CN110810248A - 一种白及双层复式组织培养基、制备方法及应用 - Google Patents

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林云斌
叶伟军
黄剑雄
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Abstract

本发明公开了一种白及双层复式组织培养基，该培养基含有两层固体培养基，分别为上层的种子萌发培养基与下层的增殖分化培养基，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6‑苄氨基腺嘌呤0.10‑2.0mg、蔗糖10‑50g、琼脂糖6‑20g、土豆100‑250g，培养基的pH为5.8‑6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10‑2.0mg、蔗糖10‑50g、琼脂糖6‑20g、土豆100‑250g，培养基的pH为5.8‑6.2，上下层培养基的用量比例在1:1～1:5。提高了萌芽率、种子萌发后可继续在瓶中生长增殖，分化率高，减少了组织培养过程中人工转接的操作环节，减少了污染机会，与传统的培养基相比，利用本发明的培养基培养的白及组织叶肉饱满、茎枝粗壮，生长状况更佳，大大提高了白及成活率。

Description

一种白及双层复式组织培养基、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及白及的快繁技术，尤其是一种白及双层复式组织培养基、制备方法及应用。
背景技术
白及(Bletilla striata)，又名白芨，为兰科白及属多年生草本植物，其根茎入药，具有收敛止血，消肿生肌之功效，用于治疗肺结核咳血、支气管扩张咯血、胃溃疡及尿血、便血、外伤出血等疾病,此外，白及块茎中富含白及胶与白及多糖，被广泛应用于食品工业和日化工业中,故经济价值很高。白及的果荚内有三万多个种子，在自然条件下很难萌发，种子萌发率一般只有5％左右，而种子萌发后植株的生长成活率低，白及因其种子自然萌发率低，因过度采挖导致生态环境受到严重破坏，资源日益枯竭。
白及的繁殖方法主要有块茎繁殖和组织培养。传统的块茎繁殖速度慢，周期长，工作量大，生产效率低成本高不能大规模栽培；而组织培养生产的无菌试管苗需要多次转接操作，而且移栽易污染，成活率低、生产成本较高，未进行大规模繁殖，白及产量不能满足白及临床用药和工业生产的需求，严重制约白及产业的发展。本技术可应用于白及组织培养，不仅促进种子的快速萌发以及促进种苗的繁殖，同时也减少生产环节，减少污染，降低生产成本，对于推广白及组培的规模化栽培种植，提高白及药材的质量与产量等均有具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种白及双层复式组织培养基，可以提高白及的发芽率；还提供一种该培养基的制备方法，可减少生产环节，提高生产效率，成本较低；另外还提供该培养基在白及培育中的应用。
本发明的技术方案为：
一种白及双层复式组织培养基，其特征在于：该培养基含有两层固体培养基，分别为上层的种子萌发培养基与下层的增殖分化培养基，上层培养基以1/2MS培养基为基础，每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2；下层培养基以1/2MS培养基为基础，每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2，上下层培养基的用量比例在1:1～1:5。
一种白及双层复式组织培养基的制备方法：它包括以下步骤：
步骤1，按常规方法配制1/2MS培养基；
步骤2，按每升1/2MS培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2的配方比例，分别称取苄氨基腺嘌呤、蔗糖、土豆和琼脂糖；
步骤3，分别将土豆切成3cm X 3cm X 3cm的方块，并绞成土豆汁。
步骤4,将步骤2中称取的萘乙酸、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，分装入培养瓶，于121℃高压灭菌20-30min，得到下层白及种子萌发培养基。
步骤5，将步骤2中称取的苄氨基腺嘌呤、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，装入三角锥瓶，于121℃高压灭菌20-30min，获得上层白及增殖培养液。
步骤6，待分瓶后的下层白及种子萌发培养基冷凝后，放置在超净工作台，将上层白及增殖培养液无菌环境中趁热倒入下层白及种子萌发培养基的瓶子，上下层培养基的用量比例在1:1-1:5，放置冷凝后，备用。
本发明的有益效果为：将白及种子撒播在本发明的培养基上，由于具备两层用途完全不同的培养基，种子首先接触到利于萌发的种子萌发培养基，继而生根发芽；后续经过培养后植株接触下层的增殖分化培养基，从而提高增殖和分化的效率，提高白及的发芽率；减少生产环节，提高生产效率，成本较低。
具体实施方式
下面结合具体实施方式作进一步说明：
配置1/2MS培养基：白及组织培养基配制时使用的1/2MS培养基为本领域技术人员公知的培养基，1/2MS培养基配制时按照公知的配方称取其中的各个组分和配制方法进行配制即可。
1/2MS培养基的配方如表1所示：
表1 1/2MS培养基的配方
Figure BDA0002312700290000021
Figure BDA0002312700290000031
具体操作方法为：
操作方法：
步骤1，按常规方法配制1/2MS培养基；
步骤2，按每升1/2MS培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2的配方比例，分别称取苄氨基腺嘌呤、蔗糖、土豆和琼脂糖；
步骤3，分别将土豆切成3cm X 3cm X 3cm的方块，并绞成土豆汁。
步骤4,将步骤2中称取的萘乙酸、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，分装入培养瓶，于121℃高压灭菌20-30min，得到下层白及种子萌发培养基。
步骤5，将步骤2中称取的苄氨基腺嘌呤、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，装入三角锥瓶，于121℃高压灭菌20-30min，获得上层白及增殖培养液。
步骤6，待分瓶后的下层白及种子萌发培养基冷凝后，放置在超净工作台，将上层白及增殖培养液趁热倒入下层白及种子萌发培养基的瓶子，上下层培养基的用量比例在1:1-1:5，放置冷凝后，备用。
调节pH使用的试剂为1N HCl溶液、1N NaOH溶液。。
实施例1
实施例1的白及双层复式组织培养基，该培养基含有两层固体培养基，分别为上层的种子萌发培养基与下层的增殖分化培养基，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.10mg、蔗糖10g、琼脂糖6g、土豆100g，培养基的pH为5.8。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10mg、蔗糖10g、琼脂糖6g、土豆100g，培养基的pH为5.8，上下层培养基的用量比例在1:1。
实施例2
实施例2的白及双层复式组织培养基，该培养基含有两层固体培养基，分别为上层的种子萌发培养基与下层的增殖分化培养基，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg、蔗糖25g、琼脂糖10g、土豆150g，培养基的pH为6.0。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸1.0mg、蔗糖25g、琼脂糖10g、土豆150g，培养基的pH为6.0，上下层培养基的用量比例在1:3。
实施例3
实施例3的白及双层复式组织培养基，该培养基含有两层固体培养基，分别为上层的种子萌发培养基与下层的增殖分化培养基，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤2.0mg、蔗糖50g、琼脂糖20g、土豆250g，培养基的pH为6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸2.0mg、蔗糖50g、琼脂糖20g、土豆250g，培养基的pH为6.2，上下层培养基的用量比例在1:5。
上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (7)

1.一种白及双层复式组织培养基，其特征在于，培养基分为两层，上层为种子萌发培养基，下层为组织增殖培养基，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2，上下层培养基的用量比例在1:1～1:5。
2.根据权利要求1所述的一种白及双层复式组织培养基，其特征在于，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.10mg、蔗糖10g、琼脂糖6g、土豆100g，培养基的pH为5.8。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10mg、蔗糖10g、琼脂糖6g、土豆100g，培养基的pH为5.8，上下层培养基的用量比例在1:1。
3.根据权利要求1所述的一种白及双层复式组织培养基，其特征在于，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg、蔗糖25g、琼脂糖10g、土豆150g，培养基的pH为6.0。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸1.0mg、蔗糖25g、琼脂糖10g、土豆150g，培养基的pH为6.0，上下层培养基的用量比例在1:3。
4.根据权利要求1所述的一种白及双层复式组织培养基，其特征在于，上层培养基每升1/2MS培养基中含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤2.0mg、蔗糖50g、琼脂糖20g、土豆250g，培养基的pH为6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸2.0mg、蔗糖50g、琼脂糖20g、土豆250g，培养基的pH为6.2，上下层培养基的用量比例在1:5。
5.一种白及双层复式组织培养基的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备：
步骤1，按常规方法配制1/2MS培养基；
步骤2，按每升1/2MS培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2。下层每升1/2MS培养基中含有以下组分：萘乙酸0.10-2.0mg、蔗糖10-50g、琼脂糖6-20g、土豆100-250g，培养基的pH为5.8-6.2的配方比例，分别称取苄氨基腺嘌呤、蔗糖、土豆和琼脂糖；
步骤3，分别将土豆切成3cm X 3cm X 3cm的方块，并绞成土豆汁；
步骤4，将步骤2中称取的萘乙酸、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，分装入培养瓶，于121℃高压灭菌20-30min，得到下层白及种子萌发培养基；
步骤5，将步骤2中称取的苄氨基腺嘌呤、蔗糖、琼脂糖以及步骤3中的土豆汁混匀，并按配方比例加入配制好的1/2MS培养基，充分搅拌均匀，pH调节至5.8-6.2，装入三角锥瓶，于121℃高压灭菌20-30min，获得上层白及增殖培养液；
步骤6，待分瓶后的下层白及种子萌发培养基冷凝后，放置在超净工作台，将上层白及增殖培养液在无菌环境中趁热倒入下层白及种子萌发培养基的瓶子，上下层培养基的用量比例在1:1-1:5，放置冷凝后，备用。
6.根据权利要求5所述的一种白及双层复式组织培养基的制备方法，其特征在于，调节pH使用的试剂为1N HCl溶液、1N NaOH溶液。
7.一种白及双层复式组织培养基的应用，其特征在于：所述白及双层复式组织培养基应用于白及种子萌发及增殖培养。
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