CN114051853B - 一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法及其应用，涉及高度感松材线虫病马尾松的鉴定技术。该方法是一种通过确定拟评价马尾松的最小群体数量、每株马尾松的最少春梢数、春梢的采集技术，春梢的离体接种松材线虫的处理方式，以及接种后离体春梢的松材线虫数量，最后根据数理统计分析结果，鉴定出高度感病的活体马尾松植株的方法。本发明是一种全新的技术，在备好接种用松材线虫和马尾松苗木的前提下，单批样本仅需4天时间即可鉴定出四年生高度感病松材线虫马尾松，具有离体快速、环保、成本低的特点，鉴定出的高感马尾松不带松材线虫，可用于马尾松育种材料，具有广泛的应用前景，有利于大规模推广。

Description

一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法及其 应用

技术领域

本发明涉及高度感松材线虫病马尾松的鉴定技术，具体涉及一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法及其应用。

背景技术

松材线虫病是重要的检疫性病害，自从1986年在江苏发现马尾松松材线虫病以来，截至2020年初，松材线虫病已扩散至我国18个省(自治区、直辖市)的588个县级行政区，发生面积974万亩(国家林业和草原局公告，2020年第4号；李娟和姚翰文，2019)。我国种植马尾松的地区都遭受了松材线虫危害，引起马尾松大面积死亡，严重破坏了林业生态环境建设。松材线虫病防控困难的主要原因之一松材线虫对松树的致病机理尚不清楚。而研究致病机理是需要高度感病的马尾松植株。另外离体鉴定出高感马尾松苗，可以有效筛选掉高度感病马尾松植株。从而有利于该病防控。因此长期以来，人们一直在寻求快速离体鉴定高感松材线虫病马尾松苗的方法。

关于高感松材线虫病马尾松鉴定技术，目前常用方法有：活体马尾松人工接种技术。1.活体马尾松人工接种技术依据马尾松龄期和接种方法不同而不同，半年生以上到1年生以下马尾松幼苗常采用嫩梢表皮划伤接种法；1～3年生马尾松苗常采用人工皮接法或截枝套管法接种；3～10年生马尾松幼树常采用截枝套管法接种，10年生以上树常采用树干打孔法接种，嫁接苗常采用剥皮接种法接种(徐福元等，1994；徐六一等，2012；汤陈生等，2013；张佳雯，2018)。以上无论哪种接种结果，是接种后6或18天开始发病。但无论哪种接种方法的最后接种结果都是接种对象死亡，或者接过种的松材线虫马尾松苗已经被松材线虫污染。因此马尾松育种单位及马尾松苗木生产单位因担心松材线虫病污染本单位接种材料，均不采用。2.离体马尾松枝条人工接种技术。是在日平均温度25度以上的季节，将符合条件的马尾松枝条从林间采回温室内，放在三角瓶中水培，用截枝套管法人工接种松材线虫后，观察发病结果，一般接种后发病时间需要21天，在接种过程中，每2天都要换一次水，工作量大(刘军民，1994；)。但是由于离体马尾松枝条在水培过程中影响因素较多，而且天气炎热，枝条容易死亡。且从未见过马尾松离体枝条松材线虫病评价结果与马尾松林间活体接种松材线虫病结果的一致性分析结果的报道，因此该方法的有效性，尚待进一步鉴定。

鉴于松材线虫病是我国的头号森林病害，活体高感马尾松是揭示松材线虫病致病机理的基础材料。而且防控松材线虫病的最有效途径是抗病育种，高感马尾松是开发抗性分子标记的必要材料，而抗病育种需要马尾松育种单位及马尾松苗木生产单位参加。因此必须发明离体快速鉴定高感松材线虫病马尾松苗方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法。该方法通过离体马尾松春梢样本采集技术，该春梢来源于活体马尾松，可用于鉴定马尾松对松材线虫病的高度感病性。

本发明的另一个目的是提供上述离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法的应用。

本发明通过实验确定马尾松感染松材线虫病发株病率，确定拟评价马尾松植株样本内马尾松植株数；然后通过查阅不同预处理的离体马尾松春梢初始侵入线虫数量的差别，判别利用初始春梢线虫数量判定评价松树感病性的可行性；然后选出合适的接种春梢的松材线虫数量；最后将利用春梢初侵染松材线虫数量评价结果与其相对应的活体马尾松植株人工接种松材线虫后的评价结果相比较，从而确定拟评价马尾松的最小群体数量，拟采集马尾松植株的春梢特点，春梢的采集要求，春梢的离体接种松材线虫的处理方式，以及接种后离体春梢的松材线虫数量，最后根据数理统计分析结果，鉴定出高度感病的活体马尾松植株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，包括如下步骤：

(1)常规培养和配置松材线虫悬浮液；

(2)选取同一种源同一批次的4～6年生至少10株、每株至少带有4个长度≥10cm生长一致的当年生春梢的马尾松植株为一个样本；其中，马尾松植株需长势一致；

(3)在接种当天分别用枝剪剪取长度≥10cm的当年生春梢，拔掉整枝针叶，剩余茎干部分，称重；将拔掉针叶的春梢枝条有切口的一端垂直放入到松材线虫悬浮液中，25℃～28℃浸泡处理24h～36h后，用蒸馏水冲洗枝条3～5次，直到洗干净枝条表皮残余的线虫；然后将冲洗干净的离体春梢用贝尔曼漏斗法分离24h～36h后，静置30min～40min，置于体视镜下计数，得出每克木样中的松材线虫数量；

(4)对松材线虫数量进行显著性分析，判定每组春梢的抗性分级；初侵入松材线虫数量最高的那一组是高感松材线虫病马尾松。

步骤(1)中所述的松材线虫为采用常规方法培养得到的松材线虫。

步骤(1)中所述的松材线虫悬浮液的浓度为1000～5000条/mL；优选为3000～5000条/mL；进一步优选为3000条/mL；

步骤(2)中所述的马尾松植株为采用常规方法培育的健康的马尾松植株。

优选的，步骤(2)中，马尾松植株为4年生马尾松植株；

优选的，步骤(2)中，每株至少带有6个长度≥10cm生长一致的当年生春梢；

步骤(2)中所述的样本的最小样本数是长势一致的同一种源的同一批次的10株马尾松。

步骤(3)中，为了提高接种效率，节约成本，本发明对浸泡液线虫数量进行了优化；所述的松材线虫悬浮液中的松材线虫的虫数为1000～5000条；优选为3000～5000条；进一步优选为3000条。

统计结果表明，1000，3000条和5000条均能显著区别出高感马尾松。考虑到节约成本以接种3000条松材线虫为本发明接种松材线虫数量(图1～2)。

优选的，步骤(3)中，所述的浸泡处理的条件为25℃浸泡处理24h；

优选的，步骤(3)中，所述的分离的时间为24h；

优选的，步骤(3)中，所述的静置的时间为30min。

步骤(4)中，所述的显著性分析通过Excel、SPSS进行分析；

步骤(4)中，为了验证离体春梢鉴定结果与对应的活体马尾松植株人工接种之后的高感马尾松植株的一致性，分二批进行了离体马尾松春稍接种与活体植株接种选出高感马尾松植株一致性的比较实验。结果证实，二批实验结果均证明选出的高感马尾松具有感病性(图1～2，表2)。

所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法在筛选感病马尾松植株或马尾松苗抗性评价中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明是一种全新的技术，在备好接种用松材线虫和马尾松苗木的前提下，单批样本仅需4天时间即可鉴定出四年生高度感病松材线虫马尾松，具有离体快速、环保、成本低的特点，鉴定出的高感马尾松不带松材线虫，可用于马尾松育种材料，具有广泛的应用前景。

(2)由于松材线虫病的复杂性，人们一直在努力缩短鉴定出高度感病的活体马尾松植株的时间，本发明的时间仅需4天时间。因此本发明首次将鉴定时间比传统技术缩短了21天，大大提高速度，节约了成本。

(3)用该方法鉴定高度感病马尾松时，马尾松样本群体是关键的技术参数。本发明通过比较分析，得出最小样本数是同一种源的10棵马尾松。未见同类报道。

(4)用该方法鉴定高度感病马尾松时，所鉴定马尾松的春梢数是关键的技术参数，本发明依据数据分析要求，限定每株马尾松当年生春梢数4个以上。未见同类报道。

(5)用该方法鉴定高度感病马尾松时，浸泡春梢松材线虫数是关键的技术参数。本发明通过1000条、3000条和5000条三个处理，筛选出3000条松材线虫是最佳接种松材线虫数量，提高了工作效率。

(6)依据本发明，可以设计出包含鉴定说明书，专用剪刀，线虫浸泡装置的配套工具箱，从而使得鉴定技术更加简单程序化，成本低、有利于大规模推广。

附图说明

图1是四月不同线虫浓度浸泡离体春梢后初始侵入松材线虫数量比较。

图2是五月不同线虫浓度浸泡离体春梢后初始侵入松材线虫数量比较。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

采用贝尔曼漏斗法分离线虫(冯士明.简介松材线虫的分离方法[j].云南林业，2005(2):29-29)。实施例中的马尾松均为信宜马尾松。

实施例1拟筛选单批样本内马尾松植株数量的确定

1.常规方法接种松材线虫；

2.2019年5月30日，为了确定拟评价马尾松的最小群体，采用嫩梢表皮划伤接种法对四年生信宜马尾松苗接种5000条/500μL松材线虫，本发明分三批接种了4年生共计60棵马尾松(表1和表2加起来处理组共60棵马尾松)，结果表明四年生马尾松苗的发病率是20％以上；第三批处理组(40株)接种80d后，常规方法对接种植株进行抗性评价，统计松材线虫病发病率，并对发病植株采用常规技术分离松材线虫；发现四年生马尾松苗的松材线虫发病株率大于20％(表1)；后期观察再无发病植株增加，感病马尾松植株枯死后，采用贝尔曼漏斗法分离，其体内松材线虫平均含量为112.06条/g(表1)。第一批和第二批四年生信宜马尾松接种松材线虫实验结果也证明植株发病率均在20％以上(表2)，因此，10株有约2棵马尾松发病，因此，选择10株为拟筛选的最小样本数。

表1四年生信宜马尾松苗常规方法接种松材线虫结果

实例2离体马尾松春梢接种松材线虫数量的确定及活体马尾松抗性评价结果验证实验

1、用常规马尾松离体枝条接种方法(嫩梢表皮划伤接种法)，在2019.4.3日(第一批实验)对当日选取的11株四年生马尾松植株(第一批植株编号1-1，1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11)作为一个样本，进行离体春梢枝条接种(枝条为长度约10cm的当年生春梢，接种前拔掉整枝针叶，剩余茎干部分，称其重量并记录)。其中10株处理组剪取马尾松离体枝条接种松材线虫，每株取3个枝条分别将有切口的一端垂直浸泡在含有1mL的1000条/1mL、3000条/1mL、5000条/1mL浓度的松材线虫悬浮液的10mL离心管中，重复3次(每株共计取9个枝条)；1株接种等体积双蒸水为空白对照，每个处理设置对照，重复3次。在2019.5.16日(第二批实验植株编号2-1，2-2，2-3，2-4，2-5，2-6，2-7，2-8，2-9，2-10，2-11)对当日选取的11株四年生马尾松作为一个样本，进行离体枝条接种(枝条为长度约10cm的当年生春梢，接种前拔掉整枝针叶，剩余茎干部分，称其重量并记录)。其中各10株处理组剪取马尾松离体枝条接种松材线虫，每株取3个枝条分别将有切口的一端垂直浸泡在含有1mL的3000条/1mL和5000条/1mL浓度的松材线虫悬浮液的10mL离心管中，重复3次(每株共计取6个枝条)；1株接种等体积双蒸水为空白对照，每个处理设置对照，重复3次。以上各处理在25℃浸泡处理24h后，用蒸馏水冲洗干净离体枝条表皮的松材线虫后，将冲洗干净的离体枝条用贝尔曼漏斗法分离24h后，取下1.5mL离心管或小试管静置30min，置于体视镜下计数，得出每克木样中的松材线虫数量。通过SPSS22对不同马尾松离体枝条初始侵入松材线虫数量进行差异显著性分析，并进行分组比较，分析其特征，采用Excel作图。同时常规接种方法对与四月和五月接种马尾松离体枝条相对应编号的二批马尾松活体植株分别接种5000条/500μL松材线虫进行抗性评价，对照组接种等体积的双蒸水。接种后每隔两天观察、并拍照记录植株的发病症状。参考常规抗性评价方法对马尾松植株的抗性进行分级，并与其相对应编号的马尾松离体枝条初始侵入松材线虫数量分析所得结果进行比较，分析两者之间的相关性。

2、四月(第一批实验)不同松材线虫浓度接种离体马尾松春梢结果

在四月，分别用不同浓度的线虫液接种拔掉针叶的马尾松离体春梢。根据数理统计显著性差异和分离出的线虫数量综合，线虫数量最少为高抗，最多为高感，其余为中感或中抗。结果表明：接种1000条、接种3000条和接种5000条处理后，不同植株之间初始侵入线虫数量存在显著性差异。接种1000条，1-5、1-7号植株为高感；接种3000条，1-5号植株为高感；接种5000条，1-5号植株为高感。综上，1-5号植株为高感马尾松。表明三个浓度接种松材线虫发病结果一致(图1)，因此选用3000条松材线虫作为接种接种松材线虫数量。

3、五月(第二批实验)不同松材线虫浓度接种离体马尾松枝条结果

在五月份剪取当年生马尾松离体春梢，拔掉针叶接种3000条和5000条松材线虫。结果表明，同一处理不同植株之间初始侵入线虫数量存在显著性差异。五月份离体枝条接种松材线虫，2-5号植株为高感(图2)。表明3000条或5000条的浓度接种松材线虫发病结果一致(图1，图2)。

4、马尾松离体枝条与活体植株接种法评价松材线虫病感病性的比较结果

采用嫩梢表皮划伤接种法对与四月(第一批实验)和五月(第二批)不同松材线虫浓度处理的马尾松离体株编号相对应的各10株四年生活体信宜马尾松接种5000条松材线虫。结果表明：

与四月离体枝条(第一批实验)相对应的活体马尾松苗接种松材线虫200天后，植株发病率是50％，其中1-5为高感植株。该结果与接种1000条、3000条和5000条离体枝条初始侵入线虫数量分析所得1-5为高感植株一致(图1，表2)。

与五月离体枝条(第二批实验)相对应的活体马尾松苗接种松材线虫200天后，植株发病率是20％，其中2-5植株为感病植株。该结果与接种3000条和5000条离体枝条初始侵入线虫数量分析所得2-5为高感植株一致(图2，表2)。

表2四年生信宜马尾松春梢离体接种与活体植株接种抗性评价结果比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)常规培养和配置松材线虫悬浮液；

(2)选取同一种源同一批次的4～6年生至少10株、每株至少带有4个长度≥10cm生长一致的当年生春梢的马尾松植株为一个样本；其中，马尾松植株需长势一致；

(3)在接种当天分别用枝剪剪取长度≥10cm的当年生春梢，拔掉整枝针叶，剩余茎干部分，称重；将拔掉针叶的春梢枝条有切口的一端垂直放入到步骤(1)所得松材线虫悬浮液中，25℃～28℃浸泡处理24h～36h后，用蒸馏水冲洗枝条3～5次，直到洗干净枝条表皮残余的线虫；然后将冲洗干净的离体春梢用贝尔曼漏斗法分离24h～36h后，静置30min～40min，置于体视镜下计数，得出每克木样中的松材线虫数量；

(4)对松材线虫数量进行显著性分析，判定每组春梢的抗性分级；初侵入松材线虫数量最高的那一组是高感松材线虫病马尾松。

2.根据权利要求1所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的松材线虫悬浮液的浓度为1000～5000条/mL。

3.根据权利要求2所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的松材线虫悬浮液的浓度为3000～5000条/mL。

4.根据权利要求1～3任一项所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(2)中，马尾松植株为4年生马尾松植株；

步骤(2)中，每株至少带有6个长度≥10cm生长一致的当年生春梢。

5.根据权利要求1～3任一项所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的样本的最小样本数是长势一致的同一种源的同一批次的10株马尾松。

6.根据权利要求1～3任一项所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(3)中，所述的浸泡处理的条件为25℃浸泡处理24h；

步骤(3)中，所述的分离的时间为24h；

步骤(3)中，所述的静置的时间为30min。

7.根据权利要求1所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法，其特征在于：

步骤(4)中，所述的显著性分析通过Excel、SPSS进行分析。

8.权利要求1～7任一项所述的离体春梢快速鉴定高感松材线虫病马尾松的方法在筛选感病马尾松植株或马尾松苗抗性评价中的应用。

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