JP2002535377A - コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む配合物 - Google Patents

コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む配合物

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Abstract

(57)【要約】 コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドを薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルとともに含む治療用および／または整形用の配合物は、コネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする際に有用であり、特に、ニューロン細胞の死の低下、傷の治癒、炎症の低下、傷痕形成の低下、ならびに皮膚の若返りおよび厚化において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、治療的処置および／または整形的処置において使用される配合物に
関し、詳しくは、直接的な細胞−細胞連絡の限局的な破壊が望まれる配合物に関
する。
【０００２】 （背景） ギャップ結合は、直接的な細胞−細胞連絡を容易にする細胞膜構造である。ギ
ャップ結合チャンネルが、それぞれが６個のコネキシンサブユニットから構成さ
れる２つの半チャンネル（コネキソン）から形成されている。これらのコネキシ
ンは、その分子量に従って一般に名付けられているか、あるいは系統発生的な基
準に基づいて、すなわち、αクラスおよびβクラスに分類されるタンパク質のフ
ァミリーである。
【０００３】 従って、コネキシンの発現を制御する能力（特に、コネキシン発現をダウンレ
ギュレーションする能力）は、治療目的および／または矯正目的のために患者に
おける細胞−細胞連絡を調節する可能性をもたらす。しかし、多数のコネキシン
タンパク質が身体中で広く発現しているので、全身的なダウンレギュレーション
作用は、治療効果を特定の部位において誘導する際には望ましくない。
【０００４】 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、特異的な遺伝子発現
を操作する薬剤として大きな可能性を有している（総説：Ｓｔｅｉｎ他、１９９
２；Ｗａｇｎｅｒ、１９９４）。しかし、克服することが必要な困難が依然とし
て存在する。これらには、そのようなＯＤＮの短い半減期（未修飾のホスホジエ
ステルオリゴマーは、典型的には、細胞内の半減期が、細胞内ヌクレアーゼによ
る分解のために２０分にすぎない（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４））、および標的組
織に対する安定かつ確実な送達が含まれる。
【０００５】 本出願人が本発明を考案したのは、これらの困難を少なくとも部分的に克服す
ることを目的としている。
【０００６】 （発明の要旨） 従って、第１の局面において、本発明は、治療的処置および／または整形的処
置において使用される配合物であって、コネキシンタンパク質に対する少なくと
も１つのアンチセンスポリヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリアまたはビ
ヒクルとともに含む配合物を提供する。
【０００７】 １つの好ましい形態において、配合物は、１つのコネキシンタンパク質のみに
対するポリヌクレオチドを含有する。最も好ましくは、このコネキシンタンパク
質はコネキシン４３である。
【０００８】 本発明の多くの局面がオリゴデオキシヌクレオチドに関して記載されている。
しかし、他の好適なポリヌクレオチド（ＲＮＡポリヌクレオチドなど）がこれら
の局面において使用され得ることが理解される。
【０００９】 あるいは、配合物は、２つ以上のコネキシンタンパク質に対するオリゴデオキ
シヌクレオチドを含有する。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドが指向す
るコネキシンタンパク質の１つはコネキシン４３である。オリゴデオキシヌクレ
オチドが指向する他のコネキシンタンパク質には、コネキシン２６、コネキシン
３１．１およびコネキシン３２が含まれる。
【００１０】 好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１１】
【化５】 から選択される。
【００１２】 最も好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１３】
【化６】 である。
【００１４】 好都合には、コネキシン２６に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１５】
【化７】 である。
【００１６】 好都合には、コネキシン３１．１に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１７】
【化８】 である。
【００１８】 好都合には、コネキシン３２に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１９】
【化９】 である。
【００２０】 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、非経口投与、筋肉内投与、大脳内
投与、静脈内投与、皮下投与または経皮投与のために配合することができる。ア
ンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは（処置しようとする部位に）局所投
与される。好適には、アンチセンスポリヌクレオチドは、薬学的組成物を得るた
めに薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤と一緒にされる。
【００２１】 好適な薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルには、局所投与のために広
く使用されている任意のものが含まれる。局所用配合物は、クリーム、軟膏、ゲ
ル、エマルション、ローションまたは塗布剤の形態であり得る。本発明の配合物
はまた、含浸包帯の形態で提供され得る。
【００２２】 好適なキャリア材には、局所投与のためのクリーム、ローション、ゲル、エマ
ルションまたは塗布剤の基剤として広く使用されている任意のキャリアまたはビ
ヒクルが含まれる。例として、乳化剤、炭化水素基剤を含む不活性なキャリア、
乳化基剤、非毒性の溶媒または水溶性基剤が挙げられる。特に好適な例として、
ラノリン、硬パラフィン、液状パラフィン、軟黄色パラフィンまたは軟白色パラ
フィン、白蜜ろう、黄蜜ろう、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、
ジメチコーン、乳化ワックス、ミリスチン酸イソプロピル、微結晶ワックス、オ
レイルアルコールおよびステアリルアルコールが挙げられる。
【００２３】 好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルはゲルであり、好ま
しくは非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体ゲル（
例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル、プルロニックＦ−１２７（Ｂ
ＡＳＦ Ｃｏｒｐ．））である。このゲルは、低温で液体であるが、生理学的温
度で急速に硬化し、それにより適用部位またはそのような部位のすぐ近くでのＯ
ＤＮ成分の放出が制限されるために特に好ましい。
【００２４】 カゼイン、ゼラチン、アルブミン、膠剤、アルギン酸ナトリウム、カルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースまたはポリ
ビニルアルコールなどの補助的な薬剤もまた本発明の配合物に含ませることがで
きる。
【００２５】 薬学的組成物は、アンチセンスポリヌクレオチドの持続的な放出が得られるよ
うに配合することができる。
【００２６】 好都合なことに、配合物はさらに、オリゴデオキシヌクレオチドの細胞浸透を
助ける界面活性剤を含むか、または配合物は任意の好適な負荷剤を含有すること
ができる。ＤＭＳＯなどの任意の好適な非毒性の界面活性剤を含むことができる
。あるいは、尿素などの経皮浸透剤を含むことができる。
【００２７】 さらなる局面において、本発明は、治療目的および／または整形目的のために
コネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法で
あって、上記に記載された配合物を、前記のダウンレギュレーションが必要とさ
れる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法を提供する。
【００２８】 なおさらなる局面において、本発明は、その他の場合では、患者の脳、脊髄ま
たは視神経における特異的部位に対するニューロン傷害から生じるニューロン細
胞の死を低下させる方法であって、前記部位およびそのすぐ近くにおけるコネキ
シンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために
、上記に規定された配合物を前記部位に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２９】 好ましくは、配合物は、脳、脊髄または視神経に対する物理的外傷によるニュ
ーロン喪失を低下させるために投与される。
【００３０】 好都合なことに、配合物は、投与後の少なくとも２４時間にわたって前記のコ
ネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするた
めに十分な量で投与される。
【００３１】 なおさらなる局面において、本発明は、患者の傷治癒を促進する方法であって
、前記傷の部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは
複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を
前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３２】 通常、傷は、火傷を含む外傷の結果である。しかし、傷は手術の結果であって
もよい。
【００３３】 なおさらなる局面において、本発明は、物理的外傷を受けた傷および／または
組織を処置することの一部としての炎症を低下させる方法であって、上記に規定
された配合物を前記傷または組織あるいはその近くに投与する工程を含む方法を
提供する。
【００３４】 好ましくは、前記傷は火傷である。
【００３５】 あるいは、前記傷は、脳、脊髄または視神経などのニューロン組織を含む組織
に対する物理的外傷の結果である。
【００３６】 なおさらなる局面において、本発明は、傷を受けた患者の傷痕形成を低下させ
る方法であって、前記傷の部位またはそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク
質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定
された配合物を前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３７】 再度ではあるが、傷は外傷または手術の結果であり得るし、配合物は、外科的
な修復および／またはその閉鎖の直前にその傷に適用される。
【００３８】 なおさらなる局面において、本発明は、整形目的または治療目的のために皮膚
を若返らせるか、または厚くする方法であって、上記に規定された配合物を皮膚
表面に１回または反復的に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３９】 好都合なことに、前記配合物は、コネキシン２６またはコネキシン４３に対す
るオリゴデオキシヌクレオチドを含み、そして上皮基底細胞の分裂および増殖を
調節するために投与される。
【００４０】 別の実施形態において、前記配合物は、コネキシン３１．１に対するオリゴデ
オキシヌクレオチドを含み、そして外層の角質化を調節するために投与される。
【００４１】 好ましくは、配合物はクリームまたはゲルである。
【００４２】 （図面の簡単な説明） 図１〜図５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、また
はプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害
部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除
く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ
×２ｍｍである。
【００４３】 図１Ａおよび図１Ｃは、傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つ
の面を示す。傷害部はプルロニックゲル単独で処置されている。切片はＮｉｓｓ
ｌ染色（青色核）され、ニューロンマーカーのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（褐色細胞
）で抗体標識されている。図１Ｂおよび図１Ｄは、印を付けた傷害部の輪郭に関
する図１Ａおよび図１Ｃのグレースケール像をそれぞれ示す。傷害部の大きなサ
イズおよび不規則に広がった端に注意すること。傷害部は、傷害を与えたちょう
ど２４時間以内に脳梁（点線）に向かって下側に広がっている。
【００４４】 図２は、傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示す。図２Ａには、Ｎｉ
ｓｓｌ染色（青色核）および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示さ
れている。図２Ｂは、印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上
に関するグレースケール等価図である。元の針跡は明瞭であるが、ニューロンの
死が、Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識によって示されているように、傷害部端の十分
な後方に生じている。傷害部の端は不規則であり、傷害部は、ちょうど２４時間
以内に脳梁内にまっすぐ広がった。
【００４５】 図３Ａおよび図３Ｂは、傷害を与えた４８時間後の、コネキシン４３アンチセ
ンスで処置された傷害部のカラー像およびグレースケール像である。傷害部の輪
郭には、傷害部の広がりおよび印をつけた脳梁（点線）の頂部を示すために、図
３Ｂにおいて印が付けられている。図３Ａは、Ｎｉｓｓｌ（青色核）およびＮｅ
ｕｒｏｎａｌ−Ｎ（ピンク細胞）について染色されている。コントロールの傷害
部と比較して、傷害部は４８時間後でさえもかなり密集していることに注意する
こと（図１および２）。右側に少しの広がりが存在するが、傷害部の左側は、本
質的には元の針跡に従い、広がりの徴候はほとんど見られない。傷害部の左側は
非常に直線的であるが、脳梁まで広がっていない。
【００４６】 図４Ａおよび図４Ｂは、傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３ア
ンチセンス処置傷害部を示す。標識は、グレースケール像（図４Ｂ）に輪郭が示
される傷害部に関する図３と同じである。４８時間後でさえ、この傷害部は極め
て密集しており、左側（中央側）へのみのわずかな広がりが見られる。傷害部の
右側は、針跡の端までの生存ニューロン（傷害部領域内で実際に生存している）
を伴ってかなり直線的であることに注意すること。傷害部は、脳梁（点線）の十
分に上方にあり、実際には下方向の広がりがないことを示している。
【００４７】 図５は、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部の端を示す高倍率像
である。傷害部の端に印が付けられ、傷害を与えた４８時間後でさえ、傷害を与
えた針跡の端までの生存ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ染色）が示されてい
る。
【００４８】 図６は、傷害を与えた２４時間後の、コネキシン４３に特異的なアンチセンス
で処置された傷害部のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組
織化学的標識である。像は、傷害部の深さの半分の地点での傷害部の側方端で得
られている。活性化された星状膠細胞のレベルは、コントロール（図７）と比較
して上昇しており、コネキシン４３のレベルは著しく低下している。残存するコ
ネキシン標識は、一般に血管（矢印）に結合している。
【００４９】 図７は、傷害を与えた２４時間後の、コントロール傷害物のＧＦＡＰ（赤色）
およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。像は傷害部の中央
端から得られ、ＧＦＡＰレベルが、傷害を受けていない皮質よりもわずかに上昇
したことを示している。ＧＦＡＰ星状膠細胞マーカー（矢印）と同時に存在する
ことが多い広範囲のコネキシン４３標識に注意すること。
【００５０】 図８は、傷害を与えた２４時間後（丸）および４８時間後（ひし形）における
傷害部断面の下側半領域の比較を示す。分析を、冠状面で切断された連続的な切
片化傷害部の中央部分について行った。傷害部は、生存ニューロンを明らかにす
るＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識を使用して評価した。ＤＢ１で処置された傷害
部（緑色マーカー）は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチドで処置されている。ゲルのみの傷害部群（赤色マーカー）もまた、
中身のない傷害部を含み、ＨＢ３群（紫色マーカー）は、ランダム配列のコント
ロールオリゴデオキシヌクレオチドを含有するゲルで処置されている。コネキシ
ン４３アンチセンスで処置された傷害部が大きくなっている場合がある（アンチ
センスが十分に送達されていない場合と考えられる）が、非常に小さくなった傷
害部はすべて、コネキシン４３アンチセンスで処置されていることに注意するこ
と。傷害部は２ｍｍの深さに達し、分析はその１ｍｍ下までを含み、アンチセン
スが到着しなかった外側端を除くようにした。
【００５１】 図９は、コネキシン４３のセンスＯＤＮおよびアンチセンスＯＤＮによる処置
を行った２４時間後のラット脊髄における傷害部である。センスで処置された傷
害部は未処置のコントロールと差がなかったが、アンチセンスで処置された傷害
部は小さくなり、炎症が低下していた。
【００５２】 図１０は、コネキシン４３のセンスＯＤＮ（左肢）およびアンチセンスＯＤＮ
（右肢）による処置を行った２４時間後の新生児マウス前肢における傷害部であ
る。アンチセンスで処置された肢における炎症の低下および増大した治癒速度に
注意すること。
【００５３】 図１１は、図１０に示された２４時間の傷の中心部を通る切片である。切片は
、好中球を明らかにするためにトルイジンブルーで染色されている。アンチセン
スで処置された傷には、著しいことに好中球がほとんど存在しておらず、炎症も
ほとんど生じていなかった。
【００５４】 図１２は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコン
トロールＯＤＮで処置された、傷害を与えた５日後のラット肢の組合せである。
アンチセンスで処置された傷害部は、より早く治癒しつつあり、傷痕の徴候はほ
とんど見られない。
【００５５】 図１３は、新生児段階で作製されたラット肢の傷害部の組合せであり、この場
合には傷害を与えた８日後が示されている。傷害部は、コネキシン４３に特異的
なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯＤＮで処置された。毛が成
長し、そして、アンチセンス処置により、より小さな傷痕、およびより少ない毛
喪失が得られたことが明かである。傷害部の部位は、センスで処置されたコント
ールでは依然として目立っているが、アンチセンスで処置された肢では検出する
ことが困難である。
【００５６】 （発明の詳細な説明） 上記に広く規定されているように、本発明の中心は、コネキシン発現の部位特
異的なダウンレギュレーションにある。これは、コネキシン発現をダウンレギュ
レーションさせる部位での直接的な細胞−細胞連絡を低下させるという作用を有
し、これにより、下記に記載されているように多数の治療的／整形的な適用がも
たらされる。
【００５７】 コネキシン発現のダウンレギュレーションは、一般には、アンチセンスポリヌ
クレオチド（ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）を使
用するアンチセンス法に基づいており、より詳細には、アンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用に基づいている。これらのポリヌクレオチド
（例えば、ＯＤＮ）は、ダウンレギュレーションすべきコネキシンタンパク質（
１つまたは複数）を標的とする。典型的には、ポリヌクレオチドは一本鎖である
が、二本鎖であってもよい。
【００５８】 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および／または
翻訳を阻害することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、コネ
キシン遺伝子からの転写および／または翻訳の特異的な阻害剤であり、他の遺伝
子からの転写および／または翻訳を阻害しない。その産物は、（ｉ）コード領域
の５’および／または（ｉｉ）コード領域および／または（ｉｉｉ）コード領域
の３’のいずれかでコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡに結合することができる。
【００５９】 一般に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンのｍＲＮＡお
よび／またはタンパク質の細胞内での発現を低下させる。
【００６０】 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、一般には、コネキシンｍＲＮＡに
対するアンチセンスである。そのようなポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮ
Ａにハイブリダイゼーションし得ることがあり、従って、コネキシンの発現が、
転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡの核からの輸送、翻訳またはｍＲＮＡ分
解を含むコネキシンｍＲＮＡ代謝の１つまたは２つ以上の局面を妨害することに
よって阻害され得る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、
コネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションして、ｍＲＮＡの翻訳の直接的な
阻害および／または脱安定化をもたらし得る二重鎖を形成する。そのような二重
鎖はヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。
【００６１】 本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部にハイブ
リダイゼーションすることができる。典型的には、本発明のアンチセンスポリヌ
クレオチドは、コネキシンｍＲＮＡのリボソーム結合領域またはコード領域にハ
イブリダイゼーションする。本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡ
の全体または一部の領域に対して相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部の完全な相補体であり得る。しかし、
絶対的な相補性は必要とされず、生理学的条件のもとで、２０℃、３０℃または
４０℃よりも大きな脱離温度を有する二重鎖を形成するために十分な相補性を有
するポリヌクレオチドが、本発明における使用には特に好適である。
【００６２】 従って、本発明のポリヌクレオチドは、典型的にはｍＲＮＡのホモログである
。本発明のポリヌクレオチドは、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなどの中度から高度のストリンジェン
シーな条件のもとでコネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドであり得る。
【００６３】 本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、長さが６ヌクレオチド〜４０ヌク
レオチドである。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは長さが１２ヌクレオ
チド〜２０ヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、長さが少なくと
も４０ヌクレオチドであってもよく、例えば、少なくとも６０ヌクレオチドまた
は少なくとも８０ヌクレオチドであり、そして１００ヌクレオチドまで、２００
ヌクレオチドまで、３００ヌクレオチドまで、４００ヌクレオチドまで、５００
ヌクレオチドまで、１０００ヌクレオチドまで、２０００ヌクレオチドまで、ま
たは３０００ヌクレオチドまで、またはそれ以上までのヌクレオチドの長さであ
ってもよい。
【００６４】 コネキシンタンパク質またはＯＤＮに標的とされるタンパク質は、ダウンレギ
ュレーションが作用する部位によって変わる。このことはコネキシンサブユニッ
ト組成物による、体全体の各種部位におけるギャップ結合の不均一構造を反映し
ている。コネキシンはヒトまたは動物において自然発生するいずれのコネキシン
でもよい。コネキシン遺伝子（コード化配列を含む）は一般に、表１に示すコネ
キシン４３コード化配列と相同であるように、本明細書で述べる特定のコネキシ
ンのいずれとも相同性を持つ。コネキシンは通常、αまたはβコネキシンである
。好ましくは、コネキシンは皮膚または神経組織（脳細胞を含む）中で発現され
る。
【００６５】 しかし一部のコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関しては他のタンパク
質よりも遍在性である。最も広範囲に及ぶもののひとつは、コネキシン４３であ
る。したがって、コネキシン４３を標的とするＯＤＮは本発明での使用に特に適
している。
【００６６】 別個のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮを組み合わせて使用すること
（たとえば、１、２、３、４またはさらに異なるコネキシンを標的としてもよい
）も考慮されている。たとえばコネキシン４３を標的とするＯＤＮおよびコネキ
シン族の他の１個以上の要素（コネキシン２６、３１．１、３２、３６、４０お
よび４５）は組み合わせて使用できる。
【００６７】 個々のアンチセンスポリヌクレオチドはあるコネキシンに対して特異性である
か、１、２、３またはさらに別のコネキシンを標的とすることがある。特異性ポ
リヌクレオチドは一般に、コネキシン間で保存されないコネキシン遺伝子または
ｍＲＮＡ内の配列を標的とするが、非特異性ポリヌクレオチドは保存配列を標的
とする。
【００６８】 本発明で使用するＯＤＮは一般に、未修飾ホスホジエステルオリゴマーとなる
。これらの長さは変化するが、３０ｍｅｒＯＤＮを持つものが特に適する。
【００６９】 アンチセンスポリヌクレオチドは化学修飾してもよい。化学修飾によってヌク
レアーゼに対する耐性が高まり、細胞を入れる能力が向上する。たとえばホスホ
ロチオ酸オリゴヌクレオチドが使用できる。他のデオキシヌクレオチド類似体と
しては、メチルホスホン酸、ホスホルアミド酸、ホスホロジチオ酸、Ｎ３’Ｐ５
’−ホスホルアミド酸、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオ酸、その２’−Ｏ
−アルキル類似体および２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホン酸が
挙げられる。
【００７０】 または、混合主鎖オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）を使用してもよい。ＭＢＯは
ホスホチオ酸オリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび修飾オリゴデオキ
シ−またはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメントを含む。ＭＢ
Ｏはホスホロチオ酸結合のセグメント、および非イオン性で、ヌクレアーゼに高
い耐性を持つメチルホスホン酸などの他の修飾オリゴヌクレオチドや２’−Ｏ−
アルキルオリゴリボヌクレオチドの他のセグメントを持つ。
【００７１】 本発明で使用するアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキ
シンタンパク質によって変わる。コネキシン４３の場合、次の配列を持つＯＤＮ
が特に適している：
【００７２】
【化１０】
【００７３】 他のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮは、任意の便利な従来の手法に
よって、そのヌクレオチド配列の観点から選択できる。たとえば、コンピュータ
プログラムのＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（米国オレゴン州の
ユージーンのＯｌｉｇｏ ｅｔｃ．）を使用できる。たとえば、コネキシン２６
、３１．１および３２のＯＤＮは以下の配列を持つ。
【００７３】
【化１１】 ＯＤＮはいったん選択すると、ＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。
【００７４】 本発明で使用する場合、ＯＤＮは部位特異性送達が必要である。これらは長期
間にわたる送達も必要とする。送達時間は明らかにダウンレギュレーションが誘
発される部位と望ましい治療効果の両方に依存し、２４時間以上の連続送達が必
要な場合が多い。
【００７５】 本発明によれば、このことは、ＯＤＮを製薬的に許容可能な担体またはビヒク
ルとともに、特に局所投与用の調合物の形の調合物中に包含させることによって
実現できる。
【００７６】 本発明の調合物はいったん調製してしまえば、細胞−細胞伝達における過渡的
および部位特異性の中断が望ましい場合のあらゆる治療／化粧用手法において有
用である。これらは、脳、脊髄または視神経におけるニューロン損傷の治療（損
傷ができるだけ局在化される場合）、創傷治癒の促進、たとえば成形外科およ火
傷の後の傷形成の低減などが含まれる。
【００７７】 特にクリームなどの局所調合物を使用して、上皮基底細胞の分裂ならびに増殖
（コネキシン４３を標的とするＯＤＮを使用）および外層角質化（コネキシン３
１．１を標的とするＯＤＮを使用）を調節できる。
【００７８】 アンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）は、実質的に遊離形で存在す
る。生成物は、生成物の所期の目的を阻害せず、実質的に遊離していると見なさ
れる担体または希釈在と混合してもよいことを理解されたい。本発明の生成物は
実質的に精製形であり、そのような場合、ポリヌクレオチドまたは調製物の乾燥
重量の一般に９０％、たとえば少なくとも９５％、９８％または９９％より成る
。
【００７９】 投与 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）（一般に本明細書で
述べる調合物の形で）はしたがって、本明細書で述べる疾病または症状のいずれ
かを持つヒトまたは動物などの、治療の必要なヒトまたは動物に投与される。す
ると、ヒトまたは動物の症状を改善することができる。ポリヌクレオチドおよび
調合物はそのため、治療によるヒトまたは動物の体の処置に使用できる。これら
は本明細書で述べる症状すべてを治療するための薬剤の製造に使用される。
【００８０】 アンチセンスポリヌクレオチドは局所的に（治療される部位に）投与できる。
製薬組成物を製造するために、アンチセンスポリヌクレオチドを製薬的に許容可
能な担体または希釈剤と組み合わせることが好ましい。適切な担体および希釈剤
としては、たとえばリン酸緩衝生理食塩水などの等張食塩水が挙げられる。該組
成物は、非経口、筋肉内、脳内、静脈内、皮下または経皮投与用に調合できる。
【００８１】 患者に投与されるアンチセンスポリヌクレオチドの用量は、年齢、体重および
患者の全身状態、治療する症状、投与される特定のアンチセンスポリヌクレオチ
ドなどによって変わる。しかし適切な投与量は、１〜４０ｍｇ／体重１ｋｇなど
、０．１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００８２】 哺乳類細胞による核酸の摂取は、たとえば形質移入剤の使用を含む手法などの
、複数の既知の形質移入手法によって向上する。投与される調合物はこのような
薬剤を含むことがある。このような薬剤の例としては、カチオン剤（たとえばリ
ン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（たと
えばリポフェクタム（登録商標）およびトランスフェクタム（登録商標））が挙
げられる。
【００８３】 熟練した医師は特定の患者および症状に最適な投与経路および用量をただちに
決定できるため、上述した投与経路および用量は単なる指標である。
【００８４】 相同体 本明細書では相同および相同体について述べる（たとえば該ポリヌクレオチド
はコネキシンｍＲＮＡにおける配列の相同体でもよい）。このようなポリヌクレ
オチドは一般に、たとえば（相同性配列の）少なくとも１５、２０、４０、１０
０以上の近接ヌクレオチドの領域に渡って、関連配列と少なくとも７０％は相同
性であり、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％は相同性で
あることが好ましい。
【００８５】 相同性は当業界におけるどの方法に基づいて計算してもよい。たとえばＵＷＧ
ＣＧパッケージは、相同性の計算に使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供
する（たとえばそのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ
ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ．
３８７−３９５）。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．（１９９３） Ｊ
Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ
ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０で述べられてい
るように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性やライ
ンアップ配列（通常はデフォルト設定で）を計算できる。
【００８６】 ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇ
ｏｖ／）を通じて、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース
配列中の同じ長さのワードとともに整列させた場合、ある正の閾値スコアＴに一
致または満足する問合せ配列における長さＷのショートワードを識別することに
よって、高得点配列対（ＨＳＰ）を最初に識別することを含む。Ｔは、隣接ワー
ドスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， 同上）と呼ばれる。これらの
初期隣接ワードのヒットが、それらを含むＨＳＰを見つける検索を開始する発端
として作用する。このワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加する
限りは、各配列に沿って両方向に拡張する。各方向のワードヒットの拡張は次の
場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値よりＸという量
だけ低下した場合；累積アラインメントスコアが、１個以上の負のスコアの残基
アラインメントの蓄積によって、ゼロ以下になった場合；またはどちらかの配列
の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、
アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォル
トとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈ
ｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）アライ
ンメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ） １０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比
較を用いる。
【００８７】 ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析を行う；たとえば
、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡ
ＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の基準の１つは最小和確率（Ｐ（Ｎ
））である。これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然発生す
る確率を示すものである。たとえば、第１の配列を第２の配列と比較した場合に
最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１
未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列と等
しいと見なされる。
【００８８】 相同性配列は通常、関連配列とは、少なくとも（またはせいぜい）２、５、１
０、１５、２０以上の（置換、欠失または挿入である）変異により相違する。こ
れらの突然変異は、相同性の計算に関連して上述したいずれの領域においても測
定できる。
【００８９】 相同性配列は通常、バックグラウンドよりも著しく高いレベルで、選択的に元
の配列にハイブリダイズする。選択的ハイブリダイゼーションは通常、厳密性が
中程度から高程度（たとえば、約５０〜６０℃において０．０３Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて実施される。しかし、
そのようなハイブリダイゼーションは、当業界で既知の適切などの条件下でも実
施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング
：実験室マニュアル）を参照）。たとえば高い厳密性が必要な場合、適切な条件
としては６０℃における０．２ｘＳＳＣが挙げられる。低い厳密性が必要な場合
、適切な条件としては６０℃における２ｘＳＳＣが挙げられる。
【００９０】 本発明の各種態様は、以下の実験節を引用して説明する。これらは例示のみの
ために与えられ、本発明の範囲を制限するものでないことを理解されたい。
【００９１】 実験 実験１ 物質および方法 アンチセンスの適用 リン酸緩衝生理食塩水（分子級水）中の３０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７ゲ
ル（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ）を用いて、未修飾ａ１コネキシン（コネキシン４３）
特異性アンチセンスＯＤＮを発生中のニワトリ胚に送達した（Ｓｉｍｏｎｓ，
ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ニワトリ胚は３８℃でインキュベートし、Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎおよびＨａｍｂｕｒｇｅｒのステージに従って実施した。卵に窓を開
け、治療する領域のｖｉｔｌｅｌｉｎｅおよび羊膜は細い鉗子を用いて開いた。
アンチセンスの適用の後、卵をテープで密封し、大半の実験が解析される４８時
間の間、インキュベータ内に置いた。ただし、ａ１コネキシン「ノックダウン」
および回復の時間経過解析の場合は除く。
【００９２】 Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃の低温では液体であるが、生理温度の胚に滴
下すると凝固して、少なくとも１２時間定着したままである。該ゲルの別の利点
は弱い界面活性剤であることであり、これは単独で使用したり、ＤＭＳＯととも
に使用すると、ＯＤＮの細胞内へ浸透を著しく促進するように思われる（Ｗａｇ
ｎｅｒ、１９９４）。共焦レーザー走査顕微鏡法を用いて見られる、ＦＩＴＣタ
グのＤＢ１ ＯＤＮへの付加は、プローブの細胞間貫入を示す。使用したデオキ
シオリゴヌクレオチドの配列は、表１に示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】 すべてのＯＤＮは、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭを範囲とする予備実験中の用量依
存解析の後、０．５〜１．０ｍＭ最終濃度で適用された。一般毒性効果は、ＯＤ
Ｎ濃度が１０ｍＭを超える場合のみに明らかになった。ＯＤＮゲル混合物は、−
８０℃で保存した濃縮貯蔵溶液から調製した。
【００９５】 アンチセンス配列 ＤＢ１は、ａ１コネキシン遺伝子の塩基１０９４−１１２３の対して相補性の
、マウスのアンチセンス配列である。ニワトリａ１コネキシン配列とは４つのミ
スマッチがある。ＣＧはニワトリａ１コネキシン塩基７２０−７４９に対して相
補性である。このプローブの有効性は、１％のジミメチルスフホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）をゲルに添加すると向上した。ＤＭＳＯは他のアンチセンスＯＤＮまたは対
照の結果に、追加の影響を与えなかった。
【００９６】 対照配列 ＤＢ１（ニワトリ）は、ニワトリａ１コネキシン塩基９５４−９８３に一致す
る、ＤＢ１のニワトリａ１コネキシン相当物である。しかし解析は、ステムルー
プ構造（Ｇ＝−７．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，ループＴｍ＝９２°）の形成およびホ
モ二量体化（Ｔｍ＝１．５°）が高い確率で生じることを示しているため、対照
配列として作用する。一部のセンスオリゴヌクレオチドが、転写を阻害する安定
なＤＮＡトリプレットを形成可能であることが報告されている（Ｎｅｃｋｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．， １９９３）。しかし、これはＤＢ１（センス）では明確では
なかった。安定な第２構造（Ｇ＝１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を持たず、不安定な
ホモニ量体化が生じるランダム対照配列も使用され、ＣＶ３と呼ばれた。ＤＢ１
の追加の対照適用同濃度混合物およびＤＢ１（センス）は、欠失のバックグラウ
ンドレベルを与えた。
【００９７】 タンパク質ノックダウンの監視 細胞−細胞界面におけるａｌコネキシンギャップ結合タンパク質の免疫組織化
学局在化は、アンチセンス効果の直接測定値を与える。アンチペプチドａ１コネ
キシン特異性抗体プローブを用いて、ホールマウント胚を染色し、コネキシン分
布は、確立された手順（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）に従って、共焦
レーザー走査顕微鏡法を用いて解析した。発生ニワトリ胚で発現される他の２つ
のコネキシン（コネキシンｂ１およびｂ２）の対照標識付けも、配列特異性抗体
を使用して同様に実施した（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００９８】 結果 ａ１コネキシン発現の低下 未修飾ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮを発生ニワトリ胚に送達する
ためにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲルを使用すると、タンパク質発現が選択
された時点で阻害され、ニワトリ胚の特定領域を標的としたアンチセンス治療が
可能となる。比較的低濃度でアンチセンスを含むゲルの小滴を各胚に正確に滴下
した。ゲルは凝固し、少なくとも１２時間は定着したままであるため、この領域
では低用量のアンチセンスが持続した。アンチセンス適用は、肢、神経管および
顔における上昇発現の前に結合を抑止するために、標的化および計時された。こ
れらの時間は、標的組織の細胞膜中にすでに存在するタンパク質のターンオーバ
ーに依存するのではなく、新たなタンパク質の発現を低下させることによってア
ンチセンスの効果を最適化するために選択した。ＤＢ１およびＣＧ１ ＯＤＮの
両者が、２時間以内に神経管および肢芽内のａ１コネキシンタンパク質の発現を
低下させ、４〜８時間内に劇的に低下させ、１８〜２４時間および４８時間では
一部の組織で持続していた（データは示さない）。ａ１コネキシンタンパク質の
ダウンレギュレーションは、使用したいずれの対照においても明確ではなかった
。同様に、ニワトリ胚で発現したコネキシン族の２つの要素、ｂ１コネキシンお
よびｂ２コネキシンは、ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮによって影響
を受けなかった。
【００９９】 すべての実験で、複数の並行対照を実施した。これらには；ＤＢ１センス、組
み合わされたＤＢ１アンチセンスおよびＤＢ１センス、（それ自体を用いてステ
ムループ構造を形成する）ＤＢ１ニワトリ、ランダムＯＤＮ’ｓ ＣＶ３、Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃゲル単独、ＤＭＳＯを含むＰｌｕｒｏｎｉｃゲル、ＰＢＳ単独が含
まれる。いずれの対照も、ａ１コネキシンタンパク質発現に対して顕著な効果は
示さなかった。
【０１００】 実験２ 概要 星状細胞は、哺乳類の脳において最も豊富な細胞種を構成している。これらは
主としてコネキシン４３より成るギャップ結合によって、相互におよびニューロ
ンに幅広く結合する（Ｇｉａｕｒｍｅ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９６）
）。誘発された虚血または物理的脳損傷の後、これらのチャネルは開いたままで
、（上昇した組織内カリウムならびにグルタミン酸およびアポトーシス信号によ
って開始される）機能低下の拡張波が伝播される（Ｃｏｔｒｉｎａ ｅｔ ａｌ
．，（１９９８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９８））。上昇したサイトゾルカ
ルシウムの波およびＩＰ３などの第２メッセンジャー分子は、ギャップ結合チャ
ネル経由で損傷領域の核を越えてゆっくりとニューロンに広がり、攻撃の２４〜
４８時間後に損傷への拡張が起きる。このような方法で、損傷していない隣接細
胞は破壊され（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、これがいわゆるバイスタ
ンダー効果である。
【０１０１】 本実験は、本発明の調合物がこのバイスタンダー効果を防止する能力を調査す
る。
【０１０２】 物質 オリゴヌクレオチドは以下の配列によって調製した。
【０１０３】
【化１２】
【０１０４】 方法 オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ） 未修飾ＯＤＮは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ
−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）によって送達した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは低温（０
−４℃）にて液体であり、生理温度にて凝固し、弱い界面活性剤でもある。未修
飾ＯＤＮは通常、細胞内での半減期が約２０分であるが（Ｗａｇｎｅｒ １９９
４）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル装填法によって連続拡散源が与えられ、ゲルがリザ
ーバーとして作用する（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９））。コネキ
シン４３に対して特異性のＯＤＮまたは同様の塩基組成の対照ランダムＯＤＮは
、２ｍＭの最終濃度にて適用した。ゲルのみの対照も実施された。ＯＤＮは３０
ｍｅｒであり、解析によってヘアーピンループまたはホモ二量体化が生じないこ
とが示された。
【０１０５】 障害 脳障害は２５０〜３００ｇのオスのウィスターラットで実施した。動物は酸素
中の１〜２％ハロセンによって麻酔をかけ、頭は定位固定クランプで保持した。
障害部位周辺の領域は剪毛し、頭骨上の皮膚はメスを用いて矢状断面で切開し、
頭骨板を露出させておくために引き戻した。Ａｒｌｅｃエングレーバーを用いて
前頂の右側に直径０．５ｍｍの穴を頭骨板３ｍｍに開け、マイクロメータステー
ジに結合された１９Ｇ１ １／２ゲージシリンジを用いて、脳の皮質内に窓外を
作成した。ステージによって正確な方向制御と、障害を脳梁のはるか上の皮質内
に維持する、正確な２ｍｍの貫入深さが可能となる。
【０１０６】 準備した動物を用いて、コネキシン４３特異性ＯＤＮ（または対照ＯＤＮ）を
含む、１０ｍｌの氷冷Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）を、先が
平らになるようにやすりで切り、予備冷却した１９Ｇ１ １／２ゲージ注射器の
針内に吸引した。注射針は、切り詰めた黄色いピペットチップによってメスピペ
ットに取り付けた。次に、針内のゲルは室温まで加温すると凝固した。チップに
ゲルの栓を含む針を、ＰＢＳを含む１ｍｌ注射器に付け替えて、過度に貫入する
のを防ぐため、針チップが（頭骨に対して直面している）スリーブを備えた障害
まで下げられるように、スリーブを針シャフト上に滑らせた。注射器のピストン
にゆっくりと圧を加えると、ゲルが針から押し出されて障害に貫入した。次に創
傷を過酸化水素で処置して出血を止め、皮膚を元通りに縫合した。動物を注意深
く監視し、２４時間後、４８時間後または１２日後に屠殺する準備ができるまで
放置した。
【０１０７】 凍結切断 動物はＮｅｍｂｕｔａｌ（ペントバルビトンナトリウム、Ｖｉｒｂａｃ）を用
いて屠殺し、断頭した。脳を損なわないように取り出し、ドライアイスでただち
に凍結させ、切断準備ができるまで−８０℃で保存した。連続凍結切片（３０ｍ
ｍ切片）を前部から後部（冠状面）まで採取し、乾燥した切片をクロム明礬処理
スライドに装着し、組織化学または免疫組織化学用に−８０℃で保存した。障害
の中間切片が明確に識別されるように、各障害の最初と最後の切片を記録した。
【０１０８】 組織化学 ヘマトキシリンおよびエオシン染色するため、切片を順次濃度を下げたアルコ
ール（無水、２×９５％、１×７０％、水）で水和させ、Ｇｉｌｌのヘマトキシ
リンで４分間染色した。次に切片を水で洗浄し、Ｓｃｏｔｔ水に浸漬し、再度水
で洗浄した。次にＭｏｏｒｅの緩衝エオシンで３０秒間染色した。切片を再度水
で洗浄してから、一連のアルコール（２×９５％、１×無水）、５０：５０のア
ルコール：キシロールで脱水し、キシレンに浸漬した。さらに切片をＨｉｓｔｏ
ｍｏｕｎｔａ封入剤を用いて標本とした。
【０１０９】 Ｎｉｓｓｌ染色のために、切片を順次濃度を上げたアルコール（７５％、９５
％、３×１００％）でそれぞれ５分間脱水し、キシレンで５分間脱脂した。次に
切片を順次濃度を上げた同一のアルコールで再度水和させ、水で洗浄した。さら
に切片をＮｉｓｓｌ染色溶液（５ｍｌの２％水性Ｃｒｅｓｙｌバイオレット原液
、９０ｍｌの６％氷酢酸水溶液、１０ｍｌの１．３５％酢酸ナトリウム溶液）中
に１０分間放置した。次いで切片を一連の昇順濃度のアルコール（７５％で５分
間、９５％と３×１００％で各２分間）と、キシレン×３でそれぞれ１０分間素
早く脱水した。さらにＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔａ封入剤を用いてカバーガラスをか
けた。
【０１１０】 免疫組織化学 最初に、凍結切片をＰＢＳ中で室温に戻した。次にメタノール中で２分間透過
化処理し、ＰＢＳですすいで、０．１Ｍリジンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ
のＰＢＳ溶液中に移して、３０分以上ブロッキングした。次にＰＢＳで２分間、
２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌの一次抗体を加えた。
【０１１１】 免疫組織化学法は、コネキシン４３に対する一次抗体であるＮｅｕｒｏｎａｌ
−Ｎｕｃｌｅｉ（脊椎動物固有の核タンパク質ＮｅｕＮ）およびＧＦＡＰ（グリ
ア原繊維酸性タンパク質）を用いて実施した。以下の抗体を使用した： 濃度１：３００のウサギ抗−Ｃｘ４３（Ｇｏｕｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９
９１）） 濃度１：１００のマウス抗−Ｃｘ４３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ， Ｉｎｃ．） 濃度１：１０００のウサギ抗−ラットＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ，Ｚ０３３４） 濃度１：０００のマウス抗ニューロン核（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）
【０１１２】 コネキシンおよびＧＦＡＰ用に、標識切片は４℃で一晩インキュベートした。
次に軌道振盪機上でＰＢＳによって１５分間、３回洗浄した。この後、過剰のＰ
ＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌのＡｌｅｘａａ４８８抗−ウサギＩｇＧ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）を１：２００の濃度で加え
た。モノクローナルおよび二重標識用に、ＣＹ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１３２Ｃ
）抗−マウス二次抗体を使用した。切片を暗所にて室温で２時間インキュベート
した後、ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。標本作成のため、過剰なＰＢＳを
スライドから除去し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（グリセロール／ＰＢＳ溶液）抗−退
色剤を１，２滴加えた。カバーガラスを切片上に下げて、マニキュア液で密封し
た。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識の場合、二次抗体はビオチン化ヤギ抗−マウスで
あって、次いでアビジン結合ＨＲＰおよびＤＡＢ反応（Ｓｉｇｍａ ＥｘｔｒＡ
ｖｉｄｉｎまたはＤＡＫＯ Ｑｕｉｃｋｓｔａｉｎキット）を行った。
【０１１３】 画像診断および分析 Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ共焦レーザー走査顕微鏡を用いて、免疫蛍光標識を
実施した。次いで、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｍｂｉｎｅ機能を用いて、またはＡｄｏｂ
ｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐによって二重標識画像を組み合わせた。ヘマトキシリン
およびエオシン、Ｎｉｓｓｌ染色サンプル、またはＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識切
片は、Ｋｏｎｔｒｏｎ（Ｚｅｉｓｓ）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ３００８デジタルカメ
ラを用いてキャプチャーし、障害領域はＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａ
ｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ）を用いて解析した。障害領域は各障害の中間切
片で解析した。
【０１１４】 結果 我々の対照ゲル実験、すべての障害、対照およびアンチセンス処理において、
外傷発生から最初の２４〜４８時間における詳細に記録された脳障害の拡大は、
ゲルの装填後、ゲルが停止しにくい外縁付近で広がる傾向を見せた。しかし、対
照障害は脳梁に向かって下方および側面に広がって、でこぼこに広がった縁を形
成した（図１および２）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識組織を調べると、障害
縁の十分後ろからニューロンの死が起こっており、Ｎｉｓｓｌ染色領域では生存
しているニューロンが残っていないことが明らかになった。この拡大は主として
２４時間以内に発生し（図１および２）、障害後４８時間まで続いた。このこと
は、図２で特に明確である。図２では、２４時間以内でニューロンの死が、障害
縁の十分後ろから別の正常に見える組織にかけて明らかであり、障害はすぐ下の
脳梁へ広がっている。これに対して、コネキシン４３アンチセンス処理した、よ
り良い障害は、元の障害部位に限定されたままであり、基準面が明確に限定され
ている（図３および４）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識はＮｉｓｓｌ染色組織と共
存し、いずれのコネキシン４３アンチセンス処理した障害も脳梁へは広がらない
。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識は、元の針路障害のすぐ縁までニューロンが生存し
ていることを示している。これらの障害周囲の生存ニューロンは、針路障害の縁
を示す明確な境界を規定することが多い（図３および５）。アンチセンス処理後
は、障害自体の内部でさらに多くの組織が生存している；対照障害では、細胞死
は障害区域内の組織損失を引き起こす（図２の２４時間後の対照障害と、図３お
よび４の４８時間後のアンチセンス処理障害を比較）。
【０１１５】 グリア原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の抗体標識によって、障害縁におけ
る星状細胞の活性化上昇が多少見られるのに対して、コネキシン４３タンパク質
レベルは、アンチセンス処理障害縁に沿った多くの箇所で、対照（図７）と比較
すると特に基底および内側縁（図６）で明らかに低下している。一部の領域では
、コネキシン４３特異性アンチセンス処理の２４時間後に残っているコネキシン
４３標識は、ＧＦＡＰレベルの上昇（図６）にもかかわらず、血管壁内にある。
一般にアンチセンス処理障害周辺を標識するコネキシン４３は、半分以上のコネ
キシン４３標識が星状細胞に関連している対照においてよりもはるかに低い程度
で、ＧＦＡＰと共存する。他のコネキシンレベル（コネキシン２６および３２）
は、コネキシン４３特異性アンチセンス処理によって変化したようには思われな
かった。
【０１１６】 ３６匹の動物に障害を加えた。２１匹の動物について断面積（冠状面における
中央切片の障害量）を解析した。結果を表２に示す。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】 最終解析では、（ゲルが障害の底部に注入および定置されるため）アンチセン
ス処理がほとんどまたは全く効果を示さない外縁にて広がる障害を除外するため
に、外側皮質縁から１ｍｍ下のラインによる障害領域を測定した。１匹のアンチ
センス処理動物がこのグループの平均から３倍標準偏差を超えて外れたため、こ
れを除外した。アンチセンス処理障害の平均障害サイズは２４および４８時間後
で、１．４５ｍｍ２（＋／−０．５５）であり、対照の場合は２．１ｍｍ２（＋
／−０．６）であった。（２４および４８時間後のアンチセンス処理８個および
対照障害８個のうち）最小の４個はすべてコネキシン４３処理によるものであり
、最小の対照障害はこれらの４個よりも５０％以上大きかった。このデータはさ
らに、図８に図式的に示してある。１２日後までに、ラットでは再生が起こり（
ヒトの脳組織では起こらないが）、障害拡大の限界は明確に規定されていなかっ
た。
【０１１９】 考察 Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル栓−アンチセンスＯＤＮ法を用いて、哺乳動物の脳の大
脳皮質における障害後に発生する星状細胞増加時の、コネキシン４３ノックダウ
ンの効果を調査した。脳において、瀕死のニューロンによる毒素放出によって、
バイスタンダー効果として知られる影響が生じ、毒素がギャップ結合チャネルを
通じて近隣細胞に広がる（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８））。神経変性条
件下で、毒素をゆっくりと放出させると、明らかに星状細胞におけるコネキシン
４３チャネルのアップレギュレーションが生じ、血流への毒素の輸送および血流
からの毒素の除去が可能となる。しかし重篤な外傷の場合は、このアップレギュ
レーションが高濃度の毒素が近隣のニューロンに広がるのを促進するため、近隣
のニューロンは死に至る。コネキシン４３アップレギュレーションおよびコネキ
シン４３チャネルのノックダウンを阻止すると、この広がりが阻害され、障害が
断面積で最大５０％に縮小する。このことは、虚血性脳卒中の処置、神経変性疾
病の治療、外科的介入による副作用の調整に多大な意味を持つ。
【０１２０】 実験３ 概要 損傷ニューロンが放出する毒素による神経組織におけるバイスタンダー効果が
近隣細胞に広がり、それを死に至らしめることは詳細に記録されている。実験２
は、ギャップ結合タンパク質コネキシン４３をノックダウンするアンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドの持続性放出手法を用いて、脳におけるこの効果を低
下させられることを示している。
【０１２１】 脳に似た組成の別の組織は脊髄であり、ここでは神経集団はグリア細胞の集団
によって支持されている。グリア細胞には、神経環境からグルタミン酸および過
剰なカルシウムを除去して神経保護効果を担っている星状細胞が含まれる。この
実験は、本発明の調合物が脊髄障害の拡張を低減する能力について調査する。
【０１２２】 物質 オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した。
【０１２３】
【化１３】
【０１２４】 方法 ウィスターラットに麻酔をかけ、脊髄を露出させた。脊髄に標準二等分障害を
作成し、コネキシン４３に対するアンチセンスまたはセンスＯＤＮ（５ｍＭ）の
いずれかを含む冷却Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル５ｍｌを障害中に配置した。適用は盲
目的に行った。次に露出した脊髄を元に戻し、ラットをケージに戻した。一部の
動物は２４時間後に屠殺したが、残りの動物は１２日間および２ヶ月間維持し、
ニューロン再生の程度と障害の最終サイズを判定した。軸索再生実験では、ラッ
トに麻酔をかけ、脊髄への入口部位の前で軸索を切断した。セイヨウワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）のペレットを切断部に配置して、軸索を２４時間に渡っ
て逆標識した。翌日ラットを屠殺し、その脊髄を取り出し、２％パラホルムアル
デヒドで固定した。次に脊髄を細胞切断用に処理し、索軸から連続した縦方向８
ｍｍの切片を取り出した。次いで切片を、コネキシンまたはＧＦＡＰ用にヨウ化
プロピジウムを核マーカーとして用いて免疫染色するか、ＨＲＰを示すように処
理した。
【０１２５】 結果 障害の２４時間後、コネキシン４３およびアンチセンスＯＤＮで処理した脊髄
には著しい相違が見られた。センス障害は未処理対照との相違は示さなかったが
、これに対してアンチセンス処理障害はより小さく、炎症が少ないように見えた
（図９）。
【０１２６】 １２日後、ＨＲＰ標識軸索はセンスおよびアンチセンス処理脊髄の両方で見ら
れたが、どちらの場合も障害にわたる著しく多くの再生索軸は見られなかった。
しかし、アンチセンス障害の障害サイズには著しい相違が見られ、センスまたは
未処理障害よりも非常に小さく見えた。
【０１２７】 障害の２ヵ月後、再生索軸の脊髄ＨＲＰ標識によって、センスおよびアンチセ
ンス処理の両方において障害部位を通過できなかったことがわかった。アンチセ
ンス処理コードにおいて障害サイズが著しく小さかったのは、二次ニューロン細
胞の死が大幅に減少したことを示している。
【０１２８】 考察 本発明の調合物を使用すると、コネキシン４３のアンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチドノックダウンによって、脊髄損傷の最初の２４〜４８時間後に発生
する障害拡張が著しく低減される。コネキシン４３のノックダウンも炎症を低減
し、さらに神経保護効果を促進するが、ニューロンが障害部位で再増殖する能力
は変化しなかった。したがって、コネキシン４３特異性オリゴヌクレオチドによ
るアンチセンス処理は、損傷ニューロンの再増殖を促進できないが、損傷の拡大
を低減する著しい神経保護効果を備えている。
【０１２９】 実験４ 概要 皮膚創傷を修復するために、繊維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトなど
の多数の細胞種が活性化され、細胞外基質を増殖、移動および固着させて創傷を
満たす。
【０１３０】 伝達および細胞間信号伝達は、創傷治癒プロセスの重要な機能である。細胞間
信号伝達も皮膚層のギャップ結合チャネルの広範なネットワークを通じて役割を
担っていると思われるが、細胞外信号伝達機構は主要な因子と考えられている。
損傷細胞から表皮を通じて広がるカルシウム波は、その損傷を信号伝達する。正
常な創傷治癒コネキシンレベルは、６時間以内に低下を開始し、回復するのに６
日間かかる。これらの変化が担う役割は理解されていないが、ひとつの理論は、
細胞が迅速に分裂するために近隣の細胞から放出されて、次に接合部が再生され
て、創傷部位の内部や上部への移動を調整される。
【０１３１】 本実験は、本発明の創傷治癒を行う調合物の能力について調査する。
【０１３２】 物質 オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１３３】
【化１４】
【０１３４】 方法 ＣＤ１系統の新生マウスにスプレーによる局所麻酔で麻酔をかけた。次に長さ
２ｍｍの清潔な切開創傷を前脚に沿って虹彩刀で作成した。解剖顕微鏡の下で該
創傷を作成することによって、大きさが非常に再現しやすくなる。創傷は通常３
〜６日で治癒する。後の時点で創傷部位を引き続き確認するための印として、炭
素粉を創傷に振りかけた−どちらにしても、炭素粉は治癒には影響を与えない。
次に、センスまたはアンチセンスＯＤＮを含む、冷却した５ｍｌのＰｌｕｒｏｎ
ｉｃゲルを創傷に塗布した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃では液体であるが
、それ以上の温度では凝固する。創傷に塗布すると、ゲルはその場で凝固し、Ｏ
ＤＮの徐放リザーバーとしてはもちろん弱い界面活性剤として作用し、ＯＤＮが
組織に浸透するのを助ける。センスＯＤＮの塗布は片脚に行い、もう一方にはア
ンチセンスを塗布し、同腹仔間で左右交互にする。新生マウスはランプの下で温
めた後、母親に返した。創傷は毎日検査し、治癒品質について評価した。手術の
１日後、５日後および８日後に代表となる新生マウスを選択し、その前肢の写真
を撮ってから、麻酔をかけ、２％パラホルムアルデヒドを振りかけた。前肢を取
り外し、２％パラホルムアルデヒド中で一晩浸漬固定し、その後、樹脂（１日）
またはワックス（その後２日間）組織学用に処理した。
【０１３５】 創傷の炎症は、切開の２４時間後に評価した。樹脂部分は創傷を通じて、損傷
に反応する最初の細胞である、ｎｉｓｓｌ陽性細胞の好中球を示すためにトルイ
ジンブルーで染色した。これらは好中球特異性マーカーを用いても示すことがで
きる。
【０１３６】 細胞死およびクリアランスは、アポトーシス細胞のクリアランス速度を決定す
るために、Ｔｕｎｅｌ標識によって評価する。マクロファージ染色を用いて、次
の細胞死が終了する期間を示した。これらは損傷の３〜５日後に実施した。
【０１３７】 血管形成 肉芽は治癒結合組織の特徴であり、多数の毛細血管の浸潤によって囲まれる。
マクロファージは、ＶＥＧＦなどの強力な血管形成因子を発現することで知られ
ている。血管新生の程度は、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体である、抗−ＰＣ
ＡＭおよび抗−ｆｌｔ−１を用いて監視される。この組織の収縮は、創傷繊維芽
細胞が収縮性筋線維芽細胞に分化することによって引き起こされる。創傷を引き
合わせた後、アポトーシスによって死に、マクロファージによって除去される。
これらの細胞は、平滑筋アクチン特異性抗体によって明らかにされ、次にその形
成および除去が行われる。
【０１３８】 過神経支配 知覚神経は、損傷時に放出される信号に非常に敏感であり、成人の創傷部位で
は一過性発芽を示す。しかし新生創傷では、この発芽はさらにおびただしく、永
久の過神経支配を生じる。これらの信号が何であるか明らかではないが、炎症性
マクロファージから放出されると思われる。過神経支配は創傷７日後に極大であ
り、神経分布は神経フィラメントに対するＰＧＰ９．５抗体を用いて明らかにな
る。
【０１３９】 瘢痕は通常、創傷閉包の数週間または数ヵ月後に評価する。しかし、合理的な
評価は損傷の１２日後に実施できる。創傷による切片をコラーゲン染色Ｐｉｃｒ
ｏｓｉｒｕｓ Ｒｅｄを用いて染色し、共焦顕微鏡で調べて、創傷部位でのコラ
ーゲン密度および配向を決定する。
【０１４０】 結果 １日 創傷の２４時間後、センスおよびアンチセンス処置肢で著しい相違が明らかで
あった。センス処理創傷は、未処理と違いがないように見え、正常な治癒グレー
ドおよび速度のスペクトルが得られた（図１０）。アンチセンス処理肢は、対照
とは著しく異なり、炎症が少ないように思われ、治癒速度が一般に速かった。
【０１４１】 ｎｉｓｓｌ染色した代表的な肢の樹脂切片によって、好中球細胞が著しく少な
いことが明らかになり、このことは炎症組織が少ないことを示していた（図１１
）。
【０１４２】 ５日 創傷の数日後には、かさぶたが落ち始めた。この段階では、アンチセンス処理
創傷の大半がセンス処理よりも小さく見え、かさぶたが小さいか、瘢痕がより目
立たないかのどちらかであった（図１２）。
【０１４３】 ８日 創傷の８日後、肢に体毛が生えた。センス処理創傷はまだ見えており、創傷部
位周辺に体毛ｊがないために境界が定められていた。アンチセンス処理創傷はほ
とんど見えず、正常な体毛成長によって覆われていた。体毛成長におけるこのよ
うな相違は、アンチセンス処理創傷では瘢痕の発生が減少することを示している
（図１３）。
【０１４４】 結論 コネキシン４３アンチセンスＯＤＮを創傷に塗布すると、治癒プロセスに著し
い影響が見られる。最初の顕著な効果は、好中球のレベルによってはるかに低い
炎症反応を示す部分にて顕著である創傷の炎症が減少することである。治癒が進
むにつれ、アンチセンス処理創傷はより速く治癒し、対照障害よりも瘢痕が少な
い。
【０１４５】 このような炎症反応の低下およびその後の治癒の改善はおそらく、好中球伝達
の低下と自然治癒プロセスの高速化によるものである。アンチセンスＯＤＮは４
〜８時間後にコネキシン発現を低下できるため、創傷の最初の信号伝達に対して
影響をもたないが、第２の信号伝達イベントでは役割を果たす。創傷に反応して
侵入する好中球は、通常大量のコネキシン４３を発現することに注目するのは興
味深い。それらが創傷における他の細胞とギャップ結合を形成して、それを用い
て伝達することも可能である。この形式の伝達が減少すると、好中球による分泌
要素が減少し、創傷内の細胞死が減少することはもちろん、肉芽および過神経支
配も減少することがある。通常の条件下で、コネキシンタンパク質レベル（コネ
キシン２６、３１．１および４３）は、創傷の上皮および皮下層の両方で６時間
以内に減少し、最大６日間は低下したままであることも知られている。アンチセ
ンス手法は、膜からタンパク質除去が行われている間に翻訳プロセスを阻止する
ことによって、この初期のタンパク質減少を高速化できる。確かに、創傷直後の
コネキシン４３ノックダウンの効果は、炎症レベルの低下および治癒速度の向上
に著しい効果をもたらす。
【０１４６】 実験５ 概要 火傷後の炎症および第２細胞死は、主な関心事である。身体の高い割合を占め
る重篤な火傷の犠牲者は、外傷後１または２日で死に至ることが多い。本実験は
、本発明の調合物の火傷回復プロセスに有利な影響を及ぼす能力を調査する。
【０１４７】 物質 オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１４８】
【化１５】
【０１４９】 方法 再現性がよい火傷は湿った皮膚にもたらされ、アンチセンスＯＤＮを含むＰｌ
ｕｒｏｎｉｃゲルは火傷に皮下注射した。一連の火傷は、６匹の新生マウスの頭
蓋の左側と右側にはんだごてを用いて作成した。頭の片側の火傷はＰｌｕｒｏｎ
ｉｃゲルに含まれるコネキシン４３−特異性ＯＤＮによって、反対側はＰｌｕｒ
ｏｎｉｃゲルに含まれるセンス対照ＯＤＮによって処理した。
【０１５０】 結果 ２４時間後、６匹すべてのコネキシン４３ＯＤＮ処置火傷は、対照火傷と比較
して低レベルの炎症を示した。これらの相違は顕著であった（データは示さない
）。
【０１５１】 有用性 そのため本発明により、細胞−細胞伝達が一時的で、部位特異的な方法でダウ
ンレギュレート可能な調合物が与えられる。したがって、該調合物は治療方法に
おける用途と化粧処置における用途がある。
【０１５２】 該調合物のＯＤＮ成分を長時間（２４時間以上）にわたって送達することは、
ニューロン損傷の治療に特に遊離である。これは直接の物理的ニューロン損傷の
多くの例において、ニューロン細胞損失が実際の損傷部位をはるかに越えて周囲
の細胞に広がるためである。この第２のニューロン細胞損失は、元の損傷の２４
時間以内に発生し、結合ギャップ細胞−細胞伝達によって伝達される。したがっ
てコネキシンタンパク質発現のダウンレギュレーションは、細胞間の伝達を阻害
または少なくともダウンレギュレートし、第２のニューロン細胞損失を最小限に
抑える。
【０１５３】 同様に、他の組織損傷の例では（特に創傷）、本発明の調合物が、創傷治癒プ
ロセスの促進、炎症の低減、および瘢痕形成の最小化のいずれにも有効であるこ
とがわかっている。したがって該調合物は、外部からの外傷（火傷を含む）また
は外科的介入のどちらであっても、創傷の治療において明らかに有利である。
【０１５４】 上の説明は例示目的のためのみに与えており、本発明の範囲を逸脱せずに採用
した特異性ＯＤＮおよび製薬的に許容可能な担体またはビヒクルのどちらによっ
ても、修正できることをさらに認識されたい。
【０１５５】
【表３】
【０１５６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。
【図１Ｂ】 印を付けた傷害部の輪郭に関する図１Ａのグレースケール像を示す。
【図１Ｃ】 傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。
【図１Ｄ】 印を付けた傷害部の輪郭に関する図１そのグレースケール像を示す。
【図２Ａ】 傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示し、Ｎｉｓｓｌ染色（青色核）
および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示されている。
【図２Ｂ】 印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上に関するグレースケ
ール等価図である。
【図３Ａ】 コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のカラー像である。
【図３Ｂ】 コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のグレースケール像である。
【図４Ａ】 傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を
示す。
【図４Ｂ】 傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を
示す。
【図５】 コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部の端を示す高倍率像である。
【図６】 コネキシン４３に特異的なアンチセンスで処置された傷害部のＧＦＡＰ（赤色
）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。
【図７】 コントロール傷害物のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫
組織化学的標識である。
【図８】 傷害を与えた２４時間後（丸）および４８時間後（ひし形）における傷害部断
面の下側半領域の比較を示す。
【図９】 コネキシン４３のセンスＯＤＮおよびアンチセンスＯＤＮによる処置を行った
２４時間後のラット脊髄における傷害部である。
【図１０】 コネキシン４３のセンスＯＤＮ（左肢）およびアンチセンスＯＤＮ（右肢）に
よる処置を行った２４時間後の新生児マウス前肢における傷害部である。
【図１１】 図１０に示された２４時間の傷の中心部を通る切片である。
【図１２】 コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯ
ＤＮで処置された、傷害を与えた５日後のラット肢の組合せである。
【図１３】 新生児段階で作製されたラット肢の傷害部の組合せである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/46 Ａ６１Ｋ 47/46 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 17/12 17/12 17/16 17/16 25/00 25/00 29/00 29/00 43/00 43/00 １０５ １０５ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 GA11 HA17 4C076 AA09 AA16 BB31 CC01 CC04 CC18 CC19 EE23 4C084 AA13 MA01 MA22 MA28 MA55 MA63 NA14 ZA01 ZA89 ZB11 ZB21 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA28 MA55 MA63 NA14 ZA01 ZA89 ZB11 ZB21

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療的処置および／または整形的処置において使用される配
    合物であって、 コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチ
    ドを薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルとともに含む配合物。
  2. 【請求項２】 局所投与に適する、請求項１に記載の配合物。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドである
    、請求項１または２に記載の配合物。
  4. 【請求項４】 １つのコネキシンタンパク質のみに対するポリヌクレオチド
    を含有する、前記請求項のいずれかに記載の配合物。
  5. 【請求項５】 前記コネキシンタンパク質は、コネキシン４３、コネキシン
    ２６、コネキシン３１．１、コネキシン３２またはコネキシン３６である、請求
    項４に記載の配合物。
  6. 【請求項６】 ２つ以上のコネキシンタンパク質に対するポリヌクレオチド
    を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載に配合物。
  7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドが指向する前記コネキシンタンパク質の１
    つはコネキシン４３である、請求項６に記載の配合物。
  8. 【請求項８】 コネキシン２６、コネキシン３１．１、コネキシン３２、コ
    ネキシン３６およびコネキシン４３の少なくとも２つに対するポリヌクレオチド
    を含む、請求項６に記載の配合物。
  9. 【請求項９】 コネキシン４３に対する前記ポリヌクレオチドは、 【化１】 から選択される、請求項５、請求項７または請求項８に記載の配合物。
  10. 【請求項１０】 コネキシン２６に対する前記ポリヌクレオチドは、 【化２】 である、請求項５または請求項８に記載の配合物。
  11. 【請求項１１】 コネキシン３１．１に対する前記ポリヌクレオチドは、 【化３】 である、請求項５または請求項８に記載の配合物。
  12. 【請求項１２】 コネキシン３２に対する前記ポリヌクレオチドは、 【化４】 である、請求項５または請求項８に記載の配合物。
  13. 【請求項１３】 前記薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルはゲルで
    あるか、またはゲルを含む、前記請求項のいずれかに記載の配合物。
  14. 【請求項１４】 前記ゲルは、非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキ
    シプロピレン共重合体ゲルである、請求項１３に記載の配合物。
  15. 【請求項１５】 細胞内へのポリヌクレオチドの浸透を助ける界面活性剤ま
    たは尿素をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の配合物。
  16. 【請求項１６】 治療目的および／または整形目的のためにコネキシンタン
    パク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法であって、請求項
    １〜１５のいずれかに記載される配合物を、前記レギュレーションが必要とされ
    る患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法。
  17. 【請求項１７】 他の場合では、患者の脳、脊髄または視神経における特異
    的部位に対するニューロン傷害から生じるニューロン細胞の死を低下させる方法
    であって、前記部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つま
    たは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、請求項１〜１５のいず
    れかに記載される配合物を前記部位に投与する工程を含む方法。
  18. 【請求項１８】 前記配合物は、脳、脊髄または視神経に対する物理的外傷
    によるニューロン喪失を低下させるために投与される、請求項１７に記載の方法
    。
  19. 【請求項１９】 前記配合物は、投与後の少なくとも２４時間にわたって前
    記コネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションす
    るために十分な量で投与される、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 患者の傷治癒を促進させる方法であって、前記傷の部位お
    よびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダ
    ウンレギュレーションするために、請求項１〜１５のいずれかに記載される配合
    物を前記傷に投与する工程を含む方法。
  21. 【請求項２１】 前記傷は外傷の結果である、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記外傷は火傷である、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記傷は手術の結果である、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 物理的外傷を受けた傷および／または組織を処置すること
    の一部としての炎症を低下させる方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記
    載される配合物を前記傷または組織あるいはその近くに投与する工程を含む方法
    。
  25. 【請求項２５】 前記配合物は、脳、脊髄または視神経に対する物理的外傷
    による炎症を低下させるために投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 傷を受けた患者の傷痕形成を低下させる方法であって、前
    記傷の部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数
    ）の発現をダウンレギュレーションするために、請求項１〜１５のいずれかに記
    載される配合物を前記傷に投与する工程を含む方法。
  27. 【請求項２７】 整形目的または治療目的のために皮膚を若返らせるか、ま
    たは厚くする方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載される配合物を皮
    膚表面に１回または反復的に投与する工程を含む方法。
  28. 【請求項２８】 前記配合物は、コネキシン４３に対するポリヌクレオチド
    を含み、かつ上皮基底細胞の分裂および増殖を調節するために投与される、請求
    項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記配合物は、コネキシン３１．１に対するポリヌクレオ
    チドを含み、かつ外層の角質化を調節するために投与される、請求項２７に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 前記配合物はクリームである、請求項２７〜２９のいずれ
    かに記載に方法。
  31. 【請求項３１】 コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセ
    ンスポリヌクレオチドの使用であって、治療目的または整形目的のために、前記
    コネキシンタンパク質の発現をダウンレギュレーションするための医薬品を製造
    する際の使用。
  32. 【請求項３２】 前記医薬品は、その他の場合にはニューロンの傷害から生
    じるニューロン細胞の死を低下させるためのものである、請求項３１に記載の使
    用。
  33. 【請求項３３】 前記医薬品は傷の治癒を促進させるためのものである、請
    求項３１に記載の使用。
  34. 【請求項３４】 前記医薬品は炎症を低下させるためのものである、請求項
    ３１に記載の使用。
  35. 【請求項３５】 前記医薬品は傷痕形成を低下させるためのものである、請
    求項３１に記載の使用。
  36. 【請求項３６】 前記医薬品は、整形目的または治療目的のために皮膚を若
    返らせるためのものである、請求項３１に記載の使用。
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