CN112816512B - 一种沉积物石蜡切片的制作方法 - Google Patents

一种沉积物石蜡切片的制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沉积物石蜡切片的制作方法。本方法先用戊二醛固定沉积物样本，然后经过梯度乙醇脱水、透明处理、浸蜡包埋、切片、烤片，烤片后迅速用聚乙烯醇缩甲醛处理及用离子加湿器吹扫，这可以在切片表面形成一层膜，从而将切片细节保护在内。本方法切出的沉积物切片，结构完整，显示清晰，对观察微生物中微生物形态结构等具有明显的增强效果。

Description

一种沉积物石蜡切片的制作方法
技术领域
本发明属于石蜡切片的制作领域，具体涉及一种沉积物石蜡切片的制作方法。
背景技术
沉积物是水体中重要的环境信息载体，包含丰富的矿物质、有机质以及微生物等。微生物是沉积物中生物量最大的类群，其形态、结构及其生长环境等是影响其环境生态行为的重要因素，因此，对沉积物中微生物进行原位观察就显得尤为重要，沉积物切片可以较好地实现这个目标，然而相关的技术较为缺乏。
沉积物切片目前主要以冰冻切片为主，但目前冰冻切片技术主要应用于常规动植物组织等，由于沉积物颗粒的粘连性较差，远远低于常规动植物组织的粘连性，因此沉积物冰冻切片一般较脆，容易破碎，而且冰冻切片在进行扫描电镜观察时受沉积物介质的影响较大，难以观察到较清晰的微生物形态和结构。
石蜡切片是目前应用得最广泛的组织学常规制片技术，一般用来观察细胞组织形态结构，可长期保存。目前尚未有研究将石蜡切片技术应用于沉积物这种介质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沉积物石蜡切片的制作方法，用于后续的扫描电镜成像观察与研究。本发明通过将石蜡切片引入沉积物中微生物的扫描电镜成像中，以此观察沉积物中的微生物，尤其是长线状微生物。
本发明的沉积物石蜡切片的制作方法，包括以下步骤：
a.取样：用吸管插取沉积物柱状样本，然后用液氮速冻；
b.固定：切开并移除吸管，加入体积分数2.5％戊二醛水溶液固定沉积物柱状样本，在黑暗中固定过夜；
c.浸洗：用pH7.2的0.1M PBS溶液浸洗固定后的样本三次；
d.脱水：用梯度乙醇脱水处理；
e.透明处理：先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理一次，再用二甲苯处理两次；
f.浸蜡包埋：用65℃的石蜡浸蜡处理三次，然后置于包埋盒中冰上包埋；
g.二次包埋：将包埋后的沉积物块修整至切面小于8mm×8mm，随后重复一次步骤f的操作进行二次包埋；
h.修块及切片：将切面修整至小于1cm×1cm后，使用手动轮转式病理切片机连续切片，并在40℃水浴中进行展片，再用多聚赖氨酸包埋的细胞爬片进行贴片；
i.烤片：将切片竖直置于65℃烘箱中烤片；
j.贴膜：将切片在体积分数0.3％的聚乙烯醇缩甲醛水溶液中蘸一下，然后用离子加湿器吹切片使其在表面形成一层微孔滤膜；
k.脱蜡：用二甲苯脱蜡两次；
l.置换：用乙醇置换二甲苯两次，然后用叔丁醇置换二甲苯一次；
m.用冷冻干燥机冻干样本，然后进行扫描电镜观察。
优选，所述的步骤c的浸洗，每次10min；
优选，所述的步骤d的用梯度乙醇脱水处理，是依次用体积分数70％乙醇水溶液、体积分数85％乙醇水溶液、体积分数95％乙醇水溶液、乙醇、乙醇进行脱水处理，每次脱水处理30min。
优选，所述的步骤e，具体为：先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理30min，再用二甲苯处理两次，每次30min
优选，所述的步骤f，具体为：用65℃的石蜡浸蜡处理三次，每次1h；然后置于包埋盒中冰上包埋3h；
优选，所述的步骤h中切片厚度为25μm
优选，所述的步骤k，具体为：用二甲苯脱蜡两次，每次24h；
优选，所述的步骤l，具体为：用乙醇置换二甲苯两次，每次4h；然后用叔丁醇置换二甲苯2h。
在本发明方法中，上述固定沉积物样本的固定液为2.5％戊二醛水溶液，在黑暗中固定过夜。这可以有效地保持沉积物中形态和结构，尤其是本发明关注的微生物的形态结构。
在本发明方法中，上述脱水处理具体包括将固定处理后的沉积物样本依次放入梯度乙醇中处理，梯度乙醇包括70％、85％、95％、100％的乙醇，每次30min，其中100％的乙醇重复处理2次。
在本发明方法中，上述透明处理的透明剂包括二甲苯/乙醇(体积比为1:1)以及二甲苯。透明处理具体包括先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇脱水后的样本进行处理，时间为30min，再将样本置于二甲苯，时间为30min，其中二甲苯处理两次。
在本发明方法中，上述的浸蜡包埋处理具体包括将经过透明处理的沉积物样本在65℃石蜡中浸蜡，浸蜡处理重复三次，每次1h，然后置于包埋盒中冰上包埋，时间为3h。
在本发明方法中，上述的浸蜡包埋后，需要对包埋后的样本进行二次包埋，具体处理包括将包埋后的沉积物块修整至切面小于8mm×8mm，随后按上述方法进行二次包埋。
在本发明方法中，上述的修片和切片处理具体包括将切面修整至小于1cm×1cm后，使用切片机进行连续切片。
在本发明的方法中，上述的切片后还包括对切片依次进行展片、烤片、贴膜、脱蜡、冻干等处理，其中展片具体包括将切片贴片至多聚赖氨酸包埋的细胞爬片上，以便后续扫描电镜观察。
在本发明方法中，上述的烤片具体包括将切片竖直放置，于65℃中烤片，时间为3h。
在本发明方法中，上述的贴膜处理具体包括将烤片处理后的样本迅速用0.3％的聚乙烯醇缩甲醛处理，而后立刻用离子加湿器吹30秒。这个处理可以在切片表面形成一层微孔滤膜，从而将切片细节保护在内。
在本发明方法中，上述的脱蜡处理具体包括将烤片后的载玻片置于二甲苯中处理两次，每次24h。之后用100％乙醇置换二甲苯两次，每次4h，随后叔丁醇置换100％乙醇，每次2h。
本发明有以下优点：
本发明首次将石蜡切片方法引入沉积物中微生物的扫描电镜成像，这大大地扩展了沉积物中微生物形态结构观察的技术方法和手段。
本发明考虑到沉积物颗粒的粘连性远远低于常规动植物组织的粘连性，烤片结束后用体积分数0.3％的聚乙烯醇缩甲醛水溶液来处理，这样可以为了防止在后续的操作中切片发生明显的丢失。
附图说明
图1是实施例1获得的沉积物石蜡切片通过扫描电镜观察沉积物中的长线状微生物的效果图。
图2是对比例1获得的沉积物石蜡切片通过扫描电镜观察沉积物中的长线状微生物的效果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
实施例1的沉积物石蜡切片的制作方法，包括如下依次进行的步骤：
步骤1：取样，用直径约为0.5cm的吸管插取沉积物柱状样本，用液氮速冻10min。
注意，用吸管插取沉积物柱状样本目的是尽量保持样品的原状，以便后续的连续切片制作及成像观察。
步骤2：固定，将样品转移至玻璃六孔板中，轻柔地切开并移除吸管，加入体积分数2.5％戊二醛水溶液，在黑暗中固定过夜。
步骤3：浸洗，用0.1M PBS溶液(pH＝7.2)浸洗固定后的样本三次，每次10min；
步骤4：脱水，用梯度乙醇脱水，依次用体积分数70％乙醇水溶液、体积分数85％乙醇水溶液、体积分数95％乙醇水溶液、无水乙醇、无水乙醇进行脱水处理，每次脱水处理30min；
步骤5：透明处理，先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理30min，再用100％二甲苯处理两次，每次30min；
步骤6：浸蜡包埋，浸蜡采用65℃的石蜡，浸蜡处理三次，每次1h，然后置于包埋盒中冰上包埋3h；
步骤7：二次包埋，将包埋后的沉积物块修整至切面小于8mm×8mm，随后重复步骤6的操作进行二次包埋；
步骤8：修块及切片，用切刀将切面修整至小于1cm×1cm后，使用手动轮转式病理切片机(Leica RM2235,Germany)连续切片，切片厚度为25μm，并在40℃水浴中进行展片，再用多聚赖氨酸包埋的细胞爬片进行贴片；
步骤9：烤片，将切片竖直置于(切勿平放)65℃烘箱中烤片3h；
步骤10：贴膜，烤片结束后，迅速在体积分数0.3％的聚乙烯醇缩甲醛水溶液中蘸一下，而后立刻用离子加湿器吹30秒，使其在切片表面形成一层微孔滤膜，从而将切片细节保护在内；
步骤11：脱蜡，在室温晾干后，然后用100％二甲苯脱蜡两次，每次24h；
步骤12：置换，用100％乙醇置换二甲苯两次，每次4h；随后用100％叔丁醇置换二甲苯，一次2h；
步骤13：用冷冻干燥机冻干样本，最后进行扫描电镜观察。
图1是利用上述方法制作获得的沉积物石蜡切片通过扫描电镜观察到的沉积物中的长线状微生物的效果图。从图上可以看出，本方法切出的沉积物切片，结构完整，显示清晰，对观察微生物中微生物形态结构等具有明显的增强效果。
对比例1
本对比例的沉积物石蜡切片的制作方法，步骤与实施例1基本相同，也包括相同的取样、固定、浸洗、脱水、透明处理、浸蜡包埋、二次包埋、切片、烤片等，不同之处在于完成步骤9的烤片处理后，不进行步骤10的贴膜步骤，即烤片后直接接着进行后续步骤，即脱腊、置换及扫描电镜观察。
图2是利用上述方法制作获得的沉积物石蜡切片通过扫描电镜观察到的沉积物中的长线状微生物的效果图。从图上可以看出，本方法切出的沉积物切片，结构不够完整，显示不够清晰，细节丢失较多。

Claims (1)

1.一种水体中沉积物石蜡切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 取样：用吸管插取沉积物柱状样本，然后用液氮速冻；
b. 固定：切开并移除吸管，加入体积分数2.5%戊二醛水溶液固定沉积物柱状样本，在黑暗中固定过夜；
c. 浸洗：用pH7.2的0.1M PBS溶液浸洗固定后的样本三次，每次10 min；
d. 脱水：用梯度乙醇脱水处理，即依次用体积分数70%乙醇水溶液、体积分数85%乙醇水溶液、体积分数95%乙醇水溶液、无水乙醇、无水乙醇进行脱水处理，每次脱水处理30min；
e. 透明处理：先用体积比为1:1的二甲苯/乙醇处理30 min，再用二甲苯处理两次，每次30 min；
f. 浸蜡包埋：用65ºC的石蜡浸蜡处理三次，每次1 h，然后置于包埋盒中冰上包埋3 h；
g. 二次包埋：将包埋后的沉积物块修整至切面小于8 mm × 8 mm，随后重复一次步骤f的操作进行二次包埋；
h. 修块及切片：将切面修整至小于 1 cm × 1 cm后，使用手动轮转式病理切片机连续切片，切片厚度为25 μm，并在40ºC水浴中进行展片，再用多聚赖氨酸包被的细胞爬片进行贴片；
i. 烤片：将切片竖直置于65ºC烘箱中烤片；
j. 贴膜：将切片在体积分数0.3%的聚乙烯醇缩甲醛水溶液中蘸一下，然后用离子加湿器吹切片使其在表面形成一层微孔滤膜；
k. 脱蜡：用二甲苯脱蜡两次，每次24 h；
l. 置换：用乙醇置换二甲苯两次，每次4 h，然后用叔丁醇置换二甲苯2 h；
m. 用冷冻干燥机冻干样本，然后进行扫描电镜观察沉积物中的微生物。
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