CN111820118B - 一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用 - Google Patents

一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用，所述装置外部为透明圆柱体，容器顶部为透气膜封闭；容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基离顶部透气膜有一定的空间；所述透明凝胶培养基分为上下两层，采取了分层栽培方式，上层具有抑菌作用，选择了在保证抑菌效果下对根系生长影响小的浓度范围——体积百分浓度为0.005‑0.05％的PPM，使得整体培养基在染菌率得到抑制的同时，根系生长也不会受到影响，能让原位根系观测的清晰度得到显著提升，无论是动态实时观测还是收获植物后得到的相关功能性状都有理想的结果。

Description

一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的 应用
技术领域
本发明属于植物根系生态学，涉及一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用。
背景技术
根系因其在锚定植株，养分吸收等重要作用，近几年得到了广泛的关注。由于根系在野外环境地下生长的不透明性，原位根系观测有很大的困难。根系的原位观测包括利用X射线平面断层以及核磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)等穿透射线法，使用根箱或微根管的土壤中安置的观察法，磺酸类物质构成的透明土壤介质观测法，还有介质光学成像观测法等。前三类方式虽然精确度高，但所需仪器与材料较为昂贵从而成本较高，同时得到图像信息的速度较慢，不适用于大批量的植物根系观测。使用透明凝胶或是发芽纸作为栽培介质来原位观测植物根系，因为其成本相较于前几者更低，且采用数字成像技术，不仅可以多次获取图像信息而且耗时较少。介质光学成像法包括二维纸培法以及三维原位观测法等方式，二维纸培法因其对根系三维构型的限制，故所观测到的根系与真实状态下的根系有一定差距，所以三维原位观测法是比较优选的植物原位根系观测的方法。但是，由于现有透明凝胶技术较少考虑对成像清晰度的要求，而常规种子与外植体表面消毒步骤无法去除植物种子内部常含有的内生真菌，使得种植后培养基内部易出现染菌的状况，这对于我们在凝胶培养基中原位观测根系的清晰度有着很大的影响，而且由于凝胶易受污染，导致最终成功获取图像的成功率下降。
目前现有的植物栽培系统，二维纸培法与袋培法对于植物的三维构型有着严重的影响，更适用于草本植物初期根系形态的观测；磺酸类物质构成的透明土壤需要光学断层以及共聚焦技术，成本较为高昂；透明凝胶培养基由于对灭菌要求高，一旦出现操作不规范就容易使得培养基染菌从而影响根系的成像，而广谱抑菌剂的加入虽然对于染菌现象能有效的进行广谱性地抑制，但也会一定程度上影响根系的生长与发育甚至使其死亡。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种有效抑菌，且不会明显影响根系发育、并能让原位根系观测的清晰度得到显著提升、收获率得到显著提高的技术。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种透明原位三维植物栽培装置，所述装置包括透明容器、透气膜和培养基；所述透明容器为圆柱体，容器顶部为透气膜封闭；容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基离顶部透气膜有一定的空间；所述透明凝胶培养基分为上下两层，所述透明凝胶培养基分为上下两层，上层为含有体积百分浓度为0.005-0.05％广谱抗菌剂PPM的植物固体培养基1，下层为不含有广谱抗菌剂PPM的植物固体培养基2。
本发明透明植物栽培装置为无菌培养装置，其培养基分上下两层，上层具有浓度适量的广谱抗菌剂PPM(Plant Preservative Mixture,PPMTM,Plant Cell Technology,Washington DC,USA)，可防止培养时细菌污染，底层由于不含抑菌剂，可减少抑菌剂对根系发育的影响，使得观测结果与自然生长状态保持一致。同时上层添加的植物凝胶含量较低，适应于植物萌发初期所能承受的介质物理压力，从而更适合主根的前期生长，而下层植物凝胶含量更高，有助于维持根系苗期生长后半部分的构型维持，便于观测。其中分层培养基比例可以根据实际种植与根系观测需求进行调整，以满足不同物种的根系生长发育特征。
虽然初始下层培养基不含抑菌剂，但随着扩散作用，抑菌剂亦有可能渗透至下层中；另外，由于幼苗的开始培养在上层，且“地上”部分亦在上层，抑菌剂亦会对植株的整体有一定影响，从而可能影响根系发育。经大量试验研究，我们发现广谱抗菌剂PPM的体积百分浓度在0.005-0.05％范围内时能够有效抑制细菌而不会对根系生长造成明显影响。
容器制成圆柱体更便于后期观测与图像拍摄，成像效果更佳。
作为本发明的优选实施方式，所述上层植物固体培养基1含有1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.2-1.6‰植物凝胶和体积百分浓度为0.005-0.05％广谱抗菌剂PPM；所述下层植物固体培养基2含有1/2Hoagland营养液和质量百分浓度为1.6-2‰植物凝胶。
所述培养基经研究发现，能为植物根系生长提供更佳的营养条件和生长环境。
作为本发明的优选实施方式，所述Hoagland营养液为改良的Hoagland营养液。
作为本发明的优选实施方式，所述透明容器的高度为27.5cm，直径为12cm，所述透明容器内的透明凝胶培养基的上层高度为6-7cm，下层高度为10-11cm。
也可根据不同植物的生长特性、实验需求对容器高度、直径以及凝胶的高度进行调整，以满足不同植物的生长及实际实验的需求。
进一步地，本发明还提供了所述的栽培装置的制备方法，包括如下步骤：
(1)在培养基容器下层加入一定高度的下层植物固体培养基2，封口后进行液体高压灭菌；
(2)灭菌后将容器放置至常温并凝固，在下层植物固体培养基2上方加入灭菌过的上层植物固体培养基1溶液，封口后以同样的方式进行灭菌；
(3)灭菌后将容器放置至常温并凝固即得到所述栽培装置。
封口时，用透明透气封口膜与橡皮筋覆盖容器顶部开口并使用锡箔纸包裹住容器顶部。由于PPM抑菌剂是热稳定性的，所以高温灭菌不会对其抑菌效果有很大影响。
本发明还要求保护所述栽培装置在观测植物根系中的应用。
本发明还提供了所述的栽培装置用于观测植物根系的方法，包括如下步骤：
(1)对种子进行消毒和清洗；
(2)对步骤(1)中的种子进行催芽，得到幼苗；
(3)在所述装置的培养基表面放置一张高温灭菌过的中心十字开口的圆形锡箔纸；
(4)待步骤(2)的幼苗移入如步骤(3)所述的栽培装置中；
(5)继续培养步骤(4)中的幼苗，并观测其生长情况；
上述步骤皆在无菌条件下进行。
作为本发明的优选实施方式，步骤(3)中的圆形锡箔纸开口大小为1cm*1cm。
作为本发明的优选实施方式，步骤(1)的种子消毒方法为使用10％浓度双氧水浸泡20分钟，再用无菌纯水浸泡1小时，最后使用无菌纯水冲洗2-3遍。
可根据不同种子的特性更改消毒方式，注意消毒时间不能过长，消毒后要彻底清洗残留的消毒剂，避免影响种子发芽。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中的催芽的具体步骤为：将种子置于高温灭菌过的含有1/2Hoagland营养液+质量百分浓度为0.2％植物凝胶的培养皿中，30℃避光催芽。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(4)中进行幼苗移植时，所述幼苗的根系长0.75-1.25cm。
此时幼苗获得了足够继续发芽的养分，同时也不易因根长过长导致移苗过程中对其造成损伤而使得移苗失败。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(5)的培养条件为：26℃光照12小时，21℃避光12小时，培养时间为4周。
可根据不同植物特性及实验需求对培养条件进行调整。
进一步地，所述步骤(5)还包括将透气膜剪取小洞的步骤。
若植物在栽培时，其生长高度超出透气膜，则需要在上方的透气膜中剪取一个小洞，以避免植株地上部生长免受阻碍。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(5)的观测方法包括：原位光学数字成像观测。
本发明提供了透明原位三维植物栽培装置，可用于植物根系生长动态及根系三维构型的监测。本发明装置为对已有的透明原位根系观测系统进行很好的补充，使用了广谱性抗菌剂PPM用于根系观测的透明凝胶介质的配置，并选用最佳抑菌剂的浓度，显著提高凝胶的透明度，并避免了染菌导致样品无法被观测从而造成浪费；另外，通过采用分层栽培方式——在易染菌的上层培养基中加入合适浓度的PPM，而下层使用改良后1/2Hoagland营养液的植物凝胶，消除抑菌剂对于根系生长的影响。本发明可显著降低透明栽培植物的染菌率，显著提高植物根系的原位观测清晰度，无论是动态实时观测还是在收获植物时都可得到高度清晰、精确的相关功能性状。
附图说明
图1为本发明透明原位三维植物栽培装置对苍耳种子进行培养观测的效果。
图2为含有不同抑菌剂浓度的透明植物栽培装置A～D中的根系生长情况。
图3为含有不同抑菌剂浓度的透明植物栽培装置A～D中的根系性状的比较。
图4为透明植物栽培装置E、F中根系生长状况。
图5为透明植物栽培装置E、F中根系在体式显微镜下的比较。
图6为不同培养基的透明植物栽培装置处理下根系性状差异。
其中：1-圆形锡箔纸，2-上层培养基，3-栽培植株根系，4-下层培养基，5-透明栽培容器
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用的实施例，所述装置外部为圆柱形透明容器，培养瓶直径12cm，高27.5cm，容器顶部为透气膜封闭；容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基离顶部透气膜有一定的空间；所述透明凝胶培养基分为上下两层，所述透明凝胶培养基分为上下两层，上层为含有体积百分浓度为0.05％广谱抗菌剂PPM的植物固体培养基1，下层为不含有广谱抗菌剂PPM的植物固体培养基2；所述上层植物固体培养基1包括1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.6‰植物凝胶和体积百分浓度为0.05％广谱抗菌剂PPM，所述下层植物固体培养基2包括1/2Hoagland营养液和质量百分浓度为2‰植物凝胶；所述透明容器内的透明凝胶培养基的上层高度为6-7cm，下层高度为10-11cm。
所述的栽培装置的制备方法为：
(1)在培养基容器下层加入一定高度的下层植物固体培养基2，封口后进行液体高压灭菌；
(2)灭菌后将容器放置至常温并凝固，在下层植物固体培养基2上方加入灭菌过的上层植物固体培养基1溶液，并封口；
(3)灭菌后将容器放置至常温待上层培养基也凝固后即得到所述栽培装置。
本发明所述的栽培装置用于观测植物根系的方法，包括如下步骤：
(1)对种子进行消毒和清洗；
(2)对步骤(1)中的种子进行催芽，得到幼苗；
(3)在所述装置的培养基表面放置一张开口大小为1cm*1cm高温灭菌过的中心十字开口的圆形锡箔纸；
(4)待步骤(2)的幼苗移入如步骤(3)所述的栽培装置中；
(5)继续培养步骤(4)中的幼苗，并观测其生长情况；
上述步骤皆在无菌条件下进行；
所述步骤(1)的种子为苍耳种子，对其进行表面消毒的具体步骤为：使用10％浓度双氧水浸泡苍耳种子，并放置于摇床上震荡20分钟，以对其表面进行消毒，随后使用灭菌后的纯水浸种1小时，之后再用灭菌后的纯水冲洗3-4次以去除残留在种子表面的双氧水。
所述步骤(2)的催芽过程为：将种子在超净工作台的无菌条件下，放入高温灭菌后的1/2Hoagland营养液+质量百分浓度为0.2％植物凝胶的培养皿上，并放入30℃的恒温箱中进行无光催芽育种。
待种植发芽根长达0.75-1.25cm左右，在超净工作台的无菌条件下分别移苗到所述透明植物栽培装置中。
将移苗后的培养基放置在12h光照条件的培养箱中种植，日照条件下温度控制在26℃，没有光照时温度设置为21℃，培养四周后观测所述装置中根系的状态，结果如图1。
实施例2
本发明一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用的实施例，本实施例与实施例1的不同之处在于：所述上层植物固体培养基1含有1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.2‰植物凝胶和体积百分浓度为0.005％广谱抗菌剂PPM；所述下层植物固体培养基2含有1/2Hoagland营养液和质量百分浓度为1.6‰植物凝胶。
实施例3
本发明一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用的实施例，本实施例与实施例1的不同之处在于：所述上层植物固体培养基1含有1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.4‰植物凝胶和含有体积百分浓度为0.03％广谱抗菌剂PPM；所述下层植物固体培养基2含有1/2Hoagland营养液和质量百分浓度为1.8‰植物凝胶。
实施例4PPM浓度对根系生长的影响
按实施例1的方法对苍耳种子进行消毒、催芽。待种植发芽根长达1cm左右，选取发芽情况相近的种子，在超净工作台的无菌条件下分别移苗到不同浓度的透明植物栽培装置中。透明植物栽培装置A～D，装置为透明容器，培养瓶直径12cm，高27.5cm，容器顶部为透气膜封闭；容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基高度约为17cm；所述透明凝胶培养基不分层，成分为：1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.6‰植物凝胶和一定浓度的PPM(各装置PPM浓度如下表1)；各装置中PPM的浓度如表1所示。
表1透明植物栽培装置A～D上层培养基的PPM浓度
Figure BDA0002454163780000081
将移苗后的培养基放置在12h光照条件的培养箱中种植，日照条件下温度控制在26℃，没有光照时温度设置为21℃，培养四周后观测各装置根系的状态，结果如图2(从左向右体积百分浓度分别为0.005％、0.01％、0.03％与0.05％)。
由图2可得，随着PPM浓度的升高，主根发育明显受到抑制，尤其是下部分主根的侧根分支显著减少，至0.05％PPM处理下已几乎没有侧根萌发，同时前三种处理的主根皆接触到了栽培瓶底部，而0.05％PPM浓度处理下主根未能生长至瓶底。
将种植后收获的植株根系进行性状测量，通过直尺从植株基部到主根尖端量得主根长，将收获的幼苗根系使用WinRhizo软件(Pro 2013a,Regent Instrument Inc.)获得其总根长，总根表面积，根体积以及平均根直径等性状，之后将根系放入烘箱经过65℃烘干48小时至恒重再测量获得根系干重性状，最后将上述性状进行计算，获得比根长(总根长/根干重)、比根表面积(总根表面积/根干重)以及根组织密度(根干重/根体积)等性状。结果如图3，a-i图纵坐标分别表示主根长，总根系生物量，总根长，根总表面积，根体积，平均根直径，比根长，比根表面积以及根组织密度，横坐标为PPM的浓度。
由图3可得，大多数根系性状随着添加的PPM浓度的升高而降低(除了平均根直径与根组织密度，这两个根系性状与植物防御策略有关)，说明PPM浓度的升高使得根系的生长与发育受到了抑制。
实施例3
按实施例1的方法对苍耳种子进行催芽，选取发芽情况相近的种子，在超净工作台的无菌条件下分别移苗到透明植物栽培装置E、F中。透明植物栽培装置E～F，装置为透明容器，培养瓶直径12cm，高27.5cm，容器顶部为透气膜封闭；容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基高度约为17cm；其中栽培装置E为含有体积百分浓度为0.05％PPM的培养基，F为不含PPM的普通培养基。
表2透明植物栽培装置E、F培养基组成
组别 E F
培养基组成 含PPM培养基 普通培养基
将移苗后的培养基放置在12h光照条件的培养箱中种植，日照条件下温度控制在26℃，没有光照时温度设置为21℃，培养四周后观测各装置根系的状态，装置E、F结果如图4(左：含PPM培养基；右：普通培养基)。
进一步对装置E、F的根系进行染色处理，并在体式显微镜(LEICA-M205A)下观察根系尖端2-4cm的染色情况，具体染色步骤为：切下根系尖端2-4cm部分放置于台盼蓝溶液中(使用无水乳酚稀释至10倍浓度)30-60min，而后使用98％-100％的无水乙醇替代台盼蓝溶液浸润根系至少一夜，次日再使用新的无水乙醇对根系进行冲洗2-3次后即可。为方便在体式显微镜下观察，将染色后的根尖细胞放置在含有60％甘油溶液的载玻片上后进行观测，同样的，横截面切片后的染色根尖细胞也同样在体式显微镜下观察。所有的观测结果由数码相机进行拍摄并记录(LEICA-DFC550)。结果如图5，体式显微镜下种植四周后的：a)-普通培养基种植的根系表面；b)-体积百分浓度为0.05％浓度PPM添加下培养基的根系表面；c)-台盼蓝染色下普通培养基的根系表面；d)-台盼蓝染色下体积百分浓度为0.05％PPM添加培养基的根系表面；e)-台盼蓝染色下普通培养基的根系横截面；f)-台盼蓝染色下体积百分浓度为0.05％PPM添加培养基的根系横截面。
台盼蓝是一种活体生物染色剂，能将活体细胞染成蓝色。这里我们使用无水乳酚与台盼蓝混合的稀释10倍后的台盼蓝溶液进行染色，乳酚是一种普通固定液染料。由图5可得，对比加入PPM前后的培养基所栽培出的植物，发现加入体积百分浓度为0.05％PPM后的根系表面细胞无法被台盼蓝蓝色，证明其表面失去了活性，为死细胞。所以添加PPM对于根系来说是存在伤害作用的。
实施例5
按实施例1的方法对苍耳种子进行催芽，选取发芽情况相近的种子，在超净工作台的无菌条件下分别移苗到含有不同培养基的透明植物栽培装置(各装置的成分如表3所示。)中培养，并将种植后收获的植株根系进行性状测量。
表3各透明植物栽培装置的成分
Figure BDA0002454163780000101
根系性状进行分析，结果如图6，a)-i)图纵坐标分别表示主根长，总根系生物量，总根长，根总表面积，根体积，平均根直径，比根长，比根表面积以及根组织密度。
总体来看CK组对比其他处理，主要根系性状值都显著更高，特别是对比P组(根组织密度与平均根直径除外，这两个根系性状与植物防御策略有关，说明PPM的加入使得根系生长与发育受到了抑制)。而C-P组与P-C组之间在大多数性状上没有显著差异，只有在主根长这一性状上，P-C组会显著高于C-P组，说明下层培养基添加PPM后会显著抑制主根的生长。所以使用上层为添加了合适PPM浓度的培养基而下层为普通培养基的栽培装置，在不显著影响植株根系的生长发育下，能有效减小培养基内部染菌现象的发生，从而使得植物根系原位观测的清晰度有了明显提升。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种用于观测植物根系的透明原位三维植物栽培装置，其特征在于，所述装置包括透明容器、透气膜和培养基；所述透明容器为圆柱体，容器顶部为透气膜封闭，容器内含有透明凝胶培养基；所述透明凝胶培养基离顶部透气膜有一定的空间；所述透明凝胶培养基分为上下两层，上层植物固体培养基1含有1/2Hoagland营养液、质量百分浓度为1.2-1.6‰植物凝胶和体积百分浓度为0.005％-0.03％广谱抗菌剂PPM；下层植物固体培养基2含有1/2Hoagland营养液和质量百分浓度为1.6-2‰植物凝胶；所述上层植物固体培养基1中植物凝胶含量低于下层植物固体培养基2中植物凝胶含量；所述上层植物固体培养基1的高度低于下层植物固体培养基2的高度；
所述透明容器高度为27.5cm，直径为12cm；所述透明容器内的透明凝胶培养基的上层高度为6-7cm，下层高度为10-11cm。
2.权利要求1所述栽培装置的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在培养基容器下层加入一定高度的下层植物固体培养基2，封口后进行液体高压灭菌；
(2)灭菌后将容器放置至常温待培养基凝固，在下层植物固体培养基2上方加入灭菌过的上层植物固体培养基1溶液，并封口；
(3)将容器放置至常温待上层培养基完全凝固即得到所述栽培装置。
3.权利要求1所述栽培装置用于观测植物根系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对种子进行消毒和清洗；
(2)对步骤(1)中的种子进行催芽，得到幼苗；
(3)在如权利要求1所述装置的培养基表面放置一张高温灭菌过的中心十字开口的圆形锡箔纸；
(4)待步骤(2)的幼苗移入步骤(3)所述的栽培装置中；
(5)继续培养步骤(4)中的幼苗，并观测其生长情况；
上述步骤皆在超净工作台无菌条件下进行。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的种子消毒方法为使用10％浓度双氧水浸泡20分钟，再用无菌纯水浸泡1小时，然后用无菌纯水冲洗2-3遍。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的催芽的具体步骤为：将种子置于含有1/2Hoagland营养液+质量百分浓度为0.2％植物凝胶的无菌培养皿中，30℃避光催芽。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中进行幼苗移植时，所述幼苗的根系长0.75-1.25cm。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的培养条件为：26℃光照12小时，21℃避光12小时，培养时间为4周。
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