DE102018217023A1

DE102018217023A1 - Verfahren zur Erlangung von Pflanzenfasern ausgehend von Isolierung und Kultur von Meristemzellen

Info

Publication number: DE102018217023A1
Application number: DE102018217023.1A
Authority: DE
Inventors: Lucia Atehortua Garces; Osman Dario Fernandez Betin; Andres Dario Lara Estrada; Carlos Enrique Musklus Lopez; Esther Julia Naranjo Gomez; Oriana Parra Zuleta
Original assignee: Super Bac - Protecao Ambiental SA; Super Bac Protecao Ambiental S A; Universidad de Antioquia UdeA
Current assignee: Superbac Biotechnology Solutions SA Br; Universidad De Antioquia Co
Priority date: 2017-10-04
Filing date: 2018-10-04
Publication date: 2019-04-04
Anticipated expiration: 2038-10-05
Also published as: SE1851199A1; CN109609433A; CA3019778A1; BR102018070391A2; US20190100726A1; RU2018134913A; DE102018217023B4; CN109609433B; CO2017010115A1; JP2019088271A

Abstract

Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erlangung von Pflanzenfasern von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes von Pflanzenarten. Das Verfahren basiert auf Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes, auf deren Kultur und Vermehrung sowie auf die Induktion von faserähnlichen Strukturen zwecks Produktion von Fasern. Der Erfindungsprozess ermöglicht überraschenderweise die Erlangung von Pflanzenfasern unter Laborbedingungen von isolierten Kambialzellen des Xylemgewebes und bietet damit eine Alternative zur Produktion von Fasern von Pflanzen.

Description

ARBEITSFELD DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf biotechnologische Prozesse, besonders die In-vitro-Vermehrung von Kambialzellen des Xylemgewebes und deren Umwandlung in Industrieprodukte. Die Erfindung bezieht sich spezifisch auf die Isolierung und Kultur von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes und auf die spätere Erlangung von Fasern ausgehend von Zellkulturen.
ERFINDUNGSGESCHICHTE
Von den industriellen Tätigkeiten ist Papierherstellung eine derjenigen, welche die Umwelt am meisten negativ beeinflussen, da sämtliche Schritte des Verfahrens potentielle Schäden verursachen. Der erste Impakt auf die Umwelt ist die Umsetzung des Rohstoffes. Für den wachsenden Papierverbrauch wird eine größere Menge Bäume benötigt, um Zellstoff zu erlangen, und diese bestehen in vielen Fällen aus Monokulturen, die im Allgemeinen die Bodenproduktivität verringern. Eine weitere Quelle von Bäumen für die Papierindustrie sind Naturwälder, was Abholzung und Beeinträchtigung des Ökosystems mit sich bringt und somit die natürliche Kontrolle der Treibhausgase deutlich verringert.
Eine Alternative zu diesen Problemen wäre die In-vitro-Kultur von Pflanzenzellen und die Herstellung im Labor von Fasern, welche die Bedürfnisse der Papierindustrie und solche der auf Cellulosewaren bezogenen Industrien decken könnte. Somit würde die Abholzung vermieden und die Umweltverschmutzung, die durch die Aufbereitung zur Umwandlung des Holzgewebes in Zellstoff entsteht, teilweise verringert. Außerdem könnten in dieser Weise Fasern unabhängig von Umwelt- und Klimafaktoren hergestellt werden.
In der Fachliteratur bestehen jedoch bisher weder Berichte über Verfahren bzgl. der Kultur von meristematischen Kambialzellen vom Xylemgewebe noch über die Herstellung von Fasern daraus. Die erste Einschränkung bei der Entwicklung einer solchen Technik ist das Auffinden von geeigneten Zellkulturen, also solche, die fähig sind, sich in Fasern zu verwandeln.
Ogita, S. et al. (Ogita, S; Nomuro T., Kishimoto T, Kato E. 2012. A novel xylogenenic suspension culture model for exploring lignification in Phyllostachys bamboo. Plant Methods. 8:40 2Kumar A, et.ao. 1991. Morphogenesis response of cultured cells of cambial origin of a mature tree. Dalbergia sissoo Roxb. Plant Cell Rep. 9(12): 703-706.) stellen ein Nährmedium vor, welches es ermöglicht, Pflanzenzellen in Suspension zu halten zwecks Untersuchung des Verholzungsverfahrens, besonders in Bezug auf Bambus. Kumar et al.2 führten eine Sämlingsregeneration durch, ausgehend von einer Kambialzellsuspension aus Bäumen der Art Dalbergia sissoo. Die Ergebnisse zeigten die Entstehung einer Sprossendifferenzierung.
In ähnlicher Weise zeigt das Dokument US 8,24,230 ein Verfahren zur Isolierung und Erlangung einer homogenen Zelllinie kambialen Ursprungs mit der Fähigkeit, sich zu teilen. Solche Zellen werden ab einem Gewebe erlangt, welches das Kambium einer krautigen Pflanze enthält, insbesondere Speicherungswurzeln.
Trotzdem bestehen derzeit keinerlei Berichte über die Zellkultur von Holzarten; von der Umwandlung dieser Zellkulturen in Fasern ganz zu schweigen.
Dazu kommt eine wichtige Einschränkung bei der In-vitro-Entwicklung von Fasern, namentlich wegen der geringen Kenntnisse in Bezug auf die Biologie der Faserbildung. Fasern sind Einzelzellen, die sowohl dem Phloem als auch dem Xylem angehören. Ihre Form ist breit und sie weisen eine sekundäre dicke, hölzerne Zellwand auf sowie spitze Extremitäten ab einer Falte am Ende derselben. Die Identifizierung der Fasern in den ersten Schritten der Differenzierung ist schwierig und hängt vom Entwicklungsgrad sowie von den Eigenschaften ihrer Lage im Pflanzenorgan ab, außer der Anwesenheit von Merkmalen wie das längliche Format und der Umfang des Durchmessers, die typisch sind für prokambiale und kambiale Zellen.
Desweiteren wurden keine biochemischen, genetischen oder molekularen Markierer der vorzeitigen Entwicklung von Fasern berichtet, aufgrund der Schwierigkeit, Fasern in den Anfangsphasen zu erkennen und zu erlangen. Wenn die Zellfaktoren, welche die Determination der Faser spezifizieren, noch in den sehr vorzeitigen Differenzierungsschritten beobachtet werden, haben sie womöglich ihre Tätigkeit bereits beendet.
Es besteht deshalb im Stand der Technik die Notwendigkeit eines Verfahrens zur Erlangung von Fasern aus Pflanzenzellen, wobei die Identifizierung von geeigneten Zellkulturen, deren Vermehrung, und schließlich die Erlangung von Fasern zum Gebrauch in der Papierindustrie u.a. erfolgt.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung löst überraschenderweise die Probleme der vorigen Technik, mittels Verfügbarmachung eines Verfahrens zur Erlangung von Fasern ausgehend von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes von Pflanzenarten. Das Erfindungsverfahren beinhaltet:

(a) Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen von Pflanzen;
(b) Vermehrung der isolierten meristematischen Kambialzellen;
(c) Induktion der Produktion von faserähnlichen Strukturen ausgehend von meristematischen Kambialzellkulturen;
(d) Produktion von Fasern von faserähnlichen Strukturen.

Vorteilhaft bei diesem Erfindungsverfahren ist die Möglichkeit, Fasern In-vitro mittels biotechnischer Verfahren zu erlangen, Zellen mit faserähnlichen Struktur zu induzieren (hier „Protofaser“ genannt) und schlussendlich Fasern zwecks industrieller Anwendung zu erlangen.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes von Pflanzenarten, welche die Färbung von herkömmlichem oder reaktivem Pflanzenstoff beinhaltet, sowie auf tangentiale Schnitte an verschiedenen Höhen der Pflanze, Identifizierung der relevanten Zellen mittels Mikroskop und Erlangung von Explantaten zwecks Einführung in ein enzymhaltiges Nährmedium.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes, wobei die Zellen unter geeigneten Bedingungen zwecks späterer Differenzierung gehalten werden. Dieses Verfahren zur Vermehrung von Kambialzellen beinhaltet die Suspension der isolierten Kambialzellen in einem Nährmedium, die Erzeugung einer stabilen Suspension sowie die Subkultur der Suspension in einem frischen Nährmedium.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Erlangung von faserähnlichen Strukturen, ausgehend von Kambialzellkulturen des Xylemgewebes. Dabei erfolgt eine Suspension der Kambialzellen des Xylemgewebes in einem ersten Nährmedium, eine neue Suspension in einem zweiten Nährmedium, das Beibehalten in Suspension während einer ersten Induktionsphase, die spätere Trennung der Zellen und schlussendlich das Hinzufügen eines zweiten Nährmediums sowie das Beibehalten der Suspension unter Rühren während einer zweiten Induktionsphase.
Die Verfahren vorliegender Erfindung beinhalten ebenfalls die transkriptomische Analyse sowohl der Kambialzellen als auch der faserähnlichen Strukturen (Protofasern).
Figurenliste

1 zeigt Schnitte 4 mm unter der Stammspitze, ohne Färbung. A: Querschnitt 100X. B: Tangentialer Längsschnitt 100X.
2 zeigt tangentiale Schnitte von A: Färbung des Xylems mit rosa Anilin und B: Färbung des Xylems mit blauem Anilin 40X.
3 zeigt Schnitte unter der Stammspitze mit Färbung mit einem assistierten Markierer aus NBT-Lignin. A: Querschnitt zu 100X. B: Tangentialschnitt zu 100X.
4 zeigt die Beobachtung der Zellviabilität. A: Auf hellem Feld. B: Im Fluoreszenzfilter.
5 entspricht: A: Meristemzellen aus dem Xylemkambium: gerundet, nukleiert und vakuoliert, von hellgelber Farbe, beobachtet auf hellem Feld, 40X. B: Meristemzellen abgeleitet vom vaskulären Kambium mit FDA-Viabilität, 40X.
6 zeigt Meristemzellen abgeleitet vom vaskulären xylematischen Kambium. A: Zellen beobachtet bei DIC 40X. B: Zellen beobachtet bei polarisiertem Licht zu 40X. C-D: Zellen gefärbt mit Calcoflour, mit vorzeitigem Beginn der Zelldifferenzierung zwecks Erzeugung einer Protofaser, 40X.
7 zeigt den Beginn der Faserbildung vonb Meristemzellen abgeleitet vom vaskulären Kambium. A: Helles Feld. B: DIC. C: Polarisiertes Licht 40X.
8 zeigt den Beginn einer faserähnlichen Struktur, Protofaser, von Meristemzellen abgeleitet vom xylematischen vaskulärem Kambium. A: In Septa getrennte Protofaser mit gut definierten Kammern, mit wenigstens 4 Kernen (in den Kreisen angezeigt), entstehend von den in Ausweitung befindlichen Meristemzellen. B: Aktive und fähige Protofaser, FDA, 40X.
9 zeigt eine Protofaser in symplastischem Wachstum. A: Gefärbt mit Calcoflour, die Anwesenheit von Cellulose zeigend. B: DIC. C: Polarisiertes Licht. Bei Letzterem können die stark lichtbrechenden Enden beobachtet werden, ein deutlicher Hinweis auf die Anwesenheit von kristalliner Cellulose und womöglich Neupositionierung der Muskelfibrillen zwecks intrusivem Wachstum, 40X.
10 zeigt Protofasern in symplastischem Wachstum mit beginnender Ausweitung an den Enden. A: DIC. B: Polarisiertes Licht, 40X.
11 zeigt Protofasern im Beginn des intrusiven Wachstums. A: Erweiterte Protofaser mit Wänden im äußerlichen Verdickungsprozess. B: Erweiterte Protofaser, den Beginn eines intrusiven Wachstums an beiden Enden zeigend, 40X.
12 zeigt eine Protofaser in Intrusion und Verdickung der Zellwand, wahrscheinlich im Ablagerungsprozess der sekundären Ligninwand, DIC bei 100X.
13 zeigt die Differentialzentrifugation des Nährmediums der Protofasern.
14 zeigt die Kultur von E. grandis unter Treibhausbedingungen.
15 zeigt ein Beispeil von Färbung von E. grandis nach dem Erfindungsverfahren.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erlangung von Pflanzenfasern ab meristematischen Kambialzellen des Xylems, mit nachstehenden Schritten:

(a) Identifizierung und Isolierung von pflanzlichen meristematischen Kambialzellen von Xylem;
(b) Vermehrung der isolierten meristematischen Kambialzellen;
(c) Induktion der Produktion von faserähnlichen Strukturen (Protofasern) ausgehend von meristematischen Kambialzellkulturen;
(d) Produktion von Fasern von faserähnlichen Strukturen (Protofasern).

In dieser Weise ermöglicht das Erfindungsverfahren die Erlangung von Fasern von isolierten meristematischen Kambialzellen des Xylems unter Laborbedingungen, wobei solche Fasern denjenigen Industrien zu Nutze kommen, die faserhaltige Celluloserohstoffe anwenden, z. B. der Papierindustrie.
Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgt Schritt (a) dieses Verfahrens zur Erlangung von Pflanzenfasern mittels selektiver Zellfärbung. Diese Färbung ermöglicht die genaue und spezifische Ortung der meristematischen Kambialzellen des Xylems, welche sich für Vermehrung und Differenzierung in faserähnliche Strukturen, den Protofasern, eignen. Nach der Färbung erfolgt die Isolierung der Zellen mittels histologischen Schnitten an denjenigen Pflanzenteilen, wo sich die geeigneten Kambialzellen befinden.
Nach den Schnitten werden die Zellen vom enthaltenden Gewebe isoliert und zu einem ersten Nährmedium unter In-vitro-Bedingungen gebracht zwecks Vermehrung, laut Schritt (b).
In bevorzugter Weise enthält dieses erste Nährmedium Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Phytohormone, die zu diesem ersten Nährmedium gehören, ausgewählt aus auxin-, zytokin-, gibberellin-, ethylen- und jasmonsäureähnlichen Verbindungen und aus einer Mischung derselben.
Nach einer Ausführung der Erfindung enthalten die Makronährstoffe des ersten Nährmediums Stickstoff, Kalzium, Magnesium, Kalium und Phosphor. In bevorzugter Weise enthalten die Mikronährstoffe Bor, Kobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Kalium, Molybdän und Zink. Die Vitamine enthalten in bevorzugter Weise den B-Komplex, Polyalkohole und Aminosäuren.
Nach dem Erfindungsverfahren erfolgt nach der Vermehrung der Meristemzellen des Schritts (b) die Induktion zur Produktion von Protofasern, laut Schritt (c), wobei die Induktion in einem zweiten Nährmedium erfolgt.
In bevorzugter Weise erfolgt Schritt (c) der Erfindung in einem zweiten Nährmedium, welcher Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone enthält.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung umfassen Makronährstoffe des zweiten Kulturmediums der Erfindung Stickstoff, Kalzium, Magnesium, Kalium und Phosphor. Ebenso umfassen die Mikronährstoffe vorzugsweise Bor, Kobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Kalium, Molybdän und Zink. Vorzugsweise bestehen die Vitamine aus B-Komplex, Polyalkohol und Aminosäuren.
In bevorzugter Weise sind die Phytohormone des zweiten Nährmediums anders als die Phytohormone des ersten Nährmediums in Schritt (b). In einer bevorzugten Ausführung enthält das zweite Nährmedium ausgewählte Phytohormone aus der Gruppe der Auxinen, Zytokinen, Gibberellinen, Brassinosteroiden, Ethylen und aus einer Mischung derselben.
Laut Erfindung werden die Protofasern des Schritts (c) später in Pflanzenfasern verwandelt, mittels Protofasernkultur und Induktion ihrer Lignifizierung zwecks späterer Apoptose und folglicher Erzeugung von echten Xylemfasern.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgen die Schritte (b) und (c) in zwei Phasen, die erste in einem unter Rühren gehaltenen Behälter und die zweite in einem Luftblasensäulen-Bioreaktor.
Bei einem weiteren Ziel der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes dargestellt, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(i) Eintauchen der Segmente von apikalen Stielen des Pflanzenstoffes in eine Lösung eines ersten Färbungsreagens;
(ii) Ausführung von tangentialen Schnitten an verschiedenen Höhen der Pflanze;
(iii) Identifizierung der gefärbten Zellen und Komponenten des Xylemgewebes mittels Mikroskop;
(iv) Eintauchen der Segmente von apikalen Stielen des Pflanzenstoffes in eine Lösung eines zweiten Färbungsreagens;
(v) Ausführung von tangentialen Querschnitten an verschiedenen Höhen der Pflanze;
(vi) Analyse der gefärbten Zellen mittels Mikroskop und Identifizierung der Höhe, wo sich die relevanten meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes befinden;
(vii) Ausführung von neuen tangentialen Schnitten in dünnen Segmenten des Pflanzenstoffes an solchen Stellen, wo die relevanten meristematischen Kambialzellen des Xylems identifiziert wurden;
(viii) Einführung der Explantate in ein flüssiges, enzymhaltiges Nährmedium; und
(ix) Überprüfung der Anwesenheit von freien Zellen.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das erste Färbungsreagens des Schritts (i) ein vitales Färbungsreagens. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung wird dieses vitale Färbungsreagens aus einer Gruppe von rosa und blauem Anilin ausgewählt.
Ähnlicherweise erfolgt in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung die Färbung des Schritts (i) zweimal, jeweils mit rosa und mit blauem Anilin.
Laut 1 ermöglichen die Schnitte ohne Färbung unter der Stammspitze des Pflanzenspezimens das Unterscheiden zwischen den anwesenden Zellarten, jedoch nicht der Meristemzellen, die fähig sind, sich in Protofasern zu unterscheiden.
Nach einem Ziel der Erfindung ermöglicht die Färbung im Schritt (i), sowohl mit rosa als auch mit blauem Anilin die Identifizierung der Zellen des Xylems (2). So werden diejenigen Zellen identifiziert, die eine Apoptose erlitten und sich nicht vermehren können.
Nach dem Erfindungsverfahren wird in Schritt (iv) eine zweite Färbung durchgeführt, welche es ermöglicht, die für eine Kultur geeigneten meristematischen Kambialzellen des Xylems zu bestimmen. Nach einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das zweite Färbungsreagens ein chemischer Markierer.
In einer bevorzugten Ausführung des Erfindungsverfahrens ermöglicht der chemische Markierer des Schritts (iv) die Ligninsynthese zu bestimmen. In einer Ausführung der Erfindung ist der Ligninmarkierer das Nitrotetrazolium-Blau (NBT).
Wie in 3 gezeigt, erfolgen nach einer bevorzugten Ausführung der Erfindung in der Folge von Schritt (iv) tangentiale und Querschnitte an verschiedenen Höhen der Pflanze laut Schritt (v) und diese werden unter dem Mikroskop analysiert, Schritt (vi), wobei die meristematischen Kambialzellen identifiziert werden. In 3 beobachtet man, dass die gefärbten meristematischen Kambialzellen im Innenteil eine blaue Färbung aufweisen.
Nach der Identifizierung dieser Zellen laut Schritt (vii) des Erfindungsverfahrens erfolgen tangentiale Schnitte dünner Segmente des Pflanzenstoffes zur Erlangung von Explantaten, zu der Zeit, wenn die relevanten Kambialzellen mit Hilfe des Mikroskops identifiziert wurden. Nach einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die so erzielten Explantate in ein enzymhaltiges Nährmedium eingeführt.
In bevorzugter Weise wird das im flüssigen Nährmedium enthaltene Enzym laut Schritt (viii) aus der Gruppe der Pektinasen, Cellulasen, Hemicellulasen und aus einer Mischung derselben ausgewählt.
In einer Ausführung der Erfindung werden Segmente der apikalen Stiele von Pflanzen zwischen 2 Monaten nach der Keimung und bis zu 1 und ½ Jahr alt an den Stellen abgeschnitten, die der apikalen Region am nächsten liegen. Diese Segmente werden in die Lösung des ersten Färbungsreagens laut Schritt (i) des Erfindungsverfahrens getaucht. Nach einer bevorzugten Ausführung der Erfindung weist das erste Färbungsreagens eine Konzentration zwischen 20mg/mL und 250mg/mL auf.
Entsprechend dieser Ausführung werden die Segmente der apikalen Stiele in die Lösung des ersten Färbungsreagens getaucht und für eine bestimmte Zeit stehen gelassen. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung beträgt diese Zeitspanne 1 bis 6 Stunden, bevorzugterweise zwischen 2 und 8 Stunden.
In bevorzugter Weise erfolgen nach der Färbung des Schritts (i) die Schnitte des Schritts (ii), an Höhen zwischen 1 mm und 8 cm unter der Stammspitze.
Andererseits werden bei dieser Ausführung der Erfindung bei Schritt (iv) Segmente von apikalen Stielen entnommen in ähnlicher Weise wie bei Schritt (i) und in eine Lösung eines zweiten Färbungsreagens getaucht. In bevorzugter Weise weist dieses zweite Färbungsreagens eine Konzentration zwischen 1mg/mL und 10mg/mL auf. Ähnlich wie bei Schritt (i) und (ii) werden die Stiele für bestimmte Zeit stehen gelassen, wobei diese zweite Zeitspanne zwischen 1 und 8 Stunden beträgt, bevorzugterweise zwischen 2 und 5 Stunden, und die Schnitte des Schritts (v) erfolgen an Höhen von 1 mm bis 8 cm unter der Stammspitze.
Laut dieser Ausführung der Erfindung erfolgen bei der Identifizierung der Segmente, wo sich die Meristemzellen befinden welche sich in Protofasern unterscheiden können, Schnitte laut Schritt (vii) und die so erzielten Explantate werden desinfiziert und unter sterilen Bedingungen behandelt, zwecks späterer Einführung in ein flüssiges, enzymhaltiges Nährmedium laut Schritt (viii). In bevorzugter Weise liegt die Konzentration dieses Enzyms im Nährmedium zwischen 0,01% und 1,5%.
Bevorzugterweise werden die Explantate für bestimmte Zeit unter Rühren stehen gelassen. In bevorzugter Weise liegt diese dritte Zeitspanne zwischen 4 und 30 Tagen, bevorzugterweise zwischen 5 und 8 Tagen. Später wird Schritt (ix) unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Laut 4 beobachtet man in Schritt (ix) die Anwesenheit und Viabilität der isolierten Zellen.
Nach einer Ausführung der Erfindung erfolgen die Schritte (viii) und (ix) mehrmals.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung isolierter Meristemzellen. Dieses Erfindungsverfahren beinhaltet nachstehende Schritte:

(i) Bestimmung einer Meristemzellensuspension ausgehend vom vaskulären Kambium des Xylems, frei in einem flüssigen Nährmedium;
(ii) Beibehaltung einer stabilen Suspension zwischen 2g/L und 20 g/L in Zelltrockengewicht; und
(iii) Subkulturen der stabilen Suspension des Schritts (iii) mit Zugabe von 1g/L bis 20g/L in Zelltrockengewicht in frischem Nährmedium und Belassen dieser Subkulturen unter ständigem Rühren.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist dieses Verfahren zur Vermehrung von Meristemzellen abgeleitet vom vaskulären Kambium des Xylemgewebes, in Kultur unter Lichteinstrahlung mittels Dioden. Die 5 zeigt fähige Meristemzellkulturen abgeleitet vom vaskulären Kambium des Xylemgewebes, ersichtlich durch ihre Färbung mit Fluoresceindiacetat (FDA).
Desweiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erlangung von faserähnlichen Strukturen (Protofasern) dar, ab isolierten, vom vaskulären Kambium abgeleitete Meristemzellkulturen. Dieses Erfindungsverfahren beinhaltet:

(i) Suspension meristematischer Kambialzellen in einem ersten Nährmedium mit Makro- und Mikronährstoffen, Vitaminen, Antioxidationsmitteln und Phytohormonen;
(ii) Erneute Suspension der meristematischen Kambialzellen desr Schritts (i) in einem zweiten Nährmedium mit Makro- und Mikronährstoffen, Vitaminen, Antioxidationsmitteln und Phytohormonen;
(iii) Belassen der Suspension unter Rühren für eine erste Induktionszeit;
(iv) Trennung der Zellen vom Nährmedium und erneute Zugabe des zweiten frischen Nährmediums;
(v) Belassen der Suspension unter Rühren für eine zweite Induktionszeit, wobei das zweite Nährmedium andere Phytohormone als jene des ersten Nährmediums enthält.

In einer Ausführung der Erfindung erfolgt das Verfahren zur Erlangung von Protofasern in zwei Schritten, dem ersten in einem Behälter unter Rühren und dem zweiten in einem Luftblasensäulen-Bioreaktor.
Nach einer Ausführung der Erfindung enthalten die Makronährstoffe des ersten Nährmediums Stickstoff, Kalzium, Magnesium, Kalium und Phosphor. In bevorzugter Weise enthalten die Mikronährstoffe Bor, Kobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Kalium, Molybdän und Zink. In bevorzugter Weise enthalten die Vitamine den B-Komplex, Polyalkohol und Aminosäuren.
In bevorzugter Weise werden die im ersten Nährmedium enthaltenen Phytohormone von der Gruppe von auxin-, zytokinin-, gibberellin-, ethylen und abscisinsäureähnlichen Verbindungen und aus einer Mischung derselben ausgewählt.
In einer Ausführung der Erfindung enthält das zweite Nährmedium Makronährstoffe wie Stickstoff, Kalzium, Magnesium, Kalium und Phosphor. In bevorzugter Weise enthalten die Mikronährstoffe Bor, Kobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Kalium, Molybdän und Zink. In bevorzugter Weise enthalten die Vitamine den B-Komplex, Polyalkohole und Aminosäuren. Dieses zweite Nährmedium enthält andererseits Phytohormone ausgewählt von der Gruppe von Auxinen, Gibberellinen, Zytokininen, Abscisinsäure und einer Mischung derselben.
Nach einer Ausführung der Erfindung erfolgt zwecks Erlangung von Protofasern von der vom Kambium abgeleiteten Meristemzellen eine Suspension dieser Zellen laut Schritt (i), zwischen 3 und 20 g/L in Trockengewicht, wobei geprüft wird, daß die Zellviabilität bei oder über 75% liegt.
In Schritt (ii) dieser Ausführung der Erfindung wird die Suspension von Schritt (i) bis zu einer Konzentration von 1,5 bis 6,5 g/L in einem zweiten Nährmedium verdünnt.
Die so erlangte Suspension wird in einem Behälter unter Rühren für eine erste Induktionszeit laut Schritt (iii) belassen, später getrennt laut Schritt (iv) und erneuter Suspension im zweiten frischen Nährmedium, für ein erneutes Rühren laut Schritt (v).
Wie oben beschrieben, erfolgt in einer Ausführung der Erfindung das Verfahren zur Produktion von Protofasern in zwei Schritten, der zweite Schritt in einem Luftblasensäulen-Bioreaktor. Dabei beträgt der Speisungsluftstrom des Reaktors zwischen 0,25 L/min und 0,9 L/min.
6 zeigt den Beginn der Unterscheidung der Meristemzellen in Protofasern. Ähnlich wie in 7 wird der Beginn der Protofasernbildung von den meristematischen Kambialzellen des Xylems dargestellt.
8 stellt eine bereits in Septa getrennte Protofaser mit wenigstens vier Kernen dar (in der Figur in Kreisen angezeigt), welche in einem Ausweitungsprozess aus den meristematischen Kambialzellen des Xylems entsteht.
9 zeigt Protofasern in symplastischem Wachstum, die stark lichtbrechende Enden aufweisen. In 10 ist ersichtlich, wie die erzeugten und in symplastischem Wachstum befindlichen Protofasern die Ausweitung ihrer Enden beginnen.
In 11 ist ersichtlich, wie die erzeugten Protofasern das intrusive Wachstum beginnen, mit der äußeren Verdickung ihrer Wände, sowie der Beginn des intrusiven Wachstums an beiden Enden. Ähnlicherweise zeigt 12 eine Protofaser im nachträglichen Intrusionsprozess und die Zellwandverdickung.
Nach dem Verfahren zur Erlangung von Protofasern erfolgt während der Schritte (iv) und (v) eine zusätzliche Differentialzentrifugierung der Suspension zwecks Trennung der erzielten Protofasern von den meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes, noch ohne Unterscheidung, was die Bereicherung des Protofasermediums ermöglicht. 13 zeigt ein Beispiel der Differentialzentrifugierung von mittels des Erfindungsverfahrens erzielten Protofasern.
Desweiteren enthalten nach der vorliegenden Erfindung die hier dargestellten Verfahren ein zusätzlicher Schritt, bei welcher eine transkriptomische Analyse der isolierten meristematischen Kambialzellen und der erzielten Protofasern erfolgt. Diese Analyse erfolgt im Allgemeinen mittels bekannten RNA-Extraktions- und Sequenzierungsprotokollen.
Beispiele
Als Pflanzenbezugsstoff wurde Eucalyptus grandis (E. grandis) extrahiert, eine der meistgezüchteten Holzarten weltweit aufgrund ihrer Holzqualität und kurzen Fasern, was sie als Rohstoff für die Papierindustrie geeignet macht.
Samen von E. grandis wurden unter Treibhausbedingungen zur Erlangung von Sämlingen kultiviert, zwecks Extraktion von Meristemzellen. 14 zeigt die gekeimten Sämlinge unter Treibhausbedingungen.
Beispiel 1: Identifizierung und Isolierung von Meristemzellen
Es wurden wässrige Lösungen mit rosa Anilin (etwa 50mg/mL) und blauem Anilin (etwa 90 mg/mL) zwecks Eintauchen der Segmente der entnommenen apikalen Stiele, ca. 8 cm lang, zubereitet (15). Die Segmente wurden für 3-8 Stunden bei Raumtemperatur in der Lösung belassen. Nachträglich erfolgten Schnitte bei 4 mm, 1 cm, 2 cm und 4 cm unter der Stammspitze, beobachtet unter dem Mikroskop.
Es wurde ebenfalls eine wässrige Lösung von Nitrotetrazolium-Blau (N6876 - SIGMA-ALDRICH) von ca. 3,0-5,0 g/L zubereitet. Entnommene Segmente von apikalen Stielen, ca. 8 cm lang, wurden für 3-8 Stunden bei Raumtemperatur in der Lösung belassen. Nachträglich erfolgten Schnitte bei 4 mm, 1 cm, 2 cm und 4 cm unter der Stammspitze, beobachtet unter dem Mikroskop.
Nach Identifizierung der Portionen, welche die geeigneten meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes enthalten zwecks Unterscheidung in Protofasern, wurden Explantate des Stieles erlangt und in steriles Wasser getaucht. Nachträglich wurden diese in eine Lösung mit Nährmedium eingeführt, bereichert mit Enzymen wie Pektinase, Cellulase, Hemicellulase oder Mischungen derselben, bei einer Konzentration zwischen 3-10%.
Die Anwesenheit von freien Zellen und deren Viabilität wurde mittels Beobachtung unter dem Mikroskop analysiert.
Beispiel 2: Vermehrung der Meristemzellen
Es wurde eine Suspension von Meristemzellen, abgeleitet vom vaskulärem Kambium des Xylemgewebes zubereitet, in einem Nährmedium unter sterilen Bedingungen bis zur Stabilität, zu einer Konzentration in Trockengewicht von ca. 6 g/L.
Nachträglich erfolgten Subkulturen dieser Suspension, mit der Einführung von 2 bis 10 g/L in ein frisches Nährmedium.
Beispiel 3: Vermehrung der Meristemzellen mittels Lichteinstrahlung
Suspensionen von ca. 6g/L wurden einer senkrechten Einstrahlung mittels Dioden ausgesetzt, mit einer Intensität zwischen 2 W/m2 und 10 W/m2. Es erfolgten Zyklen von 24 Lichtstunden.
Beispiel 4: Induktion von Protofasern
Isolierte Meristemzellen wurden in Suspension gehalten zu einem Viabilitätsprozentsatz von über 75%, zwecks Erlangung einer Konzentration zwischen 6 und 9 g/L in Trockengewicht. Es erfolgte ein Nährmedium zur Induktion von Protofasern bis zur Erlangung einer Verdünnung zwischen 1,5 und 4 g/L. Der Viabilitätsprozentsatz der Zellen wurde analysiert und die Konzentration der Suspension wurde stabil belassen.
Die Suspensionen kamen in einen Orbitalschüttler unter einer Drehzahl zwischen 80 und 100 Upm. Nachträglich wurden Proben extrahiert zwecks Analyse des Viabilitätsprozentsatzes, der Konzentration und Induktionsprozentsatz der Protofasern.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 824230 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Ogita, S; Nomuro T., Kishimoto T, Kato E. 2012. A novel xylogenenic suspension culture model for exploring lignification in Phyllostachys bamboo. Plant Methods. 8:40 2Kumar A, et.ao. 1991. Morphogenesis response of cultured cells of cambial origin of a mature tree. Dalbergia sissoo Roxb. Plant Cell Rep. 9(12): 703-706 [0005]

Claims

Verfahren zur Erlangung von Fasern von Pflanzenmeristemzellen, gekennzeichnet durch nachstehende Schritte: (a) Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen; (b) Vermehrung der isolierten meristematischen Kambialzellen; (c) Induktion der Erzeugung von faserähnlichen Strukturen ab den Kambialzellkulturen; und (d) Erzeugung von Fasern ab faserähnlichen Zellen (Protofasern).
Verfahren des Anspruches 1, wobei die Identifizierung der meristematischen Kambialzellen des Schritts (a) mittels selektiver Zellenfärbung erfolgt.
Verfahren des Anspruches 1, wobei die Isolierung der Zellen des Schritts (a) mittels histologischer Schnitte an der durch die Färbung identifizierte Stelle der Pflanze erfolgt.
Verfahren irgendwelcher voriger Ansprüche, wobei die Vermehrung der meristematischen Kambialzellen des Schritts (b) mittels In-vitro-Zellkulturen in einem ersten Nährmedium erfolgt.
Verfahren des Anspruches 4, wobei das erste Nährmedium Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone enthält.
Verfahren des Anspruches 5, wobei die Phytohormone aus der Gruppe von auxin-, zytokinin-, gibberellin-, ethylen- und abscisinsäureähnlichen Verbindungen und aus einer Mischung derselben ausgewählt werden.
Verfahren nach den vorigen Ansprüchen, wobei die Induktion von faserähnlichen Strukturen des Schritts (c) in einem zweiten Nährmedium erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Induktion von faserähnlichen Strukturen des Schritts (c) in zwei Schritten erfolgt, die erste in einem Behälter unter Rühren und die zweite in einem Luftblasensäulen-Bioreaktor.
Verfahren der vorigen Ansprüche, wobei das zweite Nährmedium Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone enthält, wobei die Phytohormone Teil des zweiten Nährmediums und anders als jene des ersten Nährmediums sind.
Verfahren des Anspruches 9, wobei die Phytohormone des zweiten Nährmediums aus einer Gruppe von Auxinen, Gibberellinen, Zytokininen, Abscisinsäure und einer Mischung derselben ausgewählt werden.
Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von meristematischen Kambialzellen des Xylemgewebes, gekennzeichnet durch nachstehende Schritte: (i) Entnahme und Eintauchen der Segmente apikaler Stiele des Pflanzenstoffes in eine Lösung eines ersten Färbungsreagens; (ii) Ausführung von tangentialen Schnitten an verschiedenen Höhen der Pflanze; (iii) Identifizierung der gefärbten Zellen und Komponenten des Xylemgewebes unter dem Mikroskop; (iv) Entnahme und Eintauchen der Segmente apikaler Stiele des Pflanzenstoffes in eine Lösung eines zweiten Färbungsreagens; (v) Ausführung von tangentialen Querschnitten an verschiedenen Höhen der Pflanze; (vi) Analyse der gefärbten Zellen unter dem Mikroskop und Identifizierung derjenigen Höhe, wo sich die relevanten meristematischen Kambialzellen befinden; (vii) Ausführung von neuen tangentialen Schnitten dünner Segmente des Pflanzenstoffes an derjenigen Höhe, wo relevante meristematische Kambialzellen identifiziert wurden, zwecks Erlangung von Explantaten; (viii) Einführung der erzielten Explantate in Schritt (vii) in ein flüssiges, enzymhaltiges Nährmedium; und (ix) Prüfung der Anwesenheit freier Zellen; wobei das im flüssigen Nährmedium enthaltene Enzym des Schritts (viii) aus einer Gruppe von Pektinasen, Cellulasen, Hemicellulasen und aus einer Mischung derselben ausgewählt wird.
Verfahren des Anspruches 11, wobei das erste Färbungsreagens des Schritts (i) ein vitales Färbungsreagens ist.
Verfahren des Anspruches 12, wobei das vitale Färbungsreagens aus der Gruppe von rosa und blauem Anilin ausgewählt wird.
Verfahren des Anspruches 13, wobei der Schritt (i) mit zwei Färbungsreagenzien erfolgt, eines mit rosa und das andere mit blauem Anilin.
Verfahren des Anspruches 11, wobei das zweite Färbungsreagens ein chemischer Markierer ist.
Verfahren des Anspruches 15, wobei der chemische Markierer die Bestimmung der Ligninsynthese ermöglicht.
Verfahren des Anspruches 16, wobei der Ligninmarkierer Nitrotetrazolium (NBT) ist.
Verfahren zur Vermehrung von isolierten meristematischen Kambialzellen, gekennzeichnet durch nachstehende Schritte: (i) Zubereitung einer Suspension freier meristematischer Kambialzellen in einem flüssigen Nährmedium; (ii) Belassen einer stabilen Suspension zwischen 2 g/L und 15 g/L in Zelltrockengewicht; und (iii) Ausführung von Subkulturen der stabilen Suspension des Schritts (iii) mit Zugabe von 1 g/L bis 15 g/L in Zelltrockengewicht in frischem Nährmedium und Belassen dieser Subkulturen unter ständigem Rühren.
Verfahren des Anspruches 18, wobei die Suspension einer Lichteinstrahlung mittels Dioden ausgesetzt wird.
Verfahren des Anspruches 18, wobei der Schritt (i) in zwei Phasen erfolgt, die erste in einem Behälter unter Rühren und die zweite in einem Luftblasensäulen- Bioreaktor.
Verfahren zur Erlangung von faserähnlichen Strukturen von meristematischen Kambialzellkulturen, gekennzeichnet durch: (i) Suspension von Meristemzellen in einem ersten Nährmedium, welches Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone enthält; (ii) Entnahme der Suspension der Meristemzellen des Schritts (i) in einem zweiten Nährmedium, welches Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine, Antioxidationsmittel und Phytohormone enthält; (iii) Belassen der Suspension unter Rühren während einer ersten Induktionszeit; (iv) Trennung der Zellen vom Nährmedium und erneute Zugabe des zweiten frischen Nährmediums; (v) Belassen der Suspension unter Rühren während einer zweiten Induktionszeit; wobei das zweite Nährmedium andere Phytohormone enthält als jene des ersten Nährmediums.
Verfahren des Anspruches 21, wobei das Verfahren in einem Behälter unter Rühren beginnt und später in einem Luftblasensäulen-Bioreaktor weitergeführt wird.
Verfahren des Anspruchs 21 oder 22, wobei die Phytohormone des ersten Nährmediums aus der Gruppe von auxin-, zytokinin-, gibberellin, ethylen- und abscisinsäureähnlichen Verbindungen und aus einer Mischung derselben ausgewählt werden.
Verfahren der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Phytohormone des zweiten Nährmediums aus der Gruppe von Auxinen, Gibberellinen, Zytokininen und Abscisinsäure und aus einer Mischung derselben ausgewählt werden.
Verfahren irgenwelcher voriger Ansprüche, wobei zusätzlich die transkriptomische Analyse der Meristemzellen und der faserähnlichen Strukturen durchgeführt wird.