CN101663968B - 一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，包括设计透明的栽培容器和生长介质、种子灭菌和催芽、出芽后移苗所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长等步骤，以便于采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获。本发明通过设计适宜的透明生长环境，保证植物根系在透明的生长环境中自然生长，便于后续的对植物根系原位生长状况进行三维可视化分析，直接反映根系的三维生长状况。

Description

一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法

技术领域

本发明属于根系生物学、植物营养学、作物栽培学和植物生理学领域，具体涉及一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法。

背景技术

根系是植物吸收养分和水分的主要器官，只有生长发育良好的根系才能满足植物生长的需要(Barber，1995；Bailey et al，2002；Lynch，2007)。因此，研究植物根系生长对了解植物对养分的需求及其与环境的关系具有十分重要的意义。

目前对根系的研究已经取得一定的进展，但是在自然生长条件下，由于土壤介质的不透明性和根系结构的复杂性，难以进行原位观察和测定(马新明等，2003；Zhu et al，2006))。

迄今已有报导的根系形态构型数据大多是破坏性采样获得的数据，并非原位数据，而且大多根构型与养分效率的研究属于定性研究，对于根构型与养分效率的定量研究还鲜见报道。此外，目前已有的研究大部分都是某一时刻的根构型数据与养分效率的研究，动态的原位根构型数据与养分效率的研究则未见技术报道。

要完成动态的原位根构型数据与养分效率的研究的基础是实现植物根系在透明的环境中自然生长。

发明内容

本发明的目的是克服现有根系形态构型观察和测定方法的局限性，提供一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，采用本发明方法栽培的植物可以在透明的生长环境中自然生长，从而实现动态的、原位的而非破坏性的根系观察和测定。

本发明在不破坏植物根系及其周围生长环境的前提下，直接将植物根系原位生长状况进行三维可视化，并结合计算机图像分析，从而对根系的形态和构型进行原位观察和测定。

实现本发明目的的具体技术方案是：

提供一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，包括以下步骤：

(1)设计透明的栽培容器和生长介质；

(2)种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长。

采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获。

上述步骤(1)所述透明的栽培容器优选透明的圆柱形容器，容器设置有一个可打开的盖子，盖子中间设置一个贯穿洞。根据不同的植物容器大小有所不同，本发明优选采用高20cm、直径12cm的圆柱形有机玻璃容器，贯穿洞优选直径为20mm的圆洞。

上述步骤(1)所述的透明的生长介质为透明培养基。透明培养基是：采用与植物适应的相应营养液+0.15％的Phytagel^TM。

所述透明培养基配置步骤如下：

(A)将培养基搅拌均匀，并调节pH值；

有机玻璃容器采用紫外线灭菌1小时，备用；

(B)将培养基在121℃灭菌30分钟；灭菌结束尽快(保证培养基未开始凝固)将培养基倒入上述已灭菌的有机玻璃容器内，以上操作在超净工作台进行；

(C)静置冷却待培养基凝固，大概需要4小时左右；

其中，在培养基快凝固时，不能挪动容器，以防止培养基凝固后里面产生气泡。

对于分层磷处理培养基，需等下层培养基完全凝固后再倒上层培养基，并确保上层培养基倒入时的温度不能太高，但也不能太低以至于发生凝固，本发明优选设定上层培养基倒入时温度为50℃左右，，以保证下层培养基不会没有融化，上层培养基不会很快发生凝固。

上述步骤(3)扫描的方法是从移苗后第1天到第20天每24小时利用三维激光扫描仪扫描植株根系一次，扫描范围为0°～360°，旋转方向的扫描精度为0.18°，上下移动方向的扫描精度为0.1mm。

本发明的有益效果是：

本发明提供适宜的培养基组成和生长容器，实现植物的根系在透明的生长环境中自然生长，通过对植物根系原位生长状况进行三维可视化分析，能直接反映根系的三维生长状况，不需要破坏性的检测，并实现动态的观测。此外，通过改变培养基所加养分的组分，可以调节生长介质对植物根系养分的供应状况。因此，运用本发明还可进行生长介质中养分的供应状况与植物根系生长的关系等方面的研究。

附图说明

图1本发明透明的栽培容器结构示意图

图2播种时的种胚朝向示意图

图3三维激光扫描仪扫描根系方式

图4传统的样条编辑方法模拟结果

图5传统的样条编辑方法模拟结果局部放大图

图6传统的样条编辑方法模拟结果

图7大豆发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像

图8水稻发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像

图9大豆发芽后第18天的植物根系三维构型模拟结果

图10水稻发芽后第18天的植物根系三维构型模拟结果

图11～16水稻根系生长6、12和18天的形态构型数据框图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明改变了现有技术破坏性观察和测定根系形态构型的观念，通过大量长期的实验总结得到本发明的设计，实现了对植物根系动态的原位观察和测定。实验中的实施例不能一一赘述，下述实施例仅用于辅助说明本发明思路，并不因此将本发明的范围限定于大豆和水稻。

实施例1大豆根系的形态构型的原位观察和测定

(1)设计透明的栽培容器和生长介质；

如附图1所示，采用一透明圆柱形有机玻璃容器1，高20cm，直径12cm，设置有一个可打开的盖子2，盖子中间设一个直径为20mm的贯穿圆洞3；

透明培养基为改良的1/2Hoagland营养液+0.15％的Phytagel^TM(W/V)+不同磷处理；所述不同磷处理包括无磷处理或1.0mM KH₂PO₄处理，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节为5.8，按照常规技术采用盐酸或氢氧化钠等试剂进行调节。

1/2Hoagland营养液组成为(μM)：KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.38，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O 0.57，Fe-EDTA(Na)82，H₃BO₃ 23.13，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.09。

如附图1所示，每个有机玻璃容器分别装15cm高的培养基4，即约1.7L培养基，以使容器内上方留有部分空间5供幼苗早期无菌生长。

培养基配置步骤如下：

(A)用搅拌机将培养基搅拌均匀，调节pH值为5.8；

有机玻璃容器用紫外线灭菌1小时备用；

(B)采用高压灭菌锅将培养基在121℃灭菌30分钟，灭菌结束尽快(保证培养基未开始凝固)将培养基倒入灭菌的有机玻璃容器内，以上操作在超净工作台进行；

(C)静置冷却待培养基凝固，大概需要4小时左右。其中，在培养基快凝固时，不能挪动容器，以防止培养基凝固后里面产生气泡。

对于分层磷处理培养基，需等下层培养基完全凝固后再倒上层培养基，并确保上层培养基倒入时的温度不能太高，但也不能太低以至于上层培养基会开始凝固，本发明优选设定上层培养基倒入时温度为50℃左右，以保证下层培养基不会没有融化，上层培养基不会很快发生凝固。

(2)种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长；

种子在播种前必须要进行灭菌以防止生长过程中产生污染。

大豆种子灭菌与催芽的方法是：将大豆种子用10％饱和双氧水浸泡30分钟，并不时摇动，再用无菌水冲洗3～5次，播种到经过高温灭菌并含有大豆培养基的培养皿里萌发，注意播种时的种胚朝向如附图2所示，使胚根向下生长，附图2中6为胚胎(embryo)，7为胚根(radicle)。播种应在超净工作台中操作，播入种子后用透气胶带封口。在25℃培养箱里暗培养24小时左右，出芽后移苗到圆柱形有机玻璃容器内。

大豆幼苗生长期间的平均温度为白天28℃，晚上19℃，相对湿度为80％，光照时间为12小时。

采用三维激光扫描仪对根系进行扫描，进行根系三维构型的原位观察和图像捕获。

根系图像三维激光扫描：从移苗后第1天到第20天每24小时利用三维激光扫描仪(Roland LPX-1200，Japan)扫描植株根系一次。扫描范围为0°～360°，旋转方向的扫描精度为0.18°，上下移动方向的扫描精度为0.1mm。

植物根系三维构型原位动态重建及模拟系统由三维激光扫描仪、计算机和图像分析软件三部分组成。各组份具体功能如下：

第一部分，三维激光扫描仪。采用日本产的Roland LPX-1200三维激光扫描仪，有效扫描范围为130.0mm(直径)×203.2mm(高)，在旋转方向扫描精度最高可达0.18°，在上下移动方向精度最高可达0.1mm。三维激光扫描仪LPX-1200内设有一个旋转台，旋转台上放置要扫描的植物，放置时需要注意使要扫描的物体中心与旋转台的中心对齐，扫描时旋转台带着植物一起旋转，扫描方式见附图3。三维激光扫描仪利用精确的非接触式激光传感器进行扫描，通过发射激光束到要扫描的植物根系表面，由传感器探测从物体表面反射的光量来测定物体的坐标，速度快、精度高、操作灵活。

第二部分，计算机。计算机的配置需要Pentium 4以上，内存1GB以上，Windows XP系统，以保证图像分析系统顺利进行。

第三部分，图像分析软件。包括图像采集、重建和模拟，利用三维激光扫描仪结合三维激光扫描仪系统的Dr.PICZA3软件采集植物根系三维构型图像，采集时间随扫描植株根系的大小和扫描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，采集的时间就越大，本领域技术人员根据具体需要确定。一般发芽后6天的大豆根系采用扫描精度在旋转方向为0.18°，在上下移动方向精度为0.1mm时，图像扫描时间需要60分钟左右。发芽后12天的大豆根系采用以上相同的精度扫描时需要90分钟左右。按照本发明方法对大豆发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像见附图7。

由于三维激光扫描仪获得的数据是在三维空间中无规则、随机分布的。其特点是数据量庞大、噪声点多、数据密集、数据点散乱分布(因此称为“点云”数据)，表面存在一些“沙洞”。若采用传统的样条编辑方法模拟，模拟结果不是很理想，见附图4～6所示，不适合直接用于后续曲面重构，附图4三维激光扫描仪获取的离散点；附图5中植物根系存在的“沙洞”，附图6表示利用传统样条编辑方法模拟得到的结果。本发明利用基于广义Hough变换原理的算法对获得的图像进行重建。根据根系的线状特征和天然的连续缓变特征，由各根的中轴线即骨架来刻画根系构型特征，并利用多节点B样条曲线插值，进行植物根系曲面拟合。按照本发明方法对大豆发芽后第18天的植物根系三维构型获得的模拟结果见附图9所示。

实施例2水稻根系的形态构型的原位观察和测定

(1)设计透明的栽培容器和生长介质；

采用一透明圆柱形有机玻璃容器，高20cm，直径12cm，设置有一个可打开的盖子，盖子中间设一个直径为20mm的贯穿圆洞；

水稻培养基为：Yoshida等在1976年改良的水稻营养液+0.15％的Phytagel^TM(W/V)+不同磷处理，所述不同磷处理包括无磷处理或1.0mM KH₂PO₄处理，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节为5.7，按照常规技术采用盐酸或氢氧化钠等试剂进行调节。

Yoshida 1976改良的水稻营养液组成为(μM)：H₃BO₃ 19，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1000，NH₄NO₃ 429，(NH₄)₆Mo7O₂₄·4H₂O 0.52，MnSO₄·H₂O 9.1，CuSO₄·5H₂O 0.16，ZnSO₄·7H₂O 0.15，K₂SO₄513，MgSO₄·7H₂O 1667，Fe-EDTA(Na)36。

每个有机玻璃容器分别装15cm高的培养基，即约1.7L培养基，以使容器内上方留有部分空间供幼苗早期无菌生长，培养基配置步骤同实施例1。

(2)种子灭菌与催芽：

水稻种子用10％双氧水浸泡60分钟，并不时摇动，再用无菌水冲洗3～5次；然后再用70％酒精浸泡10分钟，用无菌水冲洗3～5次。浸于无菌水中，放置在28℃培养箱里暗培养48小时左右出芽后移苗。

水稻幼苗生长期间的平均温度为白天28℃，晚上19℃，相对湿度为80％，光照时间为12小时。

(3)根系图像三维激光扫描：从移苗后第1天到第20天每24小时利用三维激光扫描仪(Roland LPX-1200，Japan)扫描植株根系一次。扫描范围为0°～360°，旋转方向的扫描精度为0.18°，上下移动方向的扫描精度为0.1mm。植物根系三维构型原位动态重建及模拟系统由三维激光扫描仪、计算机和图像分析软件三部分组成。各组份具体功能如下：

第一部分，三维激光扫描仪。采用日本产的Roland LPX-1200三维激光扫描仪，有效扫描范围为130.0mm(直径)×203.2mm(高)，在旋转方向扫描精度最高可达0.18°，在上下移动方向精度最高可达0.1mm。三维激光扫描仪LPX-1200内设有一个旋转台的，旋转台上放置要扫描的植物，放置时需要注意使要扫描的物体中心与旋转台的中心对齐，扫描时旋转台带着植物一起旋转，扫描方式见附图3。三维激光扫描仪利用精确的非接触式激光传感器进行扫描，通过发射激光束到要扫描的植物根系表面，由传感器探测从物体表面反射的光量来测定物体的坐标。三维激光扫描仪的特点是速度快、精度高、操作灵活。

第二部分，计算机。计算机的配置需要Pentium 4以上，内存1GB以上，Windows XP系统，以保证图像分析系统顺利进行。

第三部分，图像分析软件。包括图像采集、重建和模拟，利用三维激光扫描仪结合三维激光扫描仪系统的Dr.PICZA3软件(RolandLPX-1200，Japan)采集植物根系三维构型图像，采集时间随扫描植株根系的大小和扫描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，采集的时间就越大。一般发芽后6天的水稻根系采用扫描精度在旋转方向为0.18°，在上下移动方向精度为0.1mm时，图像扫描时间需要40分钟左右。发芽后12天的水稻根系采用以上相同的精度扫描时需要90分钟左右。按照本发明方法对水稻发芽后第18天三维激光扫描获取的根系三维构型图像见附图8。

由于三维激光扫描仪获得的数据是在三维空间中无规则、随机分布的。其特点是数据量庞大、噪声点多、数据密集、数据点散乱分布(因此称为“点云”数据)，表面存在一些“沙洞”。若采用传统的样条编辑方法模拟，模拟结果不是很理想，见附图4～6所示，不适合直接用于后续曲面重构，附图4三维激光扫描仪获取的离散点；附图5中植物根系存在的“沙洞”，附图6表示利用传统样条编辑方法模拟得到的结果。本发明利用基于广义Hough变换原理的算法对获得的图像进行重建。根据根系的线状特征和天然的连续缓变特征，由各根的中轴线即骨架来刻画根系构型特征，并利用多节点B样条曲线插值，进行植物根系曲面拟合，按照本发明方法对水稻发芽后第18天的植物根系三维构型获得的模拟结果见附图10所示。

采用本发明方法得到的水稻根系生长6、12和18天的形态构型数据框图见附图11～16。图中每个柱子所代表的数据为4个重复的平均值及其标准差，每个柱子上字母不相同表示差异显著(＜0.05)，字母相同则表示差异不显著。

Claims (4)

1.一种用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，设计透明的栽培容器和生长介质；将种子灭菌和催芽，出芽后移苗到所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生长介质中自然生长，用于三维激光扫描仪对根系扫描和观测，其特征在于所述透明的栽培容器为圆柱形有机玻璃容器，容器设置有一个可打开的盖子，盖子中间设置一个贯穿洞；所述生长介质为固体透明培养基，是与植物适应的相应营养液与0.15％Phytagel^TM的混合物；

所述固体透明培养基配置步骤如下：

(A)将培养基搅拌均匀，调节pH值；

有机玻璃容器采用紫外线灭菌1小时，备用；

(B)将培养基在121℃灭菌30分钟；灭菌结束后倒入上述已灭菌的有机玻璃容器内；

(C)培养基静置冷却，凝固。

2.根据权利要求1所述用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，其特征在于所述圆柱形有机玻璃容器高为20cm、直径为12cm；贯穿洞直径为20mm的圆洞。

3.根据权利要求1所述用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，其特征在于所述相应营养液为改良的1/2Hoagland营养液，组成为(μM)：KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O 1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.38，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O 0.57，Fe-EDTA(Na)82，H₃BO₃ 23.13，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.09。

4.根据权利要求1所述用于根系原位动态观察和测定的植物栽培方法，其特征在于所述相应营养液组成为(μM)：H₃BO₃ 19，Ca(NO₃)₂·4H₂O1000，NH₄ NO₃429，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.52，MnSO₄·H₂O9.1，CuSO₄·5H₂O 0.16，ZnSO₄·7H₂O0.15，K₂SO₄513，MgSO₄·7H₂O 1667，Fe-EDTA(Na)36。

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