JP2022550141A - 肺線維症モデルおよびそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングの使用のための、肺胞再生における新たに同定された移行細胞状態、肺線維症および肺気腫をもたらす１型肺胞細胞をアブレートするためのモデル、共培養された肺線維芽細胞およびプレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）を使用する拡張可能なｅｘ ｖｉｖｏ肺線維症モデル、ならびにそれらを使用する方法を提供する。本開示は、肺疾患の理解、薬物発見および／または薬物スクリーニングのための使用のためのモデルに役立つ移行細胞状態が肺胞再生において存在するという、本発明者らによる発見に一部基づく。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年２月１２日出願の米国仮特許出願第６２／９７５，２９４号および２０１９年９月２６日出願の米国仮特許出願第６２／９０６，２４１号に対する優先権を主張し、これらの各々の内容は、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金供与の説明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｒａｎｔ Ｎｏｓ． Ｒ００ＨＬ１２７１８１；Ｒ０１ＨＬ１５３３７５の下で、政府の支援によりなされた。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

背景
分野

本開示は、疾患モデリング、薬物発見および／または薬物スクリーニングの使用のための、肺胞再生における移行細胞状態の同定、肺線維症および肺気腫をもたらす１型肺胞細胞をアブレートするためのモデル、共培養された肺線維芽細胞およびプレ１型肺胞移行細胞状態（ｐｒｅ－ａｌｖｅｏｌａｒ ｔｙｐｅ－１ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｓｔａｔｅ）（ＰＡＴＳ）細胞を使用する拡張可能なｅｘ ｖｉｖｏ肺線維症モデル、ならびにそれらを使用する方法を提供する。

関連分野の説明
成体幹細胞は、組織損傷に応答して動的な変化を受ける。これらの変化は、静止状態または平衡を保った状態からの復活、増殖の開始、新たな遺伝子発現の活性化、およびホメオスタシスへの復帰を含む。多くの場合、修復には、例えば、損傷または裸出のエリアをカバーする一過的な伸展および拡張を介した、上皮細胞形状における変化もまた関与する。幹細胞再生の研究は、通常、ニッチからのシグナルに応答して新たな分化プログラムを細胞がどのように選択するかを理解することに焦点を当てている。しかし、細胞形状および広がりなどのパラメーターにおける変化の意義、ならびにそれらにＤＮＡ修復および老化を含む病理学的状態に通常関連する遺伝子の一過的な緊密に制御された発現が関与するかどうかについては、知られていることははるかに少ない。

肺では、ホメオスタシスでの肺胞上皮の維持および傷害後のその再生は、自己更新でき、ガス交換のために特殊化した非常に大きい薄い１型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ１）へと分化することができる、立方体状のサーファクタント産生２型肺胞上皮細胞（ＡＥＣ２）によって支持される。最近の研究は、活性なＷｎｔシグナル伝達について富化されており、Ｗｎｔ不活性なＡＥＣ２と比較して高い「幹細胞性」を有するＡＥＣ２のサブセットを同定している。肺胞前駆細胞サブセットにおけるかかる差異は、微小環境シグナルにおける差異に帰せられてきた；この場合には、ＡＥＣ２においてＷｎｔシグナル伝達を活性化するリガンドを産生するＰＤＧＦＲα発現線維芽細胞の近傍に帰せられる。最近の研究は、定常状態におけるおよび肺胞傷害に応答しての両方でのＡＥＣ２の増殖および分化における、ＢＭＰ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦβ、ＹＡＰおよびＮＦ－κＢを含む他のシグナル伝達経路もまた暗示している。しかし、ＡＥＣ２が薄く平たいＡＥＣ１に変換する際に立方体状ＡＥＣ２が細胞の形状、構造および機械的特性における劇的な変化を調整する正確な機構は、依然として分かりにくい。さらに、ほとんどの進行性肺疾患において一般に観察される特色である細胞老化に関連する遺伝子を発現するようにＡＥＣ２を駆動する細胞機構は、依然として未知である。

ここで、オルガノイド培養および単一細胞トランスクリプトーム研究を使用して、ＡＥＣ２とＡＥＣ１との間の移行を包含する以前には未知であった別個の細胞状態が発見された。さらに、傷害－修復モデルとカップリングさせたマウス系列追跡は、ｉｎ ｖｉｖｏでの類似の移行状態の存在を明らかにしている。この研究は、これらの移行状態を制御するシグナル伝達経路を明らかにする。本明細書で記載されるように、これらの移行状態は、ＤＮＡ損傷応答を示し、ＡＥＣ１に向かう途中に老化関連遺伝子を発現する。機構的に、遺伝的機能喪失、薬理学的機能獲得およびゲノム結合アッセイの使用は、ＴＰ５３シグナル伝達によるＰＡＴＳの直接的な転写制御を明らかにした。重要なことに、これらの移行状態は、進行性肺線維症を有するヒト肺における欠損した線維化病巣に関連する異常な上皮細胞と相関する。

本開示の概要
本開示は、肺疾患の理解、薬物発見および／または薬物スクリーニングのための使用のためのモデルに役立つ移行細胞状態が肺胞再生において存在するという、本発明者らによる発見に一部基づく。

本開示の一態様は、肺傷害オルガノイドモデルを生成する方法であって、ｉ）細胞の共培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップであって、共培養物が、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞および肺胞線維芽細胞を含む、ステップ；ｉｉ）培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ならびにｉｉｉ）作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、ＰＡＴＳ細胞および／または肺胞線維芽細胞の少なくとも１つの発現マーカーに対する作用物質の生物学的影響を分析するステップ、を含む方法を提供する。

本開示の一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、罹患組織から単離される。本開示の一部の実施形態では、罹患組織は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）肺組織、肺線維症肺組織、特発性肺線維症肺組織、肺気腫肺組織、肺がん組織、サルコイドーシス肺組織、間質性肺炎肺組織、敗血症肺組織、ウイルス感染および細菌感染を有する肺組織、急性呼吸促迫症候群肺組織、または気管支肺異形成症肺組織である。

本開示の一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、肺上皮細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで傷害を引き起こす作用物質（例えば、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、照射、ウイルス、細菌または真菌）に曝露させることによって生成される。

本開示の一部の実施形態では、肺胞線維芽細胞は、リポ線維芽細胞（ｌｉｐｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）である。

本開示の他の実施形態では、肺胞線維芽細胞は、疾患状態特徴を有する。本開示の一部の実施形態では、疾患状態特徴は、ＡＣＴＡ２を発現するリポ線維芽細胞、筋線維芽細胞の存在、および／または星状形状から帯状形状への細胞変化を含む。

本開示の一部の実施形態では、培養培地は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）リガンドを含む。

一部の実施形態では、培養培地は、ＰＤＧＦＲ発現を維持またはモジュレートすることが可能な作用物質を含む。

本開示の別の態様は、肺線維症のためのｅｘ ｖｉｖｏモデルを生成する方法であって、ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでアブレーションを受けたＡＥＣ１細胞の培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップ；ｉｉ）培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ならびにｉｉｉ）作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、ＡＥＣ１細胞の少なくとも１つの発現マーカーに対する作用物質の生物学的影響を分析するステップ、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、少なくとも１ラウンドのアブレーションを受けている。他の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、単独のまたは他の傷害モデルと組み合わせたアブレーションを受けている。一部の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、例えば、約３日間～約２週間の過程にわたる反復アブレーションを受けている。

本開示の一部の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、アスベスト、化学的毒性作用物質、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌に曝露されることによるアブレーションを受けている。

一部の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、ａＳＭＡおよび／またはＡＣＴＡ２を発現する。一部の実施形態では、ＡＥＣ１細胞は、線維筋細胞（ｆｉｂｒｏｍｙｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）の特徴を示す。

本開示のさらに別の態様は、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞またはＰＡＴＳ様細胞を同定する方法であって、ｉ）肺胞細胞を得るステップ；およびｉｉ）細胞を、１つまたは複数のマーカーについてスクリーニングするステップ、を含み、１つまたは複数のマーカーの存在が、ＰＡＴＳ細胞またはＰＡＴＳ様細胞の存在を示す、方法を提供する。

本開示の一部の実施形態では、肺胞細胞は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆（ＡＥＰ）細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体（ｄｉｓｔａｌ ｌｕｎｇ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系列陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺管細胞（ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ ｇｌａｎｄ ｄｕｃｔ ｃｅｌｌ）、誘導多能性幹細胞由来肺幹細胞および２型肺胞上皮（ＡＥＣ２）細胞からなる群より選択される。

本開示の一部の実施形態では、肺胞細胞は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺気腫、肺がん、サルコイドーシス、間質性肺炎、敗血症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、急性呼吸促迫症候群および／または気管支肺異形成症を患う患者の肺から得られる。

本開示の一部の実施形態では、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞またはＰＡＴＳ様細胞を同定する方法は、肺胞細胞を作用物質（例えば、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌）と接触させるステップをさらに含む。

本開示のさらに別の態様は、ｉｎ ｖｉｖｏ組織線維症モデルを生成する方法であって、ｉ）被験体においてＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいはｉｉ）ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる作用物質を被験体に投与するステップ；ならびにｉｉｉ）被験体由来の細胞を分析して、対照被験体と比較した、ＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失の生物学的影響ならびに／またはＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる作用物質の生物学的影響を決定するステップ、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる作用物質は、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲアゴニスト、ＰＤＧＦ阻害剤またはＰＤＧＦアゴニストを含む。

本開示のさらに別の態様は、ｉｎ ｖｉｖｏ組織線維症モデルを生成する方法であって、ｉ）被験体においてＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦｂの遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいはｉｉ）ＲＵＮＸ１阻害剤、ＲＵＮＸ２阻害剤、ＲＵＮＸ３阻害剤もしくはＣＢＦｂ阻害剤を被験体に投与するステップ；ならびにｉｉｉ）被験体由来の細胞を分析して、対照被験体と比較した、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβの遺伝的喪失の生物学的影響および／またはＲＵＮＸ１阻害剤、ＲＵＮＸ２阻害剤、ＲＵＮＸ３阻害剤もしくはＣＢＦβ阻害剤の生物学的影響を決定するステップ、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、阻害剤は、Ｒｏ ５－３３３５、ＡＩ－１０－４９、またはＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３および／もしくはＣＢＦβに対する中和抗体である。

一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、マウスモデルである。

一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、肺、肝臓、腎臓、皮膚、腸または骨髄における線維症のための疾患モデルである。

図１Ａ～１Ｈ。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって明らかになった、ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイドにおける以前には未知であった肺胞上皮細胞状態。図１Ａは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために利用した肺胞オルガノイド培養の概略図である。図１Ｂは、肺胞オルガノイドに由来する総細胞における細胞１つ当たりの遺伝子の数（ｎＧｅｎｅ）および独自分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ｎＵＭＩ）を可視化するピアソン相関プロットを示す（左パネル、１０，９４８細胞）。ＵＭＡＰは、肺胞オルガノイドにおける上皮細胞（５，１６３細胞）、線維芽細胞（５，６８６細胞）を含む主要細胞集団、ならびに一部の少数集団、例えば、内皮細胞（６６細胞）およびマクロファージ（３３細胞）を示す（右パネル）。図１Ｃは、肺胞オルガノイド（４，７８７細胞）、ｉｎ ｖｉｖｏホメオスタシスマウス肺（１，８７８細胞）およびＬＰＳで処置したマウス肺（１４，３２３細胞）に由来する細胞を示す統合されたＵＭＡＰである（左）。統合されたＵＭＡＰにおける示された遺伝子の発現（右）。図１Ｄは、培養された肺胞オルガノイド（ｎ＝４，５７３細胞）における上皮集団のＵＭＡＰ可視化である：ＡＥＣ２（ｎ＝３，３０３細胞）；ＡＥＣ２増殖性、増殖性ＡＥＣ２（ｎ＝６９６細胞）；ＡＥＣ１（ｎ＝２６２細胞）ならびに新たな細胞状態 － Ｌｇａｌｓ３＋（ｎ＝１８４細胞）およびＣｔｇｆ＋細胞（ｎ＝１２８細胞）。図１Ｅは、培養された肺胞オルガノイドにおける上皮集団における示された遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットである。図１Ｆは、肺胞オルガノイドｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（４，５７３細胞）およびＬＰＳで処置した肺または対照肺（１３，２０４細胞）における、ＡＥＣ２、ＡＥＣ２増殖性、ＡＥＣ１、および新規肺胞上皮細胞状態における示された遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットである。図１Ｇは、Ｃｔｇｆ＋（ｎ＝１２８細胞）およびＬｇａｌｓ３＋（ｎ＝１８４細胞）移行細胞状態において富化された特定の遺伝子を示すボルケーノプロットである。ウィルコクソンの順位和検定を統計分析に使用した。データポイントは、倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）（Ｌｏｇ２）およびＰ値（Ｌｏｇ１０）について設定した閾値を下回る転写物を示す。図１Ｈは、線維芽細胞およびＡＥＣ２を使用する肺胞オルガノイド培養の概略図である。Ｔｍｘ、タモキシフェン。 同上。 同上。 同上。

図２は、Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスにおけるブレオマイシンで誘導された肺傷害の実験的ワークフローを示す概略図である。

図３は、肺胞オルガノイド（上、ｎ＝４，５７３細胞）およびＬＰＳで傷害された肺ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（下、ｎ＝１３，２０４細胞）に由来する上皮細胞集団におけるＫｒｔ８およびＳｆｎの発現を示すバイオリンプロットである。バイオリンプロットは、細胞の分布を示す。

図４Ａ～４Ｂは、ＰＡＴＳ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでの肺傷害後に肺胞幹細胞から一過的に出現することを示す。図４Ａは、Ａｇｅｒ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ＤＴＲマウスモデルにおいてＡＥＣ１をアブレートするための実験的設計を示す概略図である。マウスに、タモキシフェンを投与し、その後ＤＴを投与して、組織を６日目に収集した。図４Ｂは、対照肺およびＡＥＣ１をアブレートされた肺における細長いＬＧＡＬＳ３＋細胞の割合を示すグラフである。^＊＊＊Ｐ＜０．０００８、対応のない両側スチューデントｔ検定；ｎ＝３匹のマウス。

図５Ａ～５Ｆは、ＰＡＴＳ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏでの肺傷害後の肺胞幹細胞に起源することを示す。図５Ａは、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを使用する、タモキシフェンの逐次投与とその後のブレオマイシン傷害、および分析のための組織収集についての実験的ワークフローを示す概略図である。図５Ｂは、ブレオマイシン傷害後のＣＬＤＮ４、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＬＧＡＬＳ３についての免疫染色の時間経過を示す。スケールバー、１０μｍ。画像は、３匹のマウスの代表である。図５Ｃは、傷害後の異なる時点におけるＣＬＤＮ４＋、ＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋およびＬＧＡＬＳ３＋細胞の定量化を示すグラフである。ｎ＝３匹のマウス。図５Ｄは、ＣＬＤＮ４＋、ＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋およびＬＧＡＬＳ３＋細胞の細胞の長さを示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０４９（ＣＬＤＮ４＋ 対 ＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋）および０．０２３５（ＣＬＤＮ４＋ 対 ＬＧＡＬＳ３＋）、対応のない両側スチューデントｔ検定；３匹のマウスからのｎ＝３０細胞。図５Ｅは、肺切除術傷害モデルを示す概略図である。図５Ｆは、異なるＰＡＴＳサブタイプを介したＡＥＣ２からＡＥＣ１への移行を示す概略図である。 同上。 同上。

図６Ａ～６Ｈは、系列追跡により、ＰＡＴＳ細胞がＡＥＣ１を生成することが明らかになったことを示す。図６Ａは、培養された肺胞オルガノイド（ｎ＝４，５７３細胞）における上皮集団のＵＭＡＰである。矢印は、図６Ｂに示される、楕円中の選択された細胞集団を示す。図６Ｂは、選択された集団（図６Ａ中の楕円；ｎ＝５７４細胞）における示された遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットである。図６Ｃは、Ｋｒｔ１９－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおけるブレオマイシン（傷害）またはＰＢＳ（対照）とその後のタモキシフェン（Ｋｒｔ１９発現細胞を標識するため）の逐次投与についての実験的ワークフローを示す概略図である。図６Ｄは、ＳＦＴＰＣ、Ｋｒｔ１９－ｔｄｔおよびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。白の矢印は、ＡＧＥＲ＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞を示す。スケールバー、３０μｍ。画像は、類似の結果を伴って独立して反復された、３匹のマウスの代表である。図６Ｅは、ＳＦＮ、Ｋｒｔ１９－ｔｄｔおよびＡＧＥＲについての共染色を示す画像である。白の矢印は、ＳＦＮ＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞を示す。スケールバー、５０μｍ。画像は、類似の結果を伴って独立して反復された、３匹のマウスの代表である。図６Ｆは、総Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞中のＡＧＥＲ＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞の定量化を示すグラフである。ｐ＝０．０３１８（片側、マン・ホイットニー）。ｎ＝３匹のマウス。図６Ｇは、ＣＬＤＮ４、Ｋｒｔ１９－ｔｄｔおよびＬＧＡＬＳ３についての免疫染色を示す画像である。矢印は、ＣＬＤＮ４＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞を示す。スケールバー、５０μｍ。画像は、類似の結果を伴って独立して反復された、３匹のマウスの代表である。矢じりは、ＬＧＡＬＳ３＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞を示す。図６Ｈは、総Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞中のＫＲＴ８＋Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞の定量化を示すグラフである。ｐ＝０．０３１８、（片側、マン・ホイットニー）。ｎ＝３匹のマウス。 同上。 同上。 同上。

図７Ａ～７Ｃは、ＰＡＴＳにおいて富化された遺伝子発現シグネチャーおよびシグナル伝達経路を示す。図７Ａは、ＫＥＧＧ分析がＰＡＴＳにおいて富化された経路を明らかにすることを示すグラフである。ウェブベースのツールＥｎｒｉｃｈｒＳｃａｌｅを使用して、ｌｏｇ２変形された合わされたスコアの値を決定した。図７Ｂは、肺胞オルガノイド（ｎ＝４，５７３細胞）およびＬＰＳで処置したマウス肺（ｎ＝１３，２０４細胞）におけるＡＥＣ２、増殖性ＡＥＣ２（ＡＥＣ２ｐｒｏ）、ＰＡＴＳおよびＡＥＣ１における示されたシグナル伝達経路の公知の標的遺伝子の発現を示すヒートマップである。スケールは、ｚ－スコアを示す。図７Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏのＬＰＳ傷害モデル（ｎ＝１３，０３９細胞）からの示された細胞集団における老化（上）およびＤＮＡ損傷応答経路（下）についてのバイオリンプロットである。黒の点は細胞を示す。バイオリン本体は、細胞の分布を示す。 同上。 同上。

図８Ａ～８Ｉは、ＰＡＴＳ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで伸展により誘導されたＤＮＡ損傷および老化を受けることを示す。図８Ａは、ブレオマイシンで傷害された（右）肺および対照（左）肺におけるβ－ガラクトシダーゼ活性についての染色を示す画像である。スケールバー、１００μｍ。図８Ｂは、対照（上）肺およびブレオマイシンで傷害された（下）肺におけるＣＤＫＮ１Ａ、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。矢じりは、ＣＤＫＮ１Ａ＋細胞を示す。白の点線はＡＥＣ１を示し、点線は、ｔｄｔ＋細胞の輪郭を描く。スケールバー５０μｍ。図８Ｃは、対照（上）肺およびブレオマイシンで傷害された（下）肺におけるγＨ２ＡＸ、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。スケールバー５０μｍ。図８Ｄは、対照マウスおよびブレオマイシンで傷害されたマウスにおける、１０日目の、ＬＧＡＬＳ３＋である総γＨ２ＡＸ＋Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＜０．０３１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３匹のマウス。図８Ｅは、ＤＴで処置された肺および対照肺におけるβ－ガラクトシダーゼ活性についての染色を示す画像である。スケールバー、１００μｍ。図８Ｆは、対照肺（上）およびＤＴで処置された肺（下）におけるＣＤＫＮ１Ａ、ＬＧＡＬＳ３およびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。矢じりは、ＣＤＫＮ１Ａ＋細胞を示す。スケールバー２０μｍ。図８Ｇは、対照肺およびＤＴで処置された肺における、ＬＧＡＬＳ３＋である総γＨ２ＡＸ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０３１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３匹のマウス。図８Ｈは、ＡＥＣ２の２Ｄ培養の概略図である。図８Ｉは、ＡＥＣ２の２Ｄ培養におけるＳｆｔｐｃ－ＧＦＰ、γＨ２ＡＸおよびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。白の矢印は、ＤＮＡ損傷マーカーを有する細胞を示す。スケールバー２０μｍ。画像は、類似の結果を伴って独立して反復された、３匹のマウスの代表である。ＤＡＰＩは、核を染色する。 同上。 同上。 同上。 同上。

図９Ａ～９Ｈは、遺伝学的および薬理学的モジュレーションならびにゲノム結合アッセイが、ＴＰ５３シグナル伝達によるＰＡＴＳの転写制御を明らかにすることを示す。図９Ａは、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを使用する、タモキシフェンの逐次投与とその後のＰＢＳまたはブレオマイシン（０日目）投与、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａまたはＤＭＳＯ処置（８～１８日目）、および分析のための組織収集（２０日目）についての実験的ワークフローを示す概略図である。図９Ｂは、ＰＢＳ＋Ｎｕｔｌｉｎ－３ａ、ブレオマイシン＋ＤＭＳＯ、およびブレオマイシン＋Ｎｕｔｌｉｎ－３ａで処置したマウスにおける、ＡＧＥＲ＋である総Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０２０１、対応のない両側スチューデントｔ検定；ｎ＝３匹のマウス。図９Ｃは、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａで処置した肺胞オルガノイド培養の概略図である。図９Ｄは、対照またはＮｕｔｌｉｎ－３ａで処置した肺胞オルガノイドにおけるＫｉ６７（緑）およびＡＧＥＲ（灰色）についての免疫染色を示す画像である。スケールバー：３０μｍ。図９Ｅは、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｔｒｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスまたは対照マウス（Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｔｒｐ５３＋／＋）における、ＡＥＣ２においてＴＰ５３を欠失させるためのタモキシフェンの逐次投与とその後のブレオマイシン傷害（０日目）についての実験的ワークフローを示す概略図である。図９Ｆは、対照マウスおよびＴｒｐ５３－ノックアウトマウスにおける、ＡＧＥＲ＋である、ＳＦＴＰＣ、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＡＧＥＲ、ならびにＣＬＤＮ４、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＬＧＡＬＳ３についてからの総Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対応のない両側スチューデントｔ検定；ｎ＝３匹のマウス。図９Ｇは、ブレオマイシンで処置した肺におけるＣＬＤＮ４＋、ＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋およびＬＧＡＬＳ３＋細胞（それぞれ、左から右の棒）の割合を示すグラフである。^＊＊Ｐ＝０．０４８（ＣＬＤＮ４）および０．００１３（ＬＧＡＬＳ３）、対応のない両側スチューデントｔ検定；ｎ＝３匹のマウス。図９Ｈは、ブレオマイシンで処置した対照マウスおよびＴｒｐ５３－ノックアウトマウスにおける、ｐ２１＋であるＳｆｔｐｃ－ｔｄｔおよびＳＦＮからの総Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対応のない両側スチューデントｔ検定；ｎ＝３匹のマウス。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１０Ａ～１０Ｅは、ＴＰ５３シグナル伝達によるＰＡＴＳの転写制御を示す。図１０Ａは、ＰＡＴＳ（上の線）およびホメオスタシスＡＥＣ２（下の線）における、ＰＡＴＳマーカー遺伝子座におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークの分布を示すグラフである。図１０Ｂは、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスにおけるブレオマイシンで誘導された肺傷害とその後のＰＡＴＳ選別およびＣｈＩＰ分析についての実験的ワークフローを示す概略図である。図１０Ｃは、ＩＧＶにおいて示されたＴＲＰ５３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（活性なプロモーター）およびＨ３Ｋ２７ａｃ（活性なエンハンサー）についてのＣｈＩＰ富化である。図１０Ｄ ＩＧＶトラックは、ＡＥＣ１遺伝子座の公知の標的に対応するゲノム遺伝子座では、ＴＰ５３結合についての富化を示さない。図１０Ｅ ＩＧＶトラックは、ＡＥＣ２遺伝子座の公知の標的に対応するゲノム遺伝子座では、ＴＰ５３結合についての富化を示さない。 同上。 同上。

図１１Ａ～１１Ｍは、ＩＰＦにおけるＰＡＴＳ様状態の富化が、病理学的環境におけるこの状態の持続を示唆することを示す。図１１Ａは、健康な肺およびＩＰＦ肺におけるＡＥＣからのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを示すＵＭＡＰである（ｎ＝１１，７２５細胞）。図１１Ｂは、健康な肺およびＩＰＦ肺についてのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおける遺伝子の発現を示すＵＭＡＰプロットである。図１１Ｃは、ＩＰＦ肺組織切片に対するヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。ＩＰＦ肺における線維化（右側の四角のボックス）領域および非線維化（左側の四角のボックス）領域を示す代表的な画像。スケールバーは、２００μｍを示す。図１１Ｄは、健康なヒト肺（左）、ならびにＩＰＦを有する患者由来の肺の非線維化（中央）領域および重症線維化（右）領域における、ＡＣＴＡ２、ＳＦＮおよびＳＦＴＰＣについての免疫染色を示す画像である。図１１Ｅは、健康な肺、ならびにＩＰＦ肺の非線維化領域および線維化領域における、ＳＦＴＰＣ＋、ＳＦＴＰＣ＋ＳＦＮ＋およびＳＦＮ＋細胞の割合を示すグラフである；ｎ＝３個のヒト試料。図１１Ｆは、ＩＰＦ肺の線維化領域におけるＳＦＮ、ＣＬＤＮ４およびＡＧＥＲについての免疫染色を示す画像である。図１１Ｇは、ＩＰＦ肺の非線維化領域および重症線維化領域における、ＣＬＤＮ４＋である総ＳＦＮ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０２１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３個のヒト試料。図１１Ｈは、重症線維症を有するＩＰＦ肺の領域におけるＳＦＮ、ＫＲＴ１７およびＴＰ６３についての免疫染色を示す画像である（矢じりはＳＦＮ＋ＫＲＴ１７＋ＴＰ６３＋細胞を示す）。図１１Ｉは、ＩＰＦ肺における重症線維症の領域と比較した、非線維化領域におけるＫＲＴ１７＋またはＫＲＴ１７＋ＴＰ６３＋である総ＳＦＮ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０３１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３個のヒト試料。図１１Ｊは、健康な肺およびＩＰＦ肺における候補シグナル伝達経路の富化を示すｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータからのＵＭＡＰプロットである（ｎ＝１１，７２５細胞）。図１１Ｋは、対照肺およびＩＰＦ肺における、示された細胞型／状態におけるＩＰＦ関連遺伝子の発現を示すバイオリンプロットである（ｎ＝１１，７２５細胞）。バイオリンプロットは、健康な肺およびＩＰＦ肺における細胞分布を示す。図１１Ｌは、ＣＤＫＮ１Ａ＋である総ＳＦＮ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０３１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３個のヒト試料。図１１Ｍは、γＨ２ＡＸ＋である総ＳＦＮ＋細胞の割合を示すグラフである。^＊Ｐ＝０．０２１８、片側マン・ホイットニー検定；ｎ＝３個の健康なヒト試料および４個のＩＰＦヒト試料。差し込み図：白のボックス中の領域の単一チャネル画像。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１２は、肺胞幹細胞媒介性上皮再生における新規移行細胞状態の出現および疾患病理発生におけるその持続を記載する概略図である。肺胞幹細胞は、損傷に応答して複製し、機能的な１型肺胞上皮細胞へと通常は成熟する新規移行細胞状態を生成する。以前には認識されなかった移行状態は、ＴＰ５３シグナル伝達によって直接的に調節され、ＤＮＡ損傷に対して脆弱であり、一過的な老化状態を受ける。この状態は、ヒト線維化肺において富化される。

図１３Ａは、ＡＥＣ１特異的アブレーションモデルの概略図である。図１３Ｂは、４ラウンドのＡＥＣ１アブレーションを受けた細胞についての、３日目、６日目、１０日目および６０日目に分析した、ＳＦＮ、ＡＣＴＡ２、ＬＧＡＬＳ３およびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。

図１４Ａは、反復ＡＥＣ１アブレーションの概略図である。図１４Ｂは、２２日後のＨ＆Ｅおよびトリクロームを示す画像である。図１４Ｃは、２２日後の、アブレートされた組織のＬＧＡＬＳ３、ＡＣＴＡ２およびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。図１４Ｄは、反復ＡＥＣ１アブレーションによる形態学的変化を示す概略図である。図１４Ｅは、肺切除術で誘導された傷害と組み合わせたＡＥＣ１の単回アブレーションにおける幅広い線維症を示す画像である。 同上。 同上。

図１５は、ＰＡＴＳまたはＡＥＣ２とリポ線維芽細胞との共培養の概略図である。右側のデータは、ＰＡＴＳの共培養がリポ線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換を誘導するが、ＡＥＣ２の共培養は誘導しないことを実証している。

図１６は、ＰＤＧＦＡがＡＥＣ１において優勢に発現されることを示すバイオリンプロットである。さらに、ＰＤＧＦＡ転写物は、ＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化の間の移行細胞においても観察される。

図１７は、対照マウスおよびＰＤＧＦＲＡ－ＣｒｅＥＲ／ＰＤＧＦＲＡ^{ｆｌｏ ｘ}マウスにおけるａＳＭＡ、ＰＤＧＦＲＡおよびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。これらのデータは、線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲＡの喪失が、筋線維芽細胞へのそれらの変換を誘導するのに十分であることを実証している。

図１８は、ＡＥＣ１アブレーション後およびブレオマイシン傷害後の線維芽細胞においてＲｕｎｘ１が上方調節されることを示すバイオリンプロットである。

図１９は、ＡＥＣ１アブレーションモデル、反復ＡＥＣ１アブレーションモデルおよびＰＤＧＦＲＡ欠失での、Ｒｕｎｘ１、ａＳＭＡ、ＰｄｇｆａおよびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。これらのデータは、ＲＵＮＸ１発現が、単回および反復ＡＥＣ１アブレーションマウスモデルにおいて、ならびに線維芽細胞におけるＰＤＧＦＲＡの標的化された喪失において増加することを実証している。

図２０Ａは、ＲＵＮＸ１欠損細胞におけるＧＦＰ、ａＳＭＡ、ＰｄｇｆａおよびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。図２０Ｂは、ＴＧＦ－Ｂを含むＲＵＮＸ１欠損細胞におけるＧＦＰ、ａＳＭＡ、ＰｄｇｆａおよびＤＡＰＩについての免疫染色を示す画像である。これらのデータは、ＲＵＮＸ１の喪失が筋線維芽細胞への線維芽細胞変換を遮断することを実証している。

詳細な説明
本開示の原理の理解を促進することを目的として、ここで、好ましい実施形態に対して参照がなされ、特定の言語がそれを記載するために使用される。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定はそれによって意図されないことが理解され、本明細書で示される本開示のかかる変更およびさらなる改変は、本開示が関連する分野の当業者に通常想起されることが企図される。

定義

冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象のうち１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つよりも多くの要素を含み得る。

「約」は、所望の結果に影響を与えることなしに所与の値が端点を「僅かに上回り」得るまたは「僅かに下回り」得ることを定めることによって、数的範囲の端点に柔軟性を提供するために使用される。

用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの変形形態の本明細書での使用は、その後に列挙された要素およびそれらの等価物ならびにさらなる要素を包含する意味である。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうち１つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組合せ、ならびに選択的に解釈される場合（「または」）には組合せの欠如を指し、それを包含する。

本明細書で使用される場合、移行句「～から本質的になる」（および文法的異形）は、列挙された材料またはステップ、および特許請求された本発明の「基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈すべきである。したがって、用語「～から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈すべきではない。

さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書に示された任意の特色または特色の組合せが排除または除外され得ることもまた企図する。説明のために、本明細書が、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと述べる場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せが、単独でまたは任意の組合せで除外および権利放棄され得ることが、具体的に意図される。

本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で他に示されない限り、その範囲内に入る各別々の値に個々に言及する簡略化された方法として機能することのみを意図し、各別々の値は、それが本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と述べられる場合、例えば、２％～４０％、１０％～３０％または１％～３％などの値が、本明細書で明示的に列挙されている意図である。これらは、具体的に意図されているものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間でありかつそれらの値を含む数値の全ての可能な組合せが、本開示で明示的に述べられているとみなすべきである。

用語「疾患」は、本明細書で使用される場合、生物の一部に影響を与える構造または機能の任意の異常な状態および／または障害を含むがこれらに限定されない。これは、外部要因、例えば、感染性疾患によって、または内部機能不全、例えば、がん、がん転移などによって引き起こされ得る。

用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。

本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」は、患者によって呈されるまたは患者がそれに対して感受性であり得る疾患、障害または病原体感染に応答して行われる臨床的介入を指す。処置の目的は、症状の軽減もしくは予防、進行の緩徐化もしくは停止、または疾患、障害、疾患の原因となる作用物質（例えば、細菌、ウイルス、化学療法剤、放射線）もしくは状態の悪化、および／あるいは疾患、障害または状態の緩解を含む。

他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

ＰＡＴＳ

幹細胞は、傷害に応答して動的な変化を受けて、失われた細胞を再生させる。しかし、移行状態の正体、およびそれらのトラジェクトリー（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）を駆動する機構は、依然研究中である。肺オルガノイド、複数のｉｎ ｖｉｖｏ修復モデル、単一細胞トランスクリプトミクスおよび系列追跡を使用して、本発明者らは、１型細胞への分化を受けている２型肺胞上皮細胞が、最終的な成熟化に向かう途中にプレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）を獲得することを見出した。本発明者らは、移行細胞が、分化の間に広範な伸展を受けて、ＤＮＡ損傷に対して脆弱になることをさらに見出した。本発明者らは、ＰＡＴＳにある細胞が、ＴＰ５３、ＴＧＦβ、ＤＮＡ損傷応答シグナル伝達の富化および細胞老化を示すことを決定した。実施例に記載されるように、機能獲得および機能喪失ならびにゲノム結合アッセイは、ＴＰ５３シグナル伝達によるＰＡＴＳの直接的な転写制御を明らかにした。本発明者らは、ヒト線維化肺におけるＰＡＴＳ様細胞の蓄積が観察されたこともまた見出しており、これは、線維症における移行状態の持続を示唆している。したがって、本明細書の実施例のセクションに記載される結果は、正常な上皮組織修復における老化に関連する一過的な状態および疾患状態におけるその異常な持続を暗示している。

新規肺胞上皮Ｉ型細胞（肺細胞Ｉ型としても公知）アブレーションモデルを使用して、本発明者らは、肺線維症を発症する最初の遺伝的モデルを樹立した。さらに、本発明者らは、上記新規移行細胞状態（ＰＡＴＳ）および肺胞線維芽細胞の共培養を使用するｅｘ ｖｉｖｏ肺線維症モデルを開発した。これらの新規ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ線維症モデルは、拡張可能であり、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを可能にする。これらの特色は、進行性肺疾患において見出される場合が多く、ヒト線維化肺においてＰＡＴＳ様状態にある細胞の富化が観察され得、これは、線維症における移行状態の持続を示す。したがって、本明細書で提供される研究は、正常な上皮組織修復における老化に関連する一過的な状態および疾患状態におけるその異常な持続を暗示している。

本明細書で使用される場合、用語「オルガノイド」は、培養物中で成長させた幹細胞に由来する自己組織化された三次元（３Ｄ）構造または実体を指す。オルガノイド培養物は、臓器の複雑性を再現でき、または、例えば、ある特定の型の細胞のみを産生することによって、臓器の選択された状況を表現できる。あるいは、分化前のある特定の段階では、これらは、幹細胞のみから構成され得る。

幹細胞は、それ自身を複製（自己更新）しかつ他の細胞型を生じる能力を有する細胞である。幹細胞が分裂する場合、娘細胞は、幹細胞のままであり得るか、またはより特殊化した型の細胞になり得、または１つもしくは複数の特殊化した細胞型へと分化する他の娘を生じ得る。２つの型の哺乳動物幹細胞は、以下である：胚盤胞または着床前胚中に存在する未分化の細胞に由来する多能性胚性幹細胞、および成体の組織または臓器において見出される成体幹細胞。成体幹細胞は、組織または臓器の正常なターンオーバーまたは再生を維持することができ、損傷後に組織または臓器において細胞を修復および補充することができる。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、増殖および自己更新が可能であり、１つもしくは複数の他の細胞型を生成する能力を有する前駆細胞を生じることが可能な未分化の細胞、または分化した細胞を生じ得る先駆体を指す。ある特定の場合には、娘細胞または前駆細胞もしくは先駆細胞は、分化した細胞を生じ得る。ある特定の場合には、娘細胞または前駆細胞もしくは先駆細胞は、それ自身で増殖し自己更新することができるだけでなく、１つまたは複数の成熟細胞型へと引き続いて分化する子孫を生じることができる。

前駆細胞は、自己更新することができるかまたは分化した細胞型へと分化することができるという点で幹細胞と類似した細胞を指すが、前駆細胞は既に、幹細胞よりも特殊化しているかまたは規定されている。

本開示の幹細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない任意の動物に由来し得る。

本開示の方法およびモデルにおいて使用され得る幹細胞は、正常な細胞（例えば、被験体の健康な組織由来の細胞）または異常な細胞（例えば、形質転換された細胞、樹立された細胞、または罹患組織試料に由来する細胞）であり得る。

一部の実施形態では、本開示の方法およびモデルにおいて使用される細胞は、肺幹細胞に由来し得る。肺幹細胞の分裂は、肺の構造の更新を促進し得る。肺幹細胞の例は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆（ＡＥＰ）細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系列陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺管細胞、誘導多能性幹細胞由来肺幹細胞および２型肺胞上皮（本明細書でＡＥＣ２またはＡＴ２と呼ばれる）細胞を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、本開示の方法およびモデルにおいて使用される細胞は、皮膚、乳腺、食道、膀胱、前立腺、卵巣および唾液腺を含む臓器由来の基底幹細胞に由来し得る。

方法およびモデル

したがって、本開示の一態様は、肺胞再生における新たに同定された移行細胞状態（ＰＡＴＳ）の同定を提供する。この移行細胞状態は、病理学的線維芽細胞（筋線維芽細胞）への肺線維芽細胞変換を誘導する。さらに、この移行細胞状態は、ヒト線維化（例えば、特発性肺線維症および間質性肺疾患）肺においても見出される。

本開示の別の態様は、肺線維症、肺気腫（ヒト気腫合併肺線維症症候群（ＣＰＦＥ）において観察されるものと類似）をもたらす肺胞Ｉ型細胞（肺細胞Ｉ型としても公知）をアブレートするためのモデル系を提供する。

一部の実施形態では、モデル系は、動物モデルを含む。一実施形態では、動物は、マウスを含む。一部の実施形態では、動物は、肺を有する任意の動物を含む。

本開示の別の態様は、肺傷害オルガノイドモデルを生成する方法であって、ｉ）細胞の共培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップであって、共培養物が、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞および肺胞線維芽細胞を含む、ステップ；ｉｉ）培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ｉｉｉ）作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、ＰＡＴＳ細胞および／または肺胞線維芽細胞の少なくとも１つの発現マーカーに対する作用物質の生物学的影響を分析するステップ、を含む、それからなる、あるいはそれから本質的になる方法を提供する。

肺胞線維芽細胞は、肺における肺修復／線維症プロセスに関与する細胞である。肺胞線維芽細胞は、細胞外マトリックスおよびコラーゲンを合成することができ、動物組織において間質を産生することができる。肺胞線維芽細胞の例は、ヒト胎児肺線維芽細胞（例えば、ＨＦＬｌ、ＭＲＣ－５、２ＢＳおよびＷＩ３８）、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞（Ｖ－９７）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス初代肺線維芽細胞およびＣＣ－２５１２細胞を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、肺胞線維芽細胞は、リポ線維芽細胞である。一部の実施形態では、肺胞線維芽細胞は、疾患状態特徴を有する。

用語「疾患状態特徴」は、本明細書で使用される場合、その細胞が疾患細胞であることを示す、細胞の表現型特性または遺伝子型特性を指す。これらの特徴は、疾患状態を示す細胞におけるある特定のマーカーの発現または形態学的変化であり得る。一部の実施形態では、肺胞線維芽細胞の疾患状態特徴は、ＡＣＴＡ２を発現するリポ線維芽細胞、筋線維芽細胞の存在、および／または星状形状から帯状形状への細胞変化を含む。

一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、罹患組織から単離される。

用語「罹患組織」は、健康な組織と比較して異常である、被験体（例えば、ヒトまたは動物モデル）の組織を指す。罹患組織は、生きたまたは死んだ被験体の組織から得ることができる。罹患組織の例は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）肺組織、肺線維症肺組織、特発性肺線維症肺組織、肺気腫肺組織、肺がん組織、サルコイドーシス肺組織、間質性肺炎肺組織、敗血症肺組織、ウイルス感染および細菌感染を有する肺組織、急性呼吸促迫症候群肺組織、ならびに気管支肺異形成症肺組織を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、肺線維症肺組織または特発性肺線維症肺組織から単離される。

肺がん細胞は、肺がんを患う被験体から単離され得る。肺がん細胞は、原発性肺腫瘍または二次肺腫瘍（例えば、別の組織において始まり、肺に転移するがん）から単離され得る。肺がん細胞の例は、小細胞癌、混合型小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、パンコースト腫瘍細胞、神経内分泌腫瘍または肺カルチノイド腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない小細胞肺がん細胞または非小細胞肺がん細胞を含むがこれらに限定されない。樹立された肺がん細胞系もまた、本開示の方法およびモデルにおいて使用され得る。本開示の方法およびモデルにおいて使用され得る肺がん細胞系は、ＡＴＣＣウェブサイト上で見出すことができる。肺がん細胞系の例は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ Ｆｕｓｉｏｎ－Ａ５４９同質遺伝子細胞系、ＮＣＩ－Ｈ８３８［Ｈ８３８］、ＨＣＣ８２７、ＳＫ－ＬＵ－１、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、ＮＣＩ－Ｈ１８１９［Ｈ１８１９］、ＮＣＩ－Ｈ６７６Ｂ［Ｈ６７６Ｂ］、Ｈｓ ６１８．Ｔ、ＨＢＥ４－Ｅ６／Ｅ７［ＮＢＥ４－Ｅ６／Ｅ７］、ＮＣＩ－Ｈ１６６６［Ｈ１６６６、Ｈ１６６６］、ＮＣＩ－Ｈ２３［Ｈ２３］、ＮＣＩ－Ｈ１４３５［Ｈ１４３５］、ＮＣＩ－Ｈ１５６３［Ｈ１５６３］、７０３Ｄ４、およびＮＣＩ－Ｈ１６８８［Ｈ１６８８］、ＮＣＩ－Ｈ１８７［Ｈ１８７］、ＮＣＩ－Ｈ６６１［Ｈ６６１］、ＮＣＩ－Ｈ４６０［Ｈ４６０］、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ１１５５［Ｈ１１５５］、ＤＭＳ １１４、ＮＣＩ－Ｈ６９［Ｈ６９］、ＤＭＳ ７９、ＤＭＳ ５３、ＳＷ １２７１［ＳＷ１２７１、ＳＷ１２７１］、ＳＨＰ－７７、ＮＣＩ－Ｈ２０９［Ｈ２０９］、ＮＣＩ－Ｈ１４６［Ｈ１４６］、ＮＣＩ－Ｈ３４５［Ｈ３４５］、ＮＣＩ－Ｈ１３４１［Ｈ１３４１］、ＤＭＳ １５３、ＮＣＩ－Ｈ８２［Ｈ８２］、ＮＣＩ－Ｈ１０４８［Ｈ１０４８］、ＮＣＩ－Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＮＣＩ－Ｈ４４６［Ｈ４４６］、ＮＣＩ－Ｈ１２８［Ｈ１２８］、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ［Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ５１０］、Ｈ６９ＡＲ．ＨＬＦ－ａ、Ｈｓ ９１３Ｔ、ＧＣＴ［巨細胞腫瘍］、ＳＷ ９００［ＳＷ－９００、ＳＷ９００］、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）、ＨＢＥ１３５－Ｅ６Ｅ７、Ｔｅｒａ－２、ＮＣＩ－Ｈ２９２［Ｈ２９２］、ｓＮＦ０２．２、ＮＣＩ－Ｈ１７０３［Ｈ１７０３］、ＮＣＩ－Ｈ２１７２［Ｈ２１７２］、ＮＣＩ－Ｈ２４４４［Ｈ２４４４］、ＮＣＩ－Ｈ２１１０［Ｈ２１１０］、ＮＣＩ－Ｈ２１３５［Ｈ２１３５］、ＮＣＩ－Ｈ２３４７［Ｈ２３４７］、ＮＣＩ－Ｈ８１０［Ｈ８１０］、ＮＣＩ－Ｈ１９９３［Ｈ１９９３］、およびＮＣＩ－Ｈ１７９２［Ｈ１７９２］を含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、健康な組織（例えば、正常な肺組織）から単離される。

用語「組織」は、本明細書で使用される場合、組織が得られる被験体の構造材料を形成する、細胞間物質と一緒になった、特定の種類のものであり得る細胞の凝集体を指す。本開示の一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、組織から単離および精製され得る。

本開示の一部の実施形態では、ＰＡＴＳ細胞は、肺上皮細胞（例えば、ＡＥＣ２またはＡＥＣ１）をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで傷害を引き起こす作用物質に曝露させることによって生成され得る。

用語「傷害を引き起こす作用物質」は、本明細書で使用される場合、健康な細胞を罹患細胞状態に変換または移行させることが可能な作用物質を指す。用語「傷害を引き起こす作用物質」は、本明細書で使用される場合、疾患状態細胞が生じるように正常な細胞をアブレートすることが可能な作用物質もまた指す。

傷害を引き起こす作用物質は、例えば、化学療法剤（例えば、ブレオマイシン、タモキシフェン、アクチノマイシン－Ｄ、マイトマイシン、タキサンおよびゲムシタビン）、外毒素（例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ））、ウイルス、細菌、真菌、アスベスト、化学的毒性作用物質または照射であり得る。

一部の実施形態では、傷害を引き起こす作用物質は、ヒトまたは肺を有する任意の動物の肺組織に感染することが可能な病原体（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）であり得る。

肺に感染することができる細菌は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むがこれらに限定されない。

肺に感染することができるウイルスは、２２９Ｅ（アルファコロナウイルス）、ＮＬ６３（アルファコロナウイルス）、ＯＣ４３（ベータコロナウイルス）、ＨＫＵ１（ベータコロナウイルス）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群、即ちＭＥＲＳを引き起こすベータコロナウイルス）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群、即ちＳＡＲＳを引き起こすベータコロナウイルス）もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（コロナウイルス疾患２０１９、即ちＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす新型コロナウイルス）、インフルエンザ－Ａウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、低病原性鳥インフルエンザ、高病原性鳥インフルエンザまたはＨ５Ｎ１）、インフルエンザ－Ｂウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、またはエンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス７１）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

肺に感染することができる真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓを含むがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、本開示の方法およびモデルにおいて使用される培養培地および／または被験体（例えば、マウス）は、血小板由来増殖因子受容体（例えば、血小板由来増殖因子受容体－Ａ、血小板由来増殖因子受容体－Ｂまたは血小板由来増殖因子受容体－ＡＢ）を含む。

一部の実施形態では、本開示の方法およびモデルにおいて使用される培養培地および／または被験体（例えば、マウス）は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）リガンドを含む。一部の実施形態では、ＰＤＧＦＲリガンドは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。ＰＤＧＦは、細胞の成長および分裂を調節することができる増殖因子である。一部の実施形態では、ＰＤＧＦＲリガンドは、血小板由来増殖因子サブユニットＡ（ＰＤＧＦ－Ａ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）、血小板由来増殖因子サブユニットＣ（ＰＤＧＦ－Ｃ）、血小板由来増殖因子サブユニットＤ（ＰＤＧＦ－Ｄ）および／または血小板由来増殖因子サブユニットＡＢ（ＰＤＧＦ－ＡＢ）である。ＰＤＧＦファミリーに属するタンパク質をコードするヒト遺伝子は、ＦＩＧＦ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦｄ、ＰＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ４１、ＶＥＧＦＢおよびＶＥＧＦＣを含む。

一部の実施形態では、本開示の方法およびモデルは、ＰＤＧＦシグナル伝達ペプチド、ＰＤＧＦ受容体、ＰＤＧＦアゴニスト、ＰＤＧＦＲアゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲアンタゴニスト、またはＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路をモジュレートすることが可能な任意の作用物質の使用を含む。他の実施形態では、本開示の方法およびモデルは、ＰＤＧＦリガンドおよび／またはＰＤＧＦＲ受容体の薬理学的遮断の使用を含む。

ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路のモジュレーターは、基質、阻害剤、活性化因子、神経伝達物質、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、インバースアンタゴニスト、部分アゴニストおよび部分アンタゴニストを含む。ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路のモジュレーターは、ＰＤＧＦアイソフォームアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲ活性化遮断剤、細胞におけるＰＤＧＦおよび／またはＰＤＧＦＲの発現を増加または減少させることが可能な作用物質、化学化合物、例えば、内因性代謝物、非内因性代謝物、合成化学化合物、ポリペプチド、アミノ酸残基、核酸、ｓｉＲＮＡ、ならびに抗体（例えば、中和抗体）を含むがこれらに限定されない。

ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路のモジュレーターの例は、フィブロネクチンペプチド、Ｒａｓ－ＧＡＰ、チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＴＣ－ＰＴＰ、ＰＴＰＲＪ／ＤＥＰ－１）、ＳＨＰ－２、インテグリン、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質、ヒアルロナン受容体ＣＤ４４、ソラフェニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、ＡＧ１２９５およびＡＧ１２９６、セレコキシブ、エトリコキシブおよびＤＦＵ、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤（コキシブ）、パゾパニブＨＣｌ、パゾパニブ、ラドチニブ（ｒａｄｏｔｉｎｉｂ）、ＡＺＤ２９３２、トセラニブリン酸塩、ＴＡＫ－５９３、クレノラニブ、トセラニブ、ＳＵ１４８１３、ＳＵ１４８１３マレイン酸塩、オランチニブ（ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）、ＳＵ ４３１２、スニチニブリンゴ酸塩、リニファニブ、ＫＧ ５、Ｎ－デセチルスニチニブ、ＣＰ－６７３４５１、ＶＥＧＦＲ２キナーゼ阻害剤ＩＩ、ＶＥＧＦＲ２キナーゼ阻害剤ＩＩ、ＡＣ７１０メシル酸塩、ＡＣ７１０、ＤＭＰＱ二塩酸塩、リプレチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、レゴラフェニブ、スニチニブ、ポナチニブ（ｐｎａｔｉｂｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｎｉｂ）リンゴ酸塩、ＴＧ １００５７２、イロラセルチブ（ｉｌｏｒａｓｅｒｔｉｂ）、イマチニブ、アキシチニブ、イマチニブメシル酸塩、パゾパニブ、クレノラニブ、ＳＵ ５４０２、アバプリチニブ、リプレチニブ、セジラニブ、ＣＰ ６７３４５１、ドビチニブ、ＴＡＫ ５９３、トセラニブ、ＰＤＧＦＲａキナーゼ阻害剤－１、ＳＵ１６ｆ、ＰＤＧＦＲαを標的化するアゴニスト性ヒトモノクローナル自己抗体、およびＰＤＧＦＲαを標的化する非アゴニスト性ヒトモノクローナル自己抗体、ならびにまたはそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」は、受容体（例えば、ＰＤＧＦＲ）またはタンパク質（例えば、ＰＤＧＦ）に結合し、その受容体またはタンパク質を活性化して生物学的応答を生じさせるモジュレーターを指す。

本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、受容体またはタンパク質に結合し、それを活性化するのではなく遮断することによって、生物学的応答を遮断する、妨げるまたは弱める、モジュレーターまたはリガンドを指す。

本明細書で使用される場合、用語「インバースアゴニスト」は、アゴニストと同じ受容体に結合するが、そのアゴニストと反対の生物学的応答を誘導する、モジュレーターまたはリガンドを指す。

本明細書で使用される場合、用語「部分アンタゴニスト」は、受容体に結合できるがその受容体の効果を完全には遮断せず、むしろ、受容体の最大潜在力を減少させる、モジュレーターまたはリガンドを指す。

一部の実施形態では、方法およびモデルにおいて使用される培養培地は、細胞におけるＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲ－Ａ、ＰＤＧＦＲ－ＢまたはＰＤＧＦＲ－ＡＢ）発現を維持することが可能な作用物質を含む。一部の実施形態では、細胞におけるＰＤＧＦＲ－Ａ発現を維持することが可能な作用物質は、Ｒｏ ５－３３３５またはＡＩ－１０－４９である。

一部の実施形態では、細胞におけるＰＤＧＦＲＡ発現を維持することが可能な作用物質は、ＲＵＮＸ（例えば、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２またはＲＵＮＸ３）またはコア結合因子（ＣＢＦ）関連ファミリーのタンパク質（例えば、ＣＢＦ－β）をモジュレートすることができる任意の分子である。

ＲＵＮＸまたはＣＢＦ関連タンパク質を調節する分子の例は、ＲＵＮＸおよび／またはＣＢＦの基質、阻害剤、活性化因子、神経伝達物質、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、インバースアンタゴニスト、部分アゴニストおよび部分アンタゴニストであり得る。

ＲＵＮＸおよび／またはＣＢＦをモジュレートする分子は、ＲＵＮＸとＣＢＦとの間のタンパク質－タンパク質相互作用を妨害する分子であり得る。これらのモジュレーターは、ＲＵＮＸ（例えば、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２またはＲＵＮＸ３）の阻害剤またはＣＢＦ－βの阻害剤であり得る。ＲＵＮＸまたはＣＢＦモジュレーターの例は、Ｒｏ ５－３３３５、ＡＩ－１０－４９、ＣＡＤＤ５２２、ムラミルジペプチド、Ｌ－ケブラキトール（ｑｕｅｂｒａｃｈｉｔｏｌ）、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸、アスコルビン酸２－リン酸マグネシウム、２－ピリジルベンズイミダゾールＡＩ－４－５７、ＲＵＮＸ１／ＭＴＧ８融合タンパク質、ならびにＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３および／もしくはＣＢＦｂに対する中和抗体、ならびに／またはそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。

「作用物質」は、本明細書で使用される場合、小分子、タンパク質、ペプチド、遺伝子、化合物、または他の薬学的に活性な成分を指す。一部の実施形態では、作用物質は、疾患（例えば、肺線維症）の処置、予防または緩和のために使用され得る。

ＰＡＴＳ細胞発現マーカーは、ＰＡＴＳ細胞またはＰＡＴＳ様細胞上で発現される遺伝子転写物を指す。一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーは、ＰＡＴＳ細胞状態に独自であり、関連する細胞状態（例えば、ＡＥＣ２またはＡＥＣ１）上では典型的には発現されない。ＰＡＴＳ細胞マーカーは、ＣＬＤＮ４、ＫＲＴ１９、ＳＦＮ、ＬＧＡＬＳ３、ＳＯＸ４、Ｓ１００Ａ２、ＰＴＧＳ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ８、ＣＡＬＳ１、ＭＭＰ７、ＰＲＳＳ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＤＫ、ＴＡＧＬＮ、ＧＤＦ１５、ＴＭ４ＳＦ１ ＴＰ６３および／またはＣＴＳＥを含み得る。

一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーは、共発現される２つまたはそれよりも多くのマーカーのマーカーシグネチャーを含み得る。一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ４、ＬＧＡＬＳ３およびＬＧＡＬＳ３である。一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーシグネチャーは、ＣＬＤＮ４、ＫＲＴ１９およびＳＦＮである。一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーシグネチャーは、ＣＡＬＤ１、ＰＲＳＳ２、ＭＭＰ７およびＳ１００Ａ２である。

一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーシグネチャーは、ＴＰ６３、ＫＲＴ１７およびＣＯＬ１Ａ１である。

一部の実施形態では、ＰＡＴＳマーカーシグネチャーは、ＡＲＥＧ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２およびＴＩＭＰ１である。

肺胞線維芽細胞発現マーカーは、肺胞線維芽細胞上で発現される遺伝子転写物を指す。肺胞線維芽細胞は、Ｐｄｇｆｒａを含み得る。

本開示の別の態様は、肺線維症のためのｅｘ ｖｉｖｏモデルを生成する方法であって、ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでアブレーションを受けた肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）の培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップ；ｉｉ）培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ｉｉｉ）作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）の少なくとも１つの発現マーカーに対する作用物質の生物学的影響を分析するステップ、を含む方法を提供する。

用語「アブレーション」は、本明細書で使用される場合、組織もしくは細胞、またはそれらの機能の除去または破壊を指す。アブレーションは、手術、ホルモン、薬物、高周波、熱、または組織もしくは細胞の破壊を引き起こす他の方法によって引き起こされ得る。

一部の実施形態では、肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）は、少なくとも１ラウンドのアブレーション（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ラウンドのアブレーション）を受けている。一部の実施形態では、肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）は、１ラウンドと５ラウンドとの間のアブレーションを受けている。一部の実施形態では、細胞は、単独のまたは本明細書で記載される他の傷害モデルと組み合わせたアブレーションを受けている。

一部の実施形態では、肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）は、反復アブレーションを受けている。一部の実施形態では、反復アブレーションは、約３日間～約２週間の過程にわたって行われ得る。一部の実施形態では、反復アブレーションは、約３日間～約１年間の過程にわたって行われ得る。

一部の実施形態では、肺胞細胞（例えば、ＡＥＣ１細胞）は、傷害を引き起こす作用物質に曝露されることによるアブレーションを受けている。一部の実施形態では、傷害を引き起こす作用物質は、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌である。

一部の実施形態では、アブレートされた細胞は、ａＳＭＡおよび／またはＡＣＴＡ２を発現する。一部の実施形態では、アブレートされた細胞は、線維筋細胞の特徴を示す。

本開示のさらに別の態様は、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞を同定する方法であって、ｉ）肺細胞を得るステップ；およびｉｉ）細胞を、１つまたは複数のマーカーについてスクリーニングするステップ、を含み、１つまたは複数のマーカーの存在が、ＰＡＴＳ細胞の存在を示す、方法を提供する。

一部の実施形態では、肺細胞は、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆（ＡＥＰ）細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系列陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺管細胞、誘導多能性幹細胞由来肺幹細胞および２型肺胞上皮（ＡＥＣ２）細胞からなる群より選択され得る。

一部の実施形態では、肺細胞は、ＡＥＣ２細胞、ＡＥＣ１細胞または肺胞マクロファージからなる群より選択され得る。

一部の実施形態では、肺細胞は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺気腫、肺がん、サルコイドーシス、間質性肺炎、敗血症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、急性呼吸促迫症候群および／または気管支肺異形成症を患う患者の肺から得られる。

一部の実施形態では、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞を同定する方法は、肺胞細胞を傷害を引き起こす作用物質と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、作用物質は、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌である。

本開示の別の態様は、拡張可能であり、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを可能にする、上記新規移行細胞状態（ＰＡＴＳ）および肺胞線維芽細胞の共培養を使用するｅｘ ｖｉｖｏ肺線維症モデルを提供する。

本開示の別の態様は、肺および他の組織において線維症を生成するｉｎ ｖｉｖｏモデルを生成する方法を提供する。本開示のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏモデルと同様、ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、例えば、治療剤について疾患を処置または予防する能力を試験するために使用され得る。本開示のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、種々の動物被験体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サルもしくはブタ、または線維症をモデリングすることが可能な任意の動物）を利用し得る。

ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、作用物質の効果を調査するためおよび疾患（例えば、肺線維症）の生物学的プロセスを研究するための、生きた動物全体の使用を指す。

本開示の別の態様は、肺および他の組織において線維症を生成するｉｎ ｖｉｖｏモデルを生成する方法であって、ｉ）被験体においてＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいはｉｉ）ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレート（例えば、遮断、増強、増加または減少）することができる作用物質を被験体に投与するステップ；ならびにｉｉｉ）被験体由来の細胞を分析して、正常な対照被験体と比較した、ＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失の生物学的影響ならびに／またはＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレート（例えば、遮断、増強、増加または減少）することができる作用物質の生物学的影響を決定するステップ、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達を遮断することができる作用物質は、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦリガンドおよび／またはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）に対する中和抗体を含む。

本開示の別の態様は、肺および他の組織において線維症を生成するｉｎ ｖｉｖｏモデルを生成する方法であって、ｉ）被験体においてＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβの遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいはｉｉ）ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβをモジュレート（例えば、阻害）することができる作用物質を被験体に投与するステップ；ならびにｉｉｉ）被験体由来の細胞を分析して、正常な対照被験体と比較した、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβの遺伝的喪失の生物学的影響および／またはＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβをモジュレートすることの生物学的影響を決定するステップ、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、ＲＵＮＸ１モジュレーター、ＲＵＮＸ２モジュレーター、ＲＵＮＸ３モジュレーターまたはＣＢＦβモジュレーターは、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３および／またはＣＢＦβに対する中和抗体である小分子阻害剤である。

一部の実施形態では、本開示のモデルは、肺線維症、心線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、腸線維症、皮膚線維症および／または骨髄線維症の線維症モデルである。一部の実施形態では、本開示のモデルは、身体中の他の組織、例えば、心、肝臓、腎臓、腸、皮膚および／または骨髄組織に対する肺線維症の影響をモデリングすることができる肺線維症モデルである。

一部の実施形態では、本開示のモデルの細胞は、肺、心臓、腎臓、肝臓、腸、皮膚または骨髄である。

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。

実施例
材料および方法

マウス。

８～１６週齢の間の雄性および雌性の両方のマウスを実験に使用した。全てのマウスは、他に示されない限り、Ｃ５７ＢＬ／６であった。以下のマウスを実験に使用した：Ｓｆｔｐｃｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ｂｌｈ（Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ）、Ｋｒｔ１９ｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ）Ｇｇｕ／Ｊ（Ｋｒｔ１９－ＣｒｅＥＲ）、Ｒｏｓａ２６Ｒ－ＣＡＧ－ｌｓｌ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲと交雑させた）、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）（Ｋｒｔ１９－ＣｒｅＥＲと交雑させた）、Ｔｇ（ＳＦＴＰＣ－ＧＦＰ）＃Ｈｅａｔ（Ｓｆｔｐｃ－ＧＦＰ）５１、Ｂ６．Ｃｇ－Ａｇｅｒｔｍ２．１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ｂｌｈ／Ｊ（Ａｇｅｒ－ＣｒｅＥＲ）、Ｂ６－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＨＢＥＧＦ）Ａｗａｉ／Ｊ（Ｒ２６Ｒ－ＤＴＲ）、Ｍｋｉ６７ｔｍ１．１Ｃｌｅ／Ｊ（Ｍｋｉ６７－ＲＦＰ）、Ｔｇ（Ｃｔｇｆ－ＥＧＦＰ）ＦＸ１５６Ｇｓａｔ（Ｃｔｇｆ－ＧＦＰ）１５およびＴＰ５３ｆｌ／ｆｌ（混合バックグラウンド）。Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを用いた系列追跡のために、３～５用量の、体重２０ｇ当たり２ｍｇのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、経口胃管栄養法または腹腔内注射を介して与えた。Ｋｒｔ１９－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏを使用する系列追跡のために、１用量の、体重２０ｇ当たり１ｍｇのタモキシフェンを、ブレオマイシン傷害またはＰＢＳ投与の７日後に、腹腔内注射を介して与えた。動物実験は、ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに従って、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが承認した。

ブレオマイシン傷害。

ブレオマイシンで誘導された肺傷害のために、２．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシンを、タモキシフェン注射の２週間後に鼻腔内投与し、マウスを毎日モニタリングした。ＰＢＳを投与したマウスは、対照として機能した。マウスを、ブレオマイシン傷害後の異なる時点において屠殺した。

ＤＴの投与。

ＤＴ投与の２週間前に、Ａｇｅｒ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ＤＴＲマウスは、腹腔内注射を介してタモキシフェンを受けた。１用量の３μｇのＤＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３２２３２６）を腹腔内注射を介して投与し、マウスを、組織の収集および分析のために、６日後に屠殺した。

マウス肺の解離およびＦＡＣＳ。

肺の解離およびＦＡＣＳを、以前に記載されたように実施した１１。簡潔に述べると、肺を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の酵素溶液（ｄｉｓｐａｓｅ、５Ｕ／ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３５；ＤＮａｓｅ Ｉ、０．３３Ｕ／ｍｌ；およびＩ型コラゲナーゼ、４５０Ｕ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、１７１００－０１７）１ｍｌで気管内膨張させた。分離した肺葉をさいの目に切り、回転させながら３７℃で２５分間、３ｍｌの酵素溶液と共にインキュベートした。反応を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む等量の培地でクエンチし、１００μｍ濾過器を介して濾過した。細胞ペレットを、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ_３および０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、２分間インキュベートし、次いで、４０μｍ濾過器を介して濾過した。細胞ペレットを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％ＢＳＡ中に再懸濁し、以前に記載された５６ように、以下の抗体を用いて染色した：ＥｐＣＡＭ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇ８．８）、ＰＤＧＦＲα（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＡＰＡ５）およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌ７５２６）。選別を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、ＳＯＮＹ ＳＨ８００ＳまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓ ＥＱシステムを使用して実施した。

肺胞オルガノイド培養。

肺胞オルガノイド培養を、以前に記載されたように実施した（Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２３：１１１８－１１２３）。簡潔に述べると、Ｔｍｘで処置したＳｆｔｐｃ－ＧＦＰまたはＳｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス由来の系列標識されたＡＥＣ２（１～３×１０^３）を、ＦＡＣＳによって選別し、ＰＤＧＦＲα＋（５×１０^４）線維芽細胞を、ＭＴＥＣ／Ｐｌｕｓ中に再懸濁し、等量の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）と混合した。培地を１日おきに交換した。

Ｎｕｔｌｉｎ－３ａ処置。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスに、１用量のタモキシフェンを注射し、２週間休養させ、その後、ブレオマイシンまたはＰＢＳを投与した。Ｎｕｔｌｉｎ－３ａ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ８０５９）またはＤＭＳＯ（対照）を、１０日間連日２０ｍｇ／ｋｇ／ｄの濃度で、傷害の８日後に腹腔内注射によって投与し、試料を、ブレオマイシン投与の２０日後に収集した。ｅｘ ｖｉｖｏ研究のために、肺胞オルガノイドを、７日間培養し、その後、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａ（２μＭ）で８日間処置し、その後回収した。

液滴ベースのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。

Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に包埋したオルガノイドを、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ａ６９６４）と共に３７℃で２０分間インキュベートし、その後、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡと共に３７℃で１０分間インキュベートした。トリプシンを、１０％のＦＢＳを追加補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｈａｍ培地を使用して不活性化し、次いで、細胞を、０．０１％のＢＳＡを追加補充したＰＢＳ中に再懸濁した。４０μｍ濾過器を介した濾過の後、細胞を、３，０００μｌ／ｈのｍＲＮＡ捕捉ビーズおよび１３，０００μｌ／ｈの液滴生成オイルと共に、１００細胞μｌ／ｈの濃度で、微少流体チャネルを介して３，０００μｌ／ｈで流した。事前増幅ステップ（９５℃で３分間を１サイクル；９８℃で１５秒間、６５℃で３０秒間および６８℃で４分間を１５～１７サイクル；および７２℃で１０分間を１サイクル）のためのＤＮＡポリメラーゼを、Ｔｅｒｒａ ＰＣＲ ｄｉｒｅｃｔポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、６３９２７１）によって置き換えた。他のプロセスを、元の液滴ベースのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑプロトコールに記載されるように実施した。ライブラリーを、１５０ｂｐペアードエンド配列決定を用いてＨｉＳｅｑ Ｘシステムを使用して配列決定した。

ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの計算的分析。

肺胞オルガノイドのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの分析を、ｄｒｏｐＳｅｑＰｉｐｅ ｖ０．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｈｏｏｈｍ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｄｒｏｐＳｅｑＰｉｐｅ）を使用してＦＡＳＴＱファイルを処理することによって実施し、アノテーションバージョンを用いてＧＲＣｍ３８ゲノム参照上にマッピングした９１。次いで、独自分子識別子（ＵＭＩ）計数を、ＲパッケージＳｅｕｒａｔ ｖ３．１．１を使用してさらに分析した（参考文献５８）。ＬＰＳで処置したマウス肺のＵＭＩ計数行列（ＧＳＥ１３０１４８）１４をＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）から得た。ＵＭＩ計数を、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍを使用して正規化した。目的のクラスターについての細胞バーコードを抽出し、ｖｅｌｏｃｙｔｏ．ｐｙ ｖ０．１７．１５におけるｖｅｌｏｃｙｔｏ実行命令（参考文献１８）のため、ならびにＲパッケージＳｅｕｒａｔＷｒａｐｐｅｒｓ ｖ０．１．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓａｔｉｊａｌａｂ／ｓｅｕｒａｔ－ｗｒａｐｐｅｒｓ）と組み合わせてｖｅｌｏｃｙｔｏ．Ｒ ｖ０．６を使用してＲＮＡ速度プロットを生成するために利用した。傾き計算スムージング（ｓｌｏｐｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）における２５個の最近傍のものを、ＲｕｎＶｅｌｏｃｉｔｙ命令に使用した。二重項（ｄｕｐｌｅｔ）を排除した後、特定の細胞クラスターを、ＵＭＡＰプロットにおける、Ｓｆｔｐｃ、Ｓｆｔｐａ１、Ｓｆｔｐａ２、Ｓｆｔｐｂ、Ｌａｍｐ３、Ａｂｃａ３、Ｈｏｐｘ、Ａｇｅｒ、Ａｋａｐ５、Ｅｐｃａｍ、Ｃｄｈ１、Ｋｒｔ７、Ｋｒｔ８、Ｋｒｔ１８、Ｋｒｔ１９、Ｓｃｇｂ１ａ１およびＳｃｇｂ３ａ１についての富化、ならびにＶｉｍ、Ａｃｔａ２、ＰｄｇｆｒａおよびＰｄｇｆｒｂの陰性発現に基づいて単離した。対照肺および特発性肺線維症（ＩＰＦ）肺についてのＲｄｓファイルを、ＧＥＯから得た（ＧＳＥ１３５８９３）２９。ＡＥＣ２、ＡＥＣ１、移行ＡＥＣ２およびＫＲＴ５－ＫＲＴ１７＋細胞の細胞クラスターを抽出し、分析した。ＳｅｕｒａｔにおいてＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ命令を使用して得た各クラスターについてのマーカーを、Ｅｎｒｉｃｈｒを介して特異的シグナル伝達経路および遺伝子オントロジーを同定するために利用した５９。Ｚ－スコアを、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）において、合わされたスコアに基づいて計算して、異なる細胞クラスターにわたってシグナル伝達の富化およびオントロジーを比較した。結果を、Ｒパッケージｐｈｅａｔｍａｐ ｖ１．０．１２を使用して生成したヒートマップ形式で示した。Ｓｅｕｒａｔオブジェクト中の調整されたデータを抽出し、各経路中の遺伝子メンバーの調整されたスコアの平均値を計算し、シグナル伝達経路の富化としてＵＭＡＰで示した。利用した経路の遺伝子メンバーリストを、ＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙｓ６０およびＡｍｉＧＯ６１から得た。ウィルコクソンの順位和検定を用いてＳｅｕｒａｔにおいてＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ命令を使用して抽出した各遺伝子についてのｌｏｇ２倍数変化およびＰ値を、ＲパッケージＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ ｖ１．３．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｅｖｉｎｂｌｉｇｈｅ／ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ）を使用してボルケーノプロットで示して、Ｃｔｇｆ＋細胞についての特異的マーカーを示した。

Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰ－ｓｅｑ。

ヒストンマークのＣｈＩＰ分析のために、ＰＡＴＳ（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＣＤ１４０ａ－ＣＤ３２６＋Ｃｔｇｆ－ＧＦＰ＋）細胞を、ブレオマイシンで誘導された肺傷害後の１２日目に、Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスから選別した。ＡＥＣ２（ＣＤ３１－ＣＤ４５－ＣＤ３２６＋Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ＋Ｍｋｉ６７－ＲＦＰ－細胞）を、Ｍｋｉ６７－ＲＦＰホメオスタシスマウスから選別した。Ｍｋｉ６７マウスを使用して、ＲＦＰ＋細胞をネガティブ選択として（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）ゲートで除くことによって、細胞分裂中のあらゆる細胞を除外した。Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰプロトコールは、以前に記載された通りであった６２。ＴＰ５３ ＣｈＩＰ配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）のために、ＰＡＴＳ（ＣＤ３１－ＣＤ４５－Ｓｆｔｐｃ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋Ｃｔｇｆ－ＧＦＰ＋細胞）を、ブレオマイシン投与後の８日目に、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスから選別した。この場合、本発明者らは、以前に記載された改変型Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰ（バージョン３）プロトコール（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｉｎｙｕｒｌ．ｃｏｍ／ｕｄｑｋｓｃｔ）を使用した。細胞溶解の後、クロマチンを、３００単位のＭＮａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２４７Ｓ）で３７℃で１０分間消化した。Ｔ７アダプターライゲーションを２時間実施し、次いで、試料を分けて、ヒストン－改変ＣｈＩＰ－ｓｅｑのために、抗体１つ当たりおよそ７，０００細胞にした。ＴＰ５３について、本発明者らは、各複製試料のためにおよそ４０，０００細胞を使用した。試料を、ヒストンＨ３抗体（Ｈ３；１μｌ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、３９７６３）、ヒストンＨ３リシン３６トリメチル化抗体（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３；１μｌ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、６１１０１）、ヒストンＨ３リシン４トリメチル化抗体（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３；１μｌ；Ａｂｃａｍ、ａｂ８５８０）、ヒストンＨ３リシン２７アセチル化抗体（Ｈ３Ｋ２７ａｃ；１μｌ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、３９１３３）またはＴＰ５３抗体（５μｌ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５２４Ｔ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡを精製し、その後、３７℃で３時間、Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼ媒介性のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った。逆転写を、元のプロトコールに記載されたように実施し、その後、Ｔｅｒｒａ ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、６３９２７１）を使用してライブラリーを調製した。２つの実験的複製を、各細胞集団について実施した。ライブラリーを、Ｈｉｓｅｑ ＸまたはＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムを使用して配列決定した（試料１つ当たり少なくとも５×１０^６読み取りの１５０ｂｐペアードエンド）。

Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰの計算的分析。

ＦＡＳＴＱファイルを、Ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用して生成した。Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰ ＦＡＳＴＱファイルについてのさらなる逆多重化を、Ｊｅを使用して実施した６３。低品質読み取りを、ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３８を使用して、ＦＡＳＴＱファイルからトリミングして除いた。読み取りを、ＢＷＡを使用してｍｍ１０ゲノム参照上にマッピングした６５。パッケージを、ＭｉｎｔＣｈＩＰと呼ばれるパイプライン（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｉａｎｈｏｎｇ／ＭｉｎｔＣｈＩＰ）を介して実行した。ＨＯＭＥＲ６６を使用して、ｂｅｄＧｒａｐｈファイルを生成し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）においてピークを可視化した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３についてのピークコールを、Ｈ３による正規化と共に、ＨＯＭＥＲの関数ｇｅｔＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＰｅａｋｓＲｅｐｌｉｃａｔｅｓ．ｐｌ －ｒｅｇｉｏｎ －ｓｉｚｅ １０００ －ｍｉｎＤｉｓｔ ２０００ －Ｃ ０ －Ｌ ５０を使用して実施した。モチーフ分析を、ＨＯＭＥＲのｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ関数を使用して実施した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３についてコールされたピークのチャートを、ｄｅｅｐＴｏｏｌｓを使用して生成した６８。異なる細胞集団由来の各ゲノム遺伝子座についてコールされたピークを、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒで作成した。

ヒト肺組織。

既存の慢性肺疾患および外植された線維化ヒト肺を有さないドナーから切除された移植品質未満のヒト肺組織を、機関の手順（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｏ０００８２３７９－「Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」；４５ＣＦＲ１６４．５１４に記載されるＰｒｉｖａｃｙ Ｒｕｌｅを満たす、４５ ＣＦＲ ４６．１０２（ｆ）、２１ ＣＦＲ ５６．１０２（ｅ）および２１ ＣＦＲ ８１２．３（ｐ）に記載される研究は免除する）に従って、ＢｉｏＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを介して入手した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに使用したＩＰＦ組織の試料は、２か所の肺移植センター（ＶＵＭＣおよびＮＴＩ）において肺移植の時点で取り出された肺から得た。非線維化対照組織試料は、臓器提供を拒否された肺から得た。ＩＰＦ肺について、診断を、ＡＴＳ／ＥＲＳコンセンサス基準に従って決定した。全ての研究は、現地の施設内審査委員会（ＩＲＢ；Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ ＩＲＢ番号０６０１６５および１７１６５７、ならびにＷｅｓｔｅｒｎ ＩＲＢ番号２０１８１８３６）が承認した。ＩＰＦの診断を、外科病理学チームが評価した。検体を、膨張および４％のパラホルムアルデヒド中での４℃で一晩の浸漬前に、ＰＢＳ中で完全に洗浄した。検体を、血液の出現が最小限になるまでＰＢＳで引き続いて洗浄し、その後、３０％のスクロース中で４℃でインキュベートした。次いで、試料を、１：１の比でＯＣＴコンパウンドと共に４℃で１時間インキュベートし、その後、ＯＣＴ中に包埋した。７～９μｍの厚さを有する切片を、組織学的分析に使用した。

免疫染色。

肺および肺胞オルガノイドを、以前に記載されたように調製した。簡潔に述べると、組織を、４％のパラホルムアルデヒドで、４℃で４時間（肺について）または室温で３０分間（オルガノイドについて）固定し、次いで、ＯＣＴコンパウンドまたはパラフィン中に包埋した。切片化した試料（１０μｍ）を、１０ｍＭクエン酸ナトリウムを使用する抗原賦活化のための９５℃で１０～１５分間のインキュベーション後に染色のために利用した。一次抗体は、以下の通りであった：プロサーファクタントタンパク質Ｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ａｂ３７８６、１：５００）、ＡＧＥＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１１７９、１：２５０）、ＫＲＴ８（ＤＳＨＢ、ＴＲＯＭＡ－Ｉ、１：５０）、ＫＲＴ１７（ＮＳＪ、Ｖ２１７６、１：２５０）、ＫＲＴ１９（ＤＳＨＢ、ＴＲＯＭＡ－ＩＩＩ、１：５０）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＯＲＩＧＥＮＥ、ＡＢ８１８１－２００、１：５００）、ＣＬＤＮ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３６－４８００、１：２００；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１６１６５－１－ＡＲ、１：５００）、ＧＦＰ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１００－１７７０、１：５００）、ＬＧＡＬＳ３（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ＣＬ８９４２ＡＰ、１：５００）、ＳＯＸ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＡ５－３１４２４、１：２５０）、ＳＦＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＡ５－９５０５６、１：２５０；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６２５１－１－Ｉｇ、１：５００；Ａｂｃａｍ、ａｂ７７１８７、１：２００）、ＡＣＴＡ２（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６１９８、１：５００）、γ－Ｈ２ＡＸ（Ｒ＆Ｄ、４４１８－ＡＰＣ、１：５００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１００－７４４３５、１：２５０）、ＣＤＫＮ１Ａ（Ｓｉｇｍａ、ＺＲＢ１１４１、１：２００；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４３０、１：２００）、ＣＯＬ１Ａ１（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６７２８８－Ｉｇ、１：１，０００）、ＹＡＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４９１２Ｓ、１：２５０）。

Ｘ－ｇａｌならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色。

パラホルムアルデヒド固定された凍結切片を、１ｍｇ／ｍｌのＸ－ｇａｌ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒ０９４１）、５ｍＭのＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６、５ｍＭのＫ_４Ｆｅ（ＣＮ）_６、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％のデオキシコール酸ナトリウムおよび０．０２％のＮＰ－４０を含むＸ－ｇａｌ染色緩衝液と共に、３７℃で一晩インキュベートした。切片を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、マウントした。ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、１０μｍのパラフィン切片を、Ｈｉｓｔｏ－ｃｌｅａｒおよび一連のエタノール中に浸した。マイヤーヘマトキシリンを使用して核を染色し、その後、１％のエオシンＹを使用して染色した。

近接ライゲーションｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。

近接ライゲーションｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、以前に記載されたように実施した６９。簡潔に述べると、凍結マウス肺切片を、４．０％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで３７℃で９分間処置し、漸増する一連の（ｕｐ－ｓｅｒｉｅｓ）エタノールで脱水した。切片を、ハイブリダイゼーション緩衝液（１Ｍのトリクロロ酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２ｍｇ／ｍｌのヘパリン）中で、遺伝子特異的オリゴと共に、３７℃で２時間インキュベートした。コモンブリッジ（ｃｏｍｍｏｎ－ｂｒｉｄｇｅ）プローブおよびサークル（ｃｉｒｃｌｅ）プローブを切片に添加し、１時間インキュベートし、その後、２時間のＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応を行った。ローリングサークル増幅を、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、３０２２１）を使用して、３７℃で１２時間実施した。フルオロフォアコンジュゲートした検出プローブを適用し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む媒体中でマウントした。

画像の獲得、処理および定量化。

画像を、×２０、×４０または×６０対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ３０００共焦点顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ広視野蛍光顕微鏡（Ｘ－ｇａｌ染色）およびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ広視野蛍光顕微鏡（ヘマトキシリンおよびエオシン）を使用して捕捉した。細胞を、免疫組織化学マーカーおよびＤＡＰＩに基づいて手動で計数した。直線距離当たりの平均交差の決定のために、平均線形切片分析を、目的の単一チャネル免疫蛍光染色に対して、以前に記載されたように実施した１１。画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣｅｌｌＳｅｎｓアプリケーションまたはＩｍａｇｅＪを使用して処理し、図面を、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用して作成した。

統計学および再現性。

実験を、少なくとも３つの生物学的複製に対して実施した（オルガノイドｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｓｅｑを除く）。試料サイズは事前に決定しなかった。データは、各実験内の変動を示すために、ｓ．ｅ．ｍ．を伴った平均として示される。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで実施した。対応のない両側スチューデントｔ検定を、２つの実験的条件間の比較に使用した。マン・ホイットニー片側検定を、非正規分布を示した２つの条件間の比較に使用した。

（実施例１）
単一細胞トランスクリプトミクスは、ｅｘ ｖｉｖｏオルガノイドにおける以前には未知であった肺胞上皮細胞状態を明らかにする
最近の研究は、ＡＥＣ２が、肺傷害に応答して増殖し、ＡＥＣ１を生じることを示している。さらに、ＡＥＣ２は、肺胞オルガノイドにおいてＡＥＣ１を自発的に生成する。しかし、ＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化の根底にある分子機構および移行細胞状態は、あまり理解されていない。これらの問題に対処するために、本発明者らは、ＡＥＣ２およびＰＤＧＦＲα＋線維芽細胞を精製して、肺胞オルガノイドを樹立した。単一細胞トランスクリプトーム分析を、１０日目のオルガノイド培養物から単離した細胞に対して実施した（図１Ａ）。均一マニホールド近似投影（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）は、Ｅｐｃａｍ＋上皮細胞およびＶｉｍ＋Ｐｄｇｆｒａ＋線維芽細胞からなる２つの主要なクラスターを同定した（図１Ｂ）。次に、本発明者らは、上皮細胞集団をさらにデコンボリューションおよび可視化し、それらを、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）で傷害された肺胞上皮細胞の公に入手可能な単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）データセットと比較した１４。オルガノイド由来上皮細胞は、それらのｉｎ ｖｉｖｏ対応物と重複し、これは、転写的類似性および細胞状態類似性を明らかにしている（図１Ｃ）。本発明者らは、オルガノイド由来上皮細胞において、以下の複数のサブクラスターを観察した：Ｓｆｔｐｃ（ＡＥＣ２のマーカー）を発現する細胞、Ａｇｅｒ（ＡＥＣ１のマーカー）を発現する細胞およびＳｆｔｐｃ＋Ｍｋｉ６７＋増殖性ＡＥＣ２（図１Ｄ）。

さらに、本発明者らは、Ｃｌｄｎ４、Ｋｒｔ１９およびＳｆｎを発現する肺胞上皮細胞の集団を同定した（図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆ）。このクラスターに独自のマーカー遺伝子は、ＵＭＡＰおよびボルケーノプロットで可視化した場合、２つの別個のパターンを示した（図１ｂ～ｄ）。１つのサブセット（Ｃｔｇｆ＋細胞）は、Ｃｔｇｆ、Ｃｌｕ、Ｓｏｘ４およびＡｃｔｎ１について富化されたが、他（Ｌｇａｌｓ３＋細胞）は、Ｌｇａｌｓ３、Ｃｓｒｐ１、Ｓ１００ａ１４およびＣｌｄｎ１８について富化された。Ａｇｅｒ、Ｅｍｐ２およびＨｏｐｘ（ＡＥＣ１のマーカー）を含む、Ｌｇａｌｓ３＋サブクラスターにおいて富化されたさらなる転写物は、Ｌｇａｌｓ３＋細胞とＡＥＣ１との間での類似点および潜在的系列ヒエラルキーを示唆している（図１Ｇ）。これらのデータは、Ｃｌｄｎ４＋Ｋｒｔ１９＋Ｓｆｎ＋集団が、ＡＥＣ２とＡＥＣ１との間の中間体であることを示唆している。この集団を、「プレ１型肺胞移行細胞状態」（ＰＡＴＳ）と称した。本発明者らは、肺胞オルガノイドに対してＰＡＴＳマーカーについての免疫蛍光を実施して、単一細胞データを検証した（図１Ｈ）。画像は、３匹のマウス由来の３０個のオルガノイドの代表であった。これにより、アルベオロスフィア（ａｌｖｅｏｌｏｓｐｈｅｒｅ）中の、ＣＬＤＮ４、ＬＧＡＬＳ３およびＳＯＸ４を発現する細胞の存在が確認された。合わせると、これらのデータにより、オルガノイド培養において肺胞上皮幹細胞分化の間の独自の細胞状態が同定された。

（実施例２）
ＰＡＴＳ細胞は、肺胞傷害後にｉｎ ｖｉｖｏで出現する。
次いで、ＰＡＴＳ細胞が、ホメオスタシスおよび再生中の肺胞組織においてｉｎ ｖｉｖｏで観察され得るかどうかを調査した。これを試験するために、本発明者らは、ＬＰＳで処置したマウス肺および対照マウス肺からのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータをＵＭＡＰプロットでレンダリングし、ＬＰＳ傷害に独自の集団を見出した。ＵＭＡＰプロットは、肺胞オルガノイドｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（４，５７３細胞）およびＬＰＳで処置した肺または対照肺（１３，２０４細胞）における、ＡＥＣ２（ＬａｍｐおよびＳｆｔｐｂ）、ＡＥＣ２増殖性（Ｍｋｉ６７およびＴｏｐ２ａ）、ＡＥＣ１（ＡｇｅｒおよびＡｋａｐ５）および新規肺胞上皮細胞状態における遺伝子の発現を示した。重要なことに、この集団は、Ｃｌｄｎ４、Ｓｏｘ４、Ｌｇａｌｓ３、Ｓ１００ａ１４およびＦｎ１を含む、ＰＡＴＳにおいて発現される遺伝子について富化されている。

ＰＡＴＳをさらに特徴付けるために、Ｃｔｇｆ－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジェニックマウス系を利用した（Ｈａｌｌ－Ｇｌｅｎｎｅｔ ａｌ．， ２０１２， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３０５６２）。マウスを、一過的な線維症を引き起こす薬物であるブレオマイシンに曝露させ、傷害後の１２日目にマウスの肺を収集した（図２）。未傷害のＣｔｇｆ－ＧＦＰマウスにおけるＧＦＰについての免疫蛍光は、線維芽細胞において特異的に、ＧＦＰシグナルを明らかにしたが、肺胞上皮細胞においては明らかにしなかった。対照的に、ブレオマイシンで傷害された肺では、ＧＦＰ発現は、ＣＬＤＮ４、ＬＧＡＬＳ３およびＳＦＮを含むＰＡＴＳマーカーで共標識された上皮細胞において見出された。低レベルのＡＥＣ２マーカーを共発現する僅かなＧＦＰ＋細胞が観察され、これは、ＰＡＴＳへのＡＥＣ２移行の際のＳＦＴＰＣタンパク質の永続に恐らくは起因する。

ブレオマイシンで傷害された肺におけるＫＲＴ８の発現を試験した。ＫＲＴ８発現細胞とＣｔｇｆ－ＧＦＰ発現細胞との間の重複における有意な増加が、１２日目に、対照肺およびブレオマイシンで処置した肺において、Ｃｔｇｆ－ＧＦＰ、ＫＲＴ８およびＳＦＴＰＣについての免疫染色によって見出された。これらのデータは、オルガノイドおよびＬＰＳ傷害からのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるＫｒｔ８発現の上昇したレベルをさらに裏付ける（図３）。合わせると、これらのデータにより、ＰＡＴＳ細胞が、ブレオマイシン傷害後にｉｎ ｖｉｖｏで肺胞において出現することが明らかである。

次いで、ＰＡＴＳ細胞がブレオマイシン傷害に特異的であるのか他の傷害モデルにおいても出現するのかを試験した。これを試験するために、Ａｇｅｒ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ＤＴＲマウスに、タモキシフェンを投与し、その後、ＡＥＣ１の選択的アブレーションを生じるジフテリア毒素（ＤＴ）を投与した。本発明者らは、ＤＴ注射後の６日目および２８日目に試料を収集し、免疫染色を実施した（図４Ａ）。興味深いことに、６日目のＡＥＣ１をアブレートされた肺中に、細長い形態を有する、ＣＬＤＮ４、ＳＦＮ、ＫＲＴ１９およびＬＧＡＬＳ３を発現する細胞が観察されたが、対照中では観察されなかった（図４Ｂ）。ＰＡＴＳマーカーを共発現した細長い細胞における低レベルのＳＦＴＰＣ発現もまた、免疫染色によって観察され、これは、ＰＡＴＳへのＡＥＣ２の移行の間のＳＦＴＰＣの永続に恐らくは起因する。２８日目には、ＡＥＣ１をアブレートされた肺において、免疫染色によってＰＡＴＳマーカーが観察されなかったことに留意されたい。これは、ＰＡＴＳ細胞が、完全に分化したＡＥＣ１へと成熟化したことを示唆している。これらのデータは、ＰＡＴＳの出現が、肺胞再生における一般的な機構であることを示唆している。

（実施例３）
系列追跡は、ＰＡＴＳ細胞がＡＥＣ２に起源することを明らかにする。
オルガノイドおよび傷害モデルから先に提示されたデータは、ＰＡＴＳ細胞がＡＥＣ２に起源することを示唆した。この仮説を実験的に試験するために、本発明者らは、タモキシフェンの投与が、ＡＥＣ２およびその子孫において特異的に、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を恒久的に誘導する、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（本明細書で以後Ｓｆｔｐｃ－ｔｄＴ＋と呼ぶ）マウスモデルを使用した（図５Ａ）。ブレオマイシン投与後の１０日目に、損傷した肺胞領域において、ＬＧＡＬＳ３、ＳＦＮおよびＣＬＤＮ４を共発現する系列標識された（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋、ｔｄｔ＋）細胞が観察されたが、対照肺では観察されなかった。ＡＧＥＲを共発現するｔｄｔ＋細胞は、後の時点では、平たく薄く細長い形態を示し、ＡＥＣ１へのＡＥＣ２移行が確認された。興味深いことに、ＳＦＮ、ＣＬＤＮ４およびＬＧＡＬＳ３を含むＰＡＴＳマーカーを共発現する系列標識された細胞は、修復プロセスの間に、別個の形態学的特色（円形の、「伸展した」、および細長い）を有した（図５Ｂ）。これを定量化するために、本発明者らは、ＣＬＤＮ４＋および／またはＬＧＡＬＳ３＋発現ならびにそれらの形状に従って、系列陽性細胞をスコア付けした（図５Ｃ）。３つの別個のパターンのマーカー発現、ＣＬＤＮ４＋、ＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋およびＬＧＡＬＳ３＋が観察され、これらがそれぞれ、円形、伸展したおよび細長い形態と相関したことが見出された（図５Ｃおよび図５Ｄ）。さらに、本発明者らは、ブレオマイシンで誘導された傷害の後、８日目のＣＬＤＮ４＋細胞の、１０日目のＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋細胞の、および１２日目のＬＧＡＬＳ３＋細胞の、実質的な富化を観察した（図２ｌ）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおけるＣＬＤＮ４＋およびＣＬＤＮ４＋ＬＧＡＬＳ３＋細胞状態が注目されたが、別個のＬＧＡＬＳ３＋集団は注目されなかった。類似のＰＡＴＳマーカー発現が、肺切除術で誘導された「生理学的」再生の間に、ＡＥＣ２系列標識されたマウスにおいて検出された（図５Ｅ）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑにおけるＬＧＡＬＳ３の発現 対 免疫染色におけるＬＧＡＬＳ３の発現との間の食い違いは、最終ＡＥＣ１におけるＬＧＡＬＳ３タンパク質の永続に起因し得る。合わせると、この分析により、ＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化が、２つの別個の状態を通過することが明らかになった（図５Ｆ）。

（実施例４）
系列追跡分析は、ＰＡＴＳ細胞がＡＥＣ１を生成することを明らかにする
先に示された実験からの複数ラインのデータは、ＰＡＴＳ細胞がＡＥＣ１に向かう途中であることを示唆している。これを試験するために、スプライシングされたメッセンジャーＲＮＡとスプライシングされていないメッセンジャーＲＮＡとの間の比率に基づいた細胞分化トラジェクトリーの予測を可能にする、Ｖｅｌｏｃｙｔｏと呼ばれるアルゴリズムツール１８を使用した。ＰＡＴＳ１ Ｃｔｇｆ＋集団に起源して、ＰＡＴＳ２ Ｌｇａｌｓ３＋集団を介してＡＥＣ１への、強いＲＮＡ速度（トラジェクトリー）が観察された（図６Ａおよび図６Ｂ）。次いで、Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏと組み合わせた、ＰＡＴＳにおいて富化される遺伝子であるＫｒｔ１９のＣｒｅＥＲ対立遺伝子（Ｋｒｔ１９－ｔｄｔ）を使用して、ブレオマイシン傷害後の系列追跡を実施して、同じトラジェクトリーが、再生中の肺胞においてｉｎ ｖｉｖｏで生じるかどうかを試験した。最初に、マウスを、ブレオマイシンで傷害し、タモキシフェンを７日後に投与して、Ｋｒｔ１９発現細胞およびそれらの子孫を標識した（図６Ｃ）。次いで、ＡＥＣ２、ＡＥＣ１およびＰＡＴＳマーカーについての免疫蛍光を実施した。

ＡＥＣ１のマーカーであるＡＧＥＲを共発現する多数のＫｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞が、ブレオマイシン投与後の１２日目に見出された（図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ）。未傷害の肺では、本発明者らは、ＡＥＣ１ではまれな、一部のＬＧＡＬＳ３＋マクロファージにおけるｔｄｔ発現を観察した（図６Ｇ）。本発明者らは、ブレオマイシンで処置したマウスの未傷害の領域において、ＳＦＴＰＣを共発現するＫｒｔ１９－ｔｄｔ＋細胞を見出さず、これは、Ｋｒｔ１９発現が、損傷した領域において傷害に応答して特異的に活性化されること、ならびに本発明者らが試験した条件がＰＡＴＳを標識および追跡するために十分に適していることを示している。共免疫染色により、ブレオマイシンで処置した肺における、ＳＦＮ、ＣＬＤＮ４およびＬＧＡＬＳ３を含むＰＡＴＳマーカーを共発現する、伸展したｔｄＴｏｍａｔｏ標識された細胞が明らかになったが、対照では明らかにならなかった（図６Ｄ～６Ｇおよび図６Ｈ）。したがって、組み合わされたＲＮＡ速度および系列追跡分析は、新たに同定されたＰＡＴＳがＡＥＣ２とＡＥＣ１との間を横断することを明らかにしている。

（実施例５）
ＰＡＴＳ中の保存された転写プログラムおよび経路。
ＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化は、立方体状から平たく薄いものへの、細胞の形状および構造における劇的な変化に関連する。かかる移行には、典型的には、シグナル伝達タンパク質および構造タンパク質の発現における多くの変化が伴う。したがって、これらの変化がＰＡＴＳ細胞において生じると考えられた。これらの変化がＰＡＴＳ細胞において生じるかどうかを決定するために、オルガノイド培養物（４，５７３細胞）およびＬＰＳで誘導された傷害モデル（１３，２０４細胞）からのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを分析した。以下を含む多数の遺伝子が、ＰＡＴＳ細胞間で保存されていた：ＴＧＦβシグナル伝達経路中の遺伝子（Ｃｄｋｎ２ｂ、Ｍａｐｋ３、Ｍｙｃ、Ｎｂｌ１、Ｐｐｐ２ｒ１ａ、Ｒｂｘ１、Ｒｈｏａ、Ｓｋｐ１ａ、Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｉｆ１およびＴｈｂｓ１）、ｐ５３シグナル伝達経路中の遺伝子（Ｂａｘ、Ｃａｓｐ８、Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｄ２、Ｃｃｎｇ１、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｃｓ、Ｅｉ２４、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｓｅｓｎ３、Ｓｆｎ、Ｓｈｉｓａ５、Ｔｈｂｓ１およびＴｒｐ５３）、細胞老化に関与する遺伝子（Ｃａｌｍ１、Ｃａｌｍ２、Ｃａｐｎ２、Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｄ２、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ２ｂ、Ｅｉｆ４ｅｂｐ１、Ｅｔｓ１、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｈ２－Ｄ１、Ｈ２－Ｋ１、ｈ２－Ｑ４、Ｈ２－Ｑ６、Ｈ２－Ｑ７、Ｈ２－Ｔ２２、Ｈ２－Ｔ２３、Ｋｒａｓ、Ｍａｐ２ｋ２、Ｍａｐｋ１３、Ｍａｐｋ３、Ｍｙｃ、Ｐｐｉｄ、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｐｐｐ３ｃａ、Ｒｂｂｐ４、Ｒｈｅｂ、Ｒｒａｓ、Ｓｑｓｔｍ１、Ｓｌｃ２５ａ４、Ｔｇｆｂ２、Ｔｒｐ５３、Ｖｄａｃ１、Ｖｄａｃ２、Ｖｄａｃ３およびＺｆｐ３６ｌ１）、タイトジャンクションシグナル伝達遺伝子（Ａｃｔｂ、Ａｃｔｇ１、Ａｃｔｎ１、Ａｃｔｎ４、Ａｃｔｒ３、Ｃｃｎｄ１、Ｃｄｃ４２、Ｃｄｋ４、Ｃｌｄｎ３、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ７、Ｃｌｄｒｎ１８、ｃｔｔｎ、Ｅｚｒ、Ｆ１１ｒ、Ｈｓｐａ４、Ｉｔｇｂ１、Ｊｕｎ、Ｍｓｎ、Ｍｙｈ９、Ｍｙｌ６、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａ、Ｍｙｌ１２ｂ、Ｍｙｎ１２ａ、Ｎｅｄｄ４、Ｏｃｌｎ、Ｐｐｐ２ｒ１ａ、Ｒａｃ１、Ｒａｐ１ａ、Ｒｈｏａ、Ｓｌｃ９ａ３ｒ１、Ｔｕｂａ１ａ、Ｔｕｂａ１ｂ、Ｔｕｂａ１ｃおよびＶａｓｐ）、およびＤＮＡ損傷チェックポイント遺伝子（Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｇ１、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｄｄｘ３９ｂ、ｌｅｒ３、Ｐｒｐｆ１９、Ｒｐｌ２６、Ｒｐｓ２７ｌ、Ｓｏｘ４、Ｓｙｆ２およびＴｒｐ５３）。

経路富化分析により、ＴＰ５３、ＴＮＦ－ＮＦ－κＢ、ＥｒｂＢ、ＨＩＦ１、Ｈｉｐｐｏ－ＹＡＰ、細胞周期停止、細胞骨格動態、タイトジャンクションおよびＴＧＦβシグナル伝達が、他の集団と比較して、ＰＡＴＳ細胞において活性化されることが明らかになった（図７Ａおよび図７Ｂ）。細胞老化およびＤＮＡ損傷応答経路を代表する遺伝子についての実質的な富化が、予想外に見出された（図７Ｃおよび図７Ｂ）。

（実施例６）
ＰＡＴＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肺胞再生の間に、ＤＮＡ損傷および老化を天然に示す。
これらのデータは、ＤＮＡ損傷関連遺伝子および老化関連遺伝子が、ＰＡＴＳにおいて高度に富化されることを示した。これらの知見を検証するために、ブレオマイシンで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスの肺を、老化細胞のバイオマーカーとして機能するβ－ガラクトシダーゼ活性およびＤＮＡ損傷のマーカーであるγＨ２ＡＸについて、１０日後にアッセイした。興味深いことに、ブレオマイシンで傷害された肺胞において、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）由来の青色の沈着に基づいて、多数のβ－ガラクトシダーゼ活性細胞が検出されたが、対照肺胞では検出されなかった（図８Ａ）。これは、ブレオマイシンで処置した肺において特異的な、老化マーカーＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）の発現によってさらに支持された（図８Ｂ）。ＣＤＫＮ１Ａ発現は、伸展したｔｄｔ＋細胞において観察されたが、ＡＧＥＲ＋細胞では観察されず、これは、老化がＡＥＣ１において観察されないことを示している（図８Ｂ）。同様に、γＨ２ＡＸ斑の蓄積もまた、ブレオマイシンで処置した肺において、伸展したＳｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の核において検出されたが、ＡＧＥＲ＋細胞では検出されなかった（図８Ｃ）。さらなる分析により、ブレオマイシンで傷害された肺において、ＬＧＡＬＳ３を共発現するγＨ２ＡＸ＋Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の顕著な数が明らかになったが、対照では明らかにならず、これは、ＰＡＴＳ細胞が肺胞再生の間にＤＮＡ損傷を受けることを示している（図８Ｄ）。

ブレオマイシンは、細胞においてＤＮＡ損傷を誘導することが公知である。しかし、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析および免疫染色は共に、ＰＡＴＳ細胞におけるＤＮＡ損傷修復シグナル伝達の強い富化を明らかにした。老化およびＤＮＡ損傷に対するブレオマイシンからのあらゆる潜在的な影響を回避するために、マーカー分析を、ＡＥＣ１特異的アブレーションモデルからの肺に対して実施した（図４Ａ）。ＡＥＣ１をアブレートされた肺において、多数のＸ－ｇａｌ＋細胞が検出され、ＬＧＡＬＳ３＋細胞におけるＣＤＫＮ１ＡまたはγＨ２ＡＸの発現が観察されたが、対照肺胞では観察されなかった（図８Ｅ、図８Ｆおよび図８Ｇ）。

（実施例７）
ＰＡＴＳ細胞は、機械的伸展で誘導されたＤＮＡ損傷に対して脆弱である
以前の研究は、電離放射線、酸化ストレス、ならびに細胞の遊走および伸展の間に生じる機械的な力が、全てＤＮＡ損傷を引き起こし得ることを示している。経路分析により、酸化ストレスではなく細胞骨格変化に関与する遺伝子についての富化が明らかになった。ＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化が広範な細胞の広がりおよび細胞骨格動態を要求することを考慮して、ＰＡＴＳ細胞が、ＤＮＡ損傷をもたらし得る機械的伸展を経験すると仮説を立てた。これを試験するために、ＡＥＣ２を、ＳＦＴＰＣ－ＧＦＰマウスから精製し、ＡＥＣ２が広がりＡＥＣ１へと分化する条件であるプラスチック表面上でそれらを培養した（二次元（２Ｄ）培養）（図８Ｈｂ）。プレーティング後５日以内に、ＡＥＣ２のほとんどは伸展し、ＧＦＰ発現は喪失した（ＧＦＰ－）または下方調節された（ＧＦＰｌｏ）。これらの細胞は、伸展の間中、その表面積を増加させ、ＡＥＣ１マーカーを発現し始めた。興味深いことに、ＡＧＥＲ＋細胞は、ＤＮＡ損傷マーカーγＨ２ＡＸについても陽性であった（図８Ｈおよび図８Ｉ）。プレーティング後の２日目には、細胞においてＤＮＡ損傷マーカーが観察されなかったことに留意されたい（図８Ｉ）。合わせると、これらのデータは、大きく薄いＡＥＣ１へと分化する立方体状ＡＥＣ２が、ＤＮＡ損傷修復を天然に経験し、一過的老化を受けることを示している。

（実施例８）
ＴＰ５３シグナル伝達の遺伝的機能喪失および薬理学的活性化は、肺胞傷害－修復の間のＰＡＴＳを介したＡＥＣ２～ＡＥＣ１の分化を異常調節する
これらのデータは、ＴＰ５３シグナル伝達の活性化が、傷害された肺におけるＰＡＴＳに関連することを示唆している。他の組織における以前の研究は、ＴＰ５３シグナル伝達が分化を促進し、幹細胞自己更新を抑制することを示唆している。ＴＰ５３シグナル伝達の増強された活性化が、傷害後のＰＡＴＳが関与するＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化を増加させるかどうかを決定するために、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおいてブレオマイシンで誘導された傷害を実施し、その後、傷害後の８日目に開始するＮｕｔｌｉｎ－３ａ（ＴＰ５３活性化因子）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）投与を実施し、２０日目に組織収集した（図９Ａ）。ＡＧＥＲについての免疫染色により、Ｎｕｌｔｉｎ－３ａ処置が、ＤＭＳＯ処置と比較して、Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞のＡＥＣ１への有意に高い分化をもたらしたことが明らかになった（図９Ｂ）。Ｎｕｔｌｉｎ－３ａを受けた未傷害の肺では、ＡＧＥＲ＋Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の存在は観察されず、これは、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａで誘導されたＴＰ５３活性化単独では、ＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化を誘導するのに不十分であることを示唆している（図９Ｂ）。さらに、肺胞オルガノイド中のＡＥＣ２に対するＮｕｔｌｉｎ－３ａの影響を試験した。オルガノイドを、７日目に開始して、１５日目の回収まで、Ｎｕｔｌｉｎ－３ａまたはＤＭＳＯで処置した（図９Ｃ）。Ｎｕｔｌｉｎ－３ａで処置したオルガノイドは、対照と比較して、ＡＧＥＲ＋細胞の数および強度における増加、ならびにＫｉ６７＋増殖性細胞の数における減少を示した（図９Ｄ）。これらのデータは、ＴＰ５３シグナル伝達の異所的活性化が、ＡＥＣ２分化をｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで増強することをさらに支持している。

データは、ＴＰ５３シグナル伝達の活性化がＡＥＣ２分化を増強することを示した。ＴＰ５３がＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化に必要かどうかを試験するために、タモキシフェン投与が、ＡＥＣ２において特異的に、ＴＰ５３の欠失およびｔｄＴｏｍａｔｏの発現を可能にする、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｔｒｐ５３ｆｌ／ｆｌマウスモデルを利用した。ブレオマイシン傷害を実施し、その後、１２日目に組織収集した（図９Ｅ）。Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｔｒｐ５３＋／＋マウスを対照として使用した。免疫染色により、ブレオマイシンで処置した対照マウスにおける、ＡＧＥＲを共発現する多数の伸展した系列標識された細胞が明らかになった（図９Ｆ）。対照的に、ＴＰ５３欠損肺におけるｔｄｔ＋細胞は、ブレオマイシン処置後にＡＧＥＲ発現を示さず、異常な形態を有した（図９Ｆ）。ＴＰ５３欠損ＡＥＣ２が、ブレオマイシンで誘導された傷害を有さない領域において正常に見えたことに留意されたい。免疫染色および定量化により、傷害後の対照と比較して、ＴＰ５３－変異体マウスの肺において、ＣＬＤＮ４＋Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞の数における有意な増加およびより少ないＬＧＡＬＳ３＋Ｓｆｔｐｃ－ｔｄｔ＋細胞が明らかになった（図９Ｇ）。

発現分析により、対照と比較して、ＴＰ５３ｆｌ／ｆｌ肺において、ＣＤＫＮ１Ａ（ＴＰ５３の公知の標的）のレベルにおける有意な減少が明らかになった（図９Ｈ）。細胞死マーカーについての免疫染色により、ＴＰ５３変異体と対照との間に差異が存在しないことが明らかになり、これは、ＴＰ５３の喪失が細胞死に影響を与えなかったことを示している。合わせると、これらのデータは、ＴＰ５３が、ＡＥＣ２のＡＥＣ１への分化にとって必須であり、ＴＰ５３欠損ＡＥＣ２がＰＡＴＳにはまり込み、ＡＥＣ１に進行することができないことが明らかになった。

（実施例９）
ＴＰ５３は、ＰＡＴＳ関連遺伝子座に結合し、それらの発現を制御する
ＰＡＴＳ細胞において潜在的に活性な転写因子モジュールを同定するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析を、ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃについて実施して、それぞれ、活性なプロモーター、転写している遺伝子およびエンハンサーを同定した。ブレオマイシンで処置したＣｔｇｆ－ＧＦＰおよび対照マウス由来のＰＡＴＳ細胞およびＡＥＣ２をそれぞれ単離し、ヒストンマーク分析に使用した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３富化は、細胞型特異的プロモーターに対応する遺伝子（ＡＥＣ２ではＳｆｔｐｃ、ＰＡＴＳではＦｎ１）において見出された。さらなる分析により、対照由来のＡＥＣ２と比較して、ブレオマイシン損傷で誘導された肺由来のＰＡＴＳ細胞に特異的な転写物の転写開始部位およびプロモーターと重複する多数のＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークの富化が明らかになった（図１０Ａ）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ピークのモチーフ分析は、ＴＰ５３、ＥＴＳ１、ＮＦ１、ＡＴＦ３およびＳＯＸ４ － これらは全て、ＰＡＴＳで富化された経路に関与している － を含む転写因子についての結合部位の富化を予測した。ＡＥＣ２と比較したＰＡＴＳにおける、公知のＴＰ５３標的遺伝子座（ＦａｓおよびＭｄｍ２）におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ３６ｍｅ３についての富化。ＴＰ５３について、予測された結合部位が、Ｍｄｍ２エンハンサーおよびＦａｓプロモーター中に見出され、これらは、ＴＰ５３の２つの周知の直接的標的である。合わせると、これらのデータは、ＰＡＴＳ特異的遺伝子の転写制御におけるＴＰ５３の直接的な役割を暗示している。

ＣｈＩＰ分析を、ＰＡＴＳ細胞におけるＴＰ５３について実施して、ＴＰ５３が、ＰＡＴＳに関連する転写プログラムを直接的に調節するかどうかを実験的に試験した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析が、ＴＰ５３シグナル伝達がＰＡＴＳのＣｔｇｆ＋サブセットにおいて高度に富化されることを明らかにしたことを考慮して、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスモデルを生成して、ＣｈＩＰ分析のためにＡＥＣ２系列由来ＰＡＴＳ細胞を精製した。ＰＡＴＳ細胞（ｔｄｔ＋ＧＦＰ＋）を、ブレオマイシン投与後の８日目に、Ｓｆｔｐｃ－ＣｒｅＥＲ；Ｒ２６Ｒ－ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｃｔｇｆ－ＧＦＰマウスの肺から精製し、ＴＰ５３について多重インデックス化Ｔ７ ＣｈＩＰ（Ｍｉｎｔ－ＣｈＩＰ）分析を実施した（図１０Ｂ）。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）トラック上でのデータ可視化により、Ｍｄｍ２、Ｔｒｐ５３およびＢａｓｐ１を含む以前に記載された標的上でのＴＰ５３の強い富化が明らかになった。より重要なことに、ＴＰ５３の強い富化は、Ｆｎ１、Ｓｆｎ、Ａｃｔｎ１、Ｎｕｐｒ１、Ｍｙｌ１２ａ、Ｃａｌｍ１、Ｃｔｇｆ、Ｃｄｋｎ１ａおよびＫｒｔ１９を含む、本発明者らが分析した多く（２８のうち２２）のＰＡＴＳ標的遺伝子上で観察された（図１０Ｃ）。ＴＰ５３富化がＡＥＣ１遺伝子座でもＡＥＣ２遺伝子座でも観察されなかったことに留意されたい（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。さらに、ＰＡＴＳ関連遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー上でのＴＰ５３結合と一致して、ＴＰ５３富化領域とＨ３Ｋ４ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ａｃマークとの間での重複もまた観察された（図１０Ｃ）。合わせると、これらのデータにより、ＴＰ５３が、ＰＡＴＳで富化された遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーに直接的に結合することが明らかになった。

（実施例１０）
ＰＡＴＳ関連遺伝子発現シグネチャーおよびシグナル伝達経路は、ヒト線維化肺において富化される
最近の研究は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）において線維化病巣を裏打ちする肺胞上皮細胞が、老化、成長停止および分化遮断の特色を示すことを示唆している。肺胞前駆体が、非許容的な病理学的微小環境に応答してその分化プロセスをＰＡＴＳ様状態で留め置くかどうかを試験するために、ＩＰＦを有するヒト患者の肺からの、最近報告されたｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット２９を分析した。最初に、全ての非上皮および気道細胞を、さらなる分析から排除した。健康な肺およびＩＰＦ肺の両方において、ＵＭＡＰプロットにおける見かけの重複を伴って、多数のＡＥＣ２およびＡＥＣ１が観察された（図１１Ａ）。対照的に、ＩＰＦ試料において高度に富化され、ＡＥＣ１またはＡＥＣ２のいずれとも重複しなかった、別個の細胞クラスターが見出された（図１１Ｂ）。これらの細胞は、それらのマーカー遺伝子発現によって、ＫＲＴ５－ＫＲＴ１７＋と以前にアノテーションされた。特に、差次的遺伝子発現の分析により、マウスオルガノイドおよび傷害モデル由来のＩＰＦで富化された細胞クラスターとＰＡＴＳ細胞との間で、Ｓｆｎ、Ｓｏｘ４およびＦｎ１、ならびにまたＳ１００Ａ２、ＰＴＧＳ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ８、ＣＡＬＳ１、ＣＬＤＮ４、ＭＭＰ７、ＰＲＳＳ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＤＫ、ＴＡＧＬＮ、ＧＤＦ１５、ＴＭ４ＳＦ１およびＣＴＳＥを含む転写物の、著しい類似点が明らかになった。したがって、ヒトＩＰＦ特異的クラスターを「ＰＡＴＳ様」細胞と命名した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。ＰＡＴＳ様集団において高度に富化された他の転写物は、ＣＡＬＤ１、ＰＲＳＳ２、ＭＭＰ７およびＳ１００Ａ２である。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを検証するために、免疫蛍光分析を、健康なヒト、ならびにＩＰＦを有する肺の線維化領域および非線維化領域に対して実施した（図１１Ｃ）。ＰＡＴＳ様細胞（ＳＦＮ、ＣＬＤＮ４およびＫＲＴ１７）、ＡＥＣ２（ＳＦＴＰＣおよびＨＴＩＩ－２８０）、ＡＥＣ１（ＡＧＥＲ）および筋線維芽細胞（ＡＣＴＡ２）の共免疫蛍光分析により、ＩＰＦ肺の線維化領域中において特異的な、ＰＡＴＳ様マーカーの発現が明らかになったが、健康な対照中および健康な外観を有するＩＰＦ肺の領域中では明らかにならなかった（図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ）。興味深いことに、ＫＲＴ１７は、正常な肺の基底細胞およびＩＰＦ肺中の基底様細胞において発現されることが最近示された（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７５３８０６；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７５９９０２）。ＩＰＦ肺の線維化領域において特異的な、基底細胞の別のマーカーであるＴＰ６３の類似の発現パターンもまた見出されたが、非線維化領域では見出されなかった（図１１Ｈ、図１１Ｉ）。ＰＡＴＳ様マーカーは、高レベルのＣＯＬ１Ａ１、および筋線維芽細胞の蓄積（図７Ｄ）と一致して、重症線維症の領域において高度に富化されることが見出された（図１１Ｄ～図１１Ｉ）。ＰＡＴＳマーカー（ＳＦＮ、ＣＬＤＮ４、ＫＲＴ１７およびＴＰ６３）の定量化が、これらの知見をさらに支持した（図１１Ｅ、図１１Ｇおよび図１１Ｉ）。さらに、ＰＡＴＳ細胞は、健康な肺における立方体状ＡＥＣ２とは対照的に、ＩＰＦ肺において細長い形態を獲得したことが観察された（図１１Ｄ、図１１Ｆおよび図１１Ｇ）。ＡＧＥＲ発現が、多くのＰＡＴＳ様細胞を有するＩＰＦ肺中の領域には存在しなかったことに留意されたい（図１１Ｆ）。遺伝子オントロジーおよび経路分析により、ｐ５３シグナル伝達（ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２ＡおよびＭＤＭ２、ならびにＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ１、ＳＮＦ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＢＩＤ、ＢＡＸ、ＰＭＡＩＰ１、ＢＢＣ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＰＥＲＰ、ＺＭＡＴ３、ＩＧＦＢＰ３、ＣＤ８２、ＴＨＢＳ１、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ３、ＳＴＥＡＰ３、ＴＰ７３）、ＤＮＡ損傷チェックポイント（ＲＰＳ２７ＬおよびＰＬＫ３、ならびにＢＲＳＫ１、ＨＭＧＡ２、ＰＥＡ１５、ＰＬＫ２、ＰＲＫＤＣ、ＳＯＸ４、ＴＲＩＡＰ１）および細胞老化（ＴＧＦＢ２およびＨＩＰＫ２、ならびにＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＸＣＬ８、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＳ１、ＮＦＡＴＣ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＴＧＦＢ１、ＺＦＰ３６Ｌ１）の構成要素についての富化が明らかになった（図１１Ｊ）。さらに、ＰＡＴＳ様クラスターは、接着斑、タイトジャンクション、およびアクチン細胞骨格の調節の構成要素について富化され、これは、ＩＰＦにおけるＰＡＴＳ様細胞とオルガノイドおよび再生中の肺胞におけるＰＡＴＳ様細胞との間の著しい類似点を示している。線維症の公知の調節因子であるＡＲＥＧ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２およびＴＩＭＰ１についての有意な富化が、ＰＡＴＳ様細胞において見出された（図１１Ｋ）。次に、細胞老化（β－ガラクトシダーゼ活性およびＣＤＫＮ１Ａ）およびＤＮＡ損傷応答（γＨ２ＡＸ）のマーカーを、ＩＰＦ肺および健康な肺において分析した。このデータにより、ＩＰＦ中のＰＡＴＳ様集団におけるこれらのマーカーの特異的発現が明らかになったが、健康な肺では明らかにならなかった（図１１Ｌおよび図１１Ｍ）。合わせると、この分析により、再生中の組織由来のＰＡＴＳ細胞と病理学的線維化肺に特異的なＰＡＴＳ様細胞との間での類似性が明らかになった。

考察

この研究は、ＡＥＣ２とＡＥＣ１との間を横断し、特異的遺伝子発現シグネチャーを有する、以前には未知であった移行状態（ＰＡＴＳ）を発見した。運命マッピング研究は、ＡＥＣ２からＰＡＴＳからＡＥＣ１への明らかな系列関係を実証している。したがって、これらの移行細胞状態の追加により、本研究は、肺胞上皮細胞のヒエラルキーを訂正する。特異的遺伝子発現シグネチャーは、ＰＡＴＳが、ＡＥＣ２特徴の段階的な喪失を受けているだけでなく、独自の移行集団を表すことを示している（図１２）。これらの細胞は、肺再生のために重要であることが以前に示された、ＴＰ５３、ＮＦ－κＢ、ＹＡＰ、ＴＧＦβおよびＨＩＦ１を含む経路について富化される（ＬａＣａｎｎａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２９， ２１０７－２１２２；Ｒｉｅｍｏｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ５， ｅ１２３６３７；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８， ６５０４－６５１３；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １７， ２１７３－２１８２）。上皮－間葉移行および他の組織における細胞接着の公知の調節因子である、細胞周期停止、老化およびＳＯＸ４に関連する転写物についての富化が観察された３３。遺伝学的および薬理学的モジュレーションを通じて、これらのデータは、ＴＰ５３シグナル伝達が、再生中の組織において、ＰＡＴＳが関与するＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化を促進するのに必要かつ十分であることを実証している。ＣｈＩＰによる分析により、ＴＰ５３によるＰＡＴＳ遺伝子の直接的制御が明らかになった。この研究は、多数の細胞骨格遺伝子へのＴＰ５３の結合の直接的な証拠を提供する。さらに、ＴＰ５３結合は、ＤＮＡ損傷経路に関与する遺伝子（Ｎｕｐｒ１およびＳｏｘ４）上で観察された。

ヒト肺の上記分析は、ＩＰＦ肺の線維化領域中に特異的に存在するＰＡＴＳ様細胞を同定した。マウスＰＡＴＳ細胞と同様に、ヒト肺中のＰＡＴＳ様細胞は、細胞老化、ＴＰ５３シグナル伝達およびＴＧＦβによる調節される遺伝子に関連する遺伝子 － これらは全て、肺を含む複数の臓器における線維症に関与することが公知である － についての富化によって特徴付けられる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ． ６， ｅ１８４７；Ｌｉｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ５， Ｓ２４）。対照的に、一部の差異が、マウスＩＰＦ特異的ＰＡＴＳ様細胞とヒトＩＰＦ特異的ＰＡＴＳ様細胞との間で、遺伝子発現シグネチャーにおいて見出された。これらは、ヒトＰＡＴＳ様細胞においてのみ見出されるＴＰ６３、ＫＲＴ１７およびＣＯＬ１Ａ１を含む。ヒトｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータからのＲＮＡ速度投影は、これらのＫＲＴ１７＋ＴＰ６３＋細胞がＡＥＣ２に起源することを示唆している。ＫＲＴ１７およびＴＰ６３についての免疫蛍光は、これらの細胞が同じ肺胞内でＰＡＴＳ様細胞によって取り囲まれていることをさらに示唆した。

これらの知見は、ＰＡＴＳ細胞が、薄く大きいＡＥＣ１へのＡＥＣ２分化の間に広範な伸展を受け、ほとんどの変性性肺疾患、特に、肺線維症およびがんに関連する特色であるＤＮＡ損傷に対して脆弱になることを示した（Ｋｒｏｐｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ６， ９－１７；ｄａ Ｓｉｌｖａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１３， ＢＭＣ Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． １４， ９３）。以前の研究により、細胞が遊走するまたは狭い空間を押し分けて進む場合、細胞伸展がＤＮＡ損傷を引き起こすことが明らかになっている（ＭｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４０， ３２－４０）。傷害モデルおよび２Ｄ培養は実際に、ＡＥＣ２が、ＡＥＣ１への分化の間に広範な伸展を受けることを示唆している。したがって、移行細胞状態は、特に、ＤＮＡ損傷に関連する肺疾患において、臨床的関与を有する（ｄａ Ｓｉｌｖａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１３， ＢＭＣ Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． １４， ９３；Ｓａｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ５２， １７０１９９４）。興味深いことに、ＰＡＴＳ集団は、ＤＮＡ損傷後に誘導され、ＴＰ５３の安定化および機能において重要なＳＯＸ４（細胞骨格遺伝子を調節することが公知）について富化される。合わせると、これらのデータは、細胞が伸展を受ける場合に生じ得るＤＮＡ損傷と戦うために細胞が共転写プログラムを進化させたモデルを支持する。さらに、ゲノムワイド研究は、ＤＮＡ損傷修復構成要素、例えば、ＸＲＣＣファミリー遺伝子、ＬＩＧ４、ＴＥＲＣ、ＰＡＲＰおよびＲＴＥＬ１における変異を、肺気腫および肺線維症と共に同定している４０。したがって、新たに同定された移行状態は、肺病理発生における肺胞幹細胞分化に伴う細胞形状変化および関連の脆弱性を暗示する。

老化は、細胞が異常で不可逆的な状態を獲得する、加齢関連の病理学的状態とみなされる場合が多い。本明細書で記載されるように、肺胞幹細胞分化には、正常な組織再生における老化の主要な特色を示す移行状態が関与することが見出された。以前の研究は、発生中の肢芽組織において、老化細胞を実際に見出している（Ｓｔｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｃｅｌｌ， １１５， １１１９－１１３０）。したがって、老化は、加齢組織において排他的に生じるわけでは必ずしもない場合があるが、組織再生に伴う可逆的な一過的状態であり得る。したがって、この研究は、老化を、正常な組織維持プログラムの一部として生じ得、ヒト疾患において進行を阻止され得る状態として再定義する。

結論として、肺胞オルガノイドおよびｉｎ ｖｉｖｏ傷害－修復モデルを使用して、肺再生におけるプレＡＥＣ１移行状態が同定された。この独自の状態は、細胞老化、および欠損した肺胞再生経路についての富化に関連する（図１２）。これらの結果は、移行細胞状態における長期老化およびストレス媒介性経路が、線維症などの疾患をもたらし得ることを強く示唆している。

（実施例１１）
新規の調節可能な肺傷害モデルは、一過的な線維症をｉｎ ｖｉｖｏで再現する
肺線維症は、劇的な細胞外マトリックス変化および組織リモデリングを全てが次に生じる、上皮、間葉および免疫集団における変更が関与する、複雑な疾患である。これらの複雑な相互作用の結果として、線維症の開始はあまり理解されておらず、これらの個々の因子の全ての組合せの結果であると仮定されている。今のところ、単一の細胞型への損傷が線維化開始を生じ得るかどうかについては、いまだ未知である。

これに対処するために、細胞型特異的上皮アブレーションモデルを開発し（図１３Ａ）、単一の細胞型であるＡＥＣ１のアブレーションが、リポ線維芽細胞に特徴的なＰｄｇｆｒａの発現および星型形状を維持しつつ、常在性Ｐｄｇｆｒａ＋リポ線維芽細胞においてアルファ平滑筋アクチン（ａＳＭＡまたはＡＣＴＡ２、組織線維症のマーカー）の迅速な活性化を生じることが見出された。これらの細胞は、筋線維芽細胞において通常見られる形態学的変化を示さないので、「線維筋細胞」と称される（図１３Ｂ）。特に、単一ラウンドのＡＥＣ１アブレーションの後、線維筋細胞は一過的であり、上皮ホメオスタシスが回復されるにつれ、ＡＣＴＡ２発現は徐々に減少する。さらに、ＡＥＣ１細胞の特異的アブレーションは、３日目までの迅速な活性化を伴い、６日目にピークに達する、中間のＰＡＴＳ状態を生じた。興味深いことに、ＰＡＴＳおよび線維筋細胞は同時に存在し、ＰＡＴＳは、線維筋細胞が変換した間葉と直接的に重なる。ＰＡＴＳは、１０日目までには顕著な数で存在せず、これは、上皮組織が、この細胞型特異的傷害後に迅速に回復することを示唆している。

（実施例１２）
ＰＡＴＳの持続は、リポ線維芽細胞をｉｎ ｖｉｖｏで筋線維芽細胞へと駆動する
単一ラウンドのＡＥＣ１アブレーションが、一過的で可逆的な線維症、線維筋細胞移行のみを生じ、筋線維芽細胞を生じなかったことを考慮すると、反復ＡＥＣ１アブレーション（反復肺胞傷害の代用物）が、線維症をさらに駆動し得ると考えられた（図１４Ａ）。反復ＡＥＣ１アブレーション後のマウス肺の予備的組織学的分析により、実際に、肺胞における増加したＡＣＴＡ２発現、ならびに星型から「帯状」形態への、ＡＣＴＡ２＋細胞における形態学的変化が明らかになった（図１４Ｂ、図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。さらに、反復アブレーションは、線維化病巣の同定を可能にし、マッソントリクローム分析は、これらの肺におけるＥＣＭ産生における増加を実証した。

反復アブレーションは、分化の反復性の必要性、およびしたがって、ＰＡＴＳ蓄積の結果として、ＰＡＴＳが存在する時間の量を増加させるが、単一の重度に損傷する傷害が、増加したＰＡＴＳおよび線維症を同様に生じるとも仮説を立てた。これを実証するために、２つの別個の傷害モデル、肺切除術およびＡＥＣ１アブレーションを組み合わせた。重要なことに、これら２つの傷害は、ＰＡＴＳがこれら２つの傷害において同時に蓄積するように、タイミングを合わせた。これらの条件下で、重症線維症および筋線維形成（ｍｙｏｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、ａＳＭＡ染色によって示されるように、肺の末梢から肺全体に拡大した（図１４Ｅ）。特に、この二重傷害モデルでは、幅が広い筋線維芽細胞のバンド、線維化病巣、ならびに残留ＰＡＴＳの存在が、これらの筋線維芽細胞が支配的な領域において観察された。

（実施例１３）
拡張可能な共培養モデルは、肺線維症をｅｘ ｖｉｖｏで再現する
集合的に、ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＰＡＴＳが、筋線維芽細胞変換において直接的な役割を果たすことを示唆した。この細胞間コミュニケーションを決定的に実証するために、上皮およびリポ線維芽細胞の両方の成長を支持し、それらの正常な表現型を維持する培養条件を確立した。次いで、リポ線維芽細胞を、ＡＥＣ２細胞（ＳＦＴＰＣ－ＧＦＰマウスに由来する）またはＰＡＴＳ（ブレオマイシン傷害後にＣＴＧＦ－ＧＦＰマウス（ＧＦＰ^＋／ＥｐＣＡＭ^＋）細胞から単離した）と共に７日間共培養し、免疫染色によって分析した。これらの条件下で、リポ線維芽細胞は、ＰＡＴＳの存在下でのみＡＣＴＡ２を自発的に発現したが、ＡＥＣ２とでは発現しなかった。これらのデータは、ＰＡＴＳが、線維化促進性因子を産生し、リポ線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換を誘導することをさらに示唆している（図１５）。

（実施例１４）
リポ線維芽細胞の正体は、強直性のＡＥＣ１由来ＰＤＧＦＡシグナル伝達によって維持される
しかし、これら３つの傷害モデルからのデータは、ＰＡＴＳの存在がさらなる線維形成を駆動することを示唆しているが、単回ＡＥＣ１アブレーションでは、ネイティブ間葉におけるａＳＭＡ発現がＰＡＴＳの出現に先行することが観察された。これは、ＡＥＣ１の孤立した喪失が、リポ線維芽細胞の筋線維芽細胞への移行を誘導するのに十分であることを示唆しており、したがって、ＡＥＣ１が、細胞間コミュニケーションを介してリポ線維芽細胞の正体を維持すると仮説を立てた。

ＡＥＣ１と線維芽細胞との間の相互作用をさらに探索するために、ホメオスタシス単一細胞データからの上皮－間葉リガンド－受容体発現データを、Ｃｅｌｌｐｈｏｎｅ ＤＢを使用して試験した。特に、ホメオスタシスで見出される２つの上皮細胞のうち、ＡＥＣ２と比較してＡＥＣ１は、リポ線維芽細胞との、より多数のより強いコミュニケーション相互作用を有すると予測された。興味深いことに、それに対する同族受容体ＰＤＧＦＲＡが肺間葉においてリポ線維芽細胞によってもっぱら発現されるＰＤＧＦＡリガンドをＡＥＣ１が直接的に分泌することが見出された。重要なことに、ＰＤＧＦＡ発現は、ＡＥＣ２から、ＰＡＴＳ状態を介し、最終的にはＡＥＣ１への細胞移行と共に増加し、これは、ＰＤＧＦＡが、上皮－間葉ホメオスタシス維持にとって重要なシグナルであることを示唆している（図１６）。したがって、ＰＤＧＦＡは、リポ線維芽細胞の正体を維持し、ＡＥＣ１の喪失、および結果として生じるＰＤＧＦＡの喪失が、リポ線維芽細胞から筋線維芽細胞への開始の合図であると仮説を立てた。ＡＥＣ２がＡＥＣ１へと分化するにつれて、ＰＤＧＦＡ発現は回復し、これは引き続いて、線維筋細胞をそのネイティブのリポ線維芽細胞状態に戻す。

（実施例１５）
ＰＤＧＦＡシグナル伝達の崩壊は、筋線維形成の開始に十分である
ＰＤＧＦＡシグナル伝達軸の喪失が筋線維芽細胞変換に十分であるかどうかを試験するために、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＡ－ＣｒｅＥＲ／ＰＤＧＦＲＡ^ｆｌｏｘの細胞型特異的条件付きノックアウトモデルを生成した。このマウス系は、ＰＤＧＦＲＡの単一の機能的対立遺伝子のみを有し、タモキシフェン投与の際に、ＰＤＧＦＲＡ＋細胞において排他的に、ＰＤＧＦＲＡ発現の完全な喪失を生じる。特に、ＰＤＧＦＲＡ欠失のたった２日後に、これらのマウスは、肺間葉においてａＳＭＡを発現し始め、これは、ＰＤＧＦＲＡシグナル伝達軸の喪失の際の迅速な筋線維芽細胞変換を示す（図１７）。これらのデータに基づいて、ＰＤＧＦＡがリポ線維芽細胞の維持のために必要かつ十分であると仮説を立てた。

（実施例１６）
Ｒｕｎｘ１は、筋線維形成（ｍｙｏｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ）運命のマスター転写調節因子である
リポ線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行をもたらすマスター調節因子を決定するために、傷害後条件において優先的に上方調節される転写因子を調べた。複数の臓器における線維化進行に関連付けられることが公知の転写因子であるＲｕｎｘ１は、ＡＥＣ１アブレーション後およびブレオマイシン傷害後に強く上方調節されることが見出された（図１８）。重要なことに、Ｒｕｎｘ１発現は、ＡＥＣ１アブレーション、反復ＡＥＣ１アブレーションおよびＰＤＧＦＲＡ欠失を含む、本明細書に記載される線維化傷害モデルの全てのモデルにわたって増加する（図１９）。

（実施例１７）
ＲＵＮＸ１の遺伝学的および薬理学的阻害は、ＴＧＦｂにより誘導される線維形成を遮断する
この培養システムを使用して、筋線維形成におけるＲｕｎｘ１の直接的な役割を決定した。培養物中のＴＧＦ－Ｂで処置した野生型リポ線維芽細胞は、ａＳＭＡを発現し、ＰＤＧＦＲＡを下方調節する。Ｒｕｎｘ１^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}マウス由来のリポ線維芽細胞を培養し、Ａｄｅｎｏ－Ｃｒｅ－ＧＦＰウイルスを投与したところ、培養物における効率的なＲｕｎｘ１欠失が生じた（図２０Ａ）。Ｒｕｎｘ１欠失の後、ＴＧＦ－Ｂを使用して筋線維形成を誘導した。しかし、野生型線維芽細胞とは異なり、Ｒｕｎｘ１が欠失した線維芽細胞は、ａＳＭＡを発現せず、ＰＤＧＦＲＡ発現を維持し、これは、Ｒｕｎｘ１が筋線維形成に必要であることを示している（図２０Ｂ）。遺伝的欠失に加えて、これらの実験を、薬物Ｒｏ ５－３３３５によるＲｕｎｘ１の薬理学的阻害を用いて反復した。リポ線維芽細胞を、Ｒｏ ５－３３３５およびＴＧＦ－Ｂの存在下で４８時間培養した。Ｒｕｎｘ１欠失と同様に、Ｒｏ ５－３３３５で処置したリポ線維芽細胞は、ＰＤＧＦＲＡ発現およびそれらの星型形状を維持し、ａＳＭＡ発現および筋線維化（ｍｙｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）変換は事実上存在しなかった。

当業者は、本開示が、目的を実行し、言及された目標および利点ならびにその中の固有のものを得るために十分に適合されていることを容易に理解する。本明細書で記載される開示は、好ましい実施形態を目下代表しており、例示的であり、本開示の範囲に対する限定として意図されない。特許請求の範囲によって定義される本開示の精神の範囲内に包含されるその中の変化および他の使用は、当業者に想起される。

本明細書で引用される任意の非特許文書または特許文書を含む任意の参照文献が先行技術を構成するという承認は行わない。特に、他に述べられない限り、本明細書の任意の文書に対する言及は、これらの文書のいずれも、米国でも任意の他の国でも、当該分野の共通の一般知識の一部を形成するという承認を構成しないことが理解される。参考文献の任意の議論は、その著者らが何を主張しているかを述べており、出願人は、本明細書で引用された文書のいずれかの正確さおよび適切性に対して異議を申し立てる権利を留保している。本明細書で引用される全ての参考文献は、他が明示的に示されない限り、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

引用された参考文献中に見出される任意の定義および／または記載間に相違が存在する場合には、本開示が支配するものとする。

Claims (37)

1. 肺傷害オルガノイドモデルを生成する方法であって、
   ｉ）細胞の共培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップであって、前記共培養物が、プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞および肺胞線維芽細胞を含む、ステップ；
   ｉｉ）前記培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ならびに
   ｉｉｉ）前記作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、前記ＰＡＴＳ細胞および／または前記肺胞線維芽細胞の少なくとも１つの発現マーカーに対する前記作用物質の生物学的影響を分析するステップ
   を含む、方法。
2. 前記ＰＡＴＳ細胞が、罹患組織から単離される、請求項１に記載の方法。
3. 前記罹患組織が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）肺組織、肺線維症肺組織、特発性肺線維症肺組織、肺気腫肺組織、肺がん組織、サルコイドーシス肺組織、間質性肺炎肺組織、敗血症肺組織、ウイルス感染および細菌感染を有する肺組織、急性呼吸促迫症候群肺組織、ならびに気管支肺異形成症肺組織である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＰＡＴＳ細胞が、肺上皮細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで傷害を引き起こす作用物質に曝露させることによって生成される、請求項１に記載の方法。
5. 前記傷害を引き起こす作用物質が、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、照射、ウイルス、細菌または真菌である、請求項４に記載の方法。
6. 前記肺胞線維芽細胞が、リポ線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記肺胞線維芽細胞が、疾患状態特徴を有する、請求項１に記載の方法。
8. 前記疾患状態特徴が、ＡＣＴＡ２を発現するリポ線維芽細胞、筋線維芽細胞の存在、および／または星型形状から帯状形状への細胞変化を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記培養培地が、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）リガンドを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記ＰＤＧＦＲリガンドが、血小板由来増殖因子サブユニットＡ（ＰＤＧＦＡ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、血小板由来増殖因子サブユニットＣ（ＰＤＧＦＣ）および／または血小板由来増殖因子サブユニットＤ（ＰＤＧＦＤ）である、請求項９に記載の方法。
11. 前記培養培地が、ＰＤＧＦＲＡ発現を維持することが可能な作用物質を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記作用物質が、Ｒｏ ５－３３３５、ＡＩ－１０－４９、またはＲＵＮＸもしくはコア結合因子（ＣＢＦ）タンパク質を調節する他の分子である、請求項１１に記載の方法。
13. 肺線維症のためのｅｘ ｖｉｖｏモデルを生成する方法であって、
    ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでアブレーションを受けたＡＥＣ１細胞の培養物を、前記細胞の培養のために適合させた培養培地中に提供するステップ；
    ｉｉ）前記培養培地を、１種または複数の作用物質と接触させるステップ；ならびに
    ｉｉｉ）前記作用物質と接触されていない対照細胞培養培地と比較した、前記ＡＥＣ１細胞の少なくとも１つの発現マーカーに対する前記作用物質の生物学的影響を分析するステップ
    を含む、方法。
14. 前記ＡＥＣ１細胞が、少なくとも１ラウンドのアブレーションを受けている、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＡＥＣ１細胞が、単独のまたは他の傷害モデルと組み合わせたアブレーションを受けている、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ＡＥＣ１細胞が、反復アブレーションを受けている、請求項１３に記載の方法。
17. 前記反復アブレーションが、約３日間～約２週間の過程にわたって行われる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＡＥＣ１細胞が、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、アスベスト、化学的毒性作用物質、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌に曝露されることによるアブレーションを受けている、請求項１３に記載の方法。
19. 前記ＡＥＣ１細胞が、ａＳＭＡおよび／またはＡＣＴＡ２を発現する、請求項１３に記載の方法。
20. 前記ＡＥＣ１細胞が、線維筋細胞の特徴を示す、請求項１３に記載の方法。
21. プレ１型肺胞移行細胞状態（ＰＡＴＳ）細胞またはＰＡＴＳ様細胞を同定する方法であって、
    ｉ）肺胞細胞を得るステップ；および
    ｉｉ）前記細胞を、１つまたは複数のマーカーについてスクリーニングするステップ
    を含み、前記１つまたは複数のマーカーの存在が、ＰＡＴＳ細胞またはＰＡＴＳ様細胞の存在を示す、方法。
22. 前記肺胞細胞が、気管基底細胞、細気管支分泌細胞（クラブ細胞またはクララ細胞としても公知）、クラブバリアント細胞、肺胞上皮前駆（ＡＥＰ）細胞、クララバリアント細胞、遠位肺前駆体、ｐ６３＋Ｋｒｔ５－気道細胞、系列陰性上皮前駆体、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、Ｓｏｘ９＋ｐ６３＋細胞、神経内分泌前駆細胞、遠位気道幹細胞、粘膜下腺管細胞、誘導多能性幹細胞由来肺幹細胞および２型肺胞上皮（ＡＥＣ２）細胞からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記肺胞細胞が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、特発性肺線維症、肺気腫、肺がん、サルコイドーシス、間質性肺炎、敗血症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、急性呼吸促迫症候群および／または気管支肺異形成症を患う患者の肺から得られる、請求項２１に記載の方法。
24. 前記肺胞細胞を作用物質と接触させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
25. 前記作用物質が、ブレオマイシン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、タモキシフェン、ウイルス、細菌または真菌である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記１つまたは複数のマーカーが、ＣＬＤＮ４、ＫＲＴ１９、ＳＦＮ、ＬＧＡＬＳ３、ＳＯＸ４、Ｓ１００Ａ２、ＰＴＧＳ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ８、ＣＡＬＳ１、ＭＭＰ７、ＰＲＳＳ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＤＫ、ＴＡＧＬＮ、ＧＤＦ１５、ＴＭ４ＳＦ１ ＴＰ６３および／またはＣＴＳＥを含む、請求項２１に記載の方法。
27. 前記１つまたは複数のマーカーが、ＣＬＤＮ４、ＬＧＡＬＳ３およびＬＧＡＬＳ３である、請求項２１に記載の方法。
28. 前記１つまたは複数のマーカーが、ＣＬＤＮ４、ＫＲＴ１９およびＳＦＮである、請求項２１に記載の方法。
29. 前記１つまたは複数のマーカーが、ＣＡＬＤ１、ＰＲＳＳ２、ＭＭＰ７およびＳ１００Ａ２である、請求項２１に記載の方法。
30. ｉｎ ｖｉｖｏ組織線維症モデルを生成する方法であって、
    ｉ）被験体においてＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいは
    ｉｉ）ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる作用物質を被験体に投与するステップ；ならびに
    ｉｉｉ）前記被験体由来の細胞を分析して、対照被験体と比較した、ＰＤＧＦリガンドおよび／もしくはＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）シグナル伝達の遺伝的喪失の生物学的影響ならびに／またはＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる前記作用物質の生物学的影響を決定するステップ
    を含む、方法。
31. ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる前記作用物質が、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲアゴニスト、ＰＤＧＦ阻害剤またはＰＤＧＦアゴニストを含む、請求項３０に記載の方法。
32. ＰＤＧＦ－ＰＤＧＦＲシグナル伝達をモジュレートすることができる前記作用物質が、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦＲに対する中和抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
33. ｉｎ ｖｉｖｏ組織線維症モデルを生成する方法であって、
    ｉ）被験体においてＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦｂの遺伝的喪失を導入するステップ；ならびに／あるいは
    ｉｉ）ＲＵＮＸ１阻害剤、ＲＵＮＸ２阻害剤、ＲＵＮＸ３阻害剤もしくはＣＢＦｂ阻害剤を前記被験体に投与するステップ；ならびに
    ｉｉｉ）前記被験体由来の細胞を分析して、対照被験体と比較した、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３もしくはＣＢＦβの前記遺伝的喪失の生物学的影響および／または前記ＲＵＮＸ１阻害剤、前記ＲＵＮＸ２阻害剤、前記ＲＵＮＸ３阻害剤もしくは前記ＣＢＦβ阻害剤の生物学的影響を決定するステップ
    を含む、方法。
34. 前記阻害剤が、Ｒｏ ５－３３３５、ＡＩ－１０－４９、またはＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３および／もしくはＣＢＦβに対する中和抗体である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記被験体がマウスである、請求項３０または３３に記載の方法。
36. 前記細胞が、前記被験体の肺、心臓、腎臓、肝臓、腸、皮膚または骨髄に由来する、請求項３０または３３に記載の方法。
37. 前記モデルが、肺、肝臓、腎臓、皮膚、腸または骨髄における線維症のための疾患モデルである、請求項３０または３３に記載の方法。

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