组织溶解。如
Figure BDA0003505645070001884
等人，2009年所述，使用改进的FASP程序对样品进行消化。在使用DTT和IAA进行还原和烷基化后，蛋白质在
Figure BDA0003505645070001881
离心过滤器(Sartorius Vivacon 50030kDa)上离心，用8M尿素在0.1M Tris/HCl pH 8.5中洗涤三次，用50mM碳酸氢铵洗涤两次。使用0.5μg Lys-C(Wako化学品)在室温下消化过滤器上的蛋白质2小时，使用1μg胰蛋白酶(Promega)在37℃下消化16小时。通过离心(14000g下10分钟)收集肽，用0.5％TFA酸化并在-20℃下储存，直到消化后的肽被自动加载到配有纳米捕集柱(100μm ID x 2cm，AcclaimPepMAP 100 C18，5μm，
Figure BDA0003505645070001882
LC包装，赛默飞世尔科学)的95％缓冲液a(2％ACN，0.1％甲酸，在HPLC级水中)的HPLC系统(赛默飞世尔科学)上和以30μl/min流速流动的5％缓冲液B(98％ACN，HPLC级水中0.1％FA)。5min后，在分析柱(nanoEaseMZ HSS T3柱，
Figure BDA0003505645070001883
1.8μm，75μm x 250mm，水)上以250nl/min流体流速在0.1％甲酸中以3-40％非线性乙腈梯度洗脱和分离肽105min。在Q Exactive HF质谱仪(赛默飞世尔科学)中在线分析洗脱肽，所述质谱仪与带有纳米喷雾离子源的HPLC系统耦合，以数据相关模式运行。以60000的分辨率记录MS光谱，在每个MS1循环后，选择10个最丰富的肽离子进行裂解。原始光谱通过Progenesis QI软件(版本4.1，非线性动力学，Waters)导入。在特征对齐和标准化后，将光谱导出为Mascot通用文件，并使用Mascot(Matrix Science，版本2.6.2)在SwissProt小鼠数据库(16872序列)中进行搜索，搜索参数如下：10ppm肽质量公差和0.02Da片段质量公差，允许两次缺失切割，氨基甲基化被设定为固定修饰，巯基丙酰基、蛋氨酸和脯氨酸氧化被允许作为可变修饰。当使用Mascot过滤器分数截止值13和显著性阈值p值进行搜索时，Mascot集成诱饵数据库搜索计算出的平均错误发现率<5％。
肽分配重新导入Progenesis QI软件，并汇总分配给每个蛋白质的所有独特肽的丰度。所得的单个蛋白质的标准化丰度用于使用嵌套设计计算样本组之间的蛋白质比率和p值(ANOVA)。细胞外元素通过对一个染色体数据库的数据库搜索进行鉴定(Shao等人，2020年)。使用EnrichR webtool进行基因本体分析(Chen等人，2013年；Kuleshov等人，2016年)。
结果
胸膜血管轴用预先存在的流体基质冲洗受损肺
受损和发炎的肺通过组织和基质的复杂混合物重建，其来源仍然不明。发明者最近在皮肤上证明，疏松结缔组织(基质)是皮肤疤痕的来源(Correa Gallegos等人，2019年)。因此，发明者开始测试先前存在的基质在另一个受损组织即肺中移位的可能性。为此，发明者用N-羟基琥珀酰亚胺酯异硫氰酸荧光素局部标记并绘制活体小鼠肺(胸膜)衬里基质的命运图(图41A、41B)。
标记的胸膜基质病灶与二次谐波信号明显一致，表明细胞外胶原纤维标记正确。二次谐波信号还显示肺胸膜中有一个刚性的成熟胶原纤维交织的框架。纤维在肺表面形成网状结构，间隙大，无信号。相邻成熟纤维之间的间隙和距离由未成熟排列的微小纤维和多纤维聚集体构成的基质填充(图41B)。胸膜表面的未成熟基质由大量纤维和富含蛋白质的薄雾组成，围绕并包裹肺表面的刚性组织框架。这些富含蛋白质的浑浊纤维通过与胶原纤维编织的刚性框架相互连接的细丝粘附在刚性框架上。这些发现表明，肺表面由两个不同的亚结构组成，一个刚性成熟胶原框架和周围富含蛋白质的未成熟组织基质。
为了测试小鼠体内未成熟基质对疾病的反应能力，发明者将博莱霉素注入气管(图41D)。发明者之所以选择博莱霉素，是因为它会引起严重的肺炎，阻塞细支气管，导致广泛的肺瘢痕和呼吸衰竭。因此，我们可以在肺部疾病的两个关键步骤：炎症和纤维化中研究基质的来源。引人注目的是，博莱霉素诱导预先标记的基质从胸膜表面向肺部中心广泛向内移动。胸膜基质的这种活动是进行性的。在最初的几天里，它用基质沉积物持续冲洗最外层的气道(细支气管)及其周围的间质空间，这些基质沉积物有效地包裹了肺泡和细支气管。在随后的几天里，流体基质进一步向内移动，聚集在支气管和血管外膜周围，形成增厚的层和基质增生，包围主要血管和支气管。这些运动使肺主要血管的外膜、中膜和内膜室增厚(图41E)。在损伤后的2周内，流体基质沿着整个支气管树累积，并完全穿透肺间质，形成具有致密瘢痕的大区域，其中出现肌成纤维细胞病灶(图41F和G)。发明者还发现，肺表面的细纤维结构随着博来霉素的作用而发生变化，荧光强度降低，表明表面蛋白质丢失(图45)。事实上，与健康胸膜相比，病变肺表面荧光强度的降低与细纤维体积的减少和基质组织的改变有关(图41H和图45A和1B)。发明者注意到了漩涡状的纤维结构，这种结构在患病的肺中纤维含量减少。
接下来，发明者试图通过质谱法确定胸膜储层流体基质的蛋白质成分。简单地说，发明者将生物素结合的EZ-连接磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯注射到胸膜腔中，如发明者之前所做的那样，在胸膜肺表面标记基质蓄水池。发明者随后对小鼠进行博莱霉素诱导的损伤(图46A)。受伤后两周，研究者收集了病肺，通过链霉亲和素下拉标记基质，然后对所有标记肽进行质谱蛋白质组学分析。主成分分析显示基质类似于瘢痕组织(图46D)，73％的细胞外蛋白是胶原纤维的成分(图46B和C)。免疫标记病变肺证实了这一点。总的来说，这些数据揭示了从胸膜表面到深部肺外膜和支气管间隙的基质向内运动轴。他们进一步指出，肺表面含有大量基质，这些基质在数天内灌溉整个肺，有效地沉积了形成纤维化疤痕的结缔组织。
免疫协调基质归巢
肺纤维化涉及多种免疫细胞，尽管任何因果关系和/或机制仍有待确定。出于这一动机，发明家们开始研究不同免疫细胞群对肺基质入侵的影响。来自健康志愿者的淋巴细胞(B细胞和T细胞)、单核细胞和粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的发明者群体。如前所述，用染料酯在胸膜表面标记肺移植基质储库，并使用从健康志愿者获得的免疫细胞亚群对其进行单独培养(图42A)。在带有荧光标记表面的肺外植体与免疫细胞一起培养时，肺表面荧光强度持续下降。免疫缺陷样品的荧光保持不变。这表明免疫细胞导致基质从受损的肺表面丢失。将免疫细胞添加到肺外植体后48小时内，荧光强度值显著降低一半。粒细胞、中性粒细胞和单核细胞是表面基质丢失的最有效诱导因子(图42B)。如上42B所述，肺表面蛋白质和纤维的丢失伴随着标记基质的剧烈向内运动，从而冲洗肺活检的肺泡和间质间隙(图42C)。
当健康志愿者的免疫细胞触发基质侵入肺部时，发明者接下来仔细分析了肺病患者免疫细胞对基质运动的影响。为此，发明者直接从特发性肺纤维化患者中分离出免疫细胞，并将其添加到肺移植培养物中。所有类型的患者免疫细胞增强了胸膜表面基质的剧烈运动。这导致表面荧光强度降低，从49降低到20，同时伴有从60毫米到110毫米的高向内侵入指数。肺组织块的荧光组织学图像显示，特发性肺纤维化患者的单核细胞和淋巴细胞诱导了最显著的胸膜基质侵入肺泡和间质间隙，这与博莱霉素动物的最初发现非常相似。
这些发现有力地表明，单核细胞和淋巴细胞在从胸膜表面释放基质和冲洗肺部方面起着关键作用。此外，发明者还可以推断，来自患病患者的免疫细胞已经“准备好”完成这项任务，远远超过健康个体。
患病的人肺经历剧烈的基质运动
为了研究人类患病肺是否以与小鼠模型相同的方式进行基质移动，发明者将标记技术应用于来自患病患者的人类肺样本(图43A)。尽管人类的肺比老鼠的弹性纤维更为精细，但同样的两种组织仍然清晰可见。厚的成熟胶原纤维的刚性和静态框架浸泡在大量富含蛋白质的未成熟基质中。
标记的人类胸膜储层在24小时内经历了基质的剧烈向内移动。重要的是，发明者能够将电流注入受伤的人体肺组织内部(图43A)。
标记的病变肺活检的双光子图像显示，富含蛋白质和纤维完全冲洗了受损肺细支气管和血管周围的间质空间，直至主支气管。在这里，发明者观察到在外膜、中膜和内膜内沉积和混合的多个组织纤维增生层，形成增厚的支气管壁和充满新纤维的边缘，正如发明者最初在博莱霉素小鼠中发现的那样(图43B)。
总之，发明者在人类病变肺中观察到的富含蛋白质的基质运动与上述发明者在肺部疾病小鼠模型中观察到的相同。此外，在与患病患者的免疫细胞培养后，这些运动也在小鼠健康肺样本中诱导。因此，免疫细胞触发胸膜表面储液罐中富含蛋白质的基质的冲洗。因此，这些数据建立了炎症和下游纤维化之间的功能联系。
为了研究这种富含蛋白质的基质在人肺中的组成，发明者标记了病变的活检胸膜，并将其培养24小时。然后，发明者分离胸膜和间质组织进行蛋白质提取，然后进行质谱蛋白质组学(图43D)。蛋白质组学研究显示，1346种不同蛋白质类型的富含蛋白质的基质向内侵入，积聚在肺间质间隙和周围的肺细支气管内。一项针对由细胞外成分组成的数据库的蛋白质调查显示，大多数(～76％)人类胸膜基质成分由胶原纤维组成(图43E)。主成分分析表明，这种富含蛋白质的汤在成分上与萎缩性瘢痕和异常硬化的血管组织基质相似(图43F)。基质也由许多基质蛋白组成，如糖蛋白、蛋白多糖和细胞外基质相关蛋白。与多光子成像一致，发明者发现了大量的原纤维胶原纤维，如I型和III型胶原，以及赖氨酰氧化酶(Lox)和谷氨酰胺转胺酶(Tgm)等共价交联酶：两者都参与组织重塑和成熟，并与成纤维细胞活化为病理性肌成纤维细胞有关(图43G)。发明者还发现了与基膜形成和稳定性有关的蛋白质，如IV、VI型胶原，包括弹性纤维复合物，如弹性蛋白和原纤维蛋白：维持器官柔韧性和弹性所需的蛋白质，所有这些蛋白质都从胸膜表面去除。总体而言，发明者确定了一种蛋白质库存，所述库存以多种方式促进组织刚性。
通过分析保留在肺表面的蛋白质与去除的蛋白质的相对分数，发明者发现单个蛋白质具有截然不同的易位图谱(图46A)。例如，弹性纤维和纤维状胶原的易位指数高达～1.2，而基底膜成分的易位指数极低，为～0.8(图46B)。在交联酶列表中，非特异性谷氨酰胺转胺酶2(TGM2)的易位指数高于任何其它交联酶或亚型，表明非特异性交联在纤维化斑块中占主导地位。载脂蛋白(LPA)也具有极高的易位指数，与LPA作为早期纤维化标志物的作用一致。这些广泛变化的易位曲线表明，胸膜表面的蛋白质释放是动态的，而清洗受损肺部的蛋白质汤根据单个蛋白质的运动速度改变其成分。
Nintedanib通过阻断肺灌洗抑制肺纤维化
发现免疫细胞触发基质移位后，发明者继续研究抗纤维化抗炎药是否抑制动物体内基质运动。泛酪氨酸激酶抑制剂Nintedanib是目前市场上仅有的两种被批准用于治疗肺纤维化的抗纤维化药物之一，因为它具有阻止疾病进展的抗纤维化和抗炎活性。为了检查Nintedanib对基质库的可能影响，发明者在整个entirematrix蛋白质组中进行了全局激酶富集分析。事实上，鼓励发明者发现基质蛋白质组富含酪氨酸激酶，因此受到其活性的显著影响(图44A)。
为了直接回答Nintedanib的抗纤维化作用是否是通过其对基质运动的影响来介导的，发明者像以前一样在肺表面标记基质储库，用博莱霉素诱导肺炎症和纤维化，并每天注射Nintedanib(图44B)。博莱霉素触发了基质的大量向内移位，而注射尼替尼则完全消除了这些基质移动(图44C和44D)。注射了Nintedanib的动物在肺表面保持了与基质相同的结构和荧光强度，使人想起对照健康肺。此外，组织学分析显示基质储库没有向内移位和冲洗肺部。肺泡和主要血管都缺乏标记纤维的增生。在缺乏基质运动的情况下，肺间质成纤维细胞被抑制活化为病理性YAP/TAZ阳性肌成纤维细胞。因此，肺结构看起来更健康，沿肺气道和细支气管的纤维化发展迹象非常轻微(图44D)。这表明Nintedanib通过抑制来自储液罐的基质移位发挥抗纤维化作用，从而解除肺部新组织增生引起的炎症。
总之，发明者在此揭示了炎症与下游纤维化之间的关系。发明者证明，炎症可从胸膜储层动员富含蛋白质的流体基质，用疤痕组织冲洗肺部，而尼替尼通过抑制基质冲洗发挥作用，从而改善疾病进展。基质冲洗可能是器官损伤和疾病的一般原则，对许多人类纤维化疾病具有潜在的临床影响。
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Claims (15)

1.一种用于识别细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的调节剂的方法，包括(a)用标签接触可通过从哺乳动物受试者活检获得的器官组织的细胞外基质；(b)将所述标记的器官组织细胞外基质与感兴趣的化合物接触；(c)与通过活检从未接触所述感兴趣的化合物的哺乳动物受试者获得的标记的器官组织细胞外基质相比，确定所述感兴趣的化合物是否调节ECM向所述需要沉积ECM的部位的移动，其中，对需要沉积ECM的所述部位的ECM运动的调节表明所述感兴趣的化合物是所述ECM运动的调节剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中调节是抑制或促进。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述器官组织包括筋膜基质、浆膜和/或外膜。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中筋膜基质、浆膜和/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞和/或成纤维细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标签为染料或标签。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述器官组织来自皮肤、肾脏、肺、心脏、肝脏、骨、腹膜、肠、膈膜或胸膜。
7.一种用于识别与细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动相关的生物标记物的方法，包括：(a)用标签接触通过活检从哺乳动物个体获得的器官组织的细胞外基质；(b)从所述标记的ECM中分离蛋白质，其向所述需要沉积ECM的部位移动；(c)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列，从而将所述蛋白质识别为与ECM运动相关的生物标记物。
8.一种化合物，用于调节细胞外基质(ECM)向需要沉积ECM的部位移动的方法，优选用于治疗涉及ECM沉积的状况。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中ECM运动由筋膜基质介导。
10.根据权利要求8或9所述的化合物，其中筋膜基质、浆膜及/或外膜包括巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞及/或成纤维细胞。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的化合物，其中需要沉积ECM的所述部位是伤口。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的化合物，其中调节是抑制。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的化合物，其中涉及ECM沉积的所述状况是ECM过度沉积。
14.根据权利要求8至11中任一项所述的化合物，其中调节是促进。
15.根据权利要求8至11和14中任一项所述的化合物，其中涉及ECM沉积的所述状况是ECM沉积不足。
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