CN105727365A - 心脏创可贴及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心脏创可贴，心脏创口贴为在PDMS薄膜表面种植形成的心肌细胞片。并公开了上述心脏创口贴的制备方法。本发明专利涉及的体外生物材料技术，可以使干细胞分化的心肌细胞在7天的时间内进行自我排列，以达到完成心肌细胞体外排列的目的。使得原本杂乱无章，没有固定方向性的心肌细胞在体外被重新排列为类似天然人类心脏的高度规则形状，并增加心脏收缩力，改善心肌细胞电活动的传导。本发明为体外研究个体疾病模型、个体化药物治疗筛查以及生物医学工程提供了可能。

Description

心脏创可贴及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种将人类心肌细胞在体外重新排列成类似于人类心脏表型的规则排列结构及其制备方法。
背景技术
心脏是人类体内至关重要的器官，维持着人类生存的最基本循环需求。心脏细胞与神经细胞相同，均为稳定的终末细胞，即成年后便失去再生能力。任何原因导致的心脏细胞缺血、坏死(如心肌梗死)都会造成不可逆转的心肌细胞丢失。心肌细胞一旦丢失、损失，心脏的收缩功能会受到不可逆转的损伤，常会导致心力衰竭。人类多能干细胞包括人类胚胎干细胞以及人类诱导多能干细胞，具有无限自身增殖并分化为各个胚胎层体细胞的潜能，其中包含分化为中胚层的心肌细胞。但是体外分化诱导的心肌细胞，结构排列不规则，细胞形态、大小、方向各异，与人体内心脏细胞的正常结构截然不同。正常人体内的心肌细胞排列规整，同一区域内细胞方向一致，该特性被称之为心脏的异向性(Anisotropy)，该特性是保证心肌正常生理特性。例如：心肌细胞呈现同一方向排列，在心脏收缩之时，呈现最大幅度的单一方向收缩力，以保证正常心脏的泵血功能；再例如：心脏细胞的异向性保证了电活动传导的区域差异性，以适应心脏正常电活动需求，减少心律失常发生的可能性。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外心肌细胞的重新排列技术，为体外研究个体疾病模型、个体化药物治疗筛查以及生物医学工程提供了可能。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种心脏创可贴，所述心脏创口贴为在PDMS薄膜表面种植形成的心肌细胞片。
一种心脏创口贴的制备方法，包括以下步骤：
(1)对PDMS薄膜进行等离子体处理，使薄膜表面形成微皱纹；
(2)对形成微褶皱的PDMS薄膜进行生物处理
(3)在处理后的PDMS薄膜表面种植心肌细胞；
(4)进行心肌细胞培育在PDMS薄膜表面形成心脏创可贴。
所述步骤1中对PDMS薄膜进行等离子体处理步骤采用对PDMS薄膜进行1～20min的等离子体照射，之后放置在150℃温度下处理3～5min。
所述步骤1中PDMS薄膜表面形成微皱纹的主波长在2.5～4.0μm。
所述步骤2的生物处理包括以下步骤：
(1)将PDMS薄膜在体积浓度为70％的酒精溶液中浸泡15min；
(2)取出后用无菌PBS溶液冲洗3次；
(3)用生物凝胶物质对PDMS薄膜进行表面处理，之后保存在4℃的无菌PBS溶液中。
所述生物凝胶物质为Matrigel或Gelatin，处理时间为30min。
所述步骤3中心肌细胞的种植按照250,000细胞/cm2进行均匀种植，种植后将载有心肌细胞的PDMS薄膜置于容器中，储存于37℃恒温培养箱中。
所述种植的心肌细胞采用多能干细胞分化的心肌细胞，并进行浓缩处理，将心肌细胞浓缩为100,000细胞/mL的浓度以上。
所述心肌细胞的培育包括以下步骤：在种植好心肌细胞的第2天，移去心肌细胞培养液，并置换新的心肌细胞培养液；之后每3天更换一次细胞培养液，直至种植后第7天。
本发明专利涉及一种体外心肌细胞的重新排列技术，该生物材料是基于PDMS薄膜产生的，对PDMS薄膜进行等离子体照射，通过一定时间的等离子体照射，使PDMS膜自我缩水形成微皱纹(Micro-wrinkle)，通过对微皱纹的PDMS薄膜进行生物材料处理之后，将体外分化好的人类多功能干细胞诱导分化的心肌细胞进行一定密度的种植，通过7天的时间以形成类似人类心脏的规则排列结构，对散在的单个心肌细胞进行体外的生物医学工程再改造，以制成二维结构的心脏创可贴。
本发明专利涉及的体外生物材料技术，可以使干细胞分化的心肌细胞在7天的时间内进行自我排列，以达到完成心肌细胞体外排列的目的。使得原本杂乱无章，没有固定方向性的心肌细胞在体外被重新排列为类似天然人类心脏的高度规则形状，并增加心脏收缩力，改善心肌细胞电活动的传导。本发明为体外研究个体疾病模型、个体化药物治疗筛查以及生物医学工程提供了可能。
附图说明
图1是实施例PDMS薄膜的等离子体处理以及微褶皱表型形成的示意图。
图2是实施例PDMS薄膜在不同等离子体照射时间下形成的微褶皱主波长。
图3是实施例中种植获得的心肌细胞片。
图4是人类心脏活检组织体外染色参考图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
心脏创口贴为在PDMS薄膜表面种植形成的心肌细胞片，其制备方法如下：
1、对PDMS薄膜进行等离子体处理，使薄膜表面形成微皱纹
(1)对PDMS薄膜进行不同时长的等离子体(Plasma)照射，即引起PDMS薄膜的自我缩水，形成表面纳米、微米级的微皱纹，在停止等离子体照射后，微皱纹逐渐定形(见图1)；
(2)图2显示对PDMS薄膜进行不同时间的(2、5、10、15分钟)的等离子体照射后，使之在150度高温环境中自我皱缩3.5分钟后，形成的微褶皱主波长分别为2.5微米、3.1微米、3.0微米以及4.0微米。
2、对形成微褶皱的PDMS薄膜进行生物材料处理
(1)对已经进行等离子体处理的PDMS薄膜进行体积浓度为70％的酒精浸泡15分钟；
(2)移去酒精后，用无菌PBS冲洗3次；
(3)用生物凝胶物质(如Matrigel，Gelatin等)对PDMS薄膜表面进行处理，通常采用室温30分钟后，移去凝胶物质，放于无菌PBS中4度保存，保存时间最长为1周。
3、人类心肌细胞的种植：将心肌细胞按照250,000细胞/厘米2进行均匀种植，种植后小心将载有心肌细胞的PDMS薄膜置于容器中，储存于37度恒温培养箱中。用于种植的心肌细胞采用多能干细胞分化的心肌细胞，并进行浓缩处理，将心肌细胞浓缩为100,000细胞/mL的浓度以上。
4、为期7天的维护
(1)于种植好心肌细胞的第2天，小心移去心肌细胞培养液，并置换新的心肌细胞培养液；
(2)之后每3天更换一次细胞培养液，直至种植后第7天
(3)7天后心肌细胞即变成配列规整的心肌细胞片，此时，细胞之间已经完整形成细胞连接，成为一个二维的整体，即心肌创可贴。图3可见心肌细胞置于等离子体处理过5分钟的PDMS薄膜7天后，形成排列规整，类似于人类心脏细胞的排列表性。结果显示排列后的心肌细胞，已经形成了排列规整的类似人类的规整二维细胞片，即心脏创可贴。
图4是人类心脏活检组织体外染色参考图。此图为患有心脏病人的心肌活检组织体外染色，该心肌排列呈现出高度单向性，规律、整齐；图3中通过生物工程技术制成的心脏创可贴组织表型与图4中的人类本身心肌组织表现出了高度的相似性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式的限制。凡是依据本发明的技术和方法实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术和方法方案的范围内。

Claims (9)

1.一种心脏创可贴，其特征在于：所述心脏创口贴为在PDMS薄膜表面种植形成的心肌细胞片。
2.一种根据权利要求1所述心脏创口贴的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对PDMS薄膜进行等离子体处理，使薄膜表面形成微皱纹；
(2)对形成微褶皱的PDMS薄膜进行生物处理
(3)在处理后的PDMS薄膜表面种植心肌细胞；
(4)进行心肌细胞培育在PDMS薄膜表面形成心脏创可贴。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中对PDMS薄膜进行等离子体处理步骤采用对PDMS薄膜进行1～20min的等离子体照射，之后放置在150℃温度下处理3～5min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中PDMS薄膜表面形成微皱纹的主波长在2.5～4.0μm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2的生物处理包括以下步骤：
(1)将PDMS薄膜在体积浓度为70％的酒精溶液中浸泡15min；
(2)取出后用无菌PBS溶液冲洗3次；
(3)用生物凝胶物质对PDMS薄膜进行表面处理，之后保存在4℃的无菌PBS溶液中。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述生物凝胶物质为Matrigel或Gelatin，处理时间为30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3中心肌细胞的种植按照250,000细胞/cm2进行均匀种植，种植后将载有心肌细胞的PDMS薄膜置于容器中，储存于37℃恒温培养箱中。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述种植的心肌细胞采用多能干细胞分化的心肌细胞，并进行浓缩处理，将心肌细胞浓缩为100,000细胞/mL的浓度以上。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述心肌细胞的培育包括以下步骤：在种植好心肌细胞的第2天，移去心肌细胞培养液，并置换新的心肌细胞培养液；之后每3天更换一次细胞培养液，直至种植后第7天。
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