DE60021700T2 - Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine - Google Patents

Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine Download PDF

Info

Publication number
DE60021700T2
DE60021700T2 DE60021700T DE60021700T DE60021700T2 DE 60021700 T2 DE60021700 T2 DE 60021700T2 DE 60021700 T DE60021700 T DE 60021700T DE 60021700 T DE60021700 T DE 60021700T DE 60021700 T2 DE60021700 T2 DE 60021700T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
connexin
polynucleotide
antisense
protein
lesion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60021700T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60021700D1 (de
Inventor
David Laurence Becker
Colin Richard Green
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of DE60021700D1 publication Critical patent/DE60021700D1/de
Publication of DE60021700T2 publication Critical patent/DE60021700T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Description

  • Die Erfindung betrifft Formulierungen zur Verwendung bei therapeutischen und/oder kosmetischen Behandlungen, insbesondere bei solchen, bei denen ein lokalisiertes Aufbrechen der direkten Zell-Zell-Kommunikation erwünscht ist.
  • Hintergrund
  • Gap Junctions (elektrische Synapsen) sind Zellmembranstrukturen, die die direkte Zell-Zell-Kommunikation erleichtern. Ein Synapsenkanal zwischen zwei Halbkanälen (Connexons) wird gebildet, die jeweils aus 6 Connexin-Untereinheiten zusammengesetzt sind. Bei diesen Connexinen handelt es sich um eine Familie von Proteinen, die im allgemeinen entsprechend ihrem Molekulargewicht bezeichnet oder auf einer phylogenetischen Basis eingeteilt werden, d. h. in eine α-Klasse und eine β-Klasse. Die Connexin-Expression und die in vivo-Muster der interzellulären Kommunikation werden in Reaktion auf eine Epidermisverwundung verändert (Goliger et al., 1995).
  • Die Fähigkeit zur Steuerung der Connexin-Expression (und insbesondere ihrer Herunterregulierung) würde somit die Möglichkeit liefern, die Zell-Zell-Kommunikation in einem Patienten für therapeutische und/oder Heilzwecke zu modulieren. Da jedoch eine große Anzahl von Connexinproteinen in breitem Umfang im gesamten Körper exprimiert wird, ist die Wirkung einer allgemeinen Herunterregulierung zur Herbeiführung einer therapeutischen Wirkung an einer speziellen Stelle unerwünscht.
  • Antisense-Polynucleotide für Connexine werden bei in vitro-Untersuchungen zum Studium der Einflüsse von Veränderungen bei der Zellkupplung auf das Zellwachstum (Ruch et al., 1995), zur Identifizierung der Leitungsvorgänge von durch verschiedene Connexine gebildeten Kanälen (Moore und Burt, 1994) und zum Studium der in vitro-Progesteron-Sekretion aus lutealen Rinderzellen (Grazul-Bilska et al., 1998) verwendet.
  • Antisense-Oligodesoxynucleotide (ODNs) besitzen ein erhebliches Potenzial als Mittel zur Manipulation der spezifischen Genexpression (Übersichtsartikel: Stein et al., 1992; Wagner, 1994). Die entzündungshemmende, therapeutische Verwendung von ODNs gegen ICAM-1 wurde vorgeschlagen (WO-98/24797). Jedoch müssen noch Schwierigkeiten überwunden werden. Hierzu gehören die kurze Halbwertszeit von derartigen ODNs (unmodifizierte Phosphodiester-Oligomere weisen typischerweise eine intrazelluläre Halbwertszeit von nur 20 Minuten auf, was auf den intrazellulären Nuclease-Abbau zurückzuführen ist (Wagner, 1994)) und ihre beständige und zuverlässige Abgabe an Zielgewebe.
  • Der Anmelder der vorliegenden Erfindung hat es sich zur Aufgabe gemacht, diese Schwierigkeiten zumindest teilweise zu überwinden. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung Demzufolge stellt die Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers bereit.
  • Vorzugsweise handelt es sich beim Connexinprotein um Connexin 43.
  • Zahlreiche Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf Oligodesoxynucleotide beschrieben. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass für diese Aspekte auch andere geeignete Polynucleotide (wie RNA-Polynucleotide) verwendet werden können.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine Formulierung zur Verwendung bei der therapeutischen und/oder kosmetischen Behandlung bereitgestellt, wobei die Formulierung folgendes umfasst: mindestens ein Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel, wobei
    • – das Polynucleotid für Connexin 43 ist und ausgewählt ist aus: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC und GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT;
    • – das Polynucleotid für Connexin 43 ist und folgende Sequenz aufweist: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC;
    • – das Polynucleotid für Connexin 26 ist und die folgende Sequenz aufweist: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA;
    • – das Polynucleotid für Connexin 31.1 ist und die folgende Sequenz aufweist: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C; oder
    • – das Polynucleotid für Connexin 32 ist und die folgende Sequenz aufweist: TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Formulierung Polynucleotide nur für ein einziges Connexinprotein.
  • Die Formulierung kann Polynucleotide für mehr als ein Connexinprotein enthalten. Vorzugsweise handelt es sich bei einem der Connexinproteine, auf die die Polynucleotide gerichtet sind, um Connexin 43.
  • Die Antisense-Polynucleotide können für eine parenterale, intramuskuläre, intrazerebrale, intravenöse, subkutane oder transdermale Verabreichung zubereitet werden. Die Antisense-Polynucleotide werden vorzugsweise topisch (an der Behandlungsstelle) verabreicht. Geeigneterweise werden die Antisense-Polynucleotide mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Vehikel oder Verdünnungsmittel vereinigt, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erhalten.
  • Geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger oder Vehikel umfassen solche Produkte, die üblicherweise für die topische Verabreichung verwendet werden. Die topische Formulierung kann in Form einer Creme, Salbe, Gel, Emulsion, Lotion oder Anstrichmittel vorliegen. Die erfindungsgemäße Formulierung kann in Form eines imprägnierten Verbands dargereicht werden.
  • Zu geeigneten Trägermaterialien gehören beliebige Träger oder Vehikel, die üblicherweise als Grundlage für Cremes, Lotionen, Gele, Emulsionen, Lotionen oder Anstrichmittel für die topische Verabreichung verwendet werden. Zu Beispielen gehören Emulgiermittel, inerte Träger, einschließlich Kohlenwasserstoffgrundlagen, emulgierende Grundlagen, nicht-toxische Lösungsmittel oder wasserlösliche Grundlagen. Zu besonders geeigneten Beispielen gehören Lanolin, Hartparaffin, flüssiges Paraffin, weiches, gelbes Paraffin, weiches, weißes Paraffin, weißes Bienenwachs, gelbes Bienenwachs, Cetostearylalkohol, Cetylalkohol, Dimethicone, emulgierende Wachse, Isopropylmyristat, mikrokristallines Wachs, Oleylalkohol und Stearylalkohol.
  • Vorzugsweise handelt es sich beim pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel um ein Gel, geeigneterweise um ein nicht-ionisches Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymergel, z. B. ein Pluronic-Gel, insbesondere Pluronic F-127 (BASF Corp.). Dieses Gel wird besonders bevorzugt, da es bei niedrigen Temperaturen flüssig ist, sich jedoch bei physiologischen Temperaturen rasch verfestigt, was die Freisetzung der ODN-Komponente auf die Anwendungsstelle oder die unmittelbare Nachbarschaft davon begrenzt.
  • Ferner kann die erfindungsgemäße Formulierung mit einem Hilfsstoff, wie Casein, Gelatine, Albumin, Leim, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose oder Polyvinylalkohol versetzt werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Erzielung einer verzögerten Freisetzung des Antisense-Polynucleotids zubereitet werden. Zweckmäßigerweise enthält die Zubereitung ferner ein oberflächenaktives Mittel, um die Zellpenetration des Oligodesoxynucleotids zu unterstützen, oder die Zubereitung kann beliebige geeignete Füllstoffe enthalten. Ferner können beliebige geeignete nicht-toxische oberflächenaktive Mittel, wie DMSO, enthalten sein. Alternativ kann ein transdermales Penetrationsmittel, wie Harnstoff, enthalten sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung des neuronalen Zelltods, der ansonsten als Folge einer neuronalen Schädigung auftreten würde, bereit.
  • Vorzugsweise dient das Arzneimittel zur Verringerung von neuronalen Verlusten aufgrund von physischen Traumata von Gehirn, Rückenmark oder Sehnerv.
  • Zweckmäßigerweise ist das Arzneimittel zur Herunterregulierung der Expression des oder der Connexinproteine für mindestens 24 Stunden nach der Verabreichung befähigt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von mindestens einem Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Wundheilung bereit.
  • Üblicherweise handelt es sich bei den Wunden um eine Folge von traumatischen Ereignissen, einschließlich Verbrennungen. Die Wunde kann jedoch auch die Folge eines chirurgischen Eingriffs sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von mindestens einem Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung von Entzündungen bereit, insbesondere als Bestandteil der Behandlung einer Wunde und/oder eines Gewebes, bei dem ein physisches Trauma vorliegt.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Wunde um eine Verbrennung.
  • Alternativ kann die Wunde die Folge eines physischen Gewebetraumas sein, unter Einschluß von neuronalem Gewebe, wie Gehirn, Rückenmark oder Sehnerv.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von mindestens einem Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung der Narbenbildung, vorzugsweise bei einem Patienten, der an einer Wunde leidet, bereit. Auch hier kann die Wunde die Folge eines Traumas oder eines chirurgischen Eingriffs darstellen, wobei die Formulierung auf die Wunde unmittelbar vor der chirurgischen Reparatur und/oder beim Verschließen der Wunde aufzubringen ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von mindestens einem Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Hautverjüngung für einen therapeutischen Zweck bereit.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Hautverjüngung oder Hautverdickung für einen kosmetischen Zweck bereit, wobei eine Formulierung gemäß der vorstehenden Definition einmal oder mehrmals auf die Hautoberfläche zu verabreichen ist.
  • Zweckmäßigerweise umfasst diese Formulierung Oligodesoxynucleotide, die gegen Connexin 26 oder Connexin 43 gerichtet sind, und sie wird zur Regulierung der Teilung des Wachstums von epithelialen Basalzellen verabreicht.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst diese Formulierung Oligodesoxynucleotide, die gegen Connexin 31.1 gerichtet sind und sie wird zur Regulierung der Keratinisierung der äußeren Schicht verabreicht.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Formulierung um eine Creme oder ein Gel.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1 bis 5 zeigen Schnitte von Rattenhirnläsionen, die mit Pluronic Gel, das für Connexin 43 spezifische Antisense-Oligodesoxynucleotide enthält, behandelt worden sind, oder von Kontroll-Läsionen, die nur mit Pluronic-Gel allein behandelt worden sind. In sämtlichen Fällen wurden die Läsionen seriell in einer koronalen Ebene geschnitten und die Mittelpunktsschnitte wurden für die Analyse herangezogen. Die einzelnen Bilder (ausgenommen 5) zeigen Gewebe der Abmessungen 4 mm × 5,33 mm. 5 zeigt etwa 1,2 mm × 2 mm.
  • 1: 1A und 1C zeigen zwei Seiten einer Kontrollläsion 24 Stunden nach der Läsionsbildung. Die Läsion wurde mit Pluronic-Gel allein behandelt. Die Schnitte wurden einer Nissl-Färbung (blaue Kerne) und einer Antikörper-Markierung mit dem neuronalen Marker Neuronal-N (braune Zellen) unterzogen. 1B und 1D zeigen Grauskalenbilder von 1A bzw. 1C, wobei die Außenlinie der Läsion markiert ist. Hinzuweisen ist auf die ausgeprägte Größe der Läsion und die sich unregelmäßig ausbreitenden Ränder. Die Läsion hat sich nach unten in Richtung zum Corpus callosum (gestrichelte Linie) innerhalb von nur 24 Stunden nach der Läsionsbildung ausgebreitet.
  • 2: Eine Kontrollläsion 24 Stunden nach der Verwundung. 2A zeigt die Nissl-Färbung (blaue Kerne) und die Neuronal-N-Markierung von lebensfähigen Neuronen. 2B ist ein Grauskalaäquivalent, wobei der Läsionsrand und die Oberseite des Corpus callosum markiert sind (gestrichelte Linie). Die ursprüngliche Nadelführung ist klar, jedoch trat der neuronale Tod deutlich zurückgesetzt vom Läsionsrand auf, wie die Neuronal-N-Markierung zeigt. Die Läsionsränder sind unregelmäßig und die Läsion hat sich innerhalb von genau 24 Stunden nach unten in das Corpus callosum ausgebreitet.
  • 3: 3A und 3B sind Farb- und Grauskalenbilder einer mit Connexin 43-Antisense behandelten Läsion 48 Stunden nach der Läsionsbehandlung. Die Läsionsaußenlinie ist in 3B markiert, um das Ausmaß der Läsion und die Oberseite des Corpus callosum zu zeigen (gestrichelte Linie). 3A zeigt die Nissl-Färbung (blaue Kerne) und die Neuronal-N-Färbung (rosafarbene Zellen). Auf die kompakte Beschaffenheit der Läsion, selbst nach 48 Stunden, im Vergleich zu den Kontrollläsionen ist hinzuweisen (1 und 2). Obgleich eine gewisse Ausbreitung auf die rechte Seite vorliegt, folgt die linke Seite der Läsion im wesentlichen der ursprünglichen Nadelführung mit geringen Anzeichen einer Ausbreitung. Die linke Läsionsseite ist sehr gerade und hat sich nicht nach unten in das Corpus callosum ausgebreitet.
  • 4: 4A und 4B zeigen eine weitere mit Connexin 43-Antisense behandelte Läsion 48 Stunden nach der Verwundung. Die Markierung ist die gleiche wie in 3, wobei die Läsion auf dem Grauskalenbild (4B) im Umriß dargestellt ist. Auch nach 48 Stunden ist diese Läsion äußerst kompakt, wobei nur eine geringe Ausbreitung auf die linke Seite (mediale Seite) vorliegt. Bemerkenswert ist der gerade Verlauf auf der rechten Seite der Läsion, wobei lebensfähige Neuronen genau bis zum Rand der Nadelführung vorliegen (und innerhalb des läsionierten Bereiches tatsächlich überleben). Die Läsion befindet sich deutlich oberhalb des Corpus callosum (gestrichelte Linie), was zeigt, dass praktisch keine Ausbreitung nach unten stattgefunden hat.
  • 5: Eine Ansicht mit höherer Vergrößerung zeigt den Rand der mit Connexin 43-Antisense behandelten Läsion. Der Läsionsrand ist markiert und zeigt lebensfähige Neuronen (mit Neuronal-N markiert) genau bis zum Rand der Wundnadelführung auch 48 Stunden nach der Läsionsbildung.
  • 6: Immunohistochemische Markierung mit GFAP (rot) und Connexin 43 (grün) einer mit Connexin 43-spezifischem Antisense behandelten Läsion 24 Stunden nach der Läsionsbildung. Das Bild ist am seitlichen Läsionsrand auf halber Strecke nach unten in Richtung der Läsionstiefe aufgenommen. Die Konzentrationen an aktivierten Astrozyten sind im Vergleich zu Kontrollen (7) erhöht und die Connexin 43-Konzentrationen sind deutlich verringert. Die verbleibende Connexin-Markierung ist im allgemeinen mit Blutgefäßen (Pfeilen) assoziiert.
  • 7: Immunohistochemische Markierung mit GFAP (rot) und Connexin 43 (grün) einer Kontrollläsion 24 Stunden nach der Läsionsbildung. Die Aufnahme erfolgte vom medialen Rand der Läsion und zeigt, dass die GFAP-Konzentrationen gegenüber der unverletzten Rinde geringfügig erhöht sind. Bemerkenswert ist die ausgeprägte Connexin 43-Markierung, die häufig gemeinsam mit dem GFAP-Astrozytenmarker (Pfeile) lokalisiert ist.
  • 8 zeigt einen Vergleich von Läsionsquerschnitten der unteren Hälften 24 Stunden (Kreise) und 48 Stunden (Rauten) nach der Läsionsbildung. Die Analyse wurde an einem Mittelschnitt einer seriell in koronaler Ebene geschnittenen Läsion vorgenommen. Die Läsionen wurden unter Anwendung einer Neuronal-N-Antikörpermarkierung zur Nachzeichnung von lebensfähigen Neuronen bestimmt. Mit DB1 behandelte Läsionen (grüne Marker) wurden mit für Connexin 43 spezifischen Antisense-Oligodesoxynucleotiden behandelt. Die nur mit Gel behandelte Läsionsgruppe (rot gekennzeichnet) umfasst auch leere Läsionen, während die HB3-Gruppe (purpurfarben gekennzeichnet) mit Gel behandelt wurde, das eine willkürliche Sequenz von Kontroll-Oligodesoxynucleotiden enthielt. Bemerkenswert ist es, dass zwar die mit Connexin 43-Antisense behandelten Läsionen groß sein können (vermutlich Stellen, die vom Antisense nicht gut erreicht worden sind), dass es sich aber bei den kleinsten Läsionen durchweg um mit Connexin 43-Antisense behandelte Läsionen handelt. Die Läsionen wurden in einer Tiefe von 2 mm vorgenommen. Die Analyse deckt den Bereich von 1 mm und darunter ab, um den äußeren Rand auszuschließen, wo sich das Antisense nicht befand.
  • 9: Läsionen im Ratten-Rückenmark 24 Stunden nach Behandlung mit Connexin 43-Sense und -Antisense-ODNs. Die Sense-Läsionen unterschieden sich nicht von unbehandelten Kontrollen, während die mit Antisense behandelten Läsionen kleiner waren und eine verringerte Entzündung zeigten.
  • 10: Läsionen an den Vorderpfoten einer neugeborenen Maus 24 Stunden nach Behandlung mit Connexin 43-Sense-ODNs (linke Pfote) oder -Antisense-ODNs (rechte Pfote). Bemerkenswert ist die Verringerung der Entzündung und die erhöhte Heilungsgeschwindigkeit an der mit Antisense behandelten Pfote.
  • 11: Schnitte durch das Zentrum der in 10 dargestellten Wunden nach 24 Stunden. Die Schnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt, um Neutrophile zu kennzeichnen. In der mit Antisense behandelten Wunde treten signifikant weniger Neutrophile auf, wobei diese Wunde auch weniger entzündet war.
  • 12: Paare von Rattenpfoten-Läsionen 5 Tage nach Läsionsbildung bei Behandlung mit Connexin 43-spezifischen Antisense-ODNs oder -Sense-Kontroll-ODNs. Die mit Antisense behandelten Läsionen heilen rascher und zeigen weniger Anzeichen einer Narbenbildung.
  • 13: Paare von Rattenpfoten-Läsionen bei Läsionsbildung im. neonatalen Zustand und Betrachtung 8 Stunden nach der Läsionsbildung. Die Läsionen wurden mit Connexin 43 spezifischer Antisense- oder Kontroll-Sense-ODN behandelt. Es zeigt sich Haarwuchs und es ist klar, dass die Antisense-Behandlung zu einer geringeren Narbenbildung und einem geringeren Haarverlust führte. Die Läsionsstelle ist bei der mit Sense behandelten Kontrolle deutlich erkennbar; während sie bei der mit Antisense behandelten Gliedmaße schwer feststellbar ist.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Wie vorstehend breit definiert, richtet sich die Erfindung auf eine ortsspezifische Herunterregulierung der Connexin-Expression. Dies hat den Einfluß einer Verringerung der direkten Zell-Zell-Kommunikation an der Stelle, an der die Connexin-Expression herunterreguliert ist, was zu zahlreichen therapeutischen/kosmetischen Anwendungsmöglichkeiten führt, wie nachstehend erläutert wird.
  • Die Herunterregulierung der Connexin-Expression beruht allgemein auf dem Antisense-Weg unter Verwendung von Antisense-Polynucleotiden (wie DNA- oder RNA-Polynucleotiden) und insbesondere auf der Verwendung von Antisense-Oligodesoxynucleotiden (ODN). Diese Polynucleotide (z. B. ODN) zielen auf das oder die Connexinproteine ab, die heruntergeregelt werden sollen. Typischerweise sind die Polynucleotide einzelsträngig, sie können aber auch doppelsträngig sein.
  • Das Antisense-Polynucleotid kann die Transkription und/oder Translation des Connexins hemmen. Vorzugsweise handelt es sich beim Polynucleotid um einen spezifischen Inhibitor der Transkription und/oder Translation eines Connexin-Gens, wobei die Transkription und/oder Translation anderer Gene nicht gehemmt wird. Das Produkt kann an das Connexin-Gen oder -mRNA entweder (i) in 5'-Stellung an die Kodierungssequenz und/oder (ii) an die Kodierungssequenz und/oder (iii) in 3'-Stellung an die Kodierungssequenz binden.
  • Im allgemeinen bewirkt das Antisense-Polynucleotid, dass die Expression von Connexin-mRNA und/oder Protein in einer Zelle verringert wird.
  • Das Antisense-Polynucleotid verhält sich im allgemeinen "Antisense" zur Connexin-mRNA. Ein derartiges Polynucleotid kann zur Hybridisierung mit Connexin-mRNA befähigt sein und kann die Expression von Connexin hemmen, wenn es einen oder mehrere Aspekte des Connexin-mRNA-Stoffwechsels beeinträchtigt, einschließlich Transkription, mRNA-Prozessierung, mRNA-Transport aus dem Kern, Translation oder mRNA-Abbau. Das Antisense-Polynucleotid hybridisiert typischerweise mit der ConnexinmRNA unter Bildung eines Duplex, der eine direkte Hemmung der Translation und/oder eine Destabilisierung der mRNA bewirkt. Ein derartiger Duplex kann gegenüber einem Abbau durch Nucleasen empfindlich sein.
  • Das Antisense-Polynucleotid kann mit der Gesamtheit oder einem Teil der Connexin-mRNA hybridisieren. Typischerweise hybridisiert das Antisense-Polynucleotid mit der Ribosomen-Bindungsregion oder der Kodierungsregion der Connexin-mRNA. Das Polynucleotid kann komplementär mit der Gesamtheit oder einem Bereich der Connexin-mRNA sein. Beispielsweise kann es sich bei dem Polynucleotid um das exakte Komplement der Gesamtheit oder eines Teils der Connexin-mRNA handeln. Jedoch ist eine absolut komplementäre Beschaffenheit nicht erforderlich und Polynucleotide, die eine ausreichend komplementäre Beschaffenheit aufweisen, um unter physiologischen Bedingungen einen Duplex mit einer Schmelztemperatur von mehr als 20 °C, 30 °C oder 40 °C zu bilden, eignen sich insbesondere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
  • Somit handelt es sich bei dem Polynucleotid typischerweise um ein Homologes der mRNA. Beim Polynucleotid kann es sich um ein Polynucleotid handeln, das mit der Connexin-mRNA unter Bedingungen eines Mediums von hoher Stringenz hybridisiert, z. B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50 bis etwa 60 °C.
  • Das Polynucleotid weist typischerweise eine Länge von 6 bis 40 Nucleotiden auf. Vorzugsweise weist es eine Länge von 12 bis 20 Nucleotiden auf. Die Polynucleotide können eine Länge von mindestens 40, z. B. mindestens 60 oder mindestens 80, Nucleotiden aufweisen. Ihre Länge kann bis zu 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 oder 3000 oder mehr Nucleotiden gehen.
  • Das oder die Connexinproteine, auf die die ODN abzielen, hängen von dem Ort ab, an dem eine Herunterregulierung vorzunehmen ist. Dies spiegelt den ungleichmäßigen Aufbau von Gap Junctions an verschiedenen Orten im gesamten Körper im Hinblick auf die Connexin-Untereinheit-Zusammensetzung wieder. Beim Connexin kann es sich um ein beliebiges Connexin handeln, das in einem Menschen oder Tier natürlich vorkommt. Das Connexin-Gen (unter Einschluß der Kodierungssequenz) weist im allgemeinen eine Homologie mit jedem der erwähnten spezifischen Connexine auf, z. B. eine Homologie mit der in Tabelle 1 dargestellten Connexin 43-Kodierungssequenz. Beim Connexin handelt es sich typischerweise um ein α- oder β-Connexin. Vorzugsweise wird das Connexin in der Haut oder in Nervengewebe (einschließlich Gehirnzellen) exprimiert.
  • Manche Connexinproteine sind in Bezug auf ihre Verteilung im Gewebe allgegenwärtiger als andere. Eines der am weitesten verbreiteten Connexinproteine ist Connexin 43. ODNs, die auf Connexin 43 abzielen, sind daher erfindungsgemäß besonders geeignet.
  • Ferner kommt es in Betracht, dass ODNs, die auf separate Connexinproteine abzielen, in Kombination verwendet werden (z. B. kann man auf 1, 2, 3, 4 oder mehr verschiedene Connexine abzielen). Beispielsweise können ODNs, die auf Connexin 43 abzielen, und ein oder mehr Mitglieder der Connexin-Familie (wie Connexin 26, 31.1, 32, 36, 40 und 45) in Kombination miteinander verwendet werden.
  • Einzelne Antisense-Polynucleotide können spezifisch für ein bestimmtes Connexin sein oder können auf 1, 2, 3 oder mehr verschiedene Connexine abzielen. Spezifische Polynucleotide zielen im allgemeinen auf Sequenzen im Connexin-Gen oder der mRNA ab, die unter den Connexinen nicht konserviert sind, während nicht-spezifische Polynucleotide auf konservierte Sequenzen abzielen.
  • Bei den ODNs zur erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich im allgemeinen um unmodifizierte Phosphodiester-Oligomere. Sie können in ihrer Länge variieren, wobei aber eine 30-meres ODN besonders geeignet ist.
  • Die Antisense-Polynucleotide können chemisch modifiziert werden. Dies kann ihre Beständigkeit gegen Nucleasen und ihre Fähigkeit zum Eintritt in Zellen verstärken. Beispielsweise können Phosphorthioat-Oligonucleotide verwendet werden. Weitere Desoxynucleotid-Analoge umfassen Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphordithioate, N3'P5'-Phosphoramidate und Oligoribonucleotid-phosphorthioate und ihre 2'-O-Alkylanalogen sowie 2'-O-Methylribonucleotid-methylphosphonate.
  • Alternativ können Mischgerüst-Oligonucleotide (MBOs) verwendet werden. MBOs enthalten Segmente von Phosphorthioat-oligodesoxynucleotiden und in geeigneter Weise platzierte Segmente von modifizierten Oligodesoxy- oder Oligoribonucleotiden. MBOs weisen Segmente mit Phosphorthioat-Verknüpfungen und andere Segmente von anderen modifizierten Oligonucleotiden, wie Methylphosphonat, das nicht-ionisch und gegenüber Nucleasen sehr beständig ist, oder 2'-O-Alkyloligoribonucleotiden auf.
  • Die genaue Sequenz des erfindungsgemäß verwendeten Antisense-Polynucleotids hängt vom Ziel-Connexinprotein ab. Der Anmelder hat festgestellt, dass ODNs mit den folgenden Sequenzen für Connexin 43 besonders geeignet sind:
    GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC und GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT.
  • ODNs, die auf andere Connexinproteine gerichtet sind, können durch beliebige zweckmäßige und herkömmliche Verfahren in bezug auf ihre Nucleotidsequenz ausgewählt werden. Beispielsweise können die Computerprogramme MacVector und OligoTech (von Oligos, Eugene, Oregon, USA) verwendet werden. Beispielsweise weisen ODNs für die Connexine 26, 31.1 und 32 die folgenden Sequenzen auf:
    5'TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (Connexin 26)
    5'CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (Connexin 31.1)
    5'TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (Connexin 32)
  • Nach erfolgter Auswahl können die ODNs unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert werden.
  • Erfindungsgemäß ist für die ODNs eine ortsspezifische Abgabe erforderlich. Ferner ist die Abgabe über eine verlängerte Zeitspanne hinweg erforderlich. Die Abgabedauer hängt klar sowohl von der Stelle, an der die Herunterregulierung eingeleitet werden soll, als auch von der angestrebten therapeutischen Wirkung ab, wobei häufig eine kontinuierliche Abgabe für 24 Stunden oder mehr erforderlich ist.
  • Erfindungsgemäß wird dies erreicht, indem man die ODNs zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel einer Formulierung einverleibt, insbesondere einer Formulierung für die topische Verabreichung.
  • Die erfindungsgemäß hergestellten Formulierungen eignen sich für beliebige therapeutische/kosmetische Anwendungsmöglichkeiten, bei denen eine vorübergehende und ortsspezifische Unterbrechung der Zell-Zell-Kommunikation erstrebenswert ist. Hierzu gehören die Behandlung von neuronalen Schäden in Gehirn, Rückenmark oder Sehnerv (wo die Schädigung soweit wie möglich zu lokalisieren ist), die Förderung der Wundheilung und die Verringerung der Narbenbildung, beispielsweise nach kosmetischchirurgischen Eingriffen oder Verbrennungen.
  • Insbesondere können topische Formulierungen, wie Cremes, dazu herangezogen werden, die Teilung und das Wachstum von epithelialen Basalzellen (unter Verwendung von ODNs, die auf Connexin 43 abzielen) und der Keratinisierung der äußeren Schicht (unter Verwendung von ODNs, die auf Connexin 31.1 abzielen) verwendet werden.
  • Die Antisense-Polynucleotide (einschließlich das ODN) können in einer im wesentlichen Umfang isolierten Form vorliegen. Es ist ersichtlich, dass das Produkt mit Trägern oder Verdünnungsmitteln vermischt werden kann, die den vorgesehenen Anwendungszweck des Produkts nicht stören und die immer noch als im wesentlichen Umfang isoliert anzusehen sind. Ein erfindungsgemäßes Produkt kann auch in einer im wesentlichen gereinigten Form vorliegen, wobei es in diesem Fall im allgemeinen 90 %, z. B. mindestens 95 %, 98 % oder 99 % des Polynucleotids oder der Trockenmasse des Präparats ausmacht.
  • Verabreichung
  • Die erfindungsgemäßen Antisense-Polynucleotide (einschließlich ODNs) (typischerweise in Form der hier erörterten Formulierung) können somit einem behandlungsbedürftigen Menschen oder Tier verabreicht werden, z. B. einem Menschen oder Tier, die beliebige der hier erwähnten Krankheiten oder Zustände aufweisen. Der Zustand des Menschen oder Tiers kann auf diese Weise gebessert werden. Das Polynucleotid und die Formulierung können somit bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden. Sie können bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung beliebiger der hier erwähnten Zustände verwendet werden.
  • Die Antisense-Polynucleotide können in typischer Weise (an der zu behandelnden Stelle) verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Antisense-Polynucleotide mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung vereinigt. Zu geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln gehören isotonische Salzlösungen, z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann für die parenterale, intramuskuläre, intrazerebrale, intravenöse, subkutane oder transdermale Verabreichung zubereitet werden.
  • Die Dosis, in der ein Antisense-Polynucleotid einem Patienten verabreicht wird, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z. B. vom Alter, dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des Patienten, dem zu behandelnden Zustand und dem speziellen Antisense-Polynucleotid, das verabreicht wird. Eine geeignete Dosis kann jedoch 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht, z. B. 1 bis 40 mg/kg Körpergewicht, betragen.
  • Die Aufnahme von Nucleinsäuren durch Säugetierzellen wird durch mehrere bekannte Transfektionstechniken verstärkt, z. B. durch Techniken unter Verwendung von Transfektionsmitteln. Die Formulierung, die verabreicht wird, kann derartige Mittel enthalten. Zu Beispielen für diese Mittel gehören kationische Mittel (z. B. Calciumphosphat und DEAE-Dextran) und Lipofektionsmittel (z. B. Lipofectam® und Transfectam®).
  • Die vorstehend beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind nur als Richtlinien anzusehen, da der Arzt in der Lage ist, leicht die optimalen Verabreichungswege und Dosierungen für beliebige spezielle Patienten und Zustände zu ermitteln.
  • Homologe
  • Hier werden die Begriffe "Homologie" und "Homologe" erörtert (z. B. können die Polynucleotide ein Homologes der Sequenz von Connexin-mRNA darstellen). Derartige Polynucleotide weisen typischerweise eine Homologie von mindestens 70 %, vorzugsweise von mindestens 80, 90, 95, 97 oder 99 $, mit der einschlägigen Sequenz über einen Bereich von mindestens 15, 20, 40, 100 oder mehr benachbarten Nucleotiden (der homologen Sequenz) auf.
  • Die Homologie kann auf der Grundlage eines beliebigen Verfahrens gemäß dem Stand der Technik berechnet werden. Beispielsweise stellt die UWGCG-Packung ein "BESTFIT"-Programm bereit, das zur Berechnung der Homologie herangezogen werden kann (z. B. in der Default-Einstellung verwendet) (Devereux et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12 (1984), S. 387-395). Die "PILEUP"- und "BLAST"-Algorithmen können zur Berechnung der Homologie oder zur Ausrichtung von Sequenzen verwendet werden (typischerweise an ihren Default-Einstellungen), wie es beispielsweise von S. F. Altschul, J. Mol. Evol., Bd. 36 (1993), S. 290-300; und S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 403-410, beschrieben wird.
  • Die Software zur Durchführung der BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich zugänglich. Dieser Algorithmus umfasst zunächst die Identifizierung eines "high scoring"-Sequenzpaars (HSPs) durch Identifizierung kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz, die bei Ausrichtung mit einem Wort von gleicher Länge in einer Datenbanksequenz mit einer positiven Schwellenbewertung T entweder übereinstimmt oder dieser genügt. T wird als die Nachbarschaftswort-Bewertungsschwelle bezeichnet (Altschul et al., a.a.O.). Diese anfänglichen Nachbarschaftswort-Treffer dienen als Keimzellen zur Einleitung von Recherchen zum Auffinden von HSPs, die diese enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz soweit ausgedehnt, wie die kumulative Ausrichtungsbewertung erhöht werden kann. Erweiterungen der Worttreffer in jeder Richtung werden angehalten, wenn: die Bewertung der kumulativen Ausrichtung um die Menge X vom maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Bewertung auf 0 oder darunter fällt und zwar aufgrund der Ansammlung von einem oder mehreren Ausrichtungen von Resten mit negativer Bewertung; oder das Ende von einer der Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm bedient sich als Defaults einer Wortlänge (W) von 11, der BLOSUM62-Bewertungsmatrix (vergl. Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 89 (1992), S. 10915-10919), Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M=5, N=4 und eines Vergleichs beider Stränge.
  • Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; vergl. z. B. Karlin und Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 90 (1993), S. 5873-5877. Ein Maß für die Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der zufällig eine Übereinstimmung zwischen zwei Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen eintritt. Beispielsweise wird eine Sequenz als ähnlich mit einer anderen Sequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz weniger als etwa 1, vorzugsweise weniger als etwa 0,1, insbesondere weniger als etwa 0,01 und ganz besonders weniger als etwa 0,001 beträgt.
  • Die homologe Sequenz unterscheidet sich typischerweise von der einschlägigen Sequenz durch mindestens (oder durch nicht mehr als) 2, 5, 10, 15, 20 oder mehr Mutationen (bei denen es sich um Substitutionen, Deletionen oder Insertionen handeln kann). Diese Mutationen können über beliebige Bereiche, die vorstehend in Zusammenhang mit der Berechnung der Homologie erwähnt wurden, gemessen werden.
  • Die homologe Sequenz hybridisiert typischerweise mit der ursprünglichen Sequenz in einem signifikant über dem Hintergrund liegenden Niveau. Eine selektive Hybridisierung wird typischerweise unter Anwendung von Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz erreicht (z. B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat für etwa 50 °C bis etwa 60 °C). Jedoch kann eine derartige Hybridisierung typischerweise unter beliebigen geeigneten Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden (vergl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989)). Wenn beispielsweise hohe Stringenz erforderlich ist, umfassen geeignete Bedingungen: 0,2 × SSC bei 60 °C. Wenn eine geringere Stringenz erforderlich ist, umfassen geeignete Bedingungen: 2 × SSC bei 60 °C.
  • Nachstehend werden verschiedene Aspekte der Erfindung unter Bezugnahme auf den folgenden experimentellen Abschnitt beschrieben, der jedoch nur der Erläuterung dient und keine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung darstellen soll.
  • Experimenteller Teil
  • Experiment 1
  • Materialien und Methoden
  • Antisense-Anwendung
  • 30 % Pluronic F-127-Gel (BASF Corp.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Wasser von molekularer Qualität) wurde zur Abgabe von für unmodifiziertes a1-Connexin (Connexin 43) spezifische Antisense-ODNs an den sich entwickelnden Hühnerembryo verwendet (Simons et al., 1992). Hühnerembryos wurden bei 38 °C inkubiert und gemäß den Hamilton- und Hamburger-Stadien eingeteilt. An den Eiern wurde ein Fenster angebracht und die Dotterhaut und die amniotischen Membranen über dem zu behandelnden Bereich wurden unter Verwendung einer feinen Pinzette geöffnet. Nach Antisense-Anwendung wurden die Eier mit einem Klebeband verschlossen und 48 Stunden in den Inkubator gebracht. Zu diesem Zeitpunkt wurden die meisten Experimente durchgeführt, ausgenommen die Analyse des zeitlichen Verlaufs des a1-Connexin-"Abbaus" und der Erholung.
  • Pluronic-Gel ist bei niederen Temperaturen (0–4 °C) flüssig, verfestigt sich aber, wenn es bei physiologischen Temperaturen auf den Embryo getropft wird, wo es mindestens 12 Stunden an Ort und Stelle bleibt. Das Gel hat den zusätzlichen Vorteil, dass es ein mildes oberflächenaktives Mittel darstellt und somit bei alleiniger Verwendung oder bei Verwendung in Verbindung mit DMSO offensichtlich die ODN-Penetration in Zellen in ausgeprägtem Maße beschleunigte (Wagner, 1994). Durch Anbringen einer FITC-Markierung an DB1-ODN (bei Betrachtung unter Anwendung von konfokaler Laser-Scanningmikroskopie) wurde eine intrazelluläre Penetration der Sonden nachgewiesen. Die Sequenzen von Desoxyoligonucleotiden sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Tabelle 1
  • Einfluss der ODN-Anwendung auf die Gliedmaßenentwicklung zwischen den Stadien 8 & 14 der Hühnerembryoentwicklung
  • Antisense-Oligodesoxynucleotide gegen Connexin 43
    DB1 GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC
    CG1 GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT
    Kontroll-Oligodesoxynucleotide
    DB1 (Sense) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC
    DB1 (Huhn) GTA GTT ACG ACA GGA GGA ATT GTT CTC GTC
    CV3 (willkürlich) TCG AAC TGT CAA GAC TGC TAT GGC GAT CAT
    Nur Gel
  • Sämtliche ODNs wurden in einer Endkonzentration von 0,5–1,0 mM gemäß einer dosisabhängigen Analyse während Vorversuchen, die einen Konzentrationsbereich von 0,05 mM bis 50 mM abdeckten, angewandt.
  • Allgemeine Toxizitätseffekte machten sich nur bei ODN-Konzentrationen von mehr als 10 mM bemerkbar. ODN-Gelgemische wurden aus konzentrierten Vorratslösungen, die bei –80 °C aufbewahrt worden waren, hergestellt.
  • Antisense-Sequenzen
  • DB1 ist eine Maus-Antisense-Sequenz, die komplementär zu den Basen 1094–1123 des a1-Connexin-Gens ist. Sie weist vier Fehlpaarungen mit der Hühner-a1-Connexin-Sequenz auf. CG1 ist komplementär zu den Hühner-a1-Connexin-Basen 720–749. Die Wirksamkeit dieser Sonde wurde durch Zusatz von 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zum Gel verbessert. DMSO wies keinen Einfluss auf andere Antisense-ODN- oder Kontrollergebnisse auf.
  • Kontrollsequenzen
  • DB1 (Huhn) ist das Hühner-a1-Connexin-Äquivalent von DB1, bei dem Übereinstimmung mit den Hühner-a1-Connexin-Basen 954-983 besteht. Eine Analyse zeigt jedoch eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Bildung von Stammschleifenstrukturen (G = –7,0 kcal/mol, Schleifen-Tm = 92 °C) und zur Homodimerisierung (Tm = 1,5 °C). Dieses Produkt wirkt daher als Kontrollsequenz. Es wurde berichtet, dass einige Sense-Oligonucleotide stabile DNA-Triplets bilden können (Neckers et al., 1993), die die Transkription hemmen. Dies wurde jedoch mit DB1 (Sense) nicht beobachtet. Eine willkürliche Kontrollsequenz ohne stabile Sekundärstruktur (G = 1,4 kcal/mol) und einer instabilen Homodimerisierung wurde ebenfalls verwendet. Sie wurde als CV3 bezeichnet. Eine zusätzliche Kontrolle unter Anwendung eines Gemisches mit gleichen Konzentrationen an DB1 und DB1 (Sense) ergab die Hintergrundniveaus von Defekten.
  • Überwachung des Protein-Abbaus
  • Eine immunohistochemische Lokalisierung des a1-Connexin-Spaltenverbindungsproteins an Zell-Zell-Grenzflächen ergibt eine direkte Messung des Antisense-Effekts. Antipeptid-a1-Connexin-spezifische Antikörpersonden wurden zur Wholemount-Färbung von Embryos verwendet und die Connexin-Verteilung wurde durch konfokale Laser-Scanningmikroskopie gemäß eingeführten Verfahren analysiert (Green et al., 1995). Eine Kontrollmarkierung für zwei weitere Connexine, die im sich entwickelnden Hühnerembryo exprimiert werden (Connexine b1 & b2), wurde auf ähnliche Weise durchgeführt, wobei ebenfalls sequenzspezifische Antikörper verwendet wurden (Becker et al., 1995).
  • Ergebnisse
  • Verringerung der al-Connexin-Expression
  • Unter Verwendung von Pluronic F-127-Gel zur Abgabe von unmodifizierten, a1-Connexin-spezifischen Antisense-ODNs an den sich entwickelnden Hühnerembryo kann die Proteinexpression zu ausgewählten Zeitpunkten beeinträchtigt werden, wodurch die Antisense-Behandlung zielgerichtet auf spezifische Regionen eines Hühnerembryos vorgenommen werden kann. Ein Geltröpfchen mit einem Gehalt an Antisense in einer relativ niedrigen Konzentration wurde genau auf einzelne Embryos platziert. Das Gel verfestigte sich und blieb mindestens 12 Stunden an Ort und Stelle, so dass in dieser Region eine anhaltende niedrige Dosis von Antisense aufrechterhalten wurde. Die Antisense-Anwendungen wurden zielgerichtet und zeitlich so abgegeben, dass eine Verbindungsbildung vor den Perioden einer erhöhten Expression in Gliedmaßen, Neuralrohr und Gesicht blockiert wurde. Diese Zeitpunkte wurden so gewählt, dass die Einflüsse von Antisense durch Verringerung der Expression von neuem Protein optimiert wurde, anstelle einer Abhängigkeit vom Turnover von Protein, das bereits in den Membranen der Zellen des Zielgewebes vorhanden ist. Sowohl DB1 als auch CG1-ODNs verringerten die Expression von a1-Connexinprotein innerhalb von 2 Stunden im Neuralrohr und in den Gliedmaßenknospen in drastischer Weise innerhalb von 4 bis 8 Stunden und blieben in einigen Geweben 18 bis 24 Stunden und 48 Stunden bestehen (Daten nicht aufgeführt). Bei keiner der durchgeführten Kontrollen war eine Herunterregulierung von a1-Connexinprotein ersichtlich. Gleichermaßen blieben zwei weitere Mitglieder der Connexin-Familie, die im Hühnerembryo exprimiert werden, nämlich b1-Connexin und b2-Connexin, durch die a1-Connexin-spezifische Antisense-ODN unbeeinflusst.
  • Mehrere parallele Kontrollen wurden bei sämtlichen Experimenten mitgeführt. Hierzu gehörten: DB1-Sense, eine Kombination aus DB1-Antisense und DB1-Sense, DB1-Huhn (das Stammschleifenstrukturen mit sich selbst bildet), willkürliche ODNs-CV3, Pluronic-Gel allein, Pluronic-Gel mit DMSO und PBS allein). Keine der Kontrollen wies einen merklichen Einfluss auf die Expression von a1-Connexinprotein auf.
  • Experiment 2
  • Einleitung
  • Astrozyten stellen im Säugetierhirn den am reichlichsten vorhandenen Zelltyp dar. Sie sind in ausgedehntem Maße aneinander und an Neuronen über Gap Junctions, die vorwiegend aus Connexin 43 zusammengesetzt sind, gekuppelt (Giaume und McCarthy (1996)). Nach einer durch eine Ischämie induzierten oder physischen Hirnschädigung bleiben diese Kanäle offen und eine sich ausbreitende Depressionswelle (initiiert durch erhöhtes interstitielles Kalium und Glutamat und apoptotische Signale) entsteht (Cotrina et al., (1998); Lin et al. (1998)). Wellen von erhöhtem Zytosol-Calcium und zweiten Messenger-Molekülen, wie IP3, breiten sich langsam über die Spaltenverbindungskanäle auf Neuronen über den Kern der geschädigten Region hinaus aus, was zu einer innerhalb der 24 bis 48 Stunden im Anschluss an die Schädigung erweiterten Läsion führt. Auf diese Weise werden ungeschädigte Nachbarzellen zerstört (Lin et al., 1998)), d. h. der sogenannte "Bystander"-Effekt.
  • Dieses Experiment untersucht die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierungen zur Verhinderung dieses Bystander-Effekts.
  • Materialien
  • Oligodesoxynucleotide mit den folgenden Sequenzen wurden hergestellt:
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (Connexin 43)
    TTG TGA TTT ATT TAG TTC GTC TGA TTT C (willkürliche Kontrolle)
  • Methoden
  • Oligodesoxynucleotide (ODNs)
  • Unmodifizierte ODNs wurden in Pluronic F-127-Gel (BASF) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abgegeben. Pluronic-Gel ist bei niederen Temperaturen (0–4 °C) flüssig und verfestigt sich bei physiologischen Temperaturen. Ferner stellt es ein mildes oberflächenaktives Mittel dar. Unmodifizierte ODNs weisen normalerweise eine Halbwertszeit von etwa 20 Minuten in Zellen auf (Wagner, (1994)), jedoch ergibt das Verfahren mit der Beladung mit Pluronic-Gel eine kontinuierliche Diffusionsquelle, wobei das Gel als Reservoir wirkt (Becker et al., (1999)). Für Connexin 43 spezifische ODNs oder willkürliche Kontroll-ODNs mit ähnlicher Basenzusammensetzung wurden in einer Endkonzentration von 2 mM angewandt. Ferner wurden auch Kontrollen nur mit Gel durchgeführt. Bei den ODNs handelte es sich um 30-mere, bei denen durch Analyse gezeigt wurde, dass keine Haarnadelschleifenbildung oder Homodimerisation auftreten sollte.
  • Läsionsbildung
  • Hirnläsionen wurden an Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g vorgenommen. Die Tiere wurden mit 1–2 % Halothan in Sauerstoff betäubt und der Kopf wurde in einer stereotaktischen Klemme gehalten. Die Region um die Läsionsstelle herum wurde rasiert und die Haut über dem Schädel wurde in einer sagittalen Ebene mit einem Skalpell geschnitten und zurückgezogen, um die Schädelplatten freizulegen. Ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 mm wurde durch die Schädelplatte in einem Abstand von 3 mm rechts vom Scheitel unter Verwendung eines Arlec-Graviergeräts gebohrt und eine Läsion wurde in der Hirnrinde unter Verwendung einer an eine Mikrometervorrichtung angebrachten Spritzennadel Nr. 19G 1 1/2 ausgeführt. Das Objektmikrometer ermöglichte eine genaue Richtungskontrolle und eine präzise Eindringtiefe von 2 mm, wodurch die Läsion innerhalb der Rinde und deutlich oberhalb des Corpus callosum blieb.
  • Nach dieser Vorbereitung des Tiers wurden 10 ml eiskaltes Pluronic F-127-Gel (BASF) mit einem Gehalt an Connexin 43-spezifischer ODN (oder einer Kontroll-ODN) in eine vorgekühlte Spritzennadel der Größe 19G 1 1/2, die zu einer flachen Spitze abgefeilt worden war, aufgezogen. Die Spritzennadel wurde über eine abgeschnittene gelbe Pipettenspitze an eine volumetrische Pipette angebracht. Das Gel verfestigte sich beim Erwärmen auf Raumtemperatur anschließend in der Nadel. Die Nadel mit dem in der Spitze befindlichen Gelpfropfen wurde sodann an einer 1 ml fassenden Spritze mit einem Gehalt an PBS angebracht, wobei über den Nadelschaft eine Hülse gestreift wurde, so dass die Nadelspitze in die Läsion abgesenkt werden konnte, wobei die Hülse (die auf den Schädel auftraf) eine Überpenetration verhinderte. Ein leichter Druck auf den Spritzenkolben bewirkte ein "Herausschießen" des Gelpfropfens aus der Nadel in die Läsion. Die Wunde wurde sodann mit Wasserstoffperoxid behandelt, um die Blutung zu stoppen, und die Haut wurde wieder angenäht. Die Tiere wurden sorgfältig überwacht und nach 24 Stunden, 48 Stunden oder 12 Tagen getötet.
  • Gefrierschnitte
  • Die Tiere wurden unter Verwendung von Nembutal (Pentobarbitonnatrium, Virbac) getötet und enthauptet. Die Gehirne wurden vollständig entnommen und sofort in Trockeneisschnee eingefroren und bis zur Anfertigung von Schnitten bei –80 °C aufbewahrt. Serielle Kryoschnitte (30 mm-Schnitte) und von der Frontseite zur Rückseite (koronale Ebene) ausgeführt. Die Schnitte wurden trocken auf mit Chromalaun behandelten Objektträgern montiert und für die histochemische oder immunohistochemische Untersuchung bei –80 °C aufbewahrt. Der erste und letzte Schnitt einer jeden Läsion wurde aufgezeichnet, so dass die Schnitte durch den Mittelpunkt der Läsion klar identifiziert wurden.
  • Histochemie
  • Zur Färbung mit Hämotoxylin und Eosin wurden Schnitte durch eine absteigende Serie von Alkoholen (absolut, 2 × 95 %, 1 × 70 % und Wasser) hydratisiert und 4 Minuten in Gill-Hämotoxylin gefärbt. Sodann wurden die Schnitte in Wasser gewaschen, in Scott-Wasser getaucht und erneut in Wasser gewaschen. Anschließend wurden sie 30 Sekunden in gemäß Moore gepuffertem Eosin gefärbt. Die Schnitte wurden ein weiteres Mal in Wasser gewaschen, bevor sie durch eine Serie von Alkoholen (2 × 95 %, 1 × absolut), 50:50 Alkohol:Xylol dehydratisiert und anschließend in Xylol getaucht wurden. Sodann wurden die Schnitte unter Verwendung eines Histomountä-Montiermediums montiert.
  • Zur Nissl-Färbung wurden Schnitte in einer aufsteigend abgestuften Serie von Alkoholen (75 %, 95 %, 3 × 100 %) jeweils 5 Minuten dehydratisiert und 5 Minuten in Xylol entfettet. Anschließend wurden die Schnitte durch eine absteigende Serie der gleichen Alkohole rehydratisiert und in Wasser gewaschen. Sodann wurden die Schnitte 10 Minuten in eine Nissl-Färbelösung (5 ml einer 2%igen wässrigen Cresylviolett-Vorratslösung, 90 ml einer 6%igen Lösung von Eisessig in Wasser, 10 ml einer 1,35%igen Natriumacetatlösung) gelegt. Anschließend wurden die Schnitte rasch in einer Serie von aufsteigenden Alkoholen 5 Minuten bei 75 %, sodann jeweils 2 Minuten bei 95 % und 3 × 100 % dehydratisiert und 3 × jeweils 10 Minuten mit Xylol behandelt. Sodann wurden sie mit Histomountä-Montiermedium bedeckt.
  • Immunohistochemie
  • Man ließ zunächst Gefrierschnitte in PBS auf Raumtemperatur kommen. Sodann wurden sie 2 Minuten in Methanol permeabilisiert, in PBS gespült und zum Blockieren 30 Minuten in eine Lösung von 0,1 M Lysin und 0,1 % Triton-X 100 gebracht. Daran schlossen sich zwei Waschvorgänge in PBS von jeweils 2 Minuten an. Das PBS wurde entfernt und 50 ml pro Schnitt primärer Antikörper wurde aufgetragen.
  • Die immunohistochemische Untersuchung wurde mit primären Antikörpern gegen Connexin 43, neuronalen-Nuclei (wirbeltierspezifisches nukleares Protein NeuN) und GFAP (gliales, fibrilläres saures Protein) durchgeführt. Es wurden die folgenden Antikörper verwendet:
    Kaninchen-anti-Cx 43 (Gourdie et al., (1991)) in einer Konzentration von 1:300.
    Mäuse-anti-Cx 43 (Chemicon International, Inc.) in einer Konzentration von 1:100.
    Kaninchen-anti-Ratten-GFAP (DAKO, Z0334) in einer Konzentration von 1:1000.
    Mäuse-anti-neuronale Kerne (Chemicon International, Inc.) in einer Konzentration von 1:1000.
  • Für die Markierung mit Connexin und GFAP wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden sie 3-mal 15 Minuten mit einem Orbitalschüttler in PBS gewaschen. Sodann wurde überschüssiges PBS entfernt und pro Schnitt wurden 50 ml Alexaä 488-anti-Kaninchen-IgG (Molecular Probes, Oregon, USA) in einer Konzentration von 1:200 aufgebracht. Für monoklonale und doppelte Markierungen wurde ein CY3 (Chemicon, 132C) sekundärer anti-Maus-Antikörper verwendet. Die Schnitte wurden im Dunklen 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und sodann 3-mal 15 Minuten in PBS gewaschen. Zur Montage wurde überschüssiges PBS von den Objektträgern entfernt und 1 oder 2 Tropfen Citifluor (Glycerin/PBS-Lösung)-Antiverblassungsmittel wurden aufgetragen. Ein Deckel wurde auf die Schnitte gelegt und mit Nagellack versiegelt. Für die Neuronal-N-Markierung handelte es sich beim sekundären Antikörper um biotinylierten Ziegen-anti-Maus-Antikörper, der anschließend einer avidinverknüpfte HRP- und DAB-Reaktion unterzogen wurde (Sigma ExtrAvidin oder DAKO Quickstain-Kit).
  • Abbildung und Analyse
  • Eine Immunofluoreszenzmarkierung wurde unter Verwendung des konfokalen Laser-Scanningmikroskops Leica TCS 4D durchgeführt. Markierte Doppelbilder wurden anschließend unter Verwendung der Leica Combine-Funktion oder im Adobe-Photoshop vereinigt. Mit Hämotoxylin und Eosin sowie gemäß Nissl gefärbte Proben oder mit Neuronal-N markierte Schnitte wurden unter Verwendung einer Kontron (Zeiss) Progress 3008-Digitalkamera aufgenommen. Die Läsionsbereiche wurden unter Verwendung von MetaMorph (Universal Imaging Corp.) analysiert. Von den Läsionsbereichen wurde jeweils der Mittelschnitt analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die gut dokumentierte Ausbreitung von Hirnläsionen, die in den ersten 24 bis 48 Stunden nach dem Trauma, die in unseren Kontrollgel-Experimenten und bei sämtlichen Läsionen, die mit Kontrolle und Antisense behandelt worden waren, auftraten, tendierte zu einer Ausbreitung in der Nähe des äußeren Randes, wo die Anwesenheit des Gels nach der Beladung weniger wahrscheinlich ist. Jedoch breiteten sich Kontrollläsionen nach unten in das Corpus callosum und seitwärts unter Bildung von ausgefransten Rändern aus (1 und 2). Eine Prüfung von mit Neuronal-N-Antikörper markierten Geweben zeigt, dass der neuronale Zelltod deutlich rückwärts vom Läsionsrand aus auftritt, wobei Bereiche von Nissl-Färbung vorhanden sind, in denen keine lebensfähigen Neuronen verbleiben. Diese Ausbreitung erfolgt vorwiegend innerhalb von 24 Stunden (1 und 2) und setzt sich bis zu 48 Stunden nach der Läsionsbildung fort. Dies ist besonders deutlich in 2, wo der neuronale Zelltod innerhalb von 24 Stunden vom Läsionsrand nach rückwärts in ansonsten normal aussehendes Gewebe auftritt. Die Läsion hat sich gerade nach unten in das Corpus callosum ausgebreitet. Im Gegensatz dazu bleiben die günstigeren, mit Connexin 43-Antisense behandelten Läsionen auf die ursprüngliche Läsionsstelle beschränkt und weisen klar definierte Basisniveaus auf (3 und 4). Die Neuronal-N-Markierung fällt mit dem Nissl-gefärbten Gewebe zusammen und keine der mit Connexin 43-Antisense behandelten Läsionen breitete sich im Corpus callosum aus. Die Neuronal-N-Markierung zeigt das Überleben von Neuronen genau bis zum Rand der ursprünglichen Nadeltraktläsion. Überlebende Neuronen um diese Läsionen herum definieren häufig scharfe Grenzen, die den Rand des Nadeltrakts markieren (3 und 5). Nach der Antisense-Behandlung bleibt mehr Gewebe innerhalb der Läsion selbst lebensfähig. Bei Kontrollläsionen führt der Zelltod zu einem Gewebeverlust innerhalb des Läsionsbereiches (vergl. die Kontrollläsionen 2 nach 24 Stunden mit den mit Antisense behandelten Läsionen in den 3 und 4 nach 48 Stunden).
  • Obgleich die Antikörper-Markierung von glialem, fibrillärem, saurem Protein (GFAP) eine gewisse Zunahme der Astrozyten-Aktivierung an den Läsionsrändern zeigt, sind die Connexin 43-Proteinkonzentrationen an zahlreichen Stellen entlang des Randes der mit Antisense behandelten Läsionen deutlich verringert, insbesondere die basalen und medialen Ränder (6), verglichen mit den Kontrollen (7). In einigen Bereichen liegt die einzige Connexin 43-Markierung, die 24 Stunden nach der Connexin 43-spezifischen Antisense-Behandlung verbleibt, in den Blutgefäßwänden, trotz erhöhter GFAP-Konzentrationen (6). Im allgemeinen fällt die Connexin 43-Markierung um die mit Antisense behandelte Läsion in wesentlich geringerem Umfang mit der GFAP-Markierung zusammen, als bei Kontrollen, bei denen mehr als die Hälfte der Connexin 43-Markierung astrozytenbezogen ist. Andere Connexin-Konzentrationen (Connexine 26 und 32) wurden durch die Connexin 43-spezifischen Antisense-Behandlungen offensichtlich nicht verändert.
  • Bei 36 Tieren wurde eine Läsion vorgenommen. Bei 21 Tieren wurde die Querschnittfläche (zentrale Scheibe des Läsionsvolumens in einer koronalen Ebene) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
  • Tabelle 2
    Figure 00240001
  • Bei der endgültigen Analyse wurde die Läsionsfläche von einer Linie 1 mm unter dem äußeren Rindenrand gemessen, um dadurch eine Läsionsausbreitung am äußeren Rand auszuschließen, wo die Antisense-Behandlungen nur eine geringe oder gar keine Wirkung hatten (aufgrund der Tatsache, dass das Gel am Boden der Läsionen injiziert wurde und sich dort absetzte). Ein mit Antisense behandeltes Tier weicht um mehr als 3 Standardabweichungen von dieser Gruppe ab und wurde ausgeschlossen. Die mittlere Läsionsgröße für mit Antisense behandelte Läsionen nach 24 und 48 Stunden betrug 1,45 mm2 ± 0,55) und für Kontrollen 2,1 mm2 ± 0,6). Die vier kleinsten Läsionen (von 8 mit Antisense behandelten und 8 Kontrollläsionen nach 24 und 48 Stunden) waren alle mit Connexin 43-Antisense behandelt, wobei die kleinste Kontrollläsion um 50 % größer als diese vier Läsionen war. Diese Daten sind ferner in graphischer Form in 8 dargestellt. Nach 12 Tagen ergibt sich eine Regeneration bei der Ratte (jedoch nicht im humanen Hirngewebe) und die Grenzen der ausgebreiteten Läsion sind nicht klar definiert.
  • Diskussion
  • Das Pluronic-Gelpfropfen-Antisense-ODN-Verfahren wurde zur Untersuchung des Einflusses des Connexin 43-Abbaus während der Astrozytose, die im Anschluss an eine Läsion der Gehirnrinde des Säugetierhirns auftritt, herangezogen. Im Hirn verursacht eine Freisetzung von Toxinen aus sterbenden Neuronen den sogenannten "Bystander"-Effekt, wobei sich die Toxine über Spaltenverbindungskanäle auf benachbarte Zellen verteilen (Lin et al, (1998)). Unter neurodegenerativen Bedingungen führt eine langsame Freisetzung von Toxinen offensichtlich zu einer Hochregulierung von Connexin 43-Kanälen in Astrozyten, um den Transport und die Entfernung der Toxine in den Blutstrom zu ermöglichen. In Fällen eines schweren Traumas unterstützt jedoch diese Hochregulierung die Verteilung von hohen Toxinkonzentrationen auf benachbarte Neuronen, wobei sie diese abtötet. Eine Blockierung der Connexin 43-Hochregulierung und ein Abbau von Connexin 43-Kanälen verhindert diese Ausbreitung und führt zu Läsionen mit einer um bis zu 50 % geringeren Querschnittfläche. Dies hat erhebliche Auswirkungen bei der Beherrschung von ischämischen Schlaganfällen, bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten und bei der Modulation von Nebenwirkungen aufgrund von chirurgischen Eingriffen.
  • Experiment 3
  • Einleitung
  • Der Bystander-Effekt in neuralen Geweben, bei dem geschädigte Neuronen Toxine freisetzen, die sich ausbreiten und Nachbarzellen abtöten, ist gut dokumentiert. Das Experiment 2 zeigt, dass dieser Effekt im Hirn verringert werden kann, indem man sich der verzögerten Freisetzung eines Antisense-Oligodesoxynucleotids bedient, um den Abbau des Spaltungsverbindungsproteins Connexin 43 zu erreichen.
  • Ein weiteres Gewebe mit ähnlicher Zusammensetzung wie das Gehirn ist das Rückenmark, in dem die neurale Population durch Populationen von glialen Zellen, einschließlich Astrozyten, unterstützt wird, die für die Neuroschutzwirkung durch Beseitigung von Glutamat und überschüssigem Calcium aus der neuralen Umgebung verantwortlich sind. Dieses Experiment untersucht die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierungen zur Verringerung der Ausbreitung von Rückenmarkverletzungen.
  • Materialien
  • Oligodesoxynucleotide mit den folgenden Sequenzen wurden hergestellt:
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (Connexin 43)
    GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (Sense-Kontrolle)
  • Methoden
  • Wistar-Ratten wurden betäubt und ihr Rückenmark wurde freigelegt. Sodann wurde im Rückenmark eine übliche Hämisektionsläsion vorgenommen und 5 ml gekühltes Pluronic-Gel, das entweder Antisense- oder Sense-ODNs für Connexin 43 (5 mM) enthielt, wurde in die Läsion gebracht. Die Anwendungen wurden blind durchgeführt. Das freigelegte Rückenmark wurde sodann wieder abgedeckt und die Ratte wurde in ihren Käfig zurückgebracht. Einige Tiere wurden nach 24 Stunden getötet, während andere 12 Tage und 2 Monate gehalten wurden, um das Ausmaß der neuronalen Regeneration und die endgültige Läsionsgröße zu bestimmen. Für axonale Regenerationsstudien wurden die Ratten betäubt und ihre Axons vor deren Eintrittsstelle in das Rückenmark abgetrennt. Ein Pellet mit Meerrettichperoxidase (HRP) wurde in den Schnitt gelegt, um die Axons innerhalb einer Periode von 24 Stunden rückläufig zu markieren. Am nächsten Tag wurden die Ratten getötet und ihr Rückenmark wurde entfernt und in 2 Paraformaldehyd fixiert. Sodann wurde das Rückenmark durch Kryosektion verarbeitet und serielle Längsschnitte von 8 mm wurden am Rückenmark ausgeführt. Die Schnitte wurden sodann entweder auf Connexine oder GFAP zusammen mit Propidiumiodid als Nuklearmarker immunogefärbt oder zur Feststellung von HRP verarbeitet.
  • Ergebnisse
  • 24 Stunden nach der Läsion bestand ein ausgeprägter Unterschied zwischen den Rückenmarkläsionen bei Behandlung mit Connexin 43-Sense- und Antisense-ODNs. Die Sense-Läsionen unterschieden sich offensichtlich nicht von unbehandelten Kontrollen, während die mit Antisense behandelten Läsionen offensichtlich kleiner und weniger entzündet waren (9).
  • Nach 12 Tagen waren HRP-markierte Axons sowohl im mit Sense als auch mit Antisense behandelten Rückenmark erkennbar, jedoch kreuzte in keinem Fall eine signifikante Anzahl von regenerierenden Axons die Läsion. Es bestand jedoch ein ausgeprägter Unterschied in der Läsionsgröße, wobei die Antisense-Läsion offensichtlich erheblich kleiner als die Sense- oder unbehandelten Läsionen war.
  • Zwei Monate nach der Läsion des Rückenmarks ergab eine HRP-Markierung von regenerierenden Axons, dass es ihnen nicht gelungen war, die Läsionsstelle sowohl bei Sense- als auch bei Antisense-Behandlung zu kreuzen. Die Läsionsgröße war bei dem mit Antisense behandelten Rückenmark erheblich kleiner, was auf eine signifikante Verringerung des sekundären neuronalen Zelltods hinweist.
  • Diskussion
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen verringert der Antisense-Oligodesoxynucleotid-Abbau von Connexin 43 in signifikantem Maße die Läsionsausbreitung, die in den ersten 24 bis 48 Stunden nach einer Rückenmarkverletzung erfolgt. Der Abbau von Connexin 43 verringert auch Entzündungen und unterstützt ferner die Neuroschutzwirkung, jedoch ergab sich keine Veränderung der Fähigkeit für Neuronen, durch die Läsionsstelle zurückzuwachsen. Somit kann eine Antisense-Behandlung mit für Connexin 43 spezifischen Oligodesoxynucleotiden nicht das neue Wachstum von geschädigten Neuronen unterstützen, hat jedoch eine erhebliche Neuroschutzwirkung unter Verringerung der Ausbreitung der Schädigung.
  • Experiment 4
  • Einleitung
  • Zur Reparatur von Hautwunden wird eine Anzahl von Zelltypen, wie Fibroblasten, Endothelialzellen und Keratinozyten, aktiviert, um eine Vermehrung, Wanderung und Ablage von extrazellulärer Matrix zum Auffüllen der Wunde zu aktivieren.
  • Eine Kommunikation und eine interzelluläre Signalleitung stellen Schlüsselmerkmale des Wundheilungsvorgangs dar. Man nimmt an, dass extrazelluläre Signalleitungsmechanismen eine Schlüsselrolle spielen, obgleich es auch möglich ist, dass eine interzelluläre Signalleitung durch das ausgedehnte Netzwerk von Spaltenverbindungskanälen in den Hautschichten eine Rolle spielen können. Calcium-Wellen, die sich von verletzten Zellen weg durch die Epidermis ausbreiten, signalisieren möglicherweise deren Schädigung. Bei der normalen Wundheilung fallen die Connexin-Konzentrationen innerhalb von 6 Stunden allmählich ab und benötigen zu ihrer Erholung bis zu 6 Tage. Die Rolle, die diese Veränderungen spielen, ist nicht bekannt, jedoch besagt eine Theorie, dass Zellen von ihren Nachbarn freigesetzt werden, um sich rasch zu teilen, und dass anschließend Verbindungen erneut gebildet werden, um die Migration zur Wundstelle und über diese hinweg zu koordinieren.
  • Dieses Experiment untersucht die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierungen, eine Wundheilung zu bewirken.
  • Materialien
  • Oligodesoxynucleotide mit den folgenden Sequenzen wurden hergestellt:
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (Connexin 43)
    GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (Sense-Kontrolle)
  • Methoden
  • Neugeborene Mäuse vom CD1-Stamm wurden durch Besprühen mit einem Lokalanästhetikum betäubt. Sodann wurde an beiden Vorderpfoten mit einem Iridektomiemesser ein Längsschnitt von 2 mm Länge ausgeführt. Wenn diese Wunden unter einem Schneidemikroskop erzeugt werden, lassen sie sich in einer gut reproduzierbaren Größe erzeugen. Sie heilen im allgemeinen innerhalb von 3 bis 6 Tagen. Kohlepulver wurde in die Wunden gestäubt, um eine Markierung für eine anschließende Identifikation der Wundstelle zu einem späteren Zeitpunkt zu ermöglichen. Dies beeinflusst in keiner Weise die Heilung. 5 ml gekühltes Pluronic-Gel, das entweder Sense- oder Antisense-ODNs enthielt, wurde sodann auf die Wunden aufgetragen. Das Pluronic-Gel ist bei 0 bis 4 °C flüssig, verfestigt sich jedoch bei einer höheren Temperatur. Nach dem Auftragen auf die Wunde verfestigt sich das Gel an Ort und Stelle und wirkt als Reservoir mit langsamer Freisetzung der ODNs sowie als mildes oberflächenaktives Mittel, das die Penetration der ODNs in das Gewebe unterstützt. Auf eine Pfote wurden Sense-ODNs und auf die andere Antisense-ODNs aufgetragen, wobei unter den Würfen zwischen links und rechts abgewechselt wurde. Die jungen Tiere wurden unter einer Lampe gewärmt und sodann ihrer Mutter zurückgegeben. Die Wunden wurden täglich untersucht und in Bezug auf die Heilungsqualität bewertet. Repräsentative junge Tiere wurden an den Tagen 1, 5 und 8 nach der Operation ausgewählt und ihre vorderen Gliedmaßen wurden photographiert. Anschließend wurden die Tiere betäubt und mit 2 % Paraformaldehyd perfundiert. Die vorderen Gliedmaßen wurden entfernt und durch Eintauchen in 2 % Paraformaldehyd über Nacht fixiert und sodann für die Harz-Histologie (Tag 1) oder für die Wachs-Histologie (ab dem 2. Tag) bearbeitet.
  • Entzündungen der Wunde wurden 24 Stunden nach der Verwundung bestimmt. Harzschnitte durch die Wunde wurden mit Toluidinblau gefärbt, um Nissl-positive Zellen, Neutrophile, die als erste Zellen auf die Verletzung reagieren, festzustellen. Diese Zellen lassen sich auch unter Verwendung von für Neutrophile spezifischen Markern feststellen.
  • Zelltod und Clearance werden durch Tunel-Markierung ermittelt, um die Geschwindigkeit der Clearance von apoptotischen Zellen zu bestimmen. Eine Makrophagen-Färbung wurde dazu herangezogen, die Klärungsdauer im Anschluss an den Zelltod festzustellen. Diese Maßnahmen wurden an den Tagen 3 bis 5 nach der Verwundung durchgeführt.
  • Angiogenese
  • Die Granulation ist ein Merkmal der Heilung von Bindegewebe und wird durch die Invasion von zahlreichen Kapillaren verursacht. Von Makrophagen ist bekannt, dass sie starke Angiogenesefaktoren, wie VEGF, exprimieren. Der Grad der Vaskularisation wird mit Antikörpern gegen VEGF-Rezeptoren, anti-PCAM und anti-flt-1, die beide gute Blutgefäßmarker darstellen, überwacht. Die Kontraktion dieses Gewebes wird durch die Differenzierung von Wundfibroblasten zu kontraktilen Myofibroblasten hervorgerufen. Nachdem sie die Wunde zusammengezogen haben, sterben sie apoptotisch und werden durch Makrophagen entfernt. Diese Zellen können durch für Actin der glatten Muskulatur spezifische Antikörper nachgewiesen werden und ihre Bildung und Entfernung kann verfolgt werden.
  • Hyperinnervation
  • Sensorische Nerven sind sehr empfindlich gegenüber Signalen, die bei einer Verwundung freigesetzt werden und entwickeln sich vorübergehend rasch an den Stellen von Wunden Erwachsener. Jedoch ist bei Wunden von Neugeborenen diese rasche Vermehrung noch ausgeprägter und führt zu einer permanenten Hyperinnervation. Obgleich es nicht klar ist, was diese Signale bedeuten, ist es wahrscheinlich, dass sie von entzündlichen Makrophagen ausgesandt werden. Die Hyperinnervation ist am 7. Tag nach der Verwundung maximal und die Nervenausbreitung kann unter Verwendung von PGP 9.5-Antikörper gegen Neurofilamente festgestellt werden.
  • Die Narbenbildung wird normalerweise Wochen oder Monate nach dem Verschließen der Wunde bestimmt. Jedoch kann eine vernünftige Bestimmung 12 Tage nach der Verwundung vorgenommen werden. Schnitte durch die Wunde werden mit dem Kollagen-Färbemittel Picrosirus Red gefärbt und an einem konfokalen Mikroskop geprüft, um die Kollagendichte und -Orientierung an der Wundstelle zu bestimmen.
  • Ergebnisse
  • 1 Tag
  • 24 Stunden nach der Verwundung traten ausgeprägte Unterschiede zwischen den mit Sense und mit Antisense behandelten Gliedmaßen auf. Die mit Sense behandelten Wunden unterschieden sich nicht von unbehandelten Wunden, wobei sich ein normales Spektrum von Heilungsgraden und -geschwindigkeiten ergab (10). Die mit Antisense behandelten Gliedmaßen unterschieden sich deutlich von den Kontrollen. Sie erschienen weniger entzündet zu sein und die Heilungsgeschwindigkeit war im allgemeinen rascher.
  • Harzschnitte von repräsentativen Gliedmaßen, die mit Nissl-Färbung gefärbt waren, ergaben signifikant weniger neutrophile Zellen, was ein Anzeichen für ein weniger entzündetes Gewebe darstellt (11).
  • 5 Tage
  • 5 Tage nach der Verwundung fiel allmählich Schorf ab. In diesem Stadium erschienen die meisten mit Antisense behandelten Wunden kleiner als die mit Sense behandelten Wunden, wobei entweder der Schorfbereich kleiner war oder die Narbenbildung weniger ausgeprägt war (12).
  • 8 Tage
  • 8 Tage nach der Verwundung trat an den Gliedmaßen Haarwuchs auf. Die mit Sense behandelten Wunden waren noch sichtbar, wobei sie durch mangelnden Haarwuchs um die Wundstelle abgegrenzt waren. Die mit Antisense behandelten Wunden waren großenteils unsichtbar und waren mit normalem Haarwuchs bedeckt. Dieser Unterschied im Haarwuchs stellt ein Anzeichen dafür dar, dass bei den mit Antisense behandelten Wunden eine geringere Narbenbildung eingetreten war (13).
  • Schlussfolgerungen
  • Die Anwendung von Connexin 43-Antisense-ODNs auf eine Wunde übt eine ausgeprägte Wirkung auf den Heilungsprozess aus. Der erste feststellbare Effekt besteht in einer Verringerung der Entzündung der Wunden, was in Schnitten erkennbar ist, die eine wesentlich geringere Entzündungsreaktion, bezogen auf die Konzentrationen an Neutrophilen, zeigten. Mit fortschreitender Heilung heilen die mit Antisense behandelten Wunden rascher und unter geringerer Narbenbildung, verglichen mit den Kontrollläsionen.
  • Diese Verringerung der entzündlichen Reaktion und die anschließende verbesserte Heilung ist möglicherweise auf eine verringerte Neutrophilen-Kommunikation und auf eine Beschleunigung der natürlichen Heilungsvorgänge zurückzuführen. Die Antisense-ODNs können die Connexin-Expression innerhalb von 4 bis 8 Stunden verringern, so dass sie keinen Einfluss auf die anfängliche Signalgebung der Verwundung ausüben, jedoch eine Rolle bei sekundären Signalgebungsereignissen spielen. Die Feststellung ist interessant, dass Neutrophile, die in Reaktion auf die Verwundung eindringen, normalerweise große Mengen an Connexin 43 exprimieren. Ferner ist es möglich, dass sie Spaltenverbindungen mit anderen Zellen in der Wunde bilden und mit diesen kommunizieren. Eine Verringerung dieser Form von Kommunikation kann zu einer Verringerung von aus den Neutrophilen sezernierten Faktoren führen und kann den Zelltod in der Wunde sowie die Granulation und Hyperinnervation verringern. Ferner ist es bekannt, dass unter normalen Bedingungen die Konzentrationen an Connexinprotein (Connexine 26, 31.1 und 43) sowohl in epithelialen als auch in subdermalen Schichten von Wunden verringert werden, wobei der Vorgang innerhalb von 6 Stunden einsetzt und bis zu 6 Tage verringert bleibt. Die Antisense-Behandlung kann diese anfängliche Proteinverringerung durch Blockierung translationaler Prozesse beschleunigen, da es zu einer Proteinentfernung aus der Membran kommt. Sicher haben die Effekte des Connexin 43-Abbaus unmittelbar im Anschluss an die Verwundung einen ausgeprägten Einfluss auf die Verringerung der Entzündungsgrade und die Erhöhung der Heilungsgeschwindigkeiten.
  • Experiment 5
  • Einleitung
  • Die Entzündung und der sekundäre Zelltod, die sich an eine Verbrennung anschließen, stellen ein großes Problem dar. Opfer von schweren Verbrennungen, die sich über einen hohen prozentualen Anteil ihres Körpers erstrecken, sterben häufig 1 oder 2 Tage nach dem Trauma. Dieses Experiment untersucht die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierungen, den Erholungsvorgang nach Verbrennungen günstig zu beeinflussen.
  • Materialien
  • Oligodesoxynucleotide mit den folgenden Sequenzen wurden hergestellt:
    GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (Connexin 43)
    GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC AAT TAC (Sense-Kontrolle)
  • Methoden
  • Reproduzierbare Verbrennungen werden an befeuchteter Haut vorgenommen. Pluronic-Gel mit einem Gehalt an Antisense-ODNs wird subdermal in die Verbrennung injiziert. Eine Reihe von Verbrennungen wird unter Verwendung eines Lötkolbens an der linken und rechten Seite des Schädels von 6 neugeborenen Mäusen erzeugt. Die Verbrennungen auf einer Kopfseite wurden mit Connexin 43-spezifischem ODN in Pluronic-Gel und die auf der anderen Seite mit Sense-Kontroll-ODN in Pluronic-Gel behandelt.
  • Ergebnisse
  • Nach 24 Stunden zeigten sämtliche mit Connexin 43-ODN behandelten Verbrennungen geringere Entzündungsgrade, verglichen mit den Kontrollverbrennungen. Diese Unterschiede waren deutlich (Daten nicht aufgeführt).
  • Verwertbarkeit
  • Somit werden erfindungsgemäß Formulierungen bereitgestellt, mit denen die Zell-Zell-Kommunikation in vorübergehender und ortsspezifischer Weise herunterreguliert werden kann. Die Formulierungen sind daher bei therapeutischen Verfahren und bei kosmetischen Anwendungen einsetzbar.
  • Die Abgabe der ODN-Komponente der Formulierung über eine verlängerte Zeitspanne (24 Stunden oder länger) stellt einen besonderen Vorteil bei der Behandlung von neuronalen Schädigungen dar. Der Grund hierfür ist, dass sich in den meisten Fällen einer direkten, physischen, neuronalen Schädigung der neuronale Zellverlust deutlich über die Stelle der tatsächlichen Schädigung auf die umgebenden Zellen ausbreitet. Dieser sekundäre neuronale Zellverlust erfolgt innerhalb von 24 Stunden nach der ursprünglichen Verletzung und wird durch eine Zell-Zell-Kommunikation über Verbindungsspalten vermittelt. Die Herunterregulierung der Expression von Connexinprotein führt daher zu einer Blockierung oder zumindest zu einer Herunterregulierung der Kommunikation zwischen den Zellen und schränkt die sekundäre neuronale Zellschädigung auf ein Minimum ein.
  • Gleichermaßen haben sich die erfindungsgemäßen Formulierungen in Fällen anderer Gewebeschädigungen (insbesondere bei Wunden) als wirksam in Bezug auf eine Förderung des Wundheilungsvorgangs, eine Verringerung der Entzündung und eine Minimierung der Narbenbildung erwiesen. Die Formulierungen erweisen sich somit als sehr wertvoll bei der Behandlung von Wunden, unabhängig davon, ob diese das Ergebnis eines äußeren Traumas (einschließlich Verbrennungen) oder eines chirurgischen Eingriffs sind.
  • Ferner ist es ersichtlich, dass die vorstehende Beschreibung nur beispielhaften Charakter hat und dass Modifikationen sowohl in Bezug auf die spezifischen ODNs als auch auf die pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel vorgenommen werden können, ohne dass der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
  • Tabelle 1
    Figure 00330001
  • Literatur
    • Becker, D. L., Evans, W. H., Green, C. R., Warner, A. (1995): Functional analysis of amino acid sequences in connexin 43 involved in intercellular communication through gap junctions. J. Cell Sci. 108, 1455-1407.
    • Becker, D. L., McGonnell, I., Makarenkova, H. P., Patel, K., Tickle, C., Lorimer, J. and Green, C. R (1999). Roles for al connexin in morphogenesis of chick embryos revealed using a novel antisense approach. Devel. Genetics, 24, 33-42.
    • Cotrina, M. L., Kang, J., Lin.J. H-C., Bueno, E., Hansen, T. W., He, L., Lie, Y. and Nedergaard, M. (1998). Astrocytic gap junctions remain open during ischemic conditions. J. Neurosci., 18, 2520-2537.
    • Giaume, C. and McCarthy, K. D. (1996). Control of gap-junctiol communication in astrocytic networks. TTNS,19, 319-325.
    • Gourdie, R. G., Green, C. R., Severs, N. J. (1991). Gap junction distribution in adult mammalian myocardium revealed by an anti-peptide antibody and laser scanning confocal microscopy. J. Cell Sci. 99: 41-55.
    • Green, C. R., Bowles, L., Crawley, A., Tickle C. (1994): Expression of the connexin 43 gag junctional protein in tissues at the tip of the chick limb bud is related to epithelial-mesenchymalinteractions that mediate morphogenesis. Devel. Biol., 161, 12-21.
    • Lin, J. H., Weigel, H., Cotrina, M. L., Liu, S., Bueno, E., Hansen, A. J., Hansen, T. W., Goldman, S. and Nedergaard, M. (1998). Gap-junction-mediated propogtion and amplification of cell injury. Nature Neurosci., 1, 431-432.
    • Neckers, L., Whitesell, L. (1993); Anti-sense technology: biotogical utility and practical considerations. Am. J. Physiol. 265 (lung cell mol physiol), L1–L12.
    • Simons, M., Edelman, E. R., DeKeyser, J. L., Langer, R., Rosenberg, R. D. (1992): Anti-sense c-myb oligonueleotides inhibit intimal arterial) smooth muscle cell accumulation in vivo. Nature, 359, 67-70.
    • Stein, C. A. (1442): Anti-sense oligodeoxynucleotides – promises and pitfalls; Leukemia 6, 967-974.
    • Wagner, R. W. (1994): Gene inhibition using anti-sense oligodeoxynucleotides, Nature, 372 333-335.
    • Goliger, J.A, Paul, D.L. (1995): Wounding alters epidermal connexin expression and gap junction-mediated intercellular communication. Mol. Biol. Cell 6, 1491-1501.
    • Grazul-Bilska, A.T., Bilski, J.J., Giles, H., Redmer, D.A., Reynolds, L.P. (1998): Transfection of brine luteal cell: with gap junctional protein connexin 43 (lx43) antisense Oligonucleotide affects progesterone secretion. Biol. Repro. 58, SUPPL. 1, 78.
    • Moore, L.K., Burt, J.M. (1994): Selective block of gap junction channel expression with connexin-specific antisense oligodeoxynucleotides. Am. J. Physiol. 267, C1371-C1380.
    • Ruch, R.J., Guan, X., Sigler, K. (1995): Inhibition of gap junctional intercellular communication and enhancement of growth in BALB/C3T3 cells treated with connexin 43 antisense oligonucleotides. Mol. Carcinogenesis 14, 269-274.

Claims (22)

  1. Antisense-Polynucleotid für ein Connexinprotein zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches ein Oligodesoxynucleotid ist.
  3. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, welches doppelsträngig ist.
  4. Polynucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Connexinprotein Connexin 43, Connexin 26, Connexin 31.1, Connexin 32 oder Connexin 36 ist.
  5. Polynucleotid nach Anspruch 4, bei welchem das Polynucleotid für Connexin 43 ausgewählt ist aus: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC, und GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT.
  6. Polynucleotid nach Anspruch 4, bei welchem das Polynucleotid für Connexin 26 ist: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA.
  7. Polynucleotid nach Anspruch 4, bei welchem das Polynucleotid für Connexin 31.1 ist: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C.
  8. Polynucleotid nach Anspruch 4, bei welchem das Polynucleotid für Connexin 32 ist: TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.
  9. Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments für die Verringerung des Neuronenzelltods, welcher sonst zu einer Neuronenverletzung führt.
  10. Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung.
  11. Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments für die Verringerung von Entzündungen.
  12. Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Narbenbildung.
  13. Verwendung mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments für die Hautverjüngung für einen therapeutischen Zweck.
  14. Verfahren zur Hautverjüngung oder -verdickung für einen kosmetischen Zweck, wobei das Verfahren das einmalige oder wiederholte Verabreichen mindestens eines Antisense-Polynucleotids für ein Connexinprotein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, auf die Hautoberfläche umfasst.
  15. Formulierung zur Verwendung bei einer therapeutischen oder kosmetischen Behandlung, wobei die Formulierung mindestens ein Antisense-Polynucleotid, wie in einem der Ansprüche 5 bis 8 definiert, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel umfasst.
  16. Formulierung nach Anspruch 15, welche für die topische Verabreichung geeignet ist.
  17. Formulierung nach Anspruch 15 oder 16, welche Polynucleotide für mehr als ein Connexinprotein enthält.
  18. Formulierung nach Anspruch 17, bei welcher eines der Connexinproteine gegen das die Polynucleotide gerichtet sind, Connexin 43 ist.
  19. Formulierung nach Anspruch 17, welche Polynucleotide, die gegen mindestens zwei von Connexin 26, Connexin 31.1, Connexin 32, Connexin 36 und Connexin 43 gerichtet sind, einschließt.
  20. Formulierung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, bei welcher der pharmazeutisch verträgliche Träger oder Vehikel ein Gel ist oder einschließt.
  21. Formulierung nach Anspruch 20, bei welcher das Gel ein nichtionisches Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymergel ist.
  22. Formulierung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, welche ferner ein grenzflächenaktives Mittel oder Harnstoff einschließt, um die Penetration der Polynucleotide in die Zellen zu fördern.
DE60021700T 1999-01-27 2000-01-27 Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine Expired - Lifetime DE60021700T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ33392899 1999-01-27
NZ33392899 1999-01-27
NZ50019099 1999-10-07
NZ50019099 1999-10-07
PCT/GB2000/000238 WO2000044409A1 (en) 1999-01-27 2000-01-27 Formulations comprising antisense nucleotides to connexins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60021700D1 DE60021700D1 (de) 2005-09-08
DE60021700T2 true DE60021700T2 (de) 2006-06-01

Family

ID=26652011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60021700T Expired - Lifetime DE60021700T2 (de) 1999-01-27 2000-01-27 Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine

Country Status (13)

Country Link
US (11) US7098190B1 (de)
EP (3) EP1146908B1 (de)
JP (4) JP4994533B2 (de)
AT (2) ATE300959T1 (de)
AU (1) AU776512B2 (de)
CA (2) CA2361251C (de)
CY (2) CY1112557T1 (de)
DE (1) DE60021700T2 (de)
DK (3) DK1621212T3 (de)
ES (3) ES2245638T3 (de)
NZ (1) NZ513154A (de)
PT (3) PT1621212E (de)
WO (1) WO2000044409A1 (de)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5991308A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Kawasaki Heavy Ind Ltd 平面の検出方法
WO2000044409A1 (en) 1999-01-27 2000-08-03 University College London Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
EP1197553A1 (de) * 2000-10-12 2002-04-17 A3D GmbH, Antisense Design & Drug Development Antisense-Nukleinsäure gegen das alphaV Integrin
US20050119211A1 (en) * 2001-05-18 2005-06-02 Sirna Therapeutics, Inc. RNA mediated inhibition connexin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
DK1699924T3 (da) * 2003-12-03 2019-10-21 Ocunexus Therapeutics Inc Connexin 43-målrettede hæmmende forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf i behandling af hornhindetraume
EP2374469A3 (de) 2004-12-21 2012-01-25 MUSC Foundation For Research Development Zusammensetzungen und Verfahren zur Förderung der Wundheilung und Geweberegeneration
US9408381B2 (en) 2004-12-21 2016-08-09 Musc Foundation For Research Development Alpha Connexin c-Terminal (ACT) peptides for use in transplant
KR20150004906A (ko) 2005-02-03 2015-01-13 코다 테라퓨틱스 (엔지) 리미티드 항-코넥신 화합물 및 그의 용도
WO2007055224A1 (ja) * 2005-11-08 2007-05-18 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. 角膜疾患治療剤
CN101437933B (zh) 2005-12-28 2013-11-06 斯克里普斯研究所 作为药物靶标的天然反义和非编码的rna转录物
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
KR20150072458A (ko) * 2006-11-15 2015-06-29 코다 테라퓨틱스, 인크. 상처 치유를 위한 개선 방법 및 조성물
CA2672220A1 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Coda Therapeutics, Inc. Impaired wound healing compositions and treatments
AU2014204482B2 (en) * 2006-12-11 2016-07-07 Coda Therapeutics, Inc. Anticonnexin polynucleotides as impaired wound healing compositions
EP2166845B1 (de) * 2007-06-21 2015-10-21 Musc Foundation for Research Development Alpha-connexin-c-terminale (act) peptide für die behandlung der altersbedingten makulardegeneration
JP5646997B2 (ja) 2007-10-03 2014-12-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 新規ｓｉＲＮＡ構造
US20110300130A1 (en) 2007-12-11 2011-12-08 Becker David L Impaired wound healing compositions and treatments
CN102920996A (zh) * 2007-12-11 2013-02-13 科达治疗公司 受损伤口愈合的药物组合物
EP2252689A2 (de) * 2007-12-21 2010-11-24 Coda Therapeutics, Inc. Verwendung von anti-connexin-polynukleotiden zur behandlung chirurgischer adhäsionen
EP2234656A2 (de) * 2007-12-21 2010-10-06 Coda Therapeutics, Inc. Verbesserte medizinische vorrichtungen
US20110130710A1 (en) * 2007-12-21 2011-06-02 David Lawrence Becker Treatment of abnormal or excessive scars
EP2237796A2 (de) * 2007-12-21 2010-10-13 Coda Therapeutics, Inc. Verwendung von anti-connexin-peptiden allein oder in kombination mit anti-connexin-polynukleotiden zur behandlung von chirurgischen adhäsionen
WO2009085269A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polynucleotides, peptides or antibodies for the treatment of orthopedic conditions
US20130184220A1 (en) * 2007-12-21 2013-07-18 Bradford James Duft Treatment of abnormal or excessive scars
AU2008343756A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polypeptide agent in combination with anti-connexin polynucleotide agent for the treatment of fibrotic conditions
CA2710382A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Treatment of orthopedic conditions
WO2009085270A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of inhibitors of c0nnexin43 for treatment of fibrotic conditions
US20110038920A1 (en) * 2008-01-07 2011-02-17 Ryoichi Mori Wound healing compositions and treatments
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
KR101770435B1 (ko) 2008-10-03 2017-09-05 큐알엔에이, 인크. 자연 안티센스 전사체가 아포리포단백질-ａ1로 억제에 의해 아포리포단백-ａ1 관련된 질환의 치료
US20110294870A1 (en) 2008-12-04 2011-12-01 Opko Curna, Llc Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
WO2010065671A2 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Curna, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
ES2629630T3 (es) 2008-12-04 2017-08-11 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (EPO) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a EPO
US8669941B2 (en) * 2009-01-05 2014-03-11 Nuance Communications, Inc. Method and apparatus for text entry
ES2762610T3 (es) 2009-02-12 2020-05-25 Curna Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) por inhibición de transcrito antisentido natural para BDNF
MX2011009751A (es) 2009-03-16 2011-09-29 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas con factor nuclear (eritroide derivado 2) tipo 2 (nrf2) por inhibicion del transcrito antisentido natural a nrf2.
WO2010107740A2 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
CN102459596B (zh) 2009-05-06 2016-09-07 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
JP6250930B2 (ja) 2009-05-06 2017-12-20 クルナ・インコーポレーテッド トリステトラプロリン（ｔｔｐ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｔｐ関連疾患の治療
KR101742334B1 (ko) 2009-05-08 2017-06-01 큐알엔에이, 인크. Ｄｍｄ 패밀리에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 디스트로핀 패밀리 관련된 질환의 치료
CN102575251B (zh) 2009-05-18 2018-12-04 库尔纳公司 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病
KR101703695B1 (ko) 2009-05-22 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｔｆｅ3 및 인슐린 수용체 기질 2(ｉｒｓ2)의 치료
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
KR101702689B1 (ko) 2009-06-16 2017-02-06 큐알엔에이, 인크. Ｐｏｎ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(ｐｏｎ1) 관련된 질환의 치료
WO2010148050A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Curna, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
CA2765889A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (tnfr2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to tnfr2
CA2765815A1 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
CA2768947C (en) 2009-07-24 2018-06-19 Opko Curna, Llc Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt)
US9234199B2 (en) 2009-08-05 2016-01-12 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS)
EP2464731B1 (de) 2009-08-11 2016-10-05 CuRNA, Inc. Behandlung von adiponectin (adipoq)-bedingten erkrankungen mittels hemmung des natürlichen antisense-transkripts gegen ein adiponectin (adipoq)
WO2011022606A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Curna, Inc. Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip
CN102482671B (zh) 2009-08-25 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制‘含有iq模体的gtp酶激活蛋白’(iqgap)的天然反义转录物而治疗iqgap相关疾病
EP2480669B1 (de) 2009-09-25 2017-11-08 CuRNA, Inc. Behandlung filaggrin (flg)-assoziierter erkrankungen durch modulierung der flg-expression und -aktivität
ES2661813T3 (es) 2009-12-16 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la peptidasa del factor de transcripción de membrana, sitio 1 (mbtps1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen mbtps1
US9068183B2 (en) 2009-12-23 2015-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (UCP2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to UCP2
CA2782373C (en) 2009-12-23 2019-03-26 Opko Curna, Llc Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
WO2011090740A2 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Opko Curna, Llc Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1
ES2585829T3 (es) 2009-12-29 2016-10-10 Curna, Inc. Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la proteína tumoral 63 (p63) por inhibición de transcripción antisentido natural a p63
US20120289583A1 (en) 2009-12-31 2012-11-15 Curna, Inc. Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3)
KR101878501B1 (ko) 2010-01-04 2018-08-07 큐알엔에이, 인크. 인터페론 조절 인자 8 (ｉｒｆ8)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인터페론 조절 인자 8 (ｉｒｆ8) 관련된 질환의 치료
EP2521785B1 (de) 2010-01-06 2022-03-09 CuRNA, Inc. Inhibition des natürlichen antisense-transkripts des pankreasentwicklungsgens zur verwendung in der behandlung von pankreatischen entwicklungsgenbezogenen krankheiten
DK2524039T3 (en) 2010-01-11 2018-03-12 Curna Inc TREATMENT OF GENDER HORMON-BINDING GLOBULIN (SHBG) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTS TO SHBG
CN102782135A (zh) 2010-01-25 2012-11-14 库尔纳公司 通过抑制rna酶h1的天然反义转录物而治疗rna酶h1相关疾病
CN102844435B (zh) 2010-02-22 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病
KR20180044433A (ko) 2010-03-24 2018-05-02 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
ES2657969T3 (es) 2010-04-02 2018-03-07 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el Factor 3 estimulante de colonias (CSF3) por inhibición del transcrito antisentido natural a CSF3
RU2610661C2 (ru) 2010-04-09 2017-02-14 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фактором роста фибробластов 21 (fgf21), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к fgf21
CN107988228B (zh) 2010-05-03 2022-01-25 库尔纳公司 通过抑制沉默调节蛋白(sirt)的天然反义转录物而治疗沉默调节蛋白(sirt)相关疾病
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
CA2799596C (en) 2010-05-26 2020-09-22 Curna, Inc. Treatment of methionine sulfoxide reductase a (msra) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to msra
US8895528B2 (en) 2010-05-26 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (ATOH1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ATOH1
KR102008708B1 (ko) 2010-06-23 2019-08-08 큐알엔에이, 인크. 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 전압 작동 나트륨 통로, 알파 소단위(scna) 관련된 질환의 치료
CN103068982B (zh) 2010-07-14 2017-06-09 库尔纳公司 通过抑制盘状大同系物(dlg)的天然反义转录物而治疗dlg相关疾病
EP2625274B1 (de) 2010-10-06 2017-07-19 CuRNA, Inc. Behandlung sialidase-4-(neu4)-vermittelter erkrankungen durch hemmung des natürlichen antisense-transkripts gegen neu4
CA2815212A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Curna, Inc. Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
CN103459599B (zh) 2010-11-23 2017-06-16 库尔纳公司 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病
JP6188686B2 (ja) 2011-06-09 2017-08-30 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド フラタキシン（ｆｘｎ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるｆｘｎ関連疾患の治療
CA2847811C (en) 2011-09-06 2019-10-22 Curna, Inc. Treatment of diseases related to alpha subunits of sodium channels, voltage-gated (scnxa) with small molecules
AU2013219799C1 (en) 2012-02-15 2017-12-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of treating and preventing diseases and disorders of the central nervous system
CN104271142B (zh) 2012-03-01 2017-07-04 福斯特斯特林研究公司 含有α连接蛋白C‑末端(ACT)肽的局部凝胶
US20150031750A1 (en) 2012-03-15 2015-01-29 The Scripps Research Institute Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
US20140274872A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Coda Therapeutics, Inc. Compositions and treatments based on cadherin modulation
EP2831233A1 (de) 2012-03-27 2015-02-04 CoDa Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und behandlungen auf der basis von cadherin-modulation
EP2970978A4 (de) * 2013-03-11 2016-11-02 Univ North Carolina Zusammensetzungen und verfahren zur abzielung auf o-verknüpfte n-acetylglucosamin-transferase und zur förderung der wundheilung
US9156896B2 (en) 2013-03-15 2015-10-13 Coda Therapeutics, Inc. Wound healing compositions and treatments
JP6883987B2 (ja) * 2013-12-04 2021-06-09 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． 化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒の処置のための方法
CA2940648A1 (en) * 2014-02-25 2015-09-03 Coda Therapeutics, Inc. Treatment of resistant lesions
US20170106047A1 (en) * 2014-06-12 2017-04-20 The Research Foundation For The State University Of New York Methods of using gap junctions as therapeutic targets for the treatment of degenerative disorders of the retina
EA201790434A1 (ru) 2014-08-22 2017-07-31 Окленд Юнисервисиз Лимитед Модуляторы каналов
CN107073294A (zh) 2014-09-05 2017-08-18 阿克赛医药公司 使用靶向tyr或mmp1的核酸治疗老化和皮肤病症的方法
AU2017224122B2 (en) * 2016-02-26 2024-04-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies and uses thereof
CA3061738A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Auckland Uniservices Limited Methods of treatment and novel constructs
EP3685824A1 (de) * 2019-01-25 2020-07-29 Breitenbronn-Consulting GbR Zusammensetzung zur verabreichung und freisetzung von oligonukleotiden
WO2023219655A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 University Of Utah Research Foundation Gja1-20k to limited cardiac arrhythmias

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9425930D0 (en) 1994-12-22 1995-02-22 Procter & Gamble Silicone compositions
AU1846297A (en) * 1996-01-31 1997-08-22 Regents Of The University Of California, The Method for inhibiting tumor cell growth
DE69736820T2 (de) * 1996-03-07 2007-08-09 Eisai Co., Ltd. Mäuse Adhesions Molekül Occludin
DE69736862T2 (de) * 1996-07-17 2007-05-31 Medtronic, Inc., Minneapolis Abgabesystem zur Abgabe von genetischem Material an Herzgewebe
EP0950060A4 (de) * 1996-12-02 2000-07-05 Dyad Pharmaceutical Corp Gegenstrang-hemmung von menschlichen adhäsionsmolekülen
EP1037981A1 (de) * 1997-12-09 2000-09-27 Children's Medical Center Corporation Lösliche inhibitoren des vaskularen endothelialen wachstumsfaktors, und verwendung davon
WO2000044409A1 (en) * 1999-01-27 2000-08-03 University College London Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
US5998148A (en) * 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression

Also Published As

Publication number Publication date
JP5736397B2 (ja) 2015-06-17
US20070078103A1 (en) 2007-04-05
EP1146908B1 (de) 2005-08-03
JP2013135677A (ja) 2013-07-11
JP2002535377A (ja) 2002-10-22
US20070037765A1 (en) 2007-02-15
JP2012041342A (ja) 2012-03-01
JP5705890B2 (ja) 2015-04-22
JP2013136594A (ja) 2013-07-11
US20070072819A1 (en) 2007-03-29
AU776512B2 (en) 2004-09-09
AU2119300A (en) 2000-08-18
CY1115521T1 (el) 2017-01-04
ES2498745T3 (es) 2014-09-25
US7902164B2 (en) 2011-03-08
US7919474B2 (en) 2011-04-05
EP1621212A1 (de) 2006-02-01
DE60021700D1 (de) 2005-09-08
US8314074B2 (en) 2012-11-20
CY1112557T1 (el) 2016-02-10
US7615540B2 (en) 2009-11-10
ES2245638T3 (es) 2006-01-16
EP1146908A1 (de) 2001-10-24
NZ513154A (en) 2004-01-30
US20070066555A1 (en) 2007-03-22
US20110065770A1 (en) 2011-03-17
EP1621212B1 (de) 2011-11-16
CA2730386C (en) 2015-08-11
US20080221051A1 (en) 2008-09-11
DK2314321T3 (da) 2014-09-08
ES2377749T3 (es) 2012-03-30
US20070060538A1 (en) 2007-03-15
CA2361251C (en) 2011-03-08
ATE300959T1 (de) 2005-08-15
US20130079388A1 (en) 2013-03-28
US20070072820A1 (en) 2007-03-29
PT1621212E (pt) 2012-02-20
JP4994533B2 (ja) 2012-08-08
PT1146908E (pt) 2005-10-31
WO2000044409A1 (en) 2000-08-03
DK1146908T3 (da) 2005-10-10
US20080249041A1 (en) 2008-10-09
ATE533515T1 (de) 2011-12-15
PT2314321E (pt) 2014-09-26
CA2730386A1 (en) 2000-08-03
US9193754B2 (en) 2015-11-24
EP2314321B1 (de) 2014-06-04
US7098190B1 (en) 2006-08-29
CA2361251A1 (en) 2000-08-03
US7879811B2 (en) 2011-02-01
EP2314321A1 (de) 2011-04-27
DK1621212T3 (da) 2012-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60021700T2 (de) Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine
WO2013053480A1 (de) Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen
DE69633396T2 (de) Activin stimulator enthaltende pharmazeutische zusammensetzung
DE69434569T2 (de) Verfahren zur erhöhung der überlebensrate von neuronen und dafür verwendbare mittel
US9932592B2 (en) Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
DE19740092A1 (de) Liposomen und Verfahren zur Transfektion von Zellen
DE4019208A1 (de) Nervenregenerationsmittel
EP1536840B1 (de) Formulierung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryotischen zellen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition