CN103416306B - 诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法。在拟南芥培养基中添加浓度为0.1～10mM的过氧化氢，进行暗培养，黑暗培养温度为22～24℃，湿度70%～90%。拟南芥在黑暗中发芽，继续培养1～2个月后，诱导发育长出两片以上真叶。本发明中所使用的方法简单、有效，对光照不足地区的作物栽培具有重要的启示作用。

Description

诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法

技术领域

本发明属于作物栽培技术领域，具体涉及一种诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法。

背景技术

光照是植物生长发育所必需条件。光照一方面为植物的光合作用提供能量，另一方面作为信号分子，调控植物生长发育。植物种子发芽后，需要光照来完成继续发育，这一过程被称为“光形态建成”。在没有光照的黑暗条件下，即使提供了植物生长所必须的营养元素和糖等养分，发芽后其发育也将会暂停，该过程被称为“暗形态建成”。在该培养条件下的植物将会具有长长的下胚轴，顶端分生组织的发育分化暂停，不能生长出真叶等表型。在这种条件下，植物发芽后发育被暂停，直到有光照后才能继续进行。目前尚未能有一种简单有效的方法诱导植物在完全黑暗的条件下打破该发育障碍，生长出真叶，继续发芽后发育进程。

发明内容

本发明的目的是打破拟南芥在黑暗条件中萌发后的发育障碍，使发芽后幼苗在黑暗中继续完成后续的发育进程。

为实现本发明的目的，本发明诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法是在拟南芥培养基中添加浓度为0.1～10mM的过氧化氢，进行暗培养，拟南芥在黑暗中发芽，继续发育长出两片以上真叶。步骤如下：

1）拟南芥种子消毒：用消毒水对拟南芥种子进行消毒，消毒方法为：使用消毒水浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

所述的消毒水可以为50%市售消毒水（V/V），也可以为15%次氯酸钠溶液（V/V）。

2）播种：将消毒好的拟南芥种子点播在1/2MS培养基的培养皿上，点播密度为每个直径为10cm的培养皿上播种100～150颗为宜；

所述的培养基的成分为：2.2克/升MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂；培养基pH值使用摩尔浓度为1M的氢氧化钾溶液调节，pH值5.7；培养基消毒后添加最终摩尔浓度为0.1～10mM过氧化氢溶液。

3）暗培养：用石腊膜将培养皿封口，再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实，以不见光为宜；将培养皿移至4℃冰箱中放置2～4天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养，培养至拟南芥长出两片以上真叶。培养条件为：黑暗培养，温度22～24℃，湿度70%～90%，培养1～2个月。

所述的暗培养的过氧化氢的优选浓度是在拟南芥培养基中添加过氧化氢的摩尔浓度为1mM、2mM或5mM，进行暗培养，拟南芥在黑暗中发芽，继续发育长出两片以上真叶。

4）统计拟南芥发育情况：暗培养1～2个月后，取出培养皿，打开锡箔纸和石腊膜，观察统计拟南芥发育情况；

所述的观察统计拟南芥发育情况，是指统计长出两片以上真叶的苗数占总发芽苗数的比例。

本发明所使用的优选植物材料是拟南芥，上述技术方案对于任意生态型的野生型拟南芥均适用，包括Columbia，WS，Ler等，但并不局限于这些生态型。

本发明诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法，打破拟南芥在黑暗条件中萌发后的发育障碍，无需光照即可让拟南芥进行发芽后继续发育，使发芽后幼苗在黑暗中继续完成后续的发育进程。拟南芥在黑暗条件下，其顶端分生组织的细胞周期被打断，细胞分裂停止在G2/M检验点前。经过一定浓度的过氧化氢处理，打破了G2/M转化点障碍，使得细胞分裂能够继续进行，从而继续完成发育进程。本发明中所使用的方法简单、有效，对光照不足地区的作物栽培具有重要的启示作用。

附图说明

图1：拟南芥黑暗中继续发育。

图中：在5mM H₂O₂处理4周情况下，黑暗培养的拟南芥长出了真叶、茎等器官，植株体型明显增大，下胚轴短，表明拟南芥发芽后发育能继续进行。而不添加H₂O₂的对照处理的幼苗只有子叶，两子叶间的顶端分生组织并未发育出真叶等器官，植株体型较小，下胚轴较长，属于典型的暗形态建成表型。

H₂O₂：使用5mM H₂O₂对黑暗培养的拟南芥处理4周后的表型，拟南芥黑暗中继续发育出真叶等器官。

对照：在培养基中不添加H₂O₂，黑暗中培养4周后的表型。

图2：在H₂O₂诱导下拟南芥在黑暗中继续发育情况。

图中：使用1mM、5mM和对照对黑暗培养的拟南芥处理1周、2周、3周、4周、6周和10周后的表型。

对照：在培养基中不添加H₂O₂时拟南芥在各个时期的表型。

1mM：在培养基中添加浓度为1mM的H₂O₂时拟南芥在各个时期的表型。

5mM：在培养基中添加浓度为5mM的H₂O₂时拟南芥在各个时期的表型。

图3：顶端分生组织。

图中：扫描电镜拍摄的结果。图中显示：拟南芥在黑暗中培养10天，经过H₂O₂处理，顶端分生组织已经明显发育分化，并长出叶芽状器官。而黑暗培养10天未经H₂O₂处理的对照幼苗，其顶端分生组织扁平，显示其发育活动处于停止状态。该结果证明了H₂O₂能促进拟南芥顶端分生组织在黑暗培养下处于活动状态，从而诱导拟南芥发芽后继续发育。

对照：在培养基中不添加H₂O₂，黑暗中发芽后经过10天培养，在扫描电镜下可以看到其顶端分生组织扁平，未发育出叶芽等器官。

H₂O₂：培养基中添加5mM H₂O₂，黑暗中发芽后经过10天培养，在扫描电镜下可以看到其顶端分生组织已经发育出叶芽和叶状结构器官。

图4：H₂O₂处理对拟南芥茎尖顶端分生组织的影响。

图中：

A：典型的有丝分裂细胞周期示例，以及pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS和pCDKB1;1-GUS报告株系在细胞周期中所示的检验点。有丝分裂细胞周期分为4个时期M、G1、S、G2，CDKA1;1为pCDKA1;1-GUS所示的检验点，即G1/S和G2/M；CDKB1;1为pCDKB1;1-GUS所示的检验点，即G2/M；CYCB1;1为pCYCB1;1-GUS所示的检验点，即G2/M。

B：黑暗培养下的pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS和pCDKB1;1-GUS报告株系在H₂O₂处理或对照培养7天时的表达情况。图中可以清晰的看到pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS和pCDKB1;1-GUS这3个报告株系中的GUS基因在H₂O₂处理下均有表达，而在对照培养中仅有pCDKA1;1-GUS株系中能检测到GUS基因表达。该结果表明，黑暗培养的拟南芥顶端分生组织有丝分裂的细胞周期能通过G1/S检验点、但停滞在G2/M检验点前，H₂O₂处理能诱导细胞周期通过G2/M检验点，完成细胞分裂周期。

对照：培养基中不添加H₂O₂进行黑暗培养7天；

H₂O₂：培养基中添加5mM H₂O₂进行黑暗培养7天。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例使用5mM H₂O₂对黑暗中发芽的拟南芥进行处理4周，诱导其在黑暗中继续发育，生长出真叶等器官。具体实施方案如下：

1）培养平板的制备：采用的培养基的成分为：2.2克/升MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7。消毒后在培养基中添加最终浓度为5mM的H₂O₂并制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

2）对拟南芥col-0野生型型种子进行消毒，消毒方法：使用15%次氯酸钠溶液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

3）将消毒好的种子点播在步骤1）制备的培养平板上；

4）使用石腊膜将培养皿封口。再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实，以不见光为宜。将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养。培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80%；

5）培养4周后取出培养皿，打开锡箔纸和石腊膜，观察统计拟南芥发育情况。

如图1显示的是在5mM H₂O₂处理4周情况下，黑暗培养的拟南芥长出了真叶、茎等器官，植株体型明显增大，下胚轴短，表明拟南芥发芽后发育能继续进行。而不添加H₂O₂的对照处理对照处理的幼苗只有子叶，两子叶间的顶端分生组织并未发育出真叶等器官，植株体型较小，下胚轴较长，属于典型的暗形态建成表型。本实施例展示了一个最佳实施方式，实现了诱导拟南芥黑暗中继续发育这一目的，完成了发明。

实施例2：

本实施例使用不同浓度的H₂O₂对黑暗中发芽的拟南芥进行处理，以获得不同的诱导效果。具体实施方案如下：

1）培养平板的制备：采用的培养基的成分为：2.2克/升MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7。消毒后在培养基中添加最终浓度为0mM，1mM，2mM，5mM和10mM的H₂O₂并制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

2）对拟南芥col-0野生型型种子进行消毒，消毒方法：使用50%84消毒液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

3）将消毒好的种子点播在步骤1）制备的培养平板上；

4）使用石腊膜将培养皿封口。再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实，以不见光为宜。将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养。培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80%；

5）分别培养1周、2周、3周、4周、6周、10周后，取出培养皿，打开锡箔纸和石腊膜，观察统计拟南芥发育情况。

上述步骤5）中所述的观察统计拟南芥发育情况，是指统计长出两片以上真叶的苗数占总发芽苗数的比例。

表1统计了各浓度H₂O₂诱导拟南芥在黑暗中继续发育的效果，统计的百分比数据为长出两片以上真叶占总发芽苗数的比例。

表1不同浓度H₂O₂处理下的诱导效果

	对照	1mM	2mM	5mM	10mM
						1周	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%	未统计
2周	0.00%	3.41%	4.11%	36.17%	未统计
						3周	0.00%	6.25%	13.24%	58.25%	未统计
4周	0.56%	9.86%	25.49%	68.92%	未统计
						6周	1.87%	9.00%	28.77%	84.21%	未统计
10周	2.15%	68.67%	47.73%	86.57%	未统计

注：在培养基中添加10mM H₂O₂导致发芽率极低，该浓度所有数据均不能有效计算。

从表1可以看出，在培养基中添加一定浓度的H₂O₂后，从第二周开始，黑暗中培养的拟南芥能够被诱导继续发育，长出真叶。随着处理时间的延长，长出真叶的拟南芥比例明显增加。而没有添加H₂O₂的对照处理中，随着培养时间的延长，并不能有效诱导拟南芥在黑暗中继续发育。如图2中的照片显示了H₂O₂对拟南芥幼苗黑暗中发育的诱导情况。随着H₂O₂处理浓度的升高，诱导比例也明显增加，培养基中添加5mM H₂O₂达到最高的诱导效果。在5mM H₂O₂处理6周后，超过80%的拟南芥能够继续发育。但添加10mM H₂O₂则显著抑制拟南芥发芽率。

实施例3：

本实施例研究了培养基中N素种类和浓度对于H₂O₂诱导拟南芥黑暗中发育效果的影响。本实施例所采用的技术方案如下：

1）培养平板的制备：采用的培养基的成分为：2.2克/升无N素MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7。消毒后在培养基中分别添加最终浓度为0.1mM，1mM，10mM的硝酸钾或氯化铵，或者不添加任何氮素。H₂O₂诱导实验通过在培养基中添加最终浓度为5mM的H₂O₂，对照实验则不添加H₂O₂。制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

2）对拟南芥col-0野生型型种子进行消毒，消毒方法：使用50%84消毒液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

3）将消毒好的种子点播在步骤1）制备的培养平板上；

4）使用石腊膜将培养皿封口。再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实，以不见光为宜。将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养。培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80%；

5）培养4周后，取出培养皿，打开锡箔纸和石腊膜，观察统计拟南芥发育情况。打开锡箔纸后的培养皿在观察统计发育情况。统计结果如表2所示：

表2N素对H₂O₂诱导拟南芥黑暗中继续发育效果的影响

从表2中可以看出，在添加了5mM H₂O₂后，培养基中必须含有一定浓度的硝酸盐才能诱导拟南芥在黑暗中发芽，在培养基无N素或仅仅含有铵盐的情况下，拟南芥不能在黑暗中发芽。在诱导拟南芥黑暗中继续发育效果方面，硝酸盐浓度越高，诱导比例越高。本实施例中，在5mM H₂O₂的诱导下，培养基中含有10mM硝酸盐能最大比例的诱导拟南芥在黑暗中继续发育。

实施例4：

本实施例研究了H₂O₂对黑暗培养拟南芥的顶端分生组织和顶端分生组织的细胞周期的影响。本实施例采用的技术方案如下：

1）培养平板的制备。采用的培养基的成分为：2.2克/升MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7。消毒后在培养基中添加最终浓度为5mM的H₂O₂或不添加H₂O₂，并制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

2）对拟南芥col-0野生型、细胞周期报告株系pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS或pCDKB1;1-GUS种子进行消毒。消毒方法：使用50%84消毒液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

3）将消毒好的种子点播在步骤1）制备的培养平板上；

4）使用石腊膜将培养皿封口。再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实，以不见光为宜。将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养。培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80%；

5）细胞周期报告株系pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS或pCDKB1;1-GUS种子发芽1周后取出，经过80%冰冷丙酮固定2小时，PBS清洗3次后，进行GUS染色过夜。移去GUS染液，于OlympusSZX16体式显微镜下观察GUS染色情况并拍照记录；

6）Col-0种子培养10天后取出，2.5%戊二醛固定4小时，PBS清洗3次后乙醇梯度脱水，再经临界点干燥、包裹金粉。最后通过Hitachi4700扫描电子显微镜观察顶端分生组织并拍照记录。

如图3是扫描电镜拍摄的结果。图中显示：拟南芥在黑暗中培养10天，经过H₂O₂处理，顶端分生组织已经明显发育分化，并长出叶芽状器官。而黑暗培养10天未经H₂O₂处理的对照幼苗，其顶端分生组织扁平，显示其发育活动处于停止状态。该结果证明了H₂O₂能促进拟南芥顶端分生组织在黑暗培养下处于活动状态，从而诱导拟南芥发芽后继续发育。

本实施例中使用的3个细胞周期报告株系pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS和pCDKB1;1-GUS分别指示细胞周期中G1/S和G2/M检验点。如附图4A所示，典型的有丝分裂细胞周期可以分为M期、G1期、S期和G2期，在各个时期之间存在着检验点。pCDKA1;1-GUS指示G1/S和G2/M这两个检验点，而pCDKB1;1-GUS和pCYCB1;1-GUS指示G2/M检验点。报告株系中的GUS基因表达则提示细胞周期能顺利通过该检验点。如图4B表示的是这3个报告株系分别在H₂O₂处理和对照处理培养基上的GUS表达情况。图中，在H₂O₂处理下，pCYCB1;1-GUS、pCDKA1;1-GUS和pCDKB1;1-GUS均有GUS表达；而在对照中，仅pCDKA1;1-GUS有GUS表达，pCDKB1;1-GUS和pCYCB1;1-GUS则没有GUS表达。该结果表明，在黑暗培养中，细胞周期能够通过G1/S检验点，但停止在G2/M检验点，细胞分裂暂停。经过H₂O₂处理，细胞周期能顺利通过G2/M检验点，从而完成细胞分裂周期。因此，H₂O₂处理能够诱导、促进在黑暗中培养的拟南芥幼苗的顶端分生组织细胞的有丝分裂，从而激活顶端分生组织的活动，诱导植株继续发育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法，其特征在于在拟南芥培养基中添加过氧化氢和硝酸钾，进行暗培养，拟南芥在黑暗中发芽，继续发育长出两片以上真叶，所采取的具体步骤如下：

(1)培养平板的制备：采用的培养基的成分为：2.2克/升无N素MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7；消毒后在培养基中添加最终浓度为1mM或10mM的硝酸钾和摩尔浓度为5mM的过氧化氢，制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

(2)用消毒水对拟南芥种子进行消毒，消毒方法：使用消毒液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

(3)将消毒好的种子点播在制备好的培养平板上；

(4)使用石蜡膜将培养皿封口，再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实；将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养；培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80％；

(5)培养4周后，取出培养皿，打开锡箔纸和石蜡膜，观察统计拟南芥发育情况。

2.诱导拟南芥在黑暗中继续发育的方法，其特征在于在拟南芥培养基中添加过氧化氢，进行暗培养，拟南芥在黑暗中发芽，继续发育长出两片以上真叶，所采取的具体步骤如下：

(1)培养平板的制备：采用的培养基的成分为：2.2克/升MS培养基，30克/升蔗糖，0.5克/升MES盐，8克/升琼脂，pH值5.7；消毒后在培养基中添加最终浓度为1mM，2mM，5mM的H₂O₂并制备相应的培养平板，待培养基凝固后备用；

(2)对拟南芥种子进行消毒，消毒方法：使用消毒液浸泡种子10分钟，移去消毒水后，以无菌蒸馏水清洗5次；

(3)将消毒好的种子点播在制备好的培养平板上；

(4)使用石蜡膜将培养皿封口，再使用3层锡箔纸将培养皿包裹严实；将培养皿移至4℃冰箱中放置3天，再移至纸盒中，放入人工气候箱中进行培养；培养条件为：黑暗培养，温度22℃，相对湿度保持在80％；

(5)分别培养1周、2周、3周、4周、6周、10周后，取出培养皿，打开锡箔纸和石蜡膜，观察统计拟南芥发育情况。