JP2010505001A - 接着結合を持つ細胞の増殖を刺激するRNAi方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立眼研究所のScheffer C.G.Tsengへの助成番号RO1 EY06819および助成番号RO1 EY015735により、全体的および部分的に支援された。米国政府は本願発明においてある種の権利を有する。
隣接する角膜実質の角膜実質細胞による汚染からHCECを単離する方法が本願明細書に開示される。機械的に裸出されたデスメ膜はいくらかの角膜実質組織を含み、角膜実質細胞が存在する。従前の方法は、トリプシンの有無でのEDTA、引き続いてトリプシン/EDTAの有無によるディスパーゼ、トリプシンまたはEDTAに続いてのコラゲナーゼ、またはコラゲナーゼに続いてのトリプシンまたはEDTAを使用する。しかしながら、これらの方法は、マトリックスから細胞を剥離するのに必要とされる培養時間の延長、細胞傷害および収量の減少、または線維芽細胞(角膜実質細胞)汚染のために細胞変性に導いた。さらに、これらの方法は、かかる線維芽細胞(角膜実質細胞)汚染が発生するのを防止するためにさらなる選択培地の使用を必要とした。
前記の単離されたものを含めた単離されたHCEC凝集物は、約3週間までまたはそれより長い間、無血清の高カルシウム濃度培地中で連続的に培養されれば円形球にさらに組織化でき、かかる保存されていた球は、発現型の六角形の形状でのHCECの単層を与えることができた(図2D)。高カルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に凝集物を貯蔵することにより、HCEC凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に開示される。
細胞と、E−カドヘリン、VE−カドヘリン、P−カドヘリン、N−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、p120およびp190の発現を下方調節する剤とを接触させることを含む、分化の間にAJを形成し、増殖を中止させる増殖細胞を刺激する方法が本願明細書に開示される。例えば、単離され保存されたHCEC凝集物の増殖または前記のHCEC凝集物から誘導されたHCEC単層の増殖は上記方法を用いて刺激できる。
上記の調製されたHCECは、適切な担体または支持の有無での組織、すなわち、外科用移植片として送達できる。(a)コラゲナーゼを含む溶液を用いて角膜実質細胞から単離され、(b)約0.8mM〜約1.5mMのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に所望により保存され、および(c)p120の発現を下方調節する剤と一過性に接触させたHCEC、ならびに生物学的適合性担体を含む外科移植片が本願明細書に開示される。1つの具体例において、HCECは、分裂促進の成長因子とさらに接触させる。もう一つの具体例において、HCECのAJ形成は、細胞質内cAMPを上昇させるための剤との接触によってさらに促進される。まだもう一つの具体例において、HCECが、生物学的適合性担体上に再接種される。生物学的適合性担体はHCEC接着を促進し、透明性であって、角膜実質に統合できる。1つの具体例において、生物学的適合性担体はコラーゲン含有細胞間マトリックスである。もう一つの具体例において、生物学的適合性担体は羊膜である。さらなる具体例において、羊膜の厚みは減少させた。まださらなる具体例において、厚みの減少はエキシマーレーザー切除によって達成された。まださらなる具体例において、剤は、凝集物または単層の形態におけるHCECと一過性に接触させる。さらなる具体例において、p120の発現を下方調節する剤はRNA干渉である。まださらなる具体例において、剤は二本鎖RNAである。まださらなる具体例において、RNA干渉はパルスで適用される。
以下の特定の実施例は、単なる例示として構築され、何らその開示の残りに制限的でないものとして、解釈されるべきものである。さらなる詳述なくして、当業者ならば、本願明細書の記載に基づいて、その最も十分な範囲まで本発明を利用できると考える。これにより、本願明細書に引用された全ての刊行物をここに出典明示してその全てを本願明細書の一部とみなす。それに対する引用は、かかる情報の有効性および公の普及を証拠づける。
材料:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ハム/F12培地、ケラチノサイト無血清培地(KSFM)、OptiMEM−1培地、HEPES緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、アンフォテリシンB、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清(FBS)、ウシ下垂体抽出物、ヒト組換え上皮成長因子(h−EGF)、0.25%トリプシン/0.53mM EDTA(トリプシン/EDTA)、およびLIVE/DEADアッセイ試薬は、Invitrogen(Carlsbad,CA)から購入した。ディスパーゼIIおよびコラゲナーゼAはRoche(Indianapolis,IN)から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地サプリメント、L−アスコルビン酸、コンドロイチン硫酸、ヨウ化プロピジウム、Hoechst−33342色素、トリトンX−100、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(h−bFGF)、パラホルムアルデヒドおよびFITC結合抗マウスIgGは、Sigma(St.Louis,MO)から得た。マウス抗−ZO−1抗体およびタイプIコラーゲンはBD Biosciences(Bedford,MA)から得た。マウス抗ラミニン5、IV型コラーゲンα2鎖、パールカンおよびコネクシン43抗体は、Chemicon(Temecula,CA)からであった。マウス抗IV型コラーゲンα1抗体はKamiya Biomedical(Seattle、WA)からであった。抗フェードマウンティング溶液はVector Laboratories(Burlingame,CA)からであった。マウス抗Ki67抗体はDakoCytomation(Carpinteria,CA)からであった。DeadEndTMの蛍光測定TUNELシステムはPromega(Madison,WI)からであった。
得られたHCEC凝集物を、異なるサプリメント(表1)を含む無血清の低カルシウムまたは高カルシウム培地中に保存した。貯蔵培地1、KSFMベースの培地のカルシウム濃度は、0.08ミリモル(mM)であり、発明者らはそれを「低カルシウム」培地と定義した。貯蔵培地2、3およびすべての培地のカルシウム濃度は、DMEM.F12の基本培地およびFBS中のカルシウムに基づいて、約1.08mMである。発明者らは、約1.08ミリモル(mM)のカルシウム濃度を有する培地を「高カルシウム」培地と定義した。
次いで、消化直後または貯蔵培地中での保存期間後のいずれかで得られたHCEC凝集物を、約37℃の温度および5パーセント(5%)の二酸化炭素(CO2)下のプラスチック皿上の異なる培養培地(表2)中で培養した。培地を約2〜3日毎に交換した。いくつかのHCEC凝集物を、前記の培養前に内皮細胞を単離するために37℃で10分間トリプシン/EDTAで予め処理した。
in vivoおよびin vitroでのHCEC中のAJおよびTJならびにそれらの調節分子の発現、ならびに細胞の細胞骨格アクチンケーブルと増殖との相関を決定した。プラスチック上での14日までのin vivoおよびin vitroでのHCEC中のAJ/TJおよびそれらの調節分子のmRNA発現を、従来の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって決定した。また、in vivoおよびin vitroでのHCEC中のAJの陽性発現した成分のmRNA発現をリアルタイムPCRによって決定した。
材料.ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ハム/F12培地、ヒト上皮成長因子(hEGF)、HEPES緩衝液、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、アンフォテリシンB、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清(FBS)および0.25%トリプシン/0.53mM EDTA(トリプシン/EDTA)をInvitrogen(Carlsbad,CA)から購入した。コラゲナーゼAはRoche(Indianapolis,IN)から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素およびインスリン・トランスフェリン亜セレン酸ナトリウム培地サプリメントをSigma−Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。ARPE−19細胞系はATCC(Manassas、VA)から購入した。GeneEraserTM siRNAトランスフェクション試薬は、Stratagene(La Jolla,CA)から購入した。RNAeasy MiniキットはQiagen(Valencia,CA)から得た。高容量逆転写キット(High Capacity Reverse Transcription Kit)およびリアルタイムPCRプライマーおよびプローブは、Applied Biosystems(Foster City,CA)から取り寄せた。モノクローナル抗−VE−カドヘリンおよびポリクローナル抗E−カドヘリン、抗N−カドヘリンおよびp120抗体は、Santa Cruz(Santa Cruz,CA)から得た。テキサスレッドをコンジュゲートしたロバ抗ウサギまたはマウスは、Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA)からのものであった。FITCをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体はSigma−Aldrichからのものであった。
ヒト組織はヘルシンキ宣言に従い取扱った。ヒト供与者の眼からの8つの角強膜組織をFlorida Lions Eye Bank (Miami,FL)から得た。それらの中央の角膜ボタンのいくつかを角膜移植に用いた。供与者の年齢は3〜65歳の間であった。全組織は試験前10日未満の間に貯蔵培地(Optisol;Chiron Vision,Irvine,CA)中に4℃で維持した。組織を50mg/mLゲンタマイシンおよび1.25mg/mLアンフォテリシンBを含有するDMEMで3回濯いだ。中央の角膜を8mmの直径のトレフィンにより取り出した。その後、デスメ膜および角膜内皮細胞を解剖顕微鏡下、辺縁角強膜組織の後面から剥取り、5%FBS、0.5%ジメチルスルホキシド、2ng/mLマウスEGF、5μg/mLインスリン、5μg/mLトランスフェリン、5ng/mLセレン、0.5μg/mLヒドロコルチゾン、1nMコレラ毒素、50μg/mLゲンタマイシンおよび1.25μg/mLアンフォテリシンBを補足した等量のHRPES緩衝DMEMおよびハムF12で調製した補足されたホルモン上皮培地(SHEM)中の1mg/mLのコラゲナーゼAで37℃にて16時間消化した。消化後、HCECは凝集物を形成し、凝集物を3分間2000rpmでの遠心により集めて、消化溶液を除去した。凝集物はSHEM培地中で3および14日間培養した。
Claims (25)
- 細胞と、E−カドヘリン、VE−カドヘリン、P−カドヘリン、N−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、p120カテニンおよび/またはp190の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させることを含むことを特徴とする接着結合を持つ細胞の増殖を刺激する方法。
- 下方調節がRNA干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内cAMPを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
- RNA干渉がp120カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項2記載の方法。
- RNA干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項3記載の方法。
- RNA干渉のパルスが少なくとも約12時間続くことを特徴とする請求項4記載の方法。
- 接触がin vivoで生じることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 接触が哺乳動物の眼において生じることを特徴とする請求項5記載の方法。
- 哺乳動物の眼が、角膜内皮細胞機能障害を有することを特徴とする請求項6記載の方法。
- 剤を哺乳動物の前眼房に投与することをさらに含むことを特徴とする請求項6記載の方法。
- 接着結合を持つ細胞が、ヒト角膜内皮細胞であって、剤が、N−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、p120カテニンおよび/またはp190の発現を下方調節する剤であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 細胞質内cAMPを上昇させる剤が、8−ブロモ−cAMP、ジブチリルcAMP、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンE2(PGE2)、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項2記載の方法。
- 細胞とN−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、p120カテニンおよび/またはp190の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させ;次いで、細胞を培養して、拡張したヒト角膜内皮細胞を形成するを含むことを特徴とする培養においてヒト角膜内皮細胞を拡張する方法。
- 下方調節がRNA干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内cAMPを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項12記載の方法。
- RNA干渉がp120カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項13記載の方法。
- RNA干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項13記載の方法。
- RNA干渉のパルスが少なくとも約12時間続くことを特徴とする請求項15記載の方法。
- ヒト角膜内皮細胞が、早期または後期の密集にて凝集物または単層の形態であることを特徴とする請求項12記載の方法。
- 細胞質内cAMPを上昇させる剤が、8−ブロモ−cAMP、ジブチリルcAMP、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンE2(PGE2)、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項13記載の方法。
- デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ;次いで、消化後に溶液からヒト角膜内皮細胞の少なくとも1つの凝集物を分離することを含むことを特徴とする角膜実質細胞からヒト角膜内皮細胞を単離する方法。
- コラゲナーゼがコラゲナーゼAであることを特徴とする請求項19記載の方法。
- コラゲナーゼ接触が約12〜約16時間であることを特徴とする請求項19記載の方法。
- 約0.8mM〜約1.5mMのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中でヒト角膜内皮細胞凝集物を貯蔵することを含むことを特徴とするヒト角膜内皮細胞凝集物の生存度を保存および維持する方法。
- (a)コラゲナーゼを含む溶液を用いて、角膜実質細胞から単離され、(b)約0.8mM〜約1.5mMのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中で所望により保存され、次いで(c)p120カテニンの発現を下方調節する剤と一過性に接触したヒト角膜内皮細胞;ならびに生物学的適合性担体を含む外科用移植片。
- 生物学的適合性担体が羊膜である請求項23記載の外科用移植片。
- 下方調節がRNA干渉によって生じ、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内cAMPを上昇させる剤とを接触させることをさらに含む請求項23記載の外科用移植片。
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