WO2015097920A1

WO2015097920A1 - 角膜内皮細胞の細胞治療併用剤

Info

Publication number: WO2015097920A1
Application number: PCT/JP2013/085359
Authority: WO
Inventors: 範子小泉; 直毅奥村; 木下　茂
Original assignee: 京都府公立大学法人; 学校法人同志社; 千寿製薬株式会社
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-07-02
Also published as: US10959997B2; US20160317528A1

Abstract

本発明は、角膜内皮細胞およびミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。より詳細には、前記ミオシンＩＩ特異的阻害剤はブレビスタチンである。前記疾患、障害または状態は、代表的にフックス角膜内皮ジストロフィまたは角膜内皮不全（水疱性角膜症）に関する障害である。角膜内皮疾患の処置または予防のための方法であって、該方法は被験体に対して有効量のミオシンＩＩ特異的阻害剤を角膜内皮細胞とともに投与する工程を包含する、方法もまた提供される。

Description

角膜内皮細胞の細胞治療併用剤

　本発明は、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤等に関する。より詳細には、本発明は、角膜内皮細胞の細胞治療併用剤に関する。

　視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
　ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。例えば、フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Ｃｏｒｎｅａｌ　ｇｕｔｔａｅ）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Ｃｏｒｎｅａｌ　ｇｕｔｔａｅ）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のＱＯＬを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
　フックス角膜内皮ジストロフィについては、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。
　非特許文献１−６は、ＲＯＣＫ阻害剤に関する研究が記載されている。

特表２０１３−５４１３４４公報

Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ：Ｖｏｌ．３１３，Ｎｏ．１６，Ｐａｇｅ．３６１６−３６２３（２００７．１０．０１）Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ：Ｖｏｌ．１８１，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅ．２６８−２７７（２０１２．０７）角膜カンファランス２０１３予稿集第３８頁、一般口演５、内皮基礎２０２０医学のあゆみ：Ｖｏｌ．２４１，Ｎｏ．１０，Ｐａｇｅ．７６５−７７０（２０１２．０６．０９）Ｉｎｔ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ：Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．３，Ｐａｇｅ．Ａ１５（２０１１．０６）同志社大学理工学研究報告：Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．４，Ｐａｇｅ．２６１−２６６（２０１２．０１．３１）

　本発明者らは、ミオシンＩＩを阻害することにより、角膜内皮を処置または予防し得る技術を見出し、本発明を完成した。したがって、本発明は以下のような発明を提供する。
（１）角膜内皮細胞と、ミオシンＩＩ特異的阻害剤とを含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬。
（２）前記ミオシンＩＩ特異的阻害剤はブレビスタチンである、項目（１）に記載の処置または予防薬。
（３）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィ、または角膜内皮不全（水疱性角膜症）に関する障害である、項目（１）または（２）に記載の処置または予防薬。
（４）前記疾患、障害または状態は、外傷または眼科手術に起因するものである、項目（１）~（３）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（５）前記疾患、障害または状態は、水疱性角膜症における羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、眼の不快感、コントラスト低下，グレア、角膜実質の浮腫および角膜混濁からなる群より選択されるものである、項目（１）~（４）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（６）前記角膜内皮は霊長類のものである、項目（１）~（５）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（７）前記角膜内皮はヒトのものである、項目（１）~（６）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（８）さらなる医薬成分を含む、項目（１）~（７）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（９）ミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬。
（１０）ミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬であって、該ミオシンＩＩ特異的阻害剤は、角膜内皮細胞とともに投与されることを特徴とする、処置または予防薬。
（１１）点眼薬である、項目（９）または（１０）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ２）前記ミオシンＩＩ特異的阻害剤はブレビスタチンである、項目（９）~（１１）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ３）前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィ、または角膜内皮不全（水疱性角膜症）に関する障害である、項目（９）~（１１）または（Ａ２）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ４）前記疾患、障害または状態は、外傷または眼科手術に起因するものである、項目（９）~（１１）または（Ａ２）~（Ａ３）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ５）前記疾患、障害または状態は、水疱性角膜症における羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、眼の不快感、コントラスト低下，グレア、角膜実質の浮腫および角膜混濁からなる群より選択されるものである、項目（９）~（１１）または（Ａ２）~（Ａ４）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ６）前記角膜内皮は霊長類のものである、項目（９）~（１１）または（Ａ２）~（Ａ５）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ７）前記角膜内皮はヒトのものである、項目（９）~（１１）または（Ａ２）~（Ａ６）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（Ａ８）さらなる医薬成分を含む、項目（９）~（１１）または（Ａ２）~（Ａ７）のいずれかに記載の処置または予防薬。
（１２）角膜内皮疾患の処置または予防のためのミオシンＩＩ特異的阻害物質。
（１３）角膜内皮疾患の処置または予防のためのミオシンＩＩ特異的阻害物質であって、該ミオシンＩＩ特異的阻害物質は、角膜内皮細胞とともに投与されることを特徴とする、ミオシンＩＩ特異的阻害物質。
（１４）角膜内皮疾患の処置または予防のための方法であって、該方法は被験体に対して有効量のミオシンＩＩ特異的阻害剤を角膜内皮細胞とともに投与する工程を包含する、方法。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　本発明は、ミオシンＩＩ特異的阻害剤を用いて角膜内皮に関連する疾患を処置または予防し得る医薬であって点眼薬等でも実現可能な技術を提供する。特に角膜内皮を移植する際の定着を格段に向上させるものとして注目される。
　また、本発明では、ミオシンＩＩ特異的阻害剤を用いた治療が、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）と同程度の効果が奏されることが確認された。Ｙ−２７６３２が特に水疱性角膜症の動物モデルにおいて１０−１００μＭで有効性を示すのに対し、本発明は１μＭ、３μＭおよび１０μＭで有効性を示す。本発明は、Ｙ−２７６３２よりもさらに下流のシグナル経路を抑制することによって同程度の角膜透明性の改善効果が得られていることから、副作用を抑えた効果的な医薬が提供されると期待される。

図１は、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤による細胞接着の検討と接着関連分子への影響の結果を示す。ＲＯＣＫ阻害剤を添加してＲｈｏ−ＲＯＣＫ経路を阻害することによる細胞接着への影響を調べた。左の図はＲＯＣＫ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った結果を示す。その結果コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べるとＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を添加した場合、接着細胞数が優位に増加していることが分かった。右の図はＲＯＣＫ阻害剤添加後のＲｈｏ−ＲＯＣＫ経路および接着関連分子の活性をウェスタンブロット法により測定した結果を示す。Ｙ−２７６３２を添加することによってミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化を抑制することが確認することができた。また接着関連分子である接着斑キナーゼ（ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｋｉｎａｓｅ；ＦＡＫ）およびパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）のリン酸化が早期に起こることが確認することができた。図２は、ＲｈｏＡ阻害剤による細胞接着の検討と接着関連分子への影響を示す。ＲｈｏＡ阻害剤（ボツリヌスＣ３酵素）の作用を用いて細胞接着への影響を調べた。左の図はＲｈｏＡ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った結果を示す。その結果コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べるとＲｈｏＡ阻害剤であるＣ３を添加した場合、接着細胞数が優位に増加していることが分かった。右の図はＲｈｏＡ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロットにて測定した結果を示す。ＲｈｏＡ阻害剤であるＣ３を添加することによって接着関連分子であるＦＡＫおよびパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）のリン酸化が促進されることが確認することができた。図３は、ＭＬＣリン酸化阻害剤による細胞接着の検討した結果を示す。Ｒｈｏ−ＲＯＣＫ経路の下流でありその活性化によりリン酸化されるＭＬＣの細胞接着への関与を検討した。左の図はｐ−ＭＬＣ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った結果を示す。その結果コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べるとｐ−ＭＬＣ阻害剤であるブレビスタチン（Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）を添加した場合、接着細胞数が有意に増加していることが示された。右の図はｐ−ＭＬＣ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロット法を用いて測定した結果を示す。ブレビスタチンを添加することによって接着関連分子であるパキシリンのリン酸化が早期に起こることが確認することができた。図４は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の前眼部写真を示す。左から処置後３日目、７日後、１４日後を示す。上段は、角膜内皮を掻爬したウサギの水疱性角膜症モデル眼に、培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をブレビスタチンを最終濃度１０μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせたものを示す。下段は同様に培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をＹ−２７６３２を最終濃度１００μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせたものを示す。図５は、上段はコントロールとして角膜内皮を掻爬したウサギの水疱性角膜症モデルの前眼部写真を示す。下段は角膜内皮を掻爬したウサギの水疱性角膜症モデル眼に、培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせたものを示す。左から処置後３日目、７日後、１４日後を示す。図６は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の角膜厚を示す。Ｘ軸は日数（日）を示し、Ｙ軸は角膜厚（μｍ）を示す。太線および黒丸はブレビスタチンを示し、破線および白丸はＹ−２７６３２を示す。投与量等は図５等と同様である。図７は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の眼圧を示す。Ｘ軸は日数（日）を示し、Ｙ軸は眼圧（ｍｍＨｇ）を示す。太線および黒丸はブレビスタチンを示し、破線および白丸はＹ−２７６３２を示す。投与量等は図５等と同様である。図８は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の免疫組織学的検討結果を示す。左から細胞機能を表すＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびファロイディン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）の染色結果を示す。上段からブレビスタチン、Ｙ−２７６３２、正常（処置なしのコントロール）の結果である。図９は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の前眼部写真を示す。左から処置後３日目、７日後、１４日後を示す。上段は、角膜内皮を掻爬したウサギの水疱性角膜症モデル眼に、培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をブレビスタチンを最終濃度１μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせたものを示す。下段は同様に培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をブレビスタチンを最終濃度３μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせたものを示す。図１０は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の角膜厚を示す。Ｘ軸は日数（日）を示し、Ｙ軸は角膜厚（μｍ）を示す。破線および黒丸はブレビスタチン１μＭを示し、太線および黒四角はブレビスタチン３μＭを示す。図１１は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の免疫組織学的検討結果を示す。左から細胞機能を表すＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎおよびファロイディン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）の染色結果を示す。上段からブレビスタチン１μＭ、３μＭの結果である。図１２は、本発明により解明されたＲｈｏ／　ＲＯＣＫ／ＭＬＣ経路の制御による細胞接着の促進のスキームを示す。本実施例の結果から、細胞は浮遊状態においてはＲｈｏＡの活性が上がり、ＲＯＣＫの活性も上がり、ＭＬＣのリン酸化が進むことで、接着関連分子であるＦＡＫ、パキシリンのリン酸化、ビンキュリン（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）の発現が抑制されることで細胞基質間接着が阻害されていたと考えられる。そしてブレビスタチンを添加することでＭＬＣのリン酸化活性を抑制することでアクチンの収縮が抑制され、接着関連分子の活性を促進することで角膜内皮細胞の基質接着性が促進するという結果が得られた。

　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（定義）
　本明細書において「ミオシンＩＩ特異的阻害剤」とは、ミオシンのうちＩＩ型を特異的に阻害する任意の薬剤をいう。特に、この阻害剤は、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化を阻害するものが利用される。このような薬剤としては、例えば、ブレビスタチン（Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ；なお、ブレビスタチンには鏡像異性体の（−）体と（＋）体とがあり、（−）体が効果を持ち、（＋）体には効果がない。）、ミオシンＩＩ特異的抗体、ミオシンＩＩ特異的ｓｉＲＮＡ、ミオシンＩＩ特異的ペプチドアプタマー、ミオシンＩＩ特異的アンチセンス、ミオシンＩＩ特異的ｓｈＲＮＡ、ミオシンＩＩ特異的デコイなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
　このほか、本発明で使用され得るミオシンＩＩ阻害剤としては、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：Ｇｏ　７８７４，Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（カタログ番号３６５２５２）、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ^ＴＭ　Ｋ−２５２ａ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ．（カタログ番号４２０２９７）、Ｋ−２５２ａ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ．（カタログ番号４２０２９８）、ＭＬ−７，Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（カタログ番号４７５８８０）、ＭＬ−９，Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（カタログ番号４７５８８２）、Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｐｅｐｔｉｄｅ１８（カタログ番号４７５９８１）、Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ（カタログ番号５２７９４８）、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．（カタログ番号５６９３９７）、Ｗ−１２，Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（カタログ番号６８１６３５）、Ｗ−１３，Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（カタログ番号６８１６３６）（以上、いずれもＭｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能）、ＢＤＭ（２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ　ｍｏｎｏｘｉｍｅ）（一般的なミオシンＩＩの阻害剤として使用されるが、骨格筋ミオシンＩＩには作用があるものの、非筋ミオシンＩＩに対しては阻害効果がないこと、むしろアクチン重合への阻害が見られることがわかっている。）等。これらの阻害剤は、特異性が十分でない場合、特異的に送達する系を用いて特異性を持たせることができる。
　本明細書において「ミオシンＩＩ」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられ、アクチンを制御するタンパク質であり、２本ずつの重鎖と、個々の重鎖に２本ずつの軽鎖（必須軽鎖（ＥＬＣ；ＬＣ１；ＭＬＣ_１７）および調節軽鎖（ＲＬＣ；ＬＣ２；ＭＬＣ_２０））の、合計６本のポリペプチド鎖からなる複合体である。重鎖はアイソフォームＡ、ＢおよびＣに対応するものとして、ＭＹＨ９、ＭＹＨ１０およびＭＨＹ１４の３遺伝子が対応している。重鎖は、それぞれ個々に二種類の軽鎖と複合体化する。理論に束縛されることを望まないが、重鎖および軽鎖については本発明の目的に合致するかぎりいずれのアイソフォームについても対象とすることができることが理解される。理論に束縛されることを望まないが、本発明はミオシンＩＩの機能が抑制または遮断される限り、どのような薬剤であっても用いられ得ることが理解される。好ましくは、理論に束縛されることを望まないが、ミオシン軽鎖の機能が抑制または遮断されれば効果が発揮されると考えられ、特に、そのリン酸化を抑制または遮断されれば効果が発揮されると考えられることから、同様の阻害剤が好ましくあり得るがこれに限定されない。
　本発明における使用のための適したミオシンＩＩ特異的阻害剤はまた、ミオシンＩＩの量または活性を阻害するそれらの能力が保持される限り、前述のミオシンＩＩ特異的阻害剤の機能的変異体、変異体、誘導体、および類似体をも含む。本明細書において使用される「変異体」、「誘導体」、および「類似体」は、親化合物に対して同様の形または構造を有し、ミオシンＩＩ特異的阻害剤として作用する能力を保持する分子を指す。例えば、本明細書において開示されるミオシンＩＩ特異的阻害剤のいずれも、結晶化されてもよく、有用な類似体は、（１つまたは複数の）活性部位の形のための担う座標に基づいて合理的に設計され得る。その代わりに、当業者は、不必要な実験を伴うことなく、知られているミオシンＩＩ特異的阻害剤の官能基を改変し得、あるいは活性、半減期、生物学的利用能、または他の望ましい特徴の増加についてそのような改変分子をスクリーニングし得るミオシンＩＩ特異的阻害剤がポリペプチドである場合、ポリペプチドの断片および改変体は、送達の容易さ、活性、半減期などを増加させるために産生され得る（例えば、上記に議論されるようなヒト化抗体または機能的抗体断片）。合成および組換えポリペプチドの産生の当技術分野における技術のレベルを考慮すれば、そのような改変体は、不必要な実験を伴うことなく、達成される可能性がある。当業者らはまた、本明細書において記載されるミオシンＩＩ特異的阻害剤の結晶構造および／または活性部位についての知識に基づいて新規な阻害剤を設計してもよい。ミオシンＩＩ特異的阻害剤はまた、ポリペプチド（抗体等）の場合、遺伝子移入を介して有効に導入され得る。したがって、本発明の方法のある実施形態は、ミオシンＩＩ特異的阻害剤の発現のための適したベクターの使用を含む。ある好ましい実施形態において、ミオシンＩＩ特異的阻害剤の投与は、ミオシンＩＩ特異的阻害剤をコードするｃＤＮＡを含むベクターを使用する遺伝子移入によって達成することができ、このベクターは、ベクターを用いて形質移入される細胞中でミオシンＩＩ特異的阻害剤のｉｎ　ｓｉｔｕ発現を引き起こし、ミオシンＩＩの活性を阻害し、ミオシンＩＩ媒介性の線維形成を抑制する。任意の適したベクターを使用することができる。好ましいベクターは、遺伝子移入の目的で開発されたアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。遺伝子移入の他の非ベクター方法、例えば脂質／ＤＮＡ複合体、タンパク質／ＤＮＡ抱合体、裸のＤＮＡの移入方法などもまた使用することができる。
　１つの例示的な実施形態において、ミオシンＩＩ特異的阻害剤は、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、およびミオシンＩＩに結合する能力を保持する他の「抗体」型といったようなそのフラグメントへのミオシンＩＩ結合を遮断する抗体である。その抗体は、キメラ化またはヒト化され得る。本明細書中、キメラ化抗体は、ヒト抗体の定常領域、およびマウス抗体といったような非ヒト抗体の可変領域を含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常領域およびフレームワーク可変領域（すなわち、超可変領域以外の可変領域）、ならびにマウス抗体といったような非ヒト抗体の超可変領域を含む。勿論、その抗体は、ファージ提示システムから選択されるもしくは選抜されるか、またはゼノマウスから産生されるヒト抗体といったような、いずれかの他の種類の抗体誘導体であり得る。
　本明細書において、「（ミオシンＩＩ等の）発現を抑制する物質（例えば、核酸）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、またはｍＲＮＡからの蛋白質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはこれらの発現ベクター等の核酸などが例示される。その中でも、ｓｉＲＮＡおよびその発現ベクターが好ましく、特にｓｉＲＮＡが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、本発明において標的遺伝子は、ミオシンＩＩのシグナル伝達経路に関与する任意の遺伝子である。
　本発明において標的とされるミオシンＩＩ等の特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上，新生化学実験講座２　核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７）。
　本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のミオシンＩＩのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のミオシンＩＩ等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のミオシンＩＩ等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するミオシンＩＩ等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明で用いられるアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２　核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、ミオシンＩＩ等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
　ミオシンＩＩ等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ　Ｐに含まれるＭ１　ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
　例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７０５９．）。
　また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆　Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてミオシンＩＩ等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
　ミオシンＩＩ等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
　本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５~４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ミオシンＩＩ等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。ミオシンＩＩ等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
　二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５~４０塩基、好ましくは１５~３０塩基、より好ましくは１５~２５塩基、更に好ましくは１８~２３塩基、最も好ましくは１９~２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１~３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
　さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１~数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１~数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１~４塩基、さらに好ましくは１~３塩基、最も好ましくは１~２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０~３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１~３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションし得ること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
　さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ　Ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
　ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
　本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
　ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
　本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２~５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
　さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、ミオシンＩＩ等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
　本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
　修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
　本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、ミオシンＩＩまたは他のミオシンＩＩシグナルのメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
　また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞（例えば、角膜内皮細胞）に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、ＯＣＨＩＹＡ，Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，１：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸または医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ　Ｆ．ＰＮＡＳ．（２００３）１０２（３４）１２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ　Ｙ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００４）３２（１３）ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において、「角膜内皮の疾患、障害または状態」とは、角膜内皮の任意の疾患、障害または状態をいい、特にミオシンＩＩに関連するものをいう。そのようなものとしては、たとえば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜内皮炎、外傷、眼科手術等を挙げることができる。このような障害としては、たとえば、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、水疱性角膜症、角膜混濁等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
　本明細書において「角膜内皮細胞」としては、任意の角膜内皮細胞を用いることができ、初代培養細胞のものはもちろん、継代培養、増殖させたもの、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）等の未分化細胞から分化誘導させたもの等を用いることができる。本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。本発明では、出願人の以前の技術であるＷＯ２０１３／１００２０８に記載の手法を用いて正常な角膜内皮細胞を調製したものを用いることができるが、これに限定されない。
　本明細書において「未分化細胞」とは、分化能がある任意の細胞をいう。従って、未分化細胞には、幹細胞のほか、一定程度分化しているが、さらになお分化し得る細胞を包含する。
　本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。本発明では、単離された角膜内皮細胞を用いることができる。
　本明細書において細胞の「正常細胞機能」とは、角膜内皮細胞等の具体的細胞について言う場合、その細胞が本来有している機能をいう。角膜内皮細胞についていえば、そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｋｅｙ：ａ　ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ　Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｍｏｎｋｅｙ：ａｎ　ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，Ｈｙｎｄｉｕｋ　ＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｗｏｕｎｄ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｔｅ　ｃｏｒｎｅａ，Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎ　Ｈｏｒｎ　ＤＬ，Ｓｅｎｄｅｌｅ　ＤＤ，Ｓｅｉｄｅｍａｎ　Ｓ，Ｂｕｃｏ　ＰＪ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｄ　ｃａｔ，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９７７，１６：５９７−６１３）等が挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、正常細胞機能を有することが確認された角膜内皮細胞を用いることが好ましい。
　ＺＯ−１およびＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅは、遺伝子の発現を免疫的な手段またはＲＴ−ＰＣＲ等の核酸レベルでの発現をみることによって評価することができる。Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能していることを確認することによって、対象の細胞が正常の機能を有しているかどうかを確認することができる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ　Ｊｏｙｃｅらの報告｛Ｊｏｙｃｅ，２００４　＃１６１｝｛Ｊｏｙｃｅ，２００３＃７｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　（好ましい実施形態の説明）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
　（ミオシンＩＩ阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防）
　１つの局面において、本発明はミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。本発明では、角膜内皮の疾患、障害または状態を、ミオシンＩＩ特異的阻害剤を投与することによって、予想外に角膜内皮の疾患、障害または状態を改善、予防または治癒させることができたことを見出した。したがって、このようなミオシンＩＩ特異的阻害剤の角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防のための用途は従来の知見からは予想できなかった用途であるといえる。
　好ましい局面では、本発明は、角膜内皮細胞と、ミオシンＩＩ特異的阻害剤とを含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。ミオシンＩＩ特異的阻害剤の効果は、角膜内皮細胞を外的に付与するときに顕著に発揮される。理論に束縛されることを望まないが、角膜内皮細胞の角膜への定着を促進するものと考えられる。
　好ましい実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、水疱性角膜症に関する障害である。水疱性角膜症は現在のところ、根本的な治療方法や技術が存在せず、水疱性角膜症の治療は角膜移植に頼らざるを得なかった。本発明は、水疱性角膜症を顕著に治療または予防し得ることから、水疱性角膜症の処置または予防に有用であることが理解される。
　１つの特定の実施形態では、本発明が対象とする疾患、障害または状態は、水疱性角膜症における羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、眼の不快感、コントラスト低下，グレア、角膜実質の浮腫、角膜混濁等を含むがこれらに限定されない。
　本発明の処置または予防薬または方法の投与（移植）対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
　本発明で用いられるミオシンＩＩ特異的阻害剤は、ミオシンＩＩを阻害することができる限り、どのような薬剤（ａｇｅｎｔ）を用いてもよい。また、阻害されるべきミオシンＩＩ特異的伝達経路は、周知のように、ミオシンＩＩの鎖（重鎖または軽鎖）が直接関連するもののほか、最終的にミオシンＩＩのシグナル伝達経路と同様（阻害剤・アンタゴニスト等であれば正反対）の効果を発揮するものであれば、どのようなシグナルに関連する因子であってもよい。特に実施例では、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化を阻害する薬剤を用いて効果が生じていることから、このようなＭＬＣのリン酸化を阻害する薬剤が好ましく用いられ得るがこれに限定されない。
　本発明においては、ミオシンＩＩ特異的阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
　１つの実施形態では、ミオシンＩＩ特異的阻害剤は、ミオシンＩＩのアンタゴニスト、ミオシンＩＩのサブユニットのリン酸化阻害剤、特にＭＬＣのリン酸化阻害剤、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。このような各成分は本明細書において他の箇所で説明された任意のものを利用することができる。
　１つの実施形態では、本発明において用いられ得るミオシンＩＩ特異的阻害剤は、ブレビスタチン、ミオシンＩＩ特異的抗体、ミオシンＩＩ特異的ｓｉＲＮＡ、ペプチドアプタマー、ｓｈＲＮＡ、デコイ、アンチセンス、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。なお、言及した抗体は中和抗体であってもよいがこれに限定されない。
　好ましい実施形態では、本発明において用いられるミオシンＩＩ特異的阻害剤は、ブレビスタチン（（Ｓ）−（−）−Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ；ＣＡＳ　Ｎｏ：８５６９２５−７１−８；参考文献；Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１７４３（２００３））を含む。フックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）異常に関連する疾患、障害または状態が改善されることが示されたからである。好ましい実施形態では、ブレビスタチンは、使用時に約０．１μＭ~約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、好ましくは、使用時に約１μＭ~約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、さらに好ましくは使用時に約１μＭの濃度で存在するように含まれる。
　本発明で使用されるミオシンＩＩ特異的阻害剤の濃度は、通常約０．１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１~３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１~７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５０μｍｏｌ／ｌ、約１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~５．０μｍｌ／ｌ、約１．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
　本発明の処置または予防薬は、さらなる医薬成分を含んでいてもよい。そのような医薬製品の代表例としては、ＲｈｏＡ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ステロイドを挙げることができる。理論に束縛されることを望まないが、ＲｈｏＡ阻害剤、および／またはＲｈｏキナーゼ阻害剤および／またはステロイドを含めることにより、角膜内皮細胞の接着を亢進することによって細胞の脱落を防止し、良好な細胞形態および高い細胞密度を持った角膜内皮細胞層の形成を可能とするため、ミオシンＩＩ特異的阻害剤の効果を強化することができるからである。本発明においては、１種類のＲｈｏＡ阻害剤、および／またはＲｈｏキナーゼ阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
　本発明において使用され得るＲｈｏＡ阻害剤としては、ボツリヌスＣ３酵素（Ｃ３）、ＲｈｏＡ特異的抗体、ＲｈｏＡ特異的ｓｉＲＮＡ、ペプチドアプタマー、ｓｈＲＮＡ、デコイ、アンチセンス、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。なお、言及した抗体は中和抗体であってもよいがこれに限定されない。
　本発明において使用され得るＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物、Ｒｈｏキナーゼ特異的抗体、Ｒｈｏキナーゼ特異的ｓｉＲＮＡ、ペプチドアプタマー、ｓｈＲＮＡ、デコイ、アンチセンス、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。なお、言及した抗体は中和抗体であってもよいがこれに限定されない。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができ、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などを挙げることができる。
　本発明中のＲｈｏＡ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ステロイドの濃度は、通常約１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約５~２０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１０μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１~１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１~７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５０μｍｏｌ／ｌ、約１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０~１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５~５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０~５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５~３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０~３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９~３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５~１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５~１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
　本発明は、点眼剤として投与することができる。
　投与量、投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態により異なるが、通常成人に対し、例えば点眼剤として使用する場合には、有効成分を約０．０００１~０．１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００３~０．０３ｗ／ｖ％含有する製剤を、１日あたり１~１０回、好ましくは１~６回、より好ましくは１~３回、１回当たり約０．０１~０．１ｍＬ投与することができる。本発明の処置または予防薬を前房内に注入する場合には、上記濃度の１０分の１~１０００分の１の濃度のものが使用され得る。当業者は疾患の状態によって、ミオシンＩＩ特異的阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤等の種類および濃度を適宜選択することができる。
　１つの局面において、本発明は、ミオシンＩＩ特異的阻害剤と角膜内皮細胞とを含む角膜内皮製剤を提供する。
　１つの局面において、本発明の角膜内皮製剤は、基材と、その基材上の試験管内で培養した角膜内皮細胞層とを含有する。
　本発明において使用される基材とは、培養角膜内皮細胞層を担持し、移植後一定期間好ましくは少なくとも３日間は生体内でもその形状を維持し得るものであれば特に限定されるものではない。また、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞を試験管内で培養する場合のスキャフォールドとしての役割を有するものであってもよく、培養後の角膜内皮細胞層を担持させる役割のみを有するものであってもよい。好ましくは、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞の培養に用いられ、培養完了後にそのまま移植に供することが可能なスキャフォールドとしての役割を有するものである。
　本発明において使用される基材としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜などがあげられる。
　本発明において使用される基材の形状は、角膜内皮細胞層を担持し、移植に適する形状であれば特に限定されるものではないが、シート状であることが好ましい。本発明の製剤がシート状の場合、移植時に適用部位に合わせた大きさに切断して用いることができる。また、シートを小さく丸めた後、創口から挿入することも可能である。好ましい具体例として、障害した角膜内皮の面積の約８割を覆う円形の形状が例示される。また、適用部位に密着可能なように、この円形の周辺部に切り込みを入れることも好ましい。
　好ましい実施形態において、本発明において使用される基材の例はコラーゲンである。コラーゲンとしては、特開２００４−２４８５２号公報に記載のコラーゲンシートが好適に使用できる。かかるコラーゲンシートは、特開２００４−２４８５２号公報に記載の方法に従って、例えば、羊膜から調製することができる。
　以下に角膜内皮製剤の一例として角膜内皮細胞層の調製を記載する。
　本発明で使用される角膜内皮細胞層は、以下の特徴を少なくとも１つ備えるものであることが好ましい。より好ましくは、以下の特徴を２つ以上、さらにより好ましくは全て備えるものである。
（１）細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
（２）細胞層における細胞密度は約１，０００~約４，０００細胞／ｍｍ^２である。特に、成人をレシピエント（移植者）とする場合には約２，０００~約３，０００細胞／ｍｍ^２であることが好ましい。
（３）細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
（４）細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
　本発明で使用される角膜内皮細胞の採取および試験管内での培養は以下のようにして行うことができる。
　角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、適切な培養液中で角膜内皮細胞を培養する。適切な培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０等を）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらにトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル阻害剤等の線維化抑制剤等の培養正常化剤（代表的には、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）を挙げることができるがこれに限定されない。詳細には、ＷＯ２０１３／１００２０８を参照することができる。）の成分を添加したものを使用することができる。培養容器（培養皿）にはその表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をＦＮＣ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。かかるコーティングと適切な培養液とを併用することにより、角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。
　角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃~約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃~約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５~１０％のＣＯ_２濃度の環境下で行われる。
　培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に上述の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約１~２×１０^６個／ｍＬである。尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば、５００ｒｐｍ（３０×ｇ）~１０００ｒｐｍ（７０×ｇ）、１~１０分を挙げることができる。
　細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代時の希釈倍率は細胞の状態によっても異なるが、約１：２~１：４、好ましくは約１：３である。継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７~３０日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。上述の培養正常化剤または適切な培養液において、細胞接着促進剤を用いれば、培養初期の細胞接着を亢進させることにより、培養期間の短縮が可能となる。
　角膜内皮細胞層の調製は以下のようにして行うことができる。細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約１，０００~約４，０００細胞／ｍｍ^２の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば３~３０日間である。
　以上のようにして培養を行うことにより、基材上に試験管内で培養した角膜内皮細胞層が形成された角膜内皮製剤が得られる。
　このような角膜内皮製剤は、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィ、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害によって生じる水疱性角膜症の治療における移植片として用いることができる。このような水疱性角膜症、角膜内皮障害などの原因としては、手術のほかフックス角膜内皮ジストロフィ、偽落屑症候群、角膜内皮炎等を挙げることができる。
　別の局面において、本発明は、角膜内皮の疾患、障害または状態の改善、治癒、処置または予防のためのミオシンＩＩ特異的阻害物質を提供する。ミオシンＩＩ特異的阻害物質は、ミオシンＩＩ特異的阻害剤と交換可能に使用され得る。この用途において、角膜内皮の疾患、障害または状態およびミオシンＩＩ特異的阻害剤については、本明細書において説明した任意の実施形態を使用することができる。
　別の局面において、本発明は、被験体における角膜内皮の疾患、障害または状態の改善、治癒、処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のミオシンＩＩ特異的阻害剤を投与する工程を包含する、方法を提供する。この方法において、角膜内皮の疾患、障害または状態およびミオシンＩＩ特異的阻害剤については、本明細書において説明した任意の実施形態を使用することができる。
　本発明の治療もしくは予防薬または方法の投与（移植）対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　（参考例１：ＲＯＣＫ阻害剤による細胞接着の検討と接着関連分子への影響）
　参考例１では、ＲＯＣＫ阻害剤を添加してＲｈｏ−ＲＯＣＫ経路を阻害することによる細胞接着への影響を調べた。
　（材料および方法）
　（角膜組織）
　本実験で使用した全てのサル角膜組織は、他の研究目的により安楽死したカニクイザル（日精バイリス株式会社滋賀研究所（ＮｉｓｓｅｉＢｉｌｉｓ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎ、株式会社ケアリー（Ｋｅａｒｉ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）の角膜を使用した。全ての角膜を、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。
　（細胞培養）
　サル角膜内皮細胞初代培養では、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ａ（カタログ番号：７０１６４９２３；Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れて３７℃でインキュベートした。１２時間後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（カタログ番号：０４０７；Ａｔｈｅｎａ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ（カタログ番号：１２３２０；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％　ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；カタログ番号：１３２５６−０２９；ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものを使用した。
　培地交換は２日ごとに行った。継代は５０~８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ^２＋Ｍｇ^２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Ｎｉｓｓｕｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ．Ｊａｐａｎ）で細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ（カタログ番号：１２５６３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ　５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２~３の密度で細胞を播種した。
　（接着細胞数の検討）
　ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒを用いて接着細胞数の解析を行った。まず、９６ｗｅｌｌプレートに最終濃度１０μＭとなるようにＹ−２７６３２（Ｗａｋｏ、カタログ番号：２５１−００５１４）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５０００個／ｗｅｌｌの培養サル角膜内皮細胞を播種した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。播種して３時間後にＰＢＳ（−）で洗浄を行い、タッピングでＰＢＳ（−）を除去した。そこに室温に戻しておいたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒの試薬と培地を１：１で添加して遮光で１０分間振盪して、さらに１０分間静置して平衡化した。その後白色プレートに移し、吸光度を測定した。
　（ウェスタンブロット法）
　最終濃度１０μＭとなるようにＹ−２７６３２を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに培養サル角膜内皮細胞を播種し経時的に０，１，３，２４時間後に、ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製、カタログ番号：ＥＨ−２２２２）に転写した。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ　ＮａＣｌ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、Ｐｈｏｓｐｈｏ　Ｍｙｏｓｉｎ　Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ２（Ｔｈｒ１８／Ｓｅｒ１９）（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：３６７４）、Ｐｈｏｓｐｈｏ　ＦＡＫ（Ｙ３９７）（Ｄ２０Ｂ１）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：８５５６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ　Ｐａｘｉｌｌｉｎ（Ｔｙｒ１１８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２５４１）、ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２１１８）に対する抗体を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：７０７４Ｐ２）とウサギ−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＮＡ９３４）インキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ）で発光させたバンドを検出した。
　（結果）
　図１にその結果を示す。図１左はＲＯＣＫ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った結果である。その結果コントロールと比べるとＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を添加した場合、接着細胞数が有意に増加していることが分かった。
図１右はＲＯＣＫ阻害剤添加後のＲｈｏ−ＲＯＣＫ経路および接着関連分子の活性をウェスタンブロット法により測定した結果である。Ｙ−２７６３２を添加することによってＭＬＣのリン酸化を抑制することが確認できた。また接着関連分子であるＦＡＫおよびパキシリンのリン酸化が早期に起こることが確認できた。
（参考例２：ＲｈｏＡ阻害剤による細胞接着の検討と接着関連分子への影響）
　参考例２では、ＲｈｏＡ阻害剤（ボツリヌスＣ３酵素）の作用を用いて細胞接着への影響を調べた。
　（材料および方法）
　手短には、ＲｈｏＡ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った。また、ＲｈｏＡ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロット法で測定した。
　（接着細胞数の検討）
　ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒを用いて接着細胞数の解析を行った。まず、９６ｗｅｌｌプレートに最終濃度３００ｎｇ／ｍｌとなるようにＣ３ボツリヌス毒素（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、カタログ番号：３４１２０８）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５０００個／ｗｅｌｌの培養サル角膜内皮細胞を播種した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。播種して３時間後にＰＢＳ（−）で洗浄を行い、タッピングでＰＢＳ（−）を除去した。そこに室温に戻しておいたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒの試薬と培地を１：１で添加して遮光で１０分間振盪して、さらに１０分間静置して平衡化した。その後白色プレートに移し、吸光度を測定した。
　（ウェスタンブロット法）
　最終濃度３００ｎｇ／ｍｌとなるようにＣ３ボツリヌス毒素を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに培養サル角膜内皮細胞を播種し経時的に０，１，３，２４時間後に、ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製、カタログ番号：ＥＨ−２２２２）に転写した。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ　ＮａＣｌ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、Ｐｈｏｓｐｈｏ　ＦＡＫ（Ｙ３９７）（Ｄ２０Ｂ１）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：８５５６）、Ｐｈｏｓｐｈｏ　Ｐａｘｉｌｌｉｎ（Ｔｙｒ１１８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２５４１）、ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２１１８）に対する抗体を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：７０７４Ｐ２）とウサギ−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＮＡ９３４）インキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ）で発光させたバンドを検出した。
　（結果）
　結果を図２に示す。図２左はＲｈｏＡ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により接着細胞数を評価することで行った結果を示す。その結果コントロールと比べるとＲｈｏＡ阻害剤であるＣ３を添加した場合、接着細胞数が有意に増加していることが分かった。図２右はＲｈｏＡ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロット法にて測定した結果である。ＲｈｏＡ阻害剤であるＣ３を添加することによって接着関連分子であるＦＡＫおよびパキシリンのリン酸化が促進されることが確認できた。
　（実施例１：ＭＬＣリン酸化阻害剤による細胞接着の検討）
　本実施例では、Ｒｈｏ−ＲＯＣＫ経路の下流でありその活性化によりリン酸化されるＭＬＣの細胞接着への関与を検討した。
　（材料および方法）
　手短には、ｐ−ＭＬＣ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＲにより接着細胞数を評価することで行った。また、ｐ−ＭＬＣ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロット法を用いて測定した。
　（接着細胞数の検討）
　ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒを用いて接着細胞数の解析を行った。まず、９６ｗｅｌｌプレートに最終濃度１００μＭとなるようにブレビスタチン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、カタログ番号：２０３３９１）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５０００個／ｗｅｌｌの培養サル角膜内皮細胞を播種した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。播種して３時間後にＰＢＳ（−）でｗａｓｈを行い、タッピングでＰＢＳ（−）を除去した。そこに室温に戻しておいたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^Ｒの試薬と培地を１：１で添加して遮光で１０分間振盪して、さらに１０分間静置して平衡化した。その後白色プレートに移し、吸光度を測定した。
　（ウェスタンブロット法）
　最終濃度１００μＭとなるようにブレビスタチンを添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに培養サル角膜内皮細胞を播種し経時的に０，１，３，２４時間後に、ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。コントロールとしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ　ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製、カタログ番号：ＥＨ−２２２２）に転写した。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ　ＮａＣｌ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、Ｐｈｏｓｐｈｏ　Ｐａｘｉｌｌｉｎ（Ｔｙｒ１１８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２５４１）、ＧＡＰＤＨ（１４Ｃ１０）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：２１１８）に対する抗体を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ　ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：７０７４Ｐ２）とウサギ−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＮＡ９３４）インキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ）で発光させたバンドを検出した。
　（結果）
　結果を図３に示す。図３左はｐ−ＭＬＣ阻害剤による細胞接着の検討をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＲにより接着細胞数を評価することで行った結果である。その結果コントロールと比べるとｐ−ＭＬＣ阻害剤であるブレビスタチンを添加した場合、有意に接着細胞数が増加していることが分かった。図３右はｐ−ＭＬＣ阻害剤添加後の接着関連分子の活性をウェスタンブロット法を用いて測定した結果である。ブレビスタチンを添加することによって接着関連分子であるパキシリンのリン酸化が早期に起こることが確認できた。
　（実施例２：ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植）
　本実施例では、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の状態を確認した。
　（方法および材料）
　本実験で使用した全てのウサギ角膜組織は、他の研究目的により安楽死したウサギより研究用眼球（オリエンタルバイオサービス株式会社）として購入したものを使用した。
　（細胞培養）
　ウサギ角膜内皮細胞初代培養では、角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し、一眼に対して０．５ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅ（カタログ番号：ＡＴ１０４、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃でウォーターバスを用いてインキュベートした。２０分後、培養培地を加えてピペッティングを行い，１２００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘ（カタログ番号：０４０７；Ａｔｈｅｎａ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ（カタログ番号：１２３２０；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％　ＦＢＳ、１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　Ｍｉｘｅｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号：２６２５２−９４；ナカライテスク）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；カタログ番号：１３２５６−０２９；ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものを使用した。
　培地交換は２日ごとに行った。継代は５０~８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ^２＋Ｍｇ^２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Ｎｉｓｓｕｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ．Ｊａｐａｎ）で細胞を洗浄し、０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（カタログ番号：２５３００−０５４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で３分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１５００ｒｐｍ　３分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ　Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２~３の密度で細胞を播種した。
　（移植）
　ウサギの角膜内皮細胞をソフトテーパードニードル（イナミ社、Ｍ−５６３Ｓ）にて剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。続いて培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をブレビスタチンを最終濃度１０μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、角膜表面を下にしたうつむき姿勢を３時間とらせた。比較群としてウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をＹ−２７６３２を最終濃度１００μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射した群、角膜内皮細胞を掻爬のみ行った群、ウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射した群を用いた。
　（結果）
　図４~５にブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の前眼部写真を示す。図４の上段は、ブレビスタチンを用いた結果（３日目、７日目、１４日目）を示す。図４の下段は、Ｙ−２７６３２を用いた結果（３日目、７日目、１４日目）を示す。コントロールとして、図５の上段は、掻爬のみの結果（３日目、７日目、１４日目）を示し、図５の下段は細胞のみの結果（３日目、７日目、１４日目）を示す。示されるように、ブレビスタチンの併用は、Ｙ−２７６３２と同様に良好であることが分かった。
　（実施例３：ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の状態）
　本実施例では、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の角膜厚、眼圧および免疫組織学的検討を測定した。
　（角膜厚および眼圧測定）
　培養角膜内皮細胞移植後にウサギの角膜厚を超音波パキメーター（ＳＰ−２０００；Ｔｏｍｅｙ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）にて測定した。また、眼圧についてはトノベット（カタログ番号：ＴＶ０１，ＭＥテクニカ）にて測定した。
　（免疫組織学的検討）
　ウサギを安楽死させて角膜を摘出して機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、４％パラホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）およびアクチンの免疫組織化学分析を行った。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。アクチンの染色は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ファロイジン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：４００希釈を用いて実施した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ２　ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
　（結果）
　結果を図６~８に示す。図６は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の角膜厚、図７はブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の眼圧、図８は、ブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植後の免疫組織学的検討結果を示す。
　（実施例４：低濃度のブレビスタチンを併用した培養角膜内皮細胞移植）
　実施例３と同様に角膜内皮を掻爬したウサギの水疱性角膜症モデル眼に、培養したウサギの角膜内皮細胞５．０×１０^５個をブレビスタチンを最終濃度１μＭおよび３μＭに調整したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）２００μｌに懸濁して前房内に注射して、うつむき姿勢を３時間とらせ、角膜の透明性回復、角膜内皮の再生を検討した。
　（免疫組織学的検討）
　ウサギを安楽死させて角膜を摘出して機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、４％パラホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ^＋／Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＢＤ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：６１０９２０）およびアクチンの免疫組織化学分析を行った。二次抗体には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。アクチンの染色は、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ファロイジン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：４００希釈を用いて実施した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ２　ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
　（結果）
　結果を図９~１１に示す。図９は、前眼部写真、図１０は角膜厚、図１１は培養角膜内皮細胞移植後の免疫組織学的検討結果を示す。
　（考察）
　これらの実験結果から、図１２に示すように、細胞は浮遊状態においてはＲｈｏＡの活性が上がると、ＲＯＣＫの活性も上がり、ＭＬＣのリン酸化が進むことで、接着関連分子であるＦＡＫおよびパキシリンのリン酸化、ビンキュリンの発現が抑制されることで細胞基質間接着が阻害されていたと考えることができる。そしてブレビスタチンを添加することでＭＬＣのリン酸化活性を抑制するとアクチンの収縮が抑制され、接着関連分子の活性を促進することで内皮細胞の基質間接着性が促進するという結果が得られた。さらにＹ−２７６３２と比べても低濃度で治療可能であることが示された。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

　ミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、特に角膜内皮細胞を用いた、角膜内皮の疾患、障害または状態の治療または予防薬に関する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。

Claims

角膜内皮細胞と、ミオシンＩＩ特異的阻害剤とを含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬。
前記ミオシンＩＩ特異的阻害剤はブレビスタチンである、請求項１に記載の処置または予防薬。
前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィ、または角膜内皮不全（水疱性角膜症）に関する障害である、請求項１に記載の処置または予防薬。
前記疾患、障害または状態は、外傷または眼科手術に起因するものである、請求項３に記載の処置または予防薬。
前記疾患、障害または状態は、水疱性角膜症における羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、眼の不快感、コントラスト低下，グレア、角膜実質の浮腫および角膜混濁からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
前記角膜内皮は霊長類のものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
前記角膜内皮はヒトのものである、請求項１に記載の処置または予防薬。
さらなる医薬成分を含む、請求項１に記載の処置または予防薬。
ミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬。
ミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む、角膜内皮の疾患、障害または状態の処置または予防薬であって、該ミオシンＩＩ特異的阻害剤は、角膜内皮細胞とともに投与されることを特徴とする、処置または予防薬。
点眼薬である、請求項９または１０に記載の処置または予防薬。
角膜内皮疾患の処置または予防のためのミオシンＩＩ特異的阻害物質。
角膜内皮疾患の処置または予防のためのミオシンＩＩ特異的阻害物質であって、該ミオシンＩＩ特異的阻害物質は、角膜内皮細胞とともに投与されることを特徴とする、ミオシンＩＩ特異的阻害物質。
角膜内皮疾患の処置または予防のための方法であって、該方法は被験体に対して有効量のミオシンＩＩ特異的阻害剤を角膜内皮細胞とともに投与する工程を包含する、方法。