CN117063780B - 一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基及其采收方法 - Google Patents
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Abstract
本发明提供了一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基及其采收方法，属于冬虫夏草培育技术领域。本发明通过将冬虫夏草子囊孢子采收培养基设置为两层结构，包括上层纯琼脂培养基和下层营养培养基，其中下层培养基为子实体提供产孢所需水分及其他营养成分，上层培养基能够隔绝通常会在培养基上滋生的杂菌，避免杂菌污染，同时提供足够的支撑性，为后续采收提供基础。采用本发明提供的冬虫夏草子囊孢子采收培养基能够避免孢子采收过程中的杂菌干扰，用于采收孢子方便快捷，易于后续统计孢子采收数量，并且得到的孢子活性更高，有利于后续高效染菌。
Description
技术领域
本发明涉及冬虫夏草培育技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基及其采收方法。
背景技术
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis），为子囊菌门肉座菌目麦角菌科中的虫草属。冬虫夏草具有极高的药用价值，是名贵中药。
自然界中，冬虫夏草子囊孢子由成熟子座部分弹射出来，散布于四周的草甸、土壤中，因此野生冬虫夏草子囊孢子极难收集。目前人工培育冬虫夏草多采取仿野生环境，将其种植在土壤中，待其弹射孢子后收集孢子及带有孢子的土壤的方法。此方法存在杂菌多、管理困难，以及无法准确统计孢子弹射数量、不能确定使用数量等诸多问题，严重影响人工培育虫草的规模化生产。
中国专利CN103571788A公开了一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法，包括如下步骤：将沙子放入能封口的多孢分离收集容器中，灭菌、干燥；选用蛹虫草子囊果发育成熟的子实体，放入有沙子的多孢分离收集容器中；振荡多孢分离收集容器，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。将收集到的沙子置于干燥无菌容器中密封，室温避光或冰箱冷藏保存。但是该种虫草孢子收集方法步骤繁琐，仍然不利于规模化生产应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基，能够避免孢子采收过程中的杂菌干扰，用于采收孢子方便快捷，易于后续统计孢子采收数量和方便确定使用量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基，所述采收培养基由上自下依次包括上层培养基层和下层培养基层；
所述上层培养基层为纯琼脂培养基；
所述下层培养基层为营养培养基。
优选的，所述纯琼脂培养基的厚度在0.5cm以上。
优选的，所述营养培养基的厚度在0.5cm以上。
优选的，所述营养培养基中含有基础培养基和土壤浸出液。
优选的，所述基础培养基为PDA培养基。
优选的，所述土壤浸出液在营养培养基中的添加体积比为10%~50%。
本发明还提供了上述采收培养基在采收冬虫夏草子囊孢子中的应用。
本发明提供了一种冬虫夏草子囊孢子的采收方法，包括以下步骤：
将冬虫夏草子实体插入上述采收培养基中；
诱导子实体弹射孢子；
用采收试剂冲洗培养基，收集冲洗液，即为冬虫夏草子囊孢子溶液。
优选的，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用光照强度5000~20000lx。
优选的，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用的光照时间为10~12h；
和/或，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用的温度10~20℃。
本发明的有益效果：
本发明通过将冬虫夏草子囊孢子采收培养基设置为两层结构，包括上层纯琼脂培养基和下层营养培养基，其中下层培养基为子实体提供产孢所需水分及其他营养成分，上层培养基能够隔绝通常会在营养培养基上滋生的杂菌，避免杂菌污染，为子实体提供足够的支撑性，同时为子囊孢子提供光滑而湿润的平面，减少子囊孢子损伤，易于子囊孢子采收。
本发明提供的一种冬虫夏草子囊孢子的采收方法可以获得任意浓度的冬虫夏草子囊孢子溶液，便于计数和管理，方便快捷，适用于人工培育冬虫夏草的规模化生产，并且得到的孢子活性更高，有利于后续高效染菌。
附图说明
图1为本发明插入冬虫夏草后的培养基状态图①；
图2为本发明插入冬虫夏草后的培养基状态图②；
图3为本发明插入冬虫夏草后的培养基状态图③。
具体实施方式
本发明提供了一种冬虫夏草子囊孢子采收培养基，所述采收培养基由上自下依次包括上层培养基层和下层培养基层；所述上层培养基层为纯琼脂培养基；所述下层培养基层为营养培养基；所述营养培养基中优选含有基础培养基和土壤浸出液，所述基础培养基优选为PDA培养基，所述土壤浸出液在营养培养基中的添加体积比优选为10%~50%。
在本发明中，所述采收培养基的制备方法优选包括以下步骤：
将PDA液体培养基与土壤浸出液混合，加热后加入10~20g/L琼脂，溶解后高压蒸汽灭菌0.5h，冷却到35~45℃后倒入容器，厚度优选在0.5cm以上，进一步优选为1~2cm，得到下层营养培养基；将琼脂按照10~20g/L溶于无菌水，高压蒸汽灭菌0.5h，冷却到35~45℃后到在凝固后的营养培养基上面，厚度优选在0.5cm以上，进一步优选为1~2cm。
本发明提供了一种冬虫夏草子囊孢子的采收方法，包括以下步骤：将冬虫夏草子实体插入上述采收培养基中；诱导子实体弹射孢子；用采收试剂冲洗培养基，收集冲洗液，即为子囊孢子溶液；本发明所述冬虫夏草子实体在采收培养基中的密度优选为10~30根/dm2，所述诱导子实体弹射孢子优选采用光照强度5000~20000lx，进一步优选为8000~12000lx；采收过程中的温度优选为10~15℃，湿度优选为66~80%。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
待种植的冬虫夏草子实体部分成熟后，将子实体部分剪断取出，取240根子实体置于75%酒精中消毒5min，取出后用无菌水冲洗3次，放置晾干备用。
制作双层培养基：
①制作PDA+土壤浸出液培养基：
称取200g马铃薯洗净去皮，再切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加入100mL土壤浸出液，加热，沸腾后加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入已消毒的平底盒内，厚度1cm。
②制作全琼脂培养基：取1L无菌水，煮沸后加入15g琼脂，完全溶于水后，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入冷却凝固的下层培养基上方，厚度1cm，冷却后备用。
将晾干后的子实体均匀插入培养基中，密度为30根/dm²，使用10000lx照度的灯光进行照射，室温10℃，湿度70%，具体情况如图1~3所示。
24h后观察到子囊果开始弹射子囊孢子，48h后进行第一次采收，在喷壶中倒入无菌山泉水，以100mL/20根子实体的用量，采用无菌山泉水对培养基以及其中的子实体进行喷洒冲洗，倒出后即为冬虫夏草子囊孢子溶液。
将收集的冬虫夏草子囊孢子溶液滴入PDA培养基中，在25℃条件下培育3天，培育过程中未出现杂菌。
实施例2
待种植的冬虫夏草子实体部分成熟后，将子实体部分剪断取出，取240根子实体置于75%酒精中消毒4min，取出后用无菌水冲洗3次，放置晾干备用。
制作双层培养基：
①制作PDA+土壤浸出液培养基：
称取200g马铃薯洗净去皮，再切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加入100mL土壤浸出液，加热，沸腾后加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入已消毒的平底盒内，厚度1cm。
②制作全琼脂培养基：取1L无菌水，煮沸后加入15g琼脂，完全溶于水后，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入冷却凝固的下层培养基上方，厚度1cm，冷却后备用。
将晾干后的子实体均匀插入培养基中，密度为20根/dm²，使用10000lx照度的灯光进行照射，室温15℃，湿度80%。
24h后观察到子囊果开始弹射子囊孢子，48h后进行第一次采收，在喷壶中倒入无菌山泉水，以100mL/20根子实体的用量，采用无菌山泉水对培养基以及其中的子实体进行喷洒冲洗，倒出后即为冬虫夏草子囊孢子溶液。
将收集的冬虫夏草子囊孢子溶液滴入PDA培养基中，在25℃条件下培育3天，培育过程中未出现杂菌。
实施例3
待种植的冬虫夏草子实体部分成熟后，将子实体部分剪断取出，取240根子实体置于75%酒精中消毒5min，取出后用无菌水冲洗3次，放置晾干备用。
制作双层培养基：
①制作PDA+土壤浸出液培养基：
称取200g马铃薯洗净去皮，再切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，加入100mL土壤浸出液，加热，沸腾后加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入已消毒的平底盒内，厚度1cm。
②制作全琼脂培养基：取1L无菌水，煮沸后加入15g琼脂，完全溶于水后，将其倒入三角瓶中置于高压灭菌釜中121℃高压蒸汽灭菌0.5h取出，冷却到40℃后倒入冷却凝固的下层培养基上方，厚度1cm，冷却后备用。
将晾干后的子实体均匀插入培养基中，密度为10根/dm²，使用10000lx照度的灯光进行照射，室温11℃，湿度68%。
24h后观察到子囊果开始弹射子囊孢子，48h后进行第一次采收，在喷壶中倒入无菌山泉水，以100mL/20根子实体的用量，采用无菌山泉水对培养基以及其中的子实体进行喷洒冲洗，倒出后即为冬虫夏草子囊孢子溶液。
将收集的冬虫夏草子囊孢子溶液滴入PDA培养基中，在25℃条件下培育3天，培育过程中未出现杂菌。
对比例1
在28cm×40cm的盒子里放入约3kg无菌土，种植清洗灭菌过的即将弹射子囊孢子冬虫夏草化苗草120根，室温15℃，湿度80%，光照10000lx照射12h，第二天开始收集子囊孢子。该方法中，需要用药匙一点一点的从每一根冬虫夏草子座根部周围舀取弹射的子囊孢子及附着子囊孢子的土壤，过程费时费工，而且子座在强光照射下容易焦尖，子囊孢子会失水活性减弱，还会导致子囊孢子弹射不完全，收集孢子量减少。
实验例
将实施例1~3中采收得到的子囊孢子水溶液稀释100倍，取0.1mL稀释液，用血球计数板在显微镜观察、计算子囊孢子数量，结果如下表1所示：
表1 子囊孢子数量统计结果（单位：万个/mL）
通过本发明提供的方法，子囊孢子弹射在琼脂平面上，易于收集，琼脂平面富含水分，能很好地滋润和保护子囊孢子。
分别采用本发明提供的实施例1和对比例1的方法，各采集3次不同数量的菌种孢子，对幼虫进行接种，记录各组染菌情况进行统计，结果如表2所示：
表2 染菌情况统计结果
由结果可知，通过本发明提供的采收方法得到的菌种具有更优活性，与现有方法相比能够显著提升孢子对幼虫的感染效果，对冬虫夏草人工培育具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种冬虫夏草子囊孢子的采收方法，其特征在于，包括以下步骤：
将冬虫夏草子实体插入采收培养基中；
诱导子实体弹射子囊孢子；
用采收试剂冲洗培养基，收集冲洗液，即为冬虫夏草子囊孢子溶液；
所述采收培养基由上自下依次包括上层培养基层和下层培养基层；
所述上层培养基层为纯琼脂培养基；
所述下层培养基层为营养培养基。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草子囊孢子的采收方法，其特征在于，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用光照强度5000~20000lx。
3.根据权利要求1所述的冬虫夏草子囊孢子的采收方法，其特征在于，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用的光照时间为10~12h；
和/或，所述诱导子实体弹射子囊孢子采用的温度为10~20℃。
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