CN114383906A - 一种植物根系石蜡切片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种植物根系石蜡切片的制备方法，属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种植物根系石蜡切片、制片与染色的改良技术。为了解决根尖这类含水量高的幼嫩组织切片制作困难的问题，本发明通过对展片方式、烤片温度、染色及脱水环节进行改进，成功解决烤片过程中细胞结构易变形，染色后脱水时，组织脱色严重的问题。本发明具有如下的有益效果：本发明解决了根系在制作切片过程中的烤片环节易发生的细胞结构不清晰、染色后脱水时组织脱色的问题，有效的提高了制片成功率。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，主要涉及一种植物根系石蜡切片制作方法，具体涉及一种陆地棉根尖石蜡切片制片与染色技术。
背景技术
植物根系是水、肥吸收的关键部位，其能通过自我调节来适应环境的变化，因此研究根系的微观结构对于植物的研究来说是至关重要的。而石蜡切片的制作是进行植物组织细胞微观结构分析的一项技术手段。
常规的石蜡切片制作程序包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片染色等步骤。由于植物根尖属于幼嫩组织，含水量较高，在进行切片制作时的烤片过程中细胞结构易变形，染色后脱水时，组织脱色严重的问题，往往会造成制片失败，而这并不利于观察根尖的微观结构以便后期的植物研究。因此，研究建立细胞结构完整、染色均匀不脱色的根尖石蜡切片制作方法已经成为促进植物细胞根系技术领域研究的一个重要课题。
发明内容
针对现有的石蜡切片方法中存在的上述问题并结合陆地棉根系材料特点，本发明提供了一种植物根系石蜡切片的制备方法。本发明的制作方法使烤片过程中细胞结构清晰、染色后脱水时，避免了组织脱色。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物根系石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：选材、脱水I、透明I、浸蜡、包埋、切片、展片与烤片、脱蜡复水、染色、脱水II、透明II、封片；
所述展片与烤片为：将切片放在装有清水的器皿中，后放入45℃的恒温环境中进行展片；展片完成后，将切片在处于直立或者倾斜状态下45℃的恒温环境烘烤；
所述染色为：用1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水稀释后的稀释液进行染色；
所述脱水II是利用100％酒精进行一次脱水。
优选的，所述选材的具体过程为：取生长8天的新鲜根，从下至上切取1cm根尖放入2mL离心管中，加入1mLFAA固定液，敞开口放入真空泵中，抽真空后，压力维持在0.08MPa，维持10min，取出后常温下静止过夜；所述FAA固定液的组成为：90mL50％酒精、5mL冰醋酸、5mL38％甲醛。
优选的，所述脱水I的具体过程为：将选材后得到的根尖在70％酒精中浸泡1h、85％酒精中浸泡1h、95％酒精中浸泡40min、95％酒精中浸泡40min、100％酒精中浸泡40min、100％酒精中浸泡40min。
优选的，所述透明I的具体过程为：将经过脱水I后得到的根尖依次用无水乙醇:环保透明剂(1:1)浸泡45min、环保透明剂浸泡45min、环保透明剂浸泡45min；所述环保透明剂为上海源叶生物科技有限公司提供，货号：R30148-500mL。
优选的，所述浸蜡的具体过程为：依次将透明I后的根尖在环保透明剂与石蜡混合剂中三次，每次3h、然后接着在石蜡中依次浸泡三次，每次3h；所述环保透明剂与石蜡混合剂中石蜡与环保透明剂的体积比依次为1:3、1:1、3:1。
优选的，所述切片的具体过程为：利用新刀片将经包埋处理好的石蜡块固定在石蜡切片机的标本台上，将切片厚度调整为8μm，后匀速转动转轮进行切片。
优选的，所述展片与烤片的具体过程为：展片的具体操作是：将装有清水(室温25℃)的玻璃皿放在45℃的烤片机上进行温水展片；烤片的过程为：将切片放在染色架上放入烘箱内45℃烘烤24h之后室温静置过夜。
其中，本发明展片方式由现有技术中的水浴锅内温水展片改为装有清水的玻璃皿放在45℃的烤片机上进行温水展片。烤片方式由在传统烤片台上平铺式烤片改为将展片后的切片先放在染色架上，后放入烘箱内45℃烘烤24h，之后室温静置过夜。
其中，本发明与传统技术中将切片直接放到烤片台上平铺式烤片相比，将切片放在染色架上放入烘箱内烘烤，同时将温度由65℃改为45℃。由于65℃是石蜡的熔点，切片在65℃的环境中会瞬间融化，在根尖组织与载玻片没有粘结牢固的情况下，石蜡融化会造成细胞轮廓的严重变形。45℃烘烤切片属于低温烤片，由于温度低于石蜡的熔点，所以在烘烤的过程中，石蜡不会熔化，因此能够有效避免因石蜡熔化造成的细胞轮廓变形的问题。
同时由于切片在染色架上处于直立状态，在重力的作用下，切片与载玻片之间的水分更容易汇聚在一起快速流出，使组织细胞与载玻片粘结的更为牢靠，可有效避免烤片中出现切片周围已经烤干但切片中心仍有大量水分无法蒸发造成切片受到的张力不同导致的切片因受力不均造成的开裂、细胞轮廓变形以及后期脱蜡过程中出现脱片的问题。
优选的，所述染色的过程为：将1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水按照1:20稀释后的稀释液染色，染色16min。
其中，本发明由现有技术中的1％的甲苯胺蓝染色液染色改为将1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水按照1:20稀释后的稀释液染色，染色16min。
其中，稀释后的甲苯胺蓝染色液在染色程度上能满足实验要求，在后期的脱水处理过程中，能够有效避免染色过深的问题，且稀释后能够节省大量染色液。
优选的，所述脱水II的过程为：使用100％酒精脱水3s。
其中，本发明将脱水II的过程由常规的70％(30s)、80％(30s)、90％(30s)、100％(1min)、100％(1min)的酒精梯度脱水改为100％酒精脱水3s。
其中，与现有技术中的按照梯度酒精多次脱水处理相比，本申请的脱水II的方案减少了实验环节，缩短了实验时长，在减少染色组织在酒精中的浸泡时长，有效保护了组织的着色、并且很大程度增加组织细胞的轮廓清晰度。
优选的，所述透明II的具体过程分别为：脱水II操作后，再用环保透明剂浸泡3min。
本发明的有益效果：
本发明提出了一种植物根系石蜡切片的制作方法，改变了常规的在烤片台上平铺式烤片的方式以及烤片温度，解决了烤片过程中切片因温度过高石蜡融化造成的细胞轮廓变形；避免了低温平铺式烤片过程中出现的切片周围已经烤干，但切片中心仍有大量水分无法蒸发，组织细胞与载玻片粘结不牢靠牢靠，切片受力不均造成的组织开裂、细胞轮廓变形以及后期脱蜡过程中出现脱片的问题。本发明在45℃烘箱内烘烤切片时，石蜡不会熔化，切片在染色架上处于直立状态，在重力的作用下，切片与载玻片之间的水分更容易汇聚在一起快速流出，使组织细胞与载玻片粘结的更为牢靠从而避免了细胞轮廓变形的问题。而本发明的染色方式，能够在现有技术的染色基础上，一边保证染色程度能满足实验要求，一边能够解决脱水处理后染色过深需再做分化处理的问题且大大节省了染色液。本发明的脱水II方案与现有的梯度酒精脱水处理相比，首先是减少了实验环节，缩短了实验时长，其次降低了染色组织在酒精中的浸泡时长，并最大程度的保护了组织的着色，更重要的是，有效提高了组织细胞的轮廓清晰度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为陆地棉三江八江大花生长8d主根根尖石蜡切片镜检图；
图2为陆地棉三江八江大花生长8d主根伸长区石蜡切片镜检图；
图3为陆地棉三江八江大花生长8d主根成熟区石蜡切片镜检图；
图4为陆地棉King生长96h正处于侧根萌发时期石蜡切片镜检图；
图5为陆地棉冀棉11号生长8d主根成熟区石蜡切片镜检图；
图6是对比例四第二次脱水时梯度酒精脱水环节过多图像不清晰的镜检图；
图7是对比例一由于平铺式烤片温度过高，造成了细胞轮廓变形的镜检图；
图8是对比例三由于烘箱内烤片温度过高，造成了细胞轮廓变形的镜检图；
图9为陆地棉绿絮1号生长8d主根根尖石蜡切片镜检图；
图10是对比例四由于1％的甲苯胺蓝染色液浓度较高，造成了根冠细胞染色较深，细胞轮廓不清的镜检图；
图11为陆地棉抗5生长8d主根成熟区石蜡切片镜检图；
图12对比例二由于平铺式烤片，切片与载玻片之间的水分无法及时蒸发，切片受热不均导致的受力不均，造成组织开裂、细胞轮廓变形的镜检图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种植物根系石蜡切片的制作方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中，所采用的实验仪器：烘箱、石蜡切片机(LEICA RM2235)染色架、烘箱、烤片机、通风柜、玻璃皿、载玻片、盖玻片、莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)。
本发明实施例中如无特别说明，酒精和甲醛的浓度均为体积浓度。
实施例一
步骤1：选材
选用陆地棉三江八江大花生长8d的主根，从下往上取1cm放入2mL离心管中，加入1mLFAA固定液，敞开口放入真空泵中，抽真空后，压力维持在0.08MPa，维持10min，取出后常温下静置过夜；所述FAA固定液的组成为：50％酒精90mL、冰醋酸5mL、38％甲醛5mL。
步骤2：脱水I
将选材后得到的根尖在70％酒精中浸泡1h、85％酒精中浸泡1h、95％酒精中浸泡40min、95％酒精中浸泡40min、100％酒精中浸泡40min、100％酒精中浸泡40min。
步骤3：透明I
将经过脱水I后得到的根尖依次用无水乙醇:环保透明剂(1:1)浸泡45min、环保透明剂浸泡45min、环保透明剂浸泡45min。
步骤4：浸蜡
将经过透明I操作后得到的根尖在65℃恒温条件下，先在不同浓度的环保透明剂与石蜡的混合剂中浸泡三次，每次三小时、然后依次在石蜡中浸泡三次，每次3h；所述环保透明剂与石蜡混合剂中石蜡与环保透明剂的体积比依次为1:3、1:1、3:1。
步骤5：包埋
趁热将浸蜡后的根尖倒在包埋机65℃的加热板上，将预热过的金属模具盒放在出蜡口下方，滴入少许石蜡，将根尖放入并摆正位置，移至冷却板上，待石蜡稍微凝固后再移至出蜡口下方，将组织包埋盒放在金属模具盒上，填满石蜡后移至冷却台上冷却，待石蜡完全凝固后移去金属模具盒。
步骤6：切片
利用新刀片将经包埋处理好的石蜡块固定在石蜡切片机的标本台上，将切片厚度调整为8μm，后匀速转动转轮进行切片。
步骤7：展片与烤片
展片过程为：在切片完成后，将其放在装有清水的玻璃皿中，然后放在45℃的烤片机上进行温水展片；烤片的过程为：将切片放在染色架上放入烘箱内45℃烘烤24h之后室温静置过夜。
步骤8：脱蜡复水
在展片与烤片操作结束后，目的物依次在以下溶液中浸泡：二甲苯中浸泡20min、二甲苯中浸泡20min、无水乙醇中浸泡5min、95％乙醇中浸泡5min、80％乙醇中浸泡3min、70％乙醇中浸泡3min、60％乙醇中浸泡3min、50％乙醇中浸泡3min、40％乙醇中浸泡3min、30％乙醇中浸泡3min、20％乙醇中浸泡3min、10％乙醇中浸泡3min、蒸馏水中浸泡3min。
步骤9：染色
脱蜡复水结束后，用1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水按照1:20稀释后的稀释液染色16min。
步骤10：脱水II
使用100％酒精脱水3s。
步骤11：透明II
经过脱水II操作后，再用环保透明剂浸泡3min。
步骤12：封片
经过上述透明II处理后，在载玻片上的根尖处滴一滴中性树胶，进行封片。
本实施例制作的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，并采集图像证明，如图1、图2、图3所示，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
实施例二
本实施例中，与实施例一的区别在于，选材时，将实施例一中的陆地棉三江八江大花生长8d的主根换为陆地棉King生长96h的主根，此时侧根正处于萌发时期，所取部位为下胚轴与根连接处往下1.5cm。
本实施例二制作的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，并采集图像证明，如图4所示，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
实施例三
实施例三与实施例一的区别在于，选材时，将实施例一中的陆地棉三江八江大花生长8d的主根换为陆地棉冀棉11号生长8d的主根。
本实施例三制作的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，并采集图像证明，如图5所示，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
实施例四
实施例四与实施例一的区别在于，选材时，将实施例一中的陆地棉三江八江大花生长8d的主根换为陆地棉绿絮1号生长8d的主根。
本实施例四制作的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，并采集图像证明，如图9所示，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
实施例五
实施例五与实施例一的区别在于，选材时，将实施例一中的陆地棉三江八江大花生长8d的主根换为陆地棉抗5生长8d的主根。
本实施例五制作的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，并采集图像证明，如图11所示，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
综上所述，根据实施例一、二、三、四、五分别对陆地棉品种：三江八江大花、King、冀棉11号、绿絮1号、抗5进行石蜡切片制作，从镜检结果图1-图5及图9、图11来看，本发明的技术方案完全适用于陆地棉这一作物。再根据实施例一、二、三、四、五对侧根萌发时期、主根成熟区、伸长区、主根根尖进行的石蜡切片镜检结果图1-5来看，本发明的石蜡切片技术适用于植物根系不同生长期、不同部位。
对比例一：
一种植物根系石蜡切片的制作方法，选取陆地棉冀棉11号生长8d的主根根尖为检测样本，制作方法步骤中，将实施例三中的步骤7的烤片方式在传统烤片台上65℃平铺式烤片，剩余步骤与实施例三完全相同。
根据对比例一方法制得的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，如图7所示，因为其温度过高造成了细胞轮廓变形。将本发明实施例三的镜检图与对比例一的镜检图相比较，发现本发明实施例一的切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
对比例二：
一种植物根系石蜡切片的制作方法，选取陆地棉抗5生长8d的主根为检测样本，制作方法步骤中，将实施例五中的步骤7的烤片方式在传统烤片台上45℃平铺式烤片，剩余步骤与实施例五完全相同。
根据对比例二方法制得的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，如图12所示，因为平铺式的烤片方式使得切片与载玻片之间的水分无法及时蒸发，整个切片受热不均，受力不均，有水的地方张力较大，无水的地方没有张力，最终使得切片被撕裂，造成细胞轮廓变形。将本发明实施例五的镜检图与对比例二的镜检图相比较，发现本发明实施例五的切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰
对比例三：
一种植物根系石蜡切片的制作方法，选取陆地棉冀棉11号生长8d的主根根尖为检测样本，制作方法步骤中，将实施例三中的步骤7的烤片方式替换为在65℃烘箱内烘烤；剩余步骤与实施例三完全相同。
根据对比例三的温度制得的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，如图8所示，因为其温度过高造成了细胞轮廓变形。而将实施例三和对比例三的镜检结果比对，发现本发明设置的45℃使切片组织细胞边界完整，组织影像清晰。
对比例四
一种植物根系石蜡切片的制作方法，选取陆地棉三江八江大花生长8d的主根为检测样本，制作方法步骤中，将实施例一的步骤10中的脱水II的过程替换为70％(30s)、80％(30s)、90％(30s)、100％(1min)、100％(1min)依次进行酒精梯度脱水。剩余步骤与实施例一完全相同。
根据对比例四方法制得的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，如图6所示，可见，其因为酒精脱水环节过多，染色组织在酒精中浸泡时间过长，致使着色组织脱色严重，最终导致细胞轮廓不清晰。而将实施例一和对比例三的镜检结果比对，发现本发明脱水方式所制备得到的镜检图组织透明效果优良，染色清晰度高、轮廓清晰。
对比例五：
一种植物根系石蜡切片的制作方法，选取陆地棉绿絮1号生长8d的主根为检测样本，制作方法步骤中，将实施例四的步骤9中的染色方式替换为利用1％的甲苯胺蓝染色液染色16min。
根据对比例五方法制得的石蜡切片，经使用莱卡正置显微镜(Leica Dm6B)观察，如图10所示，根冠细胞染色较深致使细胞轮廓不清。而将实施例四和对比例五镜检结果比对，发现本发明实施例四的镜检图相对于对比例五的镜检图，切片组织透明效果优良，染色清晰度高，细胞边界完整，组织影像清晰。
综上所述，对比例一、二、三、四、五同样以陆地棉江八江大花、冀棉11号、绿絮1号、抗5生长8d的主根为检测样本，进行石蜡切片制片，但是通过对各因素进行全方位比较，能够明显得到，本发明所改进的制片方式，均取得了显著的技术效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选材、脱水I、透明I、浸蜡、包埋、切片、展片与烤片、脱蜡复水、染色、脱水II、透明II、封片；
所述展片与烤片为：将切片放在装有清水的器皿中，后放入45℃的恒温环境中进行展片；展片完成后，将切片在处于直立或者倾斜状态下45℃的恒温环境烘烤；
所述染色为：用1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水稀释后的稀释液进行染色；
所述脱水II是利用100％酒精进行一次脱水。
2.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述选材为：生长8天的新鲜根，从下至上切取1cm根尖，用FAA固定液进行固定。
3.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱水I为：将选材后得到的样本依次在70％酒精中浸泡1h、85％酒精中浸泡1h、95％酒精中浸泡40min后换新的95％酒精再次浸泡40min然后100％酒精浸泡两次，每次40min。
4.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述透明I为：第一步用无水乙醇与环保透明剂的混合液浸泡45min、第二步用环保透明剂浸泡两次，每次45min；所述无水乙醇与环保透明剂混合液中所述无水乙醇与环保透明剂的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述浸蜡为：第一步先用不同体积比的环保透明剂与石蜡混合剂浸泡，每次3h、第二步再使用石蜡浸泡三次，每次3h；所述环保透明剂与石蜡混合剂中石蜡与环保透明剂的体积比依次为1:3、1:1、3:1。
6.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述切片厚度为8μm。
7.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述展片具体为：将切片放在装有清水的培养皿中，然后放在45℃恒温环境中行展片；
所述烤片具体为：展片后，将所述切片置于染色架上使其处于直立或者倾斜状态，然后将所述染色架置于45℃恒温烤箱烘烤。
8.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述稀释液中1％的甲苯胺蓝染色液与蒸馏水的体积比是1:20；所述染色的时间为16min。
9.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱水II的脱水时间是3s。
10.根据权利要求1所述的一种植物根系石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述透明II为：用环保透明剂浸泡3min。
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