CN111621468A - 一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生命科学及医疗技术领域，尤其涉及培养规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法及应用。本发明所提供的制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，具体步骤包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤。本发明的有益效果是，结合生物工程中的缩印技术以及生物化学技术，培养和人体心肌细胞相似的、成熟的、规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并且制造成本低、产量高，培养时间短。本发明能保持所需要的细胞形态，移植到所需的环境中进行深入实验和研究。
Description
技术领域
本发明涉及生命科学及医疗技术领域，尤其涉及利用生物工程的缩印技术（micropatterning）制备诱导长杆型多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法。
背景技术
多能干细胞是近年来由日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）教授于2006年研发出，是目前最接近人体本身的实验模型。多能干细胞具有和细胞源头一样的基因库，在正确的实验环境下可以最大限度的体现遗传疾病或基因缺陷表型。多能干细胞通过诱导培育手法可以分化出单层人源心肌细胞，进而研究病理或对有表型的遗传性心肌病进行药筛。
目前市面上所培育的诱导多能干细胞源性心肌细胞大致分为两种，一种为平面（2D culture）培养细胞，另一种为三维类器官培养（3D culture）。其中，成熟多能干细胞源性心肌细胞为最接近人体的长杆型的心肌细胞形态。现有技术中所培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞（induced Pluripotent Stem Cell derived Cardiomyocytes），缺乏有效培养规则形状的成熟多能干细胞源性心肌细胞的方法。目前已知的手法所培养出的多能干细胞源性心肌细胞多为单层，形状不规则的多能干细胞源性心肌细胞。即使有极少数实验室及单位能够将二维细胞以三维的培养手法形成规则的成熟多能干细胞源性心肌细胞，但是其制造成本高，产量低，且所需时间远高于直接培养二维多能干细胞源性心肌细胞。发明人发现，即使能培育出成熟的多能干细胞源性心肌细胞，也存在难以在保持多能干细胞源性心肌细胞形态的前提下，将所培养的多能干细胞源性心肌细胞移植到各个不同的平台进行不同的实验。
同时，在无法以长杆型多能干细胞源性心肌细胞为模型在不同的实验环境中进行实验的情况下，我们无法有效的在实验中获取最接近人类心脏生理功能的数据。
由此可以看出，在现有的培养诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法中，无论是二维培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞，还是三维培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞，都存在的难以解决的问题是，无法将细胞培养至成熟，达到与人体心肌细胞相似的规则形态，并且制造成本高，产量低，且所需时间长。
发明内容
为解决现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，以及其固定方法及应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：
（1）所述的缩印制备步骤，包括
S01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;
S02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;
S03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及
S04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；
（2)所述的多能干细胞制备步骤，包括
S1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；
S2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；
S3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，
由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。
进一步地，所述的所需要的细胞形态为长杆型。
进一步地，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液为1:5至1:20的PDMS原液兑凝固液；
优选的，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液优选为1:10的PDMS原液兑凝固液。
进一步地，所述的细胞培养基质胶由基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成的。
进一步地，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质，层粘连蛋白，明胶或纤连蛋白；
优选的，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质。
进一步地，所述的含氨基酸及葡萄糖的培养基优选为DMEM培养基。
更进一步地，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~400；
优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~100；
更优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~10。
最优选的，所述基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:10。
进一步地，在所述细胞培养盘表面刻印1.0乘以7.0微米的长方形。
更进一步地，上述的制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，还包括固定步骤和提取步骤，其中，所述固定步骤包括将上述方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟；所述的提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化诱导多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的细胞培养基质胶后，提取诱导多能干细胞源性心肌细胞。
本发明还提供了一种涨缩细胞的固定方法，将所述涨缩细胞在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟；
优选的，所述涨缩细胞为心肌细胞或骨肌细胞。
进一步地，所述涨缩细胞为上述任一项制备方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞。
进一步地，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟为含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂；
优选的，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟优选为含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂。
更进一步地，所述的固定方法还包括提取步骤，所述的提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化所固定的细胞表面粘黏的细胞培养基质胶后，提取所述固定的细胞。
此外，本发明还提供了上述任一项制备方法或上述任一项固定方法的应用，用于将所述诱导多能干细胞源性心肌细胞移植到不同的环境进行培养，包括并不限于继续进行单细胞或多细胞培养和实验。
本发明的有益效果是，结合生物工程中的缩印技术以及生物化学技术，成功培养出和人体心肌细胞相似的、成熟的、规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并且制造成本低、产量高，培养时间短。本发明所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，成熟率高，具规则的长杆形状，拥有清晰且有规律的线条型肌小节分布。使用本发明所培育出的成熟或长杆型多能干细胞源性心肌细胞，能有效减少在实验中所需的细胞数量，并且能够成功获取成熟单细胞的相关数据。
本发明提供的技术方案能够成功固定所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并在保持所需要的细胞形态的情况下成功转移至不同的培养皿中，进行新的实验或在新的环境中培养。为研究结构性蛋白突变所导致的疾病提供实验模型，有效的在实验中获取最接近人类心脏生理功能的数据。
综上所述，本发明不仅仅解决了无法将多能干细胞源性心肌细胞细胞培养至成熟的规则形状，达到与人体心肌细胞相似的形态，并且制造成本高、产量低，培养时间过长的缺点，还提供了更接近人体心肌细胞的长杆型实验模型。此外，本发明解决了无法将规则形状的多能干细胞源性心肌细胞在保持所需要的形态的情况下移植到所需的环境中的难题。成功解决了过去无法使用成熟的多能干细胞源性心肌细胞进行深入实验和研究的难题，从而提供了利用成熟的长杆型多能干细胞源性心肌细胞进行的新的实验和培养的可能性。
下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的上述和其他的目的、特征和优点将显而易见。
附图说明
图1为本发明一实施例培养的长杆型多能干细胞源性心肌细胞；
图2为本发明一实施例培养的单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞钙瞬变；
图3为本发明一实施例培养的长杆型多能干细胞源性心肌细胞流式分选图；
图4为本发明一实施例中扩张性心肌病长杆型多能干细胞源性心肌细胞大小测量图；
图5为本发明一实施例中健康长杆型多能干细胞源性心肌细胞大小测量图，与图4对照；
图6为本发明一实施例中对比健康与疾病长杆型多能干细胞源性心肌细胞在不同硬度微环境中的大小测量；
图7为本发明一实施例所培养的单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞染色图，绿色为心肌小节或称cTnT（Cardio Troponin），蓝色为细胞核染色或称DAP；
图8为本发明一实施例所培养的多个长杆型多能干细胞源性心肌细胞染色图，绿色为心肌小节或称cTnT（Cardio Troponin），蓝色为细胞核染色或称DAP；
图9为现有技术二维即2D培养多能干细胞源性心肌细胞染色图，绿色为心肌小节或称cTnT（Cardio Troponin），蓝色为细胞核染色或称DAP。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是由于说明不是限制本发明。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，具体包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：（1）缩印制备步骤，包括S01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;S02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;S03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及S04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；（2)多能干细胞制备步骤，包括S1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；S2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；S3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。值得注意的是，本实例多能干细胞制备步骤中所使用的养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞，可以采用任何现有技术存在的培养方式或未发表的培养方式进行培养，所选取的养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞要满足质量好，足以在整个培养过程中存活即可。
发明人发现，现有的培养诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，无法将细胞培养至成熟的规则形状，达到与人体心肌细胞相似的形态，并且制造成本高、产量低，培养时间过长。经过发明人大量的实验和研究，发现了一种培养成本低、产量高，培养时间短的高效培养规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法。
本实施例的技术方案，结合了生物工程中的缩印技术以及生物化学技术，先将所需要的细胞形态如长杆型心肌细胞形态，以镭射刻印在硅片上，再在硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷后，在表面覆盖细胞培养基质胶，以此为模板压印于细胞培养盘表面。然后利用生物化学技术，在已经具有所需形状的细胞培养盘上进行诱导多能干细胞源性心肌细胞培养至成熟，即培养至所需要的形态并恢复跳动。
通过本实施例的技术方案，成功培养出所需要的规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞，和人体心肌细胞相似的成熟或长杆型多能干细胞源性心肌细胞。应用本发明的技术方案，所制备诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟率高，具规则的、和人体心肌细胞相似的形状，拥有清晰且有规律的线条型肌小节分布，并且培养过程简单，培养成本低、产量高，培养时间短。使用本发明所培育出的成熟或长杆型多能干细胞源性心肌细胞，能够成功获取成熟单细胞的相关数据，并能有效减少在实验中所需的细胞数量。本实施例提供的技术方案，可使所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞更成熟，因此，可以有效提供研究任何结构性蛋白突变所导致的疾病的实验模型，如现今缺少合适实验模型的扩张性心肌病HCM（Hypertrophic Cardiomyopathy），从而有效的在实验中获取最接近人类心脏生理功能的数据。
作为优选的技术方案中，所需要的细胞形态为长杆型。
作为优选的技术方案中，在缩印制备步骤S02中，虽然不需要限制PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液的浓度，但发明人发现，在缩印制备步骤S02中，将PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液优选为1:5至1:20的PDMS原液兑凝固液，会取得更好的凝固效果。优选的，在缩印制备步骤S02中，PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液为1:10的PDMS原液兑凝固液。
作为优选的技术方案中，在缩印制备步骤S03中细胞培养基质胶由基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成的。值得注意的是，虽然该细胞基质胶可以采用本领域技术人员通用的任何细胞基质胶，但发明人发现，该基质胶优选为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质，及其他iPSC-CM ECM如：层粘连蛋白laminin，明胶gelatin或纤连蛋白fibronectin。该含氨基酸及葡萄糖的培养基优选为DMEM培养基。
为了取得更好的培养效果，作为优选的技术方案，在缩印制备步骤S03中，基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~400；优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~100；更优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~10。最优选的，所述基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:10。
作为优选的技术方案中，细胞培养盘表面刻印1.0乘以7.0微米的长方形。
作为优选的技术方案中，本发明的制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，完成缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤后，还包括固定步骤和提取步骤，其中，固定步骤包括将上述方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，在细胞灌注缓冲液中常温浸泡，本实例采用含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂作为细胞灌注缓冲液，常温浸泡三至五分钟；提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化诱导多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的细胞培养基质胶，本实例优选使用Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质作细胞培养基质胶，提取诱导多能干细胞源性心肌细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种涨缩细胞的固定方法，将涨缩细胞在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟。本发明的技术方案可以沿用于多数涨缩型细胞，如心肌细胞或骨肌细胞，并且实现单细胞高通量（384甚至1536）单细胞培养，从而研究或提取成熟收缩性细胞所产蛋白、细胞器或分泌物为实验或药物开发原料。成熟单心肌细胞也可为细胞移植或术后修复提供更好的原料及选择，此原料更可以来源于病人自身而避免免疫反应。
作为优选的技术方案中，BDM或2,3-丁二酮单肟为含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂；优选的，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟优选为含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂。
根据本发明一种典型的实施方式，还提供了一种上述制备方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞固定方法。在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟。优选的，BDM或2,3-丁二酮单肟为含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂；优选的，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟优选为含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂。
作为优选的技术方案中，本实施例的固定方法还可以包括提取步骤，具体是使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化所固定的细胞表面粘黏的细胞培养基质胶后，提取所述固定的细胞。
发明人发现，由于缺乏有效的固定多能干细胞源性心肌细胞的技术，现有技术中缺乏可以在实验室中进行实验和研究使用的高质量的多能干细胞源性心肌细胞。如果能够在保持多能干细胞源性心肌细胞形态的前提下，将所培养的多能干细胞源性心肌细胞移植到各个不同的平台或环境进行实验，就可以高效地提供为实验室进行实验和研究使用的高质量的多能干细胞源性心肌细胞。发明人经过多次研究和反复实验发现，通过使用细胞灌注缓冲液常温浸泡多能干细胞源性心肌细胞或其他涨缩细胞，如骨肌细胞或其他心肌细胞，可以很好的固定所需要的细胞形状。为了能有效固定培育出的成熟多能干细胞源性心肌细胞，良好地保持所制备的多能干细胞源性心肌细胞形态，本实施例通过使用含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂作细胞灌注缓冲液，常温浸泡三至五分钟，以固定所需要的细胞形状，并在固定形状的前提下，成功转移至不同的培养皿中，进行新的实验或在新的环境中培养。本发明的技术方案可以，但不限于，为研究结构性蛋白突变所导致的疾病提供实验模型。因为本发明能够有效提供规则形状的成熟多能干细胞源性心肌细胞为实验模型，并在不同的实验环境中进行实验，从而能够有效地通过实验室实验和研究获取最接近人类心脏生理功能的数据。
根据本发明一种典型的实施方式，本发明还提供了上述各制备方法或上述各固定方法的应用，用于将诱导多能干细胞源性心肌细胞移植到不同的环境进行培养，包括并不限于继续进行单细胞或多细胞培养和实验。应用本发明提供的技术方案，可将固定大小的成熟或长杆型心肌细胞移植至不同软硬度的培养环境，进而研究细胞肥厚（Hypertrophy），见图4和图5。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例一
1. 长杆型多能干细胞源性心肌细胞制备及固定
I、长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备
（1）缩印制备
取直径为10cm的硅片作为细胞培养盘，将所需要的长杆型的细胞形态以镭射刻在硅片上，在硅片表面其表面覆盖一层PDMS（Polydimethylsiloxane）或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液，其中，按照PDMS或聚二甲基硅氧烷原液兑凝固液1:10配比。将铺好PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅板放置于真空环境下两小时，去除气泡后，将覆盖了PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅片放置于65摄氏度的恒温箱过夜至完全凝固。将凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷取下，在取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖一层Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质和DMEM（氨基酸及葡萄糖）培养基组成的细胞培养基质胶，其中，Matrigel比DMEM为浓度1:10，再以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板将其压印于细胞培养盘表面，在直径为10cm的细胞培养盘上刻印三十二万个1.0乘以7.0微米的长方形后。静置十分钟，再将PDMS或聚二甲基硅氧烷取下。
（2）多能干细胞源性心肌细胞制备
在准备好带有长杆型基质胶的培养皿后，将培养至二十日的诱导多能干细胞源性心肌细胞提取后，重新种植于步骤（1）所得表面刻印长方形细胞培养盘中，培养五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。在此过程中，多能干细胞源性心肌细胞会自动的长成长杆型的形态。
II、固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
在细胞长成长杆型并且恢复跳动后，将步骤I长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备步骤（2）所得的长杆型多能干细胞源性心肌细胞在室温中浸泡于含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，移出含有BDM2,3-丁二酮单肟的试剂。
III、固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化吸收长杆型多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质后，提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞。
按照上述的方法和步骤所提取的长杆型多能干细胞源性心肌细胞将用于单长杆型多能干细胞源性心肌细胞电生理实验、心肌细胞大小测量及染色实验。
2. 单长杆型多能干细胞源性心肌细胞电生理实验
电生理实验为测量心肌细胞功能的国际标准。电生理实验能有效的测量心肌细胞在涨缩过程中的钙瞬变，进行细胞层面的人体心电图测量。
将按照上述1所述的方法和步骤所制备和固定提取的长杆型多能干细胞源性心肌细胞于离心机中使用1200RPM，也就是1200转速每分钟，离心五分钟，去除上清液（细胞培养液重悬细胞）后，将该细胞种植于符合电生理测量仪的培养皿，以Fura-2（细胞内钙离子特异性荧光指示剂）染色后，进行电刺激测量细胞钙瞬变。
图1为本实施例培养的长杆型多能干细胞源性心肌细胞，图2为培养的单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞钙瞬变。由图1和图2可以看出，本实例所培养的长杆型多能干细胞源性心肌细胞的形状整齐、规则，细胞成熟率高，具有与人体心肌细胞相似的形态，并且拥有清晰且有规律的线条型肌小节分布。本实施例制备的单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞可用于钙瞬变，其中，图2展示了单细胞涨缩速度与力学，可以具体测量单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞的形态及特征。
3. 多能干细胞源性心肌细胞细胞筛选
将按照上述1所述的方法和步骤所制备和固定提取的长杆型多能干细胞源性心肌细胞于离心机中使用1200RPM，也就是1200转速每分钟，离心五分钟，去除上清液（细胞培养液重悬细胞）后，将该细胞种植于符合电生理测量仪的培养皿，以Fura-2（细胞内钙离子特异性荧光指示剂）染色后，进行流式分选。由使用了含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液常温浸泡。附图3为本实施例培养的长杆型多能干细胞源性心肌细胞流式分选图。如图3所示，本实施例所提取的多能干细胞源性心肌细胞能够保持规则的细胞形态，且降低通过悬浮收缩而死亡的细胞，从而能够在流式筛选的过程中更高效并准确的筛选出相对成熟，体积较大的细胞。
4. 多能干细胞源性心肌细胞细胞大小测量
将按照上述1所述的方法和步骤所提取的长杆型多能干细胞源性心肌细胞，在室温中浸泡于含有0.1%BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，换回正常培养液或是在加入BDM或2,3-丁二酮单肟的培养液中进行显微镜下拍摄。
图4为本实施例中扩张性心肌病长杆型多能干细胞源性心肌细胞大小测量图。图4拍摄的照片是疾病长杆型多能干细胞源性心肌细胞在放松即未收缩的情况下的所显现的扩张表现后测量的细胞大小（起始大小与图5中的健康细胞相似）。图5为本实施例中健康长杆型多能干细胞源性心肌细胞大小测量图，与图4相对照。图5拍摄的照片是长杆型多能干细胞源性心肌细胞在收缩的情况下的细胞大小。图6为本实施例中对比健康与疾病长杆型多能干细胞源性心肌细胞在不同硬度微环境中的大小测量，是以本实施例所培养的长杆型心肌细胞为起始大小的健康细胞，对比扩张性心肌病HCM疾病长杆型心肌细胞的大小测量。进一步的，可以准确的测量长杆型多能干细胞源性心肌细胞的细胞张缩力、张缩速度、张缩功率等参数。
5. 多能干细胞源性心肌细胞染色实验
将按照上述1所述的方法和步骤所提取的长杆型多能干细胞源性心肌细胞，用4%PFA或多聚甲醛在室温中浸泡十分钟。十分钟后移除4%PFA或多聚甲醛进行免疫荧光染色。先用0.01%PBST或磷酸盐吐温缓冲液清洗两次，每次五分钟。将20%胚胎牛血清，0.3%聚乙二醇辛基苯基醚加入PBS或磷酸缓冲盐溶液混合过滤成封闭液后，室温浸泡一小时。在室温环境下将细胞浸泡在加入一抗的封闭液中两个小时。本实施例中使用1:1000的cTnT心肌肌钙蛋白抗体做为一抗。去除一抗后，用封闭液清洗细胞三次，每次五分钟。将细胞在室温中浸泡于加入了二抗的封闭液一小时。本实施例使用1:500的488抗小鼠免疫体做为二抗。然后使用PBST或磷酸盐吐温缓冲液清洗细胞两次，每次15分钟。移除细胞表面的所有液体后加入DAPI也就是4’，6二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole）细胞核抗体（在紫外线下呈现蓝色），本实施例中使用浓度为1奈克每毫升浓度液的DAPI也就是4’，6二脒基-2-苯基吲哚，浸泡五分钟后以PBST或磷酸盐吐温缓冲液清洗三次，每次五分钟。加上封闭液后在显微镜下进行免疫荧光拍摄。
图7为本实施例培养的单个长杆型多能干细胞源性心肌细胞染色图，其中，绿色为心肌小节或称cTnT（Cardio Troponin），蓝色为细胞核染色或称DAP。图8为本发明实施例培养的多个长杆型多能干细胞源性心肌细胞染色图其中绿色为心肌小节或称cTnT（CardioTroponin），蓝色为细胞核染色或称DAP。由图7及8可以看出，本发明能够准确提供长杆型多能干细胞源性心肌细胞的单细胞实验细胞形态，也能提供长杆型多能干细胞源性心肌细胞的多细胞形态。由图7和图8 可见，本实施例的长杆型多能干细胞源性心肌细胞，形状规则，拥有清晰且有规律的线条型肌小节分布，与成熟人体心肌细胞的形态更相似，从而可模拟更成熟人体心肌细胞的形态，进而缩短药物开发及药筛过程中所需要的时间与成本。相比之下，图9为现有技术二维即2D培养多能干细胞源性心肌细胞染色图，其中，绿色为心肌小节或称cTnT（Cardio Troponin），蓝色为细胞核染色或称DAP。由图9可以看出，现有技术中的二维培养技术所培养的细胞无法分辨肌小节及具体细胞数量。
实施例二
长杆型诱导多能干细胞源性心肌细胞的制备
（1）缩印制备
取直径为10cm的硅片作为细胞培养盘，将所需要的长杆型的细胞形态以镭射刻在硅片上，在硅片表面其表面覆盖一层PDMS（Polydimethylsiloxane）或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液，其中，按照PDMS或聚二甲基硅氧烷原液兑凝固液1:5配比。将铺好PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅板放置于真空环境下两小时，去除气泡后，将覆盖了PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅片放置于65摄氏度的恒温箱过夜至完全凝固。将凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷取下，在取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖一层Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质和DMEM（氨基酸及葡萄糖）培养基组成的细胞培养基质胶，其中，Matrigel比DMEM为浓度1:100，再以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板将其压印于细胞培养盘表面，在直径为10cm的细胞培养盘上刻印三十二万个1.0乘以7.0微米的长方形后。静置九分钟，再将PDMS或聚二甲基硅氧烷取下。
（2）多能干细胞源性心肌细胞制备
在准备好带有长杆型基质胶的培养皿后，将培养至二十日的诱导多能干细胞源性心肌细胞提取后，重新种植于步骤（1）所得表面刻印长方形细胞培养盘中，培养五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。在此过程中，多能干细胞源性心肌细胞会自动的长成长杆型的形态。
（3）固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
在细胞长成长杆型并且恢复跳动后，将步骤（2）所得的长杆型多能干细胞源性心肌细胞在室温中浸泡于含有4%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，移出含有BDM2,3-丁二酮单肟的试剂。
（4）使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化吸收长杆型多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质后，提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞。
实施例三
长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备
（1）缩印制备
取直径为10cm的硅片作为细胞培养盘，将所需要的长杆型的细胞形态以镭射刻在硅片上，在硅片表面其表面覆盖一层PDMS（Polydimethylsiloxane）或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液，其中，按照PDMS或聚二甲基硅氧烷原液兑凝固液1:20配比。将铺好PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅板放置于真空环境下两小时，去除气泡后，将覆盖了PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅片放置于65摄氏度的恒温箱过夜至完全凝固。将凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷取下，在取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖一层Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质和DMEM（氨基酸及葡萄糖）培养基组成的细胞培养基质胶，其中，Matrigel比DMEM为浓度1:400，再以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板将其压印于细胞培养盘表面，在直径为10cm的细胞培养盘上刻印三十二万个1.0乘以7.0微米的长方形后。静置十分钟，再将PDMS或聚二甲基硅氧烷取下。
（2）多能干细胞源性心肌细胞制备
在准备好带有长杆型基质胶的培养皿后，将培养至二十日的诱导多能干细胞源性心肌细胞提取后，重新种植于步骤（1）所得表面刻印长方形细胞培养盘中，培养三日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。在此过程中，多能干细胞源性心肌细胞会自动的长成长杆型的形态。
（3）固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
在细胞长成长杆型并且恢复跳动后，将步骤（2）所得的长杆型多能干细胞源性心肌细胞在室温中浸泡于含有0.5%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，移出含有BDM2,3-丁二酮单肟的试剂。
（4）使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化吸收长杆型多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质后，提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞。
实施例四
长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备
（1）缩印制备
取直径为10cm的硅片作为细胞培养盘，将所需要的长杆型的细胞形态以镭射刻在硅片上，在硅片表面其表面覆盖一层PDMS（Polydimethylsiloxane）或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液，其中，按照PDMS或聚二甲基硅氧烷原液兑凝固液1:15配比。将铺好PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅板放置于真空环境下两小时，去除气泡后，将覆盖了PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅片放置于65摄氏度的恒温箱过夜至完全凝固。将凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷取下，在取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖一层Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质和DMEM（氨基酸及葡萄糖）培养基组成的细胞培养基质胶，其中，Matrigel比DMEM为浓度1:300，再以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板将其压印于细胞培养盘表面，在直径为10cm的细胞培养盘上刻印三十二万个1.0乘以7.0微米的长方形后。静置五分钟，再将PDMS或聚二甲基硅氧烷取下。
（2）多能干细胞源性心肌细胞制备
在准备好带有长杆型基质胶的培养皿后，将培养至二十日的诱导多能干细胞源性心肌细胞提取后，重新种植于步骤（1）所得表面刻印长方形细胞培养盘中，培养四日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。在此过程中，多能干细胞源性心肌细胞会自动的长成长杆型的形态。
（3）固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
在细胞长成长杆型并且恢复跳动后，将步骤（2）所得的长杆型多能干细胞源性心肌细胞在室温中浸泡于含有1%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，移出含有BDM2,3-丁二酮单肟的试剂。
（4）使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化吸收长杆型多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质后，提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞。
实施例五
长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备及固定
I、长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备
（1）缩印制备
取直径为10cm的硅片作为细胞培养盘，将所需要的长杆型的细胞形态以镭射刻在硅片上，在硅片表面其表面覆盖一层PDMS（Polydimethylsiloxane）或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液，其中，按照PDMS或聚二甲基硅氧烷原液兑凝固液1:12配比。将铺好PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅板放置于真空环境下两小时，去除气泡后，将覆盖了PDMS或聚二甲基硅氧烷的硅片放置于65摄氏度的恒温箱过夜至完全凝固。将凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷取下，在取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖一层Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质和DMEM（氨基酸及葡萄糖）培养基组成的细胞培养基质胶，其中，Matrigel比DMEM为浓度1:1，再以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板将其压印于细胞培养盘表面，在直径为10cm的细胞培养盘上刻印三十二万个1.0乘以7.0微米的长方形后。静置八分钟，再将PDMS或聚二甲基硅氧烷取下。
（2）多能干细胞源性心肌细胞制备
在准备好带有长杆型基质胶的培养皿后，将培养至二十日的诱导多能干细胞源性心肌细胞提取后，重新种植于步骤（1）所得表面刻印长方形细胞培养盘中，培养五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。在此过程中，多能干细胞源性心肌细胞会自动的长成长杆型的形态。
II、固定长杆型多能干细胞源性心肌细胞
在细胞长成长杆型并且恢复跳动后，将I长杆型多能干细胞源性心肌细胞的制备步骤（2）所得的长杆型多能干细胞源性心肌细胞在室温中浸泡于含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟（2,3-Butanedione Monoxime）试剂的细胞灌注缓冲液五分钟后，移出含有BDM2,3-丁二酮单肟的试剂。
III、提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞
使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化吸收长杆型多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质后，提取长杆型多能干细胞源性心肌细胞。
当然，本发明还可有其他实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (13)
1.一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，其特征在于，包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：
所述的缩印制备步骤，包括
S01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;
S02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;
S03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及
S04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；
（2)所述的多能干细胞制备步骤，包括
S1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；
S2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；
S3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，
由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所需要的细胞形态为长杆型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液为1:5至1:20的PDMS原液兑凝固液；
优选的，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液优选为1:10的PDMS原液兑凝固液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基质胶由基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质，层粘连蛋白，明胶或纤连蛋白；
优选的，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的含氨基酸及葡萄糖的培养基优选为DMEM培养基。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~400；
优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~100；
更优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~10；
最优选的，所述基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养盘表面刻印1.0乘以7.0微米的长方形。
9.一种涨缩细胞的固定方法，其特征在于，将所述涨缩细胞在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟；
优选的，所述涨缩细胞为心肌细胞或骨肌细胞。
10.根据权利要求9所述的固定方法，其特征在于，所述涨缩细胞为权利要求1至8任一项所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞。
11.根据权利要求9或10所述的固定方法，其特征在于，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟为含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂；
优选的，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟优选为含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂。
12.根据权利要求9或10所述的固定方法，其特征在于，还包括提取步骤，所述的提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化所固定的细胞表面粘黏的细胞培养基质胶后，提取所述固定的细胞。
13.如权利要求1-8任一项所述的制备方法或10-12任一项所述的固定方法的应用，用于将所述的诱导多能干细胞源性心肌细胞移植到不同的环境进行培养。
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