CN109900533B - 一种植物根毛的原位观察方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物根毛的原位观察方法，包括使用聚醚砜膜覆盖于点播有种子的培养基块上，并制成装片的步骤。本发明提供的植物根毛的原位观察方法，简单可靠，可避免植物根毛细胞的变形或损伤以及因根毛细胞损伤造成的胞内自发荧光信号的干扰，实现根毛细胞的原位显微观察及成像，同时不影响种子萌发、根毛生长以及荧光信号强度，对根毛的细胞学研究起到了积极的促进作用。

Description

一种植物根毛的原位观察方法

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，具体涉及一种植物根毛的原位观察方法。

背景技术

根毛是陆生植物的重要器官，负责吸收水分和无机盐，并且参与植株地下部分在土壤中的固着。根毛的结构与功能研究是植物细胞生物学、植物生理学和发育生物学的研究热点。

目前，在对根毛进行显微观察或荧光观察分析实验时，基本都要将根毛从固体培养基中取出，制成装片，并使用盖玻片进行覆盖压平。在此过程中，将根毛从固体培养基中取出时极易对根毛造成伤害，同时，使用盖玻片制成装片再进行观察的方法，一会改变根毛的伸展形态，使根毛发生扭曲、弯折等异常，影响根毛在微观形态上的观察；二会导致根毛细胞缺氧脱水，加速细胞的死亡，在进行需要长时间观察活细胞的荧光观察分析实验中并不适用。

同时，在根毛细胞的荧光观察中，由于根毛细胞的细胞壁非常薄，在受到外界因素（如外力、pH值、光照强度等）影响后，细胞形态很容易发生改变，这些胁迫反应会使根毛细胞内部产生自发荧光，对细胞表型观察和胞内信号研究产生严重干扰。

因此，如何在植物根毛细胞的显微观察中，避免改变根毛的伸展形态造成的根毛扭曲、弯折等异常，进而避免因根毛细胞的形态损伤造成的胞内荧光信号干扰，使得植物根毛可以进行长时间的荧光观察分析，已成为目前未经研究或报道过的植物显微技术的新难题，而现有技术无法实现根毛细胞的原位显微观察及成像，也未能提供一种可以在不改变根毛正常生长状态的情况下，对根毛细胞进行明场和荧光的长时间原位显微精细观察的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种植物根毛的原位观察方法，包括使用聚醚砜膜(polyether sulphone, PES)覆盖于点播有种子的培养基块上，并制成装片的步骤。其中，聚醚砜膜选用透气防水型，可以在覆盖种子时提供种子萌发生长所需的氧气，同时保持水分，使种子可以较长时间的存活。

进一步地，聚醚砜膜的孔径为0.45-0.80微米，分子量分布系数M_w/M_n为2-3，透光率为80%-85%。

进一步地，上述方法还包括对使用前的聚醚砜膜裁剪和高温高压灭菌的步骤。优选的，聚醚砜膜的裁剪面积应以能够完全覆盖点播种子的培养基块为基准，薄膜裁剪后需独立包装后再灭菌。

更进一步地，上述方法还包括以下步骤：将所述装片放入无菌湿盒中竖直培养至萌发，置于显微镜下观察根毛细胞；其中培养至萌发的条件为温度(20±2)℃，相对湿度80%，光照条件16小时光照/8小时黑暗，光照强度为150 μmol·m^-2·s^-1。优选的，该步骤适用于对植物根毛细胞的普通显微观察。

更进一步地，上述方法还包括以下步骤：将所述装片放入避光的无菌湿盒中竖直培养至萌发，置于荧光显微镜下观察根毛细胞；其中培养至萌发的条件为温度(20±2)℃，相对湿度80%，光照条件为16小时光照/8小时黑暗，光照强度150 μmol·m^-2·s^-1。优选的，该步骤适用于对植物根毛细胞的荧光显微观察。

更进一步地，上述方法还包括在覆膜前对种子春化处理的步骤，具体包括：将种子点播在培养基上，于无菌环境下4℃春化，如此设置可以破除种子休眠，实现种子萌发的同步化。

进一步地，所述植物为拟南芥。

进一步地，上述方法具体包括如下步骤：

将灭菌的1/2 MS培养基均匀涂在载玻片表面，待培养基凝固后，用刀片在载玻片表面修整出一个2cm×1cm×0.3cm的固体培养基小块，将种子点播在培养基小块上，放入无菌的培养皿中，于4℃春化3天；将聚醚砜膜裁剪成4cm×2cm，高温高压灭菌后，覆盖在点播有种子的培养基块上，制成装片，放入无菌湿盒中竖直培养3-5天，即可直接置于显微镜下观察。

另一方面，本方法还提供了聚醚砜膜在植物原位观察制片中的应用，优选的，聚醚砜膜特别适用于拟南芥根毛的原位观察实验。

通过本发明提供的植物根毛的原位观察方法，能够带来如下有益效果：

1、本发明提供的植物根毛的原位观察方法，使用透气防水的聚醚砜膜覆盖点播有种子的培养基，制成装片后培养观察，简单可靠，无需将植物根毛从固体培养基中取出，也无需使用盖玻片，最大程度的避免植物根毛细胞的变形或损伤以及因根毛细胞损伤造成的胞内自发荧光信号的干扰，实现根毛细胞的原位显微观察及成像；

2、本发明提供的植物根毛的原位观察方法，无需杀死细胞，不影响根毛的正常生长，实验数据表明，使用聚醚砜膜覆盖连带培养基的种子，不影响种子萌发、根毛生长以及荧光信号强度，实现了在根毛正常生长状态下对根毛细胞的明场和荧光长时间精细动态观察及成像，对根毛的细胞学研究起到了积极的促进作用。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为分别覆盖聚醚砜膜和双拉伸聚丙烯(biaxially oriented polypropylene,BOPP)膜的拟南芥种子的根毛生长曲线；

图2为分别覆盖聚醚砜膜和双拉伸聚丙烯(BOPP)膜的拟南芥种子的转基因根毛表达绿色荧光蛋白信号的荧光观察图；

图3为分别覆盖聚醚砜膜和双拉伸聚丙烯(BOPP)膜的拟南芥种子的转基因根毛表达绿色荧光蛋白信号的荧光强度柱状图。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

在本说明书的实施例中，选用拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）种子（Columbia-0）进行培养和观察；聚醚砜膜由德国赛多利斯公司提供，微孔孔径为0.45微米，其余薄膜均通过商业途径购得；荧光观察实验使用日本Olympus公司提供的型号为FV1200的激光扫描共聚焦显微镜。

本发明提供了一种植物根毛的原位观察方法，包括使用透气防水的柔性薄膜覆盖于点播有种子的培养基块上，并制成装片的步骤。优选的，所述方法还包括对种子进行春化处理、对柔性薄膜进行裁剪灭菌以及对装片进行竖直培养后显微观察的步骤，具体操作如下：

S1，将刚灭好菌的1/2 MS培养基（1%蔗糖，1%琼脂）均匀涂在灭菌的载玻片表面，待培养基凝固后，用刀片在载玻片表面修整出一个2cm×1cm×0.3cm的固体培养基小块；

S2，将拟南芥种子点播在培养基小块上，放入无菌的培养皿中，于4℃春化3天；

S3，取春化后的种子连带培养基块置于载玻片上，将透气防水的柔性薄膜裁剪成4cm×2cm，高温高压灭菌后，覆盖在点播有种子的培养基块上，使柔性薄膜完全盖住载玻片上的培养基小块，放置在载玻片上制成装片；

S4，将装片放入无菌湿盒中竖直培养3-5天，即可直接置于显微镜下观察。

在一种实施方式中，当需要进行荧光观察时，将装片放入避光的无菌湿盒中竖直培养至萌发后，置于荧光显微镜下观察。

在一种实施方式中，拟南芥种子Columbia-0在点播前需要在超净工作台上依次用70%的乙醇和12%的次氯酸钠消毒；装片在无菌湿盒中竖直培养的条件为：温度(20±2)℃，光照条件16小时光照/8小时黑暗，光照强度为150 μmol·m^-2·s^-1，使种子萌发后幼根长在培养基表面。

如未特殊说明，以下实施例1-6均使用上述方法，区别仅在于所使用的透气防水的柔性薄膜材料不同。其中，各实施例均选取30粒拟南芥种子Columbia-0，分别制成装片后竖直培养3-5天，并以未覆膜的种子装片为空白对照，探究不同的柔性薄膜对拟南芥种子的萌发是否有影响，具体结果如表1所示。其中，种子萌发率(%)=(萌发的种子数量/30)×100%。

表1 不同柔性薄膜覆盖下的种子萌发率

示例	柔性薄膜	种子萌发率/%
			实施例1	混合纤维素膜	33
实施例2	聚四氟乙烯膜	27
			实施例3	聚乙烯膜	7
实施例4	聚酰胺-6膜	20
			实施例5	聚醚砜膜	67
实施例6	双向拉伸聚丙烯膜	73
			空白对照例	未覆膜	63

由表1可知，不同的柔性薄膜在拟南芥根毛细胞的原位观察中，对拟南芥种子的萌发存在较大影响。其中，相比于未覆膜的空白对照例，实施例1-4的种子萌发率较低，而实施例5与未覆膜的种子萌发率大致相同，实施例6的种子萌发率高于空白组，说明使用聚醚砜（PES）膜和双向拉伸聚丙烯(BOPP)膜并不影响拟南芥种子的萌发或有助于拟南芥种子的萌发。

其中，聚醚砜膜和双向拉伸聚丙烯膜对拟南芥种子萌发率的影响无显著差异，因此，以下将以实施例5和实施例6作为优选的实施例，探究制片所使用的覆膜对根毛的生长以及根毛细胞的荧光信号分析的影响。

通过对拟南芥种子萌发后6小时快速生长阶段内的根毛长度进行测量，并制成生长曲线的方法，探究聚醚砜膜和双向拉伸聚丙烯膜对拟南芥种子根毛生长状态影响，实验结果如图1所示。

由图1的根毛生长曲线可知，在种子萌发后6小时内，根毛长度呈现出快速增长的趋势，与拟南芥正常状态下的根毛生长规律相符合，说明使用聚醚砜膜和双向拉伸聚丙烯膜覆盖制成的装片并不影响根毛的生长状态。同时对比分别使用聚醚砜膜与双向拉伸聚丙烯膜覆盖的根毛生长曲线可知，两种膜覆盖下的根毛生长曲线没有差异，说明在两种膜覆盖下的根毛生长效果大致相同。

通过对转基因拟南芥根毛顶端表达的绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein, GFP)信号进行观察，并检测荧光信号的强度，探究覆有聚醚砜膜或双向拉伸聚丙烯膜的装片在荧光观察分析实验中，对荧光信号的采集是否有影响，实验结果如图2-3所示。

由图2中对拟南芥种子转基因根毛绿色荧光蛋白表达的荧光观察图可知，拟南芥根毛顶端表达的GFP信号最强，观察时清晰可见，而根毛除顶端外的其他部位细胞的荧光并不明显。由此说明，覆盖有聚醚砜膜或双向拉伸聚丙烯膜所制成的装片，在进行荧光观察分析时，并不影响对蛋白荧光信号的采集，还能够避免胞内自发荧光对蛋白荧光信号采集的干扰，适用于植物根毛部位细胞的荧光观察。

由图3中的荧光强度柱状图可知，使用聚醚砜膜和双向拉伸聚丙烯膜所采集到的GFP信号荧光强度无显著性差异。这表明聚醚砜膜与双向拉伸聚丙烯膜对光的透过性一致，在荧光的观察和信号采集方面不存在显著差别，均可以在荧光观察分析中使用。

采用常规方法对上述聚醚砜膜进行物理参数的测定，测得该聚醚砜膜的分子量分布系数M_w/M_n为2.4，透光率为83%，孔径为0.45微米，相比于双拉伸聚丙烯膜的防水透气性更适用，因此选择聚醚砜膜为本方法中的最优选的实施方式。在本发明中还选用了其他规格参数的聚醚砜膜，孔径为0.45-0.8微米，分子量分布系数M_w/M_n为2-3，透光率为80%-85%，实验结果没有明显差异，因此具体实验过程和结果不再赘述。

综上所述，在实施例选用的几种柔性薄膜中，聚醚砜膜和双向拉伸聚丙烯膜显示出了更好的观察效果。实验结果表明，使用聚醚砜膜或双向拉伸聚丙烯膜覆盖种子制成的装片，不抑制种子的萌发，不影响种子萌发后根毛的生长，也不影响荧光信号的观察和采集，对荧光信号没有干扰，适用于植物根毛细胞的显微观察，是在植物细胞原位观察中更优选的柔性薄膜。特别是聚醚砜膜，实验测得该膜的孔径和透光率适中，因此将聚醚砜膜作为本方法中的最优选的实施方式。

本发明提供的植物细胞的原位观察方法，在制装片时使用聚醚砜膜覆盖于点播有种子的培养基块，并直接培养至萌发后对根毛进行观察，无需将植物根毛从培养基中取出，实现植物根毛的原位观察，同时避免根毛在从培养基表面剥离或使用盖玻片造成的根毛细胞形态异常，并且可以进行需要长时间对活细胞监测拍照的荧光实验，大大减少了胞内自发荧光在观察时的干扰。

由此可得，本发明提供的方法可以实现在根毛正常生长状态下对根毛细胞的明场和荧光长时间精细动态观察及成像，对根毛的细胞学研究起到了积极的促进作用。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (4)

1.一种植物根毛的原位观察方法，其特征在于，所述方法包括使用聚醚砜膜覆盖于点播有种子的培养基块上，并制成装片的步骤，所述聚醚砜膜的孔径为0.45-0.80微米，分子量分布系数M_w/M_n为2-3，透光率为80％-85％；

所述方法具体包括如下步骤：将灭菌的1/2MS培养基均匀涂在载玻片表面，待培养基凝固后，用刀片在载玻片表面修整出一个2cm×1cm×0.3cm的固体培养基小块，将种子点播在培养基小块上，放入无菌的培养皿中，于4℃春化3天；将聚醚砜膜裁剪成4cm×2cm，高温高压灭菌后，覆盖在点播有种子的培养基块上，制成装片，放入无菌湿盒中竖直培养3-5天，即可直接置于显微镜下观察。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将所述装片放入无菌湿盒中竖直培养至萌发，置于显微镜下观察根毛细胞；所述培养至萌发的条件为温度(20±2)℃，相对湿度80％，光照条件为16小时光照/8小时黑暗，光照强度150μmol·m^-2·s^-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将所述装片放入避光的无菌湿盒中竖直培养至萌发，置于荧光显微镜下观察根毛细胞；所述培养至萌发的条件为温度(20±2)℃，相对湿度80％，光照条件为16小时光照/8小时黑暗，光照强度150μmol·m^-2·s^-1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。

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