KR20060006003A

KR20060006003A - 재생 각막 내피 세포 시트, 제조 방법 및 그 이용 방법

Info

Publication number: KR20060006003A
Application number: KR1020057015310A
Authority: KR
Inventors: 고지 니시다; 데루오 오카노; 마사유키 야마토
Original assignee: 고지 니시다; 가부시키가이샤 셀시드
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2006-01-18
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: US20070148137A1; EP1600177A4; CN1753696B; EP1600177A1; WO2004073761A1; JPWO2004073761A1; EP1600177B1; US9981064B2; JP4335873B2; CN1753696A; KR101228251B1

Abstract

조직으로부터 채취한 각막 내피 세포를, 0 ∼ 80 ℃ 의 온도 범위 내에서 수화력이 변화하는 폴리머를 표면에 피복한 세포 배양 지지체 상에서 배양하고, 배양 후,

(1) 배양액 온도를 기재 표면의 폴리머가 수화되는 온도로 하고,

(2) 배양된 각막 내피 세포 시트를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 캐리어와 함께 그대로 박리하는

것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.

상기 방법에 의해 얻어지는 재생 각막 내피 세포 시트는 생체 조직에 대한 부착성이 매우 양호하다.

재생 각막 내피 세포 시트, 캐리어

Description

재생 각막 내피 세포 시트, 제조 방법 및 그 이용 방법 {ENDOTHELIAL CELL SHEET FOR CORNEA REGENERATION, METHOD OF PRODUCING THE SAME AND METHOD OF USING THE SAME}

본 발명은 생물학, 의학 등의 분야에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트, 제조 방법 및 이들을 이용한 치료법에 관한 것이다.

각막 조직이란, 외측 표면으로부터 각막 상피층, 보우만막, 각막 실질층, 데스메막, 각막 내피층의 5 층으로 이루어진다. 가장 내측의 각막 내피층은 각막 조직에 대해 라이닝된 형상으로 되어 있으며, 데스메막이 각막 내피층의 접착 단백질로 이루어지는 기저막에 해당한다. 각막 내피 세포의 기능은 각막 실질의 팽윤압에 역행하여 실질측에서 전방(前房)측으로 물을 퍼내는 것에 있으며, 이것은 Na-K ATPase 를 사용한 펌프 작용에 의한 것으로 여겨지고 있다. 인간의 각막 내피 세포는 통상적으로 생체 내에서는 세포 분열하지 않는 것으로 알려져 있고, 변성, 탈락된 내피 세포의 부분은 잔존하는 세포가 비대화 또는 이동함으로써 대상(代償)된다. 이 때, 잔존하는 각막 내피 세포수가 지나치게 적으면, 이제는 각막 내피 조직에 의한 펌프 기능이 불충분해져, 각막 조직이 팽창하고, 각막 내피 장애, 수포성 각막증 등의 질병을 발증시키게 된다. 이들 질병에 대한 치료법 으로는, 눈의 통증에 대해 치료용 소프트콘택트 렌즈를 사용하거나, 팽윤된 각막 조직으로부터 수분을 제거하기 위해 고장 식염수의 안연고나 점안약을 사용하는 방법 등을 들 수 있지만, 이 방법은 대증 용법에 지나지 않아, 근본적인 치료법이 요망되고 있었다.

의료 기술의 현저한 발전에 따라, 최근, 치료가 곤란해진 장기를 타인의 장기와 바꾸어 놓으려는 장기 이식이 일반화되어 왔다. 상기의 각막 내피 장애, 수포성 각막증 등의 질병에 대해서도 각막 전층(全層)을 이식함으로써 근본적으로 치료하려고 하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 여전히 도너(donor)수는 환자수에 비해 압도적으로 적어 일본 내에서만도 각막 이식이 필요한 환자가 연간 약 2 만명이 나오고 있는데 비해, 실제로 이식 치료를 실시할 수 있는 환자는 약 1/10 인 2000 명 정도밖에 없는 것으로 알려져 있다. 각막 이식이라는 거의 확립된 기술이 있음에도 불구하고, 도너 부족이라는 문제 때문에, 추가 의료 기술이 요구되고 있는 것이 현실이다.

이러한 문제를 해결하는 수단으로서, 최근, 필요한 조직을 생체 외에서 인공적으로 배양하여 얻고자 하는 재생 의료 기술이 급속하게 진보되어 왔다. 종래, 이러한 세포 배양은, 유리 표면 상 또는 여러 가지 처리를 실시한 합성 폴리머의 표면 상에서 실시되었다. 예컨대, 폴리스티렌을 재료로 하는 표면 처리, 예컨대, γ 선 조사, 실리콘 코팅 등을 실시한 여러 가지 용기 등이 세포 배양용 용기로서 보급되고 있다. 그러나, 상기의 각막 내피 세포는 이러한 용기 표면에서는 고밀도로 증식시키기 어려운 세포로서 알려져 있어, 보다 좋은 배양법이 요망 되고 있었다.

또, 세포 배양용 용기를 사용하여 배양ㆍ증식한 세포는 통상적으로 트립신과 같은 단백 분해 효소나 화학 약품을 처리함으로써 용기 표면로부터 박리ㆍ회수된다. 그러나, 상기 기술한 바와 같은 화학 약품 처리를 실시하여 증식된 세포를 회수하는 경우, 불순물 혼입의 가능성이 커지는 것, 및 증식된 세포가 화학적 처리에 의해 변성 또는 손상되어 세포 본래의 기능이 손상되는 예가 있는 것 등의 결점이 지적되고 있었다. 이러한 결점을 극복하기 위해, 지금까지 몇 가지 기술이 제안되어 있다.

일본 특허공보 평2-23191호에는, 인간 신생아 유래의 각화 표피 세포를, 케라틴 조직의 막이 용기의 표면 상에 형성되는 조건 하에서, 배양 용기 내에서 배양하고, 케라틴 조직의 막을 효소를 사용하여 박리시키는 것을 특징으로 하는 케라틴 조직에 이식 가능한 막을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 구체적으로는, 3T3 세포를 영양 세포층으로서 증식, 중층화시키고, 단백질 분해 효소인 디스파제(dispase)를 사용하여 세포 시트를 회수하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 해당 공보에 기재되어 있는 방법은 다음과 같은 결점을 갖고 있었다.

(1) 디스파제는 균 유래의 것으로, 회수된 세포 시트를 충분히 세정할 필요성이 있는 것.

(2) 배양된 세포마다 디스파제 처리 조건이 다르고, 그 처리에 숙련이 필요한 것.

(3) 디스파제 처리에 의해 배양된 표피 세포가 병리학적으로 활성화되는 것.

(4) 디스파제 처리에 의해 세포외 매트릭스가 분해되는 것.

(5) 이 때문에, 그 세포 시트가 이식된 환부는 감염되기 쉬운 것.

상기 기술한 바와 같은 종래법의 결점에 추가하여, 본 발명의 대상인 각막 내피 세포는, 피부 세포만큼 세포ㆍ세포간 결합이 강하지 않기 때문에, 상기 디스파제를 갖고 있다 하더라도, 배양 후에 1 장의 시트로서 박리, 회수할 수는 없다는 결점을 갖고 있었다.

또, 일본 특허출원공보 2001-226141호에서는, 물에 대한 상한 또는 하한 임계 용해 온도가 0 ∼ 80 ℃ 인 온도 응답성 폴리머를 기재 표면에 피복한 세포 배양 지지체 상에서 전안부(前眼部) 관련 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 따라 배양 세포층을 중층화시키고, 지지체의 온도를 바꾸는 것만으로 배양한 세포 시트를 박리시킴으로써, 충분한 강도를 가진 세포 시트의 제작이 가능해졌다. 그러나, 실제로 얻어지는 각막 내피 세포 시트의 생착성(生着性), 기능을 고려하면 추가의 개선이 요망되고 있었다.

발명의 개시

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 의도하여 이루어진 것이다. 즉, 본 발명은 안 조직에 대한 부착성이 양호한 재생 각막 내피 세포 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 그 제조법 및 이용 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 여러 가지 각도에서 검토를 하여 연구 개발을 실시하였다. 그 결과, 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 특정 조건의 세포 배양 지지체 상에서 각막 내피 세포를 특정 조건 하에서 배양하고, 그 후, 배양액 온도를 기재 표면의 폴리머가 수화되는 온도로 하고, 배양한 재생 각막 내피 세포 시트를 특정한 캐리어(carrier)에 밀착시키고, 세포 시트의 수축을 억제하면서, 그대로 캐리어와 함께 박리함으로써, 생체 조직에 매우 부착성이 양호한 재생 각막 내피 세포 시트가 얻어진다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 전안부 조직에 대한 부착성이 양호하고, 기능면에서도 충분한 정도의 세포 밀도로 이루어지는, 캐리어에 밀착시킨 재생 각막 내피 세포 시트를 제공한다.

또, 본 발명은 0 ∼ 80 ℃ 의 온도 범위 내에서 탈수화하는 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 세포를 배양하고, 그 후,

(2) 배양한 각막 내피 세포 시트를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 캐리어와 함께 그대로 박리하는

것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법을 제공한다.

덧붙여, 본 발명은, 상기 재생 각막 내피 세포 시트를 이식하는 것을 특징으로 하는 치료법을 제공한다.

더욱 추가하여, 본 발명은, 창상(創傷) 조직을 치료하기 위한 상기 재생 각막 내피 세포 시트를 제공한다.

도 1 은 실시예 4 에서 세포 배양 지지체 재료로부터 박리된 재생 각막 세포 시트를 나타낸다.

도 2 는 실시예 4 에서 배양 중의 인간 재생 각막 세포 시트를 배양 1 일 후 (A), 3 일 후 (B), 7 일 후 (C), 14 일 후 (D) 에 각각 꺼내어 생성되는 콜라겐 Ⅳ (상측 도면) 및 피브로넥틴 (하측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 나타낸다.

도 3 은 실시예 4 에서 배양 4 일 후의 재생 각막 내피 세포 시트에 존재하는 ZO-1 단백질을 면역 형광 염색한 결과를 나타낸다.

도 4 는 실시예 4 에서 얻어진 박리 도중의 인간 재생 각막 세포 시트에 존재하는 콜라겐 Ⅳ (좌측 도면) 및 피브로넥틴 (우측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 나타낸다. 도면 중의 화살표는 박리 방향을 나타낸다.

도 5 는 실시예 4 에서 박리 후의 인간 재생 각막 세포 시트를 H/E 염색한 결과 (좌측 도면), 세포 시트에 존재하는 콜라겐 Ⅳ (중앙 도면) 및 피브로넥틴 (우측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 나타낸다.

도 6 은 실시예 4 에서 얻어진 인간 재생 각막 세포 시트의 TEM 상을 나타낸다. 도면 중의 기호는 각각 ECM : 세포외 매트릭스, N : 핵, GC : 골지 복합체, M : 미토콘드리아, EM : 세포질 세망을 나타내고, 화살표 부분은 세포-세포간 결합을 나타내고 있다.

도 7 은 실시예 5, 비교예 3, 4 에서 나타나는 각막 내피 세포 시트 표층에 존재하는 단백질 및 세포-세포간 결합에 관여하는 ZO-1 단백질을 SDS-PAGE 법으로 확인한 결과를 나타낸다. 상측 도면의 A 는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brillinat blue)로 염색하여 세포 시트 표층에 존재하는 단백질을 측정한 결과, 또 하측 도면의 B 는 항인간 ZO-1 폴리클로날 항체를 사용하여 염색한 결과를 나타낸다. 도면 중의 T 는 본 발명의 세포 배양 지지체 재료로부터 저온 처리로 박리시킨 세포 시트의 결과를 나타내고, D 는 시판되는 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있지 않은 기재로부터 디스파제 처리하여 얻어진 세포, S 는 그 시판되는 기재로부터 스크레이퍼법에 의해 박리한 세포의 분석 결과를 나타낸다.

도 8 은 실시예 7 에서 얻어진 박리 전의 재생 각막 내피 시트에 대해, 항토끼 Na-K ATPase 모노클로날 항체를 사용하여 염색시키고, Na-K ATPase 펌프 사이트부를 녹색으로 염색시키고, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 세포핵을 적색으로 염색시키고, 공초점 현미경을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 이 때, 상측 도면의 A 는 배양 세포 시트의 상면으로부터 관찰한 결과를 나타내고, B 는 두께 방향을 관찰한 결과이다.

도 9 는 도면 중의 A 에 인간 각막 내피 세포 시트 내의 세포 밀도에 대한 1 세포당 펌프수의 상관성을 나타내고, 도면 중의 B 에 세포 밀도에 대한 단위 면적당 펌프수의 상관성을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 사용되는 대표적인 내피 세포는 각막 조직 내에 있는 각막 내피 세포이지만, 그 종류는 전혀 제약되지 않는다. 본 발명에 있어서, 재생 각막 내피 세포 시트란, 상기한 각종 세포가 배양 지지체 상에서 단층 형상으로 배양되고, 그 후에 지지체로부터 박리된 시트를 의미한다.

본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트는 배양시에 디스파제, 트립신 등으로 대표되는 단백질 분해 효소에 의한 손상을 받지 않은 것이다. 이 때문에, 기재로부터 박리된 재생 각막 내피 세포 시트는, 세포-세포간 데스모솜 구조가 유지되어, 구조적 결함이 적고, 강도가 높은 것이다. 또, 본 발명의 시트는 배양시에 형성되는 세포-기재간 기저막형 단백질도 효소에 의해 파괴되어 있지 않다. 이에 따라, 이식시에 있어서 환부 조직과 양호하게 접착할 수 있어, 효율적인 치료를 실시할 수 있게 된다. 이상의 내용을 구체적으로 설명하면, 트립신 등의 통상의 단백질 분해 효소를 사용한 경우, 세포-세포간 데스모솜 구조 및 세포, 기재간 기저막형 단백질 등은 거의 유지되어 있지 않고, 따라서 세포는 하나하나 나뉘어진 상태가 되어 박리된다. 이 중에서, 단백질 분해 효소인 디스파제에 관해서는, 세포-세포간 데스모솜 구조에 대해서는 10 ∼ 60 % 로 유지한 상태에서 박리시킬 수 있는 것으로 알려져 있지만, 세포-기재간 기저막형 단백질 등을 거의 파괴해 버리기 때문에, 얻어지는 세포 시트는 강도가 약한 것이다. 이에 비해, 본 발명의 세포 시트는 데스모솜 구조, 기저막형 단백질 모두 80 % 이상 잔존된 상태의 것으로, 상기 기술한 바와 같은 여러 가지 효과를 얻을 수 있는 것이다.

본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트는 생체 조직인 전안부 조직에 매우 양호하게 생착된다. 이 성질은, 지지체 표면으로부터 박리시킨 재생 각막 내피 세포 시트의 수축을 억제함으로써 실현된다는 것을 발견하였다. 이 때, 재생 각막 내피 세포 시트의 수축률은 시트 내의 어느 방향에서의 길이에 있어서도 20 % 이하인 것이 요망되고, 바람직하게는 10 % 이하, 더욱 바람직하게는 5 % 이하인 것이 바람직하다. 시트의 어느 방향의 길이에 있어서 20 % 이상이 되면, 박리한 세포 시트는 늘어진 상태가 되고, 이 상태에서 생체 조직에 부착시켜도 조직에 밀착되지 않아, 본 발명에서 나타내는 고(高)생착성은 기대할 수 없다.

재생 각막 내피 세포 시트를 수축시키지 않는 방법은, 세포 시트를 수축시키지 않는 방법이라면 전혀 제약되지 않지만, 예컨대, 지지체로부터 재생 각막 내피 세포 시트를 박리시킬 때, 이들 세포 시트에 중심부를 잘라낸 링 형상의 캐리어 등을 밀착시키고, 그 캐리어마다 세포 시트를 박리하는 방법 등을 들 수 있다.

재생 각막 내피 세포 시트를 밀착시킬 때 사용하는 캐리어는, 본 발명의 세포 시트가 수축하지 않도록 유지하기 위한 구조물로, 예컨대, 폴리머막 또는 폴리머막으로부터 성형된 구조물, 금속성 지그(治具) 등을 사용할 수 있다. 예컨대, 캐리어의 재질로서 폴리머를 사용하는 경우, 그 구체적인 재질로는, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 셀룰로오스 및 그 유도체, 종이류, 키틴, 키토산, 콜라겐, 우레탄 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 밀착이라고 하는 경우, 세포 시트가 수축하지 않도록, 세포 시트와 캐리어의 경계면에서, 캐리어 상에서 세포 시트가 어긋나거나 이동하거나 하지 않는 상태의 것을 말하며, 물리적으로 결합함으로써 밀착되어 있어도 되고, 양자간에 존재하는 액체 (예컨대, 배양액, 그 밖의 등장액) 을 통해 밀착되어 있어도 된다.

캐리어의 형상은 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대, 얻어진 재생 각막 내피 세포 시트를 이식할 때, 캐리어의 일부에 이식 부위와 동일한 정도 또는 이식 부위보다 크게 잘라낸 것을 이용하면, 세포 시트는 잘라진 주위의 부분만큼 고정되어, 잘라진 부분에 있는 세포 시트를 이식 부위에 대기만 하면 되어 편리하다. 또, 각막 내피 조직이 각막 조직의 최내층에 위치한다는 점에서, 상기 세포 시트를 세포 시트의 지지체와 접촉하고 있던 반대측 면을 지그에 고정시키고, 이것을 그대로 각막 조직 내에 삽입하여, 세포 시트를 놓고 오는 이식법이어도 된다. 이 때의 지그의 형상은 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대, 생체 내의 각막 내피 조직의 형태와 동등한 곡률의 곡면을 가진 지그, 이 지그에 세포 시트가 고정되도록 흡인구를 형성한 것 등이 조작하기 쉬워 편리하다.

또, 본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트의 특징인 생체 조직에 대한 높은 생착성은, 특정한 배양 조건 하에서 실현된다. 즉, 본 발명의 세포 시트는, 지지체 표면 상에 각막 내피 세포를 파종한 후에 배양함으로써 얻어지는데, 지지체 표면 상에서 세포가 컨플루언트 (confluent ; 가득찬 상태) 가 되고 나서 10 일 후 이후, 바람직하게는 12 일 후 이후, 20 일 후 이후인 것이 더욱 바람직하다는 것이 판명되었다. 10 일보다 적으면 박리한 재생 각막 내피 세포 시트의 기저막이 충분치 않고, 이 때문에 부착성도 저감되어, 본 발명의 특징의 하나인 고생착성은 기대할 수 없게 된다.

본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트는 각막 내피 조직 본래의 기 능을 갖는 고밀도인 세포 시트이다. 이 때의 세포 밀도는 2500 개/㎟ 이상, 바람직하게는 2700 개/㎟ 이상, 2900 개/㎟ 이상인 것이 더욱 바람직하다는 것이 판명되었다. 2500 개/㎟ 이하이면, 충분한 펌프 기능을 발현시킬 수 없어, 본 발명의 특징의 하나인 고기능성은 기대할 수 없게 된다.

본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트는 충분한 펌프 기능을 갖는 세포 시트이다. 이 때의 펌프 사이트 (Na/K ATPase 펌프 사이트) 수는 3.4 × 10⁹개/㎟ 이상, 바람직하게는 3.8 × 10⁹개/㎟ 이상, 4.2 × 10⁹개/㎟ 이상인 것이 더욱 바람직하다는 것이 판명되었다. 3.4 × 10⁹개/㎟ 이하이면, 충분한 펌프 기능을 발현시킬 수 없어, 본 발명의 특징의 하나인 고기능성은 기대할 수 없게 된다.

본 발명에 있어서의 재생 각막 내피 세포 시트는, 이상에 나타내는 바와 같이, 생체 조직에 매우 양호하게 부착할 수 있으며, 또한 각막 내피 조직으로서 충분히 기능할 수 있는 고밀도인 세포 시트로, 종래 기술로부터로는 전혀 얻을 수 없었던 것이다.

본 발명의 세포 배양 지지체에 있어서, 기재에 피복되어 있는 온도 응답성 폴리머는 온도를 바꿈으로써 수화, 탈수화를 일으키는 것으로, 그 온도 범위는 0 ℃ ∼ 80 ℃, 바람직하게는 10 ℃ ∼ 50 ℃, 더욱 바람직하게는 20 ℃ ∼ 45 ℃ 인 것이 판명되었다. 80 ℃ 를 초과하면, 세포가 사멸할 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다. 또, 0 ℃ 보다 낮으면, 일반적으로 세포 증식 속도가 극도로 저하되거나, 또는 세포가 사멸해 버리기 때문에, 역시 바람직하지 않다.

본 발명에 사용하는 온도 응답성 폴리머는 호모폴리머, 코폴리머 중 어느 것이어도 된다. 이러한 폴리머로는 예컨대, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 폴리머를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 이하의 모노머의 단독 중합 또는 공중합에 의해 얻어진다. 사용할 수 있는 모노머로는, 예컨대, (메트)아크릴아미드 화합물, ((메트)아크릴아미드는, 아크릴아미드 및 메타크릴아미드를 의미한다. 이하, 동일.), N-(또는, N,N-디)알킬 치환 (메트)아크릴아미드 유도체, 또는 비닐에테르 유도체를 들 수 있으며, 코폴리머의 경우에는, 이들 중에서 임의의 2 종 이상을 사용할 수 있다. 게다가, 상기 모노머 이외의 모노머류와의 공중합, 폴리머끼리의 그래프트 또는 공중합, 또는 폴리머, 코폴리머의 혼합물을 사용해도 된다. 또, 폴리머 본래의 성질을 손상시키지 않는 범위에서 가교하는 것도 가능하다.

피복을 실시할 수 있는 기재로는, 통상적으로 세포 배양에 사용되는 유리, 개질 유리, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 화합물을 비롯하여, 일반적으로 형태를 부여할 수 있는 물질, 예컨대, 상기 이외의 폴리머 화합물, 세라믹스류 등을 모두 사용할 수 있다.

온도 응답성 폴리머의 지지체에 대한 피복 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 방법에 따르면 된다. 즉, 이러한 피복은 기재와 상기 모노머 또는 폴리머를 전자선 조사 (EB), γ 선 조사, 자외선 조사, 플라즈마 처리, 코로나 처리, 유기 중합 반응 중 어느 하나에 의 해, 또는 도포, 혼련 등의 물리적 흡착 등에 의해 실시할 수 있다.

온도 응답성 폴리머의 피복량은 0.4 ∼ 3.0 ㎍/㎠ 의 범위가 좋고, 바람직하게는 0.7 ∼ 2.8 ㎍/㎠ 이며, 더욱 바람직하게는 0.9 ∼ 2.5 ㎍/㎠ 이다. 0.4 ㎍/㎠ 보다 적은 피복량일 때, 자극을 주어도 당해 폴리머 상의 세포는 박리되기 어렵고, 작업 효율이 현저히 나빠져 바람직하지 않다. 반대로, 3.0 ㎍/㎠ 이상이면, 그 영역에 세포가 부착되기 어려워, 세포를 충분히 부착시키는 것이 곤란해진다.

본 발명에 있어서의 지지체의 형태는 특별히 제약되는 것은 아니지만, 예컨대, 접시(dish), 멀티플레이트, 플라스크, 셀인서트(cell insert) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 세포의 배양은 상기 기술한 바와 같이 하여 제조된 세포 배양 지지체 상에서 실시된다. 배지 온도는, 기재 표면에 피복된 상기 폴리머가 탈수화되는 온도에서 실시되면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 배양 세포가 증식되지 않는 저온 범위, 또는 배양 세포가 사멸하는 고온 범위에 있어서의 배양이 부적절하다는 것은 말할 필요도 없다. 온도 이외의 배양 조건은 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 사용하는 배지에 대해서는, 공지된 소 태아 혈청 (FCS) 등의 혈청이 첨가되어 있는 배지이어도 되고, 또 이러한 혈청이 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지이어도 된다. 본 발명의 방법에 있어서, 배양한 세포를 지지체 재료로부터 박리하여 회수하기 위해서는, 배양된 재생 각막 내피 세포 시트를 캐리어에 밀착시키고, 세포가 부착된 지지체 재료의 온 도를 지지체 기재의 피복 폴리머가 수화되는 온도로 함으로써, 그대로 캐리어와 함께 박리할 수 있다. 이 때, 세포 시트와 지지체 사이에 물을 흘려 박리를 원활하게 실시해도 된다. 또한, 시트를 박리하는 것은 세포를 배양하고 있던 배양액 중에서 실시할 수도 있고, 그 밖의 등장액 중에서 실시할 수도 있으며, 목적에 맞춰 선택할 수 있다.

이상의 내용을 온도 응답성 폴리머로서 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)를 예로 들어 설명한다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 31 ℃ 로 하한 임계 용해 온도를 갖는 폴리머로서 알려져 있으며, 유리 상태라면, 물 중에서 31 ℃ 이상의 온도에서 탈수화를 일으켜 폴리머 사슬이 응집되어 백탁된다. 반대로, 31 ℃ 이하의 온도에서는 폴리머 사슬은 수화되어, 물에 용해된 상태가 된다. 본 발명에서는, 이 폴리머가 샤알레 등의 기재 표면에 피복, 고정된 것이다. 따라서, 31 ℃ 이상의 온도라면, 기재 표면의 폴리머도 동일하게 탈수화되지만, 폴리머 사슬이 기재 표면에 피복, 고정되어 있기 때문에, 기재 표면이 소수성을 나타내게 된다. 반대로, 31 ℃ 이하의 온도에서는, 기재 표면의 폴리머는 수화되지만, 폴리머 사슬이 기재 표면에 피복, 고정되어 있기 때문에, 기재 표면이 친수성을 나타내게 된다. 이 때의 소수적인 표면은 세포가 부착, 증식될 수 있는 적절한 표면이고, 또 친수적인 표면은 세포가 부착될 수 없을 정도의 표면이 되어, 배양 중의 세포 또는 세포 시트도 냉각시키는 것만으로 박리되게 된다.

본 발명의 세포 시트는 세포가 고밀도로 존재하는 것이다. 그 제조법은 특별히 한정되지는 않지만, 각막 내피 세포가 빠르게 고밀도로 증식되지 않기 때문 에, 예컨대, 미리 계대 배양을 몇 번이나 실시하여, 소정의 총 세포수가 된 단계에서, 그 모든 세포를 소정의 면적에 파종하는 방법을 들 수 있다. 이 때, 세포 분산액 중의 세포 농도를 높이기 위해, 원심 분리를 실시하여 농축하거나, 기재의 배양 면적을 줄여 단위 면적당 세포수를 증가시켜도 된다. 세포의 계대 배양시에 사용하는 기재는 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대, 콜라겐 Ⅳ, 콜라겐 I, 콜라겐 Ⅲ, 라미닌, 피브로넥틴, 마트리겔 등의 접착성 단백질 상에서 배양하면, 각막 내피 세포의 형태가 흐뜨러지지 않아 편리하다.

파종시의 기재 단위 면적당 세포수는 2000 개/㎟ 이상이 좋고, 바람직하게는 2300 개/㎟ 이상, 더욱 바람직하게는 2500 개/㎟ 이상이 바람직하다. 2000 개/㎟ 미만의 경우, 얻어지는 재생 각막 내피 세포 시트의 세포 밀도를 2500 개/㎟ 이상으로 하는 것이 곤란해진다.

본 발명에서는, 세포 시트를 환부에 댄 후, 세포 시트를 캐리어로부터 박리시키면 된다. 그 박리하는 방법은 전혀 제약되지 않지만, 예컨대, 캐리어를 적셔 캐리어와 세포 시트의 밀착성을 약하게 하여 박리하는 방법, 또는 메스, 가위, 레이저광, 플라즈마파 등의 지그를 사용하여 절단하는 방법이어도 된다. 예컨대, 상기 기술한 바와 같은 일부를 잘라낸 캐리어에 밀착시킨 세포 시트를 사용한 경우, 레이저광 등을 사용하여 환부의 경계선을 따라 절단하면, 환부 이외의 쓸데없는 곳에 대해 세포 시트가 부착되는 것을 피할 수 있어 편리하다.

본 발명에서 나타내는 바와 같은 재생 각막 내피 세포 시트와 생체 조직의 고정 방법은 특별히 한정되지 않고, 세포 시트와 생체 조직을 봉합해도 되고, 또는 본 발명에서 나타내는 바와 같은 재생 각막 내피 세포 시트는 생체 조직과 빠르게 생착되기 때문에, 환부에 부착시킨 세포 시트는 생체측과 봉합하지 않아도 된다.

재생 각막 내피 세포 시트를 고수율로 박리, 회수할 목적에서, 세포 배양 지지체를 가볍게 두드리거나, 흔들거나 하는 방법, 나아가서는 피펫을 사용하여 배지를 교반하는 방법, 세포 시트와 기재 사이에 물을 흘리는 방법 등을 단독으로 사용해도 되고, 또는 병용하여 사용해도 된다. 덧붙여, 필요에 따라 배양 세포는 등장액 등으로 세정하고 박리하여 회수해도 된다.

본 발명에 나타나는 재생 각막 내피 세포 시트의 용도는 전혀 제약되지 않지만, 예컨대, 각막 내피 장애, 수포성 각막증에 유효하다.

상기 기술한 방법에 의해 얻어진 재생 각막 내피 세포 시트는, 종래 방법에 의해 얻어진 것에 비해, 박리시에 비침습(菲侵襲)성이고, 게다가 고기능인 것으로서 매우 우수하며, 이식용 각막 내피 시트로서의 임상 응용이 강력하게 기대된다. 특히, 본 발명의 재생 각막 내피 세포 시트는 종래의 이식 시트와는 달리, 생체 조직과의 높은 생착성을 갖기 때문에, 매우 빠르게 생체 조직에 생착된다. 이것은, 환부의 치료 효율의 향상, 게다가 환자가 갖는 부담의 경감도 도모되어 매우 유효한 기술이라고 생각된다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포 배양 지지체는 반복 사용이 가능하다.

이하에, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명을 조금도 한정하지 않는다.

실시예 1, 2

시판되는 3.5 ㎝φ 세포 배양용 배양 접시 (벡톤ㆍ디킨슨ㆍ랩웨어 (Becton Dickinson Labware) 사 제조의 팔콘 (FALCON) 3001) 상에, N-이소프로필아크릴아미드 모노머를 40 중량% (실시예 1), 45 중량% (실시예 2) 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.1 ㎖ 도포하였다. 0.25 MGy 강도의 전자선을 조사하여, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 (PIPAAm) 를 고정화시켰다. 조사 후, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하여, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합되지 않은 PIPAAm 을 제거하고, 클린 벤치 내에서 건조시키고, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균시킴으로써 세포 배양 지지체 재료를 얻었다. PIPAAm 의 피복량은, 각각 1.6 ㎍/㎠ (실시예 1), 1.8 ㎍/㎠ (실시예 2) 라는 것을 알 수 있었다.

한편, 통상적인 방법에 따라 백색 집토끼의 각막 주변부로부터 깊은 마취 하에서 각막 내피 조직을 채취하고, 그 각막 상피 세포를 콜라겐 Ⅳ 를 코팅한 플라스크를 사용하고, 통상적인 방법에 따라 5 계대 배양하였다 (사용 배지 : DMEM, 10 % FCS, 37 ℃, 10 % CO₂하)). 그 결과, 최종적으로 4 × 10⁶ 개의 각막 내피 세포를 회수할 수 있었다.

다음으로, 이들 모든 세포를 상기 배양 접시 표면에 PIPAAm 이 고정화된 세포 배양 지지체 재료 상에 파종하고, 4 주 동안 그대로 계속해서 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포 상에 직경 1.8 ㎝ 인 원 형상으로 잘라낸 직경 2.3 ㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어 배지를 조용히 흡인시키고, 세포 배양 지지체 재료마다 20 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이트하고 냉 각시킴으로써, 어느 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리되었다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5 % 이하인 1 장의 시트로서 충분한 강도를 가진 것이었다. 얻어진 세포 시트 내의 세포 밀도는 3000 개/㎟ 이었다.

또한, 상기 각 실시예에 있어서, 「저온 처리」는 20 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이트와 같은 조건 하에서 실시되었지만, 본 발명에 있어서 「저온 처리」는 이들 온도 및 시간에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 「저온 처리」로서 바람직한 온도 조건은 0 ℃ ∼ 30 ℃ 이고, 바람직한 처리 시간은 2 분 ∼ 1 시간이다.

실시예 1, 2 에서 얻어진 재생 각막 내피 세포 시트를 각막 내피 조직부를 결손시킨 백색 집토끼에게 이식하였다. 이 때, 재생 각막 내피 세포 시트의 지지체와 접촉하고 있던 반대측 면에서, 생체 내의 각막 내피 조직과 동등한 곡률의 흡인면을 가진 지그에 흡인, 고정시키고, 캐리어를 메스를 사용하여 절제하였다. 재생 각막 내피 세포 시트를 지그를 사용하여 창상부에 눌러 덮어 지그의 흡인을 멈추게 하고, 그대로 15 분 동안 부착시켰다. 이 때, 재생 각막 내피 세포 시트와 생체의 봉합은 실시하지 않았다. 마지막으로, 통상적인 방법에 따라, 절개한 각막 조직을 안구에 봉합하였다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 실시예 1, 2 모두 재생 각막 내피 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있으며, 각막의 팽윤도 관찰되지 않았다.

실시예 3

실시예 1 의 세포 배양 지지체 재료에 대해, 계속해서 이것 위에 N,N-메틸렌 비스아크릴아미드 (1 중량%/아크릴아미드 모노머) 를 포함하는 아크릴아미드 모노머를 5 중량% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.1 ㎖ 도포하고, 직경 1.8 ㎝ 인 금속제 마스크를 올리고, 그대로의 상태에서 0.25 MGy 강도의 전자선을 조사하여, 금속 마스크를 올린 부분 이외의 곳에 아크릴아미드 폴리머 (PAAm) 를 고정화시켰다. 조사 후, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하여, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합되지 않은 PAAm 을 제거하고, 클린 벤치 내에서 건조시키고, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균함으로써 세포 배양 지지체 재료를 얻었다.

다음으로, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해, 백색 집토끼의 각막 주변부로부터 깊은 마취 하에서 각막 내피 조직을 채취하고, 4 계대 배양함으로써, 최종적으로 7.6 × 10⁵ 개의 각막 내피 세포를 회수할 수 있었다. 다음으로, 이들 모든 세포를 상기 세포 배양 지지체 재료 상에 파종하고, 3 주 동안 그대로 계속해서 배양하였다. 배양 후, 실시예 1 과 마찬가지로 배양된 세포 상에 직경 1.8 ㎝ 인 원 형상으로 잘라낸 직경 2.3 ㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막으로부터 성형한 캐리어를 덮어 배지를 조용히 흡인시키고, 세포 배양 지지체 재료마다 20 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이트하고 냉각시킴으로써, 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 덮은 캐리어와 함께 박리되었다. 얻어진 세포 시트는 수축률 5 % 이하인 1 장의 시트로서 충분한 강도를 가진 것이었다. 얻어진 세포 시트 내의 세포 밀도는 2800 개/㎟ 이었다.

얻어진 재생 각막 내피 세포 시트를 실시예 1 과 마찬가지로, 각막 내피 조 직부를 결손시킨 백색 집토끼에게 이식하였다. 3 주간 후, 환부를 관찰한 결과, 재생 각막 내피 세포 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있으며, 각막의 팽윤도 관찰되지 않았다.

비교예 1

실시예 2 에서 각막 내피 세포 시트를 제조하고, 캐리어를 사용하지 않고 세포 시트를 박리시키고, 수축시키는 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게 각막 내피 세포 시트를 제조하였다. 이 때의 수축률은 42 % 이었다.

실시예 2 와 동일하게 얻어진 각막 내피 세포 시트를 각막 내피 조직부를 결손시킨 토끼에게 이식하였다. 이식 1 일 후에 환부를 관찰한 결과, 각막 내피 세포 시트의 안구에 대한 생착성은 약간 나빠지고, 각막의 팽윤도 관찰되었다.

비교예 2

실시예 3 에서 각막 내피 세포를 배양하고, 세포 배양 지지체로부터 박리하기까지의 기간을 9 일 후로 한 것 이외에는, 실시예 3 과 동일하게 재생 각막 내피 세포 시트를 제조하는 것을 시도하였다. 실시예 3 과 동일하게 재생 각막 내피 세포 시트의 박리를 시도했지만, 부분적으로밖에 박리할 수 없어, 세포 시트로서 불충분한 것이었다.

실시예 4

실시예 3 의 직경 1.8 ㎝ 인 금속제 마스크를 올려 얻어진 세포 배양 지지체 재료에 대해, 실시예 3 과 동일한 방법으로 인간 각막 주변부로부터 채취한 각막 내피 세포를 실시예 3 과 동일하게 상기 세포 배양 지지체 재료 상에 파종하고, 4 주 동안 그대로 계속해서 배양하였다. 배양 후, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 캐리어를 사용하면서 세포 배양 지지체 재료마다 20 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이트하고 냉각시킴으로써, 세포 배양 지지체 재료 상의 내피 세포 시트를 박리시켰다. 얻어진 내피 세포 시트는 수축률 5 % 이하인 1 장의 시트로서 충분한 강도를 가진 것이었다. 얻어진 내피 세포 시트 내의 세포 밀도는 3000 개/㎟ 이었다. 얻어진 내피 세포 시트로부터 캐리어를 제거한 것을 도 1 에 나타낸다. 배양 지지체 재료 내에 인간 재생 각막 내피 세포 시트가 부유하고 있다는 것을 알 수 있다.

배양 중의 인간 재생 각막 내피 세포 시트를 배양 1 일 후 (A), 3 일 후 (B), 7 일 후 (C), 14 일 후 (D) 에 각각 꺼내어 생성되는 콜라겐 Ⅳ (상측 도면) 및 피브로넥틴 (하측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 도 2 에 나타낸다. 배양일수가 늘어남에 따라 콜라겐 Ⅳ 및 피브로넥틴이 축적되어 있다는 것을 알 수 있다.

배양 4 일 후에 재생 각막 내피 세포 시트에 존재하는 ZO-1 단백질을 면역 형광 염색하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 이 단백질이 세포-세포간에 국재하고 있다는 것을 알 수 있으며, 이 결과로부터, 본 발명으로부터 얻어진 재생 각막 내피 세포 시트는 세포-세포간 결합이 형성되어 있으며, 그 형성이 박리 후에도 파괴되지 않고 남아 있다는 것을 알 수 있다.

다음으로, 배양 지지체 재료 내로부터 인간 재생 각막 내피 세포 시트를 박리시켰다. 박리 도중의 인간 재생 각막 내피 세포 시트에 존재하는 콜라겐 Ⅳ (좌측 도면) 및 피브로넥틴 (우측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 도 4 에 나타낸다. 이 도면으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 얻어진 재생 각막 내피 세포 시트는 콜라겐 Ⅳ 및 피브로넥틴을 갖는 것이었다.

도 5 에 박리 후의 인간 재생 각막 내피 세포 시트를 H/E 염색한 결과 (좌측 도면), 세포 시트에 존재하는 콜라겐 Ⅳ (중앙도) 및 피브로넥틴 (우측 도면) 을 통상적인 방법에 따라 염색한 결과를 나타낸다. H/E 염색 사진으로부터, 본 발명에서 얻어진 인간 재생 각막 내피 세포 시트는 생체 내에서의 통상적인 상태와 동일하게 단층이고, 콜라겐 Ⅳ 는 내피 세포 시트가 지지체와 접촉하고 있던 쪽에 국재하고 있으며, 피브로넥틴은 세포-세포간에 국재하고 있다는 것을 알 수 있다.

또한, 동일하게 준비한 재생 각막 세포 시트를 2 % 글루타르알데히드로 고정시키고, 그 후 오스늄산 염색한 것을 투과형 전자 현미경으로 관찰한 결과를 도 6 에 나타낸다. 도면으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 얻어진 재생 각막 세포 시트는 생체 내의 조직과 동일한 조직으로 되어 있었다.

실시예 5

실시예 1 에서 얻어진 세포 배양 지지체 재료에 대해, 실시예 3 과 동일한 방법으로 인간 각막 주변부로부터 채취한 각막 내피 세포를 실시예 3 과 동일하게 상기 세포 배양 지지체 재료 상에 파종하고, 4 주 동안 그대로 계속해서 배양하였다. 배양 후, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 캐리어를 사용하지 않고, 세포 배양 지지체 재료마다 20 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이트하고 냉각시킴으로써, 세포 배양 지지체 재료 상의 내피 세포 시트를 박리시켰다. 얻어진 내피 세포 시트 표층에 존재하는 단백질 및 세포-세포간 결합에 관여하는 ZO-1 단백질 등을 통상적인 방법에 따라 추출하고, SDS-PAGE 법으로 확인하였다. 결과를 도 7 중의 T 에 나타낸다. 이 때, 상측 도면의 A 는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 세포 시트 표층에 존재하는 단백질을 측정하고, 또 하측 도면의 B 는 항인간 ZO-1 폴리클로날 항체를 사용하여 염색하였다. 도 7 로부터 본 방법 발명의 방법에 따르면, 세포 표층의 단백질이 파괴되지 않고 남아 있다는 것을 알 수 있다.

비교예 3. 4

실시예 5 의 실험에 있어서, 인간 각막 내피 세포의 배양을 온도 응답성 폴리머가 피복되지 않은 시판되는 배양 기재 상에서 배양하는 것 이외에는, 동일한 조작으로 4 주 동안 계속해서 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포를 박리하기 위해, 하나의 방법으로서 통상적인 방법인 디스파제 처리를 실시하여 박리시키고 (비교예 3), 다른 한편으로는 고무제 스크레이퍼로 물리적으로 박리시키는 방법 (비교예 4) 을 실시하였다. 각각의 방법으로 얻어진 세포를 실시예 5 와 동일하게 내피 세포 시트 표층에 존재하는 단백질 및 세포-세포간 결합에 관여하는 ZO-1 단백질 등을 통상적인 방법에 따라 추출하고, SDS-PAGE 법으로 확인하였다. 결과를 각각 도 7 중의 D (비교예 3), 도 7 중의 S (비교예 4) 에 나타낸다. 도 7 로부터 디스파제 처리법에서는 세포 표층의 단백질이 파괴되어 잔존량이 적어져 있다는 것을 알 수 있다. 또, 스크레이퍼법에서는, 세포 표층의 단백질의 잔존량은 많지만, 물리적으로 박리시켰기 때문에 얻어진 각막 내피 세포 시트에는 절단된 곳이 많이 있어, 본 발명에서 나타내는 재생 각막 내피 세포 시트로는 불충분한 것 이었다. 또, 도 7 의 S 와 T 를 비교하여, 양자에 전혀 차이가 인정되지 않는다는 점에서, 본 발명인 실시예 5 로부터 얻어지는 재생 각막 내피 세포 시트의 표층 단백질은 거의 파괴되어 있지 않다는 것을 알 수 있다.

실시예 6

실시예 3 에서 얻어진 박리 전의 재생 각막 내피 시트, 및 냉각하여 박리시킨 후, 다시 시판 중인 3.5 ㎝φ 세포 배양용 배양 접시 (FALCON 3001) 상에 부착시킨 재생 각막 내피 시트를 사용하여, 박리 전후의 1 세포당 펌프수를 산출하였다. 구체적으로는, Na-K ATPase 저해제인 우아바인을 사용하여, 1 분자의 우아바인이 1 분자의 Na-K 펌프에 결합되는 것으로 생각하고, 우아바인의 총 결합량을 측정함으로써 구하였다. 이 때, 우아바인은 ³H 라벨화된 것을 사용하고, 액체 신틸레이션 카운터에 의해 측정하였다. 세포 시트에 대한 우아바인의 총 결합량 및 세포 시트의 세포 밀도로부터 실시예 3 에 있어서의 박리 전후의 1 세포당 펌프수를 산출한 결과, 박리 전의 펌프수가 3.5 × 10⁶ 개, 박리 후의 펌프수는 3.5 × 10⁶ 개이었다. 본 발명의 세포 배양 지지체를 사용하면, 박리시의 세포의 손상은 관찰되지 않았다.

실시예 7

실시예 3 의 직경 1.8 ㎝ 인 금속제 마스크를 올려 얻어진 세포 배양 지지체 재료에 대해, 실시예 3 과 동일한 방법으로 인간 각막 주변부로부터 채취한 각막 내피 세포를 실시예 3 과 동일하게 상기 세포 배양 지지체 재료 상에 파종하고, 4 주 동안 그대로 계속해서 배양하였다. 이 박리 전의 인간 재생 각막 내피 시트에 대해, 항토끼 Na-K ATPase 모노클로날 항체를 사용하여 염색시키고, Na-K ATPase 펌프 사이트부를 녹색으로 염색시켰다. 이 때, 프로피디움 아이오다이드로 세포핵을 적색으로 염색시켰다. 공초점 현미경을 사용하여 얻어진 결과를 도 8 에 나타낸다. 이 때, 상측 도면의 A 는 배양 세포 시트의 상면으로부터 관찰한 결과를 나타내고, B 는 두께 방향을 관찰한 결과이다. 도면에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 재생 각막 내피 세포 시트에는 Na-K ATPase 펌프 사이트부가 고밀도로 남겨져 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 8

사용하는 세포를 인간 각막 내피 세포로 하고, 세포 시트 내의 세포 밀도가 575 개/㎟ ∼ 3070 개/㎟ 가 될 때까지 배양하는 것 이외에는, 실시예 6 과 동일한 방법으로 배양 조작을 실시하고, 실시예 6 과 동일하게 ³H 라벨화 우아바인 결합량을 액체 신틸레이션 카운터로 측정함으로써 Na-K ATPase 펌프 사이트수를 측정하였다. Na-K ATPase 펌프 사이트수 및 세포 시트의 세포 밀도로부터, 박리시킨 재생 각막 내피 세포 시트의 1 세포당 펌프수를 산출하였다. 얻어진 결과를 도 9 에 나타낸다. 도면 중의 A 는 세포 밀도에 대한 1 세포당 펌프수의 상관성을 나타내고, 도면 중의 B 는 세포 밀도에 대한 단위 면적당 펌프수의 상관성을 나타낸다. 도면의 A 로부터 세포 밀도가 증가하면 1 세포당 펌프수가 감소하고, 도면의 B 로부터 세포 밀도가 증가하면 단위 면적당 펌프수가 증가한다는 것을 알 수 있었다. 세포 밀도를 2500 개/㎟ 로 함으로써, 본 발명의 펌프 사이트수에 도달하는 것이 분명해졌다.

비교예 5

시판되는 3.5 ㎝φ 세포 배양용 배양 접시 (FALCON 3001) 에 대해, 실시예 3 과 동일한 방법으로, 이것 위에 N,N-메틸렌비스아크릴아미드 (1 중량%/아크릴아미드 모노머) 를 포함하는 아크릴아미드 모노머를 5 중량% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.1 ㎖ 도포하고, 직경 1.8 ㎝ 인 금속제 마스크를 올리고, 그대로의 상태에서 0.25 MGy 강도의 전자선을 조사하여, 금속 마스크를 올린 부분 이외의 곳에 아크릴아미드 폴리머 (PAAm) 를 고정화시켰다. 조사 후, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하여, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합되지 않은 PAAm 을 제거하고, 클린 벤치 내에서 건조시키고, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균함으로써, 실시예 3 의 세포 배양 지지체에서 PIPAAm 피복부가 없는 배양용 지지체를 얻었다.

이 배양용 지지체를 사용하고, 실시예 4 와 동일하게 박리 전의 재생 각막 내피 시트, 및 콜라겐 분해효소를 처리하여 박리시킨 후, 다시 시판되는 3.5 ㎝φ 세포 배양용 배양 접시 (FALCON 3001) 상에 부착시킨 재생 각막 내피 시트를 사용하여, 박리 전후의 1 세포당 펌프수를 산출하였다. 박리 전후의 1 세포당 펌프수를 산출한 결과, 박리 전의 펌프수가 3.5× 10⁶ 개, 박리 후의 펌프수는 1.5 × 10⁶ 개이었다. 박리시에 이루어지는 세포의 손상이 현저하였다.

본 발명에서 얻어지는 재생 각막 내피 세포 시트는 생체 조직에 대한 생착성이 매우 높고, 고기능이며, 예컨대, 각막 내피 질환 치료 등의 임상 응용이 강력하게 기대된다. 따라서, 본 발명은 세포 공학, 의용 공학 등의 의학, 생물학 등의 분야에 있어서의 매우 유용한 발명이다.

Claims

캐리어에 밀착시킨 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항에 있어서, 단백질 분해 효소에 의한 처리를 실시하지 않고 지지체로부터 박리되고, 박리 후의 세포 시트의 수축률이 20 % 이하로 유지된 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 기저막형 단백질이 80 % 이상 잔존되어 있는 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 데스모솜 구조가 80 % 이상 잔존되어 있는 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 내의 세포 밀도가 2500 개/㎟ 이상인 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 내의 펌프 사이트수가 3.4 × 10⁹ 개/㎟ 이상인 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 각막 내피 조직의 일부 또는 전부가 손상 또는 결손된 환부를 치료하기 위한 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 박리하는 시기가 세포가 지지체 표면에서 컨플루언트가 된 날로부터 10 일째 이후인 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 재생 각막 내피 세포 시트를 환부에 대해 봉합하지 않고 피복하는 것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 환부에 피복할 때, 환부의 크기, 형상을 따라 절단된 재생 각막 내피 세포 시트.
조직으로부터 채취한 각막 내피 세포를 0 ∼ 80 ℃ 의 온도 범위 내에서 수화력이 변화하는 폴리머를 표면에 피복한 세포 배양 지지체 상에서 배양하고, 배양 후,

(1) 배양액 온도를 기재 표면의 폴리머가 수화되는 온도로 하고,

(2) 배양된 각막 내피 세포 시트를 캐리어에 밀착시키고,

(3) 캐리어와 함께 그대로 박리하는

것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 조직으로부터 채취한 각막 내피 세포를 미리 복수회 계대 배양함으로써 총 세포수를 증가시키고, 지지체 표면에 대해 최종적으로 파종 세포 농도가 2000 개/㎟ 이상이 되도록 하여 고밀도로 배양하는 것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 계대 배양이 콜라겐 Ⅳ 상에서 실시되는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)인 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어의 형상이 중심부를 잘라낸 링 형상인 것을 특징으로 하는 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 박리가 단백질 분해 효소에 의한 처리로 실시되고 있지 않은 재생 각막 내피 세포 시트의 제조 방법.
각막 내피 조직의 일부 또는 전부가 손상 또는 결손된 환부에 대해, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 재생 각막 내피 세포 시트를 이식하는 것을 특징으로 하는 치료법.
제 17 항에 있어서, 이식이

(1) 재생 각막 내피 세포 시트를 캐리어와 함께 박리시키고,

(2) 세포 시트의 지지체와 접촉하고 있던 반대측 면에 대해, 생체 내의 각막 내피 조직 형태와 동등한 곡률을 가진 지그에 고정시키고,

(3) 환부에 지지체와 접촉하고 있던 동일한 면에서 재생 각막 내피 세포 시트를 피복하고, 그 후, 세포 시트를 고정하고 있던 지그 및 캐리어를 제거하는

것을 특징으로 하는 치료법.
제 17 항에 있어서, 이식이

(1) 재생 각막 내피 세포 시트를 캐리어와 함께 박리시키고,

(2) 세포 시트의 지지체와 접촉하고 있던 반대측 면에 대해, 생체 내의 각막 내피 조직 형태와 동등한 곡률을 가진 지그에 고정시켜 캐리어를 제거하고,

(3) 환부에 지지체와 접촉하고 있던 동일한 면에서 재생 각막 내피 세포 시트를 피복하고, 그 후, 세포 시트를 고정하고 있던 지그를 제거하는

것을 특징으로 하는 치료법.
제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 이식이 환부에 대해 봉합하지 않고 피복하는 것을 특징으로 하는 치료법.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 환부에 피복할 때, 재생 각막 내피 세포 시트를 환부의 크기, 형상을 따라 절단하는 것을 특징으로 하는 치료법.
제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료해야 할 질환이 각막 내피 장애, 수포성 각막증인 것을 특징으로 하는 치료법.