CN100393369C

CN100393369C - 明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及制备方法

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Publication number: CN100393369C
Application number: CNB2006100157111A
Authority: CN
Inventors: 郑俊萍; 庄宏; 王修行; 王传增; 姚康德
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2026-09-20
Also published as: CN1919351A

Abstract

本发明涉及一种组织工程支架材料，特别是明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及其制备方法。本发明的组织工程支架材料具有三维多孔的结构特征，孔径为80～200μm。其中各组份的质量配比为：明胶1，壳聚糖0.5～2，蒙脱土0.05～0.5。方法是采用插层反应制得明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液，在经过冷冻干燥处理即可。我们用明胶和壳聚糖这两种生物相容性好的天然高分子材料，利用蒙脱土(MMT)层状特点，制备插层复合材料。本发明具有良好的理化性能和生物学性能，是性能优良的组织工程支架材料。

Description

明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及制备方法

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，特别是涉及一种组织工程支架材料，特别是明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

组织工程是近二十年来在国际上出现的一个由多学科交叉的边缘学科。它的主要任务是研究对缺损或失去功能的组织、器官进行修复和重建，其中包括皮肤、骨骼、肝脏、血管等。在进入21世纪的今天，组织工程正以飞快的速度向产业化发展。用于组织工程支架的材料通常是可降解的，因为支架往往只能起到暂时性的作用，我们最终的目的希望它能通过降解被人体吸收或排泄掉。许多天然和人工合成高分子都可作为组织工程支架材料用。

明胶(Gelatin)和壳聚糖(Chitosan)等属于天然高分子材料，它们具有良好的生物降解性，并且它们的生物相容性好，对异体免疫性反应不是特别强烈，因而可以利用它们的这些优良的生物特性制备组织工程支架。但明胶脆性大，吸水性过强，强度低，弹性模量低，热力学稳定性较差，使之目前仍不能用作生物结构材料，如骨折内固定材料等。而壳聚糖是带正电的碱性多糖，可与多种带负电的生物大分子，包括明胶，形成聚电解质配合物(PEC)。将壳聚糖与明胶复合能发挥二者优势，弥补各自不足，是可行的材料改良方法。细胞种植在明胶和壳聚糖复合材料膜和支架上生长良好。但是其力学性能仍需进一步的提高。有研究者制备明胶-壳聚糖组织工程用材料，但其力学性能仍不太理想。

发明内容

加入蒙脱土(MMT)后可以改善支架材料的亲水性以及力学等性能，进一步提高组织工程支架的各项性能，以期应用于实际组织工程用支架材料中。

我们用明胶和壳聚糖这两种生物相容性好的天然高分子材料，利用蒙脱土(MMT)层状特点，制备插层复合材料。本发明具有良好的理化性能和生物学性能，是性能优良的组织工程支架材料。

本发明的组织工程支架材料为明胶、蒙脱土和壳聚糖组织工程支架材料，包括明胶、壳聚糖和蒙脱土，具有三维多孔的结构特征，孔径为80～200μm。该组织工程用支架材料的各组分质量配比为明胶1，壳聚糖0.5～2，蒙脱土0.05～0.5。

一种制备明胶、蒙脱土和壳聚糖新型组织工程生物材料的制备方法，包括以下过程：

1)将质量浓度为0.5～4.0％蒙脱土的水悬浮液经超声波处理后，倒入三口瓶中，在温度70～75℃下均匀搅拌，以1～3滴/s的速度滴加质量浓度为1.0～5.0％的明胶水溶液，再插层反应1.0～1.5h，得到溶液A。

2)把壳聚糖溶于乙酸溶液中，并快速搅拌，直至壳聚糖完全溶于乙酸中，配制得质量浓度为0.5～2.5％的壳聚糖乙酸溶液溶液B。这里所说的乙酸质量浓度为浓度1.0～5.0％乙酸水溶液。

3)取A和B溶液，溶液份数比为A∶B＝1～3.75∶1.6～3.4，在40～45℃下B溶液以1～3滴/s的速度滴加到A溶液中，再保持40～45℃温度下反应6～8h。反应终止后静置除去泡沫。以1～3滴/s的速度滴加5～20ml戊二醛溶液，戊二醛溶液的量与A溶液的份数比为0.16～0.67∶1，再交联30～60min，得明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液。

4)取明胶/蒙脱土-壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-60℃～-100℃冷冻24～48h，再冷冻干燥48～72h。

5)清洗除去支架中残余的戊二醛和酸，再干燥处理，裁成所需尺寸，消毒，包装备用。

在所述制备步骤5种清洗的方法是用质量浓度为1.0～5.0％的NaOH水溶液浸泡10～20min，用大量去离子水洗涤；然后放入质量浓度为2.0～5.0％的NaHB₄水溶液中，并用大量去离子水洗涤；将处理过的支架浸泡在盛有去离子水的洁净烧杯中。消毒的方法是用⁶⁰Co辐射消毒28～36h。

本发明的效果是：

由本发明得到的多孔组织支架材料可采用以下方式进行性能评价：

一、多孔支架材料的孔结构

本发明得到的多孔支架材料用扫描电子显微镜(SEM)观察孔的形态和孔分布如图1所示。得到的多孔组织工程支架的孔隙率大于90％，孔的大小分布在80～200μm之间，且孔的分布均匀，连通性好。

二、力学性能评价

本发明得到的多孔支架材料力学测试所用支架样品均切成宽约1cm×4cm的长方形样条，在M350-20KN型拉力机上进行拉伸测试，拉伸速度为5mm/min。

三、降解评价

将本发明制备的多孔支架切成1cm×1.5cm的矩形，将切好的支架真空干燥至恒重，取出称重，记录重量为M₀。将支架放入恒温水浴(37℃)控制的溶菌酶PBS缓冲溶液中。每隔3天取出一组样品，用去离子水反复冲洗，放入真空干燥器干燥至恒重(约24小时)。称重，记录重量为M_t。计算降解率如下：

降解率＝(M₀-M_t)/M₀×100％；每组每次取三个试样，计算降解率的平均值。

溶菌酶PBS缓冲溶液配制：取0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液360ml，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140ml，再加入NaCl 38g，最后用去离子水加至5000ml；把缓冲溶液用NaOH溶液标定至pH＝7.4，配制溶菌酶浓度为1mg/ml的缓冲溶液。

四、生物相容性的评价

通过检测第四代TC1鼠基质干细胞的增殖速度和细胞活性来评价材料的生物相容性，从图2可以看出，鼠基质干细胞牢固地粘附在Gel/MMT-CS支架孔壁上，呈长梭形，不断向支架内部生长，并分泌大量细胞外基质，生长7天后已经充满整个支架结构，覆盖了孔壁，形成细胞/支架复合物，与传统二维平面细胞培养不同，三维支架为细胞提供了更加充分的生长空间。图3为Gel/MMT-CS、Gel-CS膜上鼠基质干细胞增殖MTT曲线。数据说明了基质干细胞在Gel/MMT-CS及Gel-CS膜上不断增殖，与TCPs组具有相似的细胞活性，表现了良好的生物相容性。

与现有技术相比，本发明所采用的材料来源广泛，成本低廉。通过调节蒙脱土的比例来调节组织工程支架材料的力学性能和降解性能。采用冷冻干燥法可以调节冷冻温度来控制多孔支架的微结构，从而制备出有适合孔径和孔隙率的多孔组织工程支架材料。与细胞有很好的相容性，有利于细胞的生长。在组织工程中有很好的应用前景。

附图说明

图1：为本发明冷冻干燥制备的多孔组织工程支架材料的SEM照片；

图2：为鼠基质干细胞在Gel/MMT-CS支架内生长7天的细胞形；

图3：为Gel/MMT-CS支架上基质干细胞增殖MTT试验(n＝3，Gel-CS、TCPs为对照组)。

具体实施方式

实施例1

将质量浓度为0.5％蒙脱土水悬浮液经超声波处理后，取10ml倒入三口瓶中，在70℃均匀搅拌下，以1滴/s的速度滴加质量浓度为5.0％的明胶水溶液20ml，再插层反应1h，形成蒙脱土明胶溶液30ml；把壳聚糖溶于质量浓度为1.0％乙酸水溶液中，制得质量浓度0.5％的壳聚糖乙酸溶液。然后在40℃下，向蒙脱土明胶溶液中以1滴/s的速度滴加壳聚糖乙酸溶液50ml，再保持40℃反应6h。反应终止后静置除去泡沫。以1滴/s的速度滴加5ml戊二醛溶液，再交联反应30min，获得明胶、壳聚糖、蒙脱土的插层复合溶液。取明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-60℃冷冻48h，再冷冻干燥72h。得到明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架，各组分配比为明胶1，壳聚糖0.5，蒙脱土0.05；把支架浸泡在质量浓度为1.0％的氢氧化钠水溶液中10min，用大量去离子水洗涤清洗除去支架中残余的戊二醛和酸；然后放入质量浓度为2.0％的NaHB₄/水溶液中，并用大量去离子水洗涤。再干燥处理，裁成所需尺寸，用⁶⁰Co辐射消毒28h，包装备用。

得到的三维多孔组织工程支架用电子扫描显微镜(SEM)观察孔形态和孔分布。在在-60℃冷冻48h，再冷冻干燥72h的多孔组织工程支架的孔隙率大于90％，孔的大小分布在100～200μm，且孔的分布均匀，连通性好。用支架样品均切成宽约1cm×4cm的长方形样条，在M350-20KN型拉力机上以5mm/min拉伸速度进行拉伸测试，测试该支架材料的力学性能，拉伸强度可达310KPa。

实施例2

将质量浓度为4.0％蒙脱土的水悬浮液经超声波处理后，取12.5ml倒入三口瓶中，在75℃均匀搅拌下，3滴/s的速度滴加质量浓度为1.0％的明胶水溶液100ml，再插层反应1.5h，形成112.5ml蒙脱土明胶溶液；把壳聚糖溶于质量浓度为5.0％乙酸水溶液中，得到质量浓度2.5％的壳聚糖乙酸溶液。然后在45℃下，向蒙脱土明胶溶液中以3滴/s的速度滴加壳聚糖乙酸溶液80ml，再保持45℃反应8h。反应终止后静置除去泡沫。以3滴/s的速度滴加20ml戊二醛溶液，再交联反应60min，获得明胶、壳聚糖、蒙脱土的插层复合溶液。取明胶/蒙脱土-壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-100℃冷冻24h，再冷冻干燥48h。得到明胶/蒙脱土-壳聚糖多孔组织工程支架，各组分配比为明胶1，壳聚糖2，蒙脱土0.5；把支架浸泡在质量浓度为5.0％的NaOH水溶液中20min，用大量去离子水洗涤清洗除去支架中残余的戊二醛和酸；然后放入质量浓度为5.0％的NaHB₄水溶液中，并用大量去离子水洗涤。再干燥处理，裁成所需尺寸，用⁶⁰Co辐射消毒36h，包装备用。

得到的三维多孔组织工程支架用电子扫描显微镜(SEM)观察孔形态和孔分布。在-100℃冷冻24h，再冷冻干燥48h的多孔组织工程支架的孔隙率大于90％，孔的大小分布在80～150μm，且孔的分布均匀，连通性好。用支架样品均切成宽约1cm×4cm的长方形样条，在M350-20KN型拉力机上以5mm/min拉伸速度进行拉伸测试，测试该支架材料的力学性能，拉伸强度达438KPa。

实施例3

将质量浓度为2.0％蒙脱土的悬浮液经超声波处理后，取15ml倒入三口瓶中，在72℃均匀搅拌下，以2滴/s的速度滴加质量浓度为3.0％的明胶水溶液40ml，再插层反应70min，形成55ml蒙脱土明胶溶液；把壳聚糖溶于质量浓度为3.0％乙酸水溶液中，得到质量浓度1.5％的壳聚糖乙酸溶液。然后在43℃下，向蒙脱土明胶溶液中以2滴/s的速度滴加壳聚糖乙酸溶液80ml，再保持43℃反应7h。反应终止后静置除去泡沫。以2滴/s的速度滴加10ml戊二醛溶液，再交联反应45min，获得明胶、壳聚糖、蒙脱土的插层复合溶液。取明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-80℃冷冻36h，再冷冻干燥60h。得到明胶/蒙脱土-壳聚糖多孔组织工程支架，各组分配比为明胶1，壳聚糖1，蒙脱土0.25；把支架浸泡在质量浓度为3.0％的氢氧化钠水溶液中15min，用大量去离子水洗涤清洗除去支架中残余的戊二醛和酸；然后放入质量浓度为4.0％的NaHB₄水溶液中，并用大量去离子水洗涤。再干燥处理，裁成所需尺寸，用⁶⁰Co辐射消毒32h，包装备用。

得到的三维多孔组织工程支架用电子扫描显微镜(SEM)观察孔形态和孔分布。在-80℃冷冻36h，再冷冻干燥60h的多孔组织工程支架的孔隙率大于90％，孔的大小分布在100～180μm，且孔的分布均匀，连通性好。把多孔组织工程支架切成1cm×1.5cm的矩形，将切好的支架真空干燥至恒重，取出称重，记录重量为M₀。将支架放入恒温水浴(37℃)控制的溶菌酶PBS缓冲溶液中。每隔3天取出一组样品，用去离子水反复冲洗，放入真空干燥器干燥至恒重(约24小时)。称重，记录重量为M_t，计算降解率，从而确定该组织工程支架的降解性能。降解试验结果表明，该支架材料在浸泡21天后的降解率为54.3％。

实施例4

将质量浓度为1.0％蒙脱土的水悬浮液经超声波处理后，取25ml倒入三口瓶中，在75℃均匀搅拌下，3滴/s的速度滴加质量浓度为2.0％的明胶水溶液50ml，再插层反应1.5h，形成75ml蒙脱土明胶溶液；把壳聚糖溶于质量浓度为2.0％乙酸水溶液中，得到质量浓度1.5％的壳聚糖乙酸溶液。然后在40℃下，向蒙脱土明胶溶液中以3滴/s的速度滴加壳聚糖乙酸溶液80ml，再保持40℃反应8h。反应终止后静置除去泡沫。以3滴/s的速度滴加16ml戊二醛溶液，再交联反应60min，获得明胶、壳聚糖、蒙脱土的插层复合溶液。取明胶/蒙脱土-壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-80℃冷冻36h，再冷冻干燥60h。得到明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架，各组分配比为明胶1，壳聚糖1.2，蒙脱土0.25；把支架浸泡在质量浓度为2.5％的NaOH水溶液中15min，用大量去离子水洗涤清洗除去支架中残余的戊二醛和酸；然后放入质量浓度为2.0％的NaHB₄水溶液中，并用大量去离子水洗涤。再干燥处理，裁成所需尺寸，用⁶⁰Co辐射消毒30h，包装备用。

把制备的多孔组织工程支架切成1cm×1.5cm的矩形，将切好的支架真空干燥至恒重，取出称重，记录重量为M₀。将支架放入恒温水浴(37℃)控制的溶菌酶PBS缓冲溶液中。每隔3天取出一组样品，用去离子水反复冲洗，放入真空干燥器干燥至恒重(约24小时)。称重，记录重量为M_t，计算降解率，从而确定该组织工程支架的降解性能。降解试验结果表明，该支架材料在浸泡21天后的降解率为43.5％。

实施例5

将质量浓度为0.5％蒙脱土的水悬浮液经超声波处理后，取20ml倒入三口瓶中，在70℃均匀搅拌下，以2滴/s的速度滴加质量浓度为5.0％的明胶水溶液40ml，再插层反应1h，形成60ml蒙脱土明胶溶液；把壳聚糖溶于质量浓度为3.0％乙酸水溶液中，得到质量浓度0.5％的壳聚糖乙酸溶液。然后在40℃下，向蒙脱土明胶溶液中以1滴/s的速度滴加壳聚糖乙酸溶液100ml，再保持40℃反应6h。反应终止后静置除去泡沫。以2滴/s的速度滴加10ml戊二醛溶液，再交联反应40min，获得明胶、壳聚糖、蒙脱土的插层复合溶液。取明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-60℃冷冻48h，再冷冻干燥72h。得到明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架，各组分配比为明胶1，壳聚糖0.5，蒙脱土0.05；把支架浸泡在质量浓度为3.0％的NaOH水溶液中16min，用大量去离子水洗涤清洗除去支架中残余的戊二醛和酸；然后放入质量浓度为3.0％的NaHB₄水溶液中，并用大量去离子水洗涤。再干燥处理，裁成所需尺寸，用⁶⁰Co辐射消毒28h，包装备用。

选用第四代TC1鼠基质干细胞，用0.25％胰蛋白酶液(含1mmol/L EDTA)消化分离单层生长的细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为8×10⁴cells/ml(用于SEM细胞形态观察)和5×10⁴cells/ml(用于MTT测试)。将溶胀后的支架平铺在24孔培养板(TCPs)中，每孔加入细胞悬液1ml，在37℃、含5％CO₂、100％相对湿度的恒温培养箱中培养。将粘附细胞的支架样品，用PBS轻轻冲洗，置于4℃的5％戊二醛PBS溶液中，固定1h。梯度酒精上行脱水(30％，50％，70％，90％，100％)，每次20min，真空干燥后表面喷金进行SEM观察。通过观察发现鼠基质干细胞牢固地粘附在Gel/MMT-CS支架孔壁上，呈长梭形，不断向支架内部生长，并分泌大量细胞外基质，生长7天后已经充满整个支架结构，覆盖了孔壁，形成细胞/支架复合物，参见图2。证明Gel/MMT-CS支架是适合细胞生长的载体。

配制5mg/ml MTT溶液，于2，5，7，9天后进行细胞增殖测试。每孔加100μl MTT溶液，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育4小时后，每孔加入350μl DMSO，平板振荡器中剧烈振荡10min，使细胞内不溶结晶物甲臜充分溶解。每孔吸出100μl至96孔板，在492nm下用酶标仪测吸光度(OD)。MTT数据说明了基质干细胞在Gel/MMT-CS组织工程支架上不断增殖，有很好的细胞活性，表现出良好的生物相容性。参见图3。

本发明公开和提出的明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数等环节实现。本发明的方法与产品和方法已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料，其特征是：组织工程支架材料具有三维多孔的结构特征，孔径为80～200μm；组份的配比为：明胶1，壳聚糖0.5～2，蒙脱土0.05～0.5。

2.如权利要求1所述的明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料的制备方法，其特征是步骤如下：

1)将质量浓度为0.5～4％蒙脱土悬浮水溶液经超声波处理后，在70-75℃温度均匀搅拌下，以1-3滴/s的速度滴加质量浓度为1.0～5.0％的明胶水溶液，再插层反应1-1.5h，得到溶液A；

2)把壳聚糖溶于质量浓度为1.0～5.0％乙酸水溶液中，并快速搅拌，直至壳聚糖完全溶于乙酸中，配制得质量浓度为0.5～2.5％壳聚糖乙酸溶液B；

3)取A和B溶液，溶液份数比为A∶B＝1～3.75∶1.6～3.4，在40～45℃下B溶液以1～3滴/s的速度滴加到A溶液中，再保持40-45℃下反应6-8h，反应终止后静置除去泡沫；以1～3滴/s的速度滴加戊二醛溶液，戊二醛溶液的量与A溶液的份数比为0.16～0.67∶1，交联30-60min，得明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液；

4)将上述明胶、蒙脱土和壳聚糖插层复合溶液，倒入一次性培养皿中，在-60℃～-100℃冷冻20-48h，再冷冻干燥44-72h；

5)清洗除去支架中残余的戊二醛和酸，再干燥处理即可。

3.如权利要求2所述的明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料的制备方法，其特征是在所述制备步骤5中的清洗采用如下方法：用质量浓度为1.0～5.0％NaOH水溶液浸泡10～20min，用去离子水洗涤；然后放入质量浓度为2.0～5.0％NaHB₄水溶液中，再用去离子水洗涤；将处理过的支架浸泡在盛有去离子水的洁净容器中，再用⁶⁰Co辐射消毒28-36h。