TWI508731B - 干擾性ｒｎａ用於製備治療及／或預防近視之藥物的用途 - Google Patents

Description

干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用 途

本發明基於發現干擾性RNA(RNA interference,RNAi)與近視及/或高度近視之關連性，因而發展出干擾性RNA對於近視之預防及/或治療與風險評估的相關應用。本發明係關於一種干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途。

微型RNA(micro RNA,miRNA)為長度約21-33個核苷酸之非編碼、單股的RNA分子(Curr Biol 2002；12：735-739.2.；Nature 2004；431：350-355.)。在一些動物中，一成熟之微型RNA與一個或多個訊息RNA(messenger RNA,mRNA)的3’非轉譯區(untranslated region,UTR)互補。一微型RNA對其目標訊息RNA的黏附(annealing)導致蛋白質轉譯的抑制及/或造成訊息RNA的裂解。微型RNA可調節細胞生長、分化與凋亡(Nature 2004；431：350-355；Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2006；103：7024-7029；British journal of cancer 2006；94：776-780；Science 2005；310：1817-1821.)。因此，微型RNA的調節異常可導致人類疾病。於這方面中，許多另人興奮的研究已聚焦於微型RNA於癌症中的角色。

PAX6 基因屬於包含配對與同源盒(homebox)DNA結合區之轉錄因子的一高度保守家族。PAX6 基因涉及了中樞 神經系統與眼睛的發育。其在角膜與視網膜分化的誘發中扮演一重要的角色，且被視為對於眼睛形成的主要基因(Exp Eye Res 2006；83：233-234；Brain Res Bull 2008；75：335-339.)。發明人先前報導，PAX6 基因之3’非轉譯區單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs662702與極端高度近視相關(Invest Ophthalmol Vis Sci 2011；52：35000-35005.)。發明人在後續報導中證實上述單核苷酸多型性位於微型RNA-328(microRNA-328,miR-328)在PAX6基因上結合位置(Invest Ophthalmol Vis Sci.2012 May 31；53(6)：2732-9)。功能分析顯示單核苷酸多型性的C對偶基因(allele)可降低PAX6蛋白質表現量，而此顯著地增加造成近視的風險。

源自於視網膜的訊息可傳遞到鞏膜(sclera)(Vis Neurosci 2005；22：251-261.)，特別是源自光感受器(photoreceptor)與視網膜色素上皮層(retinal pigment epithelium,RPE)的訊息。因此，研究介於視網膜色素上皮細胞與鞏膜細胞之間的互相作用可能提供對於近視發展的更深刻理解。

然而，之前並未有任何微小RNA對於近視發展的報導，且迄今也沒有任何以干擾性RNA做為治療及/或預防近視之藥物的相關研究。

本發明提供一種干擾性RNA(RNA interference,RNAi)用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途。

本發明也提供一種評估一個體是否具有發展成近視或高度近視之風險的方法。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

本發明基於確認了干擾性RNA(RNA interference,RNAi)與近視及/或高度近視之關連性，因而發展出干擾性RNA對於近視之預防及/或治療與風險評估的相關應用。

目前已知PAX6 基因(序列辨識號：1)控制下游基因的表現可能與近視的發展相關，而在本發明之實驗中，確認了微型RNA-328存在於動物眼組織中，而且在近視老鼠之鞏膜及視網膜中。又本發明之實驗證實了微型RNA-328可直接結合至PAX6 基因的3’非轉譯區(untranslated region,UTR)，且確認微型RNA-328可調控PAX6 的mRNA，使其mRNA量與蛋白質表現量都下降。

又於本發明之實驗中，確認了位於PAX6 3’非轉譯區之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs662702(序列辨識號：2)之風險性C對偶基因(allele)，相較於其保護性T對偶基因，對於微型RNA-328之靈敏度較高。也就是說，位於3’非轉譯區之單核苷酸多型性rs662702實質上影響微型RNA-328結合至PAX6 3’非轉譯區的結合力，導致個體間罹患近視的危險性不同。

此外，在近視形成過程中，視網膜色素上皮細胞會產 生增生現象。又先前研究指出在近視發展期間，TGF-β的增加為視網膜/鞏膜訊號傳遞途徑(retinoscleral signaling pathway)的重要因子(J Exp Eye Res 2009；88：458-466.)。而在本發明中確認了以干擾RNA的方法於視網膜色素上皮細胞可以劑量依賴方式降低PAX6 表現，且PAX6 的減少顯著增加了視網膜色素上皮細胞增生，以及增強了TGF-β3的表現。再者，於本發明中也確認微型RNA-328模擬物可以劑量依賴(dose-dependent)地增加視網膜色素上皮細胞增生以及於視網膜色素上皮細胞中，並且誘導TGF-β3的表現。

另外，目前已知鞏膜薄化、鞏膜膠原蛋白I(collagen I)減少、整合蛋白β1(integrin β1)次單元表現降低，及基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP 2)增加，為在近視形成中的重要變化(Exp Eye Res 2006；82：185-200.；Invest Ophthalmol Vis Sci 2006；47：4674-4682.；Exp Eye Res 1996；63：369-381.Invest Ophthalmol Vis Sci 2001；42：1153-1159.；Invest Ophthalmol Vis Sci 2002；43：2067-2075.)，而在本發明中，以干擾RNA的方法造成鞏膜細胞中PAX6表現量下降，可導致膠原蛋白I與整合蛋白β1程度的顯著降低，及基質金屬蛋白酶2表現量增加。

根據上述，本發明已明確證實干擾性RNA，例如微型RNA-328等會減少PAX6 的表現量，進而引起近視形成之因子朝向發展成近視的情況變化。故，於本發明中提出一概念，其藉由使用另一干擾性RNA來中和上述體內與近視 發展有關之干擾性RNA以達成治療與預防近視之功效。

因此，在本發明一第一態樣中，本發明提供一種干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途。上述干擾性RNA具有中和另一干擾性RNA之能力。

上述另一干擾性RNA可為一具有抑制PAX -6 基因表現之能力的干擾性RNA。於一實施例中，上述具有抑制PAX -6 基因表現之能力的干擾性RNA可包括微型RNA-328，但不限於此。於一示範實施例中，上述具有抑制PAX -6 基因表現之能力的干擾性RNA為微型RNA-328。

於本發明中所提及之“微型RNA-328”意指，一成熟型之微型RNA-328或微型RNA-328之前身(包括pre-microRNA-328及pri-microRNA-328)。在一實施例中，微型RNA-328可包括一原本之人類微型RNA-328(原本之人類微型RNA-328之序列為CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU)(序列辨識號：3)、一經修飾之人類微型RNA-328，例如一人類微型RNA-328之前身(例如人類pre-微型RNA-328(其序列為UGGAGUGGGGGGGCAGGAGGGGCUCAGGGAGAAAGUGCAUACAGCCCCUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGUCCCCUG)(序列辨識號：4))與人類pri-微型RNA-328)。

又在具有抑制PAX -6 基因表現之能力的干擾性RNA可包括微型RNA-328的上述實施例中，上述具有中和另一干擾性RNA之能力的干擾性RNA可包括一用以中和微型RNA-328之反股RNA(antisense RNA)，而用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列可包括微型RNA328之互補 序列的至少一部份。

在一實施例中，上述用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列可包括序列辨識號：5(序列辨識：3之互補股)或序列辨識號6(序列辨識號：4之互補股)。在另一實施例中，上述用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列可包括序列辨識號：7。在一示範之實施例中，上述用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列為序列辨識號：7。

此外，上述用以中和微型RNA-328之反股RNA可由未經修飾之RNA所構成或包括至少一個經化學修飾之核酸。

一般而言，反式寡核苷酸(antisense oligonucleotides)須具備以下性質，才能順利運用於醫學治療的用途：1.能對抗外水解酵素(exonucleases)，以增加穩定性；2.具有高溶解度；以及3.具有良好的雜交(hybridization)能力。

而為了增加干擾性RNA的穩定性、溶解度及雜交力，目前主要利用經化學修飾之核酸來形成干擾性RNA以促進其在醫學治療上的運用。而經化學修飾之核酸的類型可參見第1圖(取自Kausch et al.(2002)J Urol.168(1)：239-247.)，依照其化學修飾方式，可區分成三類：(1)在磷酸根上做修飾，如磷酸二酯核酸(phosphodiester nucleic acid)、硫代磷酸核酸(phosphorothioate nucleic acid)、甲基磷酸核酸(methylphosphonate nucleic acid)與磷醯胺核酸(phosphoroamidate nucleic acid)； (2)在5碳糖之2號碳所連結之氧原子做修飾，如2’-甲氧基核酸(2’-O-methyl nucleic acid)與鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)；以及(3)在5碳糖之3號碳上做修飾，如肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)與N-嗎啉(N-Morpholino)。

因此，於本發明中，於上述實施例中，可形成用以中和微型RNA-328之反股RNA的經化學修飾之核酸可包括，但不限於，磷酸二酯核酸、硫代磷酸核酸、甲基磷酸核酸、磷醯胺核酸、2’-甲氧基核酸、肽核酸、N-嗎啉或鎖核酸。

此外，上述具有中和另一干擾性RNA之能力的干擾性RNA可單獨被配製為一藥物，或者可與與一藥學上可接受之載體或鹽類一起被配製為一藥物。在一示範實施例中，上述藥物可為一眼藥水滴劑形式。

而藥學上可接受之載體可包括一奈米粒子，但不限於此。奈米粒子被定義為具有於10-1000 nm之尺寸範圍中之顆粒分散(particulate dispersion)或固體顆粒。可從各種材料來製備奈米顆粒，例如脂質、蛋白質、多醣polysaccharide與合成之聚合物(synthetic polymer)。根據製備之方法，可獲得奈米顆粒、奈米球(nanospheres)或奈米囊(nanocapsules)。奈米囊為於其中試劑被局陷於一由獨特聚合物膜所圍繞之空穴(cavity)的系統，而奈米球為於其中藥物被完全地與均勻地分散的基質系統(matrix system)。奈米顆粒最常藉由三種方法來製備：(1)預製聚合物(preformed polymer)之分散；(2)單體的聚合；以及(3)親水聚合物之 離子凝膠ionic gelation或凝聚(coacervation)。然而，其他方法，例如超臨界流體技術(supercritical fluid technology)與非潮溼模板中的顆粒複製(particle replication in non-wetting template,PRINT)也已被描述於關於奈米顆粒製造之文獻中。

上述奈米粒子的例子可包括，但不限於包括微脂體、微胞、金屬奈米顆粒與聚合物奈米顆粒。

在一實施例中，上述載體為一微脂體，而上述具有中和另一干擾性RNA之能力的干擾性RNA被包埋於微脂體內。又，於此實施例中，上述藥物可為一眼藥水滴劑形式。

前述藥學上可接受之載體也可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配置成劑型(dosage form)。

又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。

本發明所製備出藥物給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括眼藥水(eye drop)、皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內 (intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。

口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。

【實施例】 A.材料與方法 材料

螢光酵素分析系統(luciferase assay system)與選殖套組(cloning kit)為購自Promega Corporation(Madison,WI,USA)。抗-PAX6抗體、抗-膠原蛋白I(Collagen I)抗體、抗-整合蛋白β(integrin β)抗體與抗-基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP 2)抗體為購自GeneTex Inc.(Irvine,CA,USA)。抗-β肌動蛋白(β-actin)抗體、增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)溶液與WST-1為購自Millipore(Billerica,MA,USA)。Trizol^® 試劑、二次抗體與lipofectamine為購自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。SYBR^® Green PCR Master Mix、MultiScribe^TM Reverse Transcriptase Kit、TaqMan^® miR-328與U44試驗、微型RNA-328模擬物(mimic)為購自Applied Biosystems(Carlsbad,CA,USA)。引子組為由明欣生物科技有限公司所合成(台灣，南港)。針對PAX6短髮夾型RNA(shRNA) (其序列為序列辨識號：8)為購自中央研究院分子生物研究所RNAi核心設施(台灣，南港)。ARPE-19細胞為購自ATCC(Manassas,VA,USA)。細胞培養相關試劑為購自GIBCO-BRL(Grand Island,NY,USA)。除非另有指明，所有其他試劑為分析級(analytical grade)。

方法 1.細胞培養、處理與轉染(transfection)

人類視網膜色素上皮細胞株(human RPE cell line)、ARPE-19為生長於具有1% Penicillin/Streptomycin與10%熱去活化胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培養基中，於37℃，95%空氣/5% CO₂ 之潮濕大氣中。於所有實驗中使用小於20代的細胞。為了執行轉染實驗，將視網膜色素上皮細胞以1x10⁵ 細胞/孔的密度接種進一12-孔盤中。在一孔盤中生長達到70%滿盤後，以Lipofectamine 2000(Invitrogen)，分別轉染對照之短髮夾型RNA或針對PAX6之短髮夾型RNA及pEGFP-N3質體或帶有PAX6基因之質體。在24小時培養後，收集視網膜色素上皮細胞以進一步研究。

2. RNA分離與定量即時聚合酶鏈鎖反應

使用Trizol^® ，萃取培養之細胞的總RNA。以A260/A280讀數來檢驗RNA品質。藉由使用隨機引子(random primers)與MultiScribe^TM Reverse Transcriptase Kit來從1 μg之總RNA合成cDNA。藉由TaqMan^® MicroRNA Assays來合成 微型RNA-328之cDNA。以1：30之比例，將cDNA以PCR grade water進行稀釋，且之後儲存於-20℃。

在定量即時聚合酶鏈鎖反應方面，設計特定引子，而細節列於表1中。藉由ABI 7500 real-time PCR machine(Applied Biosystems)，以預優化條件(pre-optimized condition)來將基因表現程度進行定量。每個聚合酶鏈鎖反執行二重複，使用5 μl之2X SYBR Green PCR Master Mix、0.2 μl之引子組、1 μl之cDNA與3.6 μl之無核苷酸H₂ O以達到總反應體積為10 μl。藉由使用log₁₀ (2^-△Ct )之方程式，利用U44做為微小RNA-328之內部控制組，來將微型RNA-328之表現程度標準化，其中△Ct=(C_{T微型RNA-328} -C_TU44 )。利用管家基因(house-keeping gene)GAPDH做為其他基因之相對表現標準化。

3.免疫墨點分析

細胞於含有蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)(Calbiochem)之RIPA緩衝溶液(1% Nonidet P-40,0.5% deoxycholate,0.1% SDS於PBS中)中獲得，並於4℃以12,000 rpm離心10分鐘。將上清液做為總細胞溶解物。溶解物變性於(20 μg)2% SDS、10 mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、60 mM Tris-HCl(pH 6.8)與0.1%溴酚藍(bromophenol blue)中並載入一10%聚丙烯醯胺(polyacrylamide)/SDS膠。之後將分離之蛋白質轉移至一PVDF膜。將此膜於室溫於含5%脫脂奶粉(nonfat dry milk)的PBS中進行阻礙(block)，並於含一級抗體之PBS-T中於4℃隔夜培養。將此膜於PBS-T中清洗、以結合辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)之二級抗體於室溫培養1小時， 且之後於PBS-T中進行清洗。使用ECL非放射性偵測系統(ECL non-radioactive detection system)，藉由以Bio-Rad ChemiDoc XRS System照相，來偵測抗體-蛋白質複合物。

4. PAX6 3’非轉譯區報導質體(reporter plasmid)與突變(mutagenesis)的建構

使用列於表1中之專一於PAX6 3’非轉譯區的引子組來執行聚合酶鏈鎖反應，專一於PAX6 3’非轉譯區的引子組，其順向引子為SpeI-位-連結，而逆向引子為MluI-位-連結。將視網膜色素上皮細胞基因體DNA使用為模板。將1500-bp之聚合酶鏈鎖反應產物以SpeI與MluI來分解，並選殖(cloned)螢光酶(luciferase)基因之下游(downstream)於pMIR-REPORT螢光酶載體(luciferase vector)(Ambion)中。將此載體定序並命名為pMIR-PAX6-3’UTR。使用QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Heidelberg,Germany)來執行微型RNA-328目標位置(target site)之定點突變(site-directed mutagenesis)於PAX6 3’UTR中，且載體命名為pMIR-PAX6 -3UTR-突變株。在報導分析方面(reporter assays)，藉由使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，將細胞以野生型(pMIR-PAX6 -3’UTR)或突變型(pMIR-PAX6 -3UTR-突變株)報導質體、以及微型RNA-328模擬物瞬時轉染。pEGFP質體被共轉染並扮演為內部控制組(internal control)。於轉染後24小時，使用Luciferase Assay System(Promega)來執行報導分析。

5. PAX6全長cDNA的建構

使用列於表1中之引子，藉由聚合酶鏈鎖反應擴增PAX6(GenBank,NM_000280)之全長cDNA。於GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)中使用下列熱設定(thermal profile)來對於聚合酶鏈鎖反應擴增(500 ng)：一起始變性步驟於95℃，5分鐘；接著，94℃，1分鐘，40個循環；59℃，1分鐘與72℃，1分鐘，伴隨最後擴大(final extension)於72℃，10分鐘。以瓊脂膠(agarose gel)電泳來分析聚合酶鏈鎖反應產物。將所有的聚合酶鏈鎖反應產物選殖(cloned)於pGEM-T Easy vectors(Promega Corporation)中。在HindIII/BamHI分解(digestion)後，將PAX6 cDNA選殖於pEGFP-N3中以形成pEGFP-PAX6的構築體(construct)。藉由DNA定序來確認所有構築體的序列。

6.細胞增生分析

藉由使用顯微鏡影像，與根據製造商操作指南之WST-1細胞增生檢驗(WST-1 cell proliferation assay)(Millipore)，來測定細胞增生。簡單而言，以三重複，將10⁵ 個細胞接種於12-孔盤中之每個孔。以微型RNA-328或針對PAX6 短髮夾型RNA轉染細胞24小時後，以倒立顯微鏡(Nikon Instruments Inc.,Melville,NY)獲得影像。之後，將細胞更進一步以1：10之WST-1試劑與培養基培養4小時，使用一微孔盤分析儀(microplate reader)來測量樣本(以背景控制組(background control)為空白組(blank))於440 nm與650 nm的吸收值。

7.條件培養基(conditioned medium)之製備與處理

為了收集條件培養基，將視網膜色素上皮細胞以1x10⁵ 細胞/孔之密度接種於12-孔盤中。在每孔達到70%滿盤後，以Lipofectamine 2000(Invitrogen)，分別將混雜(scrambled)短髮夾型RNA或針對PAX6 短髮夾型RNA及pEGFP-N3或攜帶有PAX6基因之質體進行轉染。在24小時後，收集此培養基(稱之為條件培養基)。將鞏膜細胞(1x10⁵ 細胞/孔)接種於12-孔盤中。在24小時後，以1 mL之條件培養基來置換原培養基。再經過24小時後，以RT-PCR來測定鞏膜細胞之基因表現。

8.原位雜合(In situ hybridization)

C57BL/6J小鼠為購自國家實驗動物中心(台灣)。犧牲小鼠後，收集眼睛並將其固定於多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)中。在原位雜合方面，將眼睛切片(section)培養於咪唑(imidazole)緩衝溶液(0.13 M 1-methylimidazole,300 mM NaCl pH 8.0)兩次，10分鐘，接著培養於1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide HCl)(EDC；Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)溶液(16 M EDC,0.13 M 1-甲基咪唑(1-methylimidazole),300 mM NaCl pH 8.0)，達1小時於28℃。在於0.2%(w/v)甘氨酸(glycine)/PBS中清洗兩次後，藉由將切片培養於0.1 M三乙醇胺(triethanolamine)、0.5%(v/v)乙酸酐(acetic anhydride)10分 鐘來將其乙醯化化(acetylated)，接著於1×PBS中清洗3次，每次5分鐘。將5’-DIG-標記之鎖核酸修飾的微型RNA-328探針(EXIQON,Vedbaek,Denmark)以1：100之比例稀釋於雜合緩衝溶液(hybridization buffer)(50%甲醯胺(formamide)、0.3 M NaCl、20 mM Tris HCl pH 8.0、5 mM EDTA、10 mM NaPO₄ pH 8.0、10%硫酸右旋糖酐(dextran sulfate)、1×Denhardt's溶液與0.5 mg/mL酵母菌tRNA)中，並於65℃加熱5分鐘，之後於冰上冷卻。

在於54℃隔夜雜合後，將玻片清洗兩次於50%甲醯胺、1×SSC-Tween，25分鐘；一次於0.2×SSC，15分鐘；一次於1×PBS，15分鐘。之後將切片於室溫培養於阻絕溶液(blocking solution)(1×Blocking Reagent,Roche)，1小時，接著於室溫培養於含1：1500稀釋之鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)-結合之抗-DIG Fab片段(Roche Applied Science,Indianapolis,USA)的阻絕溶液，2小時。將玻片清洗兩次於1×PBS-Tween，20分鐘，之後兩次於1×PBS，20分鐘，且於黑暗中，將切片培養於BM紫色鹼性磷酸酶基質(BM Purple AP substrate)(Roche)1天。藉由將玻片於1 mM EDTA、1×PBS清洗10分鐘來終止鹼性磷酸酶基質反應，之後將其於去離子水中清洗2分鐘。在固定後，以倒立顯微鏡來抓取影像(Nikon Instruments Inc.)。

9.統計分析

使用曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test)來比較所有實驗結果。P-值小於0.05被視為是顯著差異的，所有 試驗顯示為至少執行三重複。資料為三次實驗之平均值±標準差。

10.微型RNA-328在近視老鼠之鞏膜及視網膜表現量的確認

將出生第23天之幼鼠(C57BL/6J小鼠，購自國家實驗動物中心(台灣))蓋住一側眼睛4週後，可造成該眼產生高度近視，利用同一幼鼠對側沒遮蓋的眼睛做為第一種對照組，並再用完全沒有蓋眼睛的另一幼鼠之眼睛做為第二種對照組。測定及/或計算在小鼠鞏膜及視網膜表現量如方法2中所述。

11.鎖核酸修飾之微型RNA-328反股是否可進入眼球組織內之確認

為了確認鎖核酸修飾微型RNA-328之反股(其序列為GGAAGGGCAGAGAGGGCCA(序列辨識號：7)(miRCURY LNA^TM microRNA Power inhibitor,Exiqon,Vedbaek,Denmark，產品編號：427050-00)可以眼藥水滴劑方式進入眼球組織內，將50 nM鎖核酸修飾微型RNA-328之反股溶於PBS緩衝液中，而另一實驗組則使用微脂體包埋鎖核酸修飾微型RNA-328之反股。將兩組藥劑分別滴於小鼠的不同眼睛上，每日滴一次，連滴三天。第四天時，將 老鼠犧牲，並進行原位雜交(in situ hybridization)染色實驗。負控制組為正常老鼠眼睛；正控制組則於染色時另外加入鎖核酸修飾微型RNA-328之反股，以確認染色過程正確。

B.結果 1.微型RNA-328與PAX6

首先藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應分析來偵測於視網膜色素上皮與鞏膜細胞中之微型RNA-328與PAX6的內生表現(endogenous expression)程度。微型RNA-328於視網膜色素上皮細胞的程度低於在鞏膜細胞中之程度(第2B圖)。相反地，PAX6之表現在視網膜色素上皮細胞高於在鞏膜細胞中。為了測試微型RNA-328是否於in vivo 被表現，以鎖核酸修飾微型RNA-328探針來對小鼠眼組織(ocular tissues)進行原位雜合。如於第2C圖中所示，可in vivo 偵測出微型RNA-328的表現。

接著證實微型RNA-328與PAX6可直接結合。將1500-bp長之包含預測之微型RNA-328結合位的PAX6 3’非轉譯區選殖進pMIR-報導質體中。在將pMIR-PAX6 3’UTR質體與微型RNA-328模擬物共轉染進視網膜色素上皮細胞後，測量螢光酶活性。如於第2D圖中所示，於視網膜色素上皮細胞中，微型RNA-328模擬物劑量依賴地(dose-dependently)降低了螢光酶活。為了更進一步證實PAX6 的結合，藉由定點突變，來將位於PAX6 3’非轉譯區之關鍵性結合區域中的七個核苷酸進行突變(第2A圖)。此步驟應降低或徹底破壞微型RNA-328結合至PAX6 。如於第2E圖中所示，在將微型RNA-328目標位置突變之後，微型RNA-328模擬物對於螢光酶活性不具有任何影響。

有鑑於細胞實驗中螢光酶分析試驗確認了微型RNA-328與PAX6 直接結合，進一步測試微型RNA-328是否可於視網膜色素上皮細胞中抑制PAX6 表現。在以不同劑量的微型RNA-328模擬物轉染視網膜色素上皮細胞之後，直接測量PAX6 表現。結果顯示，微型RNA-328模擬物顯著並劑量依賴地減少了PAX6表現(第2F圖)。上述實驗證實了微型RNA-328反向調控PAX6表現。

2.單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs662702影響微型RNA-328結合能力

由於在PAX6中之單核苷酸多型性(SNP)rs662702為位於微型RNA-328結合位中，且由於在發明人最近之研究中顯示此單核苷酸多型性與超高度近視相關(Invest Ophthalmol Vis Sci 2011；52：35000-35005.)，因此測試此單核苷酸多型性是否可影響微型RNA-328對於PAX6 3’非轉譯區之結合能力。建構兩個報導構築體：一個攜帶風險性C對偶基因(allele)，而另一個攜帶保護性T對偶基因。即使低劑量(15 nM)之微型RNA-328模擬物也顯著降低了以C-對偶基因構築體轉染之視網膜色素上皮細胞中的螢光酶活性(第3圖)。然而，微型RNA-328模擬物影響T-對偶 基因構築體，比在C-對偶基因構築體中小得多(第2圖)。因此，3’非轉譯區單核苷酸多型性rs662702會影響微型RNA-328結合至PAX6 3’UTR的能力，所以會影響PAX6的表現程度導致近視形成。

3. PAX6的減少(knock down)增強了視網膜色素上皮細胞生存能力(viability)並調控TGF-β表現

使用喪失功能(loss-of-function)實驗來研究PAX6對於視網膜色素上皮細胞之影響，以更加確定干擾RNA可藉著減少PAX6造成對近視生成影響。

首先，確認針對PAX-6之短髮夾型RNA可以劑量依賴方式降低視網膜色素上皮細胞內PAX6 表現(第4A圖)。PAX6 的減少顯著增加了視網膜色素上皮細胞增生(第4B與4C圖)。由於先前之研究已報導，在近視發展期間，TGF-β的增加為視網膜鞏膜訊號傳遞途徑(retinoscleral signaling pathway)的重要因子(J Exp Eye Res 2009；88：458-466.)，因此，接下來測試PAX6 是否會於視網膜色素上皮細胞中影響TGF-β表現。結果顯示，於視網膜色素上皮細胞中，抑制PAX6則會顯著增強了TGF-β3(但非TGF-β1或TGF-β2)的表現(第4D-4F圖)。

為了進一步證實PAX6 可於視網膜色素上皮細胞中調節TGF-β3表現，更進一步以增加功能(gain-of-function)實驗來證實。將PAX6 的全長cDNA(1269 bp；NM_000280)選殖進pEGFP-N3質體中(第5A圖)。視網膜色素上皮細胞將會過度產生PAX6 蛋白質。PAX6 的過度表現顯著抑制 了TGF-β3的表現(第5B圖)。此結果指出，經由調控TGF-β3媒介之訊號傳遞，PAX6 可參與近視的形成。

4.微型RNA-328影響視網膜色素上皮生存能力與TGF-β表現

上述實驗已確認了PAX6 為一微型RNA-328目標基因，且因此更進一步研究微型RNA-328對於視網膜色素上皮增生的影響。在以不同劑量之微型RNA-328模擬物轉染視網膜色素上皮細胞24小時之後，分別藉由WST-1與即時定量聚合酶鏈鎖反應(qPCR)分析來測量細胞存活與mRNA程度。如所預期，微型RNA-328模擬物劑量依賴地增加視網膜色素上皮細胞增生(第6A圖)，此結果與針對PAX6 之短髮夾型RNA之結果相似。於視網膜色素上皮細胞中，微型RNA-328模擬物顯著地誘導TGF-β3的表現(第6B圖)。此外，微型RNA-328模擬物對於TGF-β1與TGF-β2表現並未顯示顯著的影響。

5. PAX6對於鞏膜細胞的影響

鞏膜薄化、鞏膜膠原蛋白I(collagen I)聚集減少、整合蛋白β1(integrin β1)次單元表現降低，及基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP 2)增加，已被報導為在近視之發展中的重要表現(scleral phenotypes)(Exp Eye Res 2006；82：185-200.；Invest Ophthalmol Vis Sci 2006；47：4674-4682.；Exp Eye Res 1996；63：369-381.Invest Ophthalmol Vis Sci 2001；42：1153-1159.；Invest Ophthalmol Vis Sci 2002；43：2067-2075.)。測試於視網膜色素上皮細胞中PAX6表現的改變是否可影響鞏膜基因表現。以條件培養基來處理鞏膜細胞，條件培養基收集自PAX6表現低下的視網膜色素上皮細胞。在以條件培養基處理24小時之後，測量鞏膜細胞之細胞存活率與基因表現量改變。如於第7A圖中所示，發現一劑量依賴降低的鞏膜細胞存活率。此外，於鞏膜細胞中發現膠原蛋白I與整合蛋白β1程度的顯著降低，但於基質金屬蛋白酶2表現程度中的增加(第7B、7C、7D與7E圖)。

相對地，來自帶有過度表現之PAX6的視網膜色素上皮細胞的條件培養基對於鞏膜細胞增生、膠原蛋白I、整合蛋白β1與基質金屬蛋白酶2表現具有相反的影響(第8A、8B、8C、8D與8E圖)。因此，於視網膜色素上皮細胞中之PAX6表現程度顯著地影響鞏膜表現型。

6.視黃酸(retinoic acid)調控微型RNA-328表現

已報導在近視發展期間，視黃酸(retinoic acid,RA)表現增加(Ophthalmic Res 1998；30：361-367.；Vision Res 2004；44：643-653)。然而，在視黃酸於近視發展中的角色仍然不清楚。根據JASPAR資料庫(Nucleic Acids Res 2008；36：D102-106)，一些視黃酸敏感要素(responsive elements)位於微型RNA-328基因之2 kb啟動子(promoter)區域中。有鑑於視黃酸被預測可調控微型RNA-328表現，視黃酸處理之視網膜色素上皮細胞可提供一良好的模型以測試微型RNA-328與PAX6 在近視形成期間的角色。在以 不同劑量之視黃酸處理視網膜色素上皮細胞24小時後，分別藉由WST-1、即時定量聚合酶鏈鎖反應與免疫墨點分析來測量細胞存活率、RNA及蛋白質。如於第9A與9B圖中所示，視黃酸劑量依賴地增加視網膜色素上皮細胞增生。此外，藉由以一劑量依賴方式之視黃酸處理，於視網膜色素上皮細胞中之微型RNA-328表現量增加(第9C圖)，導致PAX6的表現量減少(第9D圖)。

7.確認微型RNA-328在近視老鼠之鞏膜及視網膜表現量增加

在前述微型RNA-328在近視老鼠之鞏膜及視網膜表現量的確認中，結果發現，微型RNA-328在近視眼的視網膜(第10A圖)及鞏膜(第10B圖)均較同一幼鼠對側沒遮蓋眼或另一完全正常老鼠的眼有較高的表現量。

8.確認鎖核酸修飾之微型RNA-328反股可進入眼球組織內

在前述鎖核酸修飾之微型RNA-328反股是否可進入眼球組織內之確認中，負控制組(正常老鼠眼睛)與正控制組(染色時另外加入鎖核酸修飾微型RNA-328之反股)之結果如第11A圖所示，而鎖核酸修飾微型RNA-328之反股處理組的結果則如第11B圖所示。由第11B圖可得知，鎖核酸修飾微型RNA-328之反股所在位置會被染成紫色(箭 號所標示處)。無論是否使用微脂體包埋，均可看到眼球組織尤其是鞏膜具有紫色顏色反應，確認鎖核酸修飾之微型RNA-328之反股可以眼藥水方式滴入眼球組織內，以達到預期治療近視的療效。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖顯示不同類型之經化學修飾之核酸。

第2A圖顯示於PAX6 3’UTR中微型RNA-328-結合的位置的示意圖。

第2B圖分別顯示微型RNA-328與PAX6 於視網膜色素上皮細胞與鞏膜細胞中之內生表現量。微型RNA-328與PAX6 的相對程度為藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應來分析。

第2C圖顯示以鎖核酸修飾微型RNA-328探針或負控制組來對小鼠眼組織(ocular tissues)進行原位雜合的結果。左欄：微型RNA-328之原位雜合顯示微型RNA-328存在於小鼠之正常眼睛(箭號顯示位置)(n=2)。右欄：原位雜合的負控制組(即，沒有微型RNA-328探針)沒有顯示任何訊號。

第2D與2E圖分別顯示微型RNA-328模擬物結合上野生型PAX6 3’UTR與突變型PAX6 3’UTR之螢光酶分析的結果。將細胞分別以600 ng pMiR-PAX6 3’UTR或突變型PAX6 3’UTR進行轉染並給予微型RNA-328模擬物。於24小時後，測量螢光酶活性。也將pEGFP質體共轉染進細胞，且將GFP訊號做為內部控制組。

第2F圖顯示微型RNA-328模擬物以一劑量依賴方式降低PAX6 表現。在給予細胞微型RNA-328模擬物24小時之後，分別藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應與免疫墨點分析來分析PAX6 之mRNA與蛋白質程度。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第3圖顯示微型RNA-328結合能力被PAX6 3’UTR SNP rs662702所調控。建構兩個報導構築體：一個攜帶三個3’UTR SNP rs662702之風險性C對偶基因(allele)，而另一個攜帶三個保護性T對偶基因。將構築體與微型RNA-328模擬物共轉染進視網膜色素上皮細胞。在24小時培養後，測量螢光酶活性。也將pEGFP質體共轉染進細胞，且將GFP訊號做為內部控制組。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第4A圖顯示針對PAX6短髮夾型RNA於視網膜色素上皮細胞中劑量依賴地降低PAX6表現。

第4B與4C圖分別顯示以顯微鏡觀察及WST-1分析證實於視網膜色素上皮細胞中PAX6 表現量降低時會增強視網膜色素上皮細胞增生。

第4D-4F圖顯示降低PAX6 誘導表現。在將細胞以針對PAX6短髮夾型RNA轉染24小時之後，藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應來分析PAX6、TGF-β1、TGF-β2與TGF-β3的相對mRNA程度。藉由免疫墨點來分析PAX6的蛋白質表現程度。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第5A與5B圖分別顯示於視網膜色素上皮細胞中PAX6的過度表現與其所造成之抑制TGF-β3表現。在將細胞以pEGFP-PAX6質體之劑量依賴地轉染24小時之後，藉由使用即時定量聚合酶鏈鎖反應來分別分析PAX6與TGF-β3之相對mRNA程度。藉由使用西方墨點分析來分析PAX6之蛋白質表現程度。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第6A與6B圖分別顯示微型RNA-328增加視網膜色素上皮細胞增生與微型RNA-328增加TGF-β3表現。在將細胞以微型RNA-328模擬物轉染24小時之後，藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應測量TGF-β3之相對mRNA程度。藉由WST-1分析來分析細胞存活率。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第7A至7E圖分別顯示於視網膜色素上皮細胞中之PAX6表現量下降時如何影響鞏膜細胞存活率(第7A圖)、膠原蛋白I、整合蛋白β1與基質金屬蛋白酶2的mRNA程度(第7B至7D圖)，以及膠原蛋白I、整合蛋白β1與基質金屬蛋白酶2之蛋白質表現程度(第7E圖)。在將視網膜色素上皮細胞以針對PAX6 短髮夾型RNA轉染24小時之後，收集條件培養基並將加至鞏膜細胞。分別藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應與免疫墨點來測量於鞏膜細胞中之相對mRNA與蛋白質程度。藉由WST-1分析來研究細胞存活率。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第8A至8E圖分別顯示過度表達PAX6之視網膜色素上皮細胞影響鞏膜細胞存活率(第8A圖)、膠原蛋白I、整合蛋白β1與基質金屬蛋白酶2的mRNA程度(第8B至8D圖)，以及膠原蛋白I、整合蛋白β1與基質金屬蛋白酶2之蛋白質程度(第8E圖)。在將視網膜色素上皮細胞以攜帶有PAX6基因之質體進行轉染24小時之後，收集條件培養基並將加至鞏膜細胞。分別藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應與免疫墨點來測量於鞏膜細胞中之相對mRNA與蛋白 質程度。藉由WST-1分析來研究細胞存活率。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第9A與9B圖分別顯示藉由顯微鏡觀察與WST-1分析經視黃酸處理之視網膜色素上皮細胞的結果，而結果顯示視黃酸增加視網膜色素上皮細胞增生。在以視黃酸處理細胞24小時之後，藉由顯微鏡來觀察及藉由WST-1分析來測量細胞存活能力。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第9C與9D圖分別顯示視黃酸誘發微型RNA-328表現與視黃酸降低PAX6 表現。在以視黃酸處理細胞24小時之後，藉由即時定量聚合酶鏈鎖反應來測量微型RNA-328與PAX6 之相對mRNA程度。藉由免疫墨點來測量PAX6之蛋白質程度。資料為三個實驗之平均值±標準差，且*代表p值<0.05。

第10A圖顯示微型RNA-328在視網膜中的表現量：在正常老鼠(控制組)，實驗老鼠之正常眼(對側眼控制組)及實驗老鼠之近視眼。

第10B圖顯示微型RNA-328在鞏膜中的表現量：在正常老鼠(控制組)，實驗老鼠之正常眼(對側眼控制組)及實驗老鼠之近視眼。

第11A與11B圖顯示將鎖核酸修飾微型RNA-328之反股以眼藥水滴劑方式滴到小鼠眼睛，之後對小鼠眼睛做切片並進行原位雜交之結果。第11A圖顯示負控制組與正控制組的結果，而第11B圖分別顯示眼藥水滴劑中包含未包 埋之鎖核酸修飾微型RNA-328之反股與包埋於微脂體之鎖核酸修飾微型RNA-328之反股的結果。於第11A與第11B圖中，左圖片為200倍拍攝；右圖為左圖中方格放大。結果顯示鎖核酸修飾微型RNA-328之反股可達眼睛的視網膜及鞏膜(呈紫色反應(箭號所指出))。A：視網膜；B：脈絡膜；C：鞏膜。

<110> 干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途

<120> 高雄醫學大學

<130> 0911-A52745TW

<160> 29

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 33170

<212> DNA

<213> 人類

<400> 1

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人類

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<212> RNA

<213> 人類

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<212> RNA

<213> 人類

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 人工合成微型RNA序列

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<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成微型RNA序列

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 人工合成微型RNA序列

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> 人工合成短髮夾RNA序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引子

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<223> 引子

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<223> 引子

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Claims (10)

1. 一種干擾性RNA(RNA interference,RNAi)用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該干擾性RNA具有中和另一干擾性RNA之能力，而該另一干擾性RNA為一具有抑制PAX-6 基因表現之能力的干擾性RNA，又該具有抑制PAX-6 基因表現之能力的干擾性RNA包括微型RNA-328，其中該干擾性RNA包括一用以中和微型RNA-328之反股RNA(antisense RNA)，而該用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列包括序列辨識號：5或序列辨識號6，或者，該用以中和微型RNA-328之反股RNA的序列包括序列辨識號：7。
2. 如申請專利範圍第1項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該一用以中和微型RNA-328之反股RNA係由未經修飾之RNA所構成或包括至少一個經化學修飾之核酸。
3. 如申請專利範圍第1項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該經化學修飾之核酸包括磷酸二酯核酸(phosphodiester nucleic acid)、硫代磷酸核酸(phosphorothioate nucleic acid)、甲基磷酸核酸(methylphosphonate nucleic acid)、磷醯胺核酸(phosphoroamidate nucleic acid)、2’-甲氧基核酸(2’-O-methyl nucleic acid)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、N-嗎啉(N-Morpholino)或鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)。
4. 如申請專利範圍第1項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該經化學修飾之核酸為鎖核酸。
5. 如申請專利範圍第1項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該干擾性RNA與一藥學上可接受之載體或鹽類一起被配製為一藥物。
6. 如申請專利範圍第5項所述之干擾性RNA用於製備治療近視之藥物的用途，其中該藥物為一眼藥水滴劑形式。
7. 如申請專利範圍第5項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該藥學上可接受之載體包括一奈米粒子。
8. 如申請專利範圍第7項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該奈米粒子包括微脂體、微胞、金屬奈米顆粒或聚合物奈米顆粒。
9. 如申請專利範圍第7項所述之干擾性RNA用於製備治療及/或預防近視之藥物的用途，其中該奈米粒子為微脂體。
10. 如申請專利範圍第9項所述之干擾性RNA用於製備治療近視之藥物的用途，其中該藥物為一眼藥水滴劑形式。