CN115014903A - 一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法。具体包括如下步骤：(1)将授粉后的雌蕊浸没于固定液中固定；(2)将雌蕊浸泡于酒精溶液中，然后洗涤；(3)将雌蕊与NaOH溶液混合软化、洗涤、吸干水分；(4)将雌蕊浸泡在磷酸缓冲液中；(5)将雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入磷酸缓冲液中浸泡；(6)将雌蕊吸干水分后用染色剂染色、镜检。本发明的荧光显微方法极大地弱化了雌蕊自身组织发光的现象，容易获得花粉管在雌蕊内生长的高清晰度影像，对花粉管生长行为的呈现效果非常理想，可用于澳洲坚果品种间杂交亲和性评价，实际应用价值高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法。
背景技术
花粉管作为植物有性生殖过程中雄性个体的重要载体，具有典型的顶端生长特性，而且对细胞间的相互作用以及信号传导起重要作用。花粉管在雌蕊内的生长行为能够精确呈现杂交、自交的亲和性与不亲和性，是研究植物受精过程的重要手段。
澳洲坚果的雌蕊又细又长，柱头又小又窄，花粉管直径不到10μm，需在100倍显微镜条件下进行观测。雌蕊虽然柔软，但雌蕊表皮细胞犹如坚果壳一样坚硬，极难将其软化透明，尝试许多技术均无果，必须对其进行横切后纵切才能通过显微镜观察花粉管生长行为。冰冻切片法和石蜡切片法处理复杂，操作困难，无法在短期内观察大批量授粉雌蕊。澳洲坚果维管束组织发达，花柱引导组织及其它组织自发强荧光，干扰对花粉管的观察，部分自交花柱甚至无法分辨花粉管与花柱其它组织。
花粉管中特有的胼胝质与苯胺蓝中的荧光色素结合，在紫外光下激发出明亮的蓝绿色荧光，利用该原理进行花粉管生长行为研究，在许多植物中已经得到广泛深入研究。但是，几乎没有对澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长行为展开过研究，从而导致澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长过程以及相关生物学研究严重滞后。
因此，如何提供一种易于观察雌蕊内生长行为的花粉管生长行为观测方法，以解决现有技术中无法快速、准确、大批量的制备澳洲坚果花粉管玻片的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，本发明的目的是解决澳洲坚果花粉管在雌蕊内生长行为难以观察的问题，克服现有技术无法快速、清晰、大批量观察澳洲坚果花粉管原位生长行为的缺陷，提供一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，包括如下步骤：
(1)将授粉后的雌蕊浸没于固定液中固定；
(2)将步骤(1)得到雌蕊浸泡于酒精溶液中，然后洗涤获得洗涤后的雌蕊；
(3)将步骤(2)得到洗涤后的雌蕊与NaOH溶液混合软化、洗涤、吸干水分；
(4)将步骤(3)得到雌蕊浸泡在磷酸缓冲液中；
(5)将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入磷酸缓冲液中浸泡；
(6)将步骤(5)得到雌蕊吸干水分后用染色剂染色、镜检；
所述步骤(3)不同授粉时期的雌蕊软化时间不同，雌蕊授粉后1～3d，软化时间为2h；雌蕊授粉后4～7d，软化时间为3h；雌蕊授粉后8～12d，软化时间为4h。
优选的，步骤(1)所述固定液包括酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为84～94：4～8：3～7；所述酒精溶液的体积分数为55～65％。
优选的，步骤(1)所述固定液与雌蕊的体积比为15～25:1；所述固定的时间为42～54h。
优选的，步骤(3)所述的NaOH溶液的浓度为1.5～2.5mol/L；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为35～45:1。
优选的，步骤(3)所述软化的温度为28～32℃。
优选的，步骤(6)所述染色剂为苯胺蓝和磷酸二氢钾的混合液；所述苯胺蓝的质量分数0.4～0.6％；所述磷酸二氢钾的质量分数0.005～0.015％；所述染色剂的pH为9.8～10.2。
优选的，步骤(6)不同授粉时期的雌蕊染色时间不同，雌蕊授粉后1～3d，染色时间为7～10min；雌蕊授粉后4～12d，染色时间为3～5min。
优选的，步骤(2)依次使用体积分数为55～65％、35～45％、15～25％的酒精溶液浸泡雌蕊；雌蕊在每一种浓度的酒精溶液的浸泡时间独立为8～12min。
优选的，步骤(2)所述洗涤的时间为25～35min；步骤(3)所述洗涤的次数为2～4次，每一次洗涤的时间为8～12min。
优选的，步骤(5)和(6)所述磷酸缓冲液的pH独立为6.9～7.1；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比独立为8～12:1；步骤(3)和(6)所述吸干水分是将所述雌蕊置于吸水纸上10～70s。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明的荧光显微方法极大地弱化了雌蕊自身组织发光的现象，容易获得花粉管在雌蕊内生长的高清晰度影像，对花粉管生长行为的呈现效果非常理想，可用于澳洲坚果品种间杂交亲和性评价，实际应用价值高。
2)本发明根据澳洲坚果花柱表皮细胞特性，改进了FAA固定液配方，把固定液中的酒精浓度改为60％，极大地改变了待检材料的固定效果，并有效地消除了花柱组织自发荧光的影响。本发明使用体积分数为60％的乙醇，软化和染色效果要好一些。乙醇浓度高，材料脱水严重，浓度低，材料内水分脱不完全，可能对软化和染色效果都受到影响。
3)根据待检材料的不同时期，本发明设定NaOH溶液为2mol/L，软化时间也根据不同时期雌蕊，固定在2～4h之内，极大地缩短了处理材料的时间，能够使待检材料迅速软化的同时雌蕊内部组织不受损，保证材料的完整性。
4)本发明根据澳洲坚果雌蕊中花柱引导组织，维管束等组织的性质，首先调节待检材料pH值至中性，后通过改进染色液试剂配比、浓度、pH值，以及不同待检材料染色时间，达到花粉管在荧光显微镜下高清晰度的最佳条件。本发明极大地弱化了花柱组织自发荧光，使花粉管的黄绿色荧光一枝独秀。
5)本发明操作简单、快速、精确，只需采用徒手切片法即可观测澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长行为，而且可以在短期内观察大批量雌蕊的花粉管，对花量大，坐果率低作物的生殖生物学研究具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是澳洲坚果花粉管在雌蕊内生长行为的荧光显微观测的操作流程图。
图2(A-C)是采用传统方法处理对比例1，澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长情况(100倍)，A图自发红色荧光(授粉后3d的雌蕊，染色7min；)B(授粉后5d的雌蕊，染色5min)、C图(授粉后5d的雌蕊，染色5min)花粉管和花柱组织均发强荧光，不易区分。
图3(A-B)是采用传统方法处理对比例1澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长情况(100倍)，A图花柱表皮易碎，维管束发强荧光，花粉管不易区分；B图花柱内部组织分离，混乱。
图4(A-D)是采用本发明的荧光显微处理方法的澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长情况(100倍)，A–D图是授粉后不同时期雌蕊内不同部位花粉管的生长情况。花粉管发强蓝绿色荧光，其他组织几乎不发光，花粉管与花柱其他组织边界清晰。图4中的A(实施例4：授粉后7d的雌蕊，染色5min)、B(实施例3：授粉后5d的雌蕊，染色5min)是雌蕊柱头花粉管生长行为，图4中的C(实施例5：授粉后9d的雌蕊，染色3min)是雌蕊中段花粉管生长行为；图4中的D(实施例6：授粉后12d的雌蕊，染色3min)是雌蕊下半部及子房内花粉管生长情况。
具体实施方式
本发明提供了一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，包括如下步骤：
(1)将授粉后的雌蕊浸没于固定液中固定；
(2)将步骤(1)得到雌蕊浸泡于酒精溶液中，然后洗涤获得洗涤后的雌蕊；
(3)将步骤(2)得到洗涤后的雌蕊与NaOH溶液混合软化、洗涤、吸干水分；
(4)将步骤(3)得到雌蕊浸泡在磷酸缓冲液中；
(5)将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入磷酸缓冲液中浸泡；
(6)将步骤(5)得到雌蕊吸干水分后用染色剂染色、镜检；
在本发明中，所述步骤(3)不同授粉时期的雌蕊软化时间不同，雌蕊授粉后1～3d，软化时间为2h；雌蕊授粉后4～7d，软化时间为3h；雌蕊授粉后8～12d，软化时间为4h。
在本发明中，步骤(1)所述固定液包括酒精溶液、冰醋酸和甲醛；
在本发明中，步骤(1)所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为84～94：4～8：3～7；优选为86～92：5～7：4～6；进一步优选为88～90：6：5；更优选为89：6：5。
在本发明中，步骤(1)所述酒精溶液的体积分数为55～65％；优选为57～63％；进一步优选为59～61％；更优选为60％。
在本发明中，步骤(1)所述固定液与雌蕊的体积比为15～25:1；优选为17～23:1；进一步优选为19～21:1；更优选为20:1。
在本发明中，步骤(1)所述固定的时间为42～54h；优选为44～52h；进一步优选为46～50h；更优选为48h。
在本发明中，步骤(3)所述的NaOH溶液的浓度为1.5～2.5mol/L；优选为1.7～2.3mol/L；进一步优选为1.9～2.1mol/L；更优选为2mol/L。
在本发明中，步骤(3)所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为35～45:1；优选为37～43:1；进一步优选为39～41:1；更优选为40:1。
在本发明中，步骤(3)所述软化的温度为28～32℃；优选为29～31℃；进一步优选为30℃。
在本发明中，步骤(6)所述染色剂为苯胺蓝和磷酸二氢钾的混合液。
在本发明中，步骤(6)所述苯胺蓝的质量分数0.4～0.6％；优选为0.5％。
在本发明中，步骤(6)所述磷酸二氢钾的质量分数0.005～0.015％；优选为0.007～0.013％；进一步优选为0.009～0.011％；更优选为0.01％。
在本发明中，步骤(6)所述染色剂的pH为9.8～10.2；优选为9.9～10.1；进一步优选为10。
在本发明中，步骤(6)不同授粉时期的雌蕊染色时间不同，雌蕊授粉后1～3d，染色时间为7～10min；优选为8～9min；进一步优选为9min。
在本发明中，步骤(6)雌蕊授粉后4～12d，染色时间为3～5min；优选为4min。
在本发明中，步骤(2)依次使用体积分数为55～65％、35～45％、15～25％的酒精溶液浸泡雌蕊；优选为依次使用体积分数为57～63％、37～43％、17～23％的酒精溶液浸泡雌蕊；进一步优选为依次使用体积分数为59～61％、39～41％、19～21％的酒精溶液浸泡雌蕊；更优选为依次使用体积分数为60％、40％、20％的酒精溶液浸泡雌蕊。
在本发明中，雌蕊在每一种浓度的酒精溶液的浸泡的时间独立为8～12min；优选为9～11min；进一步优选为10min。
在本发明中，步骤(2)所述洗涤的时间为25～35min；优选为27～33min；进一步优选为29～31min；更优选为30min。
在本发明中，步骤(3)所述洗涤的时间为8～12min；优选为9～11min；进一步优选为10min。
在本发明中，步骤(3)所述洗涤的次数为2～4次；优选为3次。
在本发明中，步骤(5)和(6)所述磷酸缓冲液的pH独立为6.9～7.1；优选为7。
在本发明中，步骤(5)和(6)所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比独立为8～12:1；优选为9～11:1；进一步优选为10:1。
在本发明中，步骤(3)和(6)所述吸干水分是将所述雌蕊置于吸水纸上10～70s；优选为30～50s；进一步优选为40s。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后1d的雌蕊浸没于固定液中固定42h；固定液与雌蕊的体积比为15:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为65％、45％、25％于酒精溶液中，每个浓度浸泡8min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤25min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为1.5mol/LNaOH溶液混合，加入到100mL的丝口瓶中水浴，温度为28℃水浴2h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤2次，每次洗涤8min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为35:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为6.9磷酸缓冲液中0.5h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为8:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为6.9磷酸缓冲液中浸泡0.5h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为8:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上20s，用染色剂(质量分数0.4％苯胺蓝和质量分数0.005％磷酸二氢钾的混合液，pH为9.8)染色7min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为55％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为84：4：3。
实施例2
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后12d的雌蕊浸没于固定液中固定54h；固定液与雌蕊的体积比为25:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为55％、35％、15％于酒精溶液中，每个浓度浸泡12min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤25～35min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为2.5mol/LNaOH溶液混合，加入100mL的丝口瓶中水浴，温度为32℃水浴4h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤4次，每次洗涤12min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为45:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为7.1磷酸缓冲液中1.5h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为12:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为7.1磷酸缓冲液中浸泡1.5h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为12:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上60s，用染色剂(质量分数0.6％苯胺蓝和质量分数0.015％磷酸二氢钾的混合液，pH为10.2)染色5min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为65％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为94：8：7。
实施例3
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后5d的雌蕊浸没于固定液中固定48h；固定液与雌蕊的体积比为20:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为60％、40％、20％于酒精溶液中，每个浓度浸泡10min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤30min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为2mol/LNaOH溶液混合，加入100mL的丝口瓶中水浴，温度为30℃水浴3h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤3次，每次洗涤10min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为40:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为7磷酸缓冲液中1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为7磷酸缓冲液中浸泡1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上20s，用染色剂(质量分数0.5％苯胺蓝和质量分数0.01％磷酸二氢钾的混合液，pH为10)染色5min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为60％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为89：6：5。
实施例4
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后7d的雌蕊浸没于固定液中固定48h；固定液与雌蕊的体积比为20:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为60％、40％、20％于酒精溶液中，每个浓度浸泡10min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤30min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为2mol/LNaOH溶液混合，加入100mL的丝口瓶中水浴，温度为30℃水浴3h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤3次，每次洗涤10min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为40:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为7磷酸缓冲液中1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为7磷酸缓冲液中浸泡1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上20s，用染色剂(质量分数0.5％苯胺蓝和质量分数0.01％磷酸二氢钾的混合液，pH为10)染色5min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为60％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为89：6：5。
实施例5
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后9d的雌蕊浸没于固定液中固定48h；固定液与雌蕊的体积比为20:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为60％、40％、20％于酒精溶液中，每个浓度浸泡10min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤30min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为2mol/LNaOH溶液混合，加入100mL的丝口瓶中水浴，温度为30℃水浴4h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤3次，每次洗涤10min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为40:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为7磷酸缓冲液中1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为7磷酸缓冲液中浸泡1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上20s，用染色剂(质量分数0.5％苯胺蓝和质量分数0.01％磷酸二氢钾的混合液，pH为10)染色3min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为60％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为89：6：5。
实施例6
一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，步骤如下：
(1)雌蕊采集：将授粉后12d的雌蕊浸没于固定液中固定48h；固定液与雌蕊的体积比为20:1；
(2)洗涤：将步骤(1)得到雌蕊依次浸泡体积分数为60％、40％、20％于酒精溶液中，每个浓度浸泡10min，然后用500mL纯净水中进行浸泡洗涤30min；
(3)软化：将步骤(2)得到雌蕊与浓度为2mol/LNaOH溶液混合，加入100mL的丝口瓶中水浴，温度为30℃水浴4h，然后将雌蕊放入500mL烧杯中，用纯净水浸泡洗涤3次，每次洗涤10min、将所述雌蕊置于吸水纸上60s；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为40:1。
(4)调节材料pH值：将步骤(3)得到雌蕊浸泡在pH为7磷酸缓冲液中1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(5)徒手切片：将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入pH为7磷酸缓冲液中浸泡1h；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比为10:1；
(6)染色：将步骤(5)得到雌蕊置于吸水纸上20s，用染色剂(质量分数0.5％苯胺蓝和质量分数0.01％磷酸二氢钾的混合液，pH为10)染色3min；
(7)荧光显微观测：将染色后的雌蕊取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，为保持材料完整性，不能用力压，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察。
步骤(1)所述固定液包括体积分数为60％的酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为89：6：5。
对比例1：常规方法
1)雌蕊采集：采集授粉后不同时间点的雌蕊，浸没于FAA固定液中固定24h，FAA固定液的体积是处理材料的20倍，FAA固定液使用70％的乙醇溶液、冰醋酸和甲醛，体积比为89:6:5；
2)洗涤：取步骤1)的雌蕊，经过各级酒精过渡到超纯水中，酒精浓度依次为70％、50％、30％；
3)软化：将步骤2)的雌蕊放入100mL的丝口瓶中，加3mol/L的NaOH溶液，丝口瓶置于室温条件中，软化3h后取出；
4)洗涤：将步骤3)的雌蕊放入500mL烧杯中，用超纯水进行洗涤；
5)徒手切片：将步骤4)中的雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，使用小称量瓶，单独摆放单根雌蕊；
6)染色：将步骤5)切开后的雌蕊置于吸水纸中20s后放入苯胺蓝染色液中进行染色(染色液的配制：质量分数0.1％苯胺蓝+0.01％磷酸二氢钾)，根据雌蕊的不同时期染色时间在1-40min之间；
7)荧光显微观测：将步骤7)染色好的待检材料取出置于吸水纸20s，去除多余染液，然后置于载玻片上，滴加70％甘油，盖玻片压片，子房和柱头分别制片，在紫外光下进行荧光显微观察(图2、图3)。
从图2-A可知，常规方法下澳洲坚果雌蕊组织叶绿素自发红色荧光，影响观察效果。图2-B是雌蕊柱头，图2-C是雌蕊的中间部分，常规方法下，雌蕊的花柱内部组织、维管束、花粉管均具有很强的荧光，几乎无法辨认花粉管。常规方法下，图3-A花柱表皮易碎，维管束发强荧光，花粉管不易区分；B图花柱内部组织分离，混乱。FAA固定液酒精浓度过高以及NaOH浓度过高或者处理时间过长均会造成此种现象。
图4(A-D)是采用本发明的荧光显微处理方法的澳洲坚果花粉管在雌蕊内的生长情况(100倍)，A–D图是授粉后不同时期雌蕊内不同部位花粉管的生长情况。花粉管发强蓝绿色荧光，其他组织几乎不发光，花粉管与花柱其他组织边界清晰。图4中的A(实施例4：授粉后7d的雌蕊，染色5min)、B(实施例3：授粉后5d的雌蕊，染色5min)是雌蕊柱头花粉管生长行为，图4中的C(实施例5：授粉后9d的雌蕊，染色3min)是雌蕊中段花粉管生长行为；图4中的D(实施例6：授粉后12d的雌蕊，染色3min)是雌蕊下半部及子房内花粉管生长情况。由此可以看出，本发明极大地弱化了花柱组织自发荧光，使花粉管的黄绿色荧光一枝独秀。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种澳洲坚果花粉管生长行为观测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将授粉后的雌蕊浸没于固定液中固定；
(2)将步骤(1)得到雌蕊浸泡于酒精溶液中，然后洗涤获得洗涤后的雌蕊；
(3)将步骤(2)得到洗涤后的雌蕊与NaOH溶液混合软化、洗涤、吸干水分；
(4)将步骤(3)得到雌蕊浸泡在磷酸缓冲液中；
(5)将步骤(4)得到雌蕊于中间位置进行横切，使雌蕊上半部柱头与下半部子房分开，然后再纵切成两半，再次放入磷酸缓冲液中浸泡；
(6)将步骤(5)得到雌蕊吸干水分后用染色剂染色、镜检；
所述步骤(3)不同授粉时期的雌蕊软化时间不同，雌蕊授粉后1～3d，软化时间为2h；雌蕊授粉后4～7d，软化时间为3h；雌蕊授粉后8～12d，软化时间为4h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述固定液包括酒精溶液、冰醋酸和甲醛；所述酒精溶液、冰醋酸和甲醛的体积比为84～94：4～8：3～7；所述酒精溶液的体积分数为55～65％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述固定液与雌蕊的体积比为15～25:1；所述固定的时间为42～54h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的NaOH溶液的浓度为1.5～2.5mol/L；所述NaOH溶液和雌蕊的体积比为35～45:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述软化的温度为28～32℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述染色剂为苯胺蓝和磷酸二氢钾的混合液；所述苯胺蓝的质量分数0.4～0.6％；所述磷酸二氢钾的质量分数0.005～0.015％；所述染色剂的pH为9.8～10.2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)不同授粉时期的雌蕊染色时间不同，雌蕊授粉后1～3d，染色时间为7～10min；雌蕊授粉后4～12d，染色时间为3～5min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)依次使用体积分数为55～65％、35～45％、15～25％的酒精溶液浸泡雌蕊；雌蕊在每一种浓度的酒精溶液的浸泡时间独立为8～12min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述洗涤的时间为25～35min；步骤(3)所述洗涤的次数为2～4次，每一次洗涤的时间为8～12min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)和(6)所述磷酸缓冲液的pH独立为6.9～7.1；所述磷酸缓冲液与雌蕊的体积比独立为8～12:1；步骤(3)和(6)所述吸干水分是将所述雌蕊置于吸水纸上10～70s。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116686703A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-09-05 | 广西南亚热带农业科学研究所 | 一种澳洲坚果杂交与铯辐射创制新种质的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN116686703A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-09-05 | 广西南亚热带农业科学研究所 | 一种澳洲坚果杂交与铯辐射创制新种质的方法 |
| CN116686703B (zh) * | 2023-03-20 | 2024-04-26 | 广西南亚热带农业科学研究所 | 一种澳洲坚果杂交与铯辐射创制新种质的方法 |
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